les pathogenes des crevettes peneides : exemple …
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UNIVERSITÉ D'ANTANANARIVO
FACULTÉ DE MÉDECINE
DÉPARTEMENT D’ENSEIGNEMENT
DES SCIENCES ET DE MÉDECINE VÉTÉRINAIRES
ANNÉE : 2008 N°0004
LES PATHOGENES DES CREVETTES PENEIDES : EXEMPLE DES
ELEVAGES LARVAIRES A MADAGASCAR, INTERET THERAPEUTIQUE
DES PROBIOTIQUES.
THÈSE
Présentée et soutenue publiquement
le 07 avril 2008 à Antananarivo
Par
Mademoiselle FARIDA Hassani
Née le 21 Septembre 1981 à Mahajanga
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR EN MÉDECINE VÉTÉRINAIRE
(Diplôme d'État)
MEMBRES DU JURY
Président : Professeur ANDRIANASOLO Roger
Juges : Docteur GRANGMONTAGNE Claude
: Docteur RAJAONARISON Jean Joseph
Rapporteur : Docteur LE GROUMELLEC Marc
UNIVERSITÉ D'ANTANANARIVO
FACULTÉ DE MÉDECINE
DÉPARTEMENT D’ENSEIGNEMENT
DES SCIENCES ET DE MÉDECINE VÉTÉRINAIRES
ANNÉE : 2008 N°
LES PATHOGENES DES CREVETTES PENEIDES : EXEMPLE DES
ELEVAGES LARVAIRES A MADAGASCAR, INTERET THERAPEUTIQUE
DES PROBIOTIQUES.
THÈSE
Présentée et soutenue publiquement
le 07 avril 2008 à Antananarivo
Par
Mademoiselle FARIDA Hassani
Née le 21 Septembre 1981 à Mahajanga
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR EN MÉDECINE VÉTÉRINAIRE
(Diplôme d'État)
MEMBRES DU JURY
Président : Professeur ANDRIANASOLO Roger
Juges : Docteur GRANGMONTAGNE Claude
: Docteur RAJAONARISON Jean Joseph
Rapporteur : Docteur LE GROUMELLEC Marc
DEDICACES
« Et invoque ton Seigneur en toi-même, en humilité et crainte, à mi-voix, le matin et
le soir, et ne sois pas du nombre des insouciants. »
A mes parents : Monsieur HASSANI Moussa (feu) et Madame SOAMANANA
Rosette
Pour tant d’amour et dévouement. Pour vos affections, en témoignage de ma fierté,
permettez-moi de vous exprimer ma reconnaissance éternelle. Que Dieu vous bénisse.
A mon Frère et mes Sœurs et mes Beaux-Frères
Sans votre aide et votre soutien, peut-être que je …. Donc ma réussite est la nôtre.
A Adonis,
Un compagnon dévoué, tendre et aimable et qui est toujours présent dans les meilleurs
comme dans les mauvais moments.
A mes Neveux et mes Nièces
Toutes mes tendresses et mes meilleurs vœux. Je vous aime!
A mes Cousins et Cousines
Vos encouragements me sont précieux.
A mes Amis
Vos soutiens sont des forces.
A tous ceux qui ont contribué de près ou de loin à la réalisation de cette thèse
Votre aide a été capitale.
Nos sincères salutations
À NOS MAÎTRES ET HONORABLES JUGES DE THÈSE
Monsieur le Docteur GRANDMONTAGNE Claude
Docteur vétérinaire, Assistant technique français
Conseiller du Chef de Département
FOFIFA-DRZV
Monsieur le Docteur vétérinaire RAJAONARISON Jean Joseph
Docteur vétérinaire et microbiologiste
Enseignant de maladies infectieuses et de pathologie des animaux de rentes
Qui nous ont fait le grand honneur de siéger parmi les membres du jury de cette thèse.
Qu’ils veuillent recevoir l’expression de notre respectueuse admiration et nos vifs
remerciements.
À NOTRE RAPPORTEUR DE THÈSE
Monsieur le Docteur LE GROUMELLEC Marc
Docteur vétérinaire et Docteur d’Université
Directeur de Domestication, Biosécurité et Génétique Aqualma
Qui m’a accepté au sein de la Société Aqualma comme stagiaire.
Qui a accepté sans hésitation la direction de ce travail.
Pour la confiance et la disponibilité qu’il nous a accordée.
Qu’il veuille accepter l’assurance de notre profonde considération et nos sincères
reconnaissances.
A NOTRE PRESIDENT DE THESE
Monsieur le Professeur ANDRIANASOLO Roger
Professeur spécialiste en nutrition et santé publique
Enseignant à l’Université d’Antananarivo et Mahajanga à la faculté de médecine.
Qui nous a fait le grand honneur de présider la soutenance de cette thèse.
Qu’il veuille recevoir l’expression de notre profonde gratitude.
À NOTRE MAÎTRE ET DOYEN DE LA FACULTE DE MEDECINE
D’ANATANANARIVO
Monsieur le Professeur RAJAONARIVELO Paul
Veuillez recevoir l’expression de notre haute considération.
À TOUS NOS MAÌTRES ET PROFESSEUR DE LA FACULTE DE
MEDECINE-DEPARTEMENT D’ENSEIGNEMENT DES SCIENCES ET DE
MEDECINE VETERINAIRES.
Notre reconnaissances pour tous les enseignements que vous nous avez prodigué.
AUX RESPONSABLES DE LABORATOIRE CENTRAL AQUALMA (LCA) ET
TOUS LES PERSONNELS.
Vos précieuses collaborations, tous nos hommages respectueux.
Ma grande reconnaissance
AUX RESPONSABLES DE SITES D’ELEVAGE LARVAIRE DE MIFIKO ET
ECLOSERIE DE MORAMBA PROPRIETE D’AQUALMA.
Pour vos aides techniques. Tous nos remerciements et nos reconnaissances.
SOMMAIRE
INTRODUCTION 1
PREMIERE PARTIE : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I-Rappels sur la crevette pénéide 4
I-1- Biologie 4
I-1-1 Le cycle de la reproduction des crevettes pénéides 5
I-1-2 Les différents stades de crevettes pénéides 6
I-2-La crevetticulture dans le monde et à Madagascar 8
II-Les pathogènes de crevettes pénéides 9
II-1 Pathogènes viraux 9
II-1-1 Pathogènes viraux dans le monde 9
II-1-1-1 WSSV: White Spot Syndrome virus 10
II-1-1-2 TSV: Taura Syndrome Virus 11
II-1-1-3 YHV: Yellow Head Virus 13
II-1-1-4 IHHNV: Infectious Hypodermal and Haematopoietic
Necrosis Virus 15
II-1-1-5 IMNV: Infectious MyoNecrosis Virus 16
II-1-1-6 HPV: Hepatopancreatic Parvovirus 16
II-1-1-7 MBV: Monodon Baculovirus 17
II-1-2 Pathogènes viraux à Madagascar (ouest océan indien et est de
l’Afrique) 18
II-1-2-1 HPV: Hepatopancreatic Parvovirus 19
II-1-2-2 MBV: Monodon Baculovirus 19
II-1-2-3 MONODON SLOW GROWTH SYNDROME
(MSGS) et les autres virus de crustacés décrits en Afrique de l’Est (y compris
Madagascar). 20
II-2 Les parasites 20
II-2-1 les parasites des crevettes dans le monde 20
II-2-1-1 Les parasites internes 21
II-2-1-2 Les parasites externes 22
II-2-1-3 Les pathogènes fongiques 23
II-2-2 Les parasites des crevettes à Madagascar 24
II-2-2-1 Parasites internes 24
II-2-2-2 Parasites externes (Zoothamnium spp.; Vorticella spp.;
Epistylis spp.) 25
II-3 Pathogènes bactériens 25
II-3-1 Pathogènes bactériens dans le monde 25
II-3-1-1 Bactéries intracellulaires 25
II-3-1-1-1NHP-B: Necrosis Hepatopancreatic
Bacterium 25
II-3-1-1-2 RLB: Rickettsia Like Bacterium 27
II-3-1-1-3 Spiroplasma 27
II-3-1-2 Eubactéries 28
II-3-2 Pathogènes bactériens à Madagascar 30
II-3-2-1 Bactéries intracellulaires 30
II-3-2-2 Eubactéries 31
II-4 Les pathogènes de crevettes pénéides en élevage larvaire a Madagascar 32
II-4-1 Les champignons 32
II-4-2 Les parasites 32
II-4-3 Les bactéries 33
DEUXIEME PARTIE : MATERIELS ET METHODES
I-Contexte de l’étude 34
I-1 Description de l’élevage larvaire de Mifoko 34
I-2 Les techniques d’élevage larvaire des pénéidés 35
I-3 Les moyens de contrôle des élevages larvaires et de leur état sanitaire 35
II- Objectifs et intérêts 38
III- Matériels et méthodes 39
III-1 LES PROBIOTIQUES Y COMPRIS AQUACULTURE
THERAPY 42
III-2 Observation des larves 43
III-2-1 Observation visuelle des larves 45
III-2-2 Observation microscopique des larves 46
III-3 Analyse bacteriologique 47
III-3-1 Définition et objectif 47
III-3-2 Prélèvement des échantillons 47
III-3-3 La culture bactérienne 47
III-3-4 La lecture des colonies bactériennes 48
IV-Analyse histologique 50
IV-1 Définition et Objectifs 50
IV-2 La technique histologique 50
IV-2-1 Prélèvement des échantillons 51
IV-2-2 Fixation et immersion 51
IV-2-3 Dissection et mise en cassette 55
IV-2-4 Paraffination 57
IV-2-5 Mise en bloc 58
IV-2-6 Coupe et montage sur lame 60
IV-2-7 Coloration et montage sur la lamelle 62
IV-2-7-1 Colorations de routine Hématoxyline-éosine 62
IV-2-7-2 Colorations spéciales 68
IV-2-7-2-1 La coloration de Giemsa 68
IV-2-7-2-2 La coloration de Feulgen 70
IV-2-7-2-3 La coloration de Gram de Twort 70
IV-2-8 Observation microscopique 71
IV-2-8-1 Observation microscopique de la coloration de
routine 71
IV-2-8-2 Observation microscopique des colorations
spéciale 72
TROISIEME PARTIE : LES RESULTATS
I- RESULTATS 73
I-1 Résultat d’élevage 73
I-1-1 Résultat de la survie des larves et post-larves 73
I-I-2 Résultat des analyses bactériologiques 76
I-1-2-1 Résultat de l’analyse bactériologique de l’eau de
remplissage 76
I-1-2-2 Résultat des colonies bactériennes de broyat des
animaux 78
I-2 Résultats des observations in vivo, à l’œil nu et à la loupe binoculaire 81
I-3 Résultats histologiques 81
II-Interprétation et Discussion 90
II-1 Interprétation 90
II-2 Discussion 93
III-Suggestions 98
CONCLUSION 101
Annexes
Références Bibliographiques et Webographies
LISTE DES TABLEAUX
Tableau I : Protocole pour le test d’efficacité du produit Aqaculture Therapy 40
Tableau II : Critères de lecture des bactéries de la famille Vibrionaceae 49
Tableau III: Méthode de fixation en fonction de l’âge 54
Tableau IV: Méthode de fixation en fonction du poids 54
Tableau V: Nombre d’animaux fixés en élevage larvaire 55
Tableau VI: Séquence de la coloration de routine 67
Tableau VII: Séquence de coloration de Giemsa 70
Tableau VIII : Résultats des colorations spéciales 72
Tableau IX: Résultat du dénombrement des colonies bactériennes de l’eau de
remplissage 77
Tableau X: Résultat histologique en pourcentage 83
LISTES DES FIGURES
Figure I: Diagramme d’étude histologique 51
Figure II : Fixation 52
Figure III : Immersion 53
Figure IV : Diagramme de dissection 56
Figure V : Mise en cassette 57
Figure VI : Diagramme de la mise en bloc 59
Figure VII : Coupe 60
Figure VIII : Diagramme du montage sur lame 61
Figure IX : Diagramme général de la coloration 62
Figure X : Montage de la lamelle 64
Figure XI: Courbe de survie des larves et post-larves 73
Figure XII : Composition relative de la flore microbienne vibrionacée des broyats des
animaux, mise en évidence par le rapport du nombre de colonies vertes sur le nombre de
colonies jaunes (ratio vertes/jaunes). 78
Figure XIII : Lésions bactériennes de l’HP au grossissement x1000 à la coloration H&E
(Hématoxyline – éosine – phloxine) 84
Figure XIV: Lésions bactériennes de l’HP au grossissement x600 à la coloration de
Giemsa 84
Figure XV : Lésions bactériennes de l’HP au grossissement x1000 à la coloration de
Giemsa 85
Figure XVI : Mélanisation de l’appendice causée par les bactéries ; Zoothamnium au
x600 à la coloration H&E (Hématoxyline – éosine – phloxine) 85
Figure XVII : Mélanisation de l’appendice causée par les bactéries ; Zoothamnium au
x400 à la coloration H&E (Hématoxyline – éosine – phloxine) 86
Fugure XVIII : Nodule hémocytaire au Grossissement x600 à la coloration
H&E 87
Figure XIX : Mélanisation abdominale ventrale au grossissement x600 à la coloration
H&E (Hématoxyline – éosine – phloxine) 88
Figure XX : Mélanisation abdominale dorsale au grossissement x600 à la coloration
H&E (Hématoxyline – éosine – phloxine) 88
LISTE DES ABREVIATIONS ADN: Acide Désoxyribonucléique
ARN: Acide Ribonucléique
Booster : Bac de volume réduit servant à faire des expériences à petite
échelle.
FMT: Flore Mésophile Total
H&E: Hématoxyline et Eosine
HPV: Hepatopancreatic Parvovirus
IHHNV: Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus
IMNV: Infection Myonecrosis Virus
ISH: In Situ Hybridation
MBV : Monodon Baculovirus
ml: millilitre
MSGS: Monodon Slow Growth Syndrom
NHP-B: Necrosis Hepatopencreatic Bacterium
OIE: Office International des Epizooties
PCR: Polymarese Chain Reaction
PLs: Post-Larves
RDS: Runt Deformity Syndrome
RLB: Rickettsis Like Bacterium
TCBS: Thiosulfate Citrate Bile Sucrose Agar
TSV: Taura Syndrome Virus
UFC: Unité Format Colonies (CFU en anglais)
WSSV: White Spot Syndrome Virus
YHV: Yellow Head Virus
INTRODUCTION
1
INTRODUCTION
A Madagascar, la crevette est devenue l’un des principaux produits
d’exportation, d’abord en pêche puis en aquaculture, industrie qui depuis une dizaine
d’année a connu un développement et a ouvert une nouvelle ère dans le secteur
halieutique malgache. Ce développement permet notamment de combler l’éventuelle
surexploitation en pêche de ces espèces de crustacés et de diversifier la gamme des
produits malgaches, notamment pour l’exportation. Cet élevage constitue un secteur
intéressant de l’aquaculture, compte tenu des bénéfices qu’il génère et des cycles de
production courts.
Au cours des dernières années, l'élevage des crustacés s'est remarquablement
développé à travers le monde. Plusieurs pays ont poussé ce type de production et
d'autres lancent des programmes de développement. Mais depuis une vingtaine
d’années, la production a fortement reculé dans certains pays en raison de la mortalité
massive due à plusieurs maladies (Chen, 1996). C’est comme dans tous les autres types
d'élevage, il est possible que les agents pathogènes se multiplient et causent des pertes
considérables (Vanelli, 2000). Ce sont les pathogènes viraux qui font surtout des
ravages sur la pénéiculture mondiale. Des virus, tels que le syndrome de Taura qui a
frappé les côtes américaines en premier (Lightner, 1997) et le syndrome des taches
blanches qui a fâcheusement touché l’Asie. Mais tous ces pathogènes redoutables
n’existent pas encore sur les côtes malgaches, et ce sont plutôt des pathogènes
bactériens qui dérangent la production à Madagascar. Ceux-ci sont pour la plupart des
pathogènes opportunistes, mais il existe comme on le verra par la suite de véritables
agents pathogènes bactériens chez la crevette pénéide.
La bonne santé des crevettes en élevage passe avant tout par une maîtrise de la
biosécurité, pour éviter qu’elles n’attrapent des maladies provenant de leur
environnement, ainsi que par la prophylaxie, qui est indispensable au succès pour
l'élevage des crevettes, et passe notamment par le maintien de la meilleure qualité d'eau
possible, avec un renouvellement en quantité suffisante, ainsi que par le contrôle de
l'excès de sédiments riches en matières organiques dans le fond du bassin et la maîtrise
du risque de surpopulation (densités très éloignées de leurs conditions de vie dans la
nature) (Vanelli, 2000).
2
C’est dans ce cadre de l’amélioration des conditions de vie en élevage
qu’Aqualma a décidé de mener des essais de produits commerciaux à base de
probiotiques dans ses élevages larvaires, afin de mieux prévenir les infections
bactériennes qu’il est fréquent d’observer à ce stade de développement. Les
probiotiques sont définis comme des microbes vivants ayant des effets bénéfiques sur la
communauté microbienne ambiante de l’élevage voire sur l’hôte lui-même (tractus
digestif). Ces effets sont obtenus par la modification de la flore microbienne de l’eau
d’élevage larvaire, la modification de la flore intestinale, en assurant l’amélioration de
la qualité du milieu ambiant et la stimulation de la résistance des post-larves ou
juvéniles aux maladies bactériennes (Preetha et al., 2007).
L’un de ces produits est appelé Aquaculture Therapy. C’est un produit
commercial constitué de plusieurs souches bactériennes probiotiques en dormance. Il est
censé agir en enrichissant la qualité de l’eau d’élevage, et conséquemment en réduisant
le risque d’une infection bactérienne et en augmentant la survie, en diminuant le stress
et en stimulant la croissance saine de toutes les espèces aquatiques. Les bactéries qu’il
contient sont supposées « nettoyer » le fond du bac d’élevage en consommant la matière
organique en dégradation, provenant des microorganismes et organismes morts qui vont
tapisser le fond des bacs d’élevage larvaire et constituer un biofilm complexe avec les
débris alimentaires. Selon la documentation fournie, Aquaculture Therapy comprend
des souches bénéfiques spécialement développées pour améliorer la qualité de l’eau en
limitant la croissance des microorganismes pathogènes. Un groupe de bactéries
bénéfiques a été sélectionné et isolé. Ce groupe est un antagoniste des espèces
pathogènes. Les souches bénéfiques rivalisent pour la même source d’aliment avec les
souches essentiellement pathogènes, et agissent sur celles-ci par compétition pour une
même niche écologique.
L’objectif recherché dans l’utilisation de ce produit est de diminuer la nécessité
de traitement antibiotique ou antiparasitaire voire de les supprimer si possible, et
également d’éliminer ou du moins de réduire le siphonage, pour mieux aider les larves
et les post-larves à résister aux infections bactériennes qui peuvent être la cause de
beaucoup de mortalités en élevage larvaire. Ainsi notre étude s’est concentrée sur
l’efficacité de ce produit vis-à-vis des infections bactériennes et parasitaires.
3
Afin de bien dégager la nécessité ou l’intérêt de cette expérience en élevage
larvaire, nous allons tout d’abord décrire les pathogènes des crevettes pénéides au
niveau mondial, puis plus spécifiquement à Madagascar pour souligner les enjeux
économiques existants. Nous traiterons dans un chapitre spécifique les agents
pathogènes présents en élevage larvaire à Madagascar, car c’est durant cette phase
d’élevage que notre travail expérimental s’est effectué. Nous décrirons ensuite les
diverses méthodes d’élevage et d’analyse utilisées pour obtenir nos résultats concernant
l’effet du probiotique testé en petits bacs d’élevage, tant sur les paramètres d’élevage
que sur les flores bactériennes. Nous insisterons plus particulièrement sur les analyses
bactériennes effectuées et les éventuelles lésions bactériennes ou parasitaires des
crevettes révélées par les examens réalisés au laboratoire de pathologie des crustacés
d’Aqualma.
PREMIERE PARTIE: SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
4
I- RAPPELS SUR LA CREVETTE PENEIDE (cf. Annexe I)
La pêche crevettière mondiale est en baisse constante de production, en raison
notamment d’une mauvaise gestion des populations sauvages et de la préssion de pêche
qu’elles peuvent supporter. Plusieurs espèces sont réparties dans le monde. Les
crevettes les plus importantes dans le Golfe du Mexique sont les crevettes brunes
Penaeus aztecus, les crevettes blanches Penaeus setiferus et les crevettes roses Penaeus
duorarum. En aquaculture, deux crevettes exotiques sont produites sur la côte du Golfe
du Mexique. Ce sont les crevettes blanches du Pacifique Litopenaeus vannamei et les
crevettes bleues du Pacifique Penaeus stylirostris. Ces deux espèces sont les plus
utilisées à travers les côtes Est et Ouest de l’Amérique. En Asie, dans le Pacifique et en
méditerranée, les espèces suivantes sont les plus utilisées : Penaeus monodon, Penaeus
merguiensis, Penaeus chinensis, Penaeus japonicus, Penaeus semisulcatus, Penaeus
indicus, Penaeus penicillatus et Metapenaeus ensis (il est cependant important de noter
que Litopenaeus vannamei est de plus en plus souvent élevée en Asie, supplantant
même largement la culture de Penaeus monodon dans les plus gros pays producteurs).
Penaeus monodon, souvent appelée encore la crevette tigre géante ou « black
tiger prawn » était l’espèce leader en pénéiculture mondiale, jusqu’à 2003, date à
laquelle Litopenaeus vanamei est devenue l’espèce la plus élevée sur l’ensemble des
continents. (Johnson et al., 1995).
Les espèces pêchées à Madagascar sont Penaeus indicus ou « White », Penaeus
monoceros ou « Pink », Penaeus monodon ou « black tiger », Penaeus semisulcatus ou
«brown tiger », Penaeus japonicus (Couteaux et al., 2003). Mais seule la fameuse
Penaeus monodon est élevée à Madagascar et Aqualma possède de plus une population
domestiquée de cette variété (cf. en Annexe I).
I-1- BIOLOGIE (cf. Annexe III)
La crevette est recouverte d’une cuticule protectrice appelée exosquelette, qui
est articulée, et elle possède des appendices, comme les autres arthropodes. La plupart
des organes sont localisés au niveau de la « tête » appelée « céphalothorax » et les
muscles sont concentrés au niveau de l’abdomen. (Johnson et al., 1995).
5
I-1-1 Le cycle de la reproduction des crevettes pénéides (cf. en
Annexe II)
La Penaeus monodon mature se reproduit seulement dans des habitats marins tropicaux
et passe par les stades larvaires, les stades post-larvaires, le stade juvénile/adolescent et
adulte dans les estuaires côtiers, les zones lagunaires ou les mangroves. Dans la nature,
elles montrent une activité nocturne marquée, en s'enfuyant dans le substrat durant le
jour et émergeant la nuit pour chercher de la nourriture comme tous les mangeurs
benthiques.
