Lecture  8  

Thrombophilia  

Thrombophilia  

• Arterial  Thrombosis  •  Stroke  and  myocardial  infarc:on  are  major  causes  of  death  ▫  Every  45  seconds  someone  in  the  US  suffers  a  new  or  recurrent  stroke    ▫   800,000/year  

� Every  34  seconds  someone  in  the  US  suffers  a  new  or  recurrent  MI  � 1.5  million/year  à  ~  1/3  will  die    

2

Atherosclerosis  

•  Atherosclerosis  –  thickening  of  the  arterial  wall  –  primary  cause  of  coronary  artery  disease  and  cerebrovascular  disease  –  Arterial    wall  thickens  to  form  an  atherosclero:c  plaque    –  Reduces  the  blood  supply  to  the  organ  (heart  and  brain  –  most  common)  

•  Atheroma  –  accumula:on  of  intracellular  and  extracellular  lipid  in  the  in:ma  of  large  and  medium  sized  arteries  

Atherosclerosis  •  Mechanism  

1.  A  lesion  begins  as  a  faTy  streak  (preatheroma)  that  protrudes  into  the  in:ma  •  LDL  enters  the  in:ma  –  modified  by  oxida:on  and  aggregates  within  the  extracellular  

in:ma  space  •  Smooth  muscle  cells,  T-­‐lymphocytes  ,  and  macrophages  migrate  into  the  area  –  

macrophages  phagocy:ze  the  oxidized  lipids  •  Proteoglycans,  collagen  and  elas:c  fibers  migrate  into  the  area    

2.  Fibro-­‐faTy  lesion  forms  –  diffuse  in:mal  thickening  occurs  •  Atheromatous    plaque  

3.  Complicated  plaque  •  Eggshell    briTleness,  ulcera:on  of  the  luminal  surface,  micro-­‐emboli  released  into  the  

blood  stream,  decreased  blood  flow  results  in  more  thrombus  forma:on  

Pathogenesis  

1.  Chronic  inflammatory  response  of  the  vascular  wall  to  endothelial  injury  or  dysfunc:on  

2.  Elevated  plasma  LDL  levels  causing  the  deposit  of  LDL  in  the  subendothelium  of  blood  vessels  

3.  Oxida:on  of  transmigrated  LDL  

4.  Ac:va:on  of  endothelial  cells  

5.  Recruitment  of  monocytes/macrophages  which  ingest  ox-­‐LDL  through  scavenger  receptors  

6.  Forma:on  of  foam  cells  –  faTy  streaks  

7.  Prolifera:on  of  smooth  muscle  cells  

8.  Deposi:on  of  extracellular  matrix  proteins  

Atherosclero:c  Plaque  

•  Coronary  Atherosclerosis  

hTp://up

load.wikim

edia.org/w

ikiped

ia/com

mon

s/9/9a/

Endo

_dysfunc:o

n_Athe

ro.PNG  

Mechanism  of  Arterial  Thrombosis  

8  hTp://www.drugs.com/health-­‐guide/images/205452.jpg  

CORONARY  ARTERY  DISEASE  

1.  Artery  narrowed  by  cholesterol  containing  atheroma  –  note  how  the  tube  which  the  blood  flows  through  has  been  narrowed  and  restricted    

2.  Once  the  surface  of  the  vessel  is  damaged,  platelet  clot  accumulates  restric:ng  flow  –  this  may  resolve  or  worsen  

3.  Platelets  may  accumulate  so  that  blood  flow  is  limited  by  the  clot  and  this  causes  starva:on  of  oxygen  death  of  muscle  and  a  heart  aTack  

Pathogenesis  of  coronary  heart  disease  (CHD)  

Thrombophilia  ▫  Venous  Thrombosis    ▫  DVT/PE  à  ~  900,000  to  2,000,000/year  ▫  60,000-­‐100,000  individuals  will  die  of  DVT/PE  ▫  10-­‐30%  will  die  within  one  month  of  diagnosis    ▫  ~25,000  of  these  deaths  result  from  VTE  contracted  in  hospitals  ▫  >25X  the  number  of  deaths  from  MRSA  ▫  >Combined  total  deaths  from  BC  +  AIDS  +  MVA  

