le congrès annuel de la societé francaise de toxicologie analytique

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIII, n 2, 2001

IX Congrs Annuel de la Socit Franaise de Toxicologie Analytique La Clusaz, 12-16 Mars 2001

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I^sums descommunications orales et affiches113Article available at http://www.ata-journal.org or http://dx.doi.org/10.1051/ata/2001002


Relations entre concentrations des benzodiazepines dans les milieux biologiques et leurs effets pharmacologiques et toxicologiquesB. P I Q U E T . B. LEBRUN-VIGNES, G. AYMARD, D. WAROT Service de Pharmacologie, CHU Piti-Salptrire, APHP, 47-83 bd de l'Hpital, 75013 Paris Deux situations diamtralement opposes existent quant l'valuation pharmacocintique-pharmacodynamique des benzodiazepines (BZD) et apparentes dans l'optique toxicologique : l'usage criminel et l'intoxication accidentelle ou volontaire. Les BZD prsentes comme hypnotiques (triazolam, flunitrazpam, tmazpam,...) ou anxiolytiques (lorazpam) ont t plus rgulirement utilises dans les cas de soumission mdicamenteuse. Si tant est que cela ait t rflchi, le rationnel pharmacocintique et pharmacodynamique l'emploi de ces molcules serait alors de prsenter une cintique de diffusion vers les structures encphaliques rapide et d'tre rapidement limin. Aux doses employes les effets dsinhibiteurs et amnsiants sont obtenus chez la majorit des sujets sans atteindre les effets sdatifs prononcs, ce qui permet d'agir en pleine conscience (1,2) ; de plus, une mise en vidence difficile dans les milieux biologiques semble tre un critre de choix de ces molcules. La conjonction de ces paramtres rend ainsi particulirement dlicat la mesure et l'interprtation des concentrations dans les milieux biologiques. C'est pourtant cette situation qui est la mieux prdite par les tudes de screening et de PK-PD en psychopharmacologie clinique. Diffrents plans exprimentaux et modles ont en effet permis de dterminer des CEso susceptibles de servir de rfrence ou de substitut de fourchette thrapeutique (3,4) et d'interprter les dosages plasmatiques en regard d'un effet "clinique" exprimental. Les donnes chez des patients traits sont nettement plus parcellaires et concernent les indications "anxit" et "attaque de panique" (alprazolam) pertinentes d'un point de vue thrapeutique mais pas dans l'approche toxicologique. Tout autre est la dmarche dans le cas des intoxications (suicide), o la dose est le premier facteur prendre en compte, indpendamment de la molcule, puisque, aprs normalisation sur la puissance intrinsque de chaque substance, toutes sont capables d'induire les mmes effets. Seules diffrent les constantes fractionnelles d'limination ; encore faut-il se situer dans une zone de cintique linaire, ce qui n'est pas vrifi dans la plupart des cas. Les zones "toxiques" ne sont pas clairement dfinies et varient de surcrot individuellement. Il y a donc une relation concentration/effet toxique non gnralisable. Par exemple diverses tudes dmontrent une rponse exacerbe aux BZD chez l'Ag, comparativement des sujets jeunes. Les modi114

fications physiologiques lies l'ge peuvent expliquer la plupart des modifications pharmacocintiques des molcules, qui seraient elles-mmes responsables d'un surdosage relatif Cependant les tudes conduites spcifiquement dans cette population ne permettent pas d'exclure une grande diffrence de sensibilit pharmacodynamique des patients gs, ce qui remet en question la pertinence de l'interprtation d'un dosage isol. Rfrences : 1- Green J.F., McElholm A., King D.J., A comparison of the sedative and amnestic effects of chlorpromazine and lorazpam. Psychopharmacol. 1996 ; 128 : 67-73. 2- Roehrs T., Merlotti L., Zorick F. et al. Sedative, memory, and performance effects of hypnotics. Psychopharmacol. 1994 ; 116 : 130-134. 3- Gupta S.K., Ellingwood E.H., Nikaido A.M. et ai, Simultaneous modeling of the pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of benzodiazepines. Pharm. Res. 1990 ; 7 : 570-576. 4- Ellingwood E.H., Heatherly D.G., Nikaido A.M. et al., Comparative pharmacokinetics and pharmacodynamics of lorazpam, alprazolam and diazepam. Psychopharmacol. 1985 ; 86 : 392-399.

