leishmaniosis visceral

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE FARMACIADepartamento de Parasitologa

LEISHMANIOSIS VISCERAL EN EL CRICETO

DORADO: VALORACION DE NUEVAS

FORMULACIONES DE ANFOTERICINA B

MEMORIA PRESENTADA PARA OPTAR AL GRADO DE

DOCTOR POR

Sara Rama iguez

Bajo la direccin del Doctor:

Francisco Bols Fernndez

Madrid, 2004

ISBN: 84-669-2518-X


FACULTAD DE FARMACIA

DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA

LEISHMANIOSIS VISCERAL EN EL CRICETO DORADO:

VALORACION DE NUEVAS FORMULACIONES DE

ANFOTERICINA B

TESIS DOCTORAL

SARA RAMA IIGUEZ Madrid, 2004


FACULTAD DE FARMACIA

DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA

LEISHMANIOSIS VISCERAL EN EL CRICETO DORADO:

VALORACION DE NUEVAS FORMULACIONES DE

ANFOTERICINA B

Memoria presentada por Sara Rama Iiguezpara optar al grado de Doctor

Director: D. Francisco Bols Fernndez

D. FRANCISCO BOLAS FERNANDEZ, PROFESOR TITULAR DE UNIVERSIDAD DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA DE LA FACULTAD DE FARMACIA DE LA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID,

CERTIFICA:

Que el presente trabajo de investigacin titulado: Leishmaniosis visceral en el criceto dorado: valoracin de nuevas formulaciones de anfotericina B,presentado por la Licenciada en Farmacia, Sara Rama Iiguez, ha sido realizado bajo su direccin, en el Departamento de Parasitologa de la Facultad de Farmacia de la Universidad Complutense de Madrid, cumpliendo los requisitos exigidos para su presentacin y defensa como Tesis Doctoral.

VB El Director del Departamento Madrid, de de 2004

Prof. Antonio R. Martnez Fernndez Prof. Francisco Bols Fernndez

A mis padres A Tito

AGRADECIMIENTOS:

En primer lugar quisiera expresar mi ms sincero agradecimiento al Prof. Francisco Bols Fernndez, director de esta Tesis Doctoral, por haberme permitido formar parte de su equipo de investigacin ofrecindome la posibilidad de desarrollar este trabajo, por sus consejos, su ayuda y su paciencia sobre todo en la ultima etapa de la parte experimental de la Tesis.

Tambin quiero darle las gracias al Prof. Antonio Ramn Martnez Fernndez, Catedrtico de Parasitologa y Director de este Departamento, por haberme facilitado sus instalaciones y equipos y por su continuo respaldo.

A la Dra. M Auxiliadora Dea Ayuela porque sin su ayuda esta Tesis no habra sido posible. La verdad es que podra llenar muchas hojas agradecindole a Maruxi todo lo que ha hecho por m, pero desafortunadamente tengo que ser breve. Quisiera destacar su tesn y su empeo en que las cosas salgan adelante y aunque me ha hecho trabajar a un ritmo muy fuerte durante estos aos, los frutos de tanto esfuerzo estn aqu en forma de Tesis. Ella me ha ayudado mucho a nivel profesional y personal y siempre ha estado ah en los momentos buenos y no tan buenos, sin importarle trabajar cualquier da del ao y a cualquier hora.

Al Prof. Juan Jos Torrado Durn y al Dr. Jos Antonio Snchez Brunete, colaboradores del Departamento de Farmacia Galnica y Tecnologa Farmacutica de esta Facultad, por su ayuda y consejos y porque sin sus formulaciones galnicas esta Tesis tampoco habra sido posible.

Al Prof. Jos Mara Alunda, Catedrtico del Departamento de Patologa Animal I de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid, por confiar en nosotros, por sus consejos cientficos y por conseguir la financiacin necesaria para la realizacin de los proyectos de investigacin.

A todos los Profesores del Departamento de Parasitologa: Carmen Cullar, Mercedes Martnez, Paco Ponce, Carmen Cuesta, Alicia Gmez, Catalina Castao, Angel Snchez, Jos Luis Zapatero, Jos Antonio Escario y Jos Luis Guilln por sus consejos y ayuda.

A mis compaer@s durante todos estos aos: Marta, Sonia, Gonzalo, Chus, Patricia, Ana, Susana, Juan Jos Nogal, Sara Bejarano, David, Carlos, Flery, Miriam, Celeste, Matthew, Sergio, Sara Palacios, Carlota, Juan Jos Garca, Kennedy y Carolina por haberme ofrecido su apoyo y ayuda siempre, y por las risas compartidas.

A Javier, Ins, Piedad, Antonio y Judith porque ellos contribuyen al da a da del departamento, en especial a Javier por estar siempre ah para escucharme.

A los compaer@s del Departamento de Patologa Animal I de la Facultad de Veterinaria: M Teresa, Susana, Fran, Salceda, Francisco, Nacho, Israel, Lara, Pablo y lvaro por su colaboracin.

A los Dres. Jos Mara Requena y Carlos Alonso de la Universidad Autnoma de Madrid por proporcionarnos la cepa de Leishmania infantum con la que se ha realizado esta tesis.

A la Profa. Joaquina Martn Snchez de la Faculta de Farmacia de la Universidad de Granada por compartir con nosotros sus conocimientos sobre PCR-ELISA y por su gran amabilidad.

A la Dra. Ana Canals, Directora del CISA, por permitirnos utilizar sus aparatos e instalaciones para los ensayos de linfoproliferacin in vitro.

A los compaer@s del Departamento de Microbiologa II de esta Facultad: Ada, Marta, Isabel, Vctor, Carmina, Jos, Maria Molina y Concha Gil, por su ayuda sobre todo en los estudios de Biologa Molecular.

A todas aquellas personas que han contribuido directa o indirectamente a la realizacin de este trabajo, en especial al personal de los Centros de Ayuda a la Investigacin, por sus consejos cientficos.

A mi familia y amig@s, sobre todo a mis padres por creer siempre en mi, apoyarme en mis decisiones y animarme a continuar mi formacin.

A Tito, por escucharme siempre que lo necesito, por darme nimos, por su paciencia y sobre todo por su cario.

Por ltimo, aunque no menos importante, a todos los animales que han perdido la vida en beneficio de este trabajo.

* Esta Tesis Doctoral la he realizado becada por el Ministerio de Educacin Cultura y Deporte (Beca de Formacin de Profesorado Universitario: FPU). * Este trabajo ha sido financiado por los siguientes proyectos de investigacin: AGF 98-0731, AGL 2001-1295-C03-01, AGL 2002-02175GAN (M.C.Y.T, Direccin General de Investigacin).

INDICE.

Abreviaturas

Introduccin

Revisin Bibliogrfica

1. Introduccin

1.1. Filogenia y clasificacin taxonmica

1.2. Morfologa

1.3. Ciclo biolgico

1.4. Diversidad clnica

2. Respuesta inmune

2.1. Generalidades

2.2. Modelos experimentales y respuesta inmune

2.2.1. Modelos in vitro

2.2.2. Modelos in vivo

2.2.2.1. Modelo murino

2.2.2.1.1. Modelo murino de leishmaniosis cutnea

2.2.2.1.2. Modelo murino de leishmaniosis visceral

2.2.2.2. Modelo en criceto

2.2.2.3. Modelo canino

3. Anfotericina B y sus formulaciones

3.1. Eficacia de la anfotericina B

3.1.1. Eficacia en humanos

3.1.2. Eficacia en perros

3.1.3. Eficacia en ratones

3.1.4. Eficacia en cricetos

3.2. Toxicidad

3.3. Farmacocintica

3.4. Efecto inmunomodulador

Objetivos

Material y Mtodos

1. Animales de experimentacin

2. Cepas de Leishmania

3. Cultivo y recuento de promastigotes para infeccin

4. Infecciones experimentales

5. Principio activo y polmeros empleados en las distintas formulaciones

galnicas ensayadas

6. Reactivos generales

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7. Reactivos para ELISA

8. Reactivos para Electroforesis de protenas

9. Reactivos para Western-blot

10. Reactivos para Citometra de flujo

11. Reactivos para la determinacin de inmunocomplejos en rin

12. Reactivos para PCR

13. Medios de cultivo

14. Pesos de los animales y de los rganos

15. Obtencin de amastigotes de tejidos y transformacin a promastigotes

16. Determinacin de la carga parasitaria en bazo e hgado

17. Obtencin del antgeno (extracto bruto salino)

18. Valoracin de protenas por el mtodo Bradford

19. Obtencin de sueros

20. Determinacin de los niveles de anticuerpos

21. Electroforesis de protenas en geles de poliacrilamida con Dodecil Sulfato

Sdico (SD-PAGE)

22. Deteccin de antgenos por Western-blot

23. Obtencin de linfocitos esplnicos

24. Determinacin de subpoblaciones linfocitarias mediante Citometra de flujo

25. Ensayos de Linfoproliferacin in vitro

26. Determinacin de inmuncomplejos en rin de criceto

27. Determinacin de la expresin de citoquinas en linfocitos esplnicos de

criceto mediante una RT-PCR cuantitativa a tiempo real

28. Determinacin de la carga parasitaria en bazo e hgado de criceto mediante

una PCR cuantitativa a tiempo real

29. Determinacin de los niveles de transaminasas en suero

30. Ensayos de toxicidad agua

31. Anlisis estadstico

Resultados

1. Eleccin del modelo experimental y de la dosis de infeccin

1.1. Modelo experimental en criceto dorado

1.2. Modelo experimental en ratones Balb/c

2. Tratamiento en la fase temprana (asintomtica) de la infeccin, con

anfotericina B libre y formulada en microesferas de HSA, a la dosis de 1

mg/Kg/da

2.1. Resultados a da 32 p.i.

2.2. Resultados a da 135 p.i.

2.3. Efecto de las microesferas de HSA vacias

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3. Tratamiento en el periodo sintomtico con anfotericina B formulada en HSA, a

la dosis de 2 mg/Kg/da. Estudio de los estados de agregacin

4. Estudios de toxicidad aguda

5. Tratamiento en el periodo sintomtico con anfotericina B poliagregada

formulada en HSA, a la dosis de 40 mg/Kg/da

6. Tratamiento en el periodo sintomtico con anfotericina B poliagregada libre y

formulada en HSA, a las dosis de 10 y 20 mg/Kg/da

7. Efecto de la anfotericina B poliagregada formulada en HSA, sobre la poblacin

CD4+ esplnica en cricetos sanos

8. Tratamiento en el periodo sintomtico con anfotericina B poliagregada,

formulada en Acido Polilctico-co-Gliclico. Comparacin con Fungizona

9. Puesta a punto de una tcnica de PCR cuantitativa a tiempo real para la

determinacin de citoquinas y carga parasitaria en criceto

9.1. Determinacin de citoquinas

9.1.1. Medida de la expresin de citoquinas en linfocitos esplnicos,

correspondiente a la puesta a punto del modelo experimental en

criceto

9.1.2. Medida de la expresin de citoquinas en linfocitos esplnicos de

cricetos infectados y tratados con la anfotericina B

9.1.3. Medida de la expresin de citoquinas en linfocitos esplnicos de

cricetos no infectados y tratados con anfotericina B

9.2. Determinacin de la carga parasitaria en bazo e hgado

Discusin

1. Modelo de leishmaniosis visceral en ratones Balb/c

2. Modelo de leishmaniosis visceral en cricetos

3. Efecto del tratamiento sobre la carga parasitaria: eficacia de las nuevas

formulaciones

4. Efecto del tratamiento sobre la respuesta inmune

4.1. Respuesta inmune humoral

4.2. Respuesta inmune celular

5. PCR cuantitativa a tiempo real

Conclusiones

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Abreviaturas

ABREVIATURAS.

