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LEUCEMIA LINFOCÍTICA AGUDA: PERFIL LABORATORIAL E A
IMPORTÂNCIA DA IMUNOFENOTIPAGEM NO DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL
Nelisa Luiza dos Santos*, Denise Oliveira Guimarães**
Resumo
As leucemias agudas são neoplasias hematológicas que se apresentam de duas formas, a
leucemia linfóide aguda (LLA) e a leucemia mielóide aguda (LMA), e posteriormente são
diferenciadas em subtipos. A LLA se caracteriza como o resultado do acumulo de precursores
linfoides imaturos (linfoblasto) na medula óssea, e sangue periférico. Ela compreende 70% a
80% das leucemias agudas em crianças (entre 2 a 5 anos), e apenas 20% em adultos. Para seu
diagnóstico e tratamento certas características clinicas e laboratoriais possui valor prognóstico
e servem para distingui-las em grupos diferentes de risco. Para diagnóstico e classificação da
LLA utiliza-se de análises morfológicas, citoquímicas, citogenéticas e imunofenotípicas.
Métodos esses que apresentam diferentes especificidades e sensibilidade, destacando o ultimo
como o método que eleva para 99% o percentual de casos corretamente classificados.
Classificações juntamente com o diagnóstico em fase inicial da doença tem grande importância
clínica principalmente porque define a terapêutica a ser empregada e a sobrevida do paciente.
As pesquisas e trabalhos acerca de diagnósticos laboratoriais, são cada vez mais necessárias e
pertinentes, visto que técnicas como essas são cada vez de maior constância em uma rotina
laboratorial. Palavras-chave: imunofenotipagem; leucemia linfoide aguda; diagnóstico
diferencial; citometria de fluxo; exames laboratoriais.
ACUTE LYMPHOCYTIC LEUKEMIA: LABORATORY PROFILE AND THE
IMPORTANCE OF IMUNOPHENOTHING IN DIFFERENTIAL DIAGNOSIS
Abstract
Acute leukemias are hematological malignancies that present in two forms, acute lymphocytic
leukemia (ALL) and acute myeloid leukemia (AML), and are later distinguished in subtypes.
ALL is characterized as the result of the accumulation of immature lymphoid precursors
(lymphoblasts) in the bone marrow, and peripheral blood. It comprises 70% to 80% of acute
leukemias in children (between 2 and 5 years), and only 20% in adults. For its diagnosis and
treatment certain clinical and laboratory characteristics have prognostic value and serve to
distinguish them in different groups of risk. For diagnosis and classification of ALL,
morphological, cytochemical, cytogenetic and immunophenotypic analyzes are used. These
methods present different specificities and sensitivity, highlighting the latter as the method that
increases the percentage of correctly classified cases to 99%. Classifications together with the
early diagnosis of the disease have great clinical importance mainly because it defines the
therapy to be employed and the patient's survival. Research and work on laboratory diagnoses
are increasingly necessary and pertinent, since techniques such as these are increasingly more
constant in a laboratory routine. Keywords: immunophenotyping; acute lymphoid leukemia;
differential diagnosis; flow cytometry; laboratory tests.
_________________________ *Acadêmica do 7º período do Curso de Biomedicina na Fundação Presidente Antônio Carlos FUPAC
Uberlândia–MG – e-mail: [email protected] ** Biomédica, Mestre em Ciências da Saúde pela Universidade Federal de Uberlândia-UFU, Profª. do Curso de
Biomedicina na Fundação Presidente Antônio Carlos FUPAC Uberlândia-MG – e-mail: [email protected]
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Introdução
A leucemia é o câncer dos tecidos formadores de sangue e que decorre através da
incapacidade de diferenciação das células blásticas, e envolve multiplicação e disseminação
descontrolada de células anormais e imaturas. Células atípicas quanto a seus processos de
diferenciação, maturação celular e proliferação, que podem levar a morte do indivíduo
acometido (QUIXABEIRA; SADDI, 2008). A produção de células normais capacitadas para
exercer suas funções, é impedida nesses casos pelo excesso de blastos na medula óssea
(COSTA, 2016).
O Instituto Nacional de Câncer (INCA, 2018) estima que em um ano, sejam
diagnosticados em média 5.940 novos casos de leucemia em homens e 4.860 em mulheres. Isso
representa aproximadamente 10% de novos casos para cada 100 mil habitantes. Neoplasias
hematológicas representa em média de 30% dos tumores que acometem indivíduos até os 15
anos.
Diferencia-se e classifica uma leucemia de acordo com a célula de origem e seu grau de
maturação (MICHEL, 2008). Existem diversas formas para a classificação das leucemias, que
tem como finalidade primordial separar as leucemias mielóides (LM) das leucemias linfoides
(LL), agudas e crônicas, principalmente quando há pouca ou nenhuma diferenciação entre os
blastos (ZAGO; et al., 2013). Baseadas em métodos diagnósticos morfológicos, citoquímicos,
citogenéticos e imunofenotípicos, conseguimos a distinção e assim a classificação das
leucemias (PIER, 2008).