Une observation inhabituelle d'intoxication au diazepam avec volution sur un mois des taux de diazepam et de nordiazpamL. de HARO, M. VALLI. J. H. BOURDON, A. ILIADIS, M HAYEK-LANTHOIS, J. ARDITTI Centre Antipoison, Hpital Salvator, 249, Boulevard de Sainte-Marguerite, F-13274 Marseille Cdex 09 Objectifs : Les auteurs prsentent une observation d'intoxication au diazepam inhabituelle pour plusieurs raisons : il s'agissait d'un produit de laboratoire pur et concentr ; les quantits ingres taient connues et prcises ; le patient n'tait pas trait par diazepam avant l'intoxication ; enfin des prlvements sanguins ont pu tre raliss durant un mois, ce qui a permis d'obtenir des paramtres toxicocintiques rares chez l'homme. Observation : Un homme de 54 ans absorbe 2 grammes de diazepam pur (produit de laboratoire) 20 H. Une heure aprs la prise; il dcide d'avertir les secours. 45 minutes plus tard, il est admis dans l'unit de soins du Centre Antipoison de Marseille. Le patient est trait avec 2 doses espaces de 4 H de 25 grammes de charbon actif, et diurse osmotique neutre. Le patient reste inconscient jusqu' la 13 heure, et prsente une dysarthrie, une diplopie, des vertiges et un ralentissement de l'expression verbale jusqu 'au 9 jour. Le patient quitte d'hpital au dixime jour, mais consulte rgulirement pour permettre le suivi clinique et biologique.me me


Rsultats analytiques : Les dosages du diazepam et de son principal metabolite le nordiazpam ont t raliss par CLHP avec dtection barrette de diodes (CLHP/BD). 28 chantillons sanguins ont t analyss, permettant de mesurer 20 taux de diazepam et 28 taux de nordiazpam. L'exploitation mathmatique de ces rsultats a permis d'tablir les donnes toxicocintiques suivantes : volume apparent de distribution : 714 litres, demi-vie de 67 h pour le diazepam et 86 h pour le nordiazpam. D'autres donnes seront prsentes. Conclusion : Les donnes toxicocintiques obtenues dans cette observation montrent que dans un tel cas, la demi-vie du diazepam et de son principal metabolite sont plus longues que les valeurs dcrites dans la littrature pour des doses thrapeutiques (1). L'ide classique considrant que les surdosages en benzodiazepines sont des intoxications modres facilement traites par flumaznil est frquemment exprime (2, 3). Les mdecins doivent savoir que mme si dans la plupart des cas, le pronostic vital n 'est pas mis en jeu, les benzodiazepines ne vont pas disparatre ds que le patient se rveille ! Rfrences : 1- Gilman A.G., Goodman L.S., Nies A.S. et al. Goodman and Gilman 's : The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8"' edition, Pergamon Press, New York, 1990. 2- Lheureux P., Askenasi R. Specific treatment of benzodiazepine overdose. Human Toxicol, 1988 ; 7 : 165-70. 3- Brammer G., Gibly R., Walter FG, Bey T., Torres R., Kohler S., Continuous intravenous flumazenil infusion for benzodiazepine poisoning. Vet Human Toxicol, 2000 ; 45 : 280-1.

Benzodiazepines : vous avez dit concentrations mortelles...J.P. GOULL >. J. NOUVEAU^, P. BRIQUET, H. DEBRIS >, V. CIRIMELE< , P. KINTZ >(I 2) (2 (l

(1) Groupe Hospitalier du Havre, B.P. 24, 76083 LE HAVRE (France) (2) Institut de Mdecine Lgale, 11 rue Humann, 67085 STRASBOURG (France) Objectif : L'objectif de ce travail est de prsenter deux cas d'ingestion massive de benzodiazepines et de montrer l'extraordinaire tolrance de sujets accoutums la consommation de ces molcules. Matriel et mthodes : Observation 1 : un homme de 44 ans, en invalidit pour dpression, trait par venlafaxine et clorazpate ingre, suite un diffrent familial, 23 botes de Tranxne 50 soit 34,5 g de clorazpate. A l'arrive aux urgences, le malade- est somnolent mais rveillable.

