1. INTRODUCCIN Ennuestropas,elcultivodellilium comoflordecortetieneunaimportancia econmica relevante dentro del mercado exportador de flores, alcanzando un valor de US$1,6millonesduranteelao2005,representandomsdel60%deltotalde exportaciones (ODEPA, 2005). En cultivos al aire libre de la IX y X regiones, y en invernaderos de la V regin, se ha presentadounasintomatologasemejantealadescritaparaBotrytis(VERDUGO, 2006)*. Este gnero tiene la capacidad de ser agente patgeno del cultivo provocando dao foliar, y la consecuente prdida econmica, debido a los costos que supone su control preventivo y curativo, debido al alto nivel de exigencia sanitaria que se requiere para exportar. En la V regin, el cultivo para flor de invierno se realiza en invernaderos donde se producen condiciones ptimas de humedad y temperatura para el desarrollo de esta enfermedad, lo que favorece su propagacin espacial y temporal. Elconocimientodelaetiologayepifitiologapermitedeterminarelciclodela enfermedad, con lo cual es posible manejar estrategias de control eficientes basadas en caractersticas definidas y estables del agente causal. * Verdugo, G., Ing. Agrnomo. Ms. Cs. Profesora ctedra Floricultura Facultad de Agronoma PUCV. Comunicacin personal. 2De acuerdo a esto, la investigacin tuvo como objetivos: Estudiarlaetiologayepifitiologadelasenfermedadescausadasporel gnero Botrytisen un cultivo de lilium bajo invernadero fro, con el fin de evaluar la incidenciade este tipo de patologas en la zona de estudio. DemostrarlacapacidaddeBotrytiscinereayBotrytisellipticadecausar enfermedad en plantas de Lilium sp. 32.REVISIN BIBLIOGRFICA 2.1. Antecedentes generales de la planta de Lilium sp.: ElgneroLiliumpertenecealafamiliadelasLiliceas,aligualqueimportantes especies utilizadas como flores de corte, tales como tulipanes, narcisos y Allium. El bulbo, carente de tnica, est formado por hojas modificadas que se agrupan en un disco basal o tallo modificado. Estas hojas son gruesas, generalmente de color blanco y de forma triangular, cuya funcin es almacenar sustancias de reserva para iniciar el crecimiento vegetativo. El sistema radicular es abundante, presentan races adventicias caulinares y otras de tipobasal.Lasracesprincipalesbasalessoncarnosascontonalidadesmarrones; tienen grosores de 2 a 3 mm de dimetro y longitudes de 15 a 20 cm. Las races adventicias aparecen en el tallo por sobre el bulbo y permiten el desarrollo areo al complementar la funcin de las races basales. Eltallosurgedeldiscobasalsituadoenelinteriordelbulbo.Lashojasson lanceoladasuoval-lanceoladas,dedimensionesvariables(10a15cmdelargoy anchos de 1 a 3 cm), ssiles o mnimamente pecioladas. El color es generalmente verde intenso. Las flores se sitan en el extremo del tallo; sus spalos son de varios colores, y se encuentrandesplegadosocurvadosdandoalafloraparienciadetrompeta.Se disponen solitarias o agrupadas en inflorescencias (racimos o corimbos), mostrndose erguidas o pndulas (BAON et al., 1993). 42.2.Antecedentes generales del cultivo: El cultivo se puede efectuar todo el ao, incluso se pueden realizar hasta tres cultivos dependiendo de las caractersticas de los cultivares. La plantacin se hace generalmente en mesas, en suelos con buen drenaje, estructura y con buen contenido de materia orgnica. Durante el perodo de cultivo es necesaria la utilizacin de mallas plsticas que sirven de soporte, las cuales se elevan a medida que ste crece (SEEMANN y ANDRADE, 1999). 2.3. Condiciones ambientales en el invernadero: 2.3.1 Temperatura. Para obtener un producto de calidad es necesario conseguir una buena formacin de races.Estoseconsiguecontemperaturasambientalesde12a13Cduranteel primermesdeplantacin.Temperaturasmsbajasalarganinnecesariamenteel perodo de crecimiento. Duranteeldesarrollodelcultivo,enelcasodeloshbridosasiticos,deben mantenerse temperaturas promedio de 14 a 15C. Para obtener la mxima calidad se requiere que las temperaturas alcancen los 20 a 25C durante el da y de 8 a 10 C durantelanoche.Contemperaturasnocturnassuperioresa15-20Csereducela calidad de las flores. Si las temperaturas nocturnas son superiores a 20 C, se afecta la calidad de la vara. Temperaturas muy bajas prolongan el cultivo. Para los hbridos orientales, el manejo de temperaturas es ms delicado, debindose lograr una temperatura constante ente 15 a 17C. Temperatura por debajo de los 15C pueden causar amarillamiento o cada de la hoja. 5Lilium longiflorum necesita temperaturas ptimas de 14C a 16C, pudiendo alcanzar durante el da los 20 a 22 C. Si las temperaturas disminuyen de 14C se observan grietas en los ptalos (CENTRO INTERNACIONAL DE BULBOS DE FLOR, s. f). 2.3.2Humedad Elnivelcorrectodehumedadrelativaesde80a85%.Esimportanteevitar oscilacionesparaevitarquemadurasdelashojasencultivaressensibles.La ventilacin es fundamental para reducir la alta humedad relativa y para el control de la temperatura. Se debe evitar que la humedad relativa baje demasiado rpido para evitar daos en las hojas y ocasionar prdidas de calidad. La humedad relativa alta favorecelapresenciadeenfermedades,comolasocasionadasporBotrytissp. (CENTRO INTERNACIONAL DE BULBOS DE FLOR, s. f). 2.4. Antecedentes fitopatolgicos : Segn BAON et al. (1993), lilium es atacado por las siguientes enfermedades: LapodredumbredelpiepuedeestarasociadaaPhytophthoraparasiticao Phytophthoranicotianae.Losdaosprovocadosseobservananiveldecuello, causando un decaimiento repentino por la obstruccin de los haces vasculares. ElhongoPythiumultimumproduceunalesinalcuelloqueafectaelsistema radicular adventicio. Las races se vuelven caf claro y de textura vidriosa, derivando enunaputrefaccingeneralqueterminaconelcortedeltallo,dandomuerteala planta. Rhizoctoniasolani produce su dao a nivel de suelo. Su presencia se distingue por queelbroteapicalpresentaretrasoenlaemergenciaylasprimerashojasestn podridas, las cuales caern dejando cicatrices en el tallo. 6El hongo Fusariumoxysporum (f.sp.Lilii y f.sp.narcissi) es el agente causal de la pudricinbasalenbulbos.Lossntomasdelataquesonunapodredumbrepardo oscura, que comienza en el disco basal para extenderse por toda la planta. La parte externapresentamarchitezafectandoinclusoelbotnfloral,loscualesnosern viables o tendrn antesis antes de su fecha de floracin. CylindrocarpondestructansyCylindrocarponradicicolaproducenpudricinde escamas y en el interior del bulbo. Otros hongos que afectan al bulbo, principalmente en almacenaje, son Penicillium sp. y Rhizopus nigricans. Las especies de Botrytis, por ser parte fundamental de este estudio sern descritas ms adelante. Liliumtambinesatacadoporbacterias,siendolaprincipalespecieErwinia carotovora que provoca manchas traslcidas en las escamas y posterior pudricin del bulbo que termina en marchites generalizada y muerte. Los daos por virus se caracterizan por producir distorsiones, manchas jaspeadas a nivelfoliarycrecimientoenanizante.Existenvariedadesdelilium sensibles, resistenteeinmunes.Lasresistentespuedenactuarcomoportadorasycontaminar otrasvariedadessensibles.ElLSV(LilySimtomlessVirus)esparticularmente importante por provocar manchas clorticas en las hojas, alargadas paralelamente a las nervaduras y posteriormente se vuelven necrticas. 72.5. Antecedentes fitopatolgicos en Chile: Ennuestropaselcultivohatenidocondicionesptimasparasudesarrollo.Sin embargo,tambinsehandetectadoproblemasdecarcterpatolgicoquepueden frenar el cultivo si no se detectan a tiempo. Los problemas ms graves en multiplicacin y produccin de bulbos son los virus. En la zona sur (VIII a X regin) se realizaron estudios demostrando que el cultivo puede infectarse principalmente por LSV (Lily Simtomless Virus), TVB (Tulip Break Virus) y TRV (Tobacco Rattle Virus) (MUOZ y FERNNDEZ, 2000). Enlazonanorte,principalmenteenelvalledeAzapa,sedetectFusariumsp., provocandoclorosisyprdidadeturgenciaenlaszonasbasales(SEPLVEDA-CHAVERA et al., 2004) 2.6. Botrytis cinerea: BotrytispertenecealPhylum Ascomycota,claseAscomycetes,ordenHelotiales, familia Sclerotiniaceae, gnero Botrytis(ITIS, 2005). Dentro de este gnero, la especie Botrytis cinerea Pers.es la nica especie polfaga, afectando a ms de 200 tipos de plantas. Todas las dems especies son consideradas especficas, con un rango de hospederos estrecho. (VAN BAARLEEN, STAATS y VAN KAN, 2003). Segn AGRIOS (1996), es una de las enfermedades ms comunes y ms ampliamente distribuidas de hortalizas, plantas ornamentales, frutales, cultivos tradicionales y por sobre todo, en plantas cultivadas bajo invernadero. 