BSA: Bovine Seric Albumin (Albmina Srica Bovina) CS: Control Sano Ct: Ciclo de amplificacin en PCR cuantitativa D.O.: Densidad ptica DNP: Dinitrofenilhidrazina EDTA: Acido Etilendiaminotetractico ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay GOT: Glutmico-Oxalactico-Transaminasa GPT: Glutmico-Pirvico-Transaminasa HPRT: Hipoxantina fosforribosiltransferasa HRPO: Horse Radish PeroxidaseHSA: Human Seric Albumin (Albmina Srica Humana) IE: ndice de Estimulacin OPD: O-fenileno-diamina PAGE: Polyacrylamide Gel Electrophoresis PBS: Phosphate Buffered Saline PCR: Polymerase Chain Reaction PE: Ficoeritrina PLGA: Polilactic-co-Glicolic Acid (Acido Polilctico-co-Gliclico) RT: Retro-Transcripcin SBF: Suero Bovino Fetal SDS: Sodium Dodecyl Sulphate TAE: Tampn Tris-Actico TCR: Receptor de clulas T TEMED: N,N,N,N-Tetrametil-Etilendiamina

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IInnttrroodduucccciinn

Introduccin

INTRODUCCION.

Para la especie humana, sus microorganismos patgenos y dems parsitos forman parte inseparable de su historia. Desde tiempo inmemorial, el curso de la humanidad se ha visto influido y hasta modificado por epidemias de enfermedadesinfecciosas. Algunas de estas enfermedades todava hoy representan una grave amenaza. Pobreza, desnutricin, malas o pobres condiciones higinicas, el aumento de la urbanizacin, las migraciones, los movimientos sociales, las guerras, los millonesde refugiados, etc, son causas o factores que explican, no solo el aumento de ciertas enfermedades infecciosas, sino tambin su resurgir. Protozoos parsitos de gran importancia mdica son los causantes de malaria, tripanosomiosis, leishmaniosis,amebiosis, toxoplasmosis y giardiosis.

Una de estas enfermedades, la leishmaniosis, origina importantes problemas de salud pblica y los esfuerzos que se estn haciendo para combatirla son aninsuficientes. Alrededor de 12 millones de personas sufren leishmaniosis en todo el mundo, amenazando a 350 millones de mujeres, hombres y nios en 88 pases del mundo, 72 de los cuales se encuentran en vas de desarrollo (http://www.who.int/tdr/diseases/leish/direction.htm). La amplia diversidad tanto de lasformas clnicas de dichas enfermedades, como de las situaciones epidemiolgicas, obliga a aplicar en cada foco principios y mtodos de lucha especficos. Adems, lalucha contra las leishmaniosis suele estar obstaculizada por la ignorancia de laverdadera prevalencia de estas enfermedades y por la subestimacin de lossufrimientos e incapacidades que causan. Existe una gran preocupacin ante lacreciente propagacin de las leishmaniosis en el mundo. El kala-azar, si no se trata, tiene una tasa de mortalidad elevada. Las formas mucocutneas del Nuevo Mundoson mutilantes y difciles de tratar, mientras que el desfiguramiento producido por las formas cutneas tiene un impacto psicolgico permanente. Conviene hacer especial hincapi en el riesgo que estas enfermedades presentan para la salud de los nios, yaque este grupo de edad es ms vulnerable y en l son ms probables los fallos en eldiagnstico.

Desde hace 10 aos las regiones endmicas se han extendido y ha habido un incremento marcado en el nmero de casos registrados. Esto est relacionado con eldesarrollo econmico y con cambios ambientales y de comportamiento que

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Introduccin

incrementan la exposicin a los vectores, como por ejemplo nuevos asentamientos, intrusin en bosques primarios, deforestacin, migracin masiva de zonas rurales azonas urbanas, urbanizacin rpida, nuevos esquemas de irrigacin, etc. Confrecuencia creciente se registran casos de turistas que visitan zonas endmicas y regresan a sus pases infectados. Entre la poblacin de la zona endmica, el riesgopermanente de epidemia alimenta un miedo constante. Ms recientemente, la superposicin de leishmaniosis visceral y SIDA ha desembocado en una nueva entidad re-emergente: la co-infeccin Leishmania/VIH. En Europa, donde entre el 25% y el 70% de los casos adultos de leishmaniosis visceral estn relacionados con el VIH, los drogadictos por va intravenosa han sido identificados como la mayor poblacin deriesgo. Factores de riesgo individual como la malnutricin y la inmunosupresin juegantambin un papel muy importante en el desarrollo de la enfermedad (http://www.who.int/tdr/diseases/leish/direction.htm).

En la infeccin parasitaria, al igual que en la viral o en la bacteriana, el organismo utiliza sus mecanismos de defensa para impedir tanto el establecimientocomo la multiplicacin de los parsitos, y trata de eliminarlos del cuerpo. A su vez, los parsitos evolucionan tambin, procurando escapar de estas defensas, sobrevivir y multiplicarse en el organismo que los hospeda. La investigacin en leishmaniosis, apesar de experimentar un incremento lento pero sostenido durante los aosposteriores a la Segunda Guerra Mundial, sufri de una ausencia de reconocimiento ypor lo tanto de financiacin. Pero afortunadamente, en los ltimos 30 aos el nmero de investigaciones y publicaciones en todos los aspectos de Leishmania y lasleishmaniosis han ido creciendo exponencialmente.

En la cuenca mediterrnea la enfermedad es producida por la especieLeishmania infantum. Si bien en el hombre, la infeccin tiene un carcter oportunista, emergiendo en aquellos casos de severa inmunodepresin, en el perro la enfermedadse manifiesta de forma mucho ms agresiva, planteando un serio problema de salud pblica

Se calcula que unos 250.000 perros podran esta infectados en Espaa, de ellos unos 15.000 se ubican en la Comunidad de Madrid, lo que supondra alrededordel 5,5% del censo canino. Esta cifra se incrementa hasta 9,1%-11,1% en las encuestas de seroprevalencia en perros vagabundos, llegando hasta el 30% en

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Introduccin

muestras de clnicas veterinarias, segn datos de la Comunidad de Madrid a travs delPrograma de Vigilancia y Control de la leishmaniosis.

Las terapias comnmente empleadas consiguen mejoras clnicas temporales y cambios en los parmetros inmunolgicos. Sin embargo, el tratamiento normalmenteno impide las recidivas, ni elimina al parsito totalmente. Debido a la inexistencia deuna terapia efectiva para la leishmaniosis canina, nuevos frmacos, sistemas de liberacin y estrategias de tratamiento son necesarias para conseguir una cura parasitolgica consistente en perros. Por ello, sin abandonar otras estrategias decontrol, tales como el diseo de vacunas y la lucha contra los vectores, es necesario continuar en la bsqueda de nuevos sistemas teraputicos que garanticen una curacin total y minimicen los efectos secundarios.

Los perros consituyen un excelente modelo para estudiar la leishmaniosis yaque actan como pacientes, dianas para el control y un buen modelo para la leishmaniosis humana porque los sntomas en el perro son similares a los desarrollados en humanos (Peters y Killick-Kendrick, 1987). Sin embargo, la dificultad para manejarlos hace a este modelo inapropiado para estudios en los que se requieragran nmero de animales, por ejemplo durante los test de proteccin.

Por todo ello, en el presente trabajo hemos empleado el criceto dorado comomodelo de leishmaniosis visceral para la bsqueda de nuevos sistemas teraputicos frente a esta enfermedad, ya que los parmetros clnicos e histopatolgicosobservados en dicho modelo son altamente coincidentes con los encontrados en el perro (Pearson y Queiroz-Sousa, 1996; Nieto y cols., 1999; Requena y cols., 2000).

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RReevviissiinn BBiibblliiooggrrffiiccaa

Revisin bibliogrfica

REVISION BIBLIOGRAFICA.

1. INTRODUCCION.

En 1903, William Boog Leishman y Charles Donovan, por separado,describieron al protozoo ahora denominado Leishmania donovani, en tejido esplnico de pacientes de la India con fiebre Dum-Dum o Kala-azar (Leishman, 1903; Donovan,1903), enfermedad ahora denominada leishmaniosis visceral. Al mismo tiempo, Ronald Ross describi con ms detalle, con el nombre de cuerpos de Leishman-Donovan, los amastigotes del protozoo Leishmania (Ross, 1903).

Con el paso del tiempo se fue comprobando que algunas enfermedades existentes en otras reas de diferentes continentes, se correspondan con la leishmaniosis. Por ejemplo, los autores de la poca no tardaron en diferenciar elagente infeccioso responsable del Kala-azar en la India, L. donovani, del agente causal del Kala-azar infantil en el Mediterrneo, L. infantum (Nicolle, 1908).

Un siglo despus, muchas caractersticas de las leishmaniosis y sus principalessndromes (visceral, cutnea y mucosa) han permanecido igual, pero otras han cambiado. Como antes, la epidemiologa de esta enfermedad ocurre peridicamenteen India y otras zonas del mundo, pero las leishmaniosis han emergido en nuevas regiones, por ejemplo como infecciones oportunistas asociadas al SIDA. El diagnsticotodava se basa en mtodos clsicos microbiolgicos, aunque se estn introduciendo ya tcnicas moleculares. Los antimoniales pentavalentes han sido la principal terapia antileishmanisica durante medio siglo, pero las formulaciones lipdicas de anfotericinaB (aunque muy caras y de administracin parenteral) representan el mayor avancepara tratar la leishmaniosis visceral. Son necesarios avances tecnolgicos en lacomprensin de la respuesta inmune frente a Leishmania y la patognesis de la leishmaniosis para poder encontrar buenos mtodos de diagnstico, tratamiento y prevencin de esta enfermedad (Herwaldt, 1999).

La leishmaniosis es una enfermedad causada por un protozoo intracelularobligado que se transmite mediante un vector y se caracteriza por una gran diversidady complejidad. La leishmaniosis es endmica de reas tropicales, subtropicales y del

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sur de Europa, en zonas que van desde los bosques americanos hasta desiertos en el oeste asitico y, desde zonas rurales a zonas periurbanas (Desjeux, 1996).

Distribucin de la leishmaniosis en el mundo (Handman, 2001).

Varios sndromes clnicos se engloban bajo el termino leishmaniosis: leishmaniosis visceral, cutnea y mucocutnea, que resultan de la replicacin del parsito en el sistema fagoctico mononuclear a nivel visceral, de la mucosa drmica yde la mucosa nasoorofarngea, respectivamente. Estos sndromes son causados porun total de 21 especies de Leishmania que son transmitidas por unas 30 especies de vectores de mosquitos flebtomos (Shaw, 1994; Desjeux, 1996; Ashford, 1997).