Aprs lavage gastrique, il est admis par scurit en ranimation (score de Glasgow 15). Il est somnolent pendant 3 jours. Il est ensuite transfr en mdecine puis en psychiatrie et quitte l'hpital le 12 jour. Onze prlvements sanguins sont raliss ainsi qu 'un prlvement de cheveux. Observation 2 : une femme de 38 ans, ancienne toxicomane par voie veineuse VIH 1 positive, consulte dans le cadre du traitement de son SIDA. En raison de troubles de la vigilance ainsi que de Velocution, le mdecin demande un bilan toxicologique sanguin et urinaire, orient vers la recherche de stupfiants. Des cheveux sont prlevs. Mthodes : La recherche de stupfiants est ralise dans les urines par immunoanalyse. L'identification et le dosage des benzodiazepines (BZD) par CL/UV/BD et le dosage des BZD dans les cheveux par CG/SM en mode ionisation chimique ngative (1). Rsultats : Observation 1 : les concentrations sanguines varient sur la priode de 12 jours entre 19 et 54 mg/l pour le desmthyldiazpam et de 0,35 6,53 mg/l pour 1'oxazepam. Les dosages dans les cheveux valent respectivement 6,23 et 0,95 ng/mg. Observation 2 : les dosages sanguins et capillaires permettent de mettre en vidence une conduite toxicophile aux BZD : desmthydiazpam 31,7 mg/l et 5,77 ng/mg ; diazepam 8,2 mg/l et 3,02 ng/mg ; oxazepam 3,2 mg/l et 0,67 ng/mg ; lorazpam 0,26 mg/l et 0,26 ng/mg ; lormtazpam 0,18 et 0,39 ng/mg. Conclusion : Ces deux observations mettent en vidence des phnomnes d'accoutumance et de tolrance chez des sujets prsentant des conduites toxicophiles anciennes. Elles contrastent avec les cas dcrits dans la littrature de sujets dcds d'intoxications mettant en cause uniquement une BZD (2), mais galement avec les cas tirs de notre exprience mdico-lgale, pour lesquels les concentrations mesures admises comme tant l'origine du dcs, sont souvent nettement infrieures celles mesures chez ces deux malades. Rfrences : 1- Kintz P., Cirimele V, Vayssette F., Mangin P. Hair analysis for nordiazpam and oxazepam by gas chromatography-negative-ion chemical ionization mass spectrometry. J. Chromatogr. B, 1996 ; 677 : 241-244.me

2- Richard N., Ghysel M.H., Savart M. Intoxications mortelles par les benzodiazepines : applications mdico-lgales. Toxicorama, 1996 ; VIII : 17-22.

Tolrance de hautes doses de diazepam lors de l'intoxication aigu par la chloroquineP. HANTSON . P. COUROUBLE , M. de TOURTCHANINOFF , X. WITTEBOLE , F. T H Y S , P. WALLEMACQ(2) (l) (I) (3) (1) (,)

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(1) Dpartement des soins intensifs et des urgences, (2) Laboratoire d'explorations neurophysiologiques, (3) Laboratoire de toxicologie, Cliniques St-Luc, Universit catholique de Louvain, Bruxelles Objectif : L'administration de doses importantes de diazepam fait partie du traitement des formes graves d'intoxication aigu par la chloroquine, sans que le mcanisme d'action ne soit parfaitement lucid(l). Dans des sries importantes de patients ventils, l'administration de diazepam seul, aux doses leves prconises par le protocole de rfrence, n'assure pas toujours une sedation suffisante(2). Nous rapportons une observation documente par des analyses lectroencphalographiques (EEG) et des donnes pharmacocintiques. Observation : Une patiente de 39 ans est admise une heure aprs l'ingestion volontaire de 5 g de chloroquine; elle a galement bu un sirop contenant 360 mg de codine et 72 mg de triprolidine. Elle est parfaitement consciente et prsente les signes cliniques suivants : frquence cardiaque, 146/min; frquence respiratoire, 12/min ; pression artrielle, 161/106 mm H g. U lectrocardiogramme (ECG) d'admission est sans particularit. La conscience se dtriore 20 min plus tard, de mme qu 'apparaissent une hypotension et des modifications de l'ECG (QRS > 120 msec). La patiente est intube et ventile artificiellement. Elle reoit un bolus de 2 mg/kg de diazepam en 30 min, puis une perfusion continue la dose de 60 mg/h pendant 32 h (1 mg/kg/h), combine l'administration d'adrnaline. La situation hmodynamique se stabilise. Une heure aprs le dbut de l'administration de diazepam, la patiente reste parfaitement consciente. Un premier EEG est ralis 12 h aprs le dbut du traitement, et les enregistrements sont rpts toutes les 4 h. L'analyse visuelle dmontre une surcharge en rythmes bta confirme par l'analyse spectrale. Lors du premier enregistrement la puissance relative bta est de l'ordre de 66 % et la "spectral edge frequency 95" (frquence en de de laquelle se situe 95 % du spectre de frquence) de 19 Hz. Ces valeurs restent leves tout au long du monitoring (32 h). La patiente reste veille durant toute la dure de perfusion du diazepam et conserve une ventilation spontane. Elle est extube 32 h aprs l'admission, peu avant l'arrt dfinitif du diazepam. Un pic plasmatique de diazepam de 13,1 pg/ml a t atteint la 44 h. On peut calculer une aire sous la courbe (AUC) de 553,08 pg.h/ml pour une AUC thorique de 597, 22 pg.h/ml selon la dose totale administre de 1075 mg de diazepam. Discussion :ime