Les mâles sauvages produisent des spermatozoïdes à partir d’un poids corporel de 35 g
et les femelles deviennent gravides à partir de 70 g. L'accouplement a lieu durant la nuit,
juste après la mue des femelles pendant que la cuticule est encore souple, et le sperme
véhiculé dans un spermatophore (sac) est introduit puis subséquemment conservé dans
les voies génitales femelles, inséré dans un thélycum fermé. La maturation de l'ovaire
suit cinq étapes: non développé, développé, presque mature, mature, et épuisé. Les
femelles de P. monodon ont une fécondité élevée, les femelles gravides produisant
500.000 à 750.000 œufs voire plus, dont plus de 80 à 90 % sont en général fécondés. La
ponte a lieu la nuit et la fécondation, externe, a lieu au sortir des voies génitales
femelles. L'éclosion a lieu 12 à 15 heures après la fécondation (Anonyme, 2002).
Après l’éclosion, les larves mènent une vie planctonique marine, pendant deux
ou trois semaines. Elles passent par différents stades larvaires puis post-larvaires.
Ces post-larves vont alors remonter dans les estuaires, dans les lagunes d’eau
saumâtre et les mangroves où elles vont rester 4 à 5 mois. Elles se nourrissent alors de
petits crustacés, de moules, de vers et de matière organique en décomposition
(cadavres).
Devenus sub-adultes ou juvéniles au cours de cette période, les crevettes
retournent alors vers la mer pour commencer à nouveau leur cycle de reproduction. Les
adultes de crevettes pénéides vivent en mer dans les zones de profondeur de 20 m à
70 m d’eau ; ils rampent au fond et sont capables de nager. La reproduction dépend
surtout de la saison, des conditions climatiques (salinité et température) et également du
cycle lunaire. A Madagascar, elle a lieu du mois de novembre au mois de février, cela
explique la période de la fermeture de la pêche. (Pradel, 2000).
6
I-1-2 Les différents stades de crevettes pénéides (cf. en Annexe II)
Les stades larvaires et post-larvaires
Au cours de son développement, le genre Penaeus présente plusieurs stades
larvaires avant d’atteindre le stade adulte. Ces stades sont morphologiquement et
biologiquement très différents du stade juvéniles-adultes. Le premier stade larvaire,
appelé nauplius, est morphologiquement très simple et ne se nourrit pas. Il ne dure que
quelques heures. Le second stade larvaire, appelé zoé, est d’une organisation assez
éloignée de l’adulte et mène une vie planctonique. Le troisième stade larvaire, appelé
mysis, est clairement une étape de transition entre les stades antérieurs et la forme de la
post-larve. Ces stades restent planctoniques pendant quelques temps et sont transportés
vers la côte par les courants des marées. Les post-larves ressemblent aux juvéniles et
aux adultes, et deviennent progressivement plus benthiques.
Stade nauplius
Après une courte période de développement embryonnaire de 14 à 18 heures,
l’œuf donne naissance à une larve appelée nauplius de 0,3 à 0,7 mm de long. Elles
nagent librement et ressemblent à des petites araignées. C’est le premier stade du
développement larvaire. Le stade nauplius ne se nourrit pas, mais utilise ses réserves
vitellines pour se développer. Selon les auteurs, six stades nauplius successifs ont été
décrits, depuis le nauplius II qui sort de l’œuf jusqu’au nauplius VI, les mues
successives permettent à l’animal de se métamériser en quelques heures et de constituer
ses organes internes, pour obtenir le nauplius VI, prêt à ouvrir la bouche et à
commencer à s’alimenter, après sa métamorphose dans le stade larvaire suivant appelé
zoé. Ceci a lieu dans un processus de développement qui dure une quarantaine d’heures
au total. (Le Groumellec, 1996).
Stade zoé
Il succède au stade nauplius et débute par l’ouverture de la bouche, les crevettes
mesurant 0,9 à 2,6 mm de longueur et étant capables de s’alimenter. Les stades zoés ont
des appendices simples et des corps allongés, muent trois fois et se métamorphosent
avant d’atteindre un nouveau stade. Chaque stade dure 24 heures ou plus et ils se
nourrissent principalement d’algues phytoplanctoniques.
7
Stade mysis
Les mysis qui ont des corps segmentés, des yeux pédonculés, une queue plus
proche de celle des crevettes adultes, et muent aussi trois fois avant de passer au stade
post-larve. Elles mesurent entre 2,6 et 4,5 mm de longueur. Elles ont un régime
omnivore et un comportement de recherche active de la nourriture (chasseur).
Stade post-larve
La mysis 3 se métamorphose en une jeune crevette morphologiquement
semblable à l’animal adulte, appelée post-larve. Les post-larves mènent une vie
pélagique puis deviennent rapidement benthiques ainsi elles changent leurs habitudes
alimentaires pour se nourrir des détritus benthiques, des vers polychètes et des petits
crustacés, surtout à partir du stade post-larve 6 (six jours après la métamorphose
mysis – post-larves).
Stade adulte
L’acquisition de l’ensemble des caractéristiques de l’adulte (mise en place de
tous les organes ou tissus) a lieu environ un mois et demi après l'éclosion. Mais
l’apparition des caractères sexuels secondaires n’est nettement visible que plus tard,
lorsque leur poids atteint de 5 à 10 g. Les stades juvéniles et adolescent peuvent tolérer
des conditions de salinité aussi basses que 1-2 ‰, elles sont donc beaucoup plus
euryhalines que les stades larvaires ou adultes. (cf. Annexe III)
Mue et croissance
Chez les crevettes Pénéides, la croissance est un phénomène discontinu, comme
chez les autres crustacés. Ceci s’explique par le phénomène de l’exuviation de la
cuticule et le remplacement de celle-ci par une nouvelle cuticule, qui s’accompagne
d’une entrée massive d’eau provoquant une augmentation rapide du poids et de la
longueur de l’animal. Le cycle de mue correspond à la répétition cyclique des
exuviations. Entre celles-ci, la crevette élabore de nouveaux tissus à partir des composés
et de l’énergie métabolisée lors de ses consommations d’aliment (Pradel, 2000).
8
I-2 LA CREVETTICULTURE DANS LE MONDE ET A MADAGASCAR
(cf. en Annexe II)
Il existe globalement trois méthodes d’élevage industriel pour le grossissement en
crevetticulture actuellement dans le monde. Cependant, certaines petites exploitations
sont dites artisanales ou familiales et ne rentrent pas forcément dans ces catégories.
Elevages extensifs
Dans l’élevage extensif, la densité utilisée est faible, de moins 5 individus par
m2. Les rendements sont en conséquence faibles, de l’ordre de 200 kg par hectare et par
an. Ce système nécessite peu de maintenance, il est utilisé dans les zones très riches en
proies naturelles des pénéides. Aucune alimentation artificielle (granulés) n’est
apportée. Cette méthode d’élevage correspond à ce qui se pratiquait traditionnellement
en Asie. L’aquaculture actuelle ne pourrait jamais satisfaire la demande mondiale en
restant à ces rendements, compte tenu également de la superficie réduite des zones où
l’on peut pratiquer cette aquaculture.
Elevages semi-intensifs
L’élevage semi-intensif est le type d’élevage le plus utilisé dans les pays en voie
de développement. Ce type d’élevage montre le plus de stabilité et de rentabilité dans le
temps (Anonyme, 1987). Les crevettes sont élevées dans des bassins de terre de 5000
m2 au minimum jusqu’à 10 hectares voire plus, à raison de 20 individus par m2, ce qui
représente une densité moyenne (Akiyama, 1994 ; Samudra, 1994). La hauteur de l’eau
est en moyenne de 120 cm dans ces bassins. L’alimentation se fait à la fois par les
proies vivantes (zooplancton) présentes dans le bassin et par un apport de granulés qui
complémente la ration, et apporte notamment les doses nécessaires de vitamines.
Elevages intensifs
Ce type d’élevage était à l’origine très peu répandu dans le monde car il
nécessite des investissements importants. Les bassins sont de petite taille et électrifiés,
car il est nécessaire d’ajouter des aérateurs en raison des biomasses très élevées qu’ils
peuvent contenir. Ils nécessitent aussi beaucoup de maintenance, une alimentation
quasi-totalement basée sur l’apport de granulés et un contrôle strict des paramètres
d’élevage. La biomasse dans le bassin d’élevage est supérieure à 1.2 à 1.3 kg/m2 soit 50
9
à 200 crevettes/m2. Le rendement peut être très élevé, de 15 à 20 t/ha/an. Si cette
méthode d’élevage est alléchante sur le papier, elle est néanmoins très risquée et a pour
l’instant systématiquement mené à des échecs économiques, si la biosécurité des
élevages n’est pas parfaitement maîtrisée.
La raison en est principalement les mortalités déclenchées par des agents
pathogènes qui deviennent épizootiques du fait de la densité élevée des individus et du
stress supérieur des crevettes qui les rendent plus sensibles à ces maladies. Si ce modèle
d’élevage représente une des voies d’avenir possibles de la crevetticulture, il n’est pas
encore applicable sur le terrain, car les animaux mis en bassins sont très souvent
porteurs d’agents pathogènes et de plus ils sont le produit de géniteurs sauvages dont le
statut sanitaire est par principe inconnu et n’ayant également subi aucun processus de
sélection en vue de les rendre plus résistants au stress ou aux maladies. L’étape
préalable de la domestication prend donc ici toute son importance, afin de pouvoir
contrôler l’état sanitaire et le bagage génétique de ces animaux. Elle est indispensable à
l’intensification des élevages, qui devient malheureusement souvent nécessaire pour des
raisons économiques et de biosécurité en zone endémique d’un pathogène listé OIE par
exemple.
II-LES PATHOGENES DE CREVETTES PENEIDES (cf. Annexe IV)
II-1 LES PATHOGENES VIRAUX
II-1-1 PATHOGENES VIRAUX DANS LE MONDE
On dénombre une vingtaine de virus connus affectant les crevettes marines
pénéides. La plupart de ces virus ont été découverts suite aux problèmes rencontrés dans
les élevages. En Occident, les virus du syndrome de Taura (TSV) et de la nécrose
hypodermique et hématopoïétique infectieuse (IHNNV) ont gravement affecté les
élevages des côtes américaines et d’Hawaii et, dans un cas, une pêcherie commerciale a
également été affectée; alors qu’en Asie, les virus du syndrome des taches blanches
(WSSV) et de la maladie de la tête jaune (YHV) ont provoqué des pandémies dont
l’impact économique est considérable. Ces maladies virales qui affectent les crevettes
10
depuis une dizaine d’années freinent considérablement la réussite de ce secteur dans
nombre de pays pratiquant cet élevage (Lightner et al., 1997).
II-1-1-1 WSSV: White Spot Syndrome virus
Généralités
C’est une maladie hautement infectieuse, contagieuse commune en pénéiculture.
Elle continue d'être l'une des plus graves maladies rencontrées dans l'industrie de la
crevette. Elle cause une perte considérablement élevée en aquaculture industrielle. La
maladie causée par le White Spot Syndrome Virus est encore appelée la maladie des
taches blanches.
Etiologie
Le virus des points blancs ou du syndrome des points blancs est un virus à ADN
circulaire à double brin, enveloppé, dont la forme varie du bâtonnet à une silhouette
obovale, actuellement classé dans la famille des Nimaviridae, genre Whispovirus. Il
présente un appendice filamenteux unique. Sa localisation cellulaire est nucléaire, et le
génome est de taille importante, atteignant environ 305 kb (Van Hulten et al., 2002).
Diagnostic clinique et lésionnel
La plupart des infections à WSSV affectent l’ectoderme et le mésoderme. Ils
comprennent l’épithélium subcuticulaire, les branchies, les organes lymphoïdes, les
glandes antennaires, les tissus hématopoïétiques, les ovaires et les cordes nerveuses
ventrales.
Les principaux signes cliniques du syndrome sont les taches blanches sur
l’exosquelette et l’épiderme des crevettes malades, d’une taille d’environ 0,5 à 2 mm de
diamètre. Les autres signes de la maladie comprennent la réduction rapide de
consommation d’aliment des crevettes léthargiques ou moribondes, l’anorexie, la
coloration rougeâtre ou rose du corps. En 3 jours, on observe fréquemment 100% de
mortalité dans un bassin dont la population est infectée (Nakano et al. 1999).
L’histopathologie sur des sections colorées à l’hématoxyline-éosine montre un
nombre modéré à important de noyaux hypertrophiés contenant des inclusions
basophiles centrales, entourées de chromatine excentrée, dans les tissus d’origine
11
ectodermique et mésodermique (en particulier les tissus sous-cuticulaires de l’estomac,
du céphalothorax et des branchies). L’amplification par polymérisation en chaîne (PCR)
des tissus et de l’hémolymphe permet de confirmer la maladie, ainsi que le transfert de
type western (western blot) et l’hybridation in situ (ISH) d’ADN.
La présence simultanée de WSSV avec les autres virus comme le Monodon
Baculovirus (MBV) et l’Hepatopancreatic Parvovirus (HPV) a été signalée en Inde
(Otta et al., 2003).
Epidémiologie
Le virus de la maladie des points blancs est hautement infectieux pour les
espèces de crevettes pénéides, plusieurs espèces de décapodes ou d’autres crustacés
(Chakraborty et al., 2002).
Il existe une transmission horizontale, une transmission verticale du virus. La
transmission transovarienne a été confirmée et la transmission dans l’œuf n’a pas été
exclue (Lo et al., 1997).
Géographiquement, la maladie des points blancs a été enregistrée dans la plupart
des pays asiatiques où les crevettes pénéides sont élevées en viviers. Les foyers initiaux
ont été signalés dans la République Populaire de Chine en 1993, et se sont disséminés
rapidement en Asie. Depuis le début de 1999, elle est largement présente dans les
fermes d’aquaculture de crevettes en Amérique. Ces foyers infectieux peuvent
apparaître à toutes saisons et à toutes phases de l’élevage en étang, mais ils semblent
fortement influencés par les conditions environnementales, comme les températures
basses, qui déclenchent l’infection en dessous de 30°C. D’autres facteurs déclenchant
sont notamment liés au stress.
II-1-1-2 TSV: Taura Syndrome Virus
Généralités
C’est un virus hautement infectieux surtout pour la crevette d’Amérique
centrale, L. vannamei. Il a causé les plus lourdes pertes économiques après le WSSV par
la mortalité élevée de crevettes d’élevage. Le Taura Syndrome Virus est encore appelé
le syndrome de Taura en français.
12
Etiologie
Le virus du syndrome de Taura se trouve dans la famille des Dicistroviridae.
C’est un virus à ARN non enveloppé icosaédrique, à réplication cytoplasmique.
Son diamètre est de 31-32 nm et avec un génome de 10,2 kb.
Diagnostic clinique et lésionnel
Sur le plan clinique le syndrome de Taura présente trois phases distinctes :
une phase aiguë, une phase de transition et une phase chronique.
Les crevettes au cours de la phase aiguë arrêtent de s’alimenter, sombrent
rapidement dans une phase d’agonie. Elles prennent une teinte rougeâtre à cause de
l’expansion des chromatophores. Elles présentent des carapaces molles, et un intestin
vide. Un examen minutieux de l’épithélium cuticulaire des annexes cutanées
(notamment des bords des uropodes ou des pléopodes) avec une loupe de grossissement
10 permet souvent d’observer des signes d’une nécrose épithéliale focale.
Les crevettes dans la phase de transition sont des crevettes qui ont survécu à la
phase aiguë. Elles montrent des lésions cuticulaires mélanisées, multiples et de forme
irrégulière qui se répartissent au hasard. On observe des cuticules souples et une
expansion des chromatophores rouges. Elles recommencent à se comporter et à se
nourrir normalement. Après plusieurs mues successives, les crevettes en phase de
transition passent en phase chronique, dans laquelle il n’existe aucun signe distinctif.
Au laboratoire, la coloration éosinophile de la fragmentation du cytoplasme
confère une apparence caractéristique « poivrée » ou « criblée à la chevrotine » à ces
lésions. L’organe lymphoïde est typiquement indemne dans la phase aiguë du syndrome
de Taura. Durant la phase de transition du syndrome de Taura, les lésions mélanisées de
la cuticule ressemblent à des lésions d’une maladie bactérienne de la carapace. Et dans
la phase chronique à l’exception des importants sphéroïdes dans l’organe lymphoïde,
aucune autre lésion n’est apparente. Les sphéroïdes dans l’organe lymphoïde donneront
des résultats positifs au test d’identification du virus du syndrome de Taura par ISH
d’ADN spécifiques/complémentaires de l’ARN transcrit du virus du syndrome de
Taura. L’ISH d’ADN spécifiques donne des détails complémentaires.et le PCR avec la
transcriptase inverse d’extrait d’ARN des tissus et de l’hémolymphe confirme la
maladie.
13
Epidémiologie
Le virus du syndrome de Taura est un virus hautement infectieux pour la
crevette d’Amérique centrale, L. vannamei. Toutes les crevettes pénéides contractent
cette maladie. Des études d’épreuves virulentes effectuées en laboratoire suggèrent que
P. monodon et P. japonicus sont résistants au syndrome de Taura. Le syndrome de
Taura peut survenir chez les post-larves approximativement à partir du stade post-larve,
au douzième jour après la métamorphose (P12), chez les juvéniles et chez les adultes.
La plupart des épizooties se produisent dans les élevages en stades précoces des
juvéniles.
Il y a une transmission horizontale et une transmission verticale.
Le syndrome de Taura a été diffusé de l’Amérique vers l’Asie après avoir été
identifié pour la première fois en Équateur en 1991 et 1992. Il a été isolé, décrit et
identifié comme la cause du syndrome de Taura en 1994 et 1995. De 1992 à 1995, le
virus du syndrome de Taura s’est propagé par l’expédition de post-larves et de
reproducteurs infectés. Il est enzootique dans les populations de crevettes d’élevage et
dans certaines populations sauvages de pénéides en Amérique.
II-1-1-3 YHV: Yellow Head Virus
Généralités
Yellow Head Virus (YHV) est une maladie hautement infectieuse de crevettes
pénéides connues. Il cause des pertes économiques énormes. On appelle encore la
maladie de la tête jaune.
Etiologie
Le virus de la tête jaune est un virus à ARN, en bâtonnet, enveloppé, et à brin
unique de sens positif, actuellement classé dans la famille des Rinoviridae de l’ordre des
Nidovirales, genre Okavirus. C’est un virus à réplication cytoplasmique, d’environ
15nm de diamètre et contenant 22 kb d’acide nucléique. Le virus est associé au virus
des branchies (Gill-Associated Virus) et le virus de vacuolisation des organes
lymphoïdes (Lymphoid Organ Vacuolization Virus) provenant d’Australie, qui sont
étroitement apparentés, bien que seul le virus associé aux branchies semble s’avérer
pathogène. Les éléments présentés ci-après s’appliquent à la fois au virus de la tête
jaune et au virus associé aux branchies.
14
Diagnostic clinique et lésionnel
Les signes cliniques de la maladie de la tête jaune commencent par une forte
consommation d’aliments, suivie par une interruption brutale de l’alimentation, et une
mortalité dans la population (observation inconstante). La région du céphalothorax peut
prendre une coloration jaunâtre due à la légère coloration jaune de l’hépatopancréas
sous-jacent et à sa consistance anormalement molle (observation inconstante).
La coloration générale du corps est toujours d’une clarté anormale ou d’apparence
blanchie.
Sur le plan lésionnel, la décoloration jaune du céphalothorax n’est pas toujours
observée.
L’examen histopathologique de sections colorées à l’hématoxyline-éosine de crevettes
moribondes montre un nombre modéré à important d’inclusions cytoplasmiques
intensément basophiles dans les tissus d’origine ectodermique et mésodermique
(en particulier les tissus sous-cuticulaires de l’estomac, du céphalothorax et des
branchies). Dans le même étang, des frottis d’hémolymphe provenant de crevettes
infectées mais non moribondes montrent des noyaux caryorrhectiques et pycnotiques en
l’absence de septicémie bactérienne. Le PCR de tissus et de l’hémolymphe, le Transfert
de type western (Western blot), de l‘ISH d’acides nucléiques confirment la maladie.
La lecture de l’examen histopathologique peut se réaliser à l’aide de TEM.
Epidémiologie
Le virus de la maladie de la tête jaune est hautement infectieux pour les crevettes
pénéides. Parmi eux, des infections surviennent sans qu’elles montrent de signes
pathologiques.
La transmission est uniquement horizontale.
Le virus a été signalé pour la première fois en Thaïlande en 1991. Le virus
associé aux branchies, qui lui est étroitement apparenté, a été signalé uniquement
comme associé à des mortalités dans des fermes d’aquaculture de crevettes d’Australie.
Le virus de la maladie de la tête jaune frappe surtout le stade juvénile dans les
populations naturelles de P. monodon, l’adulte est plus ou moins résistant et le stade
post-larve montre une forte résistance. Et le virus entraînant la vacuolisation des
organes lymphoïdes, qui est étroitement apparenté et non pathogène, a été observé
fréquemment dans les populations sauvages de P. monodon d’Australie, mais pas chez
15
les autres espèces de crevettes. Des foyers de la maladie peuvent survenir en toute
saison, mais ils se déclarent généralement 50 à 70 jours après le peuplement de l’étang.
II-1-1-4 IHHNV: Infectious Hypodermal and Haematopoietic
Necrosis Virus
Généralités
IHHNV est une maladie mortelle de crevettes Pénéides P. stylirostris au stade
juvénile. Elle affecte également d’autres espèces de pénéides.
Etiologie
L’IHHNV est un petit virus à ADN simple brin linéaire 4,1 kb, icosaédrique,
non enveloppé de diamètre 20 à 22 nm. La réplication du virus est nucléaire. Le virus
est dans la famille de Parvoviridae.
Diagnostic clinique et lésionnel
La virulence de ce virus varie selon les espèces de pénéides. Ainsi, les crevettes
telles que L. vannamei et P. monodon infectées par le IHHNV ne meurent pas.
Toutefois, l'infection chronique par ce virus se traduit par une maladie appelée Runt
Deformity Syndrome (RDS) pour les deux espèces et également P. stylirostris. Le RDS
peut également causer des pertes économiques importantes (Primavera et al., 2000).
Les crevettes infectées montrent une diminution de la consommation d’aliment,
un cannibalisme marqué, une léthargie et des mortalités, dans le cas de P. stylirostris.
Sur le plan lésionnel les animaux montrent une musculature abdominale opaque,
de nombreux foyers mélanisés. Au laboratoire, la détection du virus se fait
habituellement par l’histopathologie. L’ISH et la PCR peuvent fournir la plus haute
détection.
Epidémiologie
Toutes les espèces de pénéides sont infectées. L’IHHNV a été détecté pour la
première fois à Hawaii en 1981 chez P. stylirostris au stade juvénile. Le virus a été
détecté dans d'autres espèces Pénéides dans le monde. Il est présumé être enzootique
dans l’Indopacifique et en Equateur (Lightner et al., 1983a). Il existe une transmission
horizontale et une transmission verticale.