Con algunas excepciones (la leishmaniosis visceral en la India y la leishmaniosis cutnea causada por L. tropica), la especie humana es un hospedador accidental de la infeccin y, otros mamferos, como roedores o cnidos, son hospedadores reservorios. Sin embargo, la especificidad se encuentra a travs de ladiversidad ya que especies particulares de parsito, vector y hospedador mantienen elciclo de transmisin en una determinada zona ecolgica (Ashford, 1996).

1.1. Filogenia y Taxonoma.

Leishmania es un protozoo flagelado que posee una nica mitocondriaasociada al kinetoplasto, tpico del Orden Kinetoplastida. Este Orden tambin incluye a

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los tripanosomas que dan nombre a la Familia Trypanosomatidae a la que pertenecenlos protozoos del Gnero Leishmania. El Gnero Leishmania, a su vez, se divide en dos Subgneros en funcin de en qu lugar del tracto digestivo del vector semultiplique (OMS, 1990). De este modo, las especies de Leishmania, se pueden clasificar en Hipo-, Peri- y Suprapilaria.

Las Hipopilaria son las ms antiguas desde el punto de vista evolutivo,constituyen Sauroleishmania spp. y no son patgenas (Lainson y Shaw, 1987). LasPeripilaria aparecen despus en la escala filogentica, estn agrupadas en el Subgnero Viannia y se encuentran todas en el Nuevo Mundo, parasitando a mamferos como los perezosos y los osos hormigueros. Las Suprapilaria, como sunombre indica, se multiplican en las porciones suprapilricas (cerca de la probscide del vector) y parasitan a mamferos, entre ellos el hombre, siendo las ms cercanas enla escala evolutiva y constituyendo el Subgnero Leishmania.

Dentro del Subgnero Viannia se incluyen las siguientes especies: L.braziliensis, L. peruviana, L. guyanensis, L. panamensis, L. shawi, L. lainsoni, L. naiffi, L. colombiensis y L. equatorensis. Dentro del Subgnero Leishmania se incluyen las siguientes especies: L. donovani, L. archibaldi, L. infantum (syn. L. chagasi), L. tropica, L. killicki, L. major, L. gerbilli, L. arabica, L. mexicana (syn. L. pifanoi), L. amazonensis(syn L. garnhami), L. aristidesi, L. enrietti, L. hertigi, L. deanei, L. turanica y L. venezuelensis (Alvar, 2001).

Debido a las pocas diferencias morfolgicas entre los diversos miembros delgnero Leishmania, la clasificacin taxonmica est basada en la enfermedad clnica producida, las caractersticas biolgicas, geogrficas y epidemiolgicas. Donde existenmayores discrepancias es en la caracterizacin como especie o subespecie, es decir,en el empleo de trminos binmicos o trinmicos. Desde hace muchos aos se han intentado hallar los caracteres taxonmicos ms idneos y los estudios del parsitohan facilitado una comprensin ms bsica. Ejemplos de este enfoque son losprimeros estudios serolgicos, la determinacin de serotipos por el factor de excrecin y la caracterizacin biolgica en cultivos, flebtomos y cricetos. Ms tiles han sido losmtodos de biologa molecular con el fin de descubrir las caractersticas intrnsecasdel parsito que no se modifican por factores ambientales o propios del hospedador.

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Algunos de estos mtodos han puesto de relieve dichas caractersticas, que se utilizan ahora para distinguir las especies o subespecies reconocidas (OMS, 1984).

Entre los mtodos bioqumicos fenotpicos ms utilizados encontramos la caracterizacin mediante isoenzimas y los anticuerpos monoclonales. Entre los genotpicos est el polimorfismo en el tamao de los fragmentos de restriccin (RFLP),la hibridacin con sondas del ADNk del kinetoplasto, la hibridacin con sondas de ADNgenmico (in situ, en manchas, por contacto o por aplastamiento) y la reaccin encadena de la polimerasa (PCR) y sus variantes: RAPD y PCR-RFLP (Alvar, 2001).

La posicin taxonmica de L. infantum segn Cavalier Smith (1998) es la siguiente:

IMPERIO O SUPER-REINO EUKARIOTA Dougherty, 1957REINO PROTOZOA Goldfuss, 1818

SUBREINO NEOZOA Cavalier Smith, 1997 INFRA-REINO DISCICRISTATA Cavalier Smith, 1998

PHYLUM EUGLENOZOA Cavalier Smith, 1981 SUBPHYLUM SACOSTOMA Cavalier Smith, 1998

CLASE KINETOPLASTA Cavalier Smith, 1998 SUBORDEN TRYPANOSOMATINA Kent, 1880

FAMILIA TRYPANOSOMATIDAE Doflein, 1901 GENERO Leishmania Ross, 1903

SUBGENERO Leishmania Safjanova, 1982 ESPECIE Leishmania infantum Nicolle, 1908

1.2. Morfologa.

Los amastigotes (del griego mastigos: ltigo) de Leishmania de varias especies encontradas en mamferos son aparentemente idnticos, pero se ha demostrado que el tamao de esta forma vara entre distintas especies (Gardener, 1975; Scorza y cols., 1979).

En improntas teidas con Giemsa, los amastigotes aparecen como cuerposredondos u ovales dentro de una clula hospedadora o, ms frecuentemente, libresdebido a la rotura celular producida al realizar la impronta. El ncleo del parsito ocupa

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una posicin central en la clula y el kinetoplasto aparece adyacente a l. El ncleo es redondo u oval. El kinetoplasto, que se tie ms densamente que el ncleo, tambin vara en su forma, siendo redondo, oval, con forma de vara o curvado en perfil.Aunque la microscopia electrnica revela la presencia de un flagelo saliendo delreservorio de los amastigotes, la microscopia ptica raramente muestra este organelo(Peters y Killick-Kendrick, 1987).

Amastigotes en impronta de mdula sea (Rondanelli y Scaglia, 1993).

El promastigote es la forma tpica de Leishmania encontrada en el intestino medio del vector. Killick-Kendrick y cols. (1974) observaron que en algunas especiesde Leishmania existen dos formas de promastigotes en el intestino. Por un ladoexistan largos promastigotes nectomona, la mayora de los cuales estabanenganchados a la pared del intestino por un flagelo tpicamente largo y sin modificar,emergiendo anteriormente. Estas formas tienen un kinetoplasto tpico y el ncleo est en el centro del cuerpo del parsito. El otro tipo de promastigotes descritos en el vectoreran los haptomona, que son promastigotes cortos, gordos y ms brillantes que seadhieren a la cutcula de la vlvula estomacal por un flagelo modificado.

Promastigotes formando una roseta (Rondanelli y Scaglia, 1993).

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Aproximadamente 10 das despus de entrar en el insecto, el promastigotepierde la adherencia, el flagelo entonces se vuelve muy largo y el cuerpo fino y corto.Este tipo de promastigote recupera la infectividad, aunque deja de multiplicarse y se encuentra libremente en la hipofaringe, es lo que se denomina el promastigotemetacclico que ser posteriormente inoculado por el insecto en el hospedador (Sacks y Perkins, 1984).

Dentro del hospedador el promastigote contiene el kinetoplasto paralelo alncleo, el cuerpo se vuelve oval, la bolsa flagelar se hace muy profunda y el flagelo se empieza a acortar, esta forma se denomina paramastigote (Killick-Kendrick, 1979).

1.3. Ciclo Biolgico.

Leishmania se caracteriza por poseer un ciclo biolgico indirecto en el queintervienen un hospedador invertebrado o mosquito flebtomo y un hospedador vertebrado de sangre caliente. Numerosas especies de mosquitos del gnero Lutzomyia en Amrica y del gnero Phlebotomus (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) en el Viejo Mundo son los vectores de Leishmania. En el caso de L.infantum, los vectores son varias especies de dpteros del gnero Phlebotomus y loshospedadores vertebrados son fundamentalmente el perro y el hombre, adems deotras especies como el zorro, la rata y otros posibles reservorios silvestresespordicos (Botet y Ports, 1993).

Mosquito flebtomo (Rondanelli y Scaglia, 1993).

Todas las especies de Leishmania habitan en las clulas del retculo endotelial del hospedador vertebrado y en el intestino del mosquito flebtomo. Los amastigotesson ingeridos con la sangre cuando el mosquito pica al hospedador vertebrado, instaurndose en el intestino del mosquito. Muy pronto se transforman en

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promastigotes, que continan multiplicndose muy rpidamente. Tres das despus dela picadura, el mosquito defeca los remanentes de la sangre y en este punto todos los parsitos que no se han adherido son eliminados. Los parsitos que han sobrevividose adhieren por el flagelo a las microvellosidaes del intestino o a la vlvula pilrica. Encualquier caso, despus de la defecacin, los parsitos adheridos son liberados y sedividen rpidamente de nuevo, adhirindose eventualmente a la vlvula cardias.Algunos parsitos se empiezan a diferenciar en formas metacclicas, que no son adherentes y se mueven muy rpidamente. La transmisin depende de la inyeccin deestas formas metacclicas en una nueva picadura (Ashford, 2000).

Cuando el promastigote alcanza los capilares cutneos del nuevo hospedadorvertebrado, se produce su fagocitosis por el macrfago en una vacuola parasitforapara tratar de eliminarlo, mientras que las leishmanias se transforman en amastigotes que se multiplican por fisin binaria en el interior de dicha vacuola. Los amastigotesson capaces de destruir al macrfago quedando libres y entonces pueden ser fagocitados por otros macrfagos y mantener as la infeccin (Russell y Talamas-Rohana, 1989).

La conveniencia o conformidad del hospedador para el mantenimiento de laspoblaciones de Leishmania depende de muchos factores, los ms importantes son: la densidad de poblacin del hospedador, la duracin de la infeccin (y longevidad delhospedador), la localizacin del parsito en el hospedador y el estado inmunolgicodel mismo despus de la cura (Ashford, 2000).

La transmisin puede verse afectada tambin por la naturaleza de laspicaduras efectuadas por el mosquito (Schlein y Jacobson, 1994) y por la respuesta del hospedador a los antgenos de la saliva del mosquito. La transmisin, ademspuede ser realizada por la inoculacin de material infectado de una persona a otra. Porejemplo, hay evidencias de que muchas de la leishmaniosis viscerales asociadas a lainfeccin por VIH en el sur de Europa son transmitidas por el uso de jeringuillas compartidas entre drogadictos (Alvar y cols., 1997; OMS, 2000; Cruz y cols., 2002). La transmisin por contacto sexual y por transfusin sangunea es pequea o pocosignificativa.

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Amastigote intracelular

Amastigotes

Promastigotesprocclicos

Promastigotesmetacclicos

Macrfago

Fagolisosoma

Amastigote intracelular

Amastigotes

Promastigotesprocclicos

Promastigotesmetacclicos

Macrfago

Fagolisosoma

Proliferacin

Lisis

Re-invasin

PicaduraPicadura

Proliferacin en el intestino

Adhesin

Internalizacin

Proliferacin

Lisis

Re-invasinRe-invasin

PicaduraPicadura

Proliferacin en el intestino

Adhesin

Internalizacin

Esquema del ciclo biolgico de Leishmania.