•  Ironically  –  fatal  PE  caused  by  DVT  may  be  the  most  common  preventable  cause  of  hospital  death  in  the  US  –  only  1/3  of  hospitalized  paBents  with  risk  factors  for  VTE  receive  preventaBve  measures      

12

Mechanism  of  Venous  Thrombosis  

13  

•  Most  common  manifesta:ons  –  Deep  vein  thrombosis  –  Pulmonary  embolism  –  Postphlebi:c  syndrome  

•  Mechanism  –  Endothelial  damage  

•  Trauma,  surgery  •  TF  •  Thrombin  genera:on  •  Primary  hemosta:c  plug  with  fewer  platelets  

•  Venous  stasis  –  Red  clots  

Nature,  451(21)  Feb  2008  

What  Causes  a  Thrombus  to  Form?  Venous  Thrombogenesis  

–  Thrombi  begin  in  regions  of  slow/disturbed  blood  flow  Damaged  veins,  valve  cusp  pockets  

–  Inherited/acquired  hypercoagulable  states  important  –  Stasis  is  a  major  risk  factor  –  Variable  response  to  thrombus  

•  Classical  signs/symptoms  DVT  •  Minimal  signs/symptoms  

DVT/PE    

15  

   

Venous  Clot  

Thrombosis  (Blood  Clots)  

Intracoronary Clot

DVT

PE

Intracranial Bleed Hemorrhagic Stroke

Hemorrhage  (Bleeding)  

Gross  specimen,  coronal  sec:on  of  brain,  large  subcor:cal  hypertensive  ICH  

Chronic venous ulceration Very difficult to manage

Post phlebitic syndrome

Pain (dull and aching), leg cramps, heaviness, itching and altered sensation

Arterial  versus  Venous  Thrombosis  Arterial  Thrombosis     Venous  Thrombosis  

�  Arterial  thrombosis  �  Occur  under  high  shear  condi:ons  �  Rich  in  platelets  �  Involved  disrupted  atherosclero:c  

plaque  �  Platelet  adhesion,  ac:va:on,  and  

aggrega:on  prior  to  ac:va:on  of  coagula:on  cascade  

�  White  clots  

�  Myocardial  infarcBon  and  stroke  �  AnBplatelet  agents  

�  AnBfibrinolyBc  and  anBthromboBc  agents  

•  Venous  thrombosis  –  Under  low  shear  stress  –  Fewer  platelets  involved  –  TF  generates  thrombin  prior  to  

platelet  ac:va:on  –  Red  clot    

   –  DVT,  PE  –  AnBcoagulaBon  agents  for  

venous  thrombosis  

21  

Arterial  vs  Venous  Clot  

hTp://www.emedicinehealth.com/slideshow_pictures_deep_vein_thrombosis_dvt/ar:cle_em.htm  

hTps://www.med.unc.edu/wolberglabl/scien:fic-­‐images/arterial%20thrombosis.jpg/view  

Virchow’s  Triad    

 

 

23  

Thrombosis  

Stasis  

Changes  in  Blood  Composi;on  

Vascular  Injury  

Arterial Rudolph  Virchow  

 Post-­‐operaBve  state  CasBng/splinBng  Sedentary  state  Leukostasis  syndrome  (AML)  Congenital  heart  disease  

Central  line,  Sepsis  Trauma,  APA  Chemotherapy/toxins  Hyperhomocysteinemia  

Inherited  thrombophilia  Acquired  thrombophilia  

Virchow’s  Triad  

Thrombosis  involves  3  interrelated  factors:  1.  Abnormali:es  of  the  blood  vessel  wall  2.  Abnormali:es  in  blood  flow  3.  Abnormali:es  in  the  blood  cons:tuents  

•  Cells  -­‐  Erythrocytes,  leukocytes,  platelets  •  Plasma  proteins    

Risk  Factors  

25  

•  Mul:ple  risk  factors—mul:-­‐factorial  process  –  Hereditary  –  Acquired  

•  Mul:-­‐hit  hypothesis  –  Most  hereditary  and  acquired  risk  factors  have  a  rela:vely  small  

individual  effect    –  Risk  is  greatly  increased  when  two  or  more  risk  factors  combine  

•  Classifica:on  of  Thrombophilia  –  Inherited  –  Acquired—Physiologic,  Environmental  