Um dos diagnósticos existentes entre as leucemias de acordo com sua linhagem é a
leucemia linfoide aguda (LLA), e é nessa classificação que se baseou esta pesquisa, LLA que
compreende 70% dos casos em criança e é a forma mais comum de câncer na infância, descrita
com o melhor prognóstico entre as leucemias se diagnosticada, classificada e tratada
precocemente (CHIARETTI; ZINI; BASSAN, 2014).
De acordo com o grupo Franco-Americano-Britânico (FAB), a LLA é dividida em tipo B
e tipo T, e em subtipos L1, L2 e L3, porém a OMS (Organização Mundial da Saúde) não
reconhece esses subtipos, classificando apenas em tipo B e tipo T (CHIARETTI; ZINI;
BASSAN, 2014).
Para determinar um diagnóstico conciso e o mais exato possível de uma leucemia, após
achados no exame de hemograma, é utilizado análises morfológicas através do mielograma para
classificação, e também a citoquímica das células imaturas que nos fornece várias informações
e é fundamental para diferenciação entre LLA e a leucemia mielóide aguda (LMA). Contudo a
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falta de detalhes exatos desses dois critérios e a dificuldade encontrada para classificar alguns
pacientes têm levado à busca de outros parâmetros que não só diagnosticam, mas também
classificam, diferenciam, e determinam grau de maturação celular (BAPTISTA, 2012).
A análise de blastos para diagnosticar e diferenciar o tipo de leucemia linfocítica aguda
(B ou T), e avaliar presença de alterações cromossômicas que podem vir a ser numéricas ou
estruturais, é feita através da citogenética juntamente com a imunofenotipagem (PEZZINI;
CASTRO, 2014).
Quanto às classificações fenotípicas das células leucêmicas normalmente são feitas
através do exame da imunofenotipagem por citometria de fluxo (CMF). Método que utiliza
anticorpos monoclonais (AcMo), garantindo alta sensibilidade e especificidade, que permitem
prognosticar o estágio de maturação celular. Dessa forma determina-se o tipo celular e
posteriormente classifica-se o tipo de leucemia desenvolvido. Comparado a microscopia essa
técnica apresenta diversas vantagens, além da alta sensibilidade e especificidade, é um exame
rápido e preciso, sendo fundamental para o paciente aumentando as chances de sobrevida
(COSTA, 2016).
Diante disso temos que alterações cromossômicas (citogenética), quando associadas ao
painel de imunofenotipagem, apresentam papeis relevantes no diagnóstico da LLA (FARIAS;
CASTRO, 2004). Entender a importância da imunofenotipagem como exame diferencial para
LLA torna-se ainda mais evidente diante das recentes pesquisas que constataram que o estudo
imunofenotípico eleva para 99% o percentual de casos corretamente classificados e constitui a
referência mais importante para a classificação das leucemias (SILVEIRA; ARRAES, 2008).
Através de uma revisão bibliográfica, de artigos científicos datados entre os anos de 1985
e 2018, no banco de dados da SciELO (Scientific Electronic Library Online), BVS (Biblioteca
Virtual em Saúde), e no site do Ministério da Saúde. Assim buscando entender como a aplicação
da imunofenotipagem por citometria de fluxo em fase inicial da LLA traz consigo um
prognóstico favorável para o paciente, aumentando sua sobrevida. E ainda descrever a origem
da LLA e avaliar a eficiência das diversas formas diagnósticas existentes quando comparadas
com imunofenotipagem por citometria de fluxo como exame diagnóstico diferencial para a
patologia. Utilizando-se das palavras-chave: imunofenotipagem; leucemia linfoide aguda;
diagnóstico diferencial; citometria de fluxo; exames laboratoriais.
Para o profissional biomédico e a área de conhecimento envolvida nas análises clínicas,
as pesquisas e trabalhos acerca de diagnósticos laboratoriais, são cada vez mais necessárias e
pertinentes, visto que técnicas como essas são cada vez de maior constância em uma rotina
laboratorial.
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Referencial Teórico
Hematopoiese
Células sanguíneas são originadas de um processo denominado hematopoiese (Figura 1).
Processo que a partir de um precursor comum pluripotente (stem-cell ou célula-tronco), origina
células sanguíneas necessárias à vida humana. A hematopoiese é iniciada na fase embrionária,
continuado em vida fetal e posteriormente (a partir da 24ª semana) na medula óssea (MO) é sua
fase mais ativa até o fim da vida (BERTHO; FERRAZ, 2013).
Células-tronco pluripotentes sofrem estímulos por citocinas específicas, as interleucinas
e fatores estimuladores de colônias para dar origem aos precursores mielóides e linfoides,
chamados também de células multipotentes diferenciadas, que por sua vez dão origem a
monócitos, eosinófilos, neutrófilos, basófilos, eritrócitos, Natural Killer (NK) e os linfócitos
(ARENAS, 2009).