16
II-1-1-5 IMNV: Infectious MyoNecrosis Virus
Généralités
C’est une maladie infectieuse causant de lourdes pertes économiques. La
maladie est récemment inscrite dans la liste de l’OIE.
Etiologie
L’IMNV est un virus à ARN non enveloppé, icosaédrique. La taille du virus est
d’environ 40 nm et possède un génome d’environ 7,7 kb. Le virus appartient à la famille
de Totiviridae.
Diagnostic
Les foyers blancs dans le muscle et en particulier sur l’abdomen sont des signes
révélateurs de la maladie, ainsi que la nécrose de l’uropode qui devient rouge. Les
organes lymphoïdes sont hypertrophiés. On observe un faible taux de survie (30-40%).
Tous ces signes sont observés aux stades post-larves, juvéniles et adultes.
Au laboratoire, des nécroses musculaires aigues du foyer, avec coagulation et
œdème, des inclusions cytoplasmiques basophiles, une inflammation hémocytaire et des
fibroses sont observées. Il y a fréquemment des sphéroïdes (LOS) dans l’organe
lymphoïde, mais souvent ectopiques aussi.
Epidémiologie
Le virus de l’IMNV est hautement contagieux. Chez L. vannamei il est apparu
dès les post-larves du sixième jour, chez P. stylirostris aux post-larves du treizième jour
et chez P. monodon il n’y a pas des signes cliniques. Dans les deux dernières espèces, il
n’y a pas de mortalité mais sur L .vannamei la mort survient dès le stade post-larve du
treizième jour.
Le virus a été signalé pour la première fois en 2003 au Brésil, et s’est ensuite
largement diffusé dans le monde, d’abord en Amérique du Nord puis en Asie (Tang et
al., 2005).
II-1-6 HPV: Hepatopancreatic Parvovirus
Généralités
L’Hepatopancreatic Parvovirus (HPV) est une maladie infectieuse qui
touche essentiellement P. monodon et P. chinensis, mais également de nombreuses
autres espèces.
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Etiologie
C’est un virus à ADN simple brin de taille 4 à 5,8 kb, non enveloppé et
icosaédrique avec des particules virales de 22 à 24 nm de diamètre approximativement.
Diagnostic clinique et lésionnel
Souvent les crevettes infectées par le HPV montrent des signes non spécifiques
comme l’anorexie, un hépatopancréas atrophié, un faible taux de croissance. Les
crevettes deviennent faibles, les branchies sont souillées par les organismes
épicommensaux.
Le diagnostic de la maladie peut s’effectuer par l’histopathologie. Un test rapide
à la coloration de Giemsa de l’hépatopancréas met en évidence des taches. La sonde et
la PCR sensibles, ont été aussi développés pour le diagnostic du HPV (Sukhumsirichart
et al., 1999).
Epidémiologie
De nombreuses espèces de pénéides sauvages et domestiques ont été signalées
comme hôtes biologiques du HPV.
Les plus hauts niveaux de l’infection au HPV ont été signalés très tôt au stade
juvénile (Flegel et al., 1995). La transmission est horizontale et verticale.
Le HPV était signalé pour la première fois en Thaïlande en 1992 chez P.
monodon. Le virus HPV infecte la plupart des espèces de pénéides et est présent dans le
monde entier.
II-1-1-7 MBV: Monodon Baculovirus
Généralités
Monodon Baculovirus ou MBV est le premier virus signalé chez P. monodon
(Lightner and Redman, 1981).
Etiologie
Le virus du MBV est un virus à ADN double brin circulaire, enveloppé. C’est un
virus à localisation nucléaire de forme polyédrique. Il appartient à la famille des
Baculoviridae (Rohrmann, 1986).
18
Diagnostic clinique et lésionnel
Le MBV est un pathogène fréquent à large dissémination et à large distribution,
malgré sa faible virulence sur P. monodon. Les crevettes infectées par le MBV montrent
un retard de croissance significatif et leur hépatopancréas infecté devient pâle avec une
couleur jaune à brunâtre. On observe généralement le MBV dans des infections mixtes,
avec d’autres maladies virales (IHNNV, HPV, WSSV), ou des maladies bactériennes
causées par des bactéries opportunistes (Vibrio spp., Pseudomonas spp.) et des maladies
parasitaires Zoothamnium spp., Epistylis spp. Les organes cibles de la maladie sont
l’hépatopancréas et l’intestin supérieur (Anderson et al., 1987).
La caractéristique principale du diagnostic de l’infection au MBV est la présence
d’un noyau hypertrophié avec des inclusions sphériques simples ou multiples.
L’histopathologie est utilisée pour détecter la maladie. Toutefois la PCR et les sondes
moléculaires ont été développés pour la détection, ainsi que le test (Hsu et al., 2000).
Epidémiologie
Le MBV est un pathogène fréquent à large dissémination et à large distribution,
malgré sa faible virulence sur P. monodon. Il a été identifié et signalé chez toutes les
espèces de pénéides.
La transmission est uniquement horizontale.
La maladie a été observée et signalée en Asie et en Australie. La maladie est
enzootique de la région chez les espèces sauvages.
Le MBV a été trouvé au Moyen Orient et on a aussi noté sa présence en Italie,
en Afrique et en Amérique suite à l’importation des crevettes pénéides (Lightner, 2001).
II-1-2 LES PATHOGENES VIRAUX A MADAGASCAR (OUEST
OCEAN INDIEN ET EST DE L’AFRIQUE)
Etant donné la virulence et l’étendue des pathogènes viraux inscrits dans la liste
de l’OIE, même si Madagascar est encore indemne de ces maladies virales réputées
hautement infectieuses et contagieuses, il est nécessaire de connaître parfaitement leurs
caractéristiques pour mieux se défendre contre leur apparition et se préparer à contenir
leur diffusion sur l’île. Compte tenu des énormes pertes qu’elles provoquent et de la
difficulté de les éradiquer, cela semble essentiel si Madagascar veut conserver son statut
19
sanitaire et son industrie aquacole. Il faut toujours être vigilant concernant les maladies
contagieuses, et le moyen le plus efficace pour prévenir leur apparition est de se doter
des moyens de les dépister précocement. Pour dépister une maladie, la connaissance de
ses caractères est primordiale.
Mais il n’existe à ce jour à Madagascar que des pathogènes viraux signalés sur
les zones côtières de l’Afrique et à l’Ouest de l’Océan Indien et qui touchent
essentiellement l’espèce P. monodon. Ce sont les virus HPV, MBV et un syndrome,
nommé le « Monodon Slow Growth Syndrome » ou MSGS qui est présent dans la faune
sauvage malgache et que l’on suspecte d’être causé par un virus à ARN. Il existe de plus
des virus déjà détectés dans la faune crustacée malgache mais qui à ce jour n’ont pas
posé de problèmes chez les crevettes pénéides en élevage, en particulier un iridovirus
chez les chevaquines (Tang et al., 2007), un Baculovirus chez les crabes et un
Parvovirus chez les P. indicus sauvages.
II-1-2-1 HPV: Hepatopancreatic Parvovirus
Le virus du HPV infecte la plupart des espèces pénéides et est distribué dans la
nature dans beaucoup de parties du monde y compris Madagascar (Fulks and Main,
1992).
Le virus infecte également P. monodon qui est la seule espèce exploitée en élevage
industriel à Madagascar. Il n’a cependant pas causé à ce jour de dégâts particuliers en
élevage, n’a pas été considéré comme responsable de mortalités ni n’a induit de baisse
de performance des animaux notable. La souche de virus malgache est génétiquement
distincte des souches thaïlandaises et coréennes.
II-1-2-2 MBV: Monodon Baculovirus
Cette maladie a été observée et signalée au Sri Lanka, qui est dans l’Océan
Indien. La maladie est enzootique de la région chez les espèces sauvages. Au Moyen
Orient, le MBV a été détecté à Oman qui est un pays dans l’Océan Indien (Lightner,
2001). Comme le virus a été signalé et est présent dans l’Océan Indien et qu’il infecte
de façon enzootique les espèces sauvages, alors l’Ile n’est pas épargnée de sa présence.
20
Il disparaît cependant des populations en élevage si les crevettes ont un confort de vie
acceptable.
II-1-2-3 MONODON SLOW GROWTH SYNDROME
(MSGS) et les autres virus de crustacés décrits en Afrique de l’Est (y compris
Madagascar).
Le retard de croissance qui affecte quelques fermes d’élevage de crevettes en
Afrique de l’Est et dans l’Océan Indien ressemble à un problème appelé « Monodon
Slow Growth Syndrome » qui a été décrit chez P. monodon en Thaïlande dès 2001. Le
problème du syndrome de retard de croissance a pu être observé dans des crevettes
produites en Afrique pour la première fois en 2004. Le poids moyen des crevettes
affectées au bout de six mois d’élevage ne dépassait pas 19 g. C’est une perte de 30 %
par rapport aux crevettes à la croissance normale au même âge.
Il reste à démontrer que les retards de croissance observés en Afrique et en
Thaïlande, en Inde voire ailleurs en Asie sont dus aux mêmes agents pathogènes,
à moins qu’ils ne soient liés à d’autres facteurs encore inconnus (Anantasomboon et al.,
2006).
II-2 LES PARASITES
II-2-1 LES PARASITES DES CREVETTES DANS LE MONDE
Certains parasites jouent un rôle non négligeable sur la santé des crevettes.
Comme leur enveloppe extérieure est également leur squelette, certains animaux s’y
fixent et s’y développent, surtout dans les endroits protégés et à surface importante
comme les branchies. Lorsque l’infestation est trop forte, la physiologie de la crevette,
et notamment sa respiration peut en être très affectée. Le seul moyen pour la crevette
pour s’en débarrasser est de changer de carapace, ce qui a lieu pendant la mue. Jusqu’au
stade adulte, si l’animal vit confortablement, il pourra maintenir ces ectoparasites à des
niveaux acceptables.
Il existe également des parasites internes affectant gravement la crevette, qui possède un
arsenal de défenses réduit.
21
II-2-1-1 LES PARASITES INTERNES
MICROSPORIDIES
Les microsporidies sont des parasites internes qui envahissent le muscle, lequel
devient blanc laiteux. A ce stade, elles sont encore appelées cotton shrimp ou milk
shrimp nosema disease. Bien que l'infection ne soit pas immédiatement mortelle,
l’apparence affecte la valeur marchande et la qualité des produits parasités.
Trois des genres de microsporidies ont été signalés chez les crevettes pénéides à
Madagascar. Ces trois genres sont : Agmasoma (ou Thelohania), Ameson (ou Nosema)
et Pleistophora (ou Plistophora). Les espèces connues chez les pénéides sont A.
penaei, A. duorara, A. nelsoni, et P. penaei dans l’Océan Atlantique, et plus
particulièrement le golfe du Mexique.
Trois des quatre espèces de microsporidies listées plus haut infectent et changent
la couleur du muscle qui devient opaque ou blanc laiteux. Ag. penaei infecte les
gonades, le cœur, l’hémolymphe, les branchies, l’hépatopancréas et l’intestin en
produisant une couleur blanche opaque des gonades et souvent de multiples tumeurs
blanches sur les branchies et les tissus subcuticulaires du corps et des appendices. Les
crevettes sévèrement infectées, en plus d’avoir le muscle ou les gonades de couleur
blanc opaque ont typiquement la coloration de la cuticule bleu noir qui est due à
l’expansion des mélanophores cuticulaires.
Probablement toutes les espèces de crevettes pénéides peuvent être infectées par
une ou plusieurs espèces des microsporidies. Les infections aux microsporidies chez les
pénéides ont été signalées dans tous les élevages de crevettes dans le monde. (Lightner,
2001).
GREGARINES
Les grégarines sont des parasites internes qui vivent dans le tube digestif sous
forme de trophozoïtes ou occasionnellement de gamétocytes.
Les grégarines sont représentées par trois genres infectant les crevettes pénéides.
Ce sont les genres Nematopsis spp., Cephalolobus spp. et Paraophioidina spp.
Sur le plan clinique, les populations de crevettes juvéniles sévèrement infectées
accusent un retard de croissance. Des individus infectés ont des grosses tâches jaunes
dans l’intestin.
22
Les trophozoïtes sont visibles dans l’intestin moyen des larves et des post-larves
à la dissection au microscope au grossissement de 10 à 20 x.
Les grégarines ont été observées chez les pénéides d’élevage et sauvages partout
dans le monde (Lightner, 2001).
HAPLOSPORIDIES
Les haplosporidies sont des parasites internes. On les retrouve dans
l’hépatopancréas.
Une espèce d’haplosporidie au moins est connue chez les crevettes pénéides. Les
haplosporidies des crevettes sont différentes de celles des mollusques.
Les haplosporidies ont été observées dans les élevages de crevettes et les
pénéides sauvages en Cuba et Nicaragua (P. vannamei), au Mexique (P. stylirostris), en
Indonésie (P. monodon) et en Philippines. (Lightner, 2001)
II-2-1-2 LES PARASITES EXTERNES
Zoothamnium spp. , Vorticella spp. , Epistylis
Un certain nombre de parasites, en particulier les protozoaires, affectent la
crevette à différents stades de développement. Les protozoaires épicommensaux
peuvent être observés adhérant aux branchies, céphalothorax, péréiopodes et autres
appendices voire dans les organes internes. Ces protozoaires appartiennent aux genres
Zoothamnium spp., Epistylis spp., Vorticella spp., Anophrys spp., Acineta spp.,
Lagenophrys spp. et Ephelota spp.
A des niveaux élevés d'infection, les protozoaires peuvent provoquer une
obstruction des branchies (branchies sombres) et conduire à l'anorexie, un retard de
croissance et une susceptibilité accrue aux infections par les pathogènes opportunistes.
Il a été observé en outre un état de souffrance et une agitation des crevettes en cas
d’infestation aigue, certaines deviennent léthargiques et d'autres peuvent même mourir.
Les crevettes vivantes et mortes ont été échantillonnées et observées. Les signes
évidents étaient des taches brunâtres, floconneuses sur l'exosquelette, souvent étendues
aux appendices; les branchies étaient aussi brunâtres. L'examen au microscope a montré
un grand nombre de colonies de Zoothamnium ciliés, péritriches et pédonculés.
23
On observe l’infection du Zoothamnium spp. à tous les stades d’évolution des
crevettes, en élevage larvaire, en nurserie et en ferme de grossissement.
La prolifération du Zoothamnium spp. est favorisée par le non renouvellement de
l'eau, une grande quantité de déchets organiques et une grande concentration de
crevettes (Vanelli, 2000).
II-2-1-3 LES PATHOGENES FONGIQUES
Lagenidium spp. et Sirolpidium spp.
Ces espèces fongiques ont été isolées de la mer et des estuaires marins. Certains
de ces champignons sont des pathogènes aquatiques opportunistes de la crevette.
Les agents pathogènes communs, Lagenidium callinectes et Sirolpidium spp.
touchent surtout les stades larvaires. Les zoé et mysis sont généralement les stades
touchés avec des signes cliniques tels que la léthargie et la mortalité.
Les infections dues à Lagenidium spp. apparaissent en particulier aux stades
nauplii, Zoé et mysis. Tandis que les infections dues à Sirolpidium spp. sont souvent
observées au stade tardif de mysis et au premier stade des post-larves (Lightner, 2001).
Les spores et les mycéliums sont observés dans les tissus atteints,
particulièrement les branchies (Vanelli, 2000).
La mycose larvaire est un problème dans des écloseries en Inde (Gopalan et al.,
1980) L’infection par Lagenidium marina et Sirolpidium parasitica de P. monodon a
signalé des mortalités de larves aux stades Nauplii, zoé et mysis chez P. monodon
(Ramasamy et al., 1996).
Fusarium spp.
Fusarium spp. est également un champignon. Il pousse d'habitude sur des tissus
endommagés et ne cause pas de problèmes sévères.
Chez P. japonicus, on a cependant décrit une pathologie nommée “black gill”
(branchie noire) causée par Fusarium spp. Ce nom est dû à l'important dépôt de
mélanine dans les branchies. Une lésion de l'œil a également été décrite, caractérisée par
une tache blanche.
24
Le diagnostic est fait par mise en évidence des macroconidies en forme de coque
de bateau (Vanelli, 2000) qui sont les hyphes fongiques.
Le Fusarium spp. peut affecter tous les stades de développement de la crevette
pénéide. Les Fusarium spp. (F. solani, F. moniliformae) sont opportunistes.
Les agents pathogènes peuvent mener à de fortes mortalités (90%).
II-2-2 LES PARASITES DES CREVETTES A MADAGASCAR
Madagascar n’est pas épargnée par la présence des parasites dans
l’environnement. Ces parasites qui touchent essentiellement les branchies provoquent
des fortes gênes des crevettes et provoquent une léthargie, un retard de croissance, des
mortalités et une susceptibilité accrue aux infections des pathogènes opportunistes.
Ainsi, les infestations parasitaires constituent-elles une perte non négligeable pour
l’industrie de la crevette malgache en comparaison des autres pathologies, étant donné
l’absence des pathogènes redoutables sur l’île.
II-2-2-1 Parasites internes
Microsporidies
Les microsporidies existent sur les cotes malgaches. Elles affectent au moins
trois espèces de crevettes pénéides à Madagascar, qui sont Fenneropenaeus indicus, P.
monodon et P. semisultacus, classiques crevettes de pêche sur la côte ouest malgache.
Parmi les genres de microsporidies rencontrés sur l’île, le plus fréquent est
Ameson. La spore ovale a la taille de 1,4 x 1,1 µm, et est différente des deux autres
genres de parasites observés à ce jour à Madagascar.
Les infections sont évidentes comme les lésions musculaires avec une couleur
blanche coton frappante.
Grégarines
Ces parasites existent à Madagascar, et ont pu être détectés à plusieurs reprises
dans le tube digestif des post-larves sauvages, voire de post-larves d’écloserie.
25
II-2-2-2 Parasites externes (Zoothamnium spp.; Vorticella spp.;
Epistylis spp.)
Ces parasites classiques sont également présents à Madagascar, où ils causent les
mêmes troubles que ceux observés dans le reste du monde.
II-3 PATHOGENES BACTERIENS
Les infections bactériennes ont été observées depuis plusieurs années en
crevetticulture. Les scientifiques ont remarqué que les infections bactériennes sont
souvent apparues quand les crevettes sont faibles. Mais les crevettes normales peuvent
avoir des infections bactériennes lors des conditions défavorables du milieu, ou quand
les agents bactériens sont fortement pathogènes (Johnson et al., 1995).
II-3-1 PATHOGENES BACTERIENS DANS LE MONDE
II-3-1-1 Bactéries intracellulaires
II-3-1-1-1NHP-B: Necrosis Hepatopancreatic
Bacterium
C’est une infection bactérienne qui touche essentiellement l’hépatopancréas. Elle
est considérée comme un agent pathogène d’importance majeure, et fait d’ailleurs partie
des maladies listées par l’OIE.
Etiologie
La bactérie est classée parmi les Alpha-Proteobacteria (Frelier et al., 1994).
C’est une petite bactérie intracellulaire Gram négative, qui affecte les cellules
épithéliales de l’hépatopancréas. Il existe deux morphologies différentes de cette même
bactérie NHP, comme on peut le constater dans l’infection des cellules de
l’hépatopancréas. L’une est une sorte de rickettsia-like bacteria, en forme de tige
mesurant 0.3 µm x 9 µm, sans flagelle. Et l’autre est en forme d’hélice mesurant
0.2 µm x 2.6 à 2.9 µm. L’hélice possède huit flagelles sur l’apex basal et un flagellum
sur la crête de l’hélice.
26
Le diagnostic clinique et lésionnel
Les signes cliniques majeurs de la maladie observables sur le terrain sont la fréquence
accrue d’intestins vides et la réduction de la croissance. La carapace et le corps
deviennent plus mous. Les branchies sont sombres voire noires. On observe une
expansion des chromatophores, donnant une apparence sombre caractéristique sur les
bords des pléopodes et des uropodes. L’hépatopancréas est atrophié et devient
blanchâtre au milieu et les tubules sont pâles et striés en noir.
L’examen histopathologique révèle un hépatopancréas avec des tubules
atrophiés, des lésions granulomateuses multifocales qui touchent un ou plusieurs
tubules. Les cellules épithéliales tubulaires adjacentes de l’hépatopancréas sont
atrophiées et réduites sous forme cubitale, et elles contiennent des petites vacuoles
lipidiques et des vacuoles non sécrétoires. Les colorations spéciales comme la
coloration de Giemsa aide à mettre en évidence les formes en tige et en hélice. Les
vibrionacés sont souvent présents comme une infection secondaire des lumières de
tubules dans les cas sévères et individuels. Certaines infections des Vibrio spp.
deviennent systémiques.
Epidémiologie
Les infections à NHP ont été uniquement observées chez les crevettes pénéides
d’Amérique. Toutefois, des cas de NHP ont pu être décrits et rapportés en Erythrée. Ils
sont la conséquence de l’importation de Litopenaeus vannamei, non maîtrisée sur le
plan sanitaire.
La NHP a été identifiée pour la première fois dans des pénéicultures du Texas.
Une bactérie similaire a été trouvée et associée avec une sérieuse maladie épizootique
dans les fermes du Pérou, d’Equateur, du Venezuela, du Brésil, du Panama et du Costa
Rica.
La température et la salinité jouent un rôle important dans l’apparition de la
maladie.
II-3-1-1-2 RLB: Rickettsia Like Bacterium
La Rickettsia Like Bacterium est un pathogène bactérien qui touche les crevettes
pénéides. Elle existe notamment dans l’Océan Indien, et une pathologie similaire a pu
27
être décrite en Malaisie dans les années 1990. Nous traiterons donc plus
particulièrement de cette maladie dans le chapitre concernant les maladies bactériennes
présentes à Madagascar.
II-3-1-1-3 Spiroplasma
La Spiroplasma spp. est une bactérie intracellulaire à localisation cytoplasmique.
C’est un nouveau pathogène qui a pu être identifié lors de mortalités affectant
Litopenaeus vannamei.
Etiologie
Avant cette observation, ce genre a été isolé uniquement dans des fleurs et autres
parties des plantes, dans les intestins et hémolymphes d’insectes variés, dans les résines
des plantes et les insectes qui mangent ces résines. C’est une bactérie avec des flagelles
mobiles caractérisée par la présence d’une hélice.
Le diagnostic clinique et lésionnel
Les crevettes présentent cliniquement des chromatophores en expansion. Les
crevettes moribondes flottant à la surface balancent leur queue à l’aide des uropodes et
regardent vers le ciel.