Thrombophilia  

26  

•  Acquired  or  inherited  causes  

•  Venous  and  arterial  events  

•  Occurs  when  the  cloqng  system  is  ac:vated  1.  Excessive  genera:on  of  prothrombo:c  factors  2.  Failure  in  the  regulatory  mechanisms  to  down-­‐

regulate  the  coagula:on  cascade  3.  Inhibi:on  of  the  fibrinoly:c  system    

Thrombophilic  Risk  Factors  

Congenital  Risk  Factors   Mechanism  

27  

¤ Protein  C  ¤ Protein  S  ¤ AT  

¤ FVL  ¤ PG20210  ¤ FVIII  ¤ Homocysteine            (acquired  also)  

¨  Non-­‐modifiable  

Prothrombotic

Inhibitory

Acquired  Risk  Factors  

28  

¨  Acquired  risk  factors  ¤  Pregnancy  ¤  Malignancy  ¤  Surgery  ¤  Immobiliza:on  ¤  Hormone  therapy  (HRT,  OCT)  ¤  An:phospholipid  an:bodies  ¤  Trauma  ¤  Obesity  

¨  Physiologic  risk  factors  ¤  Gender  (hormonal  changes)  ¤  Age  –Increases  ~1%/year  of  age  

n  Childhood  =  1/100,000  n  40  years  =  1/1000  n  75  years  =  1/100  

¨  IdenBfy  a  populaBon  at  risk  but  have  low  predicBve  value  for  individuals    

Modifiable  

Non-­‐modifiable  

Prevalence  of  Risk  Factors    

0%

5%

10%

15%

20%

25%

% Risk

FVL PG AT PC PS FVIII

Risk Factor

Prevalence of Inherited Risk Factors

General Population Selected: 1st Thrombotic Event

Prevalence of Acquired Risk Factors

0102030405060708090

Fractures

Hip

Cancer

APAS

OCT

Pregnancy

HRT

Hcys

FVIII

Risk Factor

Incr

ease

29  

Congenital  Risk  Factors   Acquired  Risk  Factors  

Who  should  be  tested  

30  

¨  Pa:ents  presen:ng  with  ¤ Venous  thrombo:c  event  before  40-­‐50  years  of  age  ¤ Unprovoked  or  Recurrent  thrombosis  at  any  age  ¤ Thrombosis  at  unusual  site  ¤ Posi:ve  family  history  of  thrombosis  ¤ Unexplained  abnormal  laboratory  test  (PT,  aPTT)  

 ¨  Age  of  first  episode  

¤ 0-­‐12  years    Rare  ¤ 13-­‐45  years  Highly  probable  ¤ 45-­‐60  years  Probable  ¤ 60+  years    Possible  

Congenital    Risk  Factors  

When  to  test  

31  

¨ Op:mal  Times  for  Tes:ng  

•  Asymptoma:c  •  Not  on  an:coagulant  therapy  •  Any:me  for  DNA  tes:ng  

¨ To  establish  •  Pathologic  basis  for  the  thrombo:c  event  •  Dura:on  and  intensity  of  therapy    •  Prophylaxis  for  high  risk  pa:ents  •  To  alert  the  pa:ent's  immediate  family  members  to  the  presence  of  possible  inherited  risk  factors  

Laboratory  Assays  for  Thrombophilia  

32  

•  Plasma-­‐based  assays  –  AT  –  PC  –  PS  –  APC-­‐R  –  Lupus  An:coagulant/An:phospholipid  An:bodies  

•  Dilute  Russell  Viper  Venom  Test  (dRVVT)  •  An:cardiolipin  An:bodies  •  An:-­‐β2-­‐Glycoprotein  An:bodies  

–  Factor  VIII  –  Homocysteine  

•  DNA-­‐based  assays  –  FVL  –  PG20210  –  MTHFR  

An:thrombin  Deficiency  

33  

•  Eggberg,  1965  •  Reported  the  first  inherited  thrombophilic  state  •  Func:ons  as  a  naturally  occurring  inhibitor  of  the  coagula:on  cascade  •  Most  severe  of  the  inherited  condi:ons    •  Rela:vely  uncommon  (~1%  of  first  DVT)      

•   Clinical  Manifesta:ons  –  Increased  incidence  of  venous  thrombosis  –  AT  levels  <40-­‐50%  –  Ini:a:ng  events  leading  to  thrombosis  