Figura 1- Formação das células sanguíneas em nível de Medula Óssea. Fonte: Disponível em: Portal São
Francisco Biologia - Hematopoiese.
Particularmente os linfócitos são conhecidos como um dos defensores do organismo, são
células agranulares caracterizados por possuir núcleo regular e classificados em linfócitos B e
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linfócitos T (HSU et al., 2016). Durante a fase de produção e maturação dos linfócitos B e T,
respectivamente na medula óssea e timo, ocorre expressões de proteínas de membrana que
permitem prognosticar o estágio de maturação celular e expressão dos receptores dos antígenos
que são importantes tanto na produção, regulação, manutenção e liberação para a corrente
sanguínea (CS) dessas células, aonde poderão ir para os órgãos linfoides secundários para
cumprirem a função de atuantes em uma resposta imune contra antígenos circulantes (BRAND
et al., 2009).
Neoplasia hematólogica: leucemia
A leucemia é o câncer dos tecidos formadores das células sanguíneas e que decorre
através da indiferenciação das células blásticas ou proliferação de uma única célula durante a
hematopoiese, envolve multiplicação e disseminação descontrolada de células anormais e
imaturas que compromete o sistema normal da corrente sanguínea (OLIVEIRA; DINIZ;
VIANA, 2004).
Existem tipos diferentes de células, e, portanto, diversas formas de leucemias,
principalmente quando há pouca ou nenhuma diferenciação entre os blastos, são neoplasias que
diferem entre si com relação à linhagem celular comprometida, apresentação clínica e
laboratorial, curso e resposta à terapia (ZAGO; et at., 2013).
Diferencia-se e classifica uma leucemia de acordo com a célula de origem e seu grau de
maturação. Através desses parâmetros temos cinco categorias de acordo com a Associação
Brasileira de Leucemia e Linfoma (ABRALLE, 2009), e são elas: leucemia bifenotípica,
leucemia mielóide crônica (LMC), leucemia mielóide aguda (LMA), leucemia linfoide crônica
(LLC) e leucemia linfoide aguda (LLA) que por sua vez tem o melhor prognóstico entre as
cinco categorias (MICHEL, 2008).
A doença é classificada como aguda e crônica, tomando-se como base o grau de
maturação da população celular envolvida. Leucemias agudas são o tipo mais comum na
infância (OLIVEIRA; DINIZ; VIANA, 2004).
A distinção entre leucemias agudas e leucemias crônicas é feita através do
comportamento de casos não tratados, o paciente invariavelmente irá a óbito em meses quando
apresentada a forma aguda da doença, enquanto que o paciente poderá sobreviver por alguns
anos, se no caso a doença se apresentar de forma crônica (PAN, 2011).
As leucemias crônicas são caracterizadas por progressão lenta e por aumento de células
maduras na corrente sanguínea, mas anormais. Geralmente acomete pessoas mais velhas
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(BENNET, 1985). Já as agudas caracterizam-se pela multiplicação desordenada das células
linfóides imaturas (linfoblastos) (LORENZI, 2002; LOGGETTO; BENITES, 2007).
As leucemias agudas se apresentam de duas formas, a leucemia linfóide aguda (LLA) e a
leucemia mielóide aguda (LMA), e posteriormente são distintas em subtipos, sendo o
diagnóstico diferencial em fase inicial de extrema importância no prognóstico (DANTAS, et
al., 2015).
A leucemia linfóide aguda (LLA) é uma doença grave, e no Brasil, as crianças e jovens
com leucemia linfática aguda (LLA) entram em remissão completa da doença em 70% a 80%
dos casos tratados precocemente (ALMEIDA, 2009).
Leucemia linfóide aguda (LLA)
Descrito como um distúrbio maligno das células progenitoras que afetam linfócitos
maduros (T e B) e seus progenitores na medula óssea, a leucemia linfóide aguda apresenta início
abrupto, com sinais e sintomas de depressão na medula óssea, e é o câncer que resulta do
acometimento dos precursores hematopoiético linfoides (linfoblastos) em fase inicial de
maturação e origina células incapazes de se diferenciar e com proliferação descontrolada, e em
sua fase aguda pode levar o paciente a óbito em poucos meses (HAMERSCHLAK, 2012).
A leucemia linfoide aguda (LLA), compreende 70% a 80% das leucemias agudas em
crianças (entre 2 a 5 anos), e apenas 20% em adultos. A LLA é muito mais comum em pessoas
brancas do sexo masculino. No Brasil, de 10 – 15 novos casos de câncer abaixo de 15 anos, 6
são LLA. Dados apontam que crianças apresentam maior taxa de sobrevida (PAN, 2011).
Segundo Michel (2008), “As crianças do sexo masculino e indivíduos com ataxia-
telangiectasia, trissomia do cromossomo 21, síndrome de Bloom e neurofribomatose tipo I tem
maior susceptibilidade de desenvolver a doença”.
O percentual de cura da LLA é em torno de 80%, e isso decorre devido a melhora no
diagnóstico em fase inicial, através dos diagnósticos diferenciais e utilização de tratamentos
adaptados ao grupo de risco de cada paciente (DANTAS, et al., 2015).