L’examen histologique révèle des infections bactériennes systémiques, des
crevettes moribondes avec des nécroses modérées ou sévères. Cet examen montre des
réactions inflammatoires systémiques des hémocytes, des formations des nodules
hémocytaires, des phagocytoses. Les organes infectés sont la corde nerveuse ventrale,
les muscles squelettiques, le cœur, la glande antennaire, l’organe lymphoïde et le tissu
connectif. L’hépatopancréas, l’estomac, les branchies et les appendices ne sont pas
atteints. Dans plusieurs cas, il a été observé des cellules nécrotiques présentant des
vacuoles cytoplasmiques de différentes tailles avec une coloration basophile.
Epidémiologie
En janvier 2002, des mortalités sévères sont survenues sur les L. vannamei dans
les fermes d’élevages de crevettes en Colombie et sur les Caraïbes. Spiroplasma spp. est
un pathogène naturel des plantes et des insectes. Elle provoque beaucoup de mortalités
dans les fermes d’élevage des crevettes pénéides (Nunan et al., 2004).
28
II-3-1-2 Eubactéries
Vibrio spp., Proteus spp. Aeromonas spp., Pseudomonas spp.
Les maladies bactériennes peuvent causer une série de problèmes allant de la
mortalité massive, aux retards de croissance voire aux mortalités sporadiques. Le genre
Vibrio renferme les bactéries pathogènes les plus importantes dans la pénéiculture. Les
Vibrio aquatiques sont des bactéries qui sont largement présentes dans l’eau de mer,
dans l'eau douce, et dans les estuaires marins (Otta et al. 1999a, Otta et al. 2001). Bien
que la plupart des Vibrio spp. soient considérés comme des pathogènes opportunistes,
certains pourraient être pathogènes primaires comme les souches luminescentes en
particulier V. harveyi (Ruby et al., 1978, Yetinson and Shilo, 1979, Orndorff and
Colwell, 1980, Otta et al., 1999a, Otta et al., 2001), ou d’autres souches très virulentes,
telles que Vibrio penaeicida ou Vibrio nigripulchritudo, respectivement responsables du
syndrome 93 et du syndrome d’été en Nouvelle-Calédonie (Mermoud et al, 1998). Ils
peuvent causer de graves mortalités dans les écloseries de crevettes en Asie (Sunaryanto
and Mariam, 1986, Sunaryanto and Mariam, 1987, Lavilla-Pitogo et al., 1990,
Karunasagar et al., 1994).
Etiologie
De nombreux pathogènes Vibrio spp. ont pu être isolés dans les échantillons des
crevettes malades. Ces souches appartiennent aux espèces V. alginolyticus, V. costicola,
V. harveyi, V. splendidus, et V. parahaemolyticus (Duraisamy, 1997). Ce sont des
bactéries Gram négative, oxydase positive. V. parahaemolyticus, V. vulnificus,
Aeromonas spp, et Pseudomonas spp. étaient présentes dans les crevettes pénéides
malades et V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. anguillarum, V. damsela, Aeromonas
spp. et Pseudomonas spp chez les moribondes sur les côtes Sud du Vietnam comme
dans le Delta du Mekong. Le cas de l’infection était de 65% lié à la présence du genre
Vibrio. Les espèces du genre Vibrio et Proteus spp. sont présentes dans 65% de
l’échantillon. (Hao et al., 1997).
En écloserie, les agents les plus fréquemment signalés sont V. parahaemolyticus,
V. alginolyticus, V. harveyi et V. vulnificus. En nurserie et dans les fermes de
grossissement, les agents les plus fréquents sont V. parahaemolyticus, V. alginolyticus,
29
V. harveyi et V. vulnificus. Les espèces V. damsela et V. fluvialis sont
occasionnellement signalées (Lightner, 2001).
Le diagnostic clinique et lésionnel
Les signes principaux de la maladie sont la coloration rouge au niveau des
segments abdominaux (surtout les quatrième, cinquième et sixième segments) ainsi que
sur les uropodes, une nécrose des antennes secondaires et la réduction de la taille de
l’hépatopancréas par rapport aux crevettes normales. Une mortalité élevée en particulier
chez les post-larves et les juvéniles est observée (Lightner D.V, 1996, Le Groumellec
1997, Le Groumellec, 1995).
L’examen bactériologique montre des infections systémiques bactériennes qui
sont dues à V. parahaemolyticus uniquement (20% de l’échantillon). Les crevettes
moribondes montrent des éclats noirs sur les uropodes, des nécroses sur les péréiopodes
et pléopodes, des uropodes rougeâtres, et des petites taches blanches sur la région
abdominale ou sur l’exosquelette. Vibrio, Proteus spp., Aeromonas spp. et
Pseudomonas spp. sont également trouvées sur les crevettes saines examinées (Le
Moullac et al., 1997).
Epidémiologie
On trouve ces bactéries dans le monde entier et dans toutes les phases d’élevage
mais plus fréquemment en écloserie.
Toutes les espèces de crevettes pénéides en aquaculture sont sensibles à ces infections,
notamment sous l’effet du stress. La plupart des épizooties ont été signalées sur P.
japonicus au Japon, sur P. monodon en Indopacifique et sur L. vannamei en Equateur,
au Pérou, en Colombie et en Amérique centrale. Tous les stades de crevettes sont
touchés par ces bactéries.
Microcoques Gram positif
Les microcoques Gram positif peuvent également être responsables d’infections
chez la crevette. Dans les cas connus, elles apparaissent uniquement à basse salinité, ce
qui déclenche un stress majeur chez les crevettes. Dans le Moyen-Orient, le responsable
est le Lactococcus spp. qui frappe les crevettes L. vannamei. La L. vannamei est aussi
30
touchée par Micrococcus lors de tests d’infections expérimentales. En Guyane française
et en Amérique du Sud c’est encore la L. vannamei qui est infectée par la maladie.
Peritrichous spp
Les bactéries péritriches ne sont pas à proprement parler des pathogènes pour la
crevette, mais à l’instar des ectoparasites, elles colonisent les branchies des animaux
vivant dans un milieu riche en matière organique, et dont les branchies ne sont pas
nettoyées assez fréquemment. Elles participent donc à l’asphyxie des animaux
lorsqu’elles prolifèrent en grand nombre sur les lamelles branchiales, et colorent ces
branchies en leur donnant un aspect nommé « branchies sales ». Elles sont souvent
associées aux ectoparasites dont elles complètent l’action néfaste.
II-3-2 PATHOGENES BACTERIENS A MADAGASCAR
Les bactéries sont des pathogènes fortement redoutés à Madagascar. Elles
provoquent une forte mortalité surtout en élevage larvaire et même dans les fermes,
entraînant ainsi des pertes importantes pour l’industrie. Ce sont ces pathogènes
bactériens qui sont les plus menaçants tout au long du cycle d’élevage dans la situation
sanitaire actuelle de l’île.
II-3-2-1 Bactéries intracellulaires
RLB: Rickettsia Like Bacterium
La Rickettsia Like Bacterium (RLB) a déjà causé des mortalités sévères dans les
fermes d’élevage à Madagascar.
La RLB est une bactérie intracellulaire, Gram négative, à localisation
cytoplasmique.
Les signes cliniques comprennent des nécroses des carapaces au niveau du
céphalothorax avec des dépôts de calcium sur les crevettes moribondes. Avant la mue,
les hépatopancréas des crevettes moribondes deviennent blanc laiteux mais ne sont pas
atrophiés.
Des crevettes moribondes fixées à Davidson montrent une infection systémique
en examen histopathologique. A la coloration Gram de Twort, l’infection de RLB
31
affecte, dans l’ordre décroissant de gravité, l’organe lymphoïde et les tissus connectifs,
notamment de l’hépatopancréas.
Les industries d’élevage de P. monodon à Madagascar ont pu observer des
mortalités sévères dans les fermes dues aux infections par RLB durant l’année 1999
dans la région Ouest de Madagascar (Nunan et al., 2003).
II-3-2-2 Eubactéries
Vibrio spp.
Le fameux groupe des Vibrionacés touche effectivement les crevettes élevées à
Madagascar, depuis l’élevage larvaire jusqu’aux fermes crevetticoles.
Le diagnostic lésionnel s’effectue au niveau du laboratoire par des différents
examens, notamment des coupes histologiques avec des colorations spéciales, une
analyse bactériologique par mise en culture des animaux infectés, et éventuellement une
analyse de biologie moléculaire pour déterminer l’espèce bactérienne en cause voire ses
gènes de virulence.
Microcoques Gram positif
Les microcoques impliqués dans des infections de crevettes à Madagascar sont
des bactéries Gram positives. Elles apparaissent uniquement à basse salinité. Cette
bactérie existe à Madagascar et touche en particulier P. monodon. Elle déclenche une
infection systémique foudroyante, qui affecte surtout l’organe lymphoïde de la crevette
et provoque des lésions de nécrose avancée, déclenchant la mort en quelques heures.
Les moribondes peuvent se détecter sur les berges des bassins affectés, et ne présentent
pas de signes cliniques particuliers à part une léthargie très prononcée.
Peritrichous spp.
Ces bactéries sont aussi présentes à Madagascar, comme partout ailleurs dans le monde
32
II-4 LES PATHOGENES DE CREVETTES PENEIDES EN ELEVAGE
LARVAIRE A MADAGASCAR
Les pathogènes qui affectent les crevettes pénéides au cours de leurs stades
larvaires sont assez spécifiques. Outre certains virus comme le HPV, qui semble plutôt
se répliquer durant ces jeunes stades sans affecter les animaux, les lésions les plus
fréquemment rencontrées et provoquant des mortalités sont causées par des
champignons, des ectoparasites et des bactéries.
II-4-1 Les champignons
Les champignons sont des germes ubiquistes, donc Madagascar n’est pas
exempte en particulier durant les stades larvaires. A cette étape du cycle de vie, il
n’existe que deux genres de germes fongiques qui affectent l’espèce P. monodon. Ce
sont les genres Lagenidium spp. et Sirolpidium spp.
Lagenidium spp et Sirolpidium spp
Lagenidium spp. et Sirolpidium spp. affectent les crevettes jeunes au début de
leurs stades de vie. Lagenidium spp. est observée très tôt, elle affecte les stades
nauplius, zoé et mysis. Tandis que Sirolpidium spp. est observée un peu plus tard en
général, elle affecte les stades mysis avant la métamorphose en post-larve (mysis 3), et
les premiers stades de post-larves (post-larve de premier et deuxième jours surtout).
II-4- 2 Les parasites
On trouve des parasites partout, dans l’air, sur terre et dans l’eau (en eau douce
et en eau de mer). Les protozoaires comme Zoothamnium spp. et les autres parasites
externes sont des pathogènes qui vivent dans l’eau. Ils affectent les espèces aquacoles à
tous les stades y compris les crevettes en stades larvaires.
Zoothamnium spp et autres parasites externes
En élevage larvaire, le Zoothamnium spp. et autres parasites externes touchent
les crevettes en stade mysis. Et il s’observe jusqu’en nurserie.
33
Durant cette expérience, le Zoothamnium spp. et autres parasites ont observé à
partir du stade mysis 3 surtout, dans l’eau et sur les crevettes. Et elles sont de plus en
plus abondantes dans le bac d’élevage si aucune action n’est entreprise. Les post-larves
montrent des branchies sales dues à la présence de ces protozoaires, et qui se traduisent
éventuellement par une léthargie. Les crevettes deviennent anorexiques. Ces parasites
arrivent à obstruer les branchies des crevettes qui sont alors en souffrance, s’agitent
beaucoup et meurent rapidement par asphyxie.
II-4-3 Les bactéries
Les germes bactériens sont trouvés partout dans l’environnement. Ils peuvent
être bénéfiques pour l’organisme autant qu’ils peuvent être pathogènes directs (agent
étiologique) ou opportunistes. Pour ces cas, la pénéiculture n’est pas épargnée. Elle
présente ces trois formes d’action des bactéries, même en élevage larvaire. En ce stade
d’élevage, les bactéries du genre Vibrio et apparentées, causent de nombreux problèmes
aux éleveurs dans le monde, et à Madagascar comme partout ailleurs dans le monde.
Vibrio spp.
En élevage larvaire, ce sont surtout les infections dues aux souches vibrionacées
qui sont les plus redoutables et menacent les stades larvaires. Ces infections frappent
fréquemment aux stades zoé 2 et zoé 3 où les bactéries sont en prolifération massive
surtout les souches vertes luminescentes qui sont les souches les plus pathogènes pour
les larves de crevette parmi le genre Vibrio.
Les bactéries du genre Vibrio provoquent des lésions caractéristiques, par
exemple des antennes tordues ou dite communément nécrose de la seconde antenne, des
pléopodes grisâtres (pattes grises ou nécrose sur pattes), des segments rougeâtres
(nécrose sur corps) et également des uropodes rougeâtres. Mais les larves et post-larves
deviennent de plus en plus résistantes à la maladie au fur et à mesure qu’elles
grandissent, même si les souches pathogènes sont en prolifération dans le milieu. Sauf
en cas de stress des crevettes, où même les souches non spécifiquement pathogènes
opportunistes peuvent causer des infections.
DEUXIEME PARTIE : MATERIELS ET METHODES
34
I-Contexte de l’étude
I-1 Description de l’élevage larvaire de Mifoko (cf. Annexe V)
La partie expérimentale de cette thèse s’est déroulée dans l’élevage larvaire de
Mifoko, situé au nord de la baie de la Mahajamba et au sud de la baie de Moramba. Ce
centre est la propriété de la société Aqualma.
• Situation géographique et climatique
Localisé à 15°07'01.16" de latitude Sud et 47°05'49;56" de longitude Est, le site
d’Ambatomifoko (dit Mifoko) est construit dans une zone de clairière, au sein d’une
forêt primaire sèche typique de la côte ouest malgache. Le pompage s’effectue dans une
zone d’eau très claire, entourée de massifs coralliens. Les effluents sont contrôlés et
traités de manière à ne générer aucune pollution organique ou chimique du milieu
environnant.
• Description des installations
Les infrastructures sont pour l’essentiel constituées de serres contenant de grands bacs
en fibre de verre, dans lesquels les animaux sont élevés en conditions physico-
chimiques contrôlées.
Les larves sont élevées dans des bacs d’élevage larvaire elliptiques, maintenues en
suspension dans la colonne d’eau par un système d’aération continu. Les post-larves
sont quant à elles élevées dans des bacs de nurserie, de forme rectangulaire, dès qu’elles
atteignent leur stade benthique (soit à partir du cinquième jour du stade post-larve).
• Production et importance économique du site
Ce site a une capacité de production théorique de 350 millions de post-larves par an, et
est progressivement devenu le seul centre de production d’Aqualma, pour ses deux
fermes de Mahajamba et de Besalampy. Il reçoit uniquement des nauplii provenant du
Centre de Domestication de Moramba, lequel ne produit qu’à partir de géniteurs au
niveau sanitaire maîtrisé, nommés « Specific Pathogen Free ». Cela permet à la société
de produire.
35
I-2 Les techniques d’élevage larvaire des pénéidés
Les phases larvaires étant toutes planctoniques, leur alimentation se réalise dans
la colonne d’eau. Des algues phytoplanctoniques et des aliments composés leur sont
distribués jusqu’aux stades Mysis, auxquels des proies vivantes sont progressivement
rajoutées, pour suivre les métamorphoses larvaires durant lesquelles l’animal devient
carnassier. Les algues microscopiques, consommées aux jeunes stades périclitent par la
suite en générant une matière organique importante qui se dépose au fond des bacs
d’élevage et peuvent servir de substrat aux agents pathogènes. De même les fèces et les
proies vivantes ou les aliments composés non consommés, où les flores bactériennes
sénescentes se déposent sur les parois du bac en formant des biofilms complexes dans
lesquels de nombreux organismes saprophytes se développent. Ces changements
brutaux de régime alimentaire dans des périodes de temps très courtes génèrent une
évolution rapide de la flore bactérienne, qui peut se déséquilibrer facilement.
Ce sont ces déséquilibres qui doivent être maîtrisés autant que faire se peut, car des
agents pathogènes opportunistes peuvent en profiter pour se développer aux dépens des
stades larvaires, dont la physiologie est simpliste et qui ne possèdent que peu de
mécanismes de défense. Il est donc essentiel pour les performances d’élevage de
concevoir des outils de contrôle adaptés à la détection précoce d’un déséquilibre du
milieu.
I-3 Les moyens de contrôle des élevages larvaires et de leur état sanitaire
• Les contrôles des paramètres physico-chimiques mesurés quotidiennement sont
la température, la salinité, l’oxygène dissous, le pH.
• Les analyses du niveau sanitaire des élevages :
Les observations à l’œil nu du comportement des larves permettent de constater
qu’elles se déplacent normalement dans leur milieu de vie, et qu’elles s’alimentent
correctement. Il est aussi facile de repérer ainsi des comportements cannibales des
animaux. Elles sont complétées par des observations à la loupe binoculaire, qui permet
d’observer les organes de l’animal par transparence, et notamment les appendices, les
branchies, l’hépatopancréas et le tractus digestif. Toute observation d’un tissu anormal
est enregistrée, et quantifiée (en pourcentage du nombre de larves présentant ces lésions
36
par rapport au nombre de larves observées). Il est possible d’observer des symptômes
d’attaque bactérienne, telles que les pattes grises ou les nécroses internes, même si les
analyses bactériennes sont conformes. En effet, certaines bactéries pathogènes ne vont
pas cultiver sur un substrat inerte. C’est le cas notamment pour des souches du genre
Vibrio, qui possèdent souvent des formes « viables non cultivables ». C’est pourquoi il
est essentiel de savoir reconnaître des signes cliniques précoces d’attaque bactérienne,
ce qui permet de mener les actions nécessaires en temps et heure.
L’analyse bactériologique a pour objectif d’évaluer grâce à des indicateurs
prédéfinis si la flore bactérienne des élevages est conforme aux standards ou non.
Classiquement, on recherche la flore vibrionacée, pour la comparer à la flore totale.
C’est pourquoi nous utilisons le milieu de culture sélectif TCBS, qui permet d’inhiber
les flores mésophiles non vibrionacées (ou apparentées), notamment par les sels
biliaires qu’il contient. Nous distinguons classiquement plusieurs compartiments de
flore, qui doivent rester dans des proportions définies en fonction des stades de
développement larvaires pour que l’environnement des élevages larvaires reste adéquat :
le premier compartiment est constitué des flores « TCBS jaunes » correspondent à
l’ensemble des bactéries capables de dégrader le saccharose en acides, ce qui fait virer
l’indicateur coloré présent dans le milieu du vert au jaune. Ces souches sont en général
inoffensives pour les crevettes en élevage. Le deuxième compartiment est constitué des
flores « TCBS vertes », qui sont incapables de dégrader le saccharose. Celles-ci
contiennent des souches qui peuvent devenir pathogènes pour les crevettes dans
certaines circonstances. Il est normal qu’une certaine proportion de la flore bactérienne
soit constituée de souches « TCBS vertes », mais leur prédominance dans le milieu
signe un déséquilibre de celui-ci, et par conséquent un risque accru d’apparition de
souches pathogènes pour les larves. Enfin, il est important de détecter les souches
luminescentes, et de déterminer leur proportion par rapport aux souches non
luminescentes. En effet, la luminescence est directement liée à un mécanisme de
communication entre les bactéries nommé le « Quorum Sensing ». L’augmentation de la
proportion de souches luminescentes est corrélée avec le fait que la flore bactérienne
atteint une phase de développement plateau et commence à manquer de sources
37
énergétiques. Les mêmes molécules qui activent la luminescence des souches activent
également des facteurs de virulence, ce qui permet aux bactéries de devenir pathogènes
pour les larves, et donc de retrouver un substrat sur lesquelles elles peuvent se
développer. Il est donc important de ne pas laisser les souches luminescentes s’installer
comme la flore prédominante dans les bacs d’élevage. C’est pourquoi ces trois
compartiments de flore sont suivis quotidiennement et déclenchent des actions
préventives ou curatives en fonction des seuils atteints, ou de leurs proportions relatives.
L’analyse histologique confirme les observations visuelles à l’œil nu ou au
microscope, ainsi que les analyses bactériologiques effectuées. Elle permet de mettre en
évidence des infections bactériennes ou parasitaires avérées, et de mieux en évaluer la
gravité par rapport à la simple observation in vivo. Elle est donc indispensable à une
analyse sanitaire complète des élevages.
38
II- OBJECTIFS ET INTERETS
L’objectif de cette étude est d’évaluer l’intérêt de l’utilisation en élevage larvaire
d’un probiotique commercial, dénommé « Aquaculture Therapy », afin de diminuer la
nécessité de traitement en antibiotique voire de la supprimer si possible, en améliorant
par son usage les conditions du milieu d’élevage afin que les crevettes puissent mieux
résister aux pathogènes.
Il s’agit donc de limiter les infections bactériennes par la prévention, et
notamment par l’amélioration du milieu. L’intérêt de l’étude est de progresser dans la
connaissance du déclenchement des infections bactériennes en élevage larvaire de
crevettes pénéides, et de tenter de maîtriser celles-ci sur les stades précoces de
l’élevage. Et l’étude pourrait enfin permettre à terme d’éviter l’utilisation
d’antibiotiques, car c’est à ce stade que les éleveurs y ont le plus fréquemment recours,
même si les quantités utilisées sont très faibles en général.
Lors de cette étude, les signes de la présence des infections bactériennes
apparaissent en général aux stades zoé 2 et zoé 3. A ces stades, les crevettes sont
facilement infectées et la maladie peut causer beaucoup de mortalités. Et nous avons
également pu observer des nécroses internes au niveau du tube digestif, qui perd alors
son péristaltisme, ce qui diminue l’absorption d’aliment et la métabolisation de ceux-ci
par les larves infectées. Quand ces symptômes apparaissent, les larves de crevettes n’ont
plus aucune chance de survivre, et l’objectif est de limiter rapidement le nombre de
larves touchées par l’infection.
39
III- MATERIELS ET METHODES
AQUALMA suit de près sa production crevetticole, surtout par le contrôle
bactériologique, en amont du cycle de la production jusqu’en aval. C'est-à-dire que le
contrôle a commencé depuis les géniteurs sauvages capturés avant la phase de
domestication jusqu’à l’importation des produits finis dans les pays consommateurs. Ce
niveau de maîtrise est important, car même si les bactéries sont des germes pathogènes
banaux, elles peuvent provoquer des mortalités massives, surtout en élevage larvaire, et
peuvent se retrouver également sur les produits finis (bien qu’il ne s’agisse en général
pas des mêmes espèces, et en tous cas pas des mêmes souches qui affectent l’homme et
la crevette). De même, de nombreuses observations des larves sont pratiquées tous les
jours, pour détecter le plus petit signe d’apparition d’un problème d’élevage, quel que
soit sa nature. C’est grâce à ce système de contrôle permanent et au management de la
qualité utilisant l’ISO 9001 version 2000 que les performances de l’écloserie sont
maintenues voire améliorées de manière continue. Nous avons appliqué ces outils de
contrôle à la comparaison entre un élevage standard en petit volume avec un autre
élevage en conditions similaires, excepté l’application du probiotique « Aquaculture
Therapy».