1.4. Diversidad Clnica (Ashford, 2000; Alvar, 2001).

Una de las caracateristicas ms notables de las leishmaniosis es la diversidadde enfermedades causada por agentes morfolgicamente similares. La diversidad no est totalmente explicada por la diversidad gentica de los parsitos. Adems, estgenerada en parte por la variedad en la respuesta del hospedador a la infeccin y en parte por la restriccin de los parsitos a partes u rganos especficos del cuerpo. Enexperimentacin animal se ha visto que la gentica tiene un gran efecto en larespuesta del hospedador a la infeccin. Hay evidencias considerables de que el parsito ms virulento de Leishmania puede causar enfermedades no detectables en ciertos individuos.

Las principales variedades clnicas de las leishmaniosis en humanos son las siguientes:

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x Leishmaniosis cutnea, causada por L. tropica, L. major, L. aethiopica, L. mexicana, L. amazonensis, L. panamensis, L. guyanensis, L. peruviana o L.braziliensis, pero puede ser causada por cualquiera de las especies de Leishmaniaque infectan al hombre. Se caracteriza por una lesin cutnea simple, o leishmanioma,en el sitio de la picadura del mosquito. Normalmente se cura sola, acontece como un problema trivial y no hay manifestaciones sistmicas.

x Leishmaniosis cutnea difusa, causada por L. aethiopica o L.amazonensis. Los parsitos estn restringidos a la piel pero se distribuyen por toda la superficie formando placas o ndulos. No hay respuesta humoral ni celular, es difcilde tratar y puede durar el resto de la vida del paciente.

Leishmaniosis cutnea (Rondanelli y Scaglia, 1993).

x

x

Leishmaniosis mucocutnea, causada normalmente por L. braziliensis,despus de la cura de una leishmaniosis cutnea inicial. Despus de meses o aos deuna lesin cutnea, los parsitos se metastatizan por va linftica hacia laoronasofaringe. Se forman lesiones nodulares que evolucionan a lceras. Al final se perfora el tabique y se produce una deformacin de la nariz llamada nariz de tapir. Otra veces la lesin mucosa empieza en el paladar blando con posterior destruccinde la vula. Otras lesiones pueden aparecer en la epiglotis y producen disfonas.

Leishmaniosis visceral o Kala-azar (OMS, 1984; Alvar, 2001). Puede ser ampliamente restringida a nios, causada por L. infantum, o tener una pequea especificidad-edad, causada por L. donovani o L. infantum. Tambin afecta a gente de todas las edades que sufren enfermedades inmunosupresoras. En ambos casos, elcurso de la enfermedad se sabe que est muy relacionado con el estado de salud delpaciente en el momento de la infeccin y diversos estudios han mostrado que lamalnutricin exacerba la infeccin por L. infantum.

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La infeccin comienza en el sitio de la picadura apareciendo a veces una lesin primaria o leishmanioma. Si se presenta, puede ser simplemente una lesinautolimitante sin que se produzca enfermedad visceral. La enfermedad visceral sedesarrolla tpicamente despus de un periodo de incubacin variable y se acompaapor fiebre en grado irregular y persistente. Una vez establecida la enfermedad, su desarrollo puede ser bastante variable: los sntomas severos pueden ser muy agudos con progresin rpida de enfermedad en dos semanas o la progresin puede serinsidiosa, casi sin notarse, pasando probablemente como un simple ataque de malaria hasta que los sntomas abdominales se convierten en ms importantes. La esplenomegalia es el signo ms notable; el bazo aparece muy agrandado y su tamao se enfatiza al ir acompaado de caquexia. La hepatomegalia es menos consistente y menos extrema, pero se presenta normalmente en caso terminales. El cuadrohematolgico se altera considerablemente con anemia y leucopenia, que son loscambios ms significativos.

Nio afectado de leishmaniosis visceral (Alvar, 1997).

La leishmaniosis visceral se puede clasificar como endmica, espordica oepidmica y las manifestaciones clnicas suelen diferir segn se trate de una u otra delas tres situaciones. La endmica afecta sobre a todo a nios y se desarrolla en la zona del Mediterrneo, Asia sudoriental, China y Amrica Latina. La incidencia es dosveces mayor en los hombres que en las mujeres. El periodo de incubacin oscila entre10 das y ms de un ao. Los sntomas ms frecuentes son fiebre, malestar, prdidade peso y anorexia; a veces aparecen tos y diarrea. Los signos clnicos ms corrientes son esplenomegalia indolora a la presin (el bazo es blando a diferencia de otras esplenomegalias (bazo de leche)), hepatomegalia moderada (el hgado tambin es blando y con el reborde marcado) y linfadenopata, consuncin y palidez de las membranas mucosas. En la India es frecuente el oscurecimiento de la piel de la cara, manos, pies y abdomen (kala-azar: enfermedad negra). Existen signos de malnutricin

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(edema y alteraciones de la piel y el cabello). A veces se producen neumona,disentera o tuberculosis pulmonar intercurrentes.

La leishmaniosis visceral espordica se da cuando las personas no nativas de cualquier edad entran en una zona endmica y contraen la enfermedad. La fiebre aparece entre tres semanas y dos aos despus de la exposicin. La enfermedadpuede avanzar de forma aguda con escalofros, fiebre alta ondulante, sudorabundante, perdida de peso rpida y malestar profundo. A veces aparece anemiahemoltica aguda grave, lesin renal aguda y hemorragia intensa de las mucosas. La leishmaniosis visceral epidmica se puede presentar en todas las edades, excepto losque hayan sido infectados en una epidemia anterior. Se produce ms frecuentemente en los hombres que en las mujeres en una proporcin de 4:3. Las formas agudas sonraras.

Tambin existe enfermedad subclnica ya que se cree que en algunos pases(Italia, Kenya) los casos subclnicos superan a los casos clnicos en una proporcin de5:1.

x Leishmaniosis drmica post-kala-azar (LDPK), est causada por L.donovani, despus de la cura de una leishmaniosis visceral inicial y es caractersticadel subcontinente indio, aunque se observa ocasionalmente en frica oriental. No est asociada a la infeccin por L. infantum. Se presenta ocasionalmente en pacientes sin historia de enfermedad visceral, pero solo en lugares en los que L. donovani es transmitida. A veces se desarrolla antes de que la infeccin visceral se haya curado, pero su aparicin se puede retrasar hasta dos aos. Es una enfermedad variable quepuede empezar como una puncin, despigmentacin progresiva dando a la piel un aspecto de moteado o puede ser notada al principio como unas discretas ppulas, principalmente en superficies expuestas a la luz. Puede progresar produciendo una superficie extensa de ppulas o discretos ndulos.

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2. RESPUESTA INMUNE.

2.1. Generalidades.

Despus de la picadura, los amastigotes procedentes de macrfagos del hospedador son liberados en el intestino del mosquito donde se transforman en promastigotes procclicos que no son infectantes (Sacks y Perkins, 1985). Estospromastigotes procclicos expresan en su superficie grandes cantidades delipofosfoglicano (LPG) y de la metaloproteasa gp63 (Davies y cols., 1990; Pimenta ycols., 1991).

La activacin del complemento por el LPG es por la va clsica dando lugar a la lisis de los promastigotes procclicos, pero no metacclicos. Como resultado, compuestos del complejo de ataque a la membrana C5-C9 son liberados de lasuperficie del promastigote metacclico (Puentas y cols., 1991). La gp63 tambin inhibe la lisis mediada por complemento y promueve la captacin del parsito,mediante la transformacin de C3b en C3bi (Brittingham y Mosser, 1996). La opsonizacin de los parsitos con C3bi proporciona el medio adecuado por el que lospromastigotes metacclicos se unan y penetren en los macrfagos.

La muerte de Leishmania por parte de macrfagos est mediada por NO tantoin vitro (Green y cols., 1990) como in vivo (Stenger y cols., 1996). La fagocitosis de Leishmania induce fuertemente la sntesis de NO (Corradin y cols., 1999), incluso si Leishmania posee molculas de superficie que inhiban la produccin de NO,posiblemente a travs de distintos receptores celulares. Adems, la infeccin conLeishmania induce la liberacin de citoquinas que inhiben la muerte mediada por NO como el TGF-E o la IL-10 (Bogdan y Rollinghoff, 1999).

La saliva del mosquito, a travs del pptido maxadilan, suprime la actividadleishmanicida del macrfago inhibiendo la produccin de oxido ntrico y acelerando eldesarrollo de la lesin (Lima y Titus, 1996).

Cuando el promastigote metacclico se transforma en amastigote, ocurre la fusin fagosoma-lisosoma y los parsitos son capaces de sobrevivir y multiplicarse en la vacuola parasitfora rica en cidos e hidrolasas (Russell y cols., 1992).

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La presentacin de los antgenos por parte de molculas del Complejo Mayorde Histocompatibilidad (CMH) de tipo II existentes en las clulas presentadoras de antgeno a las clulas T, causa la expansin del protector IFN-J, produciendo una respuesta CD4+ Th1, y se ha pensado durante largo tiempo que esto es esencial parael control de la infeccin por Leishmania (Liew y ODonell, 1993).

Sin embargo, la presentacin por parte de las molculas del CMH de tipo II sola, no es suficiente para estimular la respuesta de las clulas T. Tambin se necesitan molculas coestimulatorias como la unin de B7-1/B7-2 y CD40 (en el macrfago) con CD28 y CD40L (en la clula T) respectivamente (Bogdan y cols., 1996).

Despus de la presentacin antignica por parte de las molculas de Clase IIdel Complejo Mayor de Histocompatibilidad, las clulas Th proliferan a travs del precursor Th0 hacia clulas Th1 Th2 que difieren en el perfil de produccin de citoquinas. De hecho, las clulas Th1 secretan IL-2, IFN-J, TNF-D y protenas inflamatorias de migracin como las protenas MIP y MIP-1; mientras que las clulas Th2 secretan IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 y el factor inhibidor de migracin (MIF)(Lohoff y cols., 1998).

Generalmente se acepta que la induccin de una inmunidad protectora frente ala leishmaniosis depende de la produccin de IL-12. Esta citoquina dirige la respuesta CD4+ Th1 e induce la produccin de IFN-J tanto por los linfocitos T citotxicos (CD8) como por clulas Natural Killer (NK) y clulas T. El IFN-J media en la proteccininduciendo la expresin de NOS2 y la produccin de NO en los macrfagos infectados (Liew y ODonell, 1993).

Los macrfagos secretan otras citoquinas adems de IL-12, que no solo regulan la funcin de los macrfagos de una manera autocrina sino que tambinjuegan un papel importante en la modulacin de la adquisicin de la respuesta inmune.Por ejemplo, el TNF-D y el factor quimiotctico activador de monocitos (MCAF) puedenfomentar la actividad leishmanicida de los macrfagos (Mannheimer y cols., 1996).

El TGF-E es un potente inhibidor de la induccin de NOS2 (Stenger y cols., 1994). En los tejidos donde se encuentra menos NOS, aparecen ms parsitos, y hay

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mas TGF-E en las lesiones de ratones susceptibles que en los resistentes, a pesar deque hay cantidades parecidas de IL-4 e IFN-J. Por lo tanto, el TGF-E parece ser unacitoquina importante capaz de disminuir la respuesta del NOS2 a las seales del IFN-J.

