Biomaterials Research (2000) 4(4) : 117-121

117

*책임연락저자 jolim@knu.ac.kr

Biomaterials

Research

C The Korean Society for Biomaterials

Lipid의 종류에 따른 liposome형 혼합국소마취제의 제형에 관한 연구 I

Characterization of Mixed Local Anesthetics Liposome Formulated from Various Lipids I

임정옥, 손미령, 백운이*

Jeong-Ok Lim, Mi-Ryeong Sohn and Woon-Yi Baek*

경북대학교 의과대학 의학연구소,* 마취과학교실 *Medical Research Institute, Dept. of Anesthesiology, Kyungpook National University, School of Medicine, Taegu, 700-721, Korea(Received March 28, 2001/Accepted July 18, 2001)

The purpose of this study is to evaluate the influence of various lipids on size and leaching property of liposomes. Thelipids used for this study are saturated fatty acids, such as phosphatidylcholine(egg PC), cholesterol(CH) and glyceroldilauroyl(Dilaurin), phosphatidylglycerol dipalmitoyl(DPPG), phosphatidylglycerol distearoyl(DSPG), and phosphati-dylcholine distearoyl(DSPC), and phosphatidylcholine diarachidoyl(DAPC) and unsaturated fatty acids such as phos-phatidylcholine dioleoyl(DOPC), and phosphatidylcholine β-arachidonoyl γ-palmitoyl(APPC). It was observed from theliposomes composed of the given saturated fatty acids for this study, the liposomal size decreased with the increasein carbon number. The paricle size of the liposome consisted of DSPC was smaller than that of DSPG. In case of lipo-somes prepared from unsaturated fatty acid, the particle size was smaller than that from saturated one. The smallestparticle size was obtained from PC/CH lipid composition containing APPC(mean diameter : 1.03 µl). Leaching of drugsincreased with time in most of the liposomes. In case of liposomes containing Dilaurin and DPPG, the leaching wasfast. The liposome containing DOPC revealed 0.86% leaching after 10 days and liposome containing APPC didn't showany leaching for extended period of time.

Key words: Liposome, Lipid, Local anesthetic, Phosphatidylcholine, Leaching

서 론

hospholipid를 사용한 liposome의 구조는 인체의

biomembrane과 유사하기 때문에 이들간의 상호작

용을 통해 피부 속으로 쉽게 침투될 수 있다. 이 원리를

이용하여 약학 및 의학분야에서는 liposome을 이용하여

약물을 효과적으로 운반하고자 노력해 왔다.1-3)

Liposome

으로 encapsulation된 약제는 피부흡수성이 빠르다고 알

려져 있어 liposome을 이용하여 색소, 단백질, melanin

등 저분자 및 고분자 물질을 피부모낭으로 전달하려는 연

구와 마취약제를 encapsulation 시켜 피부로 흡수시킴으

로서 국소마취효과를 나타내는 연고형 국소마취제의 개발

이 최근 상당한 관심을 끌고 있다.4-10)

Liposome을 이용

한 약제의 개발을 위해 조제된 liposome 제형의 특성과

안정성, 그리고 제형 조제시 영향을 미치는 인자들에 대

한 선행연구가 많이 진행되어 왔다. Elisende 등11)은

liposome 조제시 pH, cholesterol의 농도, lipid의 하전,

sonication time 등이 약제의 encapsulation에 미치는

영향을 조사였으며, Kunikazu 등12)도 dipalmitoyl phos-

phatidylcholine과 cholesterol을 사용한 liposome에 있

어서 lipid의 혼합비 및 solvent의 종류에 따른 약제의

encapsulation 효과에 대해 보고하였다. 또한 Niemiec

등13)은 약제운반에 있어서 nonionic liposome의 영향에

대해 보고하였으며 Weiner14)는 negative 하전을 띠는

lipid를 사용한 liposome의 피부침투 효과가 더 높다고

보고하였다.

본 연구에서는 liposome을 이용한 혼합국소마취제 개발에

있어서 보다 효과적이고 안정한 제형을 개발하기 위한 기초연

구로서 lipid의 포화, 불포화도 및 탄소수에 따른 liposome의

안정성과 성능을 살펴보고자 하였다. 즉 사용한 lipid의 종류,

즉 포화지방산의 탄소수, 불포화도 차이에 의한 liposome의

입자크기의 변화 및 조제 후 시간경과에 따른 약물의

leaching 효과 등을 분석하였다.