Os precursores hematopoiéticos linfoides os linfoblastos, em condições normais, sofrem
processo de multiplicação e diferenciação progressiva até o estágio de linfócito maduro
(FIGURA 2; FIGURA 3).
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Figura 2- processo de multiplicação e diferenciação progressiva até o estágio de linfócito maduro Fonte:
(PALMER, et al., 2015).
Figura 3- amostra de sangue periférico com presença de linfócitos. Fonte: (PALMER, et al., 2015).
A perda dessa capacidade de diferenciação e maturação associada a uma multiplicação
desordenada faz com que essas células imaturas façam uma hipercelularidade na medula óssea
e sangue periférico (FARIAS; CASTRO, 2004). Devido a essa invasão acentuada de células, a
formação normal das células brancas (série granulocítica), vermelhas (série eritrocítica) como
também das plaquetas (série megacariocítica) são comprometidas (COSTA, 2016). Esse tipo
de leucemia advém dessa proliferação desordenada das células linfóides imaturas (linfoblastos)
(FIGURA 4) (LORENZI, 2002; LOGGETTO; BENITES, 2007).
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Figura 4 – Células blásticas de paciente com LLA (aspirado de medula óssea). Proliferação desordenada das
células linfóides imaturas (linfoblastos) Fonte: (OLIVEIRA; DINIZ; VIANA, 2004).
Etiologia da LLA
Não se sabe ao certo a etiologia das leucemias, vários autores, entretanto deixam claro
que fatores ambientais e hereditários podem estar ligados a origem dessa doença, e também
fatores vindos das interações entre hospedeiro e agentes químicos, físicos, biológicos e virais
(MICHEL, 2008). Embora a sua causa não seja conhecida é muito provável que não resulte de
um dano único, mas sim do acúmulo de vários processos (COSTA, 2016).
A aquisição de múltiplas alterações genéticas nas células pré-leucêmicas altera o controle
celular das mesmas causando acúmulos de clones B ou T imaturos na medula óssea, que
suprime a hematopoiese normal, processo que pode acometer o indivíduo até mesmo na vida
intrauterina (ALMEIDA, 2009).
Sinais e sintomas da LLA
Os principais sintomas da leucemia decorrem do acúmulo dessas células na medula óssea,
prejudicando ou impedindo a produção dos glóbulos vermelhos (causando anemia), dos
glóbulos brancos (causando infecções) e das plaquetas (causando hemorragias). Depois de
instalada, a doença progride rapidamente, exigindo urgência no tratamento (CRIST;
SMITHSON, 2001).
A característica de manifestação clínica da LLA consistem em febre branda,
adenomegalias, manifestações hemorrágicas, sudorese noturna, palidez, fadiga, dor óssea entre
outros. A chamada tríade clinica das leucemias agudas e em especial a LLA, apresenta
diminuição dos leucócitos funcionais, hemácias e plaquetas, assim o médico procede
solicitando exames laboratoriais que o auxiliarão a corroborar com o clínico que o paciente
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apresenta, e assim fechar o diagnóstico, decidindo por fim a melhor terapia para seu paciente
(COSTA, 2016).
Classificações LLA
Classificações junto com o diagnóstico em fase inicial da doença tem grande importância
clínica principalmente porque define a terapêutica a ser empregada (FARIAS; CASTRO, 2004).
A LLA pode ser classificada de várias maneiras diferentes, as primeiras classificações
feitas na década de 70 utilizavam-se de investigações citomorfológicas e citoquímicas
(ALMEIDA, 2009).
Essa neoplasia hematológica que acomete os linfoblastos e que podem ser tanto os
linfócitos precursores B (pré B), quanto T (pré T), origina a classificação do grupo Franco-
Americano-Britânico (FAB), que subdivide primariamente em tipo T ou tipo B pelas
características imunofenotípicas dos linfoblastos, detectando-se o nível de diferenciação do
processo leucêmico, e em subtipos L1, L2 e L3 (CHIARETTI; ZINI; BASSAN, 2014), que
enfatizaremos e veremos mais adiante por ser o método mais utilizado para a classificação da
LLA utilizando achados morfológicos, imunológicos e citogenéticos.
Segundo Dantas e colaboradores (2015), LLA pré-B são responsáveis por mais ou menos
85% dos casos, enquanto 15% são representados por células pré-T.
Em relação a morfologia e com base no diâmetro das células, protuberância dos nucléolos
e quantidade de citoplasma, o grupo Francês-Americano-Britânico (FAB), desenvolveu a
classificação das leucemias agudas. Classificando assim a LLA em três subtipos morfológicos
(L1, L2, L3). Descritas e apresentadas na tabela abaixo.
Tabela 1 – Classificação morfológica (FAB) da Leucemia Linfóide Aguda
Fonte: retirado de SILVEIRA; ARRAES (2008).