40
Tableau I : Protocole pour le test d’efficacité du produit Aquaculture Therapy
LOT N° 1 2 3 4 5
BAC N° 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
VOLUME DU BAC 1,5M3 1,5M3 1,5M3 1,5M3 1,5M3 1,5M3 1,5M3 1,5M3 1,5M3 1,5M3
NOMBRE DE NAUPLII ENSEMENCEMENT PAR
LITRE 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200
ALIMENT
DOSE ET TYPE SELON LE PROTOCOLE D'ELEVAGE
PROBIOTIQUE
1ère DISTRIBUTION 6H après passage en Zoé1 NON 6H après passage en Zoé1
FREQUENCE DE DISTRIBUTION SELON LE PROTOCOLE CLASSIQUE
SELON LE PROTOCOLE CLASSIQUE
DOSE
ANTIBIOTIQUE
DOSE SELON LE PROTOCOLE CLASSIQUE
NON NON
SELON LE PROTOCOLE CLASSIQUE
FREQUENCE SELON LE PROTOCOLE CLASSIQUE
SELON LE PROTOCOLE CLASSIQUE
AQUACULTURE THERAPY
1ère DISTRIBUTION 6H après passage en Zoé1 A partir Zoé3 6H après passage en Zoé1
DOSE 5ppm à augmenter en cas de nécrose interne NON
FREQUENCE 4fois/jour à augmenter en cas de nécrose interne
SUIVIE BACTERIOLOGIQUE
SELON LE PROTOCOLE CLASSIQUE
AUTRES
SELON LE PROTOCOLE CLASSIQUE
41
Booster 13 et 14: probiotique avec Aquaculture Therapy, distribution 6h après passage
Zoé 1, traité à l’antibiotique.
Ce lot n°1 a reçu le probiotique classique et l’Aquaculture Therapy. La distribution de
ce dernier est 6 heures après passage en Zoé1 en raison de 5 ppm. Il est traité à
l’antibiotique lorsque les larves observées ont de nécrose interne.
Booster 15 et 16 : probiotique à distribuer 6h après passage Zoé 1, avec Aquaculture
Therapy distribué à partir de stade Zoé 3, traiter à l’antibiotique.
Ce lot n°2 a reçu le probiotique classique et l’Aquaculture Therapy. La distribution de
ce dernier est 6 heures après passage en Zoé3. Il est traité à l’antibiotique lorsque les
larves observées ont de nécrose interne.
Booster 17 et 18 : probiotique avec Aquaculture Therapy, distribution 6 h après passage
Zoé 1, le traitement adapté est Aquaculture Therapy mélangé avec des microparticules
en cas de nécrose interne.
Ce lot n°3 a reçu le probiotique classique et l’Aquaculture Therapy. La distribution de
ce dernier est 6 heures après passage en Zoé1. Le traitement adapté est Aquaculture
Therapy mélangé avec des microparticules en cas de nécrose interne afin que les larves
ingèrent l’Aquaculture Therapy en même temps que les microparticules.
Booster 19 et 20 : Aquaculture Therapy distribué après passage Zoé 1, traité à
l’Aquaculture Therapy mélangé avec des microparticules en cas de nécrose interne.
Ce lot n°4 n’a reçu que l’Aquaculture Therapy. En cas de nécrose interne le traitement
adapté est la distribution de l’Aquaculture Therapy mélangé avec des microparticules.
La dose et la fréquence distribution de l’Aquaculture Therapy sont à augmenter lors de
cette lésion.
42
Booster 21 et 22 : témoin, probiotique distribué après passage Zoé 1, sans Aquaculture
Therapy, traité à l’antibiotique.
Ce lot n°5 représente le lot témoin. La distribution de probiotique s’effectue après
passage en Zoé 1. Il ne contient pas l’Aquaculture Therapy et le traitement fait appel à
l’antibiotique seulement. C’est le protocole d’élevage classique.
III-1 LES PROBIOTIQUES Y COMPRIS AQUACULTURE THERAPY
Les probiotiques contiennent des souches des bactéries qui appartiennent toutes
au genre Bacillus (B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium, B. pumilis), qui ont été
pré-sélectionnnées et dont la quantité par millilitre de produit est dépasse les 100
millions (cf. Annexe VI).
Ces Bacilles jouent à la fois un rôle probiotique et immunostimulant des
animaux en aquaculture. Ainsi ces bactéries de souches probiotiques aident les animaux
contre les agressions bactériennes provoquées par les bactéries pathogènes comme les
Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio anguillarum et Vibrio vulnificus, qui
causent beaucoup de mortalité en élevage larvaire et dans les fermes de crevettes.
Dans cette présente étude comme nous avons décrit en haut, il existe deux types
de probiotiques qui sont le probiotique classique utilisé habituellement en élevage
larvaire et l’Aquaculture Therapy qui est l’objet de notre étude.
Le probiotique classique est cultivé quotidiennement pour la distribution
journalière à fréquence régulière. Donc la culture se fait tous les jours. Parce que nous
savons que les bactéries ont un pic de croissance en huit heures et qu’au delà de cette
durée, les bactéries atteignent une phase de sénescence. Alors la distribution de
probiotique doit tenir compte de cette caractéristique des bactéries pour obtenir le
43
résultat souhaité. Il fait partie du protocole normal appliqué à Mifoko, et est utilisé dans
l’ensemble des expériences, excepté pour le lot N°4 (boosters 19 et 20).
Quant à l’Aquaculture Therapy, la fréquence de distribution pour les bacs
d’élevage avec des animaux sains est de quatre fois par jour avec une dose 5ml/m3 par
booster. C’est pour la prévention de la maladie, conformément aux indications
apparaissant sur le mode d’emploi fourni par le fabricant.
La dose et la fréquence de distribution de l’Aquaculture Therapy sont à augmenter
lorsqu’il y a des animaux montrant le signe de nécrose interne. La distribution se fait
alors toutes les deux heures de temps à la dose de 6 ml/m3, comme c’est le cas par
exemple pour le lot n°3 (boosters n°17 et 18) qui est traité uniquement en Aquaculture
Therapy, donc sans antibiotique et 10ml/m3 par booster pour le lot n°4 (boosters n°19 et
20) qui ne reçoit que de l’Aquaculture Therapy durant toute l’expérience.
Durant cette étude, nous avons souhaité tester deux voies d’administration différentes
de l’Aquaculture Therapy. Les lots N°1, 2 et 3 permettent de tester son action dans le
milieu d’élevage, que ce soit dans un but préventif et/ou dans un but curatif. Le lot N°4
permet d’évaluer la capacité de l’Aquaculture Therapy à coloniser l’intérieur du tube
digestif des larves et à traiter de manière curative une infection bactérienne naissante.
Pour ce faire, lors de l’apparition des nécroses internes, l’Aquaculture Therapy est
mélangé avec un aliment larvaire liquide pour avoir une meilleure ingestion de produit
afin de renforcer la flore intestinale des larves.
III-2 OBSERVATION DES LARVES
L’élevage larvaire des crevettes pénéides consiste à élever les larves de crevettes
Penaeus monodon, venant du centre de domestication de Moramba, dans une eau
thermo régulée, dont la salinité est également étroitement contrôlée. Elles sont
alimentées par des algues planctoniques, des microparticules d’aliments composés et
des proies vivantes comme les artémias (au stade nauplii). La répartition varie en
fonction des stades larvaires, qui passent progressivement du régime herbivore (stade
44
Zoé) au régime carnivore (de Mysis 1 aux stades post-larves). La qualité du milieu
d’élevage est préservée par de fréquents changements d’eau filtrée et stérilisée à l’aide
de radiations d’ultra-violets, et de l’ajout éventuel de souches bactériennes connues et
inoffensives pour les animaux et les hommes, nommées probiotiques.
Cette expérience est effectuée dans un Booster rempli d’eau de mer d’un volume
de 1,5 m3 ensemencé à une densité de 200 nauplii par litre. La surveillance de la
température d’élevage, à l’aide du thermoplongeur, est régulière ainsi que celle du pH
du milieu, par un pH-mètre, et que l’état sanitaire des larves et des post-larves qui
s’effectue dans le bac d’élevage à l’état vivant, de l’observation microscopique et de
suivie bactériologique des broyats des larves et post-larves. La salinité de l’eau est
également surveillée régulièrement à l’aide d’un salinomètre.
Pour réaliser l’observation visuelle dans les bacs d’élevages et l’observation
microscopique, il est nécessaire de connaître la morphologie des crevettes à l’état vivant
des différents stades des larves et les post-larves, ainsi que les étapes respectives de ces
stades.
Stade nauplii
Les nauplii à différentes étapes sont tous en forme d’araignée. Elles sont faciles
à reconnaître.
Stade zoé
Les zoés muent trois fois avant d’être en stade mysis. Les étapes respectives sont
zoé1, zoé2 et zoé3. Le déplacement des zoés sont vers l’avant.
Les zoé1 ont des ébauches oculaires non ouvertes. Les zoé2 ont des yeux bien ouverts
par rapport à zoé1. On observe ces larves partout dans le bac, c'est-à-dire que se soit en
surface ou en milieu du bac. Par contre les zoé3 sont plutôt à la surface du bac,
contrairement à l’étape précédente. Elles possèdent tous une épine dorsale.
45
Stade mysis
Les mysis muent trois fois aussi comme le stade zoé. Mais elles se déplacent
vers l’arrière et sont généralement en position verticale dans l’eau, la tête vers le bas.
On différentie ces différents stades par la taille. Elles s’agrandissent au fur et à mesure.
Les étapes sont respectivement de mysis 1 à mysis 3.
Mysis 1 se différencie par ses uropodes bien différenciés et elles ont des
ébauches de pléopodes. En se déplaçant, leur tête se dirige vers le bas. En mysis 2, on
observe une double antenne qui n’existe pas encore à l’étape précédente. Les pléopodes
commencent à s’élargir. Et les mysis 3 ont des pléopodes de plus en plus visibles.
Les post-larves
Les post-larves se déplacent vers l’avant comme le stade zoé. Tous les
appendices sont complets comme des crevettes adultes. Dès le passage en post-larve, on
fait un décompte journalier pour déterminer leur âge.
III-2-1 Observation visuelle des larves
L’observation visuelle est indispensable durant l’élevage et se déroule dans les
bacs. Elle consiste à observer le comportement des larves et post-larves, c'est-à-dire le
déplacement et la mobilité, le stade d’évolution, et les signes cliniques éventuels des
larves et post-larves de crevettes. Pour mieux visualiser les animaux à l’état vivant, on
pratique un prélèvement dans le bac à l’aide d’un bécher. Les échantillons sont prélevés
au plus près des bulles d’air provoquées par l’aération, soit à la surface de l’eau soit au
fond du bac selon les stades de développement, qui sont planctoniques au stade larvaire
et deviennent benthiques aux stades post-larves , afin d’avoir le maximum d’échantillon
dans 1 Litre d’eau. Les matériels de prélèvement sont stérilisés dans de l’eau chlorée.
46
Durant ce stade d’élevage, les larves et les post-larves sont régulièrement
comptées. Le comptage consiste à déterminé la survie des animaux. Il se réalise à l’aide
d’un bécher et que le prélèvement se réalise comme tous les prélèvements effectués
pour le différent niveau de contrôle. Les animaux sont comptés par ses différents états,
la mobilité, les faibles, les morts et les stades des animaux dans le même bécher qui
représente le bac. Les animaux dans un même bac ne sont pas forcément du même stade
lors du comptage par ce que la mue se fait progressivement. Le comptage s’effectue
plusieurs fois par jours afin de mieux surveiller l’élevage.
III-2-2 Observation microscopique des larves
Durant l’élevage larvaire les larves et les post-larves sont observées
régulièrement au microscope binoculaire. L’observation microscopique consiste à
examiner les signes cliniques des larves et post-larves, leur croissance et leur
développement. Le prélèvement pour le diagnostic clinique se fait de la même manière
que ceux pour l’observation visuelle. Lors de l’apparition des lésions on applique
l’action corrective nécessaire, qui varie selon la lésion observée. Les lésions sont
différentes et leur apparition dépend du stade de développement des crevettes.
Les larves prélevées pour l’observation sont tamisées dans des pots plastiques
pour dégager l’eau et mises sur un verre de montre que l’observateur met sur la plaque
lumineuse du microscope binoculaire. Lors de l’observation, les larves mortes ou
faibles ou présentant des lésions sont faciles à observées.
L’observation microscopique s’effectue plusieurs fois par jour pour pouvoir
observer à temps les anomalies et les lésions associées et d’avoir une bonne suivie de
croissance des animaux.
47
III-3 ANALYSE BACTERIOLOGIQUE
III-3-1 Définition et objectifs
La bactériologie est l’étude des bactéries. L’analyse bactériologique en élevage
larvaire débute par le contrôle bactérien de l’eau de remplissage du bac d’élevage et des
nauplii venant du centre de domestication et de l’écloserie de Moramba propriété
d’Aqualma. Elle a pour objectif de quantifier les charges bactériennes apportées par
l’eau de l’élevage, par l’animal et tout ce qui est relatif à l’élevage ; par les aliments et
les matériels utilisés. En général, l’analyse bactériologique en élevage est un outil de
contrôle, un indicateur de l’état sanitaire global de l’animal et du fait que l’élevage se
passe normalement. Le suivi bactériologique de l’élevage larvaire se fait au laboratoire
de contrôle qualité du site de production.
III-3-2 Prélèvement des échantillons
Il consiste à prélever les échantillons dans un litre d’eau. Le prélèvement des
échantillons se fait par la même technique que les échantillons de suivi d’élevage.
Les animaux prélevés sont tamisés dans un pot plastique propre à chaque bac
représentatif.
III-3-3 La culture bactérienne
Les crevettes récoltées sont broyées sur un verre de montre stérile à l’aide d’un
pilon. On y ajoute 10 ml d’eau de mer stérile dont la salinité correspond à celle du bac
d’élevage larvaire d’origine, et on obtient ainsi une solution mère qui est diluée au 1/10.
Pour la famille des Vibrionacés, on utilise comme milieu de culture le
Thiosulfate Citrate Bile Sucrose agar (TCBS), qui est un milieu sélectif conçu
notamment pour sélectionner et isoler les bactéries du genre Vibrio (bien que des
bactéries appartenant à d’autres genres puissent y pousser, et que certains vibrions ne le
puissent pas).
48
L’ensemencement se fait en surface à raison de 0,1 ml par boite de Pétri, et on
étale cette suspension bactérienne sur toute la surface de la boite contenant le milieu
TCBS. La fréquence du prélèvement suivie de l’ensemencement dépend du stade des
larves et des post-larves de crevettes.
Pour l’estimation de la charge en Flore Mésophile Totale (FMT), on utilise du
Marine Agar 2216E, l’ensemencement se fait généralement dans la masse à raison de
0,1 ml dans un agar en surfusion, versé ensuite immédiatement dans la boite de Pétri et
refroidi rapidement.
III-3-4 La lecture des colonies bactériennes
La lecture des bactéries isolées se fait par dénombrement des colonies bactériennes
poussées dans la boite de Pétri après 24 heures d’incubation à la température adéquate
dans un étuve.
• Le dénombrement des Vibrionaceae
Après l’incubation de la boite de Pétri pendant 24 heures dans l’étuve à 30°C, les
colonies qui poussent à la surface de la boite sont observées, identifiées, distinguées les
unes des autres par leur couleur, leur forme, leur contour, leur taille et leurs
caractéristiques. Le comptage de chaque type de colonie est réalisé suivant les critères
prédéterminés (voir tableau n° 1).
49
Tableau II : Critères de lecture des bactéries de la famille Vibrionaceae
Couleur Caractéristique Taille Contour Forme
Jaune
Verte
Jaune-verte
Claire
Laiteuse
Foncée
Point noir
Point jaune
Petite
Moyenne
Grosse
Irrégulier
Régulier
Plate
Pointue
Mamelonnée
Bombée
• Le dénombrement de la Flore Mésophile Totale
La technique de dénombrement est la même que sur TCBS, mais la lecture se
fait en deux temps. La première est après incubation à 30°C pendant 24 heures de la
boite de Pétri à l’étuve et la seconde est après 24 heures supplémentaires à la
température de la salle de travail.
• L’identification des souches bactériennes
• Cette technique n’est utilisée que lorsqu’un agent pathogène bactérien est
clairement identifié. C’est le cas lorsque l’on observe une dominance nette d’un type de
colonies sur les boites de Pétri. Les colonies sont alors isolées, et une suspension
bactérienne en eau salée à la concentration de 10 ppt est réalisée. Afin de réaliser une
identification biochimique, nous utilisons des galeries API 20E. Les cupules sont
remplies comme l’indique le mode d’emploi à l’aide de la suspension bactérienne, et la
galerie est mise à incuber à la température de l’élevage larvaire, en général 30°C. La
lecture se fait conformément au mode d’emploi, et à l’aide du catalogue des souches
types API 20E et des réactions biochimiques attendues. Par contre, lorsqu’aucune
souche bactérienne n’apparaît dominante sur les milieux de culture, il est communément
admis qu’il n’y a pas d’agent pathogène véritable, mais plutôt des pathogènes
opportunistes appartenant à de nombreuses espèces de Vibrio. Il est également possible
50
que certains Vibrio ne se cultivent pas bien sur TCBS, comme c’est par exemple le cas
pour Vibrio penaeicida, mais dans ce cas la dominance reste visible sur le milieu
Marine Agar 2216, et c’est à partir de ce milieu que sont réalisées les identifications.
IV ANALYSE HISTOLOGIQUE
IV-1 Définition et Objectifs
L’histologie est l’étude microscopique des tissus vivants. En crevetticulture,
l’analyse histologique a pour objectif de caractériser morphologiquement les tissus
normaux. L’histopathologie est alors définie comme la science qui permet de
reconnaître des lésions anatomopathologiques. Il s’agit d’observer le changement ou la
déformation d’état de la cellule par rapport à son état normal. Pour cela on utilise des
colorations de routine Hématoxyline-Eosine (H&E) et des colorations spéciales suivant
la maladie suspectée.
IV-2 La technique histologique
La technique histologique utilisée au Laboratoire Central d’AQUALMA est
celle décrite par le Professeur Donald V. Lightner adaptée aux crustacés (Lightner,
1996).
51
Diagramme général
Prélèvement des échantillons
Fixation et immersion
Inclusion de paraffine
Mise en bloc
Coupe et Montage sur lame
Coloration
Observation microscopique
Figure I: Diagramme d’étude histologique
IV-2-1 Prélèvement des échantillons
C’est l’étape préliminaire mais essentielle pour l’étude histologique, car elle
détermine le pool d’un échantillon d’un bac d’origine. Les échantillons sont prélevés au
plus près de l’ébullition d’aération soit à la surface de l’eau soit au fond du bac selon les
stades larvaires à l’aide du bécher. Le nombre de crevettes fixées est variable suivant
l’âge des animaux (Voir Tableau n°2).
IV-2-2 Fixation et immersion
La fixation est la base de l’étude histologique. Elle a pour rôle de préserver la
structure de la cellule telle qu’elle était à son état vivant, et fige les structures dans un
état stable et analysable. Pour l’analyse histopathologique des crevettes, la solution
Davidson AFA est la plus adaptée (Humason, 1972).
52
La solution de Davidson conserve la structure morphologique de la cellule grâce
à sa composition :
Ethanol absolu 315 ml
Formaldéhyde 37 – 40% 200 ml
Acide acétique (solution aqueuse) 115 ml
Eau distillée 350 ml
La méthodologie de fixation dépend essentiellement de l’âge (Tableau n° 2) et
du poids de l’animal (tableau n° 3).
Depuis les stades nauplii, Zoé, Mysis et jusqu’au stade de post-larve de
cinquième jour ou P5, après la collecte, les crevettes sont directement immergées dans
la solution fixatrice. Et à partir de P6, il faut injecter le fixateur Davidson dans les tissus
de l’animal de part et d’autre du céphalothorax pour éviter l’autolyse, puis de l’abdomen
avant de les plonger dans la solution fixatrice Davidson.
Figure II : Fixation
53
Figure III : Immersion
La durée de la fixation est également fonction de l’âge de l’animal. Le volume
de la solution Davidson doit toujours être 10 fois supérieure au volume de l’animal à
fixer (Redman et al., 1999).
L’immersion est l’étape qui succède à la fixation. C’est un mode de conservation
des animaux pour une durée indéterminée. Il s’agit de garder les animaux fixés dans une
solution d’éthanol de 50° à 70° (Bell and Lightner, 1988).
54
Tableau III: Méthode de fixation en fonction de l’âge
Durée de fixation en fonction de l’âge
Stade Durée en heures
Nauplii-Zoé 12
Mysis 12 à 24
PL < 10 24
P10< PL < P20 24
P20< PL < P25 24 à 32
PL < 25 24 à 32
Juvéniles 48
Pré-adultes En fonction du poids
Géniteurs
Petits organes (tube digestif, gonades) 30
Demi-tête 48 à 50
Tête entière 72
Tableau IV: Méthode de fixation en fonction du poids
Durée de fixation en fonction du poids
Poids en gramme Durée en heures
0,5 < x < 5 12 à 24
5 < x < 30 24 à 48
30 < x < 60 60
60 x < 90 72
> 90 96
55
Tableau V: Nombre d’animaux fixés en élevage larvaire
Age de l’animal Nombre prélevé Nombre par cassette
P5 100 15 à 18
P15 50 12 à 15
P20 25 10 à 12
P25 25 8 à 10
IV-2-3 Dissection et mise en cassette
La mise en cassette consiste à mettre les échantillons dans une microcassette. Le
nombre d’animaux mis en cassette dépend de la taille de ceux-ci. Si l’animal est gros, il
faut couper entre le premier et le deuxième segment puis réaliser une dissection
longitudinale pour faciliter les opérations suivantes. Il est à noter que la partie disséquée
doit être mise face contre la base de la cassette systématiquement, afin de pouvoir
automatiser les opérations.
56
Figure IV : Diagramme de dissection
Dissection du céphalothorax
Céphalothorax disséqué
57
Figure V : Mise en cassette
IV-2-4 Paraffination
La paraffination a pour but d’infiltrer de la paraffine liquide, portée à plus de
54°C, à l’intérieur de l’animal mis en microcassette afin que celui-ci s’imbibe de cette
substance et puisse se solidifier lorsque la température sera descendue aux environ de
25°C, et que la pièce puisse donc se couper aisément.
.
Procédure de paraffinage
Les pièces fixées subissent une phase de déshydratation classique, suivie d’une
imprégnation puis d’une inclusion en paraffine, selon la méthode décrite par Gabe
(1968) et adaptée aux crustacés (Lightner 1995).