재료 및 방법

실험재료

P

118 임정옥·손미령·백운이

Biomaterials Research 2000

실험에 사용한 국소마취제는 Sigma(St. Louis, MO, USA)의

lidocaine base와 tetracaine base를 사용하였다. Lipids는 lipo-

some 제조에 다양하게 사용되는 Sigma(St. Louis, MO, USA)

사의 phosphatidylcholine(egg PC), cholesterol(CH), glycerol

dilauroyl(Dilaurin), phosphatidylglycerol dipalmitoyl(DPPG), phos-

phatidylglycerol distearoyl(DSPG), phosphatidylcholine dis-

tearoyl(DSPC), phosphatidylcholine dioleoyl(DOPC), phospha-

tidylcholine diarachidoyl(DAPC), phosphatidylcholine β-arachi-

donoyl-γ-palmitoyl(APPC) 등을 구입하여 사용하였으며 PC와

DOPC는 chloroform에 용해된 solution type을, 그 외는 powder

type을 사용하였다.

Liposome 제조

혼합국소마취제의 농도는 3%(w/w)(lidocaine 2.5 wt%,

tetracaine 0.5 wt%)로 하였으며 lipid는 PC와 CH를 기본으

로 한 3종류의 혼합지질을 사용하였는데 사용된 lipid의 종류

및 혼합비율은 Table 1과 같다. Lipid 200 mg을 혼합국소마취

제와 함께 25 ml round bottomed flask에 넣고 chloro-

form을 첨가하여 vortex mixer로 완전히 용해시킨 후 rotary

evaporator (BUCHI R-114, Swiss)를 사용하여 flask 기벽에

얇은 film이 형성되면서 chloroform이 완전히 증발되도록 100

mmHg, 20o

C에서 1시간 동안 감압 건조하였다. Tris-EDTA

(TE) buffer 0.6 ml를 첨가하여 vortex로 20분간 수화시킨 후

multilamella liposome을 얻기 위해 sonicator(Branson, UK)에

서 20분간 sonication 하였다. 냉동(-70℃)과 해동(실온) 과정을

3회 반복하여 최종적으로 liposome형 마취제를 만들었다. 포화

지방산으로 이루어진 liposome의 점도를 Brookfield DV-

II(MA, USA)를 이용하여 26o

C, 0.1 rpm 상에서 측정하였다.

Liposome의 광학현미경 관찰

Liposome을 slide glass에 얇게 펴 바른 후 광학현미경

(Olympus BX40, Japan)을 사용하여 200배 배율로 관찰하였으

며 현미경에 부착된 digital camera(SV Micro, USA)를 이용

하여 컴퓨터에 저장하였다.

입자크기 및 leaching ratio 측정

Liposome의 입자크기 및 leaching ratio는 IMT(Image and

microscope technology, Foresthill, CA, USA) software를 사

용하여 계산하였다. 입자크기는 조제직후 단위면적당 존재하는

타원형 혹은 구형 입자들의 직경을 측정하였으며, leaching

ratio는 조제한 제형을 10일간 실온보관하면서 2일 간격으로

채취한 후 표면적에 대한 crystal의 면적비(%)로 나타내었는데

1 시료당 5부위를 관찰한 후 그 평균값을 데이터로 사용하였

다.

결 과

1. Liposome의 입자분포

제조된 liposome의 광학현미경 사진을 Figure 1에 나타내었

으며 입자의 크기를 Table 2에 나타내었다.

포화지방산 탄소수 및 head group의 영향

지방산의 탄소수가 12에서 20으로 증가할수록 liposome의

점도는 178,000 cps, 202,000 cps, 210,500cps, 216,700

cps, 241,600cps로 증가하였고 입자는 균일한 구형을 형성하

였으며 평균입자의 크기는 작아지는 경향이었다. 지방산 탄소

수가 12인 Dilaurin을 사용한 경우(제형 1) 입자는 불균일한

비구상의 형태를 나타내어 입자의 크기를 측정하기가 어려웠으

나 제조직후 약제의 leaching 현상은 없었다. 탄소수 16인

DPPG를 사용한 경우(제형 2), 불균일한 타원형의 입자를 형성

하고 있는데 4.06~13.55 µm의 분포내에서 평균 7.51 µm로

다소 큰 입자를 나타내었으며 leaching에 의한 needle형의 결

정이 존재하였다. 탄소수 18인 DSPG를 사용한 경우(제형 3),

평균 입자크기는 5.76 µm로 제형 2보다 작고 선명한 타원의

입자를 나타내었으며 leaching 현상에 의한 결정화를 볼 수 있

다. 제형 3과 비교할 때 동일한 지방산의 탄소수를 가지고 있

으나 headgroup이 phosphatidylcholine인 제형 4의 경우, 입

자모양은 완전한 구형이며 균일한 분포를 나타내었고 평균입자

크기도 3.58 µm로 제형 3보다 작았다. 역시 needle형의 결정

이 전체적으로 퍼져있음을 관찰할 수 있다. Headgroup이

phosphatidylcholine인 lipid를 사용한 경우 제형의 입자는 균

Table 1. Lipid compositions and ratios of liposome formulations

Formulation Lipid composition Mixture ratio (w/w/w)