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Descrevendo-os da seguinte maneira:
- subtipo L1 os linfoblastos apresentam-se pequenos, com contorno nuclear regular, sem
nucléolos, com pouco citoplasma, sem basofilia. (Figura 5), sendo o subtipo mais comum em
crianças; e consiste em torno de 85% dos casos.
- subtipo L2 (10% dos casos), os blastos apresentam células de tamanhos diversos cujo
citoplasma varia de tamanho e basofilia, podendo apresentar nucléolos e irregularidades de
contorno (Figura 6);
- por último subtipo L3, apresenta células grandes com nucléolos, forte basofilia citoplasmática
e vacúolos, sendo considerada a forma leucêmica do linfócito de Burkitt, com blastos mais
raros, compreendendo de 1 a 2% das LLA (Figura 7). É uma variante da LLA de células B que
necessita de um enfoque terapêutico especial (MICHEL, 2008).
Figura 5 - Leucemia linfóide aguda, subtipo L1 – células primitivas imaturas, pequenas, citoplasma escasso e
núcleos arredondados regulares. Fonte: (ABRALLE, 2009).
Figura 6 - Leucemia linfóide aguda, subtipo L2 – células primitivas imaturas, que variam de tamanho e quantidade
de citoplasma; basofilia variável; núcleos e contornos variados. Fonte: (ABRALLE, 2009).
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Figura 7 - Leucemia linfóide aguda, subtipo L3; células primitivas imaturas com citoplasma de coloração azul
intensa; numerosos vácuolos perinucleares pequenos; aspecto associado geralmente com o tipo de células B (LLA-
B); Fonte: (ABRALLE, 2009).
Mesmo a morfologia sendo o diagnóstico central da LLA, depois de anos passou-se a
incorporar junto a ela outros critérios para um delineamento mais preciso da linhagem, sendo
mais coerente com a realidade do paciente (ALMEIDA, 2009).
Linfoblastos apresentam marcadores imunológicos denominados CDs (cluster of
differentiation), um conjunto de moléculas marcadoras da superfície celular usado para
diferenciar variados tipos de células, que permitem prognosticar o estágio de maturação celular
e são específicos, então determina-se o tipo celular e posteriormente classifica o tipo de
leucemia desenvolvido utilizando esses CDs, elevando o percentual de casos corretamente
diagnosticados (COSTA, 2016).
Tabela 2 – Classificação imunofenotípica e as características imunológicas de LLA
Fonte: Adaptado de (FARIAS, CASTRO 2004)
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Diante desses critérios acima a LLA é assim classificada: través da morfologia e
aprimorada de acordo com o painel imunofenotípicos para elevação do prognóstico favorável
para o paciente, aumentando sua sobrevida (DONGEN; ORFAO, 2012).
Diagnóstico da leucemia linfoide aguda
Para o diagnóstico é necessário o médico correlacionar o exame clinico-fisico com
exames laboratoriais como: hemograma, coagulograma, bioquímicas, sorologias, punção
liquórica, desidrogenase lática, raio-x de tórax, esfregaço sanguíneo da medula óssea
(mielograma), citogenética e imunofenotipagem por citometria de fluxo para diferenciação das
linhagens leucêmicas, exames que são conclusivos para diagnosticar, e classificar a leucemia
linfoide se feito em conjunto (DONGEN; ORFAO, 2012).
Cada exame exibe sua importância para o diagnóstico da doença. Entretanto evidências
deixam claro que a imunofenotipagem por citometria de fluxo (CMF) de acordo com a
expressão de antígenos específicos, permite um diagnóstico bastante preciso e rápido,
classificando até o nível de diferenciação dos blastos. Resultados dados por CMF constataram
que o estudo imunofenotípico eleva para 99% o percentual de casos corretamente classificados
e constitui o parâmetro mais importante para a classificação das leucemias (SILVEIRA;
ARRAES, 2008).
2.7.1 Hemograma
Inicialmente o hemograma completo é o exame hematológico que primeiro aponta
achados para suspeita da LLA, ele é um exame rápido e simples para a contagem global de
células sanguíneas e que também avalia a qualidade dessas células (BAPTISTA, 2012).
Devido à infiltração medular por células leucêmicas, mostrará alterações microscópicas
na contagem e qualidade das células, porém não tem um padrão único, podendo revelar anemias
normocíticas e normocrômicas, trombocitopenia (diminuição das plaquetas), normalmente uma
leucocitose, casualmente uma leucopenia, sendo que nesse último os blastos são menos
numerosos em sangue periférico e em uma leucocitose células blásticas chegam a constituir
uma maioria (OLIVEIRA; DINIZ; VIANA, 2004).
Linfoblastos são células em maioria em pacientes com LLA até mesmo em sangue
periférico, porém esse exame sozinho não consegue nos dar critérios suficientes nem fenótipos
necessários para determinação da leucemia linfocítica aguda, pois devido ao diagnóstico da
LLA ser um processo complexo, muitas são as variáveis que parecem influenciá-lo, por possuir
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aparições em hemograma muito inespecíficos semelhantes ao de outras patologias benignas e
malignas comuns da idade (OLIVEIRA; DINIZ; VIANA, 2004). Fazendo-se necessário
exames complementares para o diagnóstico (BEZERRA et al., 2011).