Au Laboratoire Centrale, nous utilisons une machine à paraffinage automatique
de type Tissue-TEK VIP 1000. On met les pièces à l’intérieur d’un panier et l’ensemble
58
est porté dans une chambre étanche à l’intérieur de la machine. Cette machine selon un
programme comprend 14 étapes, dont 8 étapes contenant de l’alcool de différents degrés
respectivement 70°, 80°, 90°, puis 100°, ensuite 2 stations de solution d’imprégnation
contenant du xylène ou « Safety Solve » (substitut du Xylène) et enfin 4 dernières
stations de paraffine liquide (car maintenue à 60°C).
Les 8 premières stations ont pour rôle de déshydrater les pièces en augmentant
progressivement le degré d’alcool dans les pièces, ce qui diminue leur concentration en
eau, puis les 2 suivantes à la déshydratation totale et les 4 dernières contiennent la
paraffine pour l’inclusion de la pièce. La durée de chaque station est d’une heure.
IV-2-5 Mise en bloc
Cette étape sert à fixer physiquement les pièces paraffinées dans un bloc de
paraffine solide. Elle est réalisée dans un moule métallique d’une dimension de 2,5 cm
par 3, 4, 5 cm voire plus, à l’aide d’une machine Tissue-Tek TEC. La machine
comprend une petite plaque à froid, trois petites plaques chaudes, un plateau froid et un
récipient contenant de la paraffine chaude à 60°C.
La procédure est comme suit : on met un peu de la paraffine liquide dans le
moule, on range les pièces d’une cassette sur ce lit de paraffine, en les alignant et en les
pressant pour bien les coller sur le fond, puis on porte le moule dans la zone froide pour
que l’animal se fixe à la base du moule et enfin on couvre avec la cassette
correspondante, qui servira de support lors de la coupe au microtome. On y ajoute de la
paraffine liquide jusqu’à la partie supérieur du moule et on la laisse se refroidir
progressivement sur le plateau à froid, qui assure une solidification en un seul bloc de
la pièce et de la paraffine qui l’entoure. Quand la paraffine est refroidie, elle devient
solide et le bloc se détache facilement du moule.
59
Figure VI : Diagramme de le mise en bloc
Rangement dans le moule métallique
Bloc
Détachement du moule
Refroidissement progressif
Couvrement du moule métallique avec la cassette
60
IV-2-6 Coupe et montage sur lame
C’est la partie la plus difficile en histologie, elle nécessite une attention
particulière. Elle est effectuée à l’aide d’un microtome manuel. La pièce mise en bloc
est coupée en fine tranches, en forme de ruban de paraffine avec une épaisseur de 10 µm
jusqu’à ce que l’on obtienne le niveau de coupe souhaité, contenant les organes cibles
(Hépatopancréas, organe lymphoïde, …). Une fois ce niveau obtenu, on diminue à
4 µm l’épaisseur de la coupe pour avoir une belle section très mince.
Le montage sur lame de la section coupée est complexe et présente des
difficultés techniques. Le ruban obtenu est déposé sur une lame surmontée d’une couche
d’éthanol 50°. Ensuite on porte la lame comportant le ruban sur un bain-marie
thermostaté à la température de 40°C. L’éthanol 50° assure la dilatation du ruban dans
le bain-marie qui est rempli d’eau distillée 1,5 l avec 1,1 g de gélatine. La plus belle
section du ruban qui contient le plus d’informations est alors sélectionnée, c'est-à-dire
une section révélant bien les différents organes et tissus. Ainsi obtenue, le tissu de
paraffine sélectionné est déposé sur une lame porte objet. Cette section se dépose et se
colle facilement sur la lame grâce à la présence de la gélatine. Ainsi faite, on laisse
sécher la lame à l’air libre.
Figure VII : Coupe
61
Figure VIII : Diagramme du montage sur lame
Ruban déposé sur lame surmonté d’éthanol 50°
Le ruban dans le bain marie à 40° C
62
IV-2-7 Coloration et montage sur la lamelle
C’est l’étape avant l’observation microscopique. Avant la coloration proprement
dite, les lames prêtes à colorer vont être déparaffinées à l’aide d’un four à chaleur sèche
de 60°C pendant 30 à 45 minutes. Quand l’excès de paraffine des lames est fondu, elles
sont prêtes à colorer.
Diagramme général
Mise au four des lames
Etape de paraffination
Etape de coloration principale
Etape de rinçage
Etape de contre coloration ou de différentiation
Etapes de déshydration
Etape de montage de la lamelle
Figure IX : Diagramme général de la coloration
IV-2-7-1 Colorations de routine Hématoxyline-éosine
Pour la coloration de routine, la méthode de Mayer modifiée par Bennett est
adaptée pour le diagnostique de routine des maladies des crevettes. En fait c’est une
excellente coloration de routine, en particulier pour la détection de virus (Sheehan and
Hrapchak 1980). Elle est de plus assez facile à réussir.
63
Procédure de la coloration en histologie :
La coloration comprend une phase de déparaffinage (finition) au xylène, une
phase de réhydratation à l’aide d’éthanol de différents degrés : de 100°, 95°, 80° et 50°
(Tableau n° 5), puis un rinçage à l’eau distillée, un passage dans une solution
d’hématoxyline suivi d’un rinçage à l’eau de robinet, et enfin une deuxième coloration
avec un mélange d’éosine-phloxine B qui joue un rôle de contre coloration. Pour
terminer, les lames subissent une autre phase de déshydratation à l’éthanol 100° et 95°,
et le dernier passage dans des solutions de xylène et un bain dans une autre solution de
xylène pendant le montage.
Ensuite la section colorée doit être recouverte de la lamelle couvre objet. Le
montage de la lamelle se réalise sous hotte chimique et à l’aide d’une résine de
montage. La résine permet de coller la lamelle sur la lame du coté qui porte les organes
ou tissus à observer. Après le collage on range les lames dans une chemise
d’observation.
64
Figure X : montage de la lamelle
Résine
Collage de la lamelle
Rangement dans la chemise d’observation
Essuyage
65
La coloration dépend à la fois (Ross, 1985) :
• De la texture des tissus fixés ;
• De la nature physico-chimique des colorations ;
• Des réactions physico-chimiques survenant entre les tissus fixés et les colorants.
Le tableau suivant décrit la composition des solutions utilisées pour cette
coloration, ainsi que les étapes de la coloration de routine : Mayer Bennett
Solution de colorant de la coloration de routine Hématoxyline-Eosine :
• Solution Hématoxyline
Eau distillée chauffée à 60°C 500 ml
Hématoxyline 0,5 g
Iodate de sodium 0,1g
Sulfate d’aluminium potassium 45 g
Acide citrique anhydre 0,5 g
Hydrate chloral 25 g
• Solution Eosine (1% de la solution aqueuse)
Eosine Y 1 g
Eau distillée 100 ml
• Solution Phloxine (1% de la solution aqueuse)
Phloxine B 1 g
Eau distillée 100 ml
66
• Solution Eosine/Phloxine (1% de la solution aqueuse)
Solution Eosine 100 ml
Solution Phloxine 100 ml
Ethanol 95° 780 ml
Acide acétique glacial 4 ml
67
Les étapes de coloration de routine
Tableau VI: Séquence de la coloration de routine
Les étapes de coloration de routine
Réactifs Processus Fréquence ou durée
1- Xylène Bain 5 minutes
2- Xylène Bain 5 minutes
3- Xylène Bain 5 minutes
4- Ethanol 100° Bain 3 minutes
5- Ethanol 100° Bain 3 minutes
6- Ethanol 95° Plongeon 10 fois
7- Ethanol 95° Plongeon 10 fois
8- Ethanol 80° Plongeon 10 fois
9- Ethanol 80° Plongeon 10 fois
10- Ethanol 50° Plongeon 10 fois
11- Eau distillée Rinçage 6 fois 10 fois par rinçage
12- Hématoxyline Bain 30 à 45 secondes
13- Eau de robinet courant Rinçage 6 fois 10 fois par rinçage
14- Eau de robinet Bain 30 à 45 secondes
15- Phloxine-éosine Bain 3 à 5 secondes
16- Ethanol 100° Plongeon 10 fois
17- Ethanol 95° Plongeon 10 fois
18- Xylène Plongeon 10 fois
19- Xylène Plongeon 10 fois
20- Xylène Plongeon 10 fois
21- Xylène Bain Pendant montage
68
IV-2-7-2 Colorations spéciales
Les colorations spéciales jouent un rôle important en analyse histopathologie
parce qu’elles spécifient exactement la nature de la lésion, permettent de connaître un
peu la nature chimique des structures anormales visibles dans les lésions. Parfois elles
déterminent s’il s’agit des lésions virales, bactériologiques ou fongiques, ou par
exemple de savoir s’il existe de l’ADN dans certaines inclusions cellulaires douteuses.
Parmi les colorations spéciales utilisées en laboratoire, il y a trois types de
coloration les plus employés en histologie actuellement, qui ont chacun un rôle
spécifique.
La méthodologie des premières étapes est identique à celle décrite
précédemment pour les colorations de routine :
• Les échantillons fixés à l’aide d’une solution fixatrice de Davidson AFA ;
• Une étape de mise en cassette et une inclusion de paraffine sont réalisées ;
• Une étape de mise en bloc ;
• Une coupe mince de 4 µm
• Une étape de déparaffinage au four sec
IV-2-7-2-1 La coloration de Giemsa
La coloration spéciale de Giemsa a pour objectif de mieux mettre en évidence la
présence de lésion bactérienne, fongique ou parasitaire (procaryotes).
Colorants pour la coloration de Giemsa :
• Solution mère de Giemsa :
Giemsa R 1g
Méthanol (méthyle alcool) 50 ml
Glycérol (glycérine) 50 ml
69
• Solution tampon n°1
Acide citrique hydraté 2,1 g
Ou
Acide citrique déshydraté 1,9 g
Eau distillée 100 ml
• Solution tampon n°2
Na2HPO4 1,42g
Eau distillée 100 ml
• Solution de travail : Giemsa extemporanément pour 5 lames
Eau distillée 62,5 ml
Solution n°1 2,25 ml
Solution n°2 2,75 ml
Solution mère de Giemsa 5 ml
70
Les étapes de coloration de Giemsa :
Tableau VII: Séquence de coloration de Giemsa
Réactifs
Processus Fréquence ou Durée
1- Xylène Bain 5 minutes
2- Xylène Bain 5 minutes
3- Ethanol 100° Bain 5 minutes
4- Ethanol 95° Bain 5 minutes
5- Ethanol 70° Bain 5 minutes
6- Eau distillée Rinçage 2 fois puis bain 10 minutes
7- Giemsa Bain 1 heure
8- Acétone Plongeon 2-3 secondes
9- Acétone xylène Plongeon 2-3 minutes
10- Xylène Bain Avant montage de lamelle
La coloration spéciale de Gram de Twort est utile si on veut confirmer la
présence des corps bactériens et déterminer s’ils sont Gram positif ou négatif. (cf. en
Annexe IX)
Et la coloration spéciale de Feulgen est utile lorsqu’on veut connaître la nature
biochimique de certaines inclusions intracellulaires, et notamment déterminer si elles
contiennent des acides nucléiques. Comme c’est le cas lorsqu’il s’agit des agents
pathogènes bactériens ou viraux.
71
IV-2-8 Observation microscopique
L’observation microscopique est la dernière étape en examen histologique. Pour
cela, la connaissance parfaite des cellules normales sont indispensable.
IV-2-8-1 Observation microscopique de la coloration de
routine
Une fois colorée et montée, on distingue nettement à l’œil nu une préparation
contrastée bicolore. Avec la coloration de routine Hématoxyline-Eosine / Phloxine de
Mayer Bennett (H&E), tout ce qui est basophile se colore en violet et tout ce qui
éosinophile se colore en rose.
Les acides nucléiques se colorent donc en violet et les protéines apparaissent en
rose. On observe les cellules à différents niveaux de grossissement. On regarde d’abord
au plus faible grossissement à 5x et 10x pour reconnaître la structure morphologique
des différents tissus et si quelque chose d’anormale est détectée, et on augmente le
grossissement à 20x pour qu’on puisse distinguer la déformation cellulaire et tissulaire.
S’il s’agit d’une lésion on augmente encore une fois le grossissement à 40x pour
identifier le type de cette lésion.
Au Laboratoire Central, nous avons effectué la lecture à l’aide d’un microscope
photonique perfectionné OLYMPUS BX50. L’observation exige une connaissance
parfaite de l’histologie des crevettes, pour une bonne prise de décision.
72
IV-2-8-2 Observation microscopique des colorations spéciales
Les résultats se résument dans le tableau suivant :
Tableau X : Résultats des colorations spéciales
Type de coloration Structure tissus ou cellules Résultats
Giemsa
Noyau Bleu/violet
Collagènes et autres éléments Rose foncé ou pale
R L B Bleu
Bactéries Bleu
Gram Twort
Bactérie Gram positif Bleu-Violet
Bactérie Gram négatif Rouge-Rose
Noyau Rouge
Autres tissus Jaune-Vert
Feulgen DNA inclusion Rose foncé ou pale
Autres éléments Verts
TROISIEME PARTIE: LES RESULTATS
73
I-RESULTATS
I-1 Résultats d’élevage (cf. Annexe VII)
I-1-1 Résultats de la survie des larves et post-larves
Figure XI: Courbe de survie des larves et post-larves
Protocole lot N°1 : Booster 13 et 14: probiotique avec Aquaculture Therapy,
distribution 6h après passage Zoé 1, traité à l’antibiotique.
Protocole lot N°2 : Booster 15 et 16 : probiotique à distribuer 6h après passage Zoé 1,
avec Aquaculture Therapy distribué à partir de stade Zoé 3, traiter à l’antibiotique.
Protocole lot N°3 : Booster 17 et 18 : probiotique avec Aquaculture Therapy,
distribution 6 h après passage Zoé 1, le traitement adapté est Aquaculture Therapy
mélangé avec microparticules en cas de nécrose interne.
Protocole lot N°4 : Booster 19 et 20 : Aquaculture Therapy distribué après passage
Zoé 1, traité à l’Aquaculture Therapy mélangé avec microparticules en cas de nécrose
interne.
Protocole lot Témoin négatif : Booster 21 et 22 : témoin, probiotique distribué après
passage Zoé 1, sans Aquaculture Therapy, traité à l’antibiotique.
74
Remarque : pour des raisons de place disponible, les bacs réplicats ont été regroupés en
un seul bac à partir du stade Zoé 3. C’est pourquoi une seule valeur apparaît ensuite par
type de traitement effectué.
Protocole lot N°1 : Boosters 13 et 14 sont regroupés dans le booster 14
Protocole lot N°2 : Boosters 15 et 16 sont regroupés dans le booster16
Protocole lot N°3 : Boosters 17 et 18 sont regroupés dans le booster17
Protocole lot N°4 : Boosters 19 et 20 sont regroupés dans le booster 20
Protocole lot Témoin négatif : Boosters 21 et 22 sont regroupés dans le booster 21
Au premier stade larvaire qui s’alimente, appelé Zoé, lorsque le lot est encore
représenté par 2 réplicats, les lots n°1 et n°5 sont homogènes. Leur perte de survie est
semblable avec des valeurs respectives de 10 % et 28 %. Durant cette première phase de
vie l’allure de la courbe est nettement diminuée mais la plus marquée est celle de 17
suivie de 19, 21, 22 ensuite 15 et 20 et puis 18 et 16 et enfin 13 et 14. Au passage en
Zoé 2 (jour 3) tous les boosters ont subi des traitements curatifs sauf les boosters 13 et
19, suite aux observations visuelles et microscopiques qui montrent des signes de
nécrose interne. Dans les boosters 13 et 19 apparaissent ces mêmes symptômes au
passage en Zoé 3 (jour 4) et ils ont reçu les traitements curatifs aussi. La nécrose interne
touche notamment l’intestin des larves. Les larves touchées perdent le péristaltisme de
l’intestin.
Au second stade de vie larvaire (de Mysis 1 à Mysis 3), la courbe de survie est
encore descendue mais l’importance de la perte a diminué par rapport au stade
précédent. Dans cette phase les boosters 16 et 17 sont les plus touchés. Durant cette
phase de vie les boosters n’ont pas reçu de traitement. Seul le booster 13 a eu un
traitement au jour 8 parce qu’il a montré des signes de pattes grises lors de l’observation
microscopique. Au stade de post-larve la courbe de survie du booster 14 est stable,
suivie du booster 16 qui a une faible diminution de survie et a reçu un traitement contre
l’infestation à Zoothamnium aux stades P2 et P3. En ce qui concerne le booster 17,
75
son allure est stable de Mysis 3 à P2 (Post-Larve de 2ème jour), jour où la courbe
commence à diminuer à cause de l’infestation par le Zoothamnium et les pattes grises.
C’est pourquoi il a reçu un traitement curatif. La courbe de survie du booster 20 ne
cesse de diminuer. Il a subi une action corrective pour le Zoothamnium à P2 et pour les
pattes grises à P3. La courbe du booster 21 se stabilise de Mysis 3 à P3 et il y a eu une
diminution à P3-P4. Au jour 12 il est infesté par le Zoothamnium et a reçu un
traitement.
Au final, les boosters 14 et 16 ont les meilleures survies, de l’ordre de 60 %,
alors que les trois autres boosters ont des survies d’environ 40 %. Les meilleurs résultats
en élevage sont donc obtenus en administrant quotidiennement un probiotique de
manière préventive, et prescrivant un traitement curatif lorsqu’une infection bactérienne
avérée est observée. Le seul traitement thérapeutique préventif du probiotique permet
d’obtenir une survie équivalente à l’emploi de l’antibiotique curatif seul, et la
performance est inférieure d’un tiers à l’emploi des deux stratégies simultanées.
76
I-I-2 Résultats des analyses bactériologiques
I-1-2-1 Résultats de l’analyse bactériologique de l’eau de
remplissage
L’eau de remplissage des bacs d’élevage provient de l’eau de mer naturelle à
l’aide de pompage. Avant d’entrer dans la plate forme, l’eau passe au travers d’un filtre
à sable à faible granulométrie en raison de 50 à 60 µm ; puis d’un filtre à cartouche à
1 µm. Elle est ensuite exposée aux rayons Ultras Violets avant d’entrer dans les bacs
d’élevage.
77
Tableau IX: Résultats du dénombrement des colonies bactériennes de l’eau de
remplissage
Booster Dilution Colonies non
luminescentes UFC/ml Luminescente
Verte jaune Verte jaune
13 10-1 0 456 4640 8 0
14 10-1 20 4 310 7 0
15 10-1 0 363 3660 3 0
16 10-1 0 956 9570 1 0
17 10-1 92 512 6040 0 0
18 10-1 1 947 9480 0 0
19 10-1 0 213 2400 27 0
20 10-1 4 3864 38700 2 0
21 10-1 1 2060 20680 3 0
22 10-1 9 365 3740 0 0
Le tableau des résultats du dénombrement des colonies bactériennes de l’eau de
remplissage nous révèle la présence des bactéries des différentes souches. Tous les
boosters contiennent des bactéries vertes luminescentes sauf les bacs 17, 18 et 22. Les
« vertes luminescentes » est le compartiment au sein duquel les souches des bactéries
les plus pathogènes sont observées en général. Nous observons donc qu’excepté le
booster 14, les flores bactériennes de l’eau sont largement dominées par les flores
78
jaunes sur TCBS. Les flores vertes luminescentes apparaissent en faible quantité dans
l’eau sans larves, en proportion des non luminescentes. Ces eaux sont donc de bonne
qualité, et peuvent recevoir des larves en élevage, sans risque d’apporter des flores
bactériennes pathogènes leur causant des dommages.
I-1-2-2 Résultats des colonies bactériennes de broyat des
animaux (cf. Annexe VIII)
Résultats de l’analyse bactériologique
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J10 J11 J12 J13
jours
vale
urs
ratio
(en
UFC/
ml)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
vale
ur ra
tio (U
FC/m
l)
Boo13Boo14Boo15Boo16Boo17Boo18Boo19Boo20Boo21Boo22
Figure XII : Composition relative de la flore microbienne vibrionacée des broyats des
animaux, mise en évidence par le rapport du nombre de colonies vertes sur le nombre de
colonies jaunes (ratio vertes/jaunes).
79
Booster 13 à 18 : ont des valeurs entre 0 à 40, leur axe des ordonnées se trouve à
gauche.
Booster 19 à 22 : ont des valeurs entre 0 à 5000, leur axe des ordonnées est à droite.
Booster 13 et 14: probiotique avec Aquaculture Therapy, distribution 6h après passage
Zoé 1, traité à l’antibiotique.
Booster 15 et 16 : probiotique à distribuer 6h après passage Zoé 1, avec Aquaculture
Therapy distribué à partir de stade Zoé 3, traiter à l’antibiotique.
Booster 17 et 18 : probiotique avec Aquaculture Therapy, distribution 6 h après passage
Zoé 1, le traitement adapté est Aquaculture Therapy mélangé avec microparticules en
cas de nécrose interne.
Booster 19 et 20 : Aquaculture Therapy distribué après passage Zoé 1, traité à
l’Aquaculture Therapy mélangé avec microparticules en cas de nécrose interne.
Booster 21 et 22 : témoin, probiotique distribué après passage Zoé 1, sans Aquaculture
Therapy, traité à l’antibiotique.
J1 à J13 sont des jours d’élevage larvaire.
Au J1, les larves sont encore au stade nauplii.
Au J2 à J6, les larves sont en stades Zoé.
Au J7 à J9, les larves sont en stades Mysis.
Au J10 à J13, les larves deviennent post-larves.
La valeur ratio est le rapport des souches vertes et des souches jaunes,
c'est-à-dire les souches vertes en UFC/ml divisées par les souches jaunes en UFC/ml. Le
résultat de comptage de bactéries s’exprime en Unité Format Colonie par ml, car il est
impossible de savoir combien de bactéries sont à la base de la formation d’une seule
colonie sur la boite de culture. En effet, il peut s’agir à la base d’une seule bactérie, ou
d’un groupe de bactéries attachées entre elles.
80
Au passage en Zoé 2 (jour 3) tous les boosters ont une valeur ratio supérieure à 1
c'est-à-dire la dominance de souches vertes pathogènes par rapport aux souches jaunes
non pathogènes; sauf le booster 13. Au passage en Zoé 3 le booster 13 montre une
valeur supérieure à 1. Dans ce même jour la valeur ratio des boosters 15, 17, 18, 19 et
20 est encore augmentée avec une forte augmentation dans les boosters 17 et 19. Cette
valeur ne cesse d’augmenter dans le lot n°4 avec une prolifération massive de souches
vertes au jour 5 au stade Zoé 3 et où on trouve aussi une forte dominance de ces souches
pathogènes au niveau de lot n°5 ainsi qu’une légère augmentation dans le booster 16.