1 PC/CH/Dilaurin(C12:0) 5 : 3 : 2

2 PC/CH/DPPG(C16:0) 5 : 3 : 2

3 PC/CH/DSPG(C18:0) 5 : 3 : 2

4 PC/CH/DSPC(C18:0) 5 : 3 : 2

5 PC/CH/DAPC(C20:0) 5 : 3 : 2

6 PC/CH/DOPC(C18:1) 5 : 3 : 2

7 PC/CH/APPC(C20:4) 5 : 3 : 2

PC : phosphatidylcholineCH : cholesterolDilaurin : glycerol dilauroyl DPPG : phosphatidylglycerol dipalmitoyl DSPG : phosphatidylglycerol distearoyl DSPC : phosphatidylcholine distearoyl DAPC : phosphatidylcholine diarachidoyl DOPC : phosphatidylcholine dioleoyl APPC : phosphatidylcholine arachidonoyl palmitoyl

Table 2. Particle size of liposomes composed of various lipids

Formulationsdiameter (µm)

min max mean SD

2 4.07 13.55 7.51 2.14

3 1.47 12.55 5.76 1.98

4 1.43 9.52 3.58 1.33

5 0.45 6.60 1.72 1.06

6 0.46 4.06 1.17 0.68

7 0.45 5.66 1.03 0.64

Lipid의 종류에 따른 liposome형 혼합국소마취제의 제형에 관한 연구 I 119

Vol. 4, No. 4

일한 구형을 형성함을 알 수 있었다.

지방산 불포화도의 영향

탄소수 18에 이중결합 1개를 가진 DOPC를 사용한 경우(제

형6), 입자 분포는 0.45~4.07 µm이며 평균 1.17 µm로 동일

한 탄소수의 포화지방산을 사용한 제형 4와 비교할 때 입자가

더 작고 균일하였으며 leaching 현상도 전혀 나타나지 않았다.

탄소수 20에 이중결합 4개를 가진 APPC를 사용한 경우(제형

7), 0.45~5.76 µm의 상당히 고른 입자분포를 나타내었는데 평

균입자크기는 1.03 µm로 상기 제형 중 가장 작았으며 제형 6

과 마찬가지로 leaching에 의한 결정은 없었다.

2. 시간에 따른 약제의 leaching ratio

Liposome 제형은 조제 후 시간이 경과함에 따라 약물의

leaching ratio가 점차 증가하는 경향이 있었으며 사용한 lipid

에 따라 증가율에 다소 차이가 있었다 (Figure 2). 제형 1의

경우, 조제직후에는 결정이 없었으나 2일 후부터 점차 증가하

여 10일 경과 후에는 전체면적의 약 15%를 차지하였으며 결

정의 모양은 plate 형상을 나타내었다(Figure 3a). 제형 3은

조제직후 이미 5.4%의 결정이 형성되어 있으며 시간이 경과함

에 따라 그 비율은 점차 증가하여 10일 경과 후에는 22.3%

로서 전체 제형 중 가장 높은 비율을 나타내었다. 제형 4의

경우, 조제직후 2.9%의 결정이 형성되어 있었고 6일 후에는

4.2%, 10일 경과 후에는 7.9%로 점차 증가하였으나 제형 3

보다 조제직후 및 조제시간 경과 후 결정의 생성비율은 훨씬

낮은 편이었다. 제형 3과 4의 결정은 needle형도 일부 있으나

대부분이 stick형 (Figure 3b)이었으며 길이가 50~600 µm로

상당히 긴 형상이었다. 제형 5의 경우, 조제직후 1.8%, 4일

후 3.1%이었고 10일 후에는 3.6%를 나타내어 시간경과에 따

른 결정의 증가비율이 상당히 완만하였으며 상기 제형들에 비

해 조제직후 및 10일 경과 후의 결정 생성율이 현저히 낮음을

알 수 있다. 결정의 모양은 needle형이었으며 (Figure 3c)

needle의 길이는 약 10~50 µm이었다. 불포화지방산을 사용한

제형 6과 7은 조제직후 결정이 생성되지 않았으며 10일 경과

후 제형 6은 1% 미만의 결정이 생성되었고 제형 7은 결정이

생성되지 않았다. 전체적으로 볼 때 제형 4~7이 제형 1~3에

Figure 1. Light micrograph of liposomes prepared from various lipids. (10 days after liposome preparation). a: PC/CH/Dilaurin b: PC/CH/DPPG c: PC/CH/DSPG d: PC/CH/DSPC e: PC/CH/DAPC f: PC/CH/DOPC g: PC/CH/APPC

Figure 2. The change in leaching ratio of liposomes during 10 daysstorage.