2.7.2 Mielograma e Citoquímica
Utilizado para avaliar a medula óssea e identificar alterações que nela existe
(celularidade/maturação), o esfregaço de sangue medular (punção aspirativa com agulha
apropriada em osso onde existe atividade hematopoética) é feito pois o diagnóstico e
classificação da LLA fundamenta-se em critérios morfológicos e na demonstração e na presença
de mais de 20% de linfoblastos na medula óssea de acordo com a classificação da OMS/2001,
e blastos acima de 30% de acordo com o grupo FAB (BRAND et al., 2009).
Uma medula óssea hipercelular, com substituição de elementos medulares normais por
células leucêmicas, é uma característica presente em pacientes com LLA; Megacariócitos
diminuídos ou ausentes são observados em nível de sangue medular, com precursores mielóides
e eritróides residuais em normalidade, podendo assim diagnosticar uma leucemia linfoide
aguda, mas não podendo sub classifica-la com clareza (DONGEN; ORFAO 2012). O
biomédico microscopista que está apto a ler e analisar o esfregaço sanguíneo e/ ou medular
deverá descrever as características morfológicas das células observadas indicando se há
presença de blastos granulares ou agranulares, essa descrição é importante para que o médico
hematologista possa laudar o exame e solicite exames mais específicos para classificação
diferencial, pois esse exame também não exime critérios suficientes para determinar a sub-
classificação da patologia de acordo com painel imunofenotípico, que traz consigo um
diagnóstico mais preciso e sensível, apenas classifica morfologicamente como vimos
anteriormente, o material aspirado da medula óssea deve ser submetido a coloração
citoquímicas (SILVEIRA; ARRAES, 2008).
Utilizada como uma técnica de coloração para auxílio diagnóstico a Citoquímica consiste
em usar importantes corantes para diferenciar as leucemias linfoblásticas agudas (LLA) das
demais leucemias (TABELA 3) (OLIVEIRA; DINIZ; VIANA, 2004). O ácido periódico - Shiff
(PAS), a peroxidase ou o Sudan Black B são alguns dos principais corantes utilizados.
(BEZERRA at al., 2011).
O glicogênio da célula é corado pelo PAS. Os linfoblastos frequentemente demonstram
um padrão de positividade nas formas de anéis concêntricos ou em bloco grosseiro, sendo que
na linhagem linfocítica B uma reação PAS positiva é mais frequente do que na de linhagem T.
As reações de mieloperoxidase e Sudan black são úteis para estabelecer e confirmar diagnóstico
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de LMA, já que são reações negativas nas leucemias linfóides e é fortemente positiva em células
da série granulocítica e fracamente positiva em monócitos, definindo assim o diagnóstico das
leucemias mielóides agudas (LMA) e a separando da LLA (BAPTISTA, 2012).
Tabela 3 – Reações citoquímicas que diferenciam as LLA das LMA
Fonte: retirado de (OLIVEIRA; DINIZ; VIANA, 2004).
Sendo assim utilizado para diferenciação apenas de LLA e LMA, nos dando critérios para
apenas distinguir as duas leucemias agudas e não seus subtipos (SILVEIRA; ARRAES, 2008).
2.7.3 Citogenética Convencional
Outro exame necessário no diagnóstico de uma LLA para determinação de padrão
genético da leucemia é a citogenética convencional, e outras técnicas de biologia molecular
(HALLEK et al., 2008).
As análises citogenéticas são preconizadas pela OMS pois leva a compreensão dos
mecanismos envolvidos na malignidade e para encontrar genes de importância biológica. É um
exame mais refinado que investiga as mutações cromossômicas pela análise do cariótipo e
revela alterações de expressão gênica numéricas dos cromossomos pela determinação da ploidia
ou alterações estruturais, entre elas as inversões, deleções, translocações (QUIXABEIRA;
SADDI, 2008).
Na LLA, assim como nas outras leucemias, a determinação do cariótipo é mais importante
para a avaliação do prognóstico do que para diagnóstico diferencial (REGO; SANTOS, 2009).
As células leucêmicas podem ser classificadas em hipodiplóides (<46 cromossomos),
diplóides (46 cromossomos) e hiperdiplóides (> 46 cromossomos). As hiperdiplóides de
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Linhagem B (> 50 cromossomos) são encontradas em torno de 20% das crianças com LLA e
têm uma boa resposta clínica. As hipodiplóides têm pior prognóstico. Uma ou mais
anormalidades cromossômicas são apresentadas em 70% dos casos de LLA. A mais comum
destas é o Cromossomo Ph (Philadelphia), translocação dos braços longos dos cromossomos
22/9, encontrado entre 3-5% das crianças com LLA (HARRISON et al., 2010).