Au jour 6 passage en Mysis 1 le rapport souches vertes/souches jaunes a
augmenté dans le lot n°1, n°2, et dans le booster 17 avec une valeur élevée dans les
boosters 14 et 16. Par contre le booster 18 et les lots n°4 et n°5 montrent une diminution
de valeur même si dans les boosters 20 et 21 la valeur reste encore élevée. Ce rapport
continue à diminuer et montre une valeur en-dessous de 1 à partir du jour 8 au passage
en Mysis 3 jusqu’au stade P4 (post-larve de 4 jours) le jour avant la fixation des
échantillons pour le Laboratoire Central d’Aqualma. Mais le booster 14 au jour 12
montre un pic élevé de valeur ratio et cette valeur a diminué à 1 au jour 13 au stade P4.
Il est notable que pour l’ensemble des boosters recevant régulièrement le probiotique, le
rapport des souches vertes sur les souches jaunes dénombrées sur le milieu TCBS est
largement en faveur de ces dernières, et que cette proportion est très stable sur
l’ensemble de la durée d’élevage. A l’inverse, pour les protocoles d’élevage ne recevant
qu’occasionnellement du probiotique, les flores peuvent être alternativement à
prédominance jaunes, puis vertes, en particulier entre les jours 4 à 7, puis aux jours 11 à
13. Cela dénote un déséquilibre de la flore bactérienne des larves à ces dates, moments
privilégiés durant lesquels les bactéries pathogènes opportunistes peuvent se développer
plus facilement.
Aucune souche bactérienne dominante n’a été détectée dans les boites de Pétri
ensemencées, tant en TCBS qu’en Marine Agar. Par conséquent, il n’a pas été
nécessaire d’isoler des souches bactériennes et de les identifier.
81
I-2 Résultats des observations in vivo, à l’œil nu et à la loupe binoculaire
Cependant, ces résultats bactériologiques ne sont pas totalement corroborés par
les observations visuelles durant le début de l’élevage, aux stades Zoé et Mysis, des
nécroses internes et pattes grises ont été observées dans l‘ensemble de ces « boosters »
expérimentaux, d’élevage en petits volumes, que le probiotique ait été administré ou
pas. Mais les observations visuelles d’infections bactériennes telles que les nécroses
internes ou les pattes grises apparaissent plus rares pour les élevages ayant reçu des
probiotiques aux stades post-larves. Les observations in vivo étant soumises à caution, il
est donc nécessaire de le confirmer en utilisant l’histologie.
I-3 Résultats histologiques
Pour reconnaître des lésions, tissus anormaux qui permettent notamment de
détecter la présence des agents pathogènes, il faut d’abord avoir une parfaite
connaissance de la structure normale des tissus. Nous allons donc décrire dans un
premier temps la structure de quelques organes ou tissus importants chez les crevettes.
Il s’agit de l’hépatopancréas, des branchies, de l’organe lymphoïde et de la glande
antennaire.
L’hépatopancréas
C’est un organe constitué des tubules juxtaposés qui sont tous connectés sur le
tube digestif. Chaque tubule est structuré de la même manière, avec de l’extérieur vers
l’intérieur une membrane basale, un épithélium constitué d’une seule couche de cellules
et une lumière centrale. Les cellules de l’épithélium peuvent être de différents types,
mais elles suivent un schéma de type équivalent, proche de la cellule glandulaire
typique. Il est facile d’observer le noyau assez volumineux par rapport à la taille totale
de la cellule, constituant environ un tiers de son volume. A l’intérieur de ce noyau, la
chromatine apparaît périphérique, marginée, et il est fréquent d’observer un nucléole
central de taille cinq fois inférieure environ à la taille du noyau. La coupe transversale
ci-dessous nous permet en outre de mettre en évidence que c’est un organe très riche en
82
protéines et en lipides, ceux-ci étant impliqués dans le stockage des réserves chez la
crevette.
Les branchies
C’est un organe très ramifié, qui présente différentes lames et lamelles, ce qui
permet d’optimiser le contact entre l’eau et les tissus internes. Il est également notable
que la cuticule de cet organe est de très faible épaisseur, ce qui facilite d’autant les
échanges de gaz dissous. La description détaillée de cet organe montre qu’outre cette
cuticule externe, il existe un épithélium sous-cuticulaire composé d’une seule couche de
cellules fines, avec un noyau très visible, constituant à peu près la moitié de la taille de
la cellule. Ce noyau possède une chromatine marginée et un nucléole qui est de taille
relativement modeste. Il est important de noter qu’en temps normal, les branchies sont
très propres même sur la face externe de la cuticule. Si de la matière organique ou des
parasites étaient détectés en grand nombre sur cette face de la cuticule, c’est une
situation anormale, qui peut diminuer grandement l’efficacité de la respiration et
stresser les animaux. Il faudrait donc le noter dans les lectures de lames.
L’organe lymphoïde
C’est un organe tubulaire, qui est juxtaposé à l’hépatopancréas dans sa partie
proximale. Sa structure observée en section peut être décrite comme une accumulation
de plusieurs couches de cellules de type épithélial, organisée en feuilles d’oignon, et
dont la partie centrale est constituée d’une lumière soit vide, soit remplie d’hémocytes.
Ces hémocytes sont parfois visibles également dans l’épaisseur de la paroi.
Le rôle de cet organe est principalement de purifier l’hémolymphe de tous les
corps étrangers et particules de tissus dégradés. Ces cellules ont une intense activité
macrophagique, complémentées dans cette tache par les hémocytes.
La glande antennaire
C’est un tissu plutôt diffus, qui ne constitue pas à proprement parler un organe. Il se
situe en partie antérieure du céphalothorax, autour de l’estomac et de l’œsophage
83
notamment. Il est constitué d’un épithélium simple dont les cellules possèdent un
cytoplasme plutôt éosinophile et un noyau dont le volume représente environ un tiers de
la cellule. Cet épithélium apparaît posséder de nombreuses circonvolutions, et en temps
normal aucun autre type cellulaire ne le compose. Néanmoins, en cas d’inflammation, il
n’est pas rare de voir des accumulations de composés inertes ou des hémocytes au sein
de ce tissu.
Les lésions observées sur les animaux fixés en cours d’élevage à Mifoko peuvent
maintenant être présentées. Nous les décrirons d’un point de vue structurel, puis en
préciserons la cause. Les échantillons fixés sont au nombre de 48 individus analysés
pour chaque booster élevé, au stade post-larve 5.
Tableau X: Résultats histologiques, présentés en pourcentage de post-larves présentant
des lésions sur le nombre total d’individus observés.
Booster 14 16 17 20 21
Lésions
bactériennes 0 0 2,08 8,33 2,08
Zoothamnium 6,25 2,08 20,83 20,83 27,08
Les résultats histologiques nous révèlent l’existence de lésions bactériennes
dans les boosters 17, 20, 21, alors qu’elles n’apparaissent pas dans les boosters 14 et 16.
84
Figure XIII : Lésions bactériennes de l’HP au grossissement x1000 à la coloration
H&E (Hématoxyline – éosine – phloxine)
Figure XIV: Lésions bactériennes de l’HP au grossissement x600 à la coloration de
Giemsa
Corps bactériens
Corps bactériens
85
Figure XV : Lésions bactériennes de l’HP au grossissement x 1000 à la coloration de
Giemsa
Figure XVI : Mélanisation de l’appendice causée par les bactéries et Zoothamnium au
x 600 à la coloration H&E (Hématoxyline – éosine – phloxine)
Zoothamnium
Mélanisation
Corps bactériens
86
Figure XVII : Mélanisation de l’appendice causée par Bactéries et Zoothamnium au
x 400 à la coloration H&E (Hématoxyline – éosine – phloxine)
Par ailleurs, le booster 17 présente des nodules hémocytaires au niveau
mandibulaire d’une post-larve sur 48 examinées, comme le montre la figure XVIII. Ceci
est un signe que l’infection bactérienne était devenue systémique, et gagnait donc
l’ensemble des organes internes de l’animal.
Mélanisation
Zoothamnium
87
Fugure XVIII : Nodule hémocytaire au Grossissement x 600 à la coloration H&E
(Hématoxyline – éosine – phloxine)
Le booster 20 présente une mélanisation de la cuticule au niveau de l’abdomen.
Dans ce booster, 4 post-larves présentent des lésions sur les 48 observées. A
l’observation microscopique in vivo, ce Booster montre aussi une post-larve sur 48
colonisées par des bactéries, mais qui ne présente pas de lésions tissulaires.
Nodule
hémocytaire
88
Figure XIX : Mélanisation abdominale ventrale au grossissement x 600 à la coloration
H&E (Hématoxyline – éosine – phloxine)
Figure XX : Mélanisation abdominale dorsale au grossissement x 600 à la coloration
H&E (Hématoxyline – éosine – phloxine)
Mélanisation
Mélanisation
89
Les échantillons prélevés dans le booster 21 présentent une post-larve atteinte de
mélanisation au niveau des appendices articulaires sur 48 observées (Figure XVI et
XVII).
Les infestations par le parasite externe Zoothamnium des boosters 14 et 16
(traités régulièrement à l’Aquaculture Therapy) sont moindres par rapport aux autres
boosters. Le nombre de post-larves atteintes de Zoothamnium dans le booster 14 est de
3 sur 48 soit 6,25%. Ceux du booster 16 est de 1 sur 48 soit 2,08 %.
Pour les boosters 17 et 20, les post-larves atteintes sont au nombre de 10 sur 48, soit
20,83 % et 13 post-larves sur 48 sont infestées pour le booster 21, soit un pourcentage
de 27,08%.
Nous confirmons donc par cette technique la présence des bactéries et des
parasites observés in vivo, mais avec une plus grande précision, et une évaluation
quantitative plus aisée. C’est ce qui en fait un outil irremplaçable pour la détection et la
confirmation de la présence des pathogènes en aquaculture.
Grâce à l’analyse histologique, nous arrivons en effet à déterminer l’étendue des lésions
et le pourcentage des animaux atteints.
Tous ces résultats nous montrent que l’utilisation de l’Aquaculture Therapy
diminue le risque d’infection bactérienne et d’infestation par Zoothamnium, surtout
pour les stades les plus âgés de l’élevage larvaire.
90
II Interprétation et Discussion
II-1 Interprétation
Avec l’eau de remplissage contenant des souches vibrionacées, il est normal que
les crevettes se retrouvent dans un milieu contenant des bactéries banales qui sont des
souches écologiques. Il contient également des souches bactériennes potentiellement
pathogènes, mais qui ne posent pas de problèmes en élevage si l’équilibre bactérien est
maintenu, et que celles-ci ne deviennent pas majoritaires.
La perte de survie durant les stades Zoé est due à l’apparition de nécroses
internes qui est causée par la prolifération de souches vertes, et surtout des vertes
luminescentes. Cette lésion apparaît surtout au passage de Zoé 1 à Zoé 2. La dose et la
fréquence de distribution de l’Aquaculture Therapy choisies n’arrivent pas à limiter la
prolifération de souches vertes pour cette phase dans les lots sans antibiotique, et il est
nécessaire de déclencher un traitement curatif pour juguler l’infection. A la fin de cette
phase de vie (stade Zoé 3) les lots traités à l’antibiotique et au probiotique ainsi que le
lot témoin résistent mieux à la nécrose interne même si les souches vertes prolifèrent
dans le bac. Certes dans les lots n°1, n°2, n°3 la survie reste meilleure au fur et à mesure
que le stade de vie avance mais l’abondance de souches vertes et en particulier la
dominance de souches vertes luminescentes dans le milieu peuvent être corrélées avec
la diminution massive de la population de crevettes dans le bac d’élevage. L’infestation
postérieure par le Zoothamnium et l’apparition de nécroses externes peuvent être reliés
à cette baisse de survie précoce, même si l’importance de cette seconde baisse est
diminuée par rapport à la première phase de vie.
Les nécroses externes se trouvent au niveau de la cuticule sur l’ensemble du
corps, des appendices articulaires, et sur les antennes. Ces lésions peuvent apparaître
lorsque les crevettes sont stressées et faibles après la mue et peuvent se rencontrer à
partir du stade Mysis et ainsi que l’infestation à Zoothamnium. Ces lésions sont dues à
la présence des bactéries pathogènes opportunistes. L’importance et/ou fréquence
91
d’apparition de nécroses externes est amplifiée s’il y a du cannibalisme, conséquence
d’une alimentation inadaptée.
Tant pour les nécroses internes qu’externes, l’apparition de ces signes d’infection
bactériennes ne sont pas clairement associées à la montée dans les boites de culture
d’une flore bactérienne dominante, qui pourrait être considérée comme la souche
responsable, donc l’agent étiologique des infections bactériennes observées. Il peut y
avoir deux raisons possibles à cette différence : soit il existe réellement un agent
étiologique, mais il ne cultive pas sur les milieux de culture choisis, soit les souches
responsables des infections sont des pathogènes opportunistes, qui profitent des
moments où les larves sont plus fragiles, notamment durant les phases de mues entre les
stades larvaires pour pouvoir proliférer jusqu’à un niveau qui affecte les larves. Il est
par contre notable que l’apparition des nécroses bactériennes les plus graves en
pourcentage des populations infectées est concomitante à l’observation des
déséquilibres de flore bactérienne mis en évidence grâce aux indicateurs bactériens
suivis.
Le résultat de la coloration de routine nous montre la présence des germes à
l’intérieur des tissus lésés. Sur les photos, nous observons que les lésions bactériennes
touchent essentiellement les cellules de l’hépatopancréas et les infestations par les
Zoothamnium se retrouvent au niveau des appendices articulaires, de la mandibule et
sur la cuticule de l’abdomen, ainsi que sur les lamelles branchiales. Les lésions
bactériennes sont caractérisées par des mélanisations au niveau des différentes cellules
et de nodules hémocytaires des mandibules. Ces lésions se distinguent par leur couleur
différente de la couleur violette basophile (les acides nucléiques) et de la couleur rose
des éosinophiles (les protéines). Ces sections de tissus sont réalisées au stade post-larve
de cinquième jour (P5).
Quant à la coloration de Giemsa, elle confirme encore plus aisément la présence
de corps bactériens dans les lésions. Cette coloration spéciale colore le noyau en
bleu/violet, les bactéries en bleu et le reste de la cellule en rose. Sur ces photos, elle
nous montre la présence de bactéries dans les cellules de l’hépatopancréas. Cette
92
coloration ne permet pas d’identifier si les bactéries sont Gram positives ou Gram
négatives. Pour les différencier, nous devons utiliser la coloration de Gram de Twort. La
coloration de Gram de Twort colore les bactéries Gram négatives en rose, les Gram
positives en rouge foncé ou violet et le reste de la préparation en jaune. Dans cette
présente étude, nous n’avons pas pu faire cette coloration parce que les P5 sont encore
trop petites pour subir plusieurs coupes successives. Ainsi les organes cibles peuvent
disparaître à la coupe.
93
II-2 Discussion
Depuis la maîtrise industrielle de la reproduction, de l’élevage larvaire et de la
nutrition des crevettes au cours des années mille neuf cent soixante-dix, la
crevetticulture a connu un développement très rapide. Elle est devenue l’une des
premières productions aquacoles au niveau mondial, dans un schéma de culture de
rente. Et cette culture de crevettes connaît à Madagascar un essor important.
Parmi les principaux facteurs limitants du développement et de la durabilité des
activités aquacoles, autant que compromettants pour les ressources naturelles, les
maladies sont reconnues comme figurant au tout premier rang. Ces maladies,
essentiellement virales (WSSV, TSV, YHV, IHNNV, IMNV), qui affectent les crevettes
limitent depuis près d’une quinzaine d’années le succès du secteur dans un bon nombre
des pays qui pratique cet élevage, en Amérique centrale et latine aussi bien qu’en Asie.
Leur incidence est aggravée par les dégradations environnementales, qui produisent un
stress accru pour les animaux. Les transferts internationaux des crevettes vivantes pour
des besoins d’aquaculture ont de toute évidence été également une des causes majeures
de la propagation de ces virus à l’échelle mondiale. Pour les pays importateurs, les
crevettes congelées sont aussi un facteur d’introduction et de dissémination potentielles
des ces virus. Ces maladies ont déjà provoqué d’énormes pertes économiques.
A l’écart de ces pays producteurs ou importateurs, l’aquaculture malgache est
pour l’instant encore préservée de ces épizooties. La Grande île ne présente pas les
pathogènes viraux inscrits dans la liste de l’OIE, car ces pathogènes sont absents sur les
côtes malgaches (excepté pour le MBV, qui devrait bientôt être retiré des listes de
l‘OIE, car peu important économiquement). Elle est indemne de ces maladies qui sont
transmises souvent par les échanges commerciaux des crevettes qu’elles soient vivantes
ou congelées, parce que Madagascar est riche en espèces sauvages, utiles pour être des
géniteurs, dans les zones côtières. Donc elle n’importe ni des géniteurs ni des nauplii ou
des larves de crevettes pénéides vivantes d’ailleurs dans le monde, comme la loi le
prescrit. Cela devrait également être le cas des produits congelés, qui sont également
des sources majeures des épizooties, mais il est malheureusement moins sûr que cela
94
soit respecté à la lettre. Ce sont les maladies bactériennes qui représentent les maladies
économiquement les plus importantes à Madagascar, et peuvent engendrer des pertes
importantes dans les élevages affectés, sans toutefois arriver au niveau de gravité des
grandes pandémies virales observables ailleurs dans le monde.
En ce qui concerne l’élevage larvaire, c’est toujours les problèmes bactériens qui
dominent également les pathologies observées, en particulier celles causées par des
souches appartenant au genre Vibrio, présentes dans les sédiments et l’eau d’élevage. Et
parmi les Vibrio, ce sont surtout les souches vertes luminescentes qui provoquent
beaucoup de mortalités à ces stades de développement très fragiles des crevettes. C’est
aussi le cas à Madagascar.
Alors pour prévenir ces infections bactériennes en élevage larvaire, AQUALMA
souhaite améliorer le milieu ainsi que les conditions de vie des larves et post-larves de
crevettes, notamment en testant un produit commercialisé comme un probiotique appelé
Aquaculture Therapy, qui contient de nombreuses souches du genre Bacillus (cf.
Annexe n° VI).
Notre étude a surtout consisté à pratiquer des analyses bactériologiques,
cliniques et pathologiques en cours d’élevage larvaire ainsi qu’au laboratoire. Les
analyses au laboratoire concernent notamment les lésions bactériennes. Cette démarche
diagnostique se limite aux analyses histologiques avec la coloration de routine
hématoxyline-éosine et la coloration spéciale de Giemsa.
Les résultats de cette expérience permettent d’évaluer l’efficacité de l’Aquaculture
Therapy vis-à-vis des infections bactériennes, parasitaires ou fongiques des larves et
post-larves de crevettes. Il est à souligner que les bactéries peuvent être bénéfiques en
élevage. Elles ne sont pas uniquement pathogènes, par exemple, l’Aquaculture Therapy
comprend des souches bénéfiques pour l’aquaculture, en quantités importantes (au
minimum 100 millions d’UFC/ml selon la documentation fournie par le fabricant).
95
Le probiotique déclenche la stimulation de l’immunité des animaux en aquaculture. Ce
qui procure son efficacité vis-à-vis des agressions bactériennes (Mariel et al., 2003).
Ainsi, les résultats bactériologiques nous montrent la présence des bactéries et
même les souches vertes luminescentes dans l’eau de remplissage qui est une source
majeure d’introduction des bactéries pathogènes en écloserie (Alabi, 1997). Donc il est
normal que le bac d’élevage contienne des bactéries. C’est pour cela que l’AQUALMA
veut améliorer le milieu de son élevage. Les bactéries se rencontrent toujours en plus
grand nombre dans l’eau d’élevage ainsi que dans les dépôts présents au fond du bac, où
elles dégradent les matières organiques mortes (Ruangpan, 1997). Les aliments
préfabriqués distribués dans le bac d’élevage pour les larves et post-larves de crevettes
constituent une autre source d’apport des bactéries dans le milieu, ainsi que les algues et
les nauplii d’artémia qui sont utilisés pour leur alimentation en proies vivantes.
Certaines de ces bactéries provoquent des mortalités importantes durant les
premiers stades de vie des larves. Au stade Zoé, nous avons observé des nécroses
internes qui touchent essentiellement le tube digestif. La mortalité induite est corrélée à
la présence des bactéries souches vertes luminescentes dans le bac. Le même cas est
observé en Inde en élevage larvaire, causé par une espèce de Vibrio luminescente qui est
Vibrio harveyi (Duraisamy, 1997).
Au second stade larvaire, en Mysis, dans cette présente étude les nécroses ont été
détectées au niveau de l’antenne et des appendices articulaires. Nous avons observé
moins de mortalité durant ce stade. Au Vietnam, une étude a été faite pour la virulence
des bactéries en écloserie. L’étude avait donné 100% de mortalité des crevettes au
cinquième jour de vie par injection de V. parahaemolyticus, et au septième jour de vie
par le bain dans une suspension de cette même espèce. Sur les crevettes moribondes,
cette espèce de Vibrio donne des lésions de nécroses sur l’antenne, les muscles et les
appendices articulaires. Vu cette étude, l’infection à Mysis est imputée à V.
parahaemolyticus (Nguyen et al., 1997). Nous avons continué d’observer ces lésions
jusqu’au stade de post-larve, mais les mortalités sont de moins en moins observées.
96
A Madagascar, il n’existe pas un type bactérien dominant pouvant être considéré
comme l’agent étiologique de ces infections, mais ce sont plutôt des souches
opportunistes, au profil biochimique variable, qui profitent d’un déséquilibre bactérien
pour s’établir dans des proportions anormalement élevées de la flore, ce qui affecte les
animaux, surtout les jeunes stades, plus primitifs. Nous pouvons nous poser la question
de savoir si la non détection d’une flore réellement pathogène associée à l’apparition de
ces lésions est due :
- à l’emploi de milieux de culture non adaptés à la croissance in vitro de
ces souches,
- ou si ces bactéries pathogènes se mettent immédiatement dans un stade
de résistance classique dans les espèces du genre Vibrio, à savoir le
stade « viable non cultivable », qui ne permet pas d’obtenir les souches
quel que soit le milieu de culture inerte employé.
- Ou si enfin il n’existe pas d’agent pathogène très virulent, mais plutôt
un ensemble de souches pathogènes opportunistes qui profitent des
déséquilibres bactériens pour synthétiser des facteurs de virulence et
provoquer des dommages dans les tissus des larves, notamment leur
tube digestifs ou leurs cuticules, en particulier quand les ressources en
nutriments deviennent rares dans le milieu de vie des bactéries, à savoir
l’eau d’élevage des larves. Cela expliquerait la montée en proportion
des souches bactériennes expriment une luminescence, car celle-ci est
fréquemment associée au phénomène de « Quorum Sensing », via
lequel les bactéries communiquent et s’informent mutuellement d’une
baisse des ressources énergétiques disponibles. Il a déjà été décrit que
ce « quorum sensing » peut aussi déclencher la synthèse de molécules
activant l’expression de facteurs de virulence bactériens, qui sont l’on
se place d’un point de vue finaliste, permet aux bactéries d’accéder à de
nouvelles ressources énergétiques, en l’occurrence les tissus des larves
de crevettes pénéides. Celles-ci sont d’autant plus affectées par ces
97
facteurs de pathogénicité qu’elles sont jeunes ou en situation
physiologique précaire, comme c’est le cas au moment
des mues / métamorphoses.
