Légúti infekciót okozó baktériumok terápiás hatékonyságot befolyásoló rezisztenciáinak és

rezisztencia mechanizmusainak vizsgálata

Doktori (PhD) értekezés tézisei

Dr. Hajdú Edit

Témavezetők: Dr. Nagy Erzsébet Dr. Vágvölgyi Csaba

Szegedi Tudományegyetem Biológia Doktori Iskola Vezető: Prof. Dr. Maróy Péter

Szegedi Tudományegyetem Szent-Györgyi Albert Orvos és Gyógyszerésztudományi

Centrum Általános Orvostudományi Kar

Klinikai Mikrobiológiai Diagnosztikai Intézet

Szeged

2007

2/24

3/24

BEVEZETÉS A baktériumok okozta légúti fertőzések az infekciózus kórképek között a

legnagyobb számban fordulnak elő. Kezelésük sokszor jelent terápiás nehézséget,

mert a különböző típusú rezisztencia mechanizmusok révén a légúti infekcióban

szerepet játszó baktériumok egyre több antibiotikum hatásával szemben válnak

ellenállóvá.

A Streptococcus pneumoniae törzsek tok polysacharid antigén alapján 90

különböző szerotípusba sorolhatók. Az egyes szerotípusokkal szemben termelődött

specifikus ellenanyag véd az azonos szerotípusú tok polysachariddal rendelkező

baktérium által okozott invazív infekciótól. A kifejlesztett védőoltásoknak ez az

alapja.

A S. pneumoniae korábban 100%-ban érzékeny volt penicillinre. A

penicillin célmolekulája a baktérium citoplazma membránjában elhelyezkedő fehérje

– penicillin binding protein (PBP) -, amely transzpeptidáz, transzglikoláz működése

révén a sejtfal peptidoglikán szintézisében játszik szerepet. A penicillin

irreverzibilisen kötődik a PBP-ekhez, ezáltal inaktiválja azokat. A PBP-k szintézisét

mozaik gének irányítják, így a változás mértékétől függően létrejöhet alacsonyabb és

magasabb szintű penicillin, valamint amoxicillin és 3. generációs cefalosporinokkal

szembeni rezisztencia. A pneumococcus okozta infekciókban ma már nem a

penicillin-G az első választandó antibiotikum, de in vitro nagyon jól reprezentálja a

béta-laktám antibiotikumokkal szembeni érzékenységet. Az egészséges emberek közel

50%-a tünetmentesen hordozza a baktériumot a nasopharynxban, elsősorban

kisgyermek korban. A vírusfertőzés fokozza a baktérium kötődését a légúti hámhoz.

A nasopharynxból a baktérium a belélegzett levegővel az alveolusokba kerül, ahol

tova terjed és gyulladást okoz. Az alsó légúti infekciók, elsősorban a közösségben

szerzett pneumónia leggyakoribb kórokozója még ma is a S. pneumoniae. Amerikai

felmérések szerint a pneumococcus fertőzések miatt elhunytak fele megmenthető

volna a pneumococcus ellenes vakcinák széleskörű alkalmazásával. Számos európai

ország, így hazánk is, kidolgozta a saját vakcinációs politikáját a pneumococcus

fertőzések megelőzésére.

Lélegeztetett és cysticus fibrosisban (CF) szenvedő betegeknél a

Pseudomonas aeruginosa okozta pneumónia kialakulásában meghatározó szerepe van

a baktérium biofilm képző tulajdonságának. Az antibakteriális gyógyszerek a

szervezet saját védekező mechanizmusa nélkül nem képesek fellépni a kórokozók

ellen. A biofilm mögé bújt baktériumok gyakran még a fagocitákkal szemben is

4/24

ellenállóak. A kezelés hatékonyságának biztosításához szükséges a biofilm képzés

csökkentése, vagy a biofilm roncsolása. Egyes makrolid antibiotikumok bizonyítottan

hatékonyak a pseudomonasok alginát produkciójának visszaszorításában, amelyet

kiegészítő kezelésként alkalmaznak a CF-es betegek kezelésében. A multirezisztens

törzsek okozta infekciók kezelése sokszor megoldhatatlannak látszó feladat.

A Klebsiella pneumoniae, az Enterobacter aerogenes és Enterobacter

cloacae, az Escherichia coli, a Serratia marcescens és a Pseudomonas aeruginosa a

leggyakrabban kórházi eredetű pneumóniát okozó Gram-negatív baktériumok. A béta-

laktám antibiotikumok túlzott használatával egyre gyakrabban izolálnak klinikai

mintákból széles spektrumú béta-laktamázt termelő törzseket. A súlyos infekciók

mortalitása igen magas, 50-100% között van, ezért igen fontos ismerni adott esetben a

terápiás lehetőségeket, az egyes osztályokon az ott infekciót okozó baktériumok

pontos spektrumát és antibiotikum rezisztenciáját.

CÉLKIT ŰZÉSEK

1. Munkánk egyik célja az Intézetünkben 1997-2005 között izolált S. pneumoniae

törzsek rezisztencia adatainak elemzése volt korcsoportonként, mintánként, járó-

és fekvőbetegek szerint. A tünetmentes óvodások pneumococcus

orrhordozásáról adatokat kívántunk gyűjteni. Választ kerestünk arra, hogy az

Intézetünkben random gyűjtött S. pneumoniae törzsek szerotípusa milyen

arányban esik egybe a hazánkban forgalomban lévő pneumococcus elleni

védőoltásokban található szerotípusokkal, így a védőoltás alkalmazása várhatóan

milyen hatékonyságot eredményezhet. A penicillinre magas rezisztenciát mutató

törzseknél vizsgáltuk egy új, orális 3. generációs cefalosporin, a cefditoren-

pivoxil hatékonyságát, mint a penicillinre rezisztens pneumococcusok által

okozott fertőzések egyik potenciális kezelési alternatíváját.

