ТЕХНОЛОГІЇ ТЕХНОЛОГІЇ МІКРОБНОГО СИНТЕЗУ МІКРОБНОГО СИНТЕЗУ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ

11

Лекцій – 38 годин, лабораторних робіт -38, диф. залік

Тема 2Тема 2.. Визначення активності Визначення активності антибіотиківантибіотиків

Одиниці біологічної активностіОдиниці біологічної активності антибіотиківантибіотиків33

Визначення антибіотичної активності Визначення антибіотичної активності мікроорганізмівмікроорганізмів99

Визначення антивірусної дії антибіотиківВизначення антивірусної дії антибіотиків1414

Визначення протипухлинної дії Визначення протипухлинної дії антибіотиківантибіотиків1919

Методи кількісного визначенняМетоди кількісного визначення антибіотиківантибіотиків

22

ВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТІ АНТИБІОТИКІВВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТІ АНТИБІОТИКІВОдиниці біологічної активності антибіотиківОдиниці біологічної активності антибіотиківВеличину Величину біологічної активності антибіотиків біологічної активності антибіотиків (протибактеріальної, антифунгальної і т.ін.) (протибактеріальної, антифунгальної і т.ін.) зазвичай виражають в умовних одиницях, що зазвичай виражають в умовних одиницях, що містяться в містяться в 1 мл розчину (од/мл) чи в 1мг 1 мл розчину (од/мл) чи в 1мг препарату (од/мг). препарату (од/мг). За За одиницю антибіотичної одиницю антибіотичної активностіактивності приймають приймають мінімальну кількість мінімальну кількість антибіотика, здатну пригнічувати розвиток чи антибіотика, здатну пригнічувати розвиток чи затримувати ріст певної кількості клітин затримувати ріст певної кількості клітин стандартного штаму тест-мікроба в одиниці стандартного штаму тест-мікроба в одиниці об’єму поживного середовища.об’єму поживного середовища.

33

За одиницю За одиницю антибіотичної антибіотичної активності бензилпеніциліну активності бензилпеніциліну прийнято прийнято мінімальну кількість препарату, здатну мінімальну кількість препарату, здатну затримувати ріст золотистого затримувати ріст золотистого стафілокока стафілокока Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus (штам 209) в 50 мл (штам 209) в 50 мл поживного бульйону. поживного бульйону.

Для Для стрептоміцинустрептоміцину одиниця одиниця активності буде іншою: мінімальна активності буде іншою: мінімальна кількість антибіотика, що затримує ріст кількість антибіотика, що затримує ріст E. coliE. coli в 1 мл поживного бульйону. в 1 мл поживного бульйону.

44

При наявності антибіотикав в При наявності антибіотикав в хімічно чистому вигляді умовні одиниці хімічно чистому вигляді умовні одиниці біологічної активності виражають в біологічної активності виражають в одиницях маси. Так 1 мг чистого одиницях маси. Так 1 мг чистого стрептоміцину еквівалентний 1000 од стрептоміцину еквівалентний 1000 од біологічної активності. Відповідно 1 од біологічної активності. Відповідно 1 од активності даного антибіотика активності даного антибіотика еквівалентна 1мкг чистого стрептоміцину. еквівалентна 1мкг чистого стрептоміцину. Нині випадків кількість стрептоміцину Нині випадків кількість стрептоміцину виражають в мкг/мл чи мкг/мг. виражають в мкг/мл чи мкг/мг.

55

Відповідність одиниць біологічної Відповідність одиниць біологічної дії ваговим одиницям для деяких дії ваговим одиницям для деяких антибіотиків антибіотиків

66

Назва антибіотикаМаса 1 од.,

мкг

Бензилпеніциліну натрієва сіль 0,6Оксацилін (кислота) 1,0

Стрептоміцин (основа) 1,0Стрептоміцин (сульфат) 1,25

Хлортетрациклін (гідрохлорид) 1,0Поліміксин В 0,1

Тетрациклін (гідрохлорид) 1,0

При вивченні умов утворення При вивченні умов утворення антибіотиків і дослідженні впливу різних антибіотиків і дослідженні впливу різних факторів на біосинтез антибіотиків факторів на біосинтез антибіотиків важливим критерієм оцінки активності є важливим критерієм оцінки активності є характеристика характеристика антибіотичної антибіотичної продуктивності організмів.продуктивності організмів.