Cette étude ne nous permet pas de conclure sur laquelle de ces trois
raisons est la bonne, mais des faisceaux de preuves nous amènent à
penser que la troisième hypothèse est la plus plausible.
En effet nous avons constaté lors de cette étude que plus les crevettes sont en
stade avancé plus elles sont résistantes aux agressions de ces bactéries, surtout lorsque
l’utilisation d’un probiotique permet de réguler les flores bactériennes.
Le résultat histologique nous a révélé que les bacs d’élevage ayant reçu de
l’Aquaculture Therapy avec ou sans traitement en antibiotique ont de faibles taux de
crevettes ayant des lésions bactériennes. Et surtout, les infestations par le Zoothamnium
sont significativement moindres dans ces bacs, par rapport au bac témoin, c'est-à-dire au
bac ayant suivi le protocole d’élevage classique sans ce probiotique.
98
III-SUGGESTIONS
Le maintien de la santé dans l’aquaculture est aujourd’hui considéré comme l’un
des plus importants aspects de développement et de gestion du secteur aquacole.
L’explication des causes des maladies est le plus souvent liée à un manque de
biosécurité, difficile à mettre en place dans un environnement aquatique ouvert.
Nous savons que le non respect de l’environnement entraîne une émergence des
maladies liées au stress des animaux et les rendent vulnérables face aux pathogènes qui
existent dans leur milieu de vie. Alors face à ces problèmes, les mesures de protection
de l’environnement sont primordiales pour la pérennisation du secteur. En effet il faut
disposer d’une étude d’impact environnemental, et suivre les directives et les normes
prévues par les Lois et les Règlements relatifs à l’environnement. Il ne faut par exemple
jamais défricher les mangroves pour augmenter la surface d’emprise de la ferme, et
systématiquement réhabiliter la surface exploitée en cas de cessation d’activités. Le
traitement des eaux usées est obligatoire avant de les évacuer dans la nature.
Le Code de conduite pour l’aquaculture de crevettes responsable et durable à
Madagascar établit les principes fondamentaux devant favoriser le développement
durable, écologiquement acceptable et économiquement viable de la crevetticulture. Il
vise aussi une meilleure intégration de l’activité dans l’environnement.
Extrait : « Loi N° 2001 – 020 portant développement d’une aquaculture de crevettes
responsable :
Le « Titre III » est relatif à la protection de l’environnement.
Le « Titre IV » indique les procédures à suivre quant à la mise en place d’un
établissement d’aquaculture de crevettes à caractère industriel et artisanal.
Concernant les crevettes d’élevage, les mesures de prévention contre
l’émergence des maladies reposent surtout sur la règlementation de l’importation,
99
c’est-à-dire le contrôle des mouvements des animaux vivants ou des produits congelés.
Les aliments importés doivent être soumis à des contrôles auprès des Services
Vétérinaires. Pour les animaux en élevage, la densité d’ensemencement et la biomasse
finale ne doivent pas être trop élevés afin d’éviter le stress des animaux. La stratégie de
l’épidémio-surveillance des zones côtières et l’analyse de risque de l’émergence des
maladies complètent le dispositif, en plus de la nécessité de respecter une bonne
conduite d’élevage. Le contrôle sanitaire doit être effectué régulièrement à toutes les
étapes de la production. La maîtrise de la température et la salinité, ainsi que du pH du
milieu d’élevage est indispensable en crevetticulture. Nous avons vu que la forte
variation de ces paramètres provoquent un stress des animaux. Cette variation est l’une
des causes majeures des maladies évoquées plus haut.
Loi N° 2001 – 020 portant développement d’une aquaculture de crevettes responsable
Le titre II est réservé aux mesures de prévention contre les maladies
Ainsi, le confort des animaux tout au long de l’élevage est primordial pour la
réussite de la chaîne de production. La détérioration de la qualité de l’eau est à éviter.
En élevage larvaire, l’utilisation d’antibiotique de prévention conduit à une résistance
des bactéries pathogènes. Il ne faut donc les utiliser que pour des traitements curatifs et
ponctuels. Alors l’utilisation de probiotiques, qui sont des produits contenant des
souches bénéfiques et qui purifient l’eau d’élevage en aidant ainsi les larves et les post-
larves de crevettes à résister aux agressions des germes pathogènes et les opportunistes,
donne aujourd’hui un nouvel espoir à l’amélioration des conditions d’élevage.
Néanmoins, sur notre présente étude la seule distribution de probiotique selon le
protocole d’administration choisi ne suffit pas encore à limiter la prolifération
bactérienne dans le milieu d’élevage au stade larvaire. Mais en plus de la distribution de
probiotiques, l’utilisation d’antibiotique en traitement curatif ponctuel, lors de
manifestation des signes cliniques ou perturbations des flores bactériennes observées
permet d’obtenir une meilleure survie des animaux dans les élevages.
100
Alors il est possible que si le probiotique est distribué à fréquence plus
importante et avec une dose plus élevée bien que raisonnable économiquement, même
en absence de l’apparition des lésions, il puisse limiter la prolifération des germes
pathogènes. Ainsi faisant, il améliore le confort des animaux dans le milieu et les aide à
résister aux agressions bactériennes ou plus généralement à celles de leur milieu de vie.
Des essais répétés de ces produits commerciaux à échelle industrielle est donc fortement
souhaitable, afin de sélectionner le meilleur probiotique commercial, et qu’il fasse partie
intégrante du protocole d’élevage larvaire telle que définie dans les procédures ISO
utilisées.
CONCLUSION
101
CONCLUSION
La pénéiculture, après une trentaine d’année d’existence entre maintenant dans
sa phase d’industrialisation. Néanmoins, cette industrie en développement est
confrontée de plus en plus à des maladies épizootiques dues aux virus et à des bactéries
causant des pertes économiques considérables dans de nombreux pays. Le transport
non contrôlé des animaux vivants, quel que soit leur âge, favorise la dissémination des
pathogènes de la maladie d’un pays à un autre, alors que l’aquaculture des crevettes
prend une part de plus en plus grande chaque année dans la production mondiale
d’origine halieutique.
Notre étude sur les maladies bactériennes de crevettes pénéides à Madagascar
repose en particulier sur l’espèce Penaeus monodon domestiquée à Madagascar, espèce
très exploitée dans le monde de l’aquaculture de nos jours. Des analyses
bactériologiques faites pour détecter la présence des germes et l’apparition des signes
cliniques ont pu être utilisées dans les laboratoires de contrôle qualité et de l’élevage
larvaire. De plus, des analyses histologiques effectuées au Laboratoire Central ont pu
être utilisées pour observer l’étendue des lésions bactériennes de ces larves et post-
larves de crevettes.
Chaque étape d’analyse permet de déterminer la présence des bactéries dans le
milieu d’élevage et l’évolution des infections durant l’expérience. Ainsi la culture des
broyats des crevettes et de l’eau nous fournit des indicateurs précieux de la flore
bactérienne présente dans le bac d’élevage. Le suivi d’élevage accompagné des
observations visuelles et microscopiques ainsi que le comptage des larves permet de
détecter les signes cliniques précoces de la maladie et de déterminer le pourcentage de
survie des animaux à tous moments. Au Laboratoire Central d’Aqualma, l’étape de
l’histopathologie nous permet d’observer les lésions et ses caractéristiques afin de
pouvoir localiser les germes responsables de celles-ci et les lésions qu’elles induisent
grâce à la coloration de routine hématoxyline-éosine, ou à l’aide des colorations
102
spéciales comme le Giemsa ou le Gram de Twort. Les résultats des analyses nous
révèlent la présence des pathogènes bactériens et des parasites sur les larves. Il n’y a pas
à ce jour de pathogènes viraux engendrant des mortalités dans les élevages larvaires
malgaches.
En effet, Madagascar est indemne des maladies épizootiques virales listées par
l’OIE, comme le WSSV ou la maladies des taches blanches, TSV ou le Syndrome de
Taura, YHV ou la maladie de la tête jaune, IHNNV ou la nécrose hypodermique et
hématopoïétique infectieuse et IMNV, ou encore de la seule maladie bactérienne listée
par l’OIE, la NHP-B, qui ont ravagées les autres pays pratiquant la pénéiculture. Seules
les bactéries sont actuellement économiquement dommageables pour l’industrie de la
crevette malgache et surtout en élevage larvaire. C’est pour cette raison que nous avons
réalisé l’étude sur l’efficacité de l’Aquaculture Therapy vis-à-vis des germes pathogènes
en élevage larvaire.
Compte tenu des résultats de cette expérience et en comparant les cas des études
faites dans d’autres pays, il semble possible que l’Aquaculture Therapy améliore la
survie des larves et post-larves de crevettes en les aidant à mieux résister aux infections
bactériennes. Donc l’utilisation de l’Aquaculture Therapy en élevage larvaire de
crevettes s’avère être bénéfique. Bien qu’elle n’améliore pas spécialement la survie des
larves en absence de traitement antibiotique durant la première phase d’élevage jusqu’à
mysis, elle semble améliorer le milieu et diminuer les infections bactériennes voire les
infestations parasitaires à Zoothamnium sur les larves, surtout aux stades post-larves
avancés.
Il est également à noter que ces essais se sont déroulés dans des petits volumes,
en bacs cylindro-coniques, et que la survie moyenne finale à P5 est nettement inférieure
à celle obtenue en moyenne dans les bacs elliptiques industriels de 15 m3 classiques.
Ces tests sont donc utiles pour sélectionner les probiotiques les plus intéressants, mais
ils ne peuvent pas simuler ce qu’il se passera en élevage industriel. Une fois plusieurs
103
probiotiques pré-sélectionnés de cette manière, des phases d’essai à plus grande échelle
pourront avoir lieu, puis l’usage de ces produits pourra être généralisé si les tests sont
concluants, tant techniquement qu’économiquement.
L’utilisation de ces probiotiques, si elle se révèle efficace comme thérapeutique
préventive, pourra apporter un confort accru aux animaux et limiter la nécessité
d’utiliser des traitements thérapeutiques curatifs. C’est donc désormais une voie de
recherche prioritaire pour l’aquaculture de crevettes.
ANNEXES
Annexe I : Classification de crevettes pénéides
EMBRANCHEMENT : Arthropodes
SOUS-EMBRANCHEMENT : Antennates
SUPER CLASSE : Crustacés
CLASSE : Malacostracés
SOUS-CLASSE : Eumalacostracés
SUPER ORDRE : Eucarides
ORDRE : Décapodes
SOUS-ORDE : Pénaéides
FAMILLE : Peneidea
SOUS-FAMILLE : Penaeinea
GENRE : Penaeus
Annexe II : Cycle de reproduction de crevettes pénéides
Annexe III : Morphologie de crevette Pénéides spp.
Annexe IV : Tableau résumant les pathogènes de crevettes pénéides
PATHOGENES VIRAUX MALADIES Acide Nucléique Signes cliniques Continents
touchés
WSSV ADN double brin Taches blanches sur l’exosquelette et épiderme
Asie Amérique
TSV ARN non enveloppé Teinte rougeâtre du corps Amérique Asie
YHV ARN enveloppé Coloration jaune du céphalothorax
Asie Amérique Australie
IHHNV ADN simple brin Opacité des muscles Asie Amérique
IMNV ARN non enveloppé Muscles comprenant des foyers blancs
Amérique Asie
HPV ADN simple brin Non spécifique (confirmation à l’histopathologie)
Mondial Madagascar
MBV ADN double brin Hépatopancréas pâle (jaune à brunâtre)
Mondial Madagascar
MSGS Retard de croissance marqué Asie
Afrique Madagascar
LES PARASITES
MALADIES Localisation Signes cliniques Continents touchés
Microsporidies Interne Muscle blanc laiteux Mondial Madagascar
Grégarines Interne Tache jaune sur l’intestin Mondial Madagascar
Haplosporidies Interne Hépatopancréas touché Asie
Zoothamnium spp. Externe Agitation des animaux Mondial Madagascar
Lagenidium spp. Sirolpidium spp. Champignons Micelliums fongiques
Présents dans les tissus internes Asie
Fusarium Champignon Dépôt de mélanine dans les branchies Asie
PATHOGENES BACTERIENS
MALADIES Gram Localisation Signes cliniques Continents touchés
NHP-B Négatif Intracellulaire Corps mou Branchies sombres Amérique
RLB Négatif Intracellulaire Nécrose de carapace du céphalothorax Madagascar
Spiroplasma Intracellulaire Expansion de chromatophore Amérique
Vibrio Négatif Eubactérie Segments abdominaux rouge
Mondial Madagascar
Microgrammes positifs Positif Eubactérie Stress Mondial
Madagascar
Peritrichous spp. Négatif Eubactérie Branchies sales Mondial Madagascar
Annexe V : Carte de localisation des sites d’Aqualma
Annexe VI : Certicat des analyses de l’Aquaculture Therapy CERTIFYING BODY CERTIFYING BODY
Parkway Research Div. Brandt Consolidate, Inc. 211 West Rt. 125 Pleasant Plains, IL 62677 USA 800.252.2905 217.626.1123 217.626.1927 Fax TOTAL CFU COUNT GUARANTEE (If applicable) 1000,000,000 CFU per ml MICROBIAL GENUS/ SPECIES Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumulis, OTHER GUARANTEE LOT NUMBER TBD INTEDED USE To improve water conditions in aquaculture environments INSTRUCTION FOR USE Refer to label for specifics HAZARDOUS SITUATIONS None ofvthe ingredients in this material meet the definition of “Hazardous Chemical” 29 CFR 1910.1200
DATE OF CERTIFICATION TBD ADDITIONAL INFO Store product in original container with lid tightly secured. Store product between 35°F / 1.7°C-100°F / 37.8°C NAME OF CERTIFYING OFFICER Ray Kimmel
CERTIFICATE OF ANALYSIS FOR
AQUACULTURE THERAPY
Annexe VII : Pourcentage de survie de post-larves
Z1 Z2 Z3 M1 M2 M3 P1 P2 P3 P4
Bo13 78,01 73,77 68,52
Bo14 91,49 87,04 81,57 73,92 72,97 66,97 66,79 66,61 66,22 65,85
Bo15 95,45 73,76 71,48
Bo16 95,98 90,76 78,31 80,24 74,13 65,68 65,37 63,74 61,09 58,24
Bo17 88,76 74,09 59,59 69,59 66,66 54,19 53,8 53,41 46,58 43,66
Bo18 95,31 83,07 74,04
Bo19 90,01 74,44 62,03
Bo20 87,5 76,83 63,97 54,49 48,33 47,03 41,88 38,74 36,91 32,84
Bo21 97,36 75,65 65,56 59,64 54,38 51,37 50,87 50,12 48,85 40,1
Bo22 91,22 76,02 63,13
Annexe VIII : Composition relative de la flore microbienne vibrionacée des
broyats des animaux, mise en évidence par le rapport du nombre de colonies vertes
sur le nombre de colonies jaunes (ratio vertes/jaunes)
N° Booster Ratio J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J10 J11 J12 J13
Boo13 0,005 0,033 0,339 7,527 3,5 5,299 Boo14 0,013 0,002 10,48 0,164 0,837 40,002 5,3991 0,0455 0,105 0,079 0,156 22 1 Boo15 0,003 0,0065 1,051 2,303 1,274 5,166 Boo16 0,001 0,018 1,747 0,974 1,96 33,766 4,6603 0,212 0,1305 0,825 0,134 0,035 0,03Boo17 0,004 0,029 3,15 22,146 1,548 5,487 2,7733 0,347 0,0875 0,023 1,643 0,146 0,04Boo18 0,001 0,011 1,583 2,883 2,017 0,785 Boo19 0,008 0,092 56,2 682,03 1540,78 9,025 Boo20 0,002 0,013 1,765 5,454 5006,98 300,79 6,1293 0,0725 0,128 0,184 0,08 0,004 0,03Boo21 0,005 0,08 62,337 6,641 1769,8 68,725 9,3173 0,384 0,5335 0,405 0,381 0,134 0,02Boo22 0,036 0,003 11,099 1,171 100,089 1,095
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Serment des Docteurs en Médecine Vétérinaire
DÉPARTEMENT D’ENSEIGNEMENT
DES SCIENCES ET DE MÉDECINE VÉTÉRINAIRES
(DESMV – Faculté de Médecine – Université d’Antananarivo)
" Au nom de Dieu Clément et Miséricordieux, en présence des membres de l’Ordre National des Docteurs Vétérinaires Malgaches et devant mes Enseignants, je fais le serment d'avoir à tout moment et en tout lieu le souci constant de la dignité et de l'honneur de la profession vétérinaire.
Ainsi, je promets et je jure :
• de conformer ma conduite professionnelle aux règles prescrites par le Code de Déontologie et d'en observer en toute circonstance les principes de correction et de droiture, • d'être fidèle aux lois de l'honneur, de la moralité, de la probité et de l'éthique dans l'exercice de la médecine vétérinaire et d'honorer ceux qui m'ont instruit dans les préceptes de mon art et de leur témoigner ma reconnaissance en restant fidèle à leur enseignement, • de respecter la vie des animaux, de jouer un rôle primordial dans la protection de leur santé et de leur bien être et d'œuvrer à l'amélioration de la santé de l'homme et de son bien être, • d'œuvrer pour la préservation de l'environnement et pour la promotion d'une vie harmonieuse entre tous les êtres vivants et de m'efforcer de créer les conditions idéales de coexistence entre l'homme et l'animal, • d'essayer de maîtriser les récentes connaissances et techniques en médecine vétérinaire et de les inculquer à d'autres tout en veillant à promouvoir les échanges avec les sciences apparentées afin de permettre l'évolution de la science.
En aucun cas, je ne consentirai à utiliser mes connaissances et mon état pour corrompre les mœurs et favoriser des actes répréhensibles.
Que les hommes m'accordent leur estime si je suis resté fidèle à mes promesses. Que je sois couvert d'opprobre et méprisé des confrères si j'y manque. "
PERMIS D’IMPRIMER
LU ET APPROUVE
Le Président de Thèse
Signé: Professeur ANDRIANASOLO Roger
VU ET PERMIS D’IMPRIMER
Le Doyen de la Faculté de Médecine
d’Antananarivo
Signé: Professeur RAJAONARIVELO Paul
Name and first name: FARIDA Hassani Title thesis: LES PATHOGENES DES CREVETTES PENEIDES : EXEMPLE DES ELEVAGES LARVAIRES A MADAGASCAR, INTERET THERAPEUTIQUE DES PROBIOTIQUES.
Number of pages : 103 Number of tables : 10 Number of figures : 20 Number of appendix: 10
SUMMARY
In Madagascar, shrimp larval rearing can be facing bacterial infections like in the rest of
the world. Aqualma is aiming at limiting or even eradicate bacterial infections if
possible in order to improve the rearing conditions of the animals and ameliorate the
performances. Our experience has taken place in Mifoko, the hatchery site which
belongs to Aqualma. At larval stages, bacterial infections can induce massive outbreaks.
The AQUACULTURE THERAPY product defined as probiotic, has been tested in
order to limit bacterial infection by favouring the larvae and post-larvae shrimp
resistance against bacteria attacks. It is claimed that this product consumes the organic
matter which resulted from the dead micro-organisms and organisms which cover the
pond and constitutes complex biofilms with food wastes. By doing so, it is supposed to
clean the bottom and improve the rearing environment of the larvae. During this
experience, the AQUACULTURE THERAPY has been showing some effect in
improving the shrimp resistance to bacterial infection, especially to older post-larvae
stages. The tank which has been treated with antibiotics when required and that has
also received AQUACULTURE THERAPY on a regular basis have had a low
percentage of parasitic lesions in young post-larvae stages and have shown an absence
of the bacterial lesions. The other tanks did show occasionally bacterial and parasitic
lesions. There were more affected post-larvae in the negative control tank (standard
larval rearing protocol) than there was in the tanks which received AQUACULTURE
THERAPY on a regular frequency. We have shown that AQUACULTURE THERAPY
can significantly limit the bacterial infection and the parasitic infestation which result
from Zoothamnium in larval rearing.
Words-keys: Pathogens; Shrimps; Peneid; Hatchery; Madagascar; Probiotics Director of the thesis: Professor ANDRIANASOLO Roger Reporter of thesis : Doctor LE GROUMELLEC Marc Address of the author: [email protected]
Nom et prénom : FARIDA Hassani Titre de la thèse : LES PATHOGENES DES CREVETTES PENEIDES : EXEMPLE DES ELEVAGES LARVAIRES A MADAGASCAR, INTERET THERAPEUTIQUE DES PROBIOTIQUES.
Nombre de pages : 103 Nombre de tableaux : 10 Nombre de figures : 20 Nombre d’annexes : 10
RÉSUMÉ
Les pathogènes bactériens causent fréquemment des problèmes en élevage larvaire de
crevette à Madagascar. Aqualma essaie de limiter les infections bactériennes, voire les
supprimer, par l’amélioration des conditions de vie de crevette en élevage. A Mifoko,
site d’élevage larvaire propriété d’Aqualma se déroulait l’expérience que nous avons
mené. A ce stade d’élevage, les bactéries pathogènes ou opportunistes causent des
infections allant jusqu’à la mortalité massive des larves. Le produit Aquaculture
Therapy, défini comme un probiotique commercial est testé pour limiter les infections
bactériennes en aidant les larves et les post-larves de crevettes à mieux résister aux
agressions des bactéries de leur milieu d’élevage. Il améliore le milieu d’élevage en
nettoyant le fond du bac en consommant la matière organique en dégradation provenant
des microorganismes et organismes morts qui tapissent les bacs d’élevage en constituant
un biofilm complexe avec les débris alimentaires. Durant cette expérience, nous avons
pu montrer que l’Aquaculture Therapy aide les crevettes à résister aux infections
bactériennes surtout aux stades post-larves avancées. Les bacs avec les traitements en
antibiotique et avec la distribution régulière de l’Aquaculture Therapy ont eu un faible
pourcentage des lésions parasitaires et révèlent une absence des lésions bactériennes en
histologie. Les autres bacs ont révélé occasionnellement des lésions bactériennes et
parasitaires, notamment Zoothamnium, lors de l’observation microscopique. Le nombre
des post-larves atteintes par cette parasitose est plus important dans le bac témoin par
rapport aux autres bacs. L’Aquaculture Therapy limite de manière significative les
infections bactériennes et les infestations par Zoothamnium en élevage larvaire.
Mots clés : Pathogènes, Crevettes, Pénéides, Elevages larvaires, Madagascar, Probiotiques Président de thèse : Professeur ANDRIANASOLO Roger Rapporteur de thèse : Docteur LE GROUMELLEC Marc Adresse de l’auteur : [email protected]