2. Célunk volt vizsgálni és követni a cysticus fibrosisban (CF) szenvedő betegek

légutait kolonizáló ismert patogén baktériumok előfordulási arányát a Szegedi

Gyermekkórház Cystás Fibrosis Ambulanciáján gondozott betegeknél 1999-

2001 között. Olyan könnyen alkalmazható detektáló rendszert kívántunk

beállítani, amellyel a cysticus fibrosisos betegek légúti mintáiból izolált P.

aeruginosa törzsek biofilm képzését, továbbá a baktériumok tenyészetében in

vitro körülmények között a makrolid antibiotikumok biofilm képzést csökkentő

hatását mérni tudjuk.

5/24

3. Az SZTE ÁOK Belgyógyászati Intenzív Osztályán alsó légúti infekció miatt

kezelt betegek különböző módon vett mintáiból kitenyészett baktériumok

egyezőségét vizsgáltuk az optimális mintavételi mód meghatározása céljából. A

nozokómiális alsó légúti infekciókból származó mintákban az

Enterobacteriaceae családba tartozó Gram-negatív baktériumok, valamint

ugyanezen esetekben a széles spektrumú béta-laktamáz termelés előfordulási

arányát kívántuk meghatározni.

4. A Gram-negatív légúti patogén baktériumok multirezisztens törzseivel szemben

potenciálisan hatékony, szinergista antibiotikum kombináció lehetséges

alkalmazása céljából vizsgáltuk különböző módszerekkel a béta-laktám/béta-

laktamáz gátló, béta-laktám/fluorokinolon, béta-laktám/aminoglikozid

antibiotikumok együttes hatását.

5. A potenciálisan légúti patogén Gram-negatív baktériumok rezisztencia

mechanizmusait kívántuk tanulmányozni hagyományos és molekuláris

módszerekkel.

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

Baktérium törzsek

A 35 tünetmentesen hordozott S. pneumoniae törzs 3-6 éves óvodás gyermekek

nasopharyngeális mintáiból származott, 93 törzset korábban a Heim Pál Kórház

betegeinek mintáiból izoláltak. A többi vizsgált S. pneumoniae törzset különböző

tünetekkel rendelkező betegek felső és alsó légúti mintáiból, hemokultúrából,

liquorból, mellűri punktátumából tenyésztettük ki Intézetünkben.

A vizsgált Gram-negatív pálcák közül a P. aeruginosa törzsek cysticus

fibrosisban szenvedő gyermekek felső és alsó légúti mintáiból származtak, a K.

pneumoniae, E. aerogenes, E. cloacae, S. marcescens törzsek klinikai izolátumok

voltak, melyeket elsősorban alsó légúti mintákból tenyésztettünk ki.

Mintavételi módszerek

A tünetmentes óvodások surveillance vizsgálata során nasopharynxból származó

mintákat, a CF-es betegek esetében torokváladék és köpet mintákat tenyésztettünk. Az

alsó légúti minták közül a köpetet előzetes citológiai megfelelés után (>25 fehérvérsejt

és <10 laphámsejt/látótér 100x-os nagyítással vizsgálva legalább 40 látóteret)

dolgoztuk fel. A lélegeztetett betegek trachea váladékát citológiai vizsgálat

eredményével is kiegészítettük. A szignifikáns baktériumszám >105 telepképző

6/24

egység/ml (colony forming unit-CFU/ml). A lélegeztetett betegekből származó védett

bronchoalveolaris lavage minta esetén a szignifikáns baktériumszám >103 CFU/ml.

Kis számban származtak a baktériumok pleurális punktátumból és hemokultúrából is.

A Streptococcus pneumoniae törzsek szerotipizálása

A S. pneumoniae törzseket specifikus antiszérumok alkalmazásával, agglutinációs

módszerrel (Mast Group Ltd. Bootle UK) szerotipizáltuk a gyártó utasításainak

megfelelően.

Antibiotikumokkal szembeni rezisztencia meghatározások

Az antibiotikum érzékenységet rutinszerűen korondiffúziós módszerrel vizsgáltuk. A

minimális gátló koncentrációt (minimum inhibitory concentration – MIC) egyrészt E-

teszttel (AB Biodisk), másrészt agardilúciós módszerrel, valamint mikroleves

hígítással határoztuk meg.

Antibiotikum rezisztencia mechanizmusok vizsgálata

A béta-laktamáz termelést nitrocefin tartalmú koronggal (Difco) mutattuk ki. A béta-

laktamáz termelő törzsek szubsztrát profiljának meghatározását mikrokolorimetriás

módszerrel, Escamilla szerint végeztük. Az enzim indukciós vizsgálatokhoz

korongdiffúziós módszert alkalmaztunk. Indukáló antibiotikumok: cefoxitin,

imipenem. Indikátor antibiotikumok: cefuroxim, cefoperazon, cefotaxim, ceftazidim. A

széles spektrumú béta-laktamáz (extended spectrum beta-lactamase-ESBL) termelés

korongdiffúzióval történő kimutatásához egyrészt két korongot (screening) (ceftazidim

és amoxicillin/klavulánsav), másrészt öt korongot (ceftazidim, cefotaxim, aztreonam,

cefepim és amoxicillin/klavulánsav) alkalmaztunk Jarlier és munkatársai szerint. Az

ESBL termelés E-teszttel való kimutatása során ceftazidim/ceftazidim-klavulánsav,

vagy cefotaxim/cefotaxim-klavulánsav tartalmú E-teszteket alkalmaztunk. Az ESBL

termelés molekuláris szinten történő vizsgálatához a K. pneumoniae, E. cloacae és S.

marcescens törzsekből a plazmid DNS-t Magic Miniprep DNA Purification Kittel

(Promega, Medison, WI) extraháltuk. Az elektroforézist 0, 7%-os agaróz gélen

végeztük, a gélt ethidium bromiddal festettük. A plazmid DNS TEM és SHV génjeit

TEM és SHV specifikus primerekkel amplifikáltuk. Az SHV gének egyes típusainak

elkülönítésére SSCP (single-stranded conformation polymorphism) analízist

alkalmaztunk. Az amplifikált terméket PstI enzimmel emésztettük, majd polyacrylamid

7/24

gélen szeparáltuk ismert SHV gén standardokkal együtt. Az ssDNS fragmenteket ezüst

nitráttal festettük.