En general, la sntesis temprana de IL-4 es necesaria para el desarrollo de la respuesta Th2. En esta respuesta Th2 estimula la inmunidad humoral e inhibe la proliferacin de la respuesta Th1 y hace al macrfago poco susceptible para laactivacin por IFN-J. La regulacin de la respuesta humoral significa la activacin de los linfocitos B con la formacin consiguiente de anticuerpos, principalmente de IgG, pero que son incapaces de contrarrestar el parsito al tener una localizacinintracelular, por lo que la enfermedad se disemina y el ratn termina muriendo (Alvar, 2001).

La IL-4 no solo disminuye la produccin de IL-12 y IFN-J y la expresin de IL-12, sino que tambin inhibe la produccin de NO por los macrfagos, lo que es crtico para la actividad leishmanicida (Vouldoukis y cols., 1997; Jones y cols., 1998).

Aunque con L. major en ratn la dicotoma Th1/Th2 esta muy clara, en el humano y en el perro existe una respuesta combinada mucho ms difcil de interpretar y de predecir. Existe una regulacin cruzada de las distintas citoquinas y el balanceentre ellas va a ser importante en la evolucin posterior de la enfermedad (Alvar, 2001).

La leishmaniosis visceral humana causada por L. donovani o L. infantum es una enfermedad severa con diseminacin generalizada del parsito al sistema retculo endotelial, como bazo, higazo y medula sea. Los casos subclnicos o asintomticos estn identificados con bajos ttulos de anticuerpos antileishmania y pueden bienmostrar una anergia a los antgenos intradrmicos y desarrollar por lo tanto enfermedad, o bien convertirse en seronegativos y en LST positivos, sugiriendo una cura espontnea (Badar y cols., 1986; Davies y Mazloumi, 1999).

Los ttulos de anticuerpos por lo general son bajos en el suero de pacientes conleishmaniosis cutnea y mucocutnea (Labrada y cols., 1989) y moderados o altos enpacientes con leishmaniosis visceral (Pearson y cols., 1986), aunque esta dicotoma no est siempre tan clara.

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La respuesta humoral tiene un efecto negativo en la leishmaniosis y la proliferacin de linfocitos B, causantes del exceso de produccin de anticuerpos, dalugar a la formacin de inmunocomplejos circulantes (Lpez y cols., 1996) que originanpatologas como la vasculitis, poliartritis y glomerulonefritis (Endo y cols., 1985). El exceso de autoanticuerpos circulantes da lugar a anemia y trombocitopenia (Valladares y cols., 1998) y los anticuerpos circulantes facilitan la fagocitosis de losamastigotes por los macrfagos, lo que es esencial para su multiplicacin.

2.2. Modelos experimentales y respuesta inmune.

2.2.1. Modelos in vitro.

Los modelos in vitro para estudiar el metabolismo, la expresin gnica onuevos compuestos frente a Leishmania son heterogneos dependiendo de la especie de Leishmania ensayada, el estadio del parsito, las condiciones del cultivo, as como la preparacin usada en el ensayo. Es por ello, que los resultados obtenidos sondiferentes y difciles de comparar y no se pueden correlacionar bien con la respuesta in vivo.

El estadio de ms fcil manejo in vitro es el promastigote por lo que es el ms empleado en los estudios de susceptibilidad a frmacos. Sin embargo, muchos estudios realizados con antimoniales pentavalentes muestran menor actividad que cuando se emplean amastigotes (Callahan y cols., 1997; Ephros y cols., 1997). Estopuede ser debido a la concentracin activa del frmaco dentro del fagolisosoma delmacrfago que contiene al amastigote, a la metabolizacin del frmaco a una forma con mayor actividad o a una distinta susceptibilidad del estadio del parsito (Berman y Wyler, 1980; Roberts y cols., 1995; Callahan y cols., 1997, Ephros y cols., 1997). Porotro lado se ha visto que la composicin del medio puede afectar a la susceptibilidad de los promastigotes (Petrillo-Peixoto y Beverly, 1987) y otros factores como ladensidad celular y grado de crecimiento, junto con las posibles alteraciones inducidaspor el frmaco en el medio de cultivo, pueden influir en los resultados obtenidos empleando promastigotes (Moreira y cols., 1995; Carri y cols., 2000).

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Debido a ello se utilizan tambin otros modelos in vitro como los cultivosaxnicos de amastigotes-like o los macrfagos infectados con amastigotes (modelointracelular).

Se han mostrado varias condiciones para muchas especies de Leishmania quepermiten el crecimiento de una forma del parsito in vitro que se asemeja a losamastigotes derivados de lesiones o tejidos. Estos amastigotes in vitro se han denominado amastigotes axnicos o formas amastigotes-like (Bates, 1993; Pan y cols., 1993; Gupta y cols., 2001). Aunque estas formas no son replicas autnticas delos amastigotes derivados de lesiones, son suficientemente cercanas por lo queconstituyen un magnifico modelo y se han usado ampliamente en estudios demetabolismo y expresin gnica (Beverly, 2003). Los experimentos iniciales paraobtener amastigotes axnicos se basaron en la observacin de que el crecimiento delos promastigotes a pH cido o alta temperatura induca cambios en la forma y expresin gnica de los promastigotes (Duncan y cols., 2001). Posteriormente,mediante la combinacin de pH cido y altas temperaturas se consigui por primera vez la diferenciacin de promastigotes de L. mexicana a amastigotes (Bates y cols., 1992). Estas formas permiten el desarrollo de cribados farmacolgicos ms representativos de la situacin in vivo, ya que el amastigote es el estadio msrelevante del parsito.

Por otro lado, el desarrollo de un modelo de infeccin in vitro, es decir, infectando macrfagos con promastigotes, ofrece mltiples aplicaciones como por ejemplo, el estudio de las interacciones receptor-ligando. Dichos estudios han permitido conocer que la fagocitosis implica dos eventos de unin: un primer paso de anclaje a travs de interacciones de baja afinidad y de cintica rpida y un segundo paso de internalizacin posterior a una interaccin de alta afinidad. En este sentido, seha podido saber que los receptores del complemento CR1 y CR3 juegan un papel importante en el proceso de fagocitosis, ocurriendo la interaccin del parsito con los CRs de tres formas: (i) en presencia de suero, activando al componente C3 del complemento y unindose a travs del fragmento C3bi del complemento a CR3; (ii) atravs de una unin independiente de suero de la proteasa de superficie gp63 a CR3;y (iii) a travs de la unin del lipofosfoglicano del parsito a un sitio lectina-like en CR3y CR1. Los receptores CR4, de fibronectina, de manosa y el receptor de glicosilacin de productos finales tambin estn implicados en la invasin. Es posible que

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interacciones receptor-ligando mltiples ocurran simultneamente, dependiendo delestado de activacin del macrfago. En el caso del promastigote, se ha visto que las dos principales familias de molculas de superficie, la gp63 y los fosfoglicanos como el lipofosfoglicano (LPG), son los principales ligandos para el anclaje a los macrfagos(Revisado en Bullen, 2002).

Este modelo de infeccin in vitro tambin ha resultado til en el estudio de las bases bioqumicas de la interaccin macrfago-Leishmania, ya que ha permitido caracterizar mecanismos de evasin de la respuesta por parte del parsito, como porejemplo, la inhibicin de la proteinkinasa C, lo que produce una entrada de Ca2+ en el macrfago y reduce los niveles de protenas relacionadas con la miristoilato-alanina C kinasa, que son sustratos de la PKC. Adems, se ha podido saber que Leishmaniabloquea la fosforilacin de la tirosinkinasa inducida por IFN-J, con un consecuente deterioro en la produccin de IL-12 y NO, y tambin activa a fosfotirosinfosfatasas quedesrregulan la sealizacin de la proteinkinasa activada por mitgenos y la expresinde c-fos y de oxido ntrico sintetasa por parte de los macrfagos. Tambin se ha observado que la cisteinproteinasa participa en la nutricin del parsito a expensas dela clula hospedadora y juega un papel importante en la penetracin en el macrfago(Brandonisio y cols., 2000).

Otros estudios realizados con el modelo promastigote-macrfago, han sido losdestinados a elucidar qu citoquinas estn implicadas en favorecer los mecanismos celulares microbicidas, observndose que algunas de ellas juegan un papel importanteen la regulacin de la produccin de NO por parte de los macrfagos infectados con Leishmania. As por ejemplo, el IFN-J y TNF-D desarrollan un papel integral en laresistencia del macrfago frente a Leishmania y son esenciales para la produccin de niveles citotxicos de NO. Pero la infeccin por Leishmania tambin induce la liberacin de citoquinas que inhiben la muerte mediada por NO, como el TGF-E o la IL-10 (Brandonisio y cols., 2000).

Los estudios celulares de linfoproliferacin han permitido observar que el factor de crecimiento hematopoytico, GM-CSF, induce la proliferacin de celular a la vez que incrementa la fagocitosis y las funciones metablicas de los macrfagos lo que dalugar a la muerte de los promastigotes (Revisado en Jones, 1996).

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Otra aplicacin es el estudio del efecto de la opsonizacin en la adhesincelular. As, en un modelo de infeccin ex vivo con Leishmania y sangre humana semostr que los promastigotes opsonizados con C3 se adheran (inmunoadherencia) a los eritrocitos antes de la fagocitosis del parsito (Domnguez y Torao, 1999).

Por ltimo, el estudio de agentes quimioteraputicos en dicho modelo ha mostrado que concentraciones adecuadas de antimoniales pentavalentes, pentamidinay anfotericina B eliminan el 90-100 % de los amastigotes de diversas especies de Leishmania de los macrfagos humanos infectados in vitro, representando una ventaja frente al empleo de los promastigotes libres ya que los amastigotes son ms sensibles,y, adems, los macrfagos pueden concentrar y metabolizar frmacos paraincrementar su toxicidad (Berman y Wyler, 1980).

Los modelos en fagocitos residentes o procedentes de lneas celulares yaestablecidas han sido tiles con las diferentes cepas empleadas. Chang consigui en1980 el mantenimiento de una lnea celular, J774.G8, infectada de manera indefinidacon amastigotes de L. amazonensis. Pero en el caso de L. infantum el desarrollo del modelo ha sido ms difcil, habindose descrito lneas celulares caninas que podaninternalizar promastigotes de L. infantum (Brandonisio y cols., 1986). Lneas como la U937, J774.G8 o la lnea THP-1 humana tambin han sido capaces de interaccionarcon el parsito (Savoia y cols., 1991; Gaspar y cols., 1992; Gebre-Hiwot y cols., 1992), Sin embargo, no se demostr una multiplicacin activa de los amastigotes en suinterior en ningn caso. Esto se mejor modificando las condiciones estndares delcultivo, de manera que mediante la preincubacin de los macrfagos durante 2 das a26C antes de realizar la infeccin con los promastigotes, se consigui una mayorinfectividad (Mndez y cols., 1996), demostrando posteriormente este modelo su utilidad en estudios de infectividad con distintas cepas in vitro, existiendo una correlacin entre la infectividad in vitro e in vivo de las mismas (Mndez y cols., 2001), por lo que este dicho modelo resulta muy til para el cribado farmacolgico.