82.6.1. Sntomas Enplantasdelilium,sepresentaproduciendoelcaractersticomiceliogris, afectndolasencualquierestadodedesarrollo,inclusoenpostcosecha,llegandoa producir muerte de plntulas, pudricin en la base de las varas, pudricin de bulbos y tizndelaflor,dondeademsseobservaabundanteesporulacinydesarrollode esclerociossiseproducencondicionesadversas.B.cinereapuedeseraisladade lesionesenhojasdelilium,peronopresentalesionestanextendidascomolas provocadas por Botrytis elliptica (GOULD, 1963). VANBAARLEN,STAATSyVANKAN(2004),comprobaronlaescasa patogenicidad de B.cinerea, a travs de la inoculacin de plantas sanas de lilium. Despus de nueve das, se generaron pequeas manchas oscuras, evidencia de escasas clulasmuertas.Laslesionesnoseextendieronyatravsdelmicroscopiono encontraronmicelio,peseaobservargerminacindeconidiasenellugarde infeccin.Tambindemostraronquealaumentarlaconcentracindelinculoera posible obtener sntomas. 2.6.2. Caractersticas morfolgicas EntrelascaractersticasobjetivasparadistinguiraB.cinereadeotrasespeciesde Botrytis estn: el crecimiento y forma del micelio, el tamao y color del conidiforo, la forma, tamao y color de las conidias, y tamao del esclerocio. 92.6.2.1. Micelio y estructuras reproductivas asexuales Lascoloniasalprincipiosonhialinas,luegosetornangrisacafgrisceoconel desarrollodelasconidias(CMI,1974).Lashifassonseptadasyramificadas (J ARVIS, 1977). Losconidiforossonerguidos,simplesoramificados(ALEXOPOULOS,1966). Miden750mhasta2mmdelongitudy16-30mdeancho,tienenuna protuberancia apical con ramificaciones alternas. Presentan color caf oscuro y tienen lapared lisa (CMI, 1974). En las clulas apicales se producen racimos de conidias unicelularesymultinucleadas(CMI,1974).Losconidiforosylosracimosde conidias se asemejan a un racimo de uvas (AGRIOS, 1996). En la superficie de las hojas infectadas se elevan uno a dos mm. Las conidias sonovales o esfricas, hialinas o de color caf plido, hidrfobas, de pared lisa y miden entre 8-14 m de largo y 6-9 m de ancho (CMI, 1974, HSIANG y CHASTAGNER, 1991). 2.6.2.3. Esclerocios Este hongo produce esclerocios irregulares, planos, duros y de color negro (AGRIOS, 1996). Segn HSIANG y CHASTAGNER (1992)el tamao vara entre 3,5 y 5 mm. stos consisten en una mdula densamente empaquetada con un pseudoparnquima color caf a negro y una capa cortical de clulas de 5-10 m de dimetro. La parte externa est compuesta por una malla de hifas entramadas unindose en un cuerpo compacto que va madurando por la acumulacin de pigmentos de melanina. 102.6.3. Reproduccin sexual. El teleomorfo es Botryotinia fuckeliana (de Bary) Whetzel . Este estado se caracteriza por la produccin de apotecios de color caf claro que emergen del esclerocio durante la primavera o a principios del verano. El apotecio se caracteriza por poseeruna superficie poco hendida, casi llana. El estipe mide entre 3 a 15 mm. Las ascosporas queseoriginandelapoteciomiden8-12mdelargoy4-6mdeancho(CMI, 1974). 2.6.4. Desarrollo de la enfermedad. 2.6.4.1Infestacin Lainfestacinoinoculacineselprocesomedianteelcualunpatgenoysu hospedero entran en contacto. En el caso de B. cinerea se produce cuando la conidia diseminadaentraencontactoconelhospedero.Tambinocurrecuandouna superficieinfestadaconmicelioentraencontactoconuntejidosano(AGRIOS, 1996). 2.6.4.2. Penetracin La conidia, despus de haber sido incubada unas horas bajo condiciones favorables a la germinacin, se adhiere fuertemente a un sustrato vivo o descompuesto mediante la produccindesecreciones(DOSSetal.,1995).Unavezadheridapenetra directamente al perforar mecnica y/o enzimticamente la cutcula e indirectamenteporheridasoporaberturasnaturales(principalmenteestomasyestigmas) (LATORRE, 1986). 11La penetracin mecnica de B.cinerea se realizatravs del apresorio que nace del extremodistaldelaconidiagerminada.Deesteapresoriosurgeelestiletede infeccin,elcualpenetradirectamentelacutculahastalasclulasepidermales (AUGER,1988).Enlilium,lasconidiasquehangerminadoraravezpenetran directamente en los tejidos que muestran un crecimiento activo, pero si lo hacen a travs de heridas o despus de que se han desarrollado durante un cierto tiempo y han formado micelio sobre ptalos de flores senescentes, follaje senescente, escamas de bulbos muertos, etc. (HSIEH, HAUNG y HSIANG, 2001). Lapenetracinenzimticadelacutcula,seproducegraciasalaproduccinde enzimascomopectinasasypolygalacturonasas(VERHOEFF,1974).Adems,el patgeno produce cido oxlico que acidifica el tejido de la planta para facilitar la hidrlisis de la pared celular (VAN BAARLEN, STAATS y VAN KAN, 2004). Durante la penetracin, en las clulas del tejido de la hoja se produce perxido de hidrgeno y xido ntrico, que permiten el ingreso del tubo de germinacin de las conidias(VANBAARLEN,STAATSyVANKAN,2004).Sinembargo,este proceso de infeccin se bloquea durante la penetracin de la pared celular, debido a que la planta es capaz de generar una respuesta en defensa al ataque de este patgeno (HSIEH, HAUNG y HSIANG, 2001). 2.6.4.3. Infeccin Laenfermedadpuedemanifestarseenformasintomticaolatente.Lainfeccin sintomtica corresponde a la infeccin comn, en la cual el patgeno ha penetrado directamenteoporheridas.LATORRE(1986)sealaquesilascondicionesson ptimas,laincubacinocurreenpocashorasyrpidamenteseproducen reinfecciones, debido a las conidias producidas luego del desarrollo de los primeros sntomas de Botrytis. 12La infeccin latente o asintomtica es aquella en la que el patgeno ha cesado de estar agresivotemporalopermanentementeylossntomasnoestnpresentes.Segn VERHOEFF (1974), la infeccin puede permanecer latente hasta un punto en el cual el estado agresivo nunca se activa o lo hace muy tarde como para afectar gravemente a la planta. La presencia de B.cinerea en forma latente en lilium es particularmente daina, ya que durante el traslado o la exportacin, si se producen las condiciones ptimas de crecimiento, provocaran una pudricin (MILLER, 1992). Esta fase es un mecanismo de sobrevivenciay de alguna forma podra influir en las epidemias. Adems le permite mantenerse hasta que el tejido se vuelva senescente y no oponga resistencia al ataque (BRAUN y SUTTON, 1988). 2.6.4.4. Resistencia a la enfermedad Unestudiorealizadoenliliumalinocularfloresconconidiasdemostrqueuna secrecin de fitotoxinas lograban bloquear la infeccin en el interior del ovario, al crear deficientes condiciones para el desarrollo del hongo. Se observo un aumento de laaccindelaperoxidasacercadelcrecimientodelmicelio,ademsdeun incrementodelaconcentracinalrededorenlasparedescelulares.Laperoxidasa actalignificandolaparedcelularloqueprovocaraunamayorresistencia (GEORGIEVA, EDREVA y RODEVA, 2003). Esta respuesta defensiva no es propia de lilium. En estudios realizados en tomate se comprob la presencia de un aumento de la peroxidasa frente al ataque de Botrytis cinerea. Este efecto es una respuesta frente a la presencia de hongos, bacterias y virus (GEORGIEVA et al., 2003) 132.6.4.5. Dispersin En clima hmedo, el hongo libera fcilmente sus conidias y stas son diseminadas por el viento (AGRIOS, 1996). Segn LATORRE (1986) la lluvia, por el fenmeno de salpicado, tiene tambin importancia en la liberacin y diseminacin de conidias. Alinteriordeuninvernadero,lasconidiassonliberadasalambienteporun mecanismohigroscpicoasociadoauncambiorpidoenlahumedadrelativa (DAUGHTREY y BENSON 2005). MILLER (1992) seala que es fundamental el manejo de los desechos del cultivo, ya que ellos provocan una dispersin de esporas si no son tratados adecuadamente. 