77

Антибіотичною продуктивністю Антибіотичною продуктивністю організмуорганізму називають кількість називають кількість антибіотику (в мкг або одиницях), що антибіотику (в мкг або одиницях), що утворюється 1 мг сухих клітин (або утворюється 1 мг сухих клітин (або міцелію) досліджуваного організму за міцелію) досліджуваного організму за певний проміжок часу (1 год). певний проміжок часу (1 год).

Антибіотична продуктивність Антибіотична продуктивність організму організму виражається в мкг/(мг*год) або виражається в мкг/(мг*год) або в од./(мг*год).в од./(мг*год).

88

Визначення антибіотичної Визначення антибіотичної активності мікроорганізмівактивності мікроорганізмів

Антибіотичні властивості мікроорганізмів Антибіотичні властивості мікроорганізмів вивчають за культивування їх на твердих вивчають за культивування їх на твердих (агаризованих) чи в рідких середовищах. (агаризованих) чи в рідких середовищах. Визначення антибіотичної активності Визначення антибіотичної активності мікрорганізмів на твердих середовищах мікрорганізмів на твердих середовищах здійснюється здійснюється методом перпендикуляр-методом перпендикуляр-них штрихів або методом агарових них штрихів або методом агарових блоківблоків, на рідких поживних середовищах , на рідких поживних середовищах – – методом паперових дисківметодом паперових дисків..

99

Визначення антибіотичної активності Визначення антибіотичної активності мікроорганізмів методом перпендикулярних мікроорганізмів методом перпендикулярних

штрихів (Егоров, 2004).штрихів (Егоров, 2004).Час культивуваня тест-культур– 20-24 годиниЧас культивуваня тест-культур– 20-24 години

Нечутливі культури Нечутливі культури ростуть рядомростуть рядом

1010

Метод паперових дисківМетод паперових дисківДиски з фільтрувального паперу діаметром 8 мм Диски з фільтрувального паперу діаметром 8 мм стерилізують в автоклаві.Стерильний диск беруть стерилізують в автоклаві.Стерильний диск беруть пінцетом і змочують в досліджуваній культуральній пінцетом і змочують в досліджуваній культуральній рідині (або екстракті). Після цього диски накладають рідині (або екстракті). Після цього диски накладають на поверхню пожив-ного агару, попередньо на поверхню пожив-ного агару, попередньо засіяного культурою тест-організму. Чашку з тест-засіяного культурою тест-організму. Чашку з тест-організмом і паперовими дисками культивують за організмом і паперовими дисками культивують за оптимальної температури 20-24 год. оптимальної температури 20-24 год. За присутності За присутності антибіотичної речовини антибіотичної речовини в в культуральній рідині навколо диска утворюєть-ся культуральній рідині навколо диска утворюєть-ся зона затримки росту тест-організму.зона затримки росту тест-організму.

1111

Недолік методуНедолік методу: : використання одного поживного використання одного поживного

середовища для досліджуваного організму і середовища для досліджуваного організму і тест-організмів. Іноді для утворення тест-організмів. Іноді для утворення антибіотика і росту продуцента необхідне антибіотика і росту продуцента необхідне середовище, що відрізняється від середовище, що відрізняється від оптимального для росту тест-організмівоптимального для росту тест-організмів

1212

Метод агарових блоківМетод агарових блоків Досліджуваний організм висівають суцільним Досліджуваний організм висівають суцільним

газоном на поверхню агаризованого середови-ща. газоном на поверхню агаризованого середови-ща. Середовище оптимальне для росту і утворення Середовище оптимальне для росту і утворення антибіотика . Вирізають 3-5 цилінд-антибіотика . Вирізають 3-5 цилінд-

рів і перенося-рів і перенося- ть на тестовуть на тестову культуру.культуру. Наявність відсут-Наявність відсут- ності зон ростуності зон росту характеризує характеризує

антибіотичну антибіотичну активністьактивність

1313

Визначення антивірусної дії Визначення антивірусної дії антибіотиківантибіотиків

Віруси Віруси – внутрішньоклітинні паразити і тому – внутрішньоклітинні паразити і тому не можуть розвиватися у вигляді чистої не можуть розвиватися у вигляді чистої культури поза клітинами хазяїна. Це змушує культури поза клітинами хазяїна. Це змушує використовувати для пошуку противірусних використовувати для пошуку противірусних речовин методи, що відповідають їх речовин методи, що відповідають їх особливостям.особливостям.

Метод тканевих культурМетод тканевих культур Найбільш зручним є метод використання Найбільш зручним є метод використання

шматочків хориоаллантоїдної тканини курячого шматочків хориоаллантоїдної тканини курячого ембріону.ембріону.

1414

1515

Метод з використання листків рослинМетод з використання листків рослинДля визначення антивірусної активності Для визначення антивірусної активності використовують також відносно простий метод використовують також відносно простий метод з’ясування антивірусної дії антибіотиків стосовно з’ясування антивірусної дії антибіотиків стосовно вірусу тютюнової мозаїки.вірусу тютюнової мозаїки.

1. Вирощують м/о на агарі; 8 мм 1. Вирощують м/о на агарі; 8 мм 2. 2. Вирізають агарові циліндри Вирізають агарові циліндри ;; 3. На лист дурману прикріплюють желатиной 3. На лист дурману прикріплюють желатиной

циліндри.циліндри. 4.Лист дурману інокулюють вірусом табачной 4.Лист дурману інокулюють вірусом табачной

мозаїки. мозаїки.

1616

1717

5. Якщо циліндр містить антибіотик – некрози не утворються

У разі культивування м/о на рідкому середовищі - його змішують з вірусом і інокулюють на поверхню листа

бб аа

1818

Листки тютюну, інокульовані вірусом тютюнової мозаїки: а – половина листка, інокульована сумішшю віруса і культуральної рідини, антивірусна активність якої вивчається; б – половина листка, інокульована вірусом.

Визначення протипухлинної дії Визначення протипухлинної дії антибіотиківантибіотиківВикористовують Використовують

безпосередньо пухлинні клітини. З цією метою безпосередньо пухлинні клітини. З цією метою використовують методи, що базуються на використовують методи, що базуються на використанні експериментальних тварин, використанні експериментальних тварин, культури тканин чи вільноживучих в окремих культури тканин чи вільноживучих в окремих полостях організму пухлинних клітин (асцитні полостях організму пухлинних клітин (асцитні клітини), але кінцевий висновок про клітини), але кінцевий висновок про антипухлинну дію антибіотика надають лише антипухлинну дію антибіотика надають лише після дослідів на тваринах.після дослідів на тваринах.

1919

• Використання Використання експериментальних тваринекспериментальних тварин

• В якості тест-об’єкта використовують В якості тест-об’єкта використовують клітини асцитного раку Ерліха у мишей. клітини асцитного раку Ерліха у мишей. Суспензію асцитних ракових клітин Суспензію асцитних ракових клітин змішують з рівним об’ємом змішують з рівним об’ємом досліджуваного антибіотичного досліджуваного антибіотичного препарата і суміш поміщують в препарата і суміш поміщують в рефрижератор при 4рефрижератор при 4С на 4 год, після С на 4 год, після чого її перевивають мишам підшкірно.чого її перевивають мишам підшкірно.

2020

Для контрольних тварин замість Для контрольних тварин замість досліджуваного препарату досліджуваного препарату використовують фізіологічний розчин. використовують фізіологічний розчин. Через 10 днів мишей забивають і Через 10 днів мишей забивають і визначають наявність пухлини і її визначають наявність пухлини і її розміри. Якщо досліджувана речовина розміри. Якщо досліджувана речовина вбиває асцитні ракові клітини, то вони вбиває асцитні ракові клітини, то вони відповідно не утворюють пухлин.відповідно не утворюють пухлин.

Тест-об’єктом можуть бути Тест-об’єктом можуть бути також інші пухлинні клітини. також інші пухлинні клітини.

2121

Використання мікроорганізмів для Використання мікроорганізмів для пошуку протипухлинних антибіотиківпошуку протипухлинних антибіотиківОбмін речовин в пухлинних клітинах Обмін речовин в пухлинних клітинах відрізняється від обміну нормальних клітин. відрізняється від обміну нормальних клітин. Зокрема, різниця визначається інтенсивністю Зокрема, різниця визначається інтенсивністю дихання, в пухлинних клітинах воно значно дихання, в пухлинних клітинах воно значно знижене. Виходячи з цього було висунуто знижене. Виходячи з цього було висунуто припущення про можливість використання в припущення про можливість використання в якості тест-об’єктів для пошуку протиракових якості тест-об’єктів для пошуку протиракових антибіотиків мутантних мікроорганізмів зі антибіотиків мутантних мікроорганізмів зі зниженим коефіцієнтом дихання.зниженим коефіцієнтом дихання.

2222

Після оброблення клітин стафілококів, Після оброблення клітин стафілококів, кишкової палички та дріжджів було отримано кишкової палички та дріжджів було отримано мікроорганізми, коефіцієнт дихання яких становив мікроорганізми, коефіцієнт дихання яких становив 20-80% 20-80% порівняно з вихідними культурами.порівняно з вихідними культурами.

Використання рослинної Використання рослинної тест-системитест-системи

Бактеріальний рак Бактеріальний рак – одне з найбільш поширених – одне з найбільш поширених і шкідливих захворювань рослин в багатьох і шкідливих захворювань рослин в багатьох країнах світу. Широке розповсюджен-ня країнах світу. Широке розповсюджен-ня бактеріального раку та його велика шкідливість бактеріального раку та його велика шкідливість вимагає пошуку нових ефективних методів вимагає пошуку нових ефективних методів боротьби з ним. боротьби з ним.

2323

Серед усіх пухлин рослин тільки Серед усіх пухлин рослин тільки корончасті гали, зумовлені вірулентними корончасті гали, зумовлені вірулентними штамами штамами Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens,, мають характерні біологічні особливості мають характерні біологічні особливості злоякісних пухлин, а саме: злоякісних пухлин, а саме: метаболітну метаболітну автономію, гормононезалежний ріст і автономію, гормононезалежний ріст і трансплантабельність.трансплантабельність. Тому їх можна Тому їх можна вважати справжніми злоякісними вважати справжніми злоякісними пухлинами рослин – фітобластомами. пухлинами рослин – фітобластомами.

2424

Для скринінгу протипухлинних Для скринінгу протипухлинних речовин використовують індукцію речовин використовують індукцію пухлиноутво-рення за допомогою пухлиноутво-рення за допомогою A. A. tumefaciens tumefaciens на різних тест-рослинах: на різних тест-рослинах: експлантатах запасаючих органів експлантатах запасаючих органів моркви, картоплі та топінамбуру . моркви, картоплі та топінамбуру . Перевагами використання такої моделі Перевагами використання такої моделі пухлиноутворення є пухлиноутворення є висока висока специфічність, незначна, порівняно з специфічність, незначна, порівняно з тваринними системами, тривалість тваринними системами, тривалість проведення дослідупроведення досліду

2525

Використання моделі індукції Використання моделі індукції пухлиноутворення за допомогою пухлиноутворення за допомогою Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens tumefaciens дає дає можливість здійснювати пошук сполук із можливість здійснювати пошук сполук із протипухлинною активністю з протипухлинною активністю з мінімальними витратами та зменшити мінімальними витратами та зменшити потребу у тваринних системах, які потребу у тваринних системах, які вимагають значних витрат коштіввимагають значних витрат коштів

2626

..

2727

Розвиток пухлин на експлантатах картоплі: 1 – експлантати, оброблені протипухлинною речовиною, 2 – не оброблені експлантати.

Методи кількісного визначення Методи кількісного визначення антибіотиківантибіотиків

Для визначення антибіотичної активності Для визначення антибіотичної активності використовують хімічні, фізичні та біологічні використовують хімічні, фізичні та біологічні методи.методи.

Найбільше значення мають Найбільше значення мають біологічні біологічні методиметоди, оскільки лише прямий вплив , оскільки лише прямий вплив антибіотиків на мікроорганізми дозволяє антибіотиків на мікроорганізми дозволяє виявити антимікробну активність. виявити антимікробну активність.

Недоліками біологічних методів є Недоліками біологічних методів є тривалість проведення аналізів, залежність тривалість проведення аналізів, залежність точності від багатьох зовнішніх факторів.точності від багатьох зовнішніх факторів.

2828

Метод послідовних розведеньМетод послідовних розведень використовується для визначення кількості використовується для визначення кількості антибіотика в культуральній рідині, розчинах чи антибіотика в культуральній рідині, розчинах чи екстрактах.екстрактах.

Суть метода:Суть метода: 1. Готують стерильне прозоре поживне 1. Готують стерильне прозоре поживне середовище та розливають у пробірки. середовище та розливають у пробірки. 2. Вносять антибіотик у певній концентрації.2. Вносять антибіотик у певній концентрації. 3. Готують тест-культуру м/о и вносять до 3. Готують тест-культуру м/о и вносять до пробірок. пробірок. 4. Інкубують пробірки в термостаті.4. Інкубують пробірки в термостаті. 5. Визначають наявність чи відсутність росту 5. Визначають наявність чи відсутність росту тест-організма.тест-організма.

2929

..

3030

Методом послідовних розведень отримують достовірні результати у разі:

• дотримання умов стерильності проведення дослідів;• використання постійних середовищ;• внесення однакової кількості клітин тест-

організму.

Для визначення активності антибіотиків Для визначення активності антибіотиків на твердих поживних середовищах на твердих поживних середовищах найбільш найбільш популярний метод популярний метод радіальної дифузії радіальної дифузії антибіотику в агарантибіотику в агар, який попередньо був , який попередньо був засіяний тест-культурою . засіяний тест-культурою . Він заснований на Він заснований на явищі дифузії антибіотику в поживне явищі дифузії антибіотику в поживне агаризоване середовище, внаслідок чого агаризоване середовище, внаслідок чого створюються несприятливі умови для розвитку створюються несприятливі умови для розвитку відповідної тест-культури. відповідної тест-культури.

Методи засновані на цьому явищі є досить Методи засновані на цьому явищі є досить простими і добре демонструють випадок простими і добре демонструють випадок антагоністичних взаємовідносин в світі антагоністичних взаємовідносин в світі мікроорганізмів. мікроорганізмів.

3131

Суть методаСуть метода::1.1. В чашки Петрі заливають 2 шари В чашки Петрі заливають 2 шари

агаризованого середовиша – нижній без тест-агаризованого середовиша – нижній без тест-культури, верхній – із суспензією тест-культури, верхній – із суспензією тест-культурою в засівній дозі в 1мл агару.культурою в засівній дозі в 1мл агару.

2.2. Тест-культури: для хлортетрацикліну – Тест-культури: для хлортетрацикліну – BBacillusacillus subtilis var. subtilis var. L2.L2.

3.3. За допомогою трафарету під кутом 60º За допомогою трафарету під кутом 60º встановлюють 6 стерильних циліндрів із встановлюють 6 стерильних циліндрів із нержавіючої сталі або алюмінію (циліндри нержавіючої сталі або алюмінію (циліндри також стандартні – однакова маса, розмір - 10 також стандартні – однакова маса, розмір - 10 мм заввишки і внутрішній діаметр 6 мм). мм заввишки і внутрішній діаметр 6 мм).

3232

Метод з використанням металевих Метод з використанням металевих циліндрів циліндрів Активність антибіотиків визначають Активність антибіотиків визначають шляхом порівняння ступеню пригнічення росту шляхом порівняння ступеню пригнічення росту чутливих мікроорганізмів в результаті дії чутливих мікроорганізмів в результаті дії випробовуваного антибіотика і стандартного випробовуваного антибіотика і стандартного зразка у відомих концентраціях. Робочими зразка у відомих концентраціях. Робочими стандартами при дослідженні антибіотику стандартами при дослідженні антибіотику служать спеціальні чисті зразки препаратів, служать спеціальні чисті зразки препаратів, активність яких встановлюється за активність яких встановлюється за міжнародними стандартними препаратами. міжнародними стандартними препаратами.

Робочі стандарти випускають і зберігають Робочі стандарти випускають і зберігають в запаяних ампулах з нейтрального скла і в запаяних ампулах з нейтрального скла і зберігають при температурі не вищій за 0ºС.зберігають при температурі не вищій за 0ºС.

3333

4. 4. В циліндри кожної чашки вносять по В циліндри кожної чашки вносять по 0,1 мл 0,1 мл стандартного розчинустандартного розчину і розчину, що і розчину, що досліджується на антибіотичну активність. досліджується на антибіотичну активність.

5. Чашки закривають і протягом 2 год витримують 5. Чашки закривають і протягом 2 год витримують при кімнатній температурі. За цей час при кімнатній температурі. За цей час відбувається дифузія антибіотику в агар.відбувається дифузія антибіотику в агар.

6. Чашки встановлюють на інкубацію 6. Чашки встановлюють на інкубацію (температура 36-38ºС протягом 18 год). (температура 36-38ºС протягом 18 год).

7. Вимірють діаметри зон пригнічення росту у 7. Вимірють діаметри зон пригнічення росту у випадку стандартного і досліджуваного препарату. випадку стандартного і досліджуваного препарату.

8. За допомогою спеціальних програм роблять 8. За допомогою спеціальних програм роблять необхідні підрахунки антибіотичної активності.необхідні підрахунки антибіотичної активності.

3434

3535

Зони пригнічення росту тест-культури

Металеві циліндри

Нижній незасіяний агаризований шар

Верхній засіяний тест-культурой агаризований шар

Метод з використанням металевих циліндрів

Метод з використанням лунок в Метод з використанням лунок в агаріагарі

Суть метода:Суть метода: 1. В 1. В агаровій пластинці засіяною тест-культурою агаровій пластинці засіяною тест-культурою

роблять лунки діаметром 8 мм, використовуючи роблять лунки діаметром 8 мм, використовуючи пробкове свердло. Блоки видаляють за пробкове свердло. Блоки видаляють за допомогою стерильного скальпеля чи допомогою стерильного скальпеля чи спеціального крючка. В одні лунки вносять спеціального крючка. В одні лунки вносять розчин досліджуваного антибіотика, в інші – розчин досліджуваного антибіотика, в інші – стандартні розчини антибіотика.стандартні розчини антибіотика.

Перевагою цього методу є відсутність Перевагою цього методу є відсутність необхідності стерилізації металевих циліндрів.необхідності стерилізації металевих циліндрів.

3636

3737

Метод з використанням лунок в агарі

8 мм

Лунки із стандартним розчином антибіотика

Лунки із досліджуваним

розчином антибіотика

Зони пригнічення росту тест-культури

Агаровий шар із тест-культурою

Метод з використанням дисків Метод з використанням дисків фільтрувального паперу фільтрувального паперу

На поверхню поживного На поверхню поживного середовища засіяного тест-культурою середовища засіяного тест-культурою розкладають диски фільтрувального розкладають диски фільтрувального паперу змочені досліджуваним розчином паперу змочені досліджуваним розчином антибіотика та його стандартними антибіотика та його стандартними розчинами. розчинами.

Промисловістю випускаються готові Промисловістю випускаються готові диски з антибіотиками.диски з антибіотиками.

3838

Схема методаСхема метода

3939

8 мм

Диски із стандартним розчином антибіотика

Диски із досліджуваним

розчином антибіотика

Зони пригнічення росту тест-культури

Агаризований шар із тест-культурою

Турбідиметричні методи Турбідиметричні методи Методи, що базуються на реєстрації Методи, що базуються на реєстрації

відповідних продуктів метаболізму відповідних продуктів метаболізму тест-організмутест-організму

Методи, які базуються на виділенні Методи, які базуються на виділенні тепла або СОтепла або СО22 в довкілля. в довкілля.

Вплив антибіотика на біолюмінесценцію.Вплив антибіотика на біолюмінесценцію.Хімічні та фізико-хімічні методи Хімічні та фізико-хімічні методи

визначення антибіотиківвизначення антибіотиківОпрацювати самостійно !!!Опрацювати самостійно !!!

4040

4141

Далі буде!