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2.2.2. Modelos in vivo.

2.2.2.1. M odelo murino.

Se han desarrollado muchos modelos experimentales de leishmaniosis. Estos modelos tienen la principal atraccin de permitir el control de la gentica del parsito ydel hospedador, pero no reproducen enteramente la enfermedad de humanos. Uno delos factores que contribuyen a las diferencias entre humanos y animales de laboratorio es el tamao y la naturaleza del inculo. En las infecciones naturales el mosquito introduce en la piel un nmero muy pequeo de promastigotes metacclicos junto consaliva fuertemente bioactiva, mientras que en el laboratorio se inyectan infeccionescon miles de millones de promastigotes derivados de cultivos o amastigotes derivados de tejidos. El mosquito deposita el inculo en un pequeo volumen de sangre, mientras que en las infecciones en laboratorio se realizan en volmenes de 50 Pl o ms. Adems, en el laboratorio la jeringa se introduce subcutnea o intravenosamente(Handman, 2001). Un mejor conocimiento de los mecanismos implicados en lamaduracin del parsito en el mosquito y en la capacidad para mimetizar algo de estoen el laboratorio, ha dado lugar a muchos protocolos de infeccin mejorados. Losinvestigadores ahora usan por ejemplo, un pequeo nmero de promastigotesmetacclicos derivados in vitro por va intradrmica ms que subcutnea en la oreja delratn (De Krey y Titus, 1999; Mndez y cols., 2001).

2.2.2.1.1 M odelo murino de leishmaniosis cutnea.

En la leishmaniosis cutnea la infeccin de cobayas con L. enriettii fue el primer modelo que se caracteriz. Los cobayas desarrollaban respuestas celulares T frente a los antgenos parasitarios en 2 semanas de infeccin y la lesin se curaba en unas 10 semanas (Mauel y cols., 1981). La principal atraccin de este modelo animales el hecho de que la combinacin hospedador-parsito es natural y que el patrn essimilar al observado en la leishmaniosis cutnea por L. major. El modelo de L. enriettiien cobayas ha sido sustituido por la infeccin de cepas consanguneas de ratn conespecies de Leishmania patgenas para humanos. Aunque no es perfecto, el espectrode manifestaciones de la enfermedad observado en la leishmaniosis humana puedeser mimetizado en el laboratorio con la infeccin de diferentes cepas consanguneas de ratn con L. major.

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El modelo en ratn reproduce muchos aspectos de la enfermedad en humanos, incluyendo un amplio rango de estados de susceptibilidad dependiendo de la cepa deratn usada.

Los ratones Balb/c son altamente susceptibles y tras la infeccin desarrollan muchas lceras en la piel que se expanden y metastatizan dando lugar a la muerte, yla infeccin produce lesiones nodulares que visceralizan, con produccin de anticuerpos pero sin el desarrollo de una hipersensibilidad tarda (Alexander y Philips, 1978; Alexander y Kaye, 1985). Por el contrario, los ratones C57/BL6 y CBA/n son resistentes a la infeccin por L. major o L. mexicana y desarrollan lesiones pequeas que se curan en 10-12 semanas, son resistentes a la reinfeccin y desarrollan respuestas inmunes humoral y de hipersensibilidad tarda (Prez y cols., 1979; Grimaldi y cols., 1980). La mayora de las otras cepas son intermedias en lasusceptibilidad (Preston y Dumonde, 1976).

El desarrollo de la infeccin depende de la activacin polarizada de una de las dos subpoblaciones de clulas T CD4+, Th1 Th2. Los ratones Balb/c producen sobre todo citoquinas Th2, como la IL-4, y este patrn se establece a las pocas horas deinfeccin (Bogdan y Rollinghoff, 1998). Una diferencia importante entre ratonessusceptibles y resistentes es que los resistentes son capaces de cambiar a un perfilTh1 y controlar la enfermedad (Heinzel y cols., 1991; Solbach y Laskay, 2000). Un importante factor de decisin para formar un fenotipo Th1 Th2 es el ambiente temprano de citoquinas y, como ya hemos visto anteriormente, la IL-12 es una de lascitoquinas que contribuye significativamente al establecimiento de un fenotipo Th1 (Solbach y Laskay, 2000). Sin embargo, en ratones susceptibles Balb/c, se ha vistouna produccin temprana simultnea de IL-12 y de citoquinas que inhiben a la IL-12,como el TGF-E, IL-4 e IL-10 (Gorak y cols., 1998).

El IFN-J, adems de controlar la resistencia temprana frente a L. major,tambin influye en el inicio de la diferenciacin Th1 en ratones resistentes, no afectndose el desarrollo de la respuesta Th1 por la presencia o ausencia de IFN-Jderivado de clulas no T (Scharton-Kersten y cols., 1995; Wakil y cols., 1998).

En el modelo murino con L. major, las clulas T CD4+ son la principal fuente de IL-4 temprana, lo que desemboca en una no respuesta a la IL-12 en ratones Balb/c e

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induce el desarrollo de una respuesta Th2 (Launois y cols., 1997). Estudios con L.major encontraron que un epitopo simple derivado del antgeno parasitario LACK (Leishmania homologue of receptors for activated C kinase) induca una rpida y temprana produccin de IL-4 por clulas T CD4+ VE4VD8 en ratones Balb/csusceptibles, lo que estaba correlacionado con el desarrollo de las lesiones. Pero, losratones convertidos en tolerantes al LACK mediante expresin transgnica en el timo, exhiban una respuesta Th2 menor y un fenotipo curativo (Julia y cols., 1996; Launois y cols., 1997). Estos resultados indican que ciertos antgenos parasitarios puedenpromover el desarrollo de una respuesta Th2 contraprotectora.

A pesar de las evidencias del papel exacerbador de la enfermedad de IL-4 en la infeccin por L. major en ratones susceptibles, otros estudios utilizando ratones Balb/c deficientes en IL-4 infectados con L. major no han sido concluyentes. Scott y cols. en 1996 demostraron que la produccin temprana de IL-4 no predice necesariamente la susceptibilidad a L. major.

Mientras que es til en muchos sentidos, uno debe recordar que el modelomurino es solo un modelo y que la patognesis y la inmunidad puede ser un pocodiferente en humanos por lo que la extrapolacin de ratn a humano se ha de hacer con mucho cuidado (Kelso, 1995).

2.2.2.1.2. M odelo murino de leishmaniosis visceral.

Hasta hace poco no existan modelos animales de infeccin adecuados para estudiar el desarrollo y progresin de las infecciones causadas o por L. donovanio por L. infantum. Una de las dificultades con el ratn como modelo de leishmaniosishumana visceral es la necesidad de inyectar amastigotes intravenosamente con el fin de inducir un patrn reproducible de la colonizacin del bazo y el hgado. Paraconseguir una infeccin visceral detectable en ratn, es necesario emplear un nmero muy elevado de parsitos, lo que est muy lejos de lo que ocurre en la infeccin natural. Adems, los ratones no mueren y la carga parasitaria, despus de uncrecimiento moderado, disminuye a niveles muy bajos o indetectables, indicando que los ratones desarrollan una inmunidad protectora frente a la infeccin (Leclerq y cols., 1996; Engwerda y cols., 1998; Honor y cols., 1998).

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Los ratones no consanguneos son generalmente resistentes a la infeccin conL. donovani, pero las cepas consanguneas presentan diferencias marcadas en la susceptibilidad, lo que dio lugar a principios de los 70, al aislamiento del gen de la susceptibilidad Lsh (posteriormente denominado NRAMP1) (Bradley, 1974). NRAMP1 determina el grado de expansin temprana de los parsitos en hgado y bazo (Bradley,1989; Blackwell, 1996). Los estudios con los modelos viscerales de ratn tambin handado dan lugar a la caracterizacin de mecanismos inmunes importantes para el desarrollo de respuestas rgano-especificas que causan el aclaramiento de los parsitos del hgado pero no del bazo (Kaye y cols., 1995; Engwerda y Kaye, 2000).Otra contribucin importante del modelo murino ha sido el descubrimiento de que la quimioterapia con antimoniales es inefectiva en ausencia de respuestas mediadas por clulas T intactas (Kaye y cols., 1995).

En general la respuesta inmune en cepas de ratn consanguneas infectadas con especies de Leishmania viscerotrpicas, es similar a la observada en el modelo murino con L. major. Pero al comparar leishmaniosis cutnea y visceral en ratonesBalb/c infectados con L. donovani se observ, que en la infeccin cutnea los esplenocitos y las clulas de los ndulos linfticos mostraban alta respuesta linfoproliferativa parsito-especfica con alta respuesta de IFN-J, IL-4, IL-10 y NOS2, mientras que en la infeccin visceral no hubo respuesta frente al antgeno (Melby ycols., 1998).

La infeccin por L. donovani en ratn ha inducido un desarrollo variable dependiendo del background gentico de la cepa de ratn, va de inoculacin, dosis einfectividad del organismo (Blackwell y cols., 1980). Estudios realizados en ratonesconsanguneos han identificado ciertas cepas como la C3H que es resistente, mientrasque las cepas B10.D2, C57BL/10, etc siguen un fenotipo susceptible curativo o no(Blackwell y cols., 1980; Nickol y Bonventre, 1985). Sin embargo, el modelo Balb/c hasido el ms estudiado, mostrando estos animales una susceptibilidad inicial, siendo capaces, despus de varias semanas, de controlar la carga parasitaria manteniendo un nivel bajo de infeccin crnica (Murray y cols., 1982; Wilson y cols., 1996; Mukherjee y cols., 2003).

Por otro lado, los perfiles de citoquinas en este modelo de ratn no son lostpicos de una respuesta Th2. Es decir, que el claro patrn de respuesta Th1/Th2

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demostrado para L. major o L. mexicana no ha sido bien observado en la leishmaniosis visceral en ratones y humanos (Honor y cols., 1998; Kaye y cols., 1991; Kemp y cols., 1993; Miralles y cols., 1994). Aunque la resistencia a L. donovani esta asociada con la produccin de IFN-J, las citoquinas Th2 no determinan susceptibilidad. De hecho ratones IL-4-/- son ligeramente ms susceptibles a L. donovani que los controles silvestres, lo que indica que la IL-4 puede tener un efecto protector frente a laleishmaniosis visceral murina (Satoskar y cols., 1995). La incapacidad para controlar las infecciones est asociada con la prdida de capacidad de los esplenocitos paraproducir IFN-J in vitro pero no la produccin de IL-4 IL-5 (Kaye y cols., 1991).

La resistencia frente a las infecciones viscerales murinas se ha asociado con respuestas celulares que incluyen a las clulas CD4+ y CD8+ (Stern y cols., 1988) y elaclaramiento de parsitos de la piel en modelos viscerales obtenidos mediante inoculacin intradrmica se ha correlacionado con respuesta inflamatoria e infiltracin y activacin de CD4+ y CD8+ (Ahmed y cols., 2003).

Como se ha mencionado anteriormente, el desarrollo cutneo o visceral puede depender de interacciones entre el genotipo del parsito y del hospedador mas queexclusivamente del parsito. Debido a las limitaciones del sistema experimental murino usando cepas visceralizantes humanas como L. donovani y L. infantum, se ha propuesto que la leishmaniosis visceral inducida en Balb/c por la cepa dermotrpica L.major puede ser un modelo mejor para la leishmaniosis visceral (Handman, 2001).

2.2.2.2. M odelo en criceto.

Se ha visto que distintas cepas de L. donovani, L. chagasi y L. infantuminfectan al criceto, induciendo una forma fulminante de leishmaniosis visceral queprogresa hacia la muerte del animal (Hommel y cols., 1995), aunque los estudiosinmunolgicos en el criceto han cado, en comparacin con otros modelos, debido a laausencia de reactivos inmunolgicos, existiendo pocos trabajos al respecto.

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Criceto dorado (Harlan Ibrica S.A.).

Sin embargo, hace ya aos que se empez a utilizar el criceto como modelo experimental en la inmunologa de la leishmaniosis. Por ejemplo, en 1976 Farrell observ que el criceto dorado era capaz de adquirir resistencia a la infeccin inducida por L. donovani, mediante la exposicin previa a la infeccin subcutnea con el mismoparsito.

Goto y cols. observaron en 1987 que los cricetos infectados con L. majortambin constituan un modelo interesante de leishmaniosis visceral ya que todos losanimales desarrollaban la enfermedad, con test cutneo negativo, presencia de anticuerpos y diseminacin del parsito en hgado y bazo al igual que en humanos. Enel mismo ao, Ghosh y Ghosh estudiaron el patrn de infeccin en cricetos infectados con diferentes aislados de pacientes indios con Kala-azar, y observaron que las cepasde L. donovani ms virulentas producan una infeccin masiva, con hepatoesplenomegalia, cargas parasitarias altas en hgado y bazo, anemia, leucopenia, hipergammaglobulinemia, aumento de anticuerpos y baja respuesta linfoproliferativa y de hipersensibilidad retardada frente al antgeno.

En cricetos infectados con L. infantum no hubo cambios en las concentracionesde urea, creatinina o nitratos, ni antes ni despus del tratamiento con anfotericina B, elcual produjo un descenso del 98,2% en la carga parasitaria, sin reduccin de los niveles de anticuerpos. Es decir, no existi produccin de NO, al contrario de lo queocurre en ratn, por lo que parece que el NO no estara implicado en el efecto curativo de la anfotericina B en este modelo (Bories y cols., 1998).

En otro estudio, en el que se ensayaron distintas dosis de infeccin por L.infantum por va intracardiaca, realizndose un seguimiento de un ao, se mostr queexistiran tres grupos de animales: sintomticos o susceptibles, oligosintomticos y

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resistentes, al igual que ocurre en perros y humanos (Requena y cols., 2000). Estosautores observaron que exista una correlacin entre la cantidad de inoculo y el tiempo de aparicin de los sntomas clnicos externos y tambin en relacin con algunosparmetros inmunolgicos. Un descubrimiento importante fue que cerca de la mitad de los animales, independientemente del tamao del inoculo, no desarrollan sntomasexternos de leishmaniosis visceral. Tambin se encontr una correlacin entre eltamao del inoculo y el momento en que se detectaba la respuesta humoral anti-Leishmania y cuando se analizaron los anticuerpos en rin, se observ que existauna relacin entre la presencia de anticuerpos en este tejido y la aparicin de los sntomas.

Existen diferencias entre la infeccin con amastigotes o con promastigotes de L. infantum por va intraperitoneal en cricetos. Las clulas esplnicas respondieron fuertemente al antgeno especfico en las primeras semanas post-infeccin, pero en el momento del pico en la carga parasitaria los ndices de estimulacin disminuyeron en ambos casos. En ambos grupos exista reconocimiento de antgenos de 21, 31, 40-42,47-50, 54-58, 63-69, 70-76, 80-88, 91-97, 100-107 y 110-118 kDa, pero el patrn dereconocimiento era muy heterogneo, no existiendo correlacin con los cambios en la carga parasitaria. La principal diferencia entre la infeccin por amastigotes ypromastigotes fue el tiempo de incubacin que fue mayor en el segundo caso (Ria-Capela y cols., 2003).

Anteriormente, se haba observado en cricetos infectados con L. donovani que aparecan anticuerpos frente a antgeno de promastigotes de 26, 35, 46, 59, 69, 107 y120 KDa (Evans y cols., 1990).

La protena GRP94 de L. infantum, que es muy abundante en el retculo endoplsmico y esta asociada con el procesamiento antignico, ha demostrado seruna diana importante durante la leishmaniosis visceral en cricetos, pudindoseemplear como marcador temprano de infeccin (Larreta, 2002).

Otros estudios sobre la respuesta humoral han sido los realizados por Campos-Neto y Bunn-Moreno en 1982, que mostraron que los cricetos infectados con L.donovani desarrollaban anticuerpos frente al parsito e hipergammaglobulinemiadebido a la activacin policlonal de las clulas B. Posteriormente, se observ que el

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extracto bruto de L. donovani induca in vitro a las clulas B a producir anticuerpos, pero esa activacin pareca ser independiente de un posible efecto mitognico sobre las clulas B (Bunn-Moreno y cols., 1985).

Al emplear el inmunosupresor ciclofosfamida se bloque la aparicin deanticuerpos especficos y policlonales frente a la infeccin por L. donovani, debidoposiblemente a un efecto sobre la poblacin de clulas T implicadas en el control de la produccin de anticuerpos por las clulas B (Otero y cols., 1993).

La presencia de antgenos de L. donovani e inmunoglobulinas de criceto en rin, origin una glomerulonefritis proliferativa mesangial progresiva, asocindose condeposicin amiloidea (Oliveira y cols., 1985; Sartori y cols., 1987). Los eluidos derin, mostraron especificidad por el antgeno de L. donovani y por inmunoglobulinas de criceto, detectndose protenas de 134, 110, 93, 89, 82, 52, 48, 31 y 26 KDa, y reconociendo la IgG de cricetos infectados la protena de 134 KDa (Sartori y cols., 1991).

Tambin se han detectado inmunoglobulinas en otros rganos como pulmn e hgado de cricetos infectados con L. chagasi (Mathias y cols., 2001). Por otro lado, el cortex y la medula de las glndulas adrenales mostraron una deposicin progresiva defibras amiloideas en cricetos infectados con L. infantum, dando lugar a la destruccin parcial del parnquima adrenal (Novoa y cols., 1990).

En cuanto a la respuesta linfoproliferativa, durante la infeccin por L. donovanien cricetos se produce una fuerte inmunosupresin, existiendo dos tipos de inhibicin: la anergia inespecfica frente a concanavalina A y una inmunosupresin antgeno-especfica mediada por la poblacin celular no adherente (clulas T), que serestauraba despus del tratamiento con Glucantime (Nickol y Bonventre, 1985). Alcontrario que en el trabajo anterior, la eliminacin de las clulas adherentes restaur la capacidad de los esplenocitos para responder al antgeno y adems esas clulas adherentes supresoras, que tenan caractersticas de macrfagos, parece que no eranlas responsables de la incapacidad de las clulas perifricas para responder alantgeno (Gifawesen y Farrell, 1989).

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Esto se confirm ms tarde, ya que la eliminacin de las clulas adherentes, con caractersticas de macrfagos, en cricetos infectados con L. donovani, tambin restaur la respuesta proliferativa frente a forbolmiristato e ionomicina. Adems, seobserv que la generacin de NO por las clulas adherentes era, por lo menos enparte, responsable de la inhibicin de la proliferacin al utilizar concanavalina A (Dasgupta y cols., 1999).

Recientemente, se ha visto que el efecto supresor que ejercen las clulas adherentes sobre la respuesta proliferativa, est mediado por una inhibicin en la activacin de una ruta metablica en la que interviene la proteinkinasa C (PKC). Estasupresin puede ser revertida por el cido okadaico, que es un inhibidor de la fosfatasa serina-treonina, y por anti-TGF-E (Mookerjee y cols., 2003).

Las clulas adherentes de bazo fueron incapaces de presentar los antgenos de L. donovani pero si otros antgenos no relacionados, y las clulas T no respondieron a los antgenos del parsito incluso cuando fueron presentados pormacrfagos normales. Todo esto demuestra que las clulas esplnicas presentadorasde antgeno eran incapaces de mediar en la proliferacin de las clulas T selectivamente frente a los antgenos del parsito (Rodrigues y cols., 1992).

Las clulas presentadoras de antgenos (esplenocitos adherentes) de cricetosinfectados con L. donovani producan altos niveles de TGF-E, indicando que dicha citoquina participa fuertemente durante el curso de la infeccin en este modelo animal(Rodrigues y cols., 1998).

Por otro lado, se ha visto que factores humorales (inmunoglobulinas, factoresreumatoides o triglicridos) del suero de criceto infectados con L. donovani, inhiban respuesta proliferativa frente a concanavalina A (Evans y cols., 1990). Previamente, se haba observado que la inmunosupresin en cricetos infectados por L. braziliensis o por L. donovani estaba relacionada con protenas sricas probablemente delhospedador (ODaly y Cabrera, 1986).

Los lpidos del suero provocaron inhibicin de la proliferacin celular en esplenocitos de cricetos normales a los que se les aadieron mitgenos y suero decricetos infectados con altos niveles de triglicridos, revirtindose la inhibicin al aadir

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albmina srica bovina, que es un carrier de cidos grasos libres (Vasconcellos ycols., 1996).

Tambin se vio que el sistema del complemento juega un papel importante en la reaccin inflamatoria y en la fagocitosis, en cricetos inoculados con promastigotes de L. chagasi, puesto que la deplecin del complemento disminuy la fagocitosis delos parsitos por clulas polimorfonucleares y por macrfagos, lo que afect a laevolucin de la infeccin (Laurenti y cols., 1996).

Por otro lado, se observ un incremento en el porcentaje de clulas NaturalKiller al comienzo de la infeccin, que no fue capaz de detener el desarrollo de la infeccin (Sartori y cols., 1999).

La ausencia de reactivos inmunolgicos para criceto empez a ser menos problemtica a partir del trabajo de Melby y cols. en 1998, en el que se clonaron ysecuenciaron porciones de IL-2, IL-4, IFN-J, TNF-D, IL-10, IL-12p40 y TGF-E,determinndose la expresin de estos genes en cricetos infectados con L. donovani durante 56 das, encontrando: (i) expresin basal de IL-4; (ii) fuerte expresin de citoquinas Th1 (IL-2, IFN-J y TNF); (iii) ausencia de expresin de RNAm de oxido ntrico sintetasa; y (iv) en los estadios tempranos an no se expresaban IL-10 TGF-E(Melby, 1998 y 2001).

El estudio de estas citoquinas en cricetos afectados de leishmaniosis cutnea muestra que la expresin de citoquinas desactivantes de macrfagos de tipo Th2 y/o la respuesta exagerada de citoquinas proinflamatorias de tipo Th1 pueden contribuir a la severidad de las lesiones (Osorio y cols., 2003).

Como veremos ms adelante (apartado 3.1.4), el criceto dorado se haempleado con xito en ensayos farmacolgicos en los que se empleaba anfotericina B (Berman y cols., 1986; Berman y cols., 1992; Agrawal y cols., 2002). Pero adems, se han ensayado otras sustancias con fines inmunoteraputicos en cricetos como laprotena A de Staphylococcus aureus (Ghose y cols., 1999), la protena papLe22 (Fragaki y cols., 2001), ciertos lipopptidos anlogos a muramildipptido (MDP) (Zehra y cols., 1995) o el picroliv, el glucsido iridoide de Picrorhiza kurroa (Puri y Saxena, 1992). El propio parsito tambin ha sido empleado como inmunoprofilctico en un

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modelo de leishmaniosis visceral criceto (Mukhopadhyay y cols., 1999) y las vacunas de L. donovani y L. major autoclavadas en unin a BCG, tambin han demostrado suutilidad profilctica frente a la leishmaniosis visceral en este modelo (Srivastava ycols., 2003).

2.2.2.3. M odelo canino.

Como ya hemos visto, el perro acta como reservorio de la leishmaniosis y, adems, en numerosas ocasiones sufre la enfermedad. La leishmaniosis canina esuna de las enfermedades parasitarias de mayor gravedad y a su vez, de ms difcil manejo, debido principalmente a la variabilidad de los cuadros clnicos, al frecuentefracaso teraputico y a su carcter zoonsico y vectorial, lo que dificulta el control endeterminadas reas endmicas (Mir y Fraile, 1999).

Perro afectado de leishmaniosis, con atrofia muscular y dermatitis (Alvar, 1997).

El perro es un buen modelo para la leishmaniosis humana, porque en l lossntomas de la enfermedad son similares a los que se desarrollan en humanos (Peters y Killick-Kendrick, 1987). Las investigaciones realizadas en los ltimos aos hanpermitido la estandarizacin del trabajo de laboratorio con perros y ahora existen herramientas especificas bsicas para los ensayos experimentales. La produccin deanticuerpos monoclonales frente a los homlogos caninos de los clusters de diferenciacin antignicos humanos (Cobbold y cols., 1994), proporciona laoportunidad de definir subpoblaciones linfoides caninas (Willians, 1997) y monitorizarestas clases celulares bajo condiciones normales (Rabanal y cols., 1995; Weiss, 2001)y patolgicas (Bourdoiseau y cols., 1997; Sinke, 1997).

De forma ms o menos terica se suponen dos tipos de respuesta inmune: una respuesta celular eficaz, basada en la produccin de linfocitos Th1 que producen IFN-J

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e IL-2, potentes activadores de macrfagos. Este tipo de respuesta solo se observa en un porcentaje inferior al 10% de los perros enfermos, considerados como animales resistentes presentando anticuerpos negativos, pero una respuesta proliferativa positiva de las clulas T frente a antgenos de Leishmania, con respuesta similar a las personas inmunocompetentes frente a la infeccin por Leishmania.

La otra respuesta es una respuesta humoral ineficaz, propia de la mayora de los perros afectados (susceptibles) que se basa en la induccin de los linfocitos Th2 supresores, productores de IL-4 e IL-10, que dan lugar a la estimulacin de los linfocitos B, provocando hipergammaglobulinemia inespecfica, con produccin masivade anticuerpos anti-Leishmania no protectores y con clulas T negativas. Se trata de una reaccin de hipersensibilidad de tipo III con formacin de abundantesinmunocomplejos, responsables de la mayora de los sntomas ms graves de la enfermedad.

En los casos en que la respuesta inmune no es eficaz, se produce ladiseminacin del parsito principalmente a los rganos hematopoyticos (bazo,medula sea), donde continua la replicacin del parsito, y desde aqu, su diseminacin al resto de los rganos (piel, rin, hgado, tubo digestivo, ojos,articulaciones, etc) (Mir y Fraile, 1999).

La gentica parece que tiene influencia a la hora de determinar la resistencia a la leishmaniosis clnica; por ejemplo, en perros de caza ibicencos, la prevalencia decasos de enfermedad es mucho menor que en otras razas y esta caracterstica ha sidoasociada a una reactividad significativa de las clulas inmunes (Solano-Gallego y cols.,2000).

Respecto a la polarizacin de las respuestas Th1 Th2, entre ambas puedeexistir una amplia gama de posibilidades. En una primera fase, de duracin variable,se producen ambas repuestas, con expresin de citoquinas de ambas ramas, hasta que por motivos desconocidos, se polariza en un sentido u otro. De un 20 a un 50% de los perros tendra una respuesta Th2 con progresin a enfermedad patente, y el resto mantendra un estado de tolerancia (Alvar, 2001).

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Un hecho muy significativo en la leishmaniosis canina es, la cada progresiva de linfocitos CD4+ (Moreno y cols., 1999) entre el sexto y el octavo mes despus de la infeccin, cuando empieza a aparecer la sintomatologa. Desde las primeras semanas tambin se observa un aumento en los linfocitos CD28+ que son precursores de loslinfocitos B, y por eso se exacerba la respuesta humoral. Adems, al igual que enhumanos, esta alta respuesta de inmunoglobulinas es favorecedora para el parsito porque los anticuerpos facilitan su fagocitosis por parte del macrfago (Slappendel, 1988).

Como nuestro trabajo se basa en el desarrollo de modelos experimentales, repasaremos ms detenidamente solo los estudios realizados en perros experimentalmente infectados.

Los subtipos de inmunoglobulinas IgG1 e IgG2 han sido propuestos como indicadores de la dicotoma en la respuesta por anticuerpos frente a la infeccin caninapor L. infantum y existe una correlacin entre los niveles de IgG1 e IgG2 y la progresin de la enfermedad (Nieto y cols., 1999; Leandro y cols., 2001; Solano-Gallego y cols., 2001).

Se ha encontrado respuesta temprana frente a los antgenos de 29 y 50-57KDa, detectndose las bandas de 34-35.4 y 26 KDa solo durante la fase aguda de laenfermedad (Carrera y cols., 1996). El reconocimiento de la banda de 26 KDa desapareci despus del tratamiento, apareciendo en ese momento dos protenas de 85 y 110 KDa (Lasri y cols., 2003). Por otro lado, en perros tratados con antimoniatode meglumine se produjo un descenso en la intensidad de las bandas en la regin de 12-30 KDa (Riera y cols., 1999).

En leishmaniosis canina experimental se ha observado una respuesta celular B notable, pero los ensayos de transformacin de linfocitos mostraron una ausencia derespuesta de las clulas T durante la enfermedad (Martnez-Moreno y cols., 1993).

Tres aos despus de la infeccin experimental, los perros resistentesrespondieron frente al antgeno, con ausencia de anticuerpos, pero en los sintomticosocurri lo contrario. En ambos grupos existi respuesta frente a concanavalina A y

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tambin existieron IL-2 y TNF en los sobrenadantes de las clulas perifricas de los asintomticos (Pinelli y cols., 1994).

Al comparar infecciones naturales y experimentales, hubo falta de respuestacelular frente al antgeno de Leishmania en todos los casos, mientras que las respuestas inespecficas frente a mitgenos fueron normales, estando parcialmente suprimidas en animales infectados naturalmente (Martnez-Moreno y cols., 1995). Porotro lado, Rhalem y cols. (1999), observaron proliferacin temprana frente a antgeno bruto y a la fraccin purificada gp63, que disminua al aparecer los sntomas.

En el caso de perros infectados con amastigotes o promastigotes, existi alta proliferacin frente a concanavalina A en todos los grupos, observndose en losinfectados con promastigotes una fuerte respuesta linfoproliferativa frente al antgeno(Leandro y cols., 2001).

En cuanto a las citoquinas, en las clulas de sangre perifrica de perros Beagle infectados con amastigotes, existi un incremento en la expresin de IFN-J e IL-2, mientras que la IL-12 e IL-10 solo se detectaron espordicamente en algunos animales. En los perros no infectados, solo se detect IFN-J en clulas estimuladas con concanavalina A y no hubo relacin entre la respuesta humoral, celular o laseveridad con la IL-10, sugiriendo todo esto un establecimiento silencioso del parsito (Santos-Gomes y cols., 2002).

3. ANFOTERICINA B Y SUS FORMULACIONES.

Tanto el tratamiento de la leishmaniosis visceral como cutnea, ha sido mejorado en los ltimos 15 aos mediante la introduccin de frmacos y formulacionesalternativas, sin embargo, el arsenal teraputico contra la leishmaniosis visceral es anlimitado. Una revisin de la farmacocintica de los antimoniales pentavalentesestndares condujo al uso de dosis altas de estos frmacos durante los aos 80; estofue necesario para el tratamiento de la leishmaniosis visceral en India y Kenia despus de la existencia de una poca de dramtico descenso en las curaciones a las dosis recomendadas previamente (Olliaro y Bryceson, 1993). Debido a ello, los antimoniales ya no pueden ser usados en el noreste indio, donde la incidencia de la leishmaniosis visceral es mayor, por la aparicin de resistencias.

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Otros frmacos de segunda eleccin tradicionales, como la anfotericina B y la pentamidina, han re-emergido frente a Leishmania debido al desarrollo de formulaciones mejoradas. El uso del antibitico polinico anfotericina B estaba hasta hace poco tiempo limitado por su toxicidad. Las formulaciones lipdicas conanfotericina B, con menor toxicidad, originalmente desarrolladas para el tratamiento de micosis sistmicas, han sido explotadas con xito en la leishmaniosis visceral pero no son asequibles en pases menos desarrollados. Otro antibitico, la paramomicina(aminosidina), tambin ha sido formulado para el tratamiento de la leishmaniosis cutnea y visceral. El alopurinol se ha usado en estudios clnicos de leishmaniosis visceral y cutnea, al igual que el ketoconazol y el itraconazol, pero los resultados han sido equvocos. La primera medicacin oral frente a la leishmaniosis visceral,miltefosina, registrada en la India, todava est en fase de estudio y, adems, es abortiva y teratognica. El desarrollo de un segundo frmaco oral, la sitamaquina,esta siendo muy lento. Al igual que en humanos, el tratamiento de la leishmaniosis canina continua siendo problemtico ya que los antimoniales, la anfotericina B y la paramomicina tienen eficacia limitada (Croft, 1997; Guerin y cols., 2002).

Las limitaciones de la terapia antimonial en perros, como la induccin deresistencias, ausencia de cura parasitolgica, toxicidad y alto coste, tambin hanconducido, al igual que en humanos, a la bsqueda de otras alternativas ms asequibles y de mayor eficacia. Es difcil establecer en perros una infeccin experimental que mimetice el curso natural de la infeccin. Por eso, los experimentos controlados de respuesta a frmacos antiprotozosicos son pocos. Sin embargo, existen varios trabajos publicados sobre la terapia de la enfermedad adquirida naturalmente, que evalan aspectos sobre la respuesta teraputica, como cambios en el estado clnico y parmetros inmunolgicos (Baneth y Shaw, 2002). As, una buenarespuesta teraputica est marcada por un descenso en los niveles de anticuerpos y recuperacin de la inmunidad mediada por clulas (Deplazes y cols., 1992;Vercammen y cols., 1995; Moreno y cols., 1999; Rhalem y cols., 1999).

3.1. Eficacia de la anfotericina B.

El agente antifngico anfotericina B ha sido ampliamente reconocid

leishmaniosis visceral

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