2.6.4.6. Sobrevivencia B. cinerea puede sobrevivir como saprfito en un gran nmero de plantas cultivadas y malezas,oenmateriasendescomposicin(AUGER,1988).Lasconidiaspueden sobrevivir por ms de 14 meses en almacenamiento, aunque disminuye su viabilidad. (SALINAS et al., 1989). Sin embargo, sobre la tierra no son capaces de lograrlo. En el suelo el hongo inverna en forma de esclerocios producidos sobre restos orgnicos dejadosluegodecosecharlasflores,odemicelioquesedesarrollaenrestosde plantas en proceso de descomposicin (BERG y LENTZ, 1968). 2.6.4.7. Fuente de inculo DAUGHTREYyBENSON(2005),descubrieronquelosesclerociospueden sobrevivirbastantetiempoysertilescomofuentedeinculoparalasiguiente estacin.Eltiempoquepuedensobrevivirfluctaentrecincoynuevemeses. Prcticas de control de malezas tanto qumicas como mecnicas no tienen efecto en su sobrevivencia. 142.6.5. Efecto de los factores ambientales Para que una enfermedad se produzca y se desarrolle ptimamente, debe haber una combinacin de tres factores: hospedero susceptible, patgeno infectante y un medio ambiente favorable (AGRIOS, 1996). 2.6.5.1. Temperatura de crecimiento J ARVIS(1977)encontrquelatemperaturaptimadecrecimientodemiceliode Botrytis cinerea en medio PDA es de 22C.En condicionas ambientales controladas, no se detect produccin de micelio areo ni de conidias a temperaturas de 30C. El micelio requiere de un clima hmedo y moderadamente fro (18 a 23C) para que sedesarrolleadecuadamente,esporule,libereygerminesusesporasyparaque produzca infeccin (DAUGHTREY y BENSON, 2005). 2.6.5.2. Temperatura de esporulacin Existen diferencias notables de acuerdo al hospedero del cual se obtiene la cepa. THOMAS, MAROIS y ENGLISH (1988) estudiando cepas del patgenoobtenidas de uva; sealan que la mayor produccin de conidias bajo condiciones ambientales controladasselogra21C.Sinembargo,J ARVIS(1977),definelatemperatura ptima para la esporulacinen 15C. 152.6.5.3. Temperatura de germinacin e infeccin Segn LATORRE y RIOJ A (2002) la germinacin de conidias ocurre en unamplio rango de temperaturas (5 a 30C), con un ptimo de 20C. Lainfeccinpuedeocurrirabajastemperaturascuandolasplantaspermanecen mojadas por largos perodos de tiempo (RIES, 1995). J ARVIS (1992) seala que la temperatura ptima de germinacin de esporas es de 20C y la temperatura ptima de crecimiento del tubo germinativo es de 30C. 2.6.5.4.Temperatura para la formacin de esclerocios. De acuerdo con J ARVIS (1992) los esclerocios se forman en otoo-invierno cuando las temperaturas fluctan entre 11 y 13C y germinan con temperaturas de 22 a 24C. 2.6.5.5 Humedad El efecto ms importante de la humedad ocurre sobre la germinacin de las conidias de los hongos y sobre la penetracin del tubo germinativo en el hospedero. Tambin influye al incrementar la suculencia del hospedero, aumentando as su susceptibilidad a ciertos patgenos (AGRIOS, 1996). Lahumedadrelativanecesariaparaqueocurrainfeccinesmayoral90%,que provoca condensaciones producto de la evapotranspiracin, difciles de medir, pero suficientesparainiciarlagerminacineinfectaralhospedero.Loseventosde infeccinenelcamposeinicianenrespuestaalluvias,lloviznasopresenciade neblinas que condensan sobre el rgano afectado (LATORRE y RIOJ A, 2002). 162.7. Botrytis elliptica: LaespecieBotrytiselliptica(Berk.)Cookeesinfecciosaenlamayoradelas variedadesdelilium,inclusoalgunaspuedenllegaralamuertesilascondiciones favorecen su desarrollo ( GOULD, 1963). Sudistribucinanivelmundialsedebealaintroduccindematerialvegetal proveniente de zonas endmicas ( Holanda) hacia pases donde el cultivo ha tenido una buena perspectiva comercial. HUANGetal., (2000) descubrieron variabilidad gentica entre aislados de zonas tan distante como Norteamrica y Asia (Taiwn), pero no se encontr evidencia de que algn morfotipo sea especfico para una regin geogrfica.

2.7.1. Sntomas. Laenfermedadprovocadaporestehongo,produceinicialmentemanchasenhojas con bordes bien delimitados, que al necrosarse toman una coloracin caf oxidado conformacindeanillosconcntricos,caractersticasqueladiferenciandeB. cinerea. La superficie del tejido limitada por el anillo, visible tanto por el haz como por el envs, se degrada poco a poco, se arruga y finalmente se seca. La hoja puede ser atacada por el borde o el interior del limbo, al ingresar por el borde la hoja se deforma y es fcilmente confundida con sntomas de virus (GOULD, 1963, MILLER, 1992, SEEMANN y ANDRADE, 1992). CABRERA, ALVAREZ y SOSA DE CASTRO (2005) destacan su forma elptica, ms anchas en el centro y con los extremos aguzados, que al envejecer adquieren color grisceo y aspecto velloso por la presencia de las estructuras reproductivas. Esta necrosis comienza generalmente en el extremo de la hoja o en la parte media y luego seextiendenhastaeltallo.Sealanademsquelasinfeccionesmsagudasse 17observan preferentemente sobre las hojas ms jvenes donde los sntomas son ms severos. GOULD (1963) y BAON et al. (1993) concuerdan que, en plantas jvenes, cuando el dao se produce en el pice, puede detener el crecimiento. El hongo puede atacar los tallos cerca del nivel del suelo, provocando una amarillez en el follaje. VAN BAARLEN, STAATS, y VAN KAN (2004) observaron como primer sntoma la traslucides de la epidermis, anterior a la lesin necrtica, luego de un da de la inoculacin experimental. A travs de microscopio ptico visualizaron plasmlisis de las clulas, luego de tres das de infeccin ubicada en la zona adyacente a la lesin. Las flores senescentes son un punto de entrada para la enfermedad. MILLER (1993) menciona que stas presentan manchas de color caf y que en condiciones fras y hmedassepudrenrpidamentecubrindosedeesporas.Encondicionessecaslas lesiones dejan de crecer y se secan. Cuando los botones florales son infectados en sus primerasfasesdedesarrollo,losmsexternosevidencianprotuberanciasyenlos tpalos aparecen una serie de punteaduras, de color gris que al tacto se manifiesta como una podredumbre blanda. Si las flores no son removidas, se inclinan sobre las hojassuperioresreteniendohumedad,dandolascondicionesapropiadasparael ataque. Los hbridos orientales son menos susceptibles que los asiticos. En algunas ocasiones, en lilium asiticos, la hoja presenta estras amarillas o rojas en sentido longitudinal a la lesin. DOOS, CHASTAGNER y RILEY (1988) sealaron que esto era provocado por una aceleracin de la senescencia en la zona adyacente al punto de infeccin. Demostraron adems que esto ocurra en plantas maduras y en hojas basales. 182.7.2Caractersticas morfolgicas 2.7.2.1.Micelio y estructuras reproductivas asexuales. Las colonias se presentan blanquecinas, expansivas, de aspecto algodonoso y denso, que luego se tornan gris, caf grisceo o negro. Las hifas son septadas y ramificadas (CABRERA, ALVAREZ y SOSA DE CASTRO, 2005). Esta especie se caracteriza por producir conidiforos formndose a partir del micelio, ramificados en los extremos, formando estructuras fialdicas pequeas (CABRERA, ALVAREZ y SOSA, 2005). Los conidiforos son abundantes, de colorcaf claro y de 500 m a 2 mm de largo (GRIGALIUNAITE,2001). En cada pice de las filides del conidiforo nacen conidias hialinas o tenuemente coloreadas, que se oscurecen a la madurez, de forma elipsoide a ovoide (SMITH et al., 1992). Bajo condiciones favorables el conidiforo se desarrolla sobre las lesiones, produciendo conidias que maduran en 9 horas (GOULD, 1963). Segn DOSS, CHASTAGNER y RILEY (1984) este patgeno no produce conidias enformaabundanteencondicionesdelaboratorio.Sinembargo,elloslograron obtenermicroconidias.stassonhialinas,dedimetroentre2a3,4myson formadas en cortas fialides que miden entre 5,9 a 10,7 m de largo. Segn J ARVIS (1977) todas las especies de Botrytis tienen la capacidad de producir microconidias. Las dimensiones de las conidias varan entre 18 a 32 m de largo y 13 a 24 m de ancho (DOSS, CHASTAGNER y RILEY, 1984). 19HSIANGyCHASTAGNER(1991)midieroneltamaodeconidiassensiblesa fungicidasylascompararonconaquellasresistentes.Eltamaodelasconidias provenientesdecepassensiblespromedio17,8mdelargoy10mdeancho mientras que las cepas resistentes promediaron los 26,4 m de largo y 19,2 m de ancho. 2.7.2.2. Esclerocios B.elliptica produce esclerocios blancos en un principio, posteriormente se vuelven negros, de forma redonda, elptica o irregular. Bajo condiciones favorables germinan enlaprimaverasiguienteparaproducirmicelioquedarorigenaotrociclode infeccin. Al madurar en las hojas afectadas caen a la tierra durante el verano. Estos raramenteseproducenenelbulbo.(GOULD,1963,VANDENENDEy PENNOCK-VOS,1997).Eldimetrovaraentre1y2,1mm(HSIANGy CHASTAGNER, 1992). 2.7.3. Reproduccin sexual Despus de muchos ensayos, DOSS, CHASTAGNER, y RILEY (1992) fueron los primeros en producir un estado sexual en laboratorio, alproducir apotecios de los cuales se originan ascosporas. Sin embargo, no se encontr evidencia suficiente de su ocurrencia natural en el ambiente. 202.7.4. Desarrollo de la enfermedad 2.7.4.1. Penetracin A travs de estudios histolgicos se ha podido determinar que la penetracin ocurre en el envs de la hoja a travs del estoma (DOSS, CHASTAGNER y RILEY, 1984). HSIEH, HAUNG y HSIANG (2001) observaron que a 20C y 100% de humedad relativalasconidiasgerminanenambassuperficiesdelahojadelilium,perolos tubos de germinacin no invaden las clulas epidermales del haz. El apresorio, de poca longitud (menor a 20 m), puede penetrar a travs de la apertura estomtica, directamenteenlasclulasepidermales,peroelmayorporcentajedepenetracin ocurreenlaepidermisdelasclulasdeguarda(52%).Bajoestascondiciones controladas,luegodenuevehorasel60%delasconidiasgerminadaslograbala penetracin. GOULD (1963) seala que las primeras lesiones aparecen luego de 10 horas despus de ocurrida la penetracin si las condiciones favorables estn presentes en forma continua. 2.7.4.2. Infeccin VANBAARLEN,STAATSyVANKAN(2004)sealanquelapatogenicidady especializacin de Botrytis elliptica para infectar plantas de lilium se demuestra por el mecanismodenominadomuertecelularprogramada.Unadelasetapasesla induccindelafragmentacindeADN,procesoespecficoenlainfeccindeB. elliptica, el cual no ocurre durante el ataque de B.cinerea. Sin embargo, el rea de infeccin provocada permite a B. cinerea infectar y colonizar a la planta. El contenido celular es ocupado como fuente nutritiva por el patgeno para continuar su avance 21porlostejidos.Otradiferenciasustancialesque B.ellipticaafectaprincipalmente tejido sano, mientras que B.cinerea afecta tejido daado o muerto. Estaenfermedadpresentaunperodomuybrevedeincubacin,expandindose rpidamentesobrehojasjvenesoptalos,debidoaqueestosrganospresentan tejidos ms dbiles y suculentos. Destaca su carcter necrotrfico debido al rpido avance y abundante esporulacin sobre los tejidos muertos cuando tiene condiciones ambientalesfavorablescomolasdeuninvernadero(ALVAREZ,CABRERAy SOSA DE CASTRO, 2005). 2.7.4.3. Diseminacin Ladiseminacinocurreprincipalmentecuando,encondicionesfavorables,los esclerociosoelmicelioproducidoentejidosmuertosproducenconidiasqueson transportadasporelviento,yporsalpicadurasdeaguahaciaelfollajequese encuentra en desarrollo durante la primavera ( HUANG et al., 2001). 2.7.4.4. Sobrevivencia El patgeno perdura como saprfito en los residuos vegetales enfermos. (VAN DEN ENDE y PENNOCK-VOS,1997) Segn GOULD (1963) sobrevive durante el invierno a travs de los esclerocios. En algunas ocasiones se ha demostrado que puede pudrir los bulbos, lo que significara otraformadesupervivencia,peroelautorsealaqueraravezocurreestoenla naturaleza. 222.7.4.5. Fuente de inculo VANDENENDEyPENNOCK-VOS(1997)mencionanquelosesclerocios formados en los tallos muertos de lilium luego de la cosecha juegan un rol importante en la epidemiologa. Ellos determinaron que los esclerocios que permanecen latentes enelveranocorrespondenalinculoprimarioparalainfeccindelaprxima temporada. 2.7.5. Resistencia a fungicidas. El uso intensivo de fungicidas para el control de esta enfermedad ha provocado la aparicindecepasresistentes.HSIANGyCHASTAGNER(1991)aislaroncepas resistentesaDicarboximidasyBenzimidazoles.Lasprimerascrecenmslentoen medio de cultivo, sus conidias son ms largas y el doble de ancho que las conidias normales. Los autores determinan que esta caracterstica le confiere una capacidad de sobrevivir ms tiempo y ser ms infectiva. Las cepas resistentes a Benzimidazoles producen menos conidias y los esclerocios son de mayor tamao y ms numerosos que los de las cepas sensibles. 2.7.6. Efecto de los factores ambientales 2.7.6.1. Temperatura de crecimiento La temperatura ptima de crecimiento es de 15 C (GOULD, 1963). Este autor seala adems que a dicha temperatura y humedad relativa alta la enfermedad se repite en ciclos en pocos das durante todo el perodo de crecimiento del cultivo, produciendo esclerocios en las partes enfermas. HSIANG y CHASTAGNER (1991) demostraron experimentalmentequeB.ellipticacrecemslentoqueB.cinereaenmediode cultivo a 20C.232.7.6.2. Temperatura de esporulacin. Enlaboratoriosehademostradoqueunrangode5-20C,acompaadadeuna humedadrelativamayoral90%producelaesporulacinapartirdemicelio.Las temperaturas ptimas para la produccin de conidias son aquellas menores a 10C( HUANG et al., 2001). 2.7.6.3. Temperatura de germinacin e infeccin La germinacin de las conidias sobre el tejido ocurre a una temperatura ptima de 15C, pero una vez que el hongo ha ingresado a la planta se desarrolla mejor a 21 C(GOULD,1963).DOSS,CHASTAGNERyRILEY(1984)demostraronquela infeccin es ms rpida a 20 C que a 25 C, manteniendo las hojas con una pelcula de agua por 48 horas. 2.7.6.4. Humedad Adems de la amplitud trmica, la humedad relativa del ambiente es muy importante para el desarrollo de la enfermedad. La humedad ambiente elevada (mayor al 90%) presente en los invernaderos es un factor decisivo para los ataques de este hongo, favoreciendo la germinacin de las conidias ( VAN DEN ENDE y PENNOCK-VOS, 1997).En condiciones de baja humedad ambiental la lesin se seca y el patgeno deja de extenderse. En cambio, bajo condiciones hmedas las lesiones se unen y afectan todalahoja,lacualsecubredemiceliogrisceoyacabapudrindose,afectando luego a toda la planta. (GRIGALIUNAIT, 2001). Una humedad relativa mayor al 90% permite la esporulacin del esclerocio (VAN DEN ENDE y PENNOCK-VOS, 1997). 243.MATERIALES Y MTODOS 3.1. Ubicacin del muestreo: Elmuestreoserealizenunprediopertenecienteaunaempresadedicadaala produccin y exportacin de flores, ubicado en la comuna de Olmu, V regin. Seanalizaronplantasconunamismafecha deplantacinhastalacosecha,delas variedades asiticas: All Round, Black Out, Tresor y Valdisole, entre los meses de abril y julio de 2005, y luego un segundo perodo desde la segunda semana de julio hasta septiembre de 2005 con las variedades asiticas: Algarve, Black Out, Madrid, Navona, Umbra, Menorca, Gironde y Wiener Blut. El cultivo se encontraba bajo invernadero fro en mesas de 36 m de largo y 1,2 m de anchoenlascualesexistan60bulbospormetrocuadrado,correspondienteaun calibre 12-14 cm. En la zona de muestreo existan 42.000 plantas en 21 mesas del sector analizado durante del primer perodo. En el sector del segundo perodo existan 58.500 en 30 mesas aproximadamente ( Anexo 1). Laslaboresrealizadascorrespondenalmanejopropiodeestecultivoaescala comercial. Un detalle de la aplicacin de fungicidas se describe en el Anexo 2. 3.2. Metodologa de muestreo: Las muestras fueron obtenidas semanalmente mediante un muestreo sistemtico con arranque aleatorio del 0,2%. El nmero de la primera planta fue elegido al azar, a la cual se le sum 500 en la misma mesa para obtener el nmero de la segunda planta a muestrearyassucesivamente.Paraelloseutilizaronplanillasenlascualesse 25registr la incidencia anotando la presencia o ausencia del sntoma o signo del agente causal Botrytis sp. (Anexo 3). Las muestras de hojas con lesiones eran recolectadas y colocadas en bolsas plsticas con cierre hermtico para su traslado al laboratorio. 3.3. Determinacin de la incidencia de Botrytis. Esta se realiz mediante la observacin de sntomas presentes en la superficie de la hoja. Para corroborar la presencia del agente causal se realizaron cmaras hmedas. A partirdeestainformacinsecalcullaincidenciadeBotrytisdeacuerdoala siguiente frmula: Incidencia de Botrytis ( %) =N de plantas con sntomas de Botrytis en hojas X 100 N total de plantas muestreadas. La incidencia fue calculada por variedad, para el caso de B.cinereayB.elliptica. Adems, para esta ltima especie se calcul la incidencia sin considerar la variedad, para observar la tendencia general de la enfermedad durante el perodo de estudio. 3.3.1. Correlacin entre la incidencia de Botrytis y factores ambientales. ParalograrcorrelacionarlaincidenciadeBotrytisconlatemperaturayhumedad relativa en los sectores analizados, se dispusieron sensores calibrados para registrar estos datos cada una hora. Una vez finalizado el muestreo, los datos fueron obtenidos medianteelprogramacomputacionalTermocron.Lastemperaturasmximas, mnimasyhumedadrelativadiariasfueronutilizadasparaobtenerlasmedias semanales.EstosdatossecorrelacionaronconlaincidenciadeBotrytismediante grficos y el posterior anlisis de los mismos. 263.4. Estimacin del ndice de dao: ParacalcularelndicededaocausadoporambasespeciesdeBotrytis,estese calcul mediante la siguiente frmula: ndice de dao: ( )100VNnvID =donde: n : n de plantas por nivel de la escalav : nivel de la escala ( grado de ataque) N : n total de plantas observadas. V : Rango mximo de la escala El grado de ataque vari de 0 a 3, utilizndose la siguiente escala de evaluacin: 0 =Ausencia de sntomas (lesin caf circular o elptica) 1 =1-2 lesiones presentes en la hoja. 2 =3-6 lesiones presentes en la hoja. 3 =7 o ms lesiones. Para corroborar la presencia del agente causal, algunas hojas con sntomas colectadas enelprediosecolocabansietedasencmarashmedas,lasquefueron confeccionadasconenvasesdeplsticoencuyatapaseregistrlafechade recoleccin y la variedad muestreada. La bandeja era previamente desinfectada con alcohol y luego se le cubra interiormente con papel absorbente estril (toalla Nova) humedecidaconaguaestril.Encadaunasecolocabaunahoja.Estasbandejas fueron colocadas a temperatura ambiente. Una vez obtenido el crecimiento de micelio y la presencia de estructuras reproductivas, se pasaba a la etapa de aislamiento. 273.5. Pruebas de patogenicidad: Eldesarrollodeestapartedeltallerserealizenellaboratorioeinvernadero climatizadodeFitopatologadelaFacultaddeAgronomadelaPontificia Universidad Catlica de Valparaso, ubicado en el sector de La Palma, comuna de Quillota, V regin. Paraambas especies se realizaron los postulados de Koch por no tener referencias a nivel nacional de la presencia de estos patgenos infectando plantas de lilium. 3.5.1. Aislamiento Una vez obtenidas las muestras con sintomatologa en el campo se procedi a aislar enelmedionutritivoagarpapadextrosa acidulado(APDA)conelfindeobtener aislados,purificarlosydescribirlascaractersticasquepresentabanloshongosas obtenidos. De las muestras a aislar se extrajeron trozos mediante bistur, de 0,5 a 1 cm2delazonadeavancedelaslesiones.Lostrozosdetejidoenfermofueron sumergidosenunasolucindehipocloritodesodioal1%por15segundospara eliminar poblaciones de bacterias y otros saprfitos, luego fueron lavados en agua estril,dejndolossecarenpapelabsorbentecercadeunmecherodentrodeuna cmaradeflujolaminar.Posteriormenteerancolocadoscuatrotrozosenforma equidistante en el medio anteriormente descrito. Paralashojascolocadasencmarahmeda,alobservarconidiassepasaba superficialmente un asa, con la cual se realizaba un estriado en placas con el mismo medio. 28Losaisladosseincubarona23Cencmaradecrecimientohastaobservarel crecimiento del micelio. Los patgenos obtenidos se purificaron a partir de repiques detrozosdehifasdesdeelmargendelascolonias.Unavezcrecidaslascolonias purificadas se describieron sus caractersticas y se conservaron en tubos de ensayo con agua estril a 5C. Dos placas por cepa fueron puestas bajo luz cercana a UV (luz negra) para estimular la produccin de conidias. 3.5.2. Recuperacin de aislados. A partir de los aislados 786, 787 y 911 guardados durante el ao 2003, clasificados comoSclerotiniasp.porpresentarmicelioblanco,esclerociospequeosdeforma elpticaynoproduciresporas,secomenzainvestigarlaposibilidaddeproducir apotecioenlaboratorio,utilizandolametodologapropuestaporGUTIERREZy SHEW(1995)conelfindecorrobarlapresenciadeestepatgenoyobtener ascosporas para su posterior inoculacin en las plantas. Losaisladosfueronrecuperadosdetubosdeensayosguardadosa5C,luego cultivadosenplacasconmediodecultivo(APDA)ycolocadosencmarade crecimientoa25C.Posteriormentefueronretiradosparacolocarlosatemperatura ambientehastaobservarlapresenciadeesclerocios.Unavezobtenidos,se dispusieronenfrascosconarenaesterilizadayhumedecidaconaguaestril.Se incubaron a 4C durante un mes. Posteriormente fueron transferidos a una cmara de crecimiento a 12C.

Los esclerocios puestos bajo estas condiciones, dieron origen a micelio y produccin de conidias, descartando la presencia de Sclerotinia sp., siendo reclasificados estos aislados como pertenecientes a la especie Botrytis elliptica. 293.5.3. Inoculacin en plantas de lilium. Luegodeaisladoslospatgenos,seprocediainocularplantassanasquefueron cultivadas en bolsas plsticas, a partir de bulbos previamente desinfectados, de las variedades Algarve, Wiener Blut, Gironde y Navona. El sustrato utilizado tambin fue previamente desinfectado. El control ambiental fue dado por la utilizacin de aire forzado obteniendo condiciones de temperatura entre 15 y 20C. La humedad relativa igual o superior al 90%, fue conseguida mediante aspersin de agua sobre las hojas, los pasillos y las paredes. Se inocularon seis cepas elegidas al azar, tres correspondientes a la especie B. cinerea (1010,1014 y 1016) y tres a la especie B. elliptica ( 786,787 y 911). Cada inculo fue preparado mediante el raspado de cinco placas por cepa, el que fue depositado en 600 ml de agua estril. Luego se agit por cinco minutos y se agrego una gota de Tween 20 para disminuir la tensin superficial del agua. El inculo se concentr a 1 x 106 conidias o propgulo (fragmentos de micelio)/ ml. Las plantas fueron inoculadas al azar. El ensayo se llev a cabo con 84 plantas en total, 21 plantas por variedad. Por cada variedad de lilium se inocularon tres plantas por cepa, dejndose tres plantas como testigo. Los patgenos fueron inoculados mediante un asperjador manual, rociando las plantas conunasuspensindeconidiasparaelcasodelascepasdeB.cinerea,yde fragmentos de micelio para el caso de las cepas deB. elliptica (debido a su dificultad para esporular invitro). Los testigos fueron rociados con agua estril. Luego de la inoculacin,lasplantasfueroncubiertasconunabolsaplsticadepolietileno transparente,cerrandoconelsticoalamacetaparaevitarelcontagioentre 30tratamientos y lograr un efecto de cmara hmeda. Estas se mantuvieron por 48 horas para ser posteriormente retiradas. Lasplantasfueronobservadasenformaperidica,conelfindemonitorearla aparicin de sntomas, realizando una evaluacin final de las plantas luego de tres semanas de inoculadas. La evaluacin se realiz usando una escala de ndice de dao distinta a la usada en el muestreo, ya que se observ mayor dao debido a que las condiciones eran favorables y la enfermedad se manifest con mayor expresin de sntomas (Anexo 4). 3.5.3.1. Anlisis estadstico. Elanlisisestadsticodelosdatosproporcionadosporlosresultadosdelas inoculaciones,sellevoacaboatravsdeunanlisisdevarianzamultifactorialusando un diseo completamente al azar (DCA). Para comparar entre tratamientos se realiz el testde Duncan para el nivel de significancia del 5 %. 3.5.4. Reaislamiento. Se debe reaislar el hongo de las plantas inoculadas siguiendo el mismo procedimiento del aislamiento anterior, para corroborar la presencia de las especies de Botrytis y su correspondiente identificacin. 3.5.5. Identificacin de cepas deBotrytis obtenidas: Para identificar las especies de Botrytis aisladas a partir de sntomas, se observ el color de la colonia, el tamao de las conidias, conidiforo y esclerocios y se compar con literatura. 31Por cada cepa se midi a travs de microscopio ptico ( 40 X) el largo y ancho de 50conidias y 10 conidiforos. Estos resultados se promediaron y se obtuvo el tamao por especie. En el caso de los esclerocios, fueron medidos 20 por cepa. 324.PRESENTACIN Y DISCUSIN DE RESULTADOS 4.1. Incidencia de Botrytis cinerea por variedad: Lapresenciade Botrytiscinereaenlasplantassemanifestenformadelesiones necrticas circulares, de un color caf oscuro a negro, encontrndose algunas con el caracterstico micelio grisceo. Al analizar la Figura 1, se observa que la presencia de la enfermedad ocurre en forma puntual durante el perodo comprendido desde abril a julio, sin presentar algn tipo de tendencia. Las variedades All Round y Tresor son las primeras en presentar la patologa durante laltimasemanadelmesdeabril.Lahumedadrelativamediaesdeun85%, condicindesfavorableparaprovocarinfeccin(LATORREyRIOJ A,2002, GOULD, 1963). Es probable que el patgeno hubiera entrado por heridas sufridas durantelaemergenciadelaplanta,yquelahumedaddeltejidofacilitesu germinacin y posterior penetracin. Luego de un mes sin presencia de la enfermedad, aparece en la variedad Valdisole, verificndose un aumento en las temperaturas mximas, aptas para la germinacin y eldesarrollodelmicelio.Asuvezlastemperaturasmnimasmediadescendieron, favoreciendolaesporulacindelmicelio,manifestndoseelpatgenodurantela semana siguiente en las variedades All Round y Black Out, registrndose condiciones ptimas para el crecimiento del micelio como para la germinacin de las conidias. 0510152025304 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 1ABRIL MAYO J UNIO J ULIOSemanas C ( T )0102030405060708090100% ( H.R.), % ( Incidencia)% Valdisole % Black Out % All Round % Tresor TMn. media sem. TMx. media sem. % H.R. media sem. FIGURA 1.Incidencia de Botrytis cinerea en plantas de lilium durante abril a julio de 2005. Olmu, V regin. Nuevamente ocurre un perodo sin incidencia, a pesar de presentar condiciones de temperaturaaptasparaesporulacin.Elfactordeterminanteeslahumedad relativa,quenolograsuperarel90%.Estaescontroladaenelprediomediante extractores de aire y la apertura de cortinas a travs de un sistema que permite regular la altura de las mismas permitiendo una ventilacin adecuada en cada momento. Laprimerasemanadejulioylaltimacorrespondientealmuestreoefectuado,se observa presencia en Valdisole y Black Out. La humedad relativa alcanza el mximo valordelperodo(93%),loquepuedeprovocarcondensacionesencimadela superficiefoliarestimulandolagerminacindeconidias(LATORREyRIOJ A, 2002). Adems, algunas flores antes de cosecha presentaron antesis y liberaron polen al ambiente, el que segn SALINAS etal. (1989) puede ser usado por B.cinerea como fuente nutritiva inicial. Elpatgeno,alserdenaturalezapolfagayactuarademscomosaprfito,puede provenir de mltiples focos. El predio se encuentra inserto en una zona de intensa produccinagrcola,dondelosdesechosdeloscultivosnosonmanejados correctamente para evitar la diseminacin. Sin embargo el intensivo uso de fungicidas permite un control eficiente de esta enfermedad, evidencindose en su nula incidencia durante el segundo perodo de muestreo. LapresenciadeB.cinereaesmuyparticularduranteeldesarrollodelcultivo.Es probable que la penetracin ocurriera a travs del dao provocado por el roce de las mallas de soporte y al pasar entre las mesas durante las labores propias del cultivo. La infeccinenlasvariedadesseobservaenperodosdiversos,alinicioconplantas pequeas y susceptibles a dao (All Round y Tresor), en un perodo intermedio entre vegetativoyaparicindeprimerasflores(Valdisole,AllRoundyBlackOut)y cercano al perodo de cosecha antes de antesis (Tresor, Black Out y Valdisole). 364.2. ndice de intensidad de dao de B. cinerea: El grado de ataque provocado por B.cinerea en hojas de lilium, fue de una a dos lesionesporhoja.Siseanalizanlosndices,seencuentranenunnivelbajo alcanzandoelmximovalorde3,3%enlavariedadBlackOut.Eldetalledelos ndices se encuentra el Anexo 5. Al analizar en forma conjunta la incidencia y el ndice de dao, es posible inferir que la enfermedad provocada por este patgeno no fue un problema significativo durante el perodo estudiado. 4.3. Incidencia de Botrytis elliptica en el cultivo: Durante el primer perodo observado no se detect su presenciaen el cultivo. Las condiciones de humedad relativa mayor al 95% favorables para la germinacin de las conidias slo se presentan al final del perodo (Figura 1). Adems las temperaturas mximas no descendieron de los 20 C, lo cual s ocurri durante el segundo perodo de evaluacin. De acuerdo a los sntomas observados en terreno y al posterior anlisis efectuado en laboratorio, este patgeno comenz su desarrollo entre la segunda y tercera semana de julio, pasando de un 0% de incidencia hasta alcanzar el valor mximo de 45% (Figura 2). Al observar los datos de humedad y temperatura mnima, se desprende que existi unacondicinpredisponenteduranteesasemanaparalagerminacindeconidias sobre las hojas y su posterior infeccin, observando perodos del da superiores al 95% de humedad relativa, con temperaturas mnimas que fluctuaron entre 3 y 8C, conunamnimamediade5C. 0510152025302 34 1 2 3 4 1 2 3 4 5J ULIO AGOSTO SEPTIEMBRESemanasC ( T)0102030405060708090100% ( H.R ), % (Incidencia)INCIDENCIA (%) T Mn. media sem. T Mx. media sem. H.R. media sem. FIGURA2.IncidenciadeBotrytisellipticaencultivodeliliumbajoinvernadero,Olmu,julioaseptiembrede20La variacin de las condiciones entre la semana anterior y en la cual se observ la lesin es muy notoria, visualizndose claramente un descenso en la temperatura. Al analizar detenidamente estos datos, se deduce que debi haber condensacin sobre las superficies de las hojas. Estas condiciones contribuyeron a formar una pelcula de aguaquejuntoatemperaturasquebordeanlos15favorecenlagerminacinde conidias (GOULD, 1963). Lastemperaturasmximasmayoresal20Cdurantealgunashorasdelda, favorecieronelposteriordesarrollodelaenfermedadyaqueelpatgenounavez ingresado a la planta crece mejor a 21C (GOULD, 1963). Lasprobablesfuentesdeinfeccinpuedenseresclerociosoriginadosdurantela temporada anterior, que permanecen en el suelo de los alrededores, en los pasillos o enpotreroscercanos.Adems,algunosrestosdelcultivoerandepositadoen quebradas cercanas, y al encontrar condiciones adversas el micelio produce este tipo deestructurasderesistencia.Lasbajastemperaturasylaaltahumedadrelativa invernaldadaporlaslluvias(mayoral90%)fueradelosinvernaderos,permiten suponerquelosesclerociosencontraronlascondicionesparaesporular,yestas conidias lograron ser diseminadas por el viento (VAN DEN ENDE y PENNOCKVOS, 1997). La diseminacin de las conidias dentro el invernadero es probable que se produzca a travsdelmovimientodeairequeocurreallevantarlascortinasparabajarla humedad relativa ( HUANG et al., 2001). Al igual que B.cinerea, las conidias tienen una fuente nutritiva al contar con polen proveniente de los cultivos anteriores que se encuentran en perodo de cosecha. A pesardequelavarasecosechaenbotncerrado,algunasfloresabrenantesde 39tiempo, liberan el polen que se dispersa por el viento y se deposita en la superficie de las hojas de plantas cercanas. En forma general, se observa un descenso paulatino durante el perodo comprendido entre julio y septiembre, debido probablemente a la aplicacin semanal y rotacin de tratamientos qumicos que frenan el desarrollo del hongo. Sin embargo, a medida que sedesarrollaelcultivopresentaunamayorreafoliarqueimpideelingresode productos a zonas ms bajas. Durantelasprimerassemanasdeagostoseobservaundescensodeun10%de incidenciarespectoalmesanterior,dadoprobablementeporunaumentodelas temperaturas mnimas que impidieron la formacin de pelculas de agua permanentes para la germinacin de conidias. Se registr un leve aumento de la incidencia durante latercerasemana,condicindadaporunaumentodelastemperaturasmnimas medias de las semanas anteriores, observndose adems un aumento de la humedad conrespectoalasdosprimerassemanas,pasandodeun88aun91%promedio semanal, lo que favorece la germinacin de conidias que no alcanzaron a germinar en juliooprobablementeaunnuevociclodeinfeccindadoporlaformacinde conidiforos sobre las lesiones anteriores (GOULD, 1963). Enelmesdeseptiembre,durantelaprimerasemanasemantienelatendenciade agostoapesardequelatemperaturamximadescendiconsiderablementeyla humedad relativa media alcanz su mximo valor (94%). En las ltimas semanas se distingueunaumentoprogresivodelatemperaturayundescensodelahumedad, coincidiendo con las mnimas incidencias. Estas condiciones son muy distintas a las que dieron origen a la infeccin. Cabedestacarquenoseencontrsntomasenfloresotallos,solamenteenhojas principalmente en lamitad superior de la planta. 404.4. ndice de intensidad de dao de B.elliptica: En forma general, la intensidad de dao de B. elliptica, al igual que su incidencia, va disminuyendo durante el perodo. Analizando los datos (Anexo 6), es posible inferir quelaenfermedadnoafectalaplantaenformaagresiva,alcanzandoenforma general una a dos lesiones presentes en la hoja, encontrndose en forma puntual el ndice 2 (tres a seis lesiones por hoja) al inicio del perodo, momento en el cual se encontraban las condiciones ambientales favorables para su desarrollo. No se encontraron plantas con ms de siete lesiones y que comprometieran el estado generaldelaplanta,ycomosesealanteriormente,debidoalfuerteusode pesticidas para frenar las enfermedades y lograr una mejor calidad de la vara. 4.5. Incidencia de Botrytis elliptica por variedad: DeacuerdoalaFigura3,lasvariedadesmsafectadascorrespondenaAlgarve, WienerBlut,Menorca,MadridyUmbra.Cabedestacarqueestasvariedades presentan un ancho de hoja mayor que las otras variedades, lo que permite captar una mayorcantidaddeinculo,ademsdedificultarlaventilacin,originando condiciones favorables para la presencia de agua libre sobre su superficie. Latendenciapresentada enlasvariedadesNavonayGirondeesnotoriamente diferente.Existeunamenorincidenciaalcomienzodelainfeccin,laquese mantieneconstantehastalaausenciadesntomasalfinaldelperodo.Espreciso sealar que sus hojas son de forma alargada y con inclinacin de los pices hacia el suelo, lo que dificulta la permanencia de gotas de agua necesarias para la germinacin de las conidias (GOULD,1963). Esto adems favorece una ventilacin ms adecuada enzonasbajas. 0510152025302 34 1 2 3 4 1 2 3 4 5J ULIO AGOSTO SEPTIEMBRESemanasC ( T)0102030405060708090100% ( H.R ), % (Incidencia)NAVONA UMBRIA GIRONDE MENORCAW. BLUT MADRID ALGARVE B. OUTT Mn. media sem. T Mx. media sem. H.R. media sem. FIGURA 3.Incidencia de Botrytis elliptica por variedad en cultivo de lilium. J ulio a septiembre 2005. Olmu,V reginAdiferenciadeAlgarveyUmbra,yusandolamismadensidaddeplantacines posible divisar el suelo desde la parte superior ya que las variedades anteriormente mencionadasformabanunabarreraquedificultabaelpasodelaire,ymantenael suelo hmedo luego de los riegos. BlackOut,nicavariedadcultivadaenambosperodosdemuestreo,nopresent sntomas asociados a este tipo de enfermedades. 4.6. ndice de intensidad de dao por variedad: Las variedades Algarve, Menorca y Wiener Blut presentan su mayor ndice de dao (Figura4)enelmomentoenqueocurrelamayorincidenciadelperodo(tercera semanadejulio).Estastresvariedadesalcanzanhastaseislesionesporhoja, disminuyendo considerablemente el rea fotosinttica. La tendencia observada es una disminucin de este ndice a medida que se aproxima la cosecha. El mayor ndice lo presentaWienerBlutalcanzandoel35,4%.Aligualcomosemencionenla incidencia,estasvariedadespresentanunamayorsuperficieporhojayunagran cantidad de follaje que favorece al patgeno para encontrar una pelcula de agua para germinar y provocar infeccin. EnelcasodelavariedadesMadrid,NavonaUmbrayGironde,elndicevara durante el perodo o se mantiene constante, no presentando una tendencia general. En estasvariedadeselgradodeataquealcanzunaadoslesionesporhoja. 0510152025302 34 1 2 3 4 1 2 3 4 5J ULIO AGOSTO SEPTIEMBRESemanasC ( T)0102030405060708090100% ( H.R ), % (Indice de dao)NAVONA UMBRIA GIRONDE MENORCAW. BLUT MADRID ALGARVE B. OUTT Mn. media sem. T Mx. media sem. % H.R. Media sem. FIGURA4.ndicededaodeBotrytisellipticaporvariedadduranteelcultivodelilium.J ulioaSeptiembre2005. Olmu,Vregin.4.7. Identificacin de cepas obtenidas: Los aislados anteriores (786,787 y 911) y los encontrados en el predio de Olmu, fueron identificados a travs de caractersticas proporcionada por literatura, poniendo nfasisalasestructurasreproductivascomotamaodeconidias,tamaodel conidiforo, tamao de los esclerocios. Adems se estudiaron las caractersticas de la colonia y sintomatologa observada en terreno como la realizada en las pruebas de patogenicidad. Laexaminacinmicroscpicadelascaractersticasmorfolgicasylaobservacin visualdelascoloniascrecidasenmediodecultivo,permitieroncorrobarquelas cepasaisladasduranteelprimerperododemuestreocorrespondenalaespecie Botrytis cinerea (Anexo 7). Las caractersticas de la lesin provocada en la hoja, las caractersticas de la colonia y de los esclerocios permitieron identificar como Botrytis elliptica a las cepas aisladas duranteelsegundoperodo(Anexo7).Estascepasnolograronesporulardadasu dificultaddeproducirconidiasinvitro,inclusosometindolasalosmismos tratamientos de luz UV-A de B. cinerea. Las cepas 786, 787 y 911 lograron producir conodiforos y conidias luego de colocar hojas con lesiones, obtenidas de las pruebas de patogenicidad, en cmaras hmedas. 4.7.1. Color de la colonia LascoloniasdeB.cinereacultivadasenmedioAPDApresentaronunmicelio blanquecino que luego de colocarlas en luz negra (UV-A, 320 nm) se torn grisceo y cafgrisceo(Figura5c).Estacaractersticaconcuerdaporlodescritoporla descripcin n 431 del CMI (1974). Por su parte, las colonias de B. elliptica tiene 45aspectoalgodonoso,conmiceliodensocreciendosobrelasuperficiedelagar,de color blanco sin cambio aparente luego del tratamiento de luz (Figura 5d). stas no presentaron color grisceo como lo observado por CABRERA, ALVAREZ y SOSA (2005).Esprobablequelafaltadecoloracinseadebidoaquenodesarroll estructurasreproductivasenlasplacas,debidoasudificultadparaesporularbajo condiciones de laboratorio, segn lo observado por DOSS, CHASTAGNER y RILEY (1984). 4.7.2. Caractersticas de estructuras reproductivas Las conidias de B.cinerea se observaron lisas, de forma oval. Miden en promedio 10,05 m de largo y 6,27 m de ancho. Los conidiforos de 10 cepas fueron medidos al microscopio ptico, encontrando un promedio de 1.422 m largo y de 11,6 m de ancho. Los conidiforos se presentan en forma libre y ramificados. (Figura 5a). Las dimensiones de ambas estructuras se encuentran dentro de los rangos presentados por la descripcin n 431 del CMI (1974). Lasconidiasde B.ellipticaseobservarondeformaelipsoideaovoide,de dimensiones23,7mdelargopromedioyde16,5mdeanchopromedio.Los conidiforos de Botrytis elliptica presentan 955 m de largo y 86 m de ancho. Estos seencuentranpocoramificadosenlosextremos(Figura5b).Estascaractersticas concuerdanconlainformacinpresentadaporDOSS,CHASTAGNERyRILEY (1984), para describir esta especie.46 FIGURA5.a) Conidiforo y conidias de Botrytis cinerea. Barra =20 m. b) Conidiforo y conidias de Botrytis elliptica. Barra =20 m. c)Colonia correspondiente a Botrytis cinerea, luego de 6 das puesta bajo luz negra. d) Colonia de Botrytis elliptica, expuesta a la misma condicin.474.7.3. Caractersticas del esclerocio. Los esclerocios de B. cinerea son de color negro, de forma y tamao irregular, miden de 3 a 5 mm de dimetro, promediando 3,85 mm. Estas dimensiones concuerdan con las observadas por HSIANG y CHASTAGNER (1992). Se les encuentra aglomerados o creciendo en forma individual. Los esclerocios de B. elliptica son de forma redondeada y elptica, de color negro, en su mayora creciendo en forma individual, de 1 a 2 mm de dimetro. El promedio es de 1,49 mm. Las dimensiones tambin concuerdan con lo observado por HSIANG y CHASTAGNER ( 1992). 4.8. Pruebas de patogenicidad:

4.8.1. Sntomas observados Luegodedosdas,lasplantasinoculadasconB.ellipticacomenzaronamostrar sntomas en el envs de la hoja, con presencia de manchas de un color caf oxidado a naranjo,ydeformaalargada(Figura6c).Posteriormenteenelhaz,secoloc traslcidalazonaafectada.EstesntomatambinfueobservadoporVAN BAARLEN, STAATS y VAN KAN, 2004. Esa lesin evolucion hasta colocarse de colorcafoxidado,alcanzandoentre1a2cmdelargoy0.5cmdeancho.Sin embargo, algunas hojas mantuvieron la mancha traslcida y en otras qued un orificio en el lugar de la infeccin. El sntoma caracterstico de la lesin necrtica, se observa primero en la variedad Algarve,lacualpresentalesionesdeformaalargadaenlashojassuperiores,que luego de seis das comenzaron a expandirse. Estos mismos sntomas se observaron en las variedades Gironde, Wiener blut y Navona luego de 10 das. 48 FIGURA6.a)LiliuminfectadoporBotrytisellipticaduranteelsegundoperodo. b) Lesiones necrticas presentadas en var. Algarve en las pruebas de patogenicidad.c)SntomainicialdeB.ellipticaobservadoenelenvs.d)Manchasnecrticas puntiformes asociadas a B.cinerea en hojas de liliumartificialmente inoculadas. 49A los 20 das de inoculacin, dos plantas de la variedad Algarve inoculadas con las cepas 786 y 911 presentaron marchitez total de la planta, con hojas y tallos secos donde se aprecian en forma muy ntida de un color ms oscuro el lugar de las lesiones inicialesylosanillosconcntricos.Lasdemsvariedadespresentansloalgunas hojasconlesionesquealextenderseseunan,provocandomarchitesyposterior desecamiento ( Figura 6b). En las plantas inoculadas con B. cinerea, se observaron lesiones muy puntuales, de un color caf oscuro de no ms de un cm, no extendidas y en menor nmero que las generadas por B. elliptica. Un sntoma muy distintivo fue observado en el envs de la hoja,lacualpresentabapuntuacionessuperficialesdecolornegro,queluegode aislarlas en APDA confirmaron la presencia de este patgeno (Figura 6d). Gironde y Navona adems de presentar las lesiones caractersticas, manifestaron en las hojas inferiores estras amarillas continuas a la lesin, observadas anteriormente por DOSS, CHASTAGNER y RILEY(1988). 4.8.2. Evaluacin de la enfermedad. Luego de 20 das se evaluaron las plantas. Los datos obtenidos fueron sometidos al anlisis estadstico correspondiente para demostrar la capacidad patognica de ambos tipos de Botrytis. Al ser reaisladas las cepas de ambas especies de Botrytis desde las plantas inoculadas, stas mantuvieron las mismas caractersticas de los aislados originales. Mediante esta comparacinsecumplenlospostuladosdeKOCH,conlocualselograislare identificarlasespeciesBotrytiselliptica(cepa786,787y911)yBotrytiscinerea (cepa1010,1014y1016)comocausantesdeenfermedadenliliumcultivadosen invernaderos de la zona de Olmu. 50Todas las plantas inoculadas con B. elliptica originaron sntomas de lesin expansiva y necrtica, en mayor o menor grado, por lo cual se reconoce como hongo capaz de provocar enfermedad en cultivares asiticos de Lilium sp. Las cepas de B. cinerea, a diferencia de B. elliptica, no lograron ser patognicas para todas las plantas, lo que sumado a la baja incidencia en el muestreo realizado (Figura 1),sereconocecomounpatgenopocoagresivo,perocapazdeprovocar enfermedad. Las plantas testigos permanecieron sanas durante el ensayo. Segn el anlisis de varianza existe interaccin entre la cepa de Botrytis y la variedad en el desarrollo de la enfermedad. Si se compara el efecto de ambas patgenos, se distingue claramente un mayor dao de B. elliptica por sobre B. cinerea (Figura 7). Segnlosresultadosdelaspruebasdepatogenicidad,Wienerblutnopresent diferencias significativas de acuerdo a la cepa deB.elliptica. inoculada. LavariedadAlgarveseviomsafectadaqueNavona,independientedelacepa utilizada. Las otras variedades tuvieron diferentes efectos dependiendo de la cepa. Es importante mencionar que no se tienen antecedentes a nivel bibliogrfico de la susceptibilidadotoleranciaaB.elliptica.delasvariedadesempleadas. acdahh h hfg fgdehhh hcdbcdabcdfgh fghghhabcefabhh hh01234567Test 1016 1014 1010 911 787 786TratamientosEscalaALGARVENAVONAW.BLUTGIRONDE FIGURA7.ndicededaoobservadoenlaspruebasdepatogenicidad.Letrasdistintasindicandiferencias estadsticamentesignificativas,al5%,segnDuncan.5.CONCLUSIONES Deacuerdoalaspruebasdepatogenicidadefectuadas,sedemuestraqueBotrytis cinerea y Botrytiselliptica son patgenos capaces de generar enfermedad en lilium cultivados en invernaderos, aunque los aislados correspondientes a la especie Botrytis elliptica son los que provocan un mayor dao. Conforme al estudio epidemiolgico realizado, la incidencia de Botrytiselliptica se inici en el mes de julio, desarrollndose la enfermedad hasta septiembre, en cultivos bajo invernadero fro ubicados en Olmu, V regin. La incidencia mxima alcanzada fue de un 45%, la que ocurri en el mes de julio, asociadas a temperaturas mximas inferiores a los 20C y humedades relativas superiores al 90%.La especie Botrytis cinerea aparece en forma dispersa durante el perodo comprendido entre abril y julio, con un nivel de de incidencia mxima de un 10%. 536.RESUMEN Durante el ao 2003, se observaron lesiones necrticas en hojas de lilium cultivados bajo invernadero fro en la zona de Olmu, V regin. En la presente investigacin, los aislados producidos y conservados en ese perodo fueron recuperados para determinar supatogenicidad..Almismotiemposerealizarondosmuestreosentreabrily septiembreenlamismazonaparadeterminarlaincidenciaendicededao provocada por el patgeno. Esto se relacion con la temperatura y humedad relativa presente en el invernadero. La identificacin de los aislados obtenidos se realiz comparando las caractersticas con literatura. Esto permiti corroborar la presencia de BotrytiscinereayBotrytis elliptica. Botrytiscinereasedetectsloduranteelprimermuestreo(abril-julio),enforma puntual y sin presentar algn tipo de tendencia. De los resultados de la incidencia e ndicededao,sedemuestraqueBotrytiscinereanoafectasignificativamenteal cultivo.Porelcontrario,Botrytiselliptica,nosepresentenelprimermuestreo, apareciendoenelmesdejulio.Laincidenciayelndicededaodisminuyena medidaquetranscurreelmuestreo,debidoaquevaranlascondicionesde temperatura y humedad relativa. Para realizar las pruebas de patogenicidad, se eligieron los aislados 1010,1014 y 1016 correspondientesaBotrytiscinerea,y786,787y911correspondientesaBotrytis elliptica,loscualesfueroninoculadosenlasvariedadesAlgarve,WienerBlut, GirondeyNavonacultivadasbajocondicionesambientalescontroladas.Escasas plantas mostraron sintomatologa asociada a Botrytiscinerea. Todas las variedades presentaron, en distintos grados, lesiones asociadas a Botrytis elliptica. De acuerdo al anlisis efectuado, se concluye que ambos patgenos son capaces de generar enfermedad en plantas de lilium cultivados en invernadero, pero la especie Botrytis elliptica es la que provoca un mayor dao al cultivo.

547.ABSTRACT During the year 2003, necrotic lesions were observed on lily (lilium sp.) leaves,from plants cultivated an unheated greenhouse, in Olmu, 5th Region, Chile. In thisstudy, isolatesthatwerecollectedandstoredwerethenre-introducedtodeterminetheir pathogenicity. In the same area, between April and September, two samplings were done to determine the incidence and damage levels provoked by the pathogens. These werethanrelatedtothetemperatureandrelativehumidityconditionsofthe greenhouse. The identification of the isolates was done by comparing their characteristics with previousdescriptionsfromtheliterature,thuspermittingtoconfirmationofthe presence of Botrytis cinerea and Botrytis elliptica. Botrytis cinerea was detected only inthefirstsampling(April-J uly),anddidnotshowapattern.Theresultsofthe incidence and damage index show that Botrytis cinerea did not significantly affect the lilies. On the other hand Botrytisellipticawas not present in the first sampling; it appeared in the month of J uly. The incidence and damage index diminished over the sampling time, due to the variability of temperature and relative humidity conditions. The Botrytiscinerea isolates 1010,1014 and 1016,andBotrytis elliptica 786, 787, and 911, were chosen for inoculating the lilyvarieties Algarve, Wiener Blut, Gironde and Navona cultivated under controlled environmental conditions. Few plants showed thesymptomatologyassociatedwithBotrytiscinerea.Allofthevarietieshad,in varying degrees, lesions associated withBotrytis elliptica. As a result of these analyses, it was concluded that both pathogens are capable of producingdiseaseingreenhouses-grownlilies,buttheBotrytisellipticaspecies provokes greater damage in this crop. 558.LITERATURA CITADA AGRIOS, G.1996.Fitopatologa.2a.ed.Mxico, D. F., Limusa.838p. ALEXOPOULOS, C.1966.Introduccin a la micologa.2a.ed.Buenos Aires, Universitaria. 615p.

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