Szinergizmus vizsgálatok

A cefoperazon - béta-laktamáz gátló (szulbaktám, klavulánsav) kombinációkat Lorian

leírása szerint chequerboard titrálással vizsgáltuk 96 lyukú Takátsi-féle mikrotitráló

lemezben. A kombináció nélküli és a kombinációban mért MIC értékekből kiszámoltuk

a frakcionális gátló koncentráció (fractional inhibitory concentration - FIC) indexet,

majd a kapott eredményt értékeltük. Az „ölési görbe” (killing curve) módszerrel a

cefoperazon 1xMIC, 2xMIC értékének megfelelő koncentrációjának a hatását önállóan,

valamint 1 mg/l klavulánsavval, 1mg/l ill. 16 mg/l szulbaktámmal kombinálva

vizsgáltuk. A tenyészeteket Ehrlen-Mayer lombikban rázatva inkubáltuk 37oC-on,

normál atmoszférán. Csíraszám meghatározást végeztünk minden tenyészetből 6 és 24

óra múlva. A kapott ml-kénti csíraszámok 10-es alapú logaritmusát az idő

függvényében ábrázoltuk. Az E-teszttel végzett szinergizmus vizsgálatok esetében a

vizsgált baktériumok friss tenyészetéből 0,5 McFarland sűrűségű szuszpenzióval

baktérium szőnyeget készítettünk. A Mueller-Hinton agar lemezre először a

kombináció „A” tagját, majd 30 perc elteltével az „A” csíkot eltávolítva a „B” tagot

tettük fel. Egy másik lemezen az antibiotikum csíkokat fordított sorrendben helyeztük

fel. A lemezeket 16-24 óráig 37oC-on, normál atmoszférán inkubáltuk. Az

antibiotikumok MIC értékét külön-külön és kombinációban is meghatároztuk. Az

egyedi és a kombinációban alkalmazott antibiotikumok esetén meghatároztuk a FIC

indexet és értékeltük a kombinációk hatását.

Biofilm termelés vizsgálat

A CF-es gyermekek légúti mintáiból izolált, vizuálisan is mucoid P. aeruginosa

törzsek biofilm termelését mértük Enzym-Linked Lectinsorbent Assay (ELLA)

módszerrel Leriche leírása szerint. A jól detektálhatóan biofilmet termelő törzseknél

vizsgáltuk a biofilm termelés gátlását clarithromycin hozzáadásával. Ennél a

vizsgálatnál Leriche módszerét úgy módosítottuk, hogy a tápfolyadékban

clarithromycint oldottunk 50, 100, 200, 300, 400 mg/l végső clarithromycin

koncentrációt létrehozva. A naponkénti tápfolyadék csere után peroxidázzal jelölt

lektint mértünk a kitapadt baktériumokra, majd meghatároztuk a biofilm termelés

változását ELLA módszerrel a kezeletlen törzshöz viszonyítva.

8/24

Direkt E-tesz vizsgálat CF-es betegek köpetmintáinak primer tenyészetén

A romló klinikai állapotú CF-es betegek köpetéből cytológiai vizsgálatot és mucolizist

követően 100 µl-nyi mintát véres agar táptalajra plétoltunk, majd antipseudomonas

hatású antibiotikumokat tartalmazó E teszteket helyeztünk fel. A lemezeket 16-24

órán át inkubáltuk 37 oC-on, normál atmoszférán. Vizsgáltuk a kísérő garatflóra

érzékenységét az antibiotikumokkal szemben, valamint a különböző MIC értékkel

bíró P. aeruginosa telepek és egyéb, multirezisztens baktériumok jelenlétét.

Antibiotikum fogyás meghatározása

1998 és 2005 között vizsgáltuk a béta-laktám antibiotikumok [anatómiai-kémiai–

terápiás - Anatomical - Therapeutic - Chemical (ATC) kódja: J01C] és a makrolid,

linkózamid [J01F] csoportba tartozó antibiotikumok fogyását Csongrád megyében és

országosan. Az éves antibiotikum felhasználási adatok forrása az IMS PharmMIS

adatbázis nagykereskedelmi eladásai voltak. Az antibiotikumok csoportosítása és

fogyasztásuk kalkulálása az egészségügyi világszervezet ATC–DDD (Defined Daily

Dose - átlagos napi dózis) indexének 2005-ös verziója alapján történt. A népességi

adataink a Központi Statisztikai Hivatal adatbázisából származtak. Az antibiotikum

fogyásnak a S. pneumoniae törzsek penicillinekkel és makrolidokkal szembeni

rezisztenciára való hatásának megítéléséhez csak az antibiotikumok per os formuláit

elemeztük. Az országos és a helyi (Csongrád megye) antibiotikum fogyási adatokat

DDD/1000 lakos/napban adtuk meg.

Az adatok statisztikai elemzése

A rezisztencia adatokat a laboratóriumunk informatikai rendszeréből gyűjtöttük. Egy

betegtől egy izolátum adatait vettük figyelembe. A vizsgált időszakokban a járó- és

fekvőbetegek mintáiból, valamint a 14 év alatti és feletti betegek mintáiból izolált

S. pneumoniae törzsek adatainak elemzésére Khi-négyzet és Fisher féle egzakt próbát

alkalmaztunk az SPSS program csomag segítségével (verzió 13.0). A statisztikai

elemzés során a p<0,05 értéket tekintettük szignifikánsnak.

EREDMÉNYEK

1. Streptococcus pneumoniae törzsek vizsgálata során kapott eredményeink

Az 1990-es években különböző közleményekben ellentmondásos adatok

jelentek meg a hazai S. pneumoniae törzsek penicillin rezisztenciájának mértékéről.