•  Surgery  •  Trauma  •  Pregnancy  •  OCT  

Protein  C  Deficiency  

34  

¨ Griffin,  early  1980’s  ¨ 75%  of  individuals  will  experience  one  or  more  events  ¨ Thrombosis  may  be  spontaneous  ¨ Func:ons  as  a  naturally  occurring  inhibitor  of  the  coagula:on  

cascade  ¨ 50%  of  heterozygotes  will  experience  VTE  by  40  years  of  age  

¨ Common  Manifesta:ons  ¤ DVT  ¤ PE  ¤ Superficial  thrombophlebi:s  ¤ Cerebrovascular  events  ¤ Myocardial  events  

Protein  S  Deficiency  

¨ Described  in  1984,  Comp  ¨ TOTAL  PS  circulates  in  2  

forms:  ¤ Bound  PS—60%  

n C4B-­‐BP—nonfunc:onal  ¤ Free  PS—40%-­‐func:onal  

¨ Serves  as  a  cofactor  for  PC  ¨ Binds  aPC  to  the  

phospholipid  surface  ¨ 50%  of  heterozygotes  will  

experience  VTE  by  40  years  of  age  

Free PS

35  

Total PS

C4bBP

36  

aPC-­‐Resistance—Screening  assay  

•  aPC-­‐resistance  –  Dahlbäck  et  al  in  1993  –  Func:ons  as  a  natural  

an:coagulant  –  Poor  an:coagulant  response  of  

aPC  to  degrade  FVa  and  VIIIa    –  Ra:o  of  2  aPTT’s—(+/-­‐  APC)  

__(aPTT  plus  APC)__                              (aPTT  minus  APC)  

•  “Screening  assay”  for  FVL  muta:on  

•  http://www.wardelab.com/arc_2.html

Approximately  90%  of  APC  Resistance  is  caused  by  a  defect  in  the  Factor  V  molecule,  known  as  the  Factor  V  Leiden  gene  muta:on  

Factor  V  Leiden—Confirmatory  Assay  for  FVL  Muta:on  

–  Muta:on  later  described  in  1994  by  Ber:na  et  al  –  Caused  by  single  point  muta:on  in  the  FV  gene  

•  A  single  nucleo:de  subs:tu:on  of  adenine  for  guanine  at  nucleo:de  1691  of  the  FV  gene  

•  Replacement  of  Arg  (R)  with  Gln  (Q)  at  pos  506  in  F.V  protein  

–  Higher  risk  for  thrombosis  –  Venous  thrombosis  most  common  manifesta:on  

37  

PG20210  Muta:on  

¨  Poort  et  al,  1996  

¨  Single  nucleo:de  subs:tu:on  G20210A  in  the  3’  UT  region  of  the  prothrombin  gene  ¤ G  →  A  subs:tu:on  at  nucleo:de  

20210  in  prothrombin  gene  

¨  Results  in  elevated  levels  of  prothrombin  (~30%  increase)  

¨  No  screening  test  available  

¨  Occurs  primarily  in  Caucasians  -­‐-­‐~3%  in  general  popula:on  

¨  2-­‐5-­‐fold  increased  risk  of  VTE  

38  

Homocysteine  

39  

¨  McCully  suggested  an  associa:on  between  elevated  levels  of  homocysteine  in  plasma  and  arterial  disease  

¨  Most  common  congenital  form  due  to:  1.  (C677T)*  in  MTHFR  gene  2.  B-­‐cystathionine  synthase  gene  

¨  Acquired  form  due  to  deficiencies  in  Folate,  B-­‐6,  B-­‐12    

¨  Gene:c  tes:ng*  is  controversial  ¤  Homocysteine  levels  may  provide  

more  informa:on  ¨  Normal  values  increase  with  age  

¤  Higher  in  males  

www.naturaleyecare.com/ar:cles/elevated-­‐homocysteine-­‐and-­‐eye-­‐...  

40  

An:phospholipid  An:bodies  •  An:phospholipid  an:bodies  

–  Acquired  thrombophilic  disorder    –  An:bodies  directed  against  proteins  that  bind  to  phospholipid  

membrane  surfaces  –  Autoimmune  process  

•  Subgroups  of  APLAs  –  Lupus  An;coagulant  –  An;-­‐  Cardiolipin  an;bodies  –  An;-­‐Beta-­‐2-­‐glycoprotein  I  an;bodies  –  An:-­‐Prothrombin  an:bodies  –  An:-­‐Phospha:dylserine  an:bodies  –  An:-­‐Phospha:dylethanolamine  an:bodies  –  An:-­‐  Phospha:dylinositol  an:bodies  

 

hTp://circ.ahajournals.org/cgi/reprint/112/3/e39  

Clinical  Diagnosis  APAS  •  Acquired  disorder  which  occur  in  1-­‐5%  of  the  general  popula:on  •  Pa:ent  must  present  with  one  clinical  and  one  laboratory  criteria  

•  Clinical  Manifesta:on  –  Vascular  thrombosis  

•  One  or  more  clinical  episodes  of  arterial,  venous  or  small  vessel  thrombosis  in  any  :ssue  or  organ  

–  Pregnancy  Morbidity  •  One  or  more  spontaneous  abor:ons,  severe  preeclampsia,  eclampsia,  death  of  a  normal  fetus  at  or  near  10  months  gesta:on  

•  Laboratory  Criteria  –  Posi:ve  test  in  the  APA  test  panel  on  2  separate  occasions,  >  6-­‐12  weeks  apart  

•  Lupus  An:coagulant  •  An:cardiolipin  An:body  •  An:  –B2-­‐Glycoprotein  I  An:body  

41  

Lupus  An:coagulant  

•  Heterogeneous  group  of  an:bodies  (IgG,  IgM,  or  both)  that  prolongs  phospholipid-­‐dependent  coagula:on  tests  –  Immunoglobulin  that  acts  as  a  coagula:on  inhibitor  

– Does  not  recognize  a  “specific”  coagula:on  factor  – Retards  the  rate  of  thrombin  genera:on  and  clot  forma:on  in  vitro  by  interfering  in  phospholipid-­‐dependent  reac:ons  

•  Detected  in  in  vitro  coagula:on  assays  only  

42  

Lupus  An:coagulant  •  Affect  2-­‐4%  of  the  U.S.  popula:on    

•  Discovered  accidentally—prolonged  aPTT  found  during  a  pre-­‐opera:ve  evalua:on  

•  O|en  cause  a  variety  of  clinical  and  laboratory  effects  

–  O|en  there  are  no  clinical  consequences  other  than  the  need  to  explain  the  reason  for  the  long  APTT  

–  Minority  of  pa:ents  with  LA  have  a  hypercoagulable  state  manifested  by:  •  Recurrent  thromboses  •  Mul:ple  spontaneous  miscarriages  •  Migraine  headaches  •  Stroke    

•  Rarely  pa:ents  may  experience  bleeding  –  Bleeding  due  to  an:bodies  to  prothrombin    

•  Lupus  an:coagulants  (LA)  are  a  heterogeneous  group  of  an:bodies  that  cause  a  variety  of  clinical  and  laboratory  effects  

43  

Lupus  An:coagulant  •  Results  in  prolonga:on  of  phospholipid-­‐dependent  assays  •  LA  is  o|en  iden:fied  during  rou:ne  screening  with  the  standard  

aPTT  –  In  vitro  à  results  in  a  prolonged  aPTT  

•  Prolonga:on  due  to  reagent  sensi:vity  to  lupus  an:coagulant    

•  Usually  does  not  result  in  clinical  bleeding  –  In  vivo  à  usually  results  in  thrombosis  rather  than  clinical  bleeding    

•  Abundance  of  phospholipid  – These  neutralize  the  an:body  – May  explain  why  bleeding  does  not  occur  in  vivo    

•  An:body  may  be  persistent  or  transient    

44  

Lupus  An:coagulant  

•  All  lupus  an:coagulants  are  APAs,  but  not  all  APAs  are  lupus  an:coagulants  

•  Targets  specific  proteins  

•  B2GPI  •  Prothrombin  •  Proteins  C,  S  •  Annexin  V  

45  

Phospholipid  AssociatedProteins:•Protein  C,S•β2GPI  •Prothrombin•and  others

Phospholipid Membrane

Antibody:•lupus  anticoagulant•anticardiolipin•antiphosphatidylserine•anti  b2GPI•anti  Annexin  V•anti  Prothrombin

ANTIBODY-­‐MEDIATED   THROMBOSIS

Lupus  An:coagulant  and  Thrombosis  

 The Paradox... How does an anticoagulant in vitro, become a risk factor for hypercoagulability in vivo ?                    Coagulation Factor/Protein = Phospholipid

                         

                                       CA+2    

                                       Calcium  Anchor  

46

=PL

46  

Clinical  Significance  of  the  APAs/LA  

47  

•  Prevalence  in  venous  and  arterial  thrombosis  •  DVT  ~32%  •  Stroke  ~15%  •  Superficial  thrombophlebi:s  ~9%  •  Pulmonary  embolism  ~9%  •  Fetal  loss  ~8%  •  TIA  ~7%  

•  Associated  with  2  broad  categories  of  phospholipids  an:bodies  –  An:cardiolipin  an:bodies  

•  Most  likely  to  be  clinically  significant  with  high  :ters  for  IgG  and  IgA    –  β2-­‐GPI  an:bodies  

•  More  specific  for  thrombosis  and  other  clinical  complica:ons  of  the  APAS  

 

E:ology  of  LA  

•  Exact  e:ology  of  LA  is  unclear  •  An:bodies  are  commonly  found  in  asymptoma:c  elderly  individuals  •  Pa:ents  with  autoimmune  disorders  •  SLE  have  the  highest  incidence  (20-­‐45%)  •  Pa:ents  with  HIV  infec:on  have  a  high  incidence  of  LA  at  some  :me  in  the  course  

of  their  disease  

•  A  number  of  drugs  are  known  to  induce  LA,  most  notably  –  Procainamide  –  Hydralazine  –  Isoniazid  –  Dilan:n  –  Phenothiazines  –  Quinidine  –  ACE  inhibitors  are  known  to  induce  LA      

48  

Lupus  An:coagulant  and  Thrombosis  

•  LA  are  one  of  the  most  common  acquired  predisposing  causes  of  thrombosis  –  cerebral  thrombosis  –  deep  venous    thrombosis  –  renal  vein  thrombosis  –  pulmonary  emboli  –  arterial  occlusions  –  stroke    

•  Reports  indicate  that  LA  are  found  in:  –  8-­‐14%  of  pa:ents  with  deep  venous  thrombosis    –  1/3  pa:ents  with  stroke  <50  years  of  age  –  Evidence  that  recurrent  thrombo:c  events  tend  to  be  persistent  over  :me  in  

the  same  pa:ent    

49  

LA  in  Thrombocytopenia  and  Pregnancy  

•  LA  and  thrombocytopenia  –  An  immune  type  thrombocytopenia  has  been  observed  in  a  small  

percentage  of  pa:ents  with  LA  –  This  may  be  due  to  reac:ons  between  an:bodies  and  platelet  

membrane-­‐associated  phospholipids  

•  LA  and  Pregnancy  –  increased  risk  of  fetal  loss  due  to  pre-­‐eclampsia,  placental  abrup:on,  

intrauterine  growth  retarda:on,  and  s:llbirth  –  Some  evidence  suggests  that  this  may  be  due  to  an:bodies  against  the  

placental  an:coagulant  protein,  annexin    V  –  Placental  infarc:on  has  been  suggested  as  the  cause  of  the  failure  to  

carry  to  term  but  pathological  analysis  has  not  definitely  supported  this  conten:on  

50  

Mechanisms  of  the  Reduc:on  of  Annexin  V  Levels  and  the  Accelera:on  of  Coagula:on  Associated  with  An:phospholipid  An:bodies    

   Rand  J,  NEJM  1997;337:154-­‐160  

•  Annexin  V  –  Phospholipid  dependent  an:coagulant  proper:es  on  cell  

membranes    –  Placental  an:coagulant  (shield  on  placental  villi)  –  Vascular  an:coagulant  

51  

Proposed  Mechanisms  of  Thrombosis  

•  Impaired  Fibrinolysis  •  Inhibi:on  of  Protein  C  and  S  system  •  Inhibi:on  of  Prostacyclin  release  from  endothelial  cells  

•  Inhibi:on  of  Annexin  V  –  Tissue  Pathway  Down  Regula:on  

•  Inhibi:on  of  B2GPI  –  may  affect  Protein  S  

52  

An:cardiolipin  An:body  ELISA  

53