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LEPTOSPIROSISGENERALIDADES Y
DIAGNOSTICO
Leptospirosis
• La Leptospirosis en una enfermedad infecto-contagiosa, aguda y febril causada por una bacteria del género Leptospira que afecta sobre todo a los animales salvajes y domésticos, que sirven como fuente de infección para el hombre.
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Orden: SpirochaetalesFamilia: LeptospiraceaeGénero: LeptospiraSp.: interrogans
biflexaSerogrupo: PomonaSerovar: PomonaCepa: Pomona
• Clasificación: género Leptospira • dividido en 2 especies: • saprofítica L. biflexa s. l. • patogénica L. interrogans s. l.
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• El género Leptospira está dividido en varias genomospecies
• Al menos 9 para leptospiras patógenas. • Pero hasta ahora para diagnóstico
experimental y epidemiológico la clasificación serológica se sigue utilizando.
• Las especies patógenas – L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchi,
L. fainei, L. borgpetersenii, L. santarosai,L. weilii, L. inadai y L. alexanderi.
• No patógenas – L. biflexa, L. meyeri y L. wolbachi.
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M E
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Características de la Bacteria
CARACTERISTICAS DE SUPERVIVENCIA
-Humedad
-pH
-Sales en el suelo
-Temperatura, Clima
-MO presentes naturalmente
Características de la Bacteria
CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS
-Forma
-Diámetro
-Flexibilidad
-Movilidad
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Bacterias Aerobias Estrictas
-Tiempo generacional 7-12 hs.-Temperatura 30 ºC-Medios enriquecidos
líquidos: Korthof, TA 80 (EMJH)semisólidos- 0,2 % agar: Fletchersólidos- 1%- 2% agar: TA 80 (EMJH)
Ciclo epidemiológico
Portador renal
Susceptibilidad
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TRANSMISION
HORIZONTAL
DIRECTAIA- Coito- Orina- Secreciones
Organos
INDIRECTAAgua- Pastos-Barro (Insectos)
VIAS DE INFECCION(Transmisión)
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VIAS DE INFECCION(Transmisión)
VERTICAL
CONGENITA (Transplacentaria)
Diagnóstico
CLINICO Manifestaciones Clínicas
MICROBIOLOGICO Detección del agente etiológicoAislamiento -Microscopía de COTincionesIFD - IHQ
MOLECULAR PCR- VNTR
SEROLOGICO MATTests Rápidos: ANTIGENO
TERMORESISTENTE TR ELISA
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Métodos directos• Microscopia de campo oscuro• Coloraciones
GiemsaRojo congoImpregnación argéntica
• Inmunofluorescencia Directa
• Cultivos: Fletcher- EMJH
• Tecnicas moleculares
• Inoculación en animales de laboratorioCobayosHamsters
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Método indirecto: serología
• Técnicas de tamizaje (Screening)Test de ELISAMacroaglutinación (Atg. TR)ContrainmunoelectroforesisInmunofluorescencia indirectaHemoaglutinación indirecta
• Técnica de confirmaciónTest de microaglutinación (MAT)
Foto de cobaya prenadaFOtos CD archivo 16467
X3-e.jpg
Foto H&E Foto W-S Microscopiode trasmision
TR MAT ELISA
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MAT
• Prueba de referencia (gold standard)• Personal entrenado• Antígenos vivos• Mantenimiento del cepario• Interpretación• Chequeo del antígeno
SUEROS
CANINOS
BallumCanicola
IcterohaemorragiaePomona
Pyrogenes
CastellonisCanicola
CopenhageniPomona
Pyrogenes
Castellon 3Hond Utrecht IV
M20PomonaSalinem
SEROGRUPO SEROVAR CEPA
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SUEROS EQUINOSPORCINOSBOVINOSOVINOS
CAPRINOS
BallumCanicola
IcterohaemorragiaePomona
GrippotyphosaSejroe
Tarassovi
CastellonisCanicola
CopenhageniPomona
GrippotyphosaWolfii-Hardjo
Tarassovi
Castellon 3Hond Utrecht IV
M20Pomona
Moskva V3705
Perepelicin
SEROGRUPO SEROVAR CEPA
MAT ELISA IgM
TEST RAPIDOS
Sensibilidad 100% 90 – 98% > 97%
Especificidad 100% 90 – 97% > 93%
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Técnicas de biología molecular
• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)• Electroforesis en campo pulsado (PFGE)• Ribotipificación• Hibridación DNA-DNA• Análisis de multiples locus de VNTR
• OTROS METODOS DE TIPIFICACIONAnticuerpos monoclonalesAglutinación absorción cruzada
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Aislados en la República ArgentinaBovinos: Pomona-Canicola-Hardjo
Ovinos: Pomona -Castellonis
Porcinos: Pomona-Icterohaemorrhagiae-Tarassovi-Canicola
Caninos:Canicola-Icterohaemorrhagiae
Animales silvestres-Ratas: Canicola-Icterohaemorrhagiae-Pomona-Grippotyphosa-Bataviae
Humano:Canicola-Icterohaemorrhagiae-Pomona-Grippotyphosa-Canicola
FIEBRE ABORTOS
ANOREXIA MORTANDAD PERINATAL
DIARREA FETOS AUTOLITICOS
CONJUTIVITIS RETENCION PLACENTARIA
NEUMONIA ATIPICA INFERTILIDAD
ENCEFALITIS DERMATITIS NECROTICA
HEMORRAGIAS MUERTE EMBRIONARIA
ANEMIA POLIARTRITIS EN TERNEROS
ICTERICIA ULCERA DE 3º PARPADO
NEFRITIS MASTITIS
AGALACTIA
Síntomas clínicos en bovinos
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LEPTOSPIROSIS• LA LEPTOSPIROSIS ES UNA ENFERMEDAD QUE AFECTA
A LOS ANIMALES DOMESTICOS Y SILVESTRES, SIENDO DE DIFICIL ERRADICACION
• ESTA ENFERMEDAD ES DE DIAGNOSTICO COMPLEJO DEBIDO AL POLIMORFISMO DE SU PRESENTACION CLINICA
• LOS DAÑOS ECONOMICOS QUE PROVOCA SON DIFICILES DE CUANTIFICAR POR LA IMPRECISIÓN DE SUS INDICADORES
• LA VACUNACION ES EL MEDIO VALIDO DE CONTROL DE ESTA ZOONOSIS
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Muchas Gracias!!!
Instituto de Patobiología del CICVy A INTA Castelar
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MAT
SUERO SANGUINEOSUERO SANGUINEO OTRAS MUESTRAS
-HUMANO: 1/ 50 ORINA: 1/ 10-BOVINO: 1/ 200 LCR: 1/ 2-A. SILVESTRES: 1/ 50 LECHE: 1/ 2-OTRAS ESPECIES: 1/ 100 HUMOR ACUOSO: 1/ 2
DILUCIONES SIGUIENTES EN PROGRESION GEOMETRICA DE 2
SEROVARESREPRESENTATIVOS
TODOS LOSSEROGRUPOS
SUEROS
HUMANOS
SUEROSANIMALES
SILVESTRES Y DELABORATORIO
SUEROS
FELINOS
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SUEROS
CANINOS
BallumCanicola
IcterohaemorragiaePomona
Pyrogenes
CastellonisCanicola
CopenhageniPomona
Pyrogenes
Castellon 3Hond Utrecht IV
M20PomonaSalinem
SEROGRUPO SEROVAR CEPA
SUEROS EQUINOSPORCINOSBOVINOSOVINOS
CAPRINOS
BallumCanicola
IcterohaemorragiaePomona
GrippotyphosaSejroe
Tarassovi
CastellonisCanicola
CopenhageniPomona
GrippotyphosaWolfii-Hardjo
Tarassovi
Castellon 3Hond Utrecht IV
M20Pomona
Moskva V3705
Perepelicin
SEROGRUPO SEROVAR CEPA
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FARM ANIMALS NUMBER OF
SAMPLES
POSITIVES(%)
Bovine 2394 61,50%
Equine 223 59,64%
Porcine 125 57,00%
MAT
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MAT ELISA IgM
TEST RAPIDOS
Sensibilidad 100% 90 – 98% > 97%
Especificidad 100% 90 – 97% > 93%
Laboratorio Referencia OIE
• Servicios Diagnósticos: MAT. Acreditación ISO 17025
IF
Aislamiento
Tipificación
• Asesoramiento técnico
• Proveedor de cepas de referencia
• Capacitación
Actividades del Laboratorio de Leptospirosis
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1) USO DE INHIBIDORES
• 5-fluoruacilo: utilizado por los gérmenes contaminantes como materia prima para la síntesis de sus ácidos nucleicos.100-200 µg /ml
– Neomicina: bacteriostático o bactericida según su concentración. 300 µg/ml en medio EMJH y 5 µg/ml en medio de Fletcher o EMJH.
2) FILTRACIÓN
Filtro con membrana de celulosa con poro de 0,22 µm. Las leptospiras pasan a través de los poros mientras que los contaminantes quedan retenidos.
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• VACUNACION
• Anual, la 1º dosis a los 4 meses de edad
• TIPOS DE VACUNAS
• Multivalente• Serotipos endémicos para cada
región• Cepas locales
C o n t r o l
AÑO
1
2
3
4
5
A: TOTAL DE LA POBLACION B: NACIDOS AÑO 1C: NACIDOS AÑO 2 D: NACIDOS AÑO 3 E: NACIDOS AÑO 4 F: NACIDOS AÑO 5
Plan de vacunación en bovinos
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Laboratorio deLeptospirosisInvestigación
Servicios a terceros
Instituto de Patobiología del CICVy A
INTA Castelar
• La etapa de extracción del ADN es el punto critico
• Debe ser ajustada a los tejidos y fluidos, previniendo la presencia de substancias inhibidoras que podrán afectar el rendimiento de la PCR y alterar su resultado
Ex: pH extremos, congelación y descongelación , quelación de los iones Mg, hemoglobina, sales biliares, cloroformo y fenol
Extracción del ADN
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Variedad de primers ha sido descrita, basada en los genes, mayoría género específicos 16S o 23S rRNA y algunos serovares específicos
para los genes de los elementos repetidores -IS
Primers leptospiras patogenas, hapl
Primers leptospiras saprofitas, 16S rRNA
Elección del primer para el diagnostico de la leptospirosis
animal
Elección del primer para el diagnostico de la leptospirosis
Género específico
MÈRIEN et al.;1992 - Lep1 y Lep2 , la región blanco :16S rARN de Leptospira interrogans serovar Canicola-331pb- patogenicas y saprófitasLEP 1: 5’ GGC GGC GCG TCT TAA ACA TG 3’LEP 2: 3’ TTC CCC CCA TTG AGC AAG ATT 5’
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Gravekamp et al., 1993-G1 y G 2, ADN blanco del gene secY- Amplifican una secuencia de 285 pb, no amplifica los serovares L. kirschneri , necesita complementar con otro par de primerG1 5’-CTG AAT CGC TGT ATA AAA GTG2 5’-GGA AAA CAA ATG GTC GGA AG
B64I y B64II, Amplifican una secuencia de 563 pbB64I 5’-ACT AAC TGA GAA ACT TCT ACB64II 5’-TCC TTA AGT CGA ACC TAT GA
Elección del primer para el diagnostico de la leptospirosis