Intézetünkben 1997-2005 között izolált S. pneumoniae törzsek penicillin, amoxicillin,

9/24

ceftriaxon, erythromycin és clindamycin rezisztencia arányát vizsgáltuk. Az

antibiotikum rezisztencia vizsgálatokat minden esetben az NCCLS/CLSI ajánlásainak

megfelelően végeztük. A saját eredményeink szerint a penicillin rezisztens törzsek

aránya 2002-ig jóval alatta maradt az országos adatoknak, melynek okát abban látjuk,

hogy nem minden magyarországi mikrobiológiai laboratórium követte szigorúan a

szakmai ajánlásokat, így a penicillin rezisztens törzsek aránya jóval magasabb volt a

ténylegesnél.

Más szempontok szerinti adatelemzésünk során két periódusra bontottuk a

vizsgált időszakot: 1998-2001, 2002-2005. A gyermekek mintáiból izolált törzsek

száma a második periódusban jelentősen emelkedett. Ennek oka egyrészt a házi

gyermekorvosok egyre nagyobb számú mintabeküldése, másrészt az egészségügyi

intézményekben történt átszervezés, amely során egyre több mintát kaptunk az

alapellátáshoz közeli területekről. A vizsgált 8 éves időszak alatt 2670 S. pneumoniae

törzset izoláltunk (1267 törzs fekvőbetegektől, 1403 járóbetegektől). A 0-2 éves

korcsoportban a vizsgált mindkét időszakban, mind járó- mind fekvőbetegek esetében

a penicillin rezisztens S. pneumoniae törzsek aránya jelentősen csökkent (20%-ról

4%-ra és 21%-ról 2%-ra). Azonos tendencia figyelhető meg a 3-14 éves gyermekek

mintáiból izolált törzsek esetében is. A felnőtt betegek mintáiból izolált S.

pneumoniae törzsek között igen alacsony volt a penicillin rezisztens törzsek aránya

mindkét időszakban (8,7% és 2,5%). Az amoxicillin rezisztens és mérsékelten

érzékeny, valamint a ceftriaxonra rezisztens törzsek előfordulási aránya egyaránt

nagyon alacsony volt. A vizsgált teljes időperiódusban az izolált erythromycin és a

clindamycin rezisztens S. pneumoniae törzsek aránya folyamatosan magas volt.

A penicillinek fogyása (J01C) Magyarországon viszonylag állandó volt

1998 és 2005 között (átlag ± SD: 8,45±0,51 DDD/1000 lakos/nap). A penicillinek

csoportján belül a széles spektrumú penicillinek (J01CA) fogyása csökkenő tendenciát

mutatott, míg a penicillinek béta-laktamázzal kombinált csoportjában (J01CR) a

fogyás folyamatosan emelkedett. A penicillinek csoportjának (J01C) és

alcsoportjainak (J01CA; J01CR) fogyása Csongrád megyében és országosan is azonos

tendenciát mutatott. A makrolid, linkózamid (J01F) csoport országos és megyei

fogyása emelkedett az évek során. A Csongrád megyei fogyás minden évben kissé

meghaladta az országos adatokat. A pneumococcusok rezisztencia változása nem volt

magyarázható az antibiotikum fogyás változásával.

Munkacsoportunk szerotipizált 57 - 2001. január és június között izolált -

random módon válogatott S. pneumoniae törzset. A két éves kor alatti gyermekek

10/24

mintáiból izolált törzsek (21 törzs) szerotípusa 95%-ban megegyezett az ebben a

korban alkalmazott immunogén konjugált vakcina szerotípusaival. A két évnél

idősebb páciensek mintáiból kitenyészett S. pneumoniae törzsek szerotípusa 97%-ban

volt azonos a 23 valens pneumococcus poliszacharid vakcinában található

szerotípusokkal.

Négy szegedi óvodában (kettő belvárosi, kettő külvárosi) megvizsgált 195

tünetmentes 3-6 éves gyermek közül 35 hordozott az orrában S. pneumoniae-t. 14

törzs rezisztens volt mind erythromycinre mind clindamycinre. Az egy darab

penicillin rezisztens törzs egyben rezisztens volt amoxicillinre, erythromycinre és

clindamycinre is. Figyelemre méltó, hogy a belvárosi óvodába járó, feltehetően jobb

szociális hátterű gyermekek kisebb arányban hordoztak S. pneumoniae-t, mint a

külvárosi óvodások (11% ill. 29%), de a kevésbé érzékeny törzsek aránya jóval

magasabb volt a belvárosi óvodába járó gyermekek esetében.

Egy újonnan bevezetett orális, 3. generációs cefalosporin (cefditoren-

pivoxil) hatékonyságát 93, a Heim Pál Kórház (Budapest) felső légúti infekcióban

szenvedő betegeitől származó S. pneumoniae törzspopuláción vizsgáltuk, melyek

24%-a érzékeny, 22%-a mérsékelten érzékeny és 54%-a rezisztens volt penicillinre. A

vizsgálatainkba bevontunk 35 felnőtt pneumóniás beteg mintájából izolált

pneumococcus törzset (30 köpetből, 5 hemokultúrából származott). Vizsgálataink

során a cefditoren MIC értékek a penicillin rezisztens törzseknél is igen alacsonyak

voltak. Az eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy a cefditoren-pivoxil a magas

penicillin rezisztenciával rendelkező S. pneumoniae törzsek esetében hatékony

antibiotikum lehet.

2. A cysticus fibrosisos betegek mintáiból izolált Pseudomonas aeruginosa törzsek

vizsgálata során kapott eredményeink

A Szegedi Gyermekkórház Cystás Fibrosis Ambulanciáján kezelt 24 beteg

alsó és felső légúti mintáiból izolált potenciális patogén baktériumok megjelenését és

folyamatos jelenlétét vizsgáltuk és elemeztük 1999. július és 2001. június között. A

vizsgált időszakban a CF-es betegek légutaiban legnagyobb arányban P. aeruginosa

tenyészett ki egyedül vagy más patogénnel (1999-ben a betegek 38%, 2000-ben 33%,

2001-ben 36%-ánál), ami folyamatos kolonizációt, infekciós tünetek esetén a

legvalószínűbb kórokozót jelentette.