120 임정옥·손미령·백운이

Biomaterials Research 2000

비해 leaching ratio가 낮은 것으로 나타났다.

고 찰

Liposome 제형의 점도, 입자모양 및 입자크기는 사용한

lipid의 종류에 따라 다르게 나타났다. Lipid를 구성하는 지방산

이 포화지방산인 제형 1~5의 경우, 탄소수가 증가할수록 lipid

의 분자량이 증가하여 점도가 높아졌다. 입자의 모양도 비구형

이나 타원형이었던 것이 완전 구형으로 되었으며 입자의 크기

도 점차 작아졌다. 동일한 탄소수를 나타내지만 headgroup이

다른 경우 입자의 모양에 차이를 나타내었는데 phosphatidyl-

glycerol을 가진 제형 3보다 phosphatidylcholine을 가진 제형

4가 훨씬 입자모양도 균일하고 크기도 더 작아 지방산의

headgroup의 영향이 큰 것으로 나타났다. 불포화지방산을 사

용함으로서 liposome 제형은 포화지방산보다 훨씬 더 작고 균

일한 입자를 나타내었다. 탄소수 20에 이중결합을 4개 함유한

제형 7이 전체제형 중 단위면적당 입자수가 가장 많았고 입자

의 평균크기도 가장 작았으며 고른 분포를 나타내었다. 균일하

고 작은 입자의 liposome을 만들기 위해서는 사용하는 lipid가

포화지방산일 경우 탄소수가 높고 headgroup이 ~choline인

phospholipid를 사용하는 것이 좋으며 포화지방산보다는 불포

화지방산을 사용할수록 제형은 더욱 우수해지는 것으로 나타났다.

포화지방산을 사용한 제형들은 대부분 조제직후에도 leaching

에 의한 약물의 결정화를 관찰할 수 있었으며 제형 5를 제외

하고는 보관 중 leaching ratio가 크게 증가하였으며 결정의

크기도 큰 편이었다. 제형 5는 조제직후 이미 작은 needle형

의 결정이 형성되어 있었으나 시간경과에 따라서는 결정량이

크게 증가하지 않고 유지되는 경향이었다. 제형 6과 7은 조제

직후 뿐만 아니라 10일간 보관중에도 거의 결정이 생성되지

않아 encapsulation 안전성이 높게 나타났는데 이는 lipid의

불포화도의 영향인 것으로 생각되며 차후연구에서는 장기간 보

관실험, oxidation에 의한 liposome의 미세구조변화를 정밀분

석 하고자 한다. 생성된 crystal의 모양과 비율은 약효와 상당

히 밀접한 관련이 있을 것이며 결정이 크고 많을수록 약제의

피부침투가 어려워져 약효는 떨어질 것으로 예상되는데 차후

상기 제형들의 임상실험을 통해 약효와 보관안정성에 대한 추

가연구가 뒤따라야 할 것으로 사료된다.

결 론

본 연구는 liposome을 이용한 혼합국소마취제의 조제에 있

어서 사용한 lipid의 종류에 따른 liposome 입자의 크기 및

보관 중 leaching ratio의 변화에 대해 조사하였다. Lipid는 3

종류를 사용하였는데 phosphatidylcholine과 cholesterol을 기

본으로 하여 Dilaurin, DPPG, DSPG, DSPC, DAPC 등의

포화지방산과 DOPC, APPC등의 불포화지방산을 사용하였다.

포화지방산을 사용한 liposome의 경우 탄소수가 증가할수록 입

자크기는 작아지고 분포는 균일하였다. 동일한 탄소수를 가진

경우, phosphatidylcholine headgroup을 지닌 DSPC가 phos-

phatidylglycerol headgroup을 가진 DSPG보다 입자의 크기는

더 작았다. 포화지방산 보다 불포화지방산을 사용한 경우, 입

자는 더 균일하고 작았다. APPC를 사용한 liposome 제형이

전체 제형 중 가장 균일하고 작은 입자를 형성하였으며 평균

입자의 크기는 1.03 µm이었다. Liposome 제형은 보관중

leaching ratio가 점차 증가하는 경향이었으며 저급 포화지방산

인 Dilaurin과 DPPG의 경우, leaching ratio의 증가율이 가장

높았다. 반면 DOPC로 구성된 제형은 10일 경과 후 1% 미만

의 결정이 생성되었으며 APPC의 경우 전혀 생성되지 않았다.

감사의 글

이 논문은 한국과학재단 목적기초연구(2000-1-20600-004-2)

지원으로 수행되었습니다.

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