des proprits pileptognes qui peuvent tre contrles par l'administration de benzodiazepines, ce qui pourrait suggrer une action sur le rcepteur central l'acide gamma-aminobutyrique (GABA). Les donnes obtenues in vitro montrent cependant que ce rcepteur a une faible affinit pour la chloroquine(3). Comme dans le cas prsent, il n'y a aucune vidence dans la littrature d'une modification de la pharmacocintique du diazepam. Rfrences : 1- Riou B, Barriot P, Rimailho A, Baud FJ. Treatment of severe chloroquine poisoning. N Engl J Med 1988 ; 318:1-6. 2- Clemessy JL, Taboulet P, Hoffman JR, Hantson P, Barriot P, Bismuth C, Baud FJ. Treatment of acute chloroquine poisoning: a 5-year experience. Crii Care Med 1996; 24: 1189-1195. 3- Liu L, Katz Y, Wiezman R, Rosenberg B, Pasternak GW, Gavish M. Interactions of chloroquine with benzodiazepine, gamma-aminobutyric acid and opiate receptors. Biochem Pharmacol 1991 ; 41: 1534-1536.

Intoxications par benzodiazepines : analyse de 4078 casF. FLESCH"*. A. JAEGER , M.L. HARLAY , B. LATRECH , P. SAUDER(2) (I) (2) (2)

(1) Centre Antipoison - Hpitaux Universitaires de Strasbourg - 67091 Strasbourg Cedex. (2) Service de Ranimation Mdicale et Urgences Mdicales - Hpitaux Universitaires de Strasbourg 67091 Strasbourg Cedex. Objectif : Analyser sur 13 ans, l'volution des intoxications par benzodiazepines : molcules ingres, traitements effectus, dures d'hospitalisation, volutions. Matriel et mthode : - analyse rtrospective de 4078 cas d'intoxications par benzodiazepines observs dans un service de ranimation et urgences mdicales. - utilisation d'un logiciel SIMA (systme d'information mdico-administratif) qui a permis la gnration de questionnaires personnaliss, la saisie des donnes, l'dition de lettres type et l'interrogation multicritres. Rsultats : De 1987 1999, 9367 patients ont t hospitaliss dans le service pour intoxication mdicamenteuse volontaire. 7067 patients, soit 75 %, avaient pris au moins un mdicament type benzodiazepine. Dans 1626 cas la benzodiazepine tait associe un autre psychotrope (antidpresseur, neuroleptique...) et dans 1157 cas elle tait associe un autre mdicament, non psychotrope. Dans 4078 cas, la benzodiazepine tait la seule molcule ingre et dans 1368 cas on notait une prise

L'hypothse d'une tolrance aigu au diazepam lors d'intoxication aigu la chloroquine n'a pas t jusqu ' prsent lucide par les donnes exprimentales. La chloroquine dose supra-thrapeutique possde

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concomitante d'alcool. Depuis 1987 le bromazpam totalise, par an, le plus grand nombre de cas d'intoxications. Pour l'alprazolam la frquence des intoxications a augment progressivement depuis 13 ans ce qui place, en 1999, cette molcule en 2 position, aprs le bromazpam. Bien que depuis 1994, les traitements (lavage gastrique, charbon activ, flumaznil) soient devenus exceptionnels, il n 'a pas t not d'augmentation de la dure moyenne de sjour. 4 patients sont dcds dont 3, gs de plus de 50 ans, de complications pulmonaires. Conclusion : Les intoxications par benzodiazepines seules reprsentent 44 % des intoxications mdicamenteuses volontaires. Il s'agit d'intoxications gnralement bnignes ne ncessitant aucun traitement particulier, hormis, ventuellement, une surveillance de courte dure. Les sujets gs restent nanmoins une population risques, et des complications rarissimes, mais pouvant mettre en jeu le pronostic vital, sont l'inhalation bronchique et l'embolie pulmonaire. Rfrences : 1- Billy F., Montaz L., Perault M.C., Vandel B., Etude des intoxications mdicamenteuses volontaires reues dans une unit d'accueil des urgences. Thrapie 1998 ; 53 : 553-8.me