Munkánk során kísérletes modellt állítottunk fel a biofilm termelés, majd a

biofilm termelés gátlásának mérésére. A vizsgálatokba azokat a mucoid telepeket

11/24

képző P. aeruginosa törzseket vontuk be, amelyeket a CF ambulancián gondozott

gyermekek légúti mintáiból izoláltunk. Meghatároztunk egy, a baktériumok biofilm

termelésének mérésére alkalmas kísérleti rendszert: az inkubálás idejét, körülményét,

a biofilmhez legjobban kötődő szignál rendszert. Az alkalmazott kísérleti rendszerrel

jól detektálható a clarithromycin biofilm termelést gátló hatása.

A CF-es betegek kezelésének megválasztásában a biofilm ellenes

kiegészítő kezelés mellett nagyon fontos, hogy a légutakban megtelepedő, különböző

klónokba tartozó, ezért esetleg különböző antibiotikum rezisztenciával rendelkező

P. aeruginosa törzsek kimutatásra kerüljenek. Egy új tenyésztési és antibiotikum

rezisztencia vizsgálati módszert vezettünk be az akut infekciós tüneteket mutató

betegeknél a köpet bakteriológiai vizsgálatában. A mucolitikus kezelése után a mintát

közvetlenül plétoltuk véres agarra, erre antipseudomonas aktivitású antibiotikumot

tartalmazó E-teszteket helyeztünk. Ezzel a módszerrel elkülöníthettük a különböző

rezisztenciájú P. aeruginosa klónokat és a kisebb számban jelenlévő, a vizsgált

antibiotikumokra rezisztens, potenciálisan patogén baktériumtelepeket. A vizsgálattal

a terápia megválasztását is segíteni tudtuk, olyan antibiotikumot ajánlva, amely a

légutak normál flóráját nem pusztítja el, így meghagyja a természetes

védekezőképességet a kolonizáló patogénekkel szemben.

3. Alsó légúti mintákból izolált ESBL termelő Enterobacteriaceae családba

tartozó Gram-negatív baktériumok előfordulása beteganyagunkban

Az SZTE ÁOK Belgyógyászati Intenzív Osztályán 1997. július és 1999.

október között a lélegeztetett betegek kórházi pneumóniáinak trachealeszívással és

védett bronchoalveolaris lavage-al (miniBAL) vett mintáinak bakteriológiai

tenyésztési eredményeit hasonlítottuk össze. A vizsgált időszakban 63 betegnél alakult

ki kórházban szerzett pneumónia. A betegektől 95 miniBAL mintát vettek, 43 beteg

49 mintájából volt eredményes a bakteriológiai tenyésztés, összesen 66 kórokozót

mutattunk ki. A tracheaváladék és a miniBAL tenyésztések során kapott eredmények

66%-ban estek egybe. Megállapítottuk, hogy a védett bronchoalveolaris lavage

(miniBAL) mintavétel kórházi pneumoniák kórokozóinak meghatározásában nem

helyettesíthető a kevésbé eszközigényes tracheaváladék mintavétellel, mivel a hosszan

tartó kórházi kezelés alatt álló betegek felső légútjait kolonizáló baktériumok

szennyezik a nem védett eszközzel levett mintákat, így azok tenyésztése során kapott

eredmények klinikai használhatósága alacsony.

12/24

Intézetünkben az alsó légúti mintákból izolált ESBL termelő Gram-negatív

pálcák előfordulását vizsgáltuk 2002-től 2005-ig. Megállapítottuk, hogy az esetek

száma a vizsgált négy évben nem változott jelentősen, bár évenként változtak a

nagyobb arányban előforduló ESBL termelő baktérium speciesek.

4. Az antibiotikum szinergizmus vizsgálataink eredményei Gram-negatív, légúti

mintákból izolált törzsek esetében

A rutin bakteriológiai vizsgálataink során elsősorban légúti mintákból

izolált 7 E. coli és 9 K. pneumoniae törzsnél korongdiffúziós antibiotikum

rezisztencia vizsgálattal szinergén hatást tapasztaltunk a cefoperazon és az

amoxicillin/klavulánsav között. Mind a 16 törzs béta-laktamáz enzim termelőnek

bizonyult. Az ólési görbe (killing curve) és chequerboard titrálás módszerével azt

találtuk, hogy a cefoperazon/klavulánsav kombináció hatása jóval kifejezettebb és

hosszan tartóbb volt, mint a cefoperazon/szulbaktám kombinációé. Így ez az

antibiotikum kombináció is hatékony a béta-laktamáz termelő Gram-negatív

baktériumokkal szemben.

Továbbiakban 110 intenzív osztályon alsó légúti infekció miatt kezelt beteg

légúti mintáiból izolált Pseudomonas spp. törzsnél kerestünk hatékony antibiotikum

kombinációt E-teszttel vizsgálva. Harminc ciprofloxacin rezisztens, ebből 26

multirezisztens (legalább 3 antipseudomonas antibiotikum csoportra rezisztens)

pseudomonas törzset találtunk. Ezen törzsek közül 10 esetben találtuk a

ceftazidim/ciprofloxacin és a piperacillin/amikacin kombinációt szinergének, míg a

másik 7 törzs esetében a piperacillin/ciprofloxacin kombináció volt szinergista hatású

a FIC index meghatározása alapján. Vizsgálataink során gyakrabban találtunk

ciprofloxacin rezisztens törzseknél szinergista hatást: piperacillin/ciprofloxacin

(23,3%), imipenem/ciprofloxacin (16,6%) és ceftazidim/ciprofloxacin (33%). A

ciprofloxacinra mérsékelten érzékeny vagy az érzékeny törzsek között a szinergista

hatás jóval kisebb százalékban volt kimutatható. Vizsgálataink eredményei alapján

megállapítottuk, hogy a rutin laboratóriumi diagnosztikában az E-teszttel történő

szinergizmus vizsgálat gyors, jól standardizálható módszer.