O estudo da ploidia é de utilidade prognóstica, pois determina-se o genótipo das amostras
com suspeitas de leucemia. A técnica nos oferece também outras informações como por
exemplo, o estadiamento da neoplasia, evidencias de linhagem celular, entre outras, porém por
ser um exame que utiliza material colhido diretamente da medula óssea o torna uma técnica
invasiva, além do mais precisa-se fazer a coleta do material quando este estiver em processo de
metáfase e que os cromossomos alcancem o máximo de condensação e alinhamento, pois senão
torna-se de difícil visualização a presença das anormalidades (SILVEIRA; ARRAES, 2008).
2.7.4 Imunofenotipagem por citometria de fluxo multiparamétrica (CMF)
Quando se trata de diagnóstico diferencial e utilização de tratamentos adaptados ao grupo
de risco de cada paciente a imunofenotipagem é fundamental para agregar ao diagnóstico
morfológico a determinação da linhagem (B ou T) e estágio de maturação dos linfoblastos
(DONGEN; ORFAO; 2014).
Imunofenotipagem por CMF é um exame que consiste em diferenciação através de AcMo
(anticorpo monoclonal), quando encontra-se células que são muitos semelhantes em seu aspecto
físico quando observadas ao microscópio óptico, porém células que possuem diferentes
moléculas em sua membrana ou citoplasma que as diferem uma das outras (COSTA, 2016).
Vários estudos o descrevem como método diagnóstico que eleva a determinação
diagnóstica correta para 99% dos casos, é indispensável para o entendimento, tratamento,
prognóstico e acompanhamento da doença (REGO; SANTOS, 2009).
Através da técnica de CMF conta-se, examina-se e é possível classificar partículas
microscópicas e que são suspensas em meio liquido em fluxo, refere-se então citometria de
fluxo multiparamétricas, pois é possível fazer avaliação simultaneamente de vários parâmetros
(BAPTISTA, 2012).
Vários descritores apontam que essa técnica possui objetividade, sensibilidade, rapidez e
precisão na análise das características celulares, incluindo o conteúdo de DNA, detecção e
quantificação de antígenos celulares, análise de resistência celular a drogas e a análise de
conteúdo citoplasmático (PIER, 2008).
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A realização desta técnica para diagnóstico de LLA, pode ser feita através de dois
principais materiais biológicos: sangue periférico e medula óssea, por isso caracteriza-se como
uma vantagem em comparação aos outros exames, mielograma e citogenética, podendo ser feita
assim que se diagnostica o paciente, melhorando o diagnostico em fase inicial (SOUTO, 2011).
É necessário a utilização de um painel de AcMo (anticorpo monoclonal) que pode ser criado a
partir da suspeita de diagnóstico do médico especialista. A imunofenotipagem baseia-se na
reação antígeno-anticorpo, utilizando-se anticorpos monoclonais conjugados a fluorocromos
(CHIARETTI; ZINI; BASSAN, 2014).
O painel para fenotipagem das células leucêmicas consta na literatura que varia de um
lugar para outro, contudo existem marcadores que são essenciais para a determinação da
linhagem celular envolvida (COSTA, 2016). Então sugere-se um painel mínimo de
combinações de anticorpos e fluorocromos para a imunofenotipagem, desenvolvido pelo grupo
Euroflow, atualmente referência para os casos de neoplasias hematológicas o painel fenotípico
para LLA-B expressa marcadores HLA-DR, TdT, CD10, CD19, CD20, CD21, CD22c,
CD79a/b, Kappa ou Lambda e IgM. Já o painel fenotípico de LLA-T expressa CD1a, CD2,
CD4, CD45, CD45RA, CD99, HLADE, TCRαβ, TCRγδ, CD3 Cit/Sm (COSTA, 2016).
São preconizados alguns itens para a execução da imunofenotipagem. Primeiramente
precisa-se que as células da medula óssea, linfonodo ou do sangue sejam recém coletadas, para
que desse modo produzam resultados em poucas horas. O material coletado deve ser
cuidadosamente misturado com anticoagulante (EDTA, heparina ou ACD) e rapidamente
transportado, em temperatura ambiente, para o laboratório que realizará a citometria de fluxo e
preferencialmente, deve ser analisado até 24 horas após a coleta. Esse material deve ser
separado para análises pelo gradiente de centrifugação (RAWSTRON, 2015).
Inicialmente, de acordo com a expressão de antígenos específicos que as células
leucêmicas apresentam e utilizando os paneis fenotípicos pode-se classificar a linhagem T ou
B, e de acordo com as características imunofenotípicas dos linfoblastos caracterizamos o nível
de diferenciação em que se encontra o processo leucêmico, isso é de grande importância pois
dessa forma casos são classificados baseados nas características individuais de cada paciente e
em fase inicial (CHIARETTI; ZINI; BASSAN, 2014).
O citômetro de fluxo juntamente com o painel da imunofenotipagem permite que a
amostra seja analisada de forma rápida e eficiente, com maior quantidade de detalhes, pois as
células em suspensão passam em fileiras em fluido de revestimento dentro do citômetro,
individualmente são analisadas através da dispersão da luz dos fluorocromos que tem como
objetivo classificar as células de acordo com a sua morfologia e granulosidade (característica
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intracitoplasmática) através dos AcMo, e logo após através de software específico identificar
em uma mesma amostra populações celulares distintas com maior número de especificidade
(QUIXABEIRA; SADDI, 2008).
Segundo Chiaretti, Zini e Bassan (2014), a imunofenotipagem por citometria de fluxo,
tornou-se um exame importantíssimo para determinação de diagnósticos corretamente
classificados devido a sua alta sensibilidade e especificidade.
Vários estudos têm demonstrado resultados satisfatórios na utilização dessa
caracterização imunofenotípica da clonalidade celular, Iwamoto e colaboradores (2011),
avaliaram através desse exame a expressão de antígenos em 1.774 crianças com LLA. Foram
observados que os marcadores CD3Cit e CD7 apresentaram positividade para todos os casos.
E os antígenos CD2, CD5 e TdT, apresentaram-se em 80% das LLA-T.
Esse resultado nos mostra o quanto houve um crescimento considerável na identificação
e análises de estruturas biológicas de difícil visualização, quando se comparado por exemplo a
microscopia. É de grande relevância utilizar a imunofenotipagem por CMF para elevar o
percentual de casos corretamente classificados, é importante analisar melhor a natureza celular,
e obter precisão nas análises (SILVEIRA; ARRAES, 2008).
A análise precisa da região intra e extracitoplasmática das células, assim como a
caracterização mais adequadas dos eventos imunológicos e moleculares fundamenta a saúde e
a doença, com isso pode-se compreender melhor cada advento do processo leucêmico
(NAOUM, 2001).
Como este diagnóstico está cada vez mais presente dentro de grandes centros
laboratoriais, Craig e colaboradores (2008), intitula a citometria de fluxo uma ferramenta
importantíssima para a imunofenotipagem, e ressalta a importância de os profissionais
biomédicos possuírem conhecimentos elevados sobre as características das linhagens celulares
em estudo.
Outra grande vantagem é que essa técnica possui uma ampla aplicação para o diagnóstico
e investigação para fins de resultados de pesquisas (SILVEIRA; ARRAES, 2008).
Entretanto também existem algumas desvantagens na técnica, dentre elas a perda celular
(por fragilidade no momento da preparação) e trabalhar com material a fresco com um número
considerável de células neoplásicas (NAOUM, 2001). Outra limitação e um grande desafio é
encontrar profissionais treinados para realização do procedimento e padronizar protocolos para
tornar o prognóstico menos confuso para o laboratorista (CRAIG, 2008). Mas vemos que nada
é tão grande quando se comparada as vantagens dessa técnica rápida e precisa.
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Conclusão
Portanto, diante da revisão bibliográfica estudada para confecção deste artigo foi possível
verificar os achados laboratoriais e eficácia dos diversos exames utilizados no diagnóstico da
LLA. Cada exame exibe sua importância no diagnóstico de tal patologia, sendo que o
diagnóstico específico laboratorial das leucemias linfoides agudas requer sempre a citologia, a
citoquímica e a imunofenotipagem. Vemos através desse que tornou-se uma ferramenta
indispensável o uso da imunofenotipagem por CMF para o diagnóstico e classificação da LLA,
pois o método baseia-se na habilidade única de detectar anormalidades imunofenotípicas,
determinar a imaturidade da população leucêmica e ainda a definição correta da linhagem
celular e subtipos, em quantidades mínimas de amostras em sangue periférico ou medula óssea.
Com isso casos de difícil diagnóstico conseguem ser esclarecidos e classificados, através
de múltiplos parâmetros analisando regiões intra e extra citoplasmaticas, que a microscopia não
consegue visualizar. O uso dos marcadores celulares tem papel importante por ajudar na
determinação da estratégia a ser utilizada no tratamento, delineando mais precisamente a
linhagem celular envolvida seu estágio de maturação, sendo mais coerente com a realidade do
paciente.
A imunofenotipagem e as técnicas citogenéticas têm contribuído de maneira fundamental
para a compreensão da biologia molecular e do tratamento da LLA. Existem ainda muitos
desafios a serem superados pela imunofenotipagem por citometria de fluxo, um deles senão o
maior é padronizar protocolos e painéis imunofenotípicos, para tornar a técnica 100% eficiente,
e atualizações de profissionais treinados, no mais é uma técnica sensível, rápida e específica,
que aplicada em fase inicial traz consigo boas chances aos pacientes.
A população biomédica ainda carece do entendimento mais profundo desta metodologia
e do conhecimento dos marcadores antigênicos necessários para a alta qualidade da
imunofenotipagem, por isso fica aqui minha sugestão para mais estudos referentes a métodos
laboratoriais de diagnósticos diferencial da LLA. A interpretação dos resultados deve
compreender a história clínica do paciente e os outros testes diagnósticos realizados. Pois, de
um diagnóstico correto e preciso dependerá a escolha do tratamento adequado e o prognóstico
da doença de cada paciente.
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