Centre antipoison de 1995 1999. Dans 89 cas, les molcules ont t identifies par CLHP/DBD ou CPG/SM. Rsultats : Entre 1995 et 1999, 67353 cas d'intoxications ou de surdosages mdicamenteux ont t rapports au centre antipoison de Lille. Une ou plusieurs benzodiazepines taient suspectes dans 18 819 cas, avec une volution fatale dans 157 de ces 18 819 cas. Le dcs tait survenu l'hpital dans 23 cas, au domicile dans 134 cas. L'analyse des circonstances retrouvait une tentative d'autolyse dans 111 cas, une toxicomanie dans 40 cas, 3 cas de tentative d'empoisonnement et dans 3 cas une erreur thrapeutique (non respect des contre indications). L'ge moyen tait de 40 ans (extrmes 14-88) avec un cart type de 16 ans. Le sexe ratio montrait une prdominance masculine avec 92 hommes pour 65 femmes. La rpartition des produits consomms tait la suivante :Benzodiazepine seule (dont alprazolam 1, lorazpam 1, oxazepam 1, nordiazpam 1) ou associe une autre benzodiazepine Benzodiazepine associe uniquement une prise d'alcool 8 cas 9 cas

Association de 1 ou plusieurs mdicaments avec les benzodiazepines (dont prsence d'antidpresseurs : 89 cas 32 fois parmi lesquels des tricycliques 16 fois) (avec prsence de carbamates 9 fois, de cardiotropes 6 fois) Association de 1 ou plusieurs stupfiants avec les benzodiazepines (cannabis 5 fois, cocane 4 fois, hrone 14 fois, buprnorphine 9 fois, methadone 13 fois) Association de benzodiazepines avec des mdicaments et des stupfiants (avec prsence de methadone 2 fois et de buprnorphine 4 fois) 38 cas

2- Buckley N.A., Dawson H.A., Whyte I.M., Oconnel D.L., Relative toxicity of benzodiazepines in overdose. B.M.J. 1995 ; 310 : 219-21. 3- Gaudreault P., Guay J., Thivierge R., Verdy I., Benzodiazepine Poisoning. Clinical and Pharmocological considerations and treatment. Drug Safety 1991 ; 6 : 247-65.

13 cas

Intoxications par des benzodiazepines : revue des 157 dcs survenus dans le nord de la France au cours des 5 dernires annesP. N I S S E . M . DEVEAUX >, J.C. L I N K E , M . H . G H Y S E L , D . P E U C E L L E , M.MATHIEUNOLF(3) (,) (1) (2 (1)

(1) Centre antipoison de Lille (2) Institut de Mdecine Lgale - CHRU de Lille (3) Laboratoire de police scientifique de Lille Objectifs : Analyse descriptive des dcs incriminant la prise de benzodiazepines notifis au Centre antipoison de Lille pendant cinq ans. Patients et mthodes : Nous avons tudi rtrospectivement les cas d'intoxication par ingestion de benzodiazepines et molcules apparentes, avec une volution fatale, signals au

Le dosage a t effectu 80 fois. Un dpassement des taux plasmatiques toxiques habituels tait constat 46 fois, notamment pour les molcules suivantes (avec le taux maximal mesur): alprazolam (1,5 pg/ml), bromazpam (4 pg/ml), clonazepam (0,256 pg/ml), clorazpate (2962 pg/ml), diazepam (7,5 pg/ml), flunitrazpam (0,231 pg/ml), lorazpam (14,1 pg/ml), nordiazpam (6,5 pg/ml), oxazepam (1790 fig/ml), tmazpam (1,6 pg/ml), zopiclone (11,7 pg/ml), Zolpidem (1,5 pg/ml). L'alcoolmie a t dose 44 fois. Conclusions : Mme si les intoxications aigus par les benzodiazepines sont frquentes, la survenue d'un dcs au dcours de l'intoxication reste rare (0,8 % des cas dans notre exprience). Cependant si la prise concomitante d'alcool, de mdicaments psychotropes ou de stupfiants opiodes lors d'une intoxication volontaire par des benzodiazepines est un critre de gravit ne pas mconnatre dans l'valuation initiale, le risque mortel li la prise isole de benzodiazepines ne doit pas tre minimis (8 dcs sur 157 cas dans cette tude).