5. A Gram-negatív bélbaktériumok béta-laktám típusú rezisztencia

mechanizmusainak vizsgálatával kapott eredményeink

Munkánk során 170 K. pneumoniae, 82 E. cloacae és 15 S. marcescens

klinikai izolátum béta-laktamáz enzim termelését vizsgáltuk, amelyek közül 109 törzs

13/24

(41%) hordozott valamilyen béta-laktamáz enzim gént. A nozokómiális járványból

izolált 15 S. marcescens törzs közül (12 klinikai minta, 3 környezeti minta volt) 14

törzs kétféle rezisztencia génnel is rendelkezett; kromoszómális indukálható béta

laktamáz és SHV-2 ESBL termelést meghatározó génnel. Nagy valószínűséggel a S.

marcescens az ugyanabban a betegben egyidőben jelen lévő K. pneumoniae törzsből

akvirálta az ESBL termelését meghatározó gént. Különösen a nozokomiális infekciók

esetén, amelyeket leggyakrabban a légutakon keresztül bejutó baktériumok okoznak,

számolnunk kell különböző, kromoszómális vagy plazmidon hordozott

rezisztenciával, s nem elhanyagolható az ilyen törzseknél a többszörös rezisztencia

jelenléte sem, valamint a különböző speciesek között a rezisztencia gének átjutása.

KÖVETKEZTETÉSEK

1. A S. pneumoniae, mint a közösségben szerzett penumóniának, valamint a felső

légúti infekcióknak a leggyakoribb kórokozója, súlyos, életet veszélyeztető

állapotot is okozhat. A saját retrospektív vizsgálataink alapján, amelyben 8 év

alatt izolált S. pneumoniae törzsek penicillin, amoxicillin, ceftriaxon és makrolid

rezisztencia adatait elemeztük, a penicillin rezisztencia előfordulása igen

alacsony volt (5,58%), különösen a felnőttek (4%) és az invazív mintákból

kitenyészett pneumococcusok esetében (3,8%). A penicillinre mérsékelten

érzékeny törzsek aránya a fekvőbetegek esetében 37%, a járóbetegeknél 39%

volt. Az antibiotikum rezisztencia vizsgálatokat a nemzetközileg elfogadott

ajánlások mindenkori betartásával végeztük. Ezek az adatok merőben eltértek az

1990-es években Magyarországról közölt adatoktól. A S. pneumoniae okozta

fertőzéseket leggyakrabban amoxicillinnel kezelik, amellyel szemben a

rezisztencia a saját vizsgálatainkban 2,62%-os volt. A pneumococcusok okozta

súlyos infekciók kezelésére a ceftriaxont alkalmazzák, a vele szembeni

rezisztencia arányt 1,12%-nak találtuk. Ezek az antibiotikumok a saját vizsgálati

eredményeink alapján biztonsággal alkalmazhatók a S. pneumoniae okozta

fertőzésekben. A makrolidokkal szembeni rezisztencia a vizsgált időszakban

egységesen magas volt, amiből azt a következtetést vonhatjuk le, hogy

empirikusan a makrolidok a pneumococcusok okozta fertőzések kezelésére nem

alkalmasak.

14/24

A tünetmentes óvodások körében S. pneumoniae hordozást 33%-ban

találtunk, a penicillin, amoxicillin, ceftriaxon és a makrolid rezisztencia hasonló

volt, mint a klinikai mintákból izolált törzseknél.

A random módon kiválasztott, 2 év alatti gyermekek mintáiból izolált S.

pneumoniae törzsek szerotípusa 95%-ban megegyezett a konjugált

pneumococcus vakcina törzseinek szerotípusával, a 2 évnél idősebbek mintáiból

izolált törzsek szerotípusa 97%-ban volt azonos az ebben a korban javasolt

vakcinában lévő szerotípusokkal.

A vizsgálataink azt mutatták, hogy a cefditoren-pivoxil, amely egy új 3.

generációs orális cefalosporin, igen jó hatású a penicillin rezisztens és

mérsékelten érzékeny pneumococcusokkal szemben, így megfelelő alternatív

kezelési lehetőség.

2. A cysticus fibrosisos betegek légutait kolonizáló P. aeruginosa törzsek biofilm

képzésének in vitro mérésére könnyen kivitelezhető módszert vezettünk be,

amely alkalmas volt a biofilm termelés makroliddal (clarithromycin) történő

gátlásának mérésére is. Követtük a cysticus fibrosisos betegek bakteriális légúti

kolonizációjának kialakulását. Az infekciós tüneteket mutató betegeknél az alsó

légúti minta direkt E-teszttel történő vizsgálatával segítettük a leghatékonyabb

antibiotikum kiválasztását azzal, hogy a különböző antibiotikum érzékenységű

P. aeruginosa és egyéb patogén baktérium kolóniákat detektáltuk, és

meghatároztuk azt az antibiotikumot, amely nem pusztította el a normál légúti

flórát.

3. Az Enterobacteriacaea családba tartozó Gram-negatív baktériumok a

leggyakoribb kórokozói az intenzív osztályon kezelt betegek lélegeztetéssel

összefüggően kialakuló kórházi pneumóniáinak. Vizsgálataink alapján a

pneumónia kórokozóinak azonosítására intubált beteg esetében a miniBAL

mintavételi módszer sokkal alkalmasabb volt, mint a tracheaváladék. A légúti

mintákból izolált kórokozók között az ESBL termelés előfordulásának

meghatározása segíti a hatékony empírikus antibiotikum választást. A Gram-

negatív baktériumok között az ESBL termelés megjelenésével szükségessé válik

a béta-laktám antibiotikumok használatának a csökkentése. Az intenzív

osztályainkon a vizsgált időszakban az ESBL termelő baktériumok viszonylag

alacsony arányú előfordulása kedvező jelenség volt.

4. Különböző in vitro módszerek állnak rendelkezésünkre az antibiotikum

kombinációk hatásosságának vizsgálatára. A chequerboard titrálásal és az ölési

15/24

görbe módszerrel igazolni tudtuk a cefoperazon/klavulánsav kombináció

hosszan tartó és nagyobb mértékű szinergista hatását a cefoperazon/szulbaktám

kombinációval szemben. A fenti módszerek időigényesek és munkaigényesek,

így rutin laboratóriumban nem alkalmazhatók. Az antibiotikum szinergizmus

vizsgálatokra általunk újonnan bevezetett E-teszt módszer a mindennapi rutin

laboratóriumi munkában jól alkalmazható. Vizsgálataink során a nozokómiális

pneumóniát okozó multirezisztens Pseudomonas ssp-k esetében a vizsgált

antibiotikum kombinációkkal -piperacillin/ciprofloxacin,

imipenem/ciprofloxacin, ceftazidim/ciprofloxacin – jelentős számban szinergista

hatást tudtunk kimutatni. A kombináció hatékonysága alapvetően függött az

izolátumtól, az antibiotikum rezisztencia mértékétől és a kombinált

antibiotikumoktól. A multirezisztens kórokozók hatásos terápiájának

meghatározásához egyedi vizsgálatokra van szükség.

5. A béta-laktám antibiotikumokkal szembeni rezisztencia genetikai hátterének

vizsgálata igen fontos, hiszen, ha azokban az esetekben, amikor a béta-laktamáz

enzim plazmidon található, számolnunk kell ennek a rezisztencia plazmidnak az

adott osztályon belüli terjedésével is. Figyelembe kell venni azt is, hogy az

alkalmazott antibiotikum(ok) hatására mind a kromoszómán mind a plazmidon

hordozott rezisztencia gén megváltozhat, újabb típusú rezisztenciát hozva létre.

Vizsgálatainkkal a Gram-negatív baktériumok esetében az SHV és a TEM típusú

gének széleskörű elterjedtségét mutattuk ki. Igazoltuk az E. cloacae törzsek

között a kromoszómán elhelyezkedő indukálható béta-laktám enzim, valamint a

stabilan derepresszált béta-laktamáz enzim génjének együttes előfordulását.

Feltételezésünk szerint egy nozokómiálás járvány során egy SHV-2 gént

hordozó K. pneumoniae törzs átadta a rezisztencia génjét egy ClassC béta-

laktamázt termelő S. marcescens törzsnek. Mindkét törzs ugyanazon az

osztályon, ugyanabban a betegben egyidőben volt jelen.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Először is hálás köszönetemet fejezem ki témavezetőmnek és egyben

munkahelyi vezetőmnek Prof. Dr. Nagy Erzsébetnek, valamint másik

témavezetőmnek Dr. Vágvölgyi Csabának felbecsülhetetlen szakmai és emberi

segítségükért, támogatásukért, biztatásukért, bizalmukért.

Köszönöm a publikációkban szerzőtárs kollégáknak, Benkő Riának, Dr.

Blazsovszky Matildnak, Dr. Dobay Orsolyának, Dr. Fodor Eleonórának, Dr. Fogas

16/24

Jánosnak, Dr. Jeszenszky Máriának, Dr. Kóczián Zsófiának, Matuz Máriának, Mayer

Ilonának, Ordas Anitának, Dr. Prágai Zoltánnak, Dr. Rudas Lászlónak, Dr. Soós

Gyöngyvérnek, Dr. Szabó Ágnesnek, Szabó Ákosnak, Dr. Szurdi Máriának a

nagyszerű közös munkát.

Hálásan köszönöm munkatársaimnak – Dr. Urbán Edit, Dr. Terhes

Gabriella, Rátkai Csilla, Pappné Ábrók Marianna, Bjelik Annamária, Dr. Lázár

Andrea, Bönde Anita, Deák Tünde, Gáborné Hevesi Márta, Marincusné Karasz Erika,

Müller Ferencné, Nagyné Dósa Éva, Redetzky Andrea, Révészné Tóth Zsuzsanna,

Szappanos Edina – a pontos, precíz laboratóriumi munkát és a vizsgálatainkban való

részvételt.

Külön köszönöm Dr. Hulesch Helgának az irodalmazáshoz nyújtott

segítségét, és a dolgozatom végső kialakításában hasznos kritikai észrevételeit.

Köszönöm Édesanyámnak, testvéreimnek, hogy most is, mint életem

eddigi útján mindig biztattak, támogattak. Nagyon köszönöm családomnak

(férjemnek, Horváth Zoltánnak, fiaimnak, Csabának és Attilának, kislányomnak,

Andreának), hogy buzdítottak és türelemmel, megértéssel viselték, amíg sokszor

dolgozatom megírásával voltam elfoglalva.

Az óvodás gyermekek S. pneumoniae hordozásának vizsgálatához

szükséges mintavevőket és a MIC érték meghatározáshoz szükséges E-teszteket a

GlaxoSmithKline bocsátotta rendelkezésünkre. Köszönöm a segítségüket.

17/24

KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE Az értekezéshez felhasznált közlemények

1. Hajdu E, Matuz M, Benko R, Ordas A, Nagy A: An 8-year evaluation of antibiotic consumption and antibiotic resistance among Streptococcus pneumoniae from in- and out-patients in Szeged, Hungary. Journal of Chemotherapy (közlés alatt)

2. Hajdú Edit , Benkő Ria, Matuz Mária, Ordas Anita, Blazsovszky Matild, Jeszenszky Mária, Szurdi Mária, Nagy Erzsébet: S. pneumoniae törzsek antibiotikum érzékenységének retrospektív értékelése 1998-2005 között az antibiotikum fogyasztás tükrében. Infektológia és Klinikai Mikrobiológi (közlés alatt)

3. Nagy E, Hajdú E, Földes J: Antimicrobial activity of cefoperazone with clavulanic acid or sulbactam against. Enterobacteriaceae. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 29: 701-703. (1990) IF: 3,886

4. Nagy E, Prágai Z, Kóczián Zs, Hajdú E, Fodor E: Investigation of the presence of different broad-spectrum beta-lactamase among clinical isolates of Enterobacteriaceae. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 45: 433-446. (1998)

5. Hajdú Edit , Fogas János, Rudas László, Nagy Erzsébet: Lélegeztetett betegek alsó légúti infekciójának mikrobiológiai diagnózisa védett bronchoalveolaris lavage mintavétel alkalmazásával. Infektológia és Klinikai Mikrobiológia IX: 65-71. (2002)

6. Nagy E, Marton A, Hajdú E: In vitro activity of cefditoren against a special collection of clinical isolates of Streptococcus pneumoniae from Hungary. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica 50: 119-124. (2003)

7. Mayer Ilona, Szabó Ágnes, Hajdú Edit , Nagy Erzsébet: Hazai cystás fibrosis centrum betegeinek légúti mintáiból származó izolátumok prospektív analízise. Gyermekgyógyászat 54: 739-745. (2003)

8. Fodor E, Hajdú E, Nagy E: Use of Etest to assess synergy of antibiotic combinations against clinical isolates of Pseudomonas spp. International Journal of Antimicrobial Agents 25: 177-184. (2005) IF: 2,428

Az értekezés témájával összefüggő közlemények 1. Hajdú Edit: Konzultatív klinikai mikrobiológia a Szent-Györgyi Albert

Orvostudományi Egyetemen. Infektológia és Klinikai Mikrobiológia V: 134-135. (1998)

2. Nagy Erzsébet, Hajdú Edit, Dósa Erika: Különböző Gram-negatív izolátumok aminoglycosid érzékenységének összehasonló analízise országos és helyi adatok alapján.

Infektológia és Klinikai Mikrobiológia II: 75-80. (2001) 3. Benkő Ria, Bácskay Tamás, Hajdú Edit, Matuz Mária, Soós Gyöngyvér:

Fekvőbeteg részlegek antibiotikum felhasználásának elemzése különös tekintettel a hematológiai betegek kezelési sajátosságaira. Acta Pharmaceutica Hungarica 72: 245-251. (2002)

4. Dobay O, Rozgonyi F, Hajdú E, Nagy E, Knausz M, Amyes SGB: Antibiotic susceptibility and serotypes os Streptococcus pneumoniae isolates from

18/24

Hungary. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 51: 887-893. (2003) IF: 3,886

5. Dobay O, Rozgonyi F, Hajdú E, Nagy E, Knausz M, Amyes SGB: The relationship between serotypes and PFGE genotypes in isolates of Streptococcus pneumoniae from Hungary. Clinical Microbiology and Infection 8: 673-676. (2005) IF: 2,679

6. Matuz M, Benko R, Doro P, Hajdu E, Nagy G, Nagy E, Monnet DL, Soos G: Regional variations in community consumption of antibiotics in Hungary, 1996-2003. British Journal of Clinical Pharmacology 61: 96-100. (2006) IF: 2,777

7. Benkő Ria, Matuz Mária, Doró Péter, Hajdú Edit , Nagy Gábor, Nagy Erzsébet, Soós Gyöngyvér: Antibiotikum-felhasználás 1996-2003: hazai áttekintés és nemzetközi kitekintés. Orvosi Hetilap 147: 1215-1222. (2006)

Az értekezés témájával összefüggő idézhető absztraktok 1. Hajdú E., Urbán E., Lázár A., Fogas J., Rudas L., Nagy E.: Value of

quantitative cultures of protected bronchoalveolar lavage in ventilated patients (poster) Clinical Microbiology and Infections, 6. (Suppl.1) 190. 2000 IF: 2,679

2. O. Dobay, E. Hajdú, E. Nagy, M. Knausz, F. Rozgonyi, S.G.B. Amyes: Comparisone of serotyping and genotyping of Hungarian Streptococcus pneumoniae isolates. Clinical Microbiology and Infection Vol. Vol. 9, (Suppl 1. 355. 2003) IF: 2,679

3. E. Fodor, E. Hajdú, E. Nagy: Investigation of the synergistic effects of combinations of beta-lactam and fluoroquinolone or aminoglycoside against clinical isolates of Pseudomonas spp. With E-test technology. Clinical Microbiology and Infection Vol. 9,(Suppl 1. 165. 2003) IF: 2,679

4. Hajdú E., Renkő R., Matuz M., Pető Z., Molnár A., Rudas L., Vér I., Jánosi G., Soós E., Nagy E.: Evaluation of antibiotic consumption and resistance patterns in a tertiary care surgical ICU and a medical ICU. Clinical Microbiology and Infection 11: 138, 2005 IF: 2,679

5. Hajdú E., Kóczián Zs., Fogas J., Urbán E., Dósa E., Lázár A., Nagy E., Rudas L.: Alsó légúti infekciók mikrobiológiai diagnosztikája védett bronchoalveoláris lavage mintákból. Infektológia és Klinikai Mikrobiológia 6: (1. suppl.) 18. 1999

6. Dobay Orsolya, Dominic Hoar, Rozgonyi Ferenc, Hajdú Edit , Nagy Erzsébet, Knausz Márta, Sebactian G.B. Amyes: Hazai pneumococcus törzsek genotipizálásával nyert adatok összehasonlítása a szerotipizálás eredményeivel. Clinical and Experimental Laboratory Medicine Vol. 29. 1. 17. (2002)

7. Hajdú Edit , Komáromy Hedvig, Fogas János, Rudas László, Nagy Erzsébet: Gépi lélegeztetéssel összefüggő pneumonia esetek egy éves beteganyagunkban. Infektológia és Klinikai Mikrobiológia Supplemen1. 2003. S12.

8. Peres Bota Daliana, Hajdú Edit , Palágyi Péter, Hortobágyi Annamária: Are infections with resistant pathogens worsening the outcome of surgical ICU patients? Aneszteziol. Intenz. Ter. 33; Suppl. 1. 24, 2003.

9. Gilyán J., Hajdú E ., Nagy E.:Súlyos infekciókból izolált Streptococcus pneumoniae törzsek rezisztencia viszonyai az SZTE klinikáin 2002-2005 között (poszter). Infektológia és Klinikai Mikrobiológia XII.évf.(1 suppl). 15.old. 2005

19/24

20/24

21/24

22/24

23/24

24/24