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Benzodiazepines : choix et stratgies analytiquesN. J O U R D I L Laboratoire de Pharmacologie CHU Grenoble - BP 217 G R E N O B L E Cedex France Objectif : Quels choix de techniques s'offrent au biologiste face une demande de "recherche de benzodiazepines" ? Quelle stratgie analytique adopter selon que la recherche est globale ou cible ? Autant d'orientations dictes par la nature chimique des 35 molcules qui composent la famille et les limites des diffrentes techniques utilises. L'accent est mis sur les acquis analytiques des 15 dernires annes. Matriel et mthode : La recherche et la mesure des benzodiazepines ont fait l'objet d'un nombre impressionnant de travaux qui attestent de l'intrt port cette famille depuis 40 ans (1re benzodiazepine commercialise en 1960) (1,2,3). La dmarche analytique de recherche et dosage des benzodiazepines se droule en trois tapes : Tout d'abord le dpistage par des mthodes immunochimiques suivi de l'identification puis de la quantification par technique chromatographique. Les performances des principaux tests immunochimiques sont compares. Pour les techniques chromatographiques potentiellement ralisables, le bilan est dress sur les diffrents choix pranalytiques prendre en considration selon le milieu biologique et la nature chimique du compos (hydrolyse, extraction, drivation) (2,3) ainsi que sur les principaux choix technologiques offerts en fonction de la sparation et de la nature du dtecteur. Rsultats : 1. Les tests immunochimiques de dpistage des benzodiazepines (au temps de rponse immdiat) (1) possdent une bonne spcificit vis vis de la famille chimique, mais un degr de reconnaissance diffrent selon la molcule et la nature de l'anticorps. 2. Les techniques chromatographiques (au temps de rponse diffr) n'ont cess d'voluer. Leur mise en oeuvre reste lourde comparativement aux tests immunochimiques. Les limites de dtection varient de 0,2 2 ng/ml pour les techniques CPG-ECD, CPG-SM-1CN, CLHP-SM, CLHP-SM-SM 10 - 20 ng/ml pour les techniques CPG-NPD, CLHP-UV, CLHP-DAD, voire plus pour la EC-SM. L'ouverture de la CLHP l'ensemble des benzodiazepines et leurs drivs polaires, sans distinction de structure chimique, sans tape prliminaire de drivation, avec des limites de dtection en CLHP-ES-SM suffisantes pour accder aux taux circulants des benzodiazepines les plus faiblement doses, prche en faveur de la CLHP-SM pour quantifier les benzodiazepines. De plus, la cration progressive de bibliothques en CLHP-SM devrait largir les possibilits de screening dans ce domaine.

Conclusion : Actuellement, si la recherche de benzodiazepines peut s'appuyer directement sur des tests immunochimiques, l'identification et la mesure des concentrations fait appel d'autres technologies. Il est aujourd'hui ncessaire d'associer plusieurs mthodes analytiques pour raliser une dtection exhaustive. Ce bilan devrait permettre d'acclrer la dmarche du biologiste face un choix technologique et lui rappeler les limites des mthodes qu 'il a slectionnes. Rfrences : J- Drummer O.H., Methods for the measurement of benzodiazepines in biological samples. J. Chromatogr. B. 1998 ; 713 : 201-225. 2- Maurer H.H., Liquid chromatography-mass spectrometry in forensic and clinical toxicology. J. Chromatogr. B. 1998 ; 713 : 3-25. 3- Segura J., Ventura R., Jurado C, Derivatization procedures for gas chromatographic-mass spectromtrie determination of xenobiotics in biological samples, with special attention to drugs of abuse and doping agents. J. Chromatogr. B. 1998 ; 713 : 61-90.

Mthode sensible de dpistage des benzodiazepines actyles par CPG/SM (*)D. BORREY . E. MEYER , W. L A M B E R T , S. VAN CALENBERGH , C. VAN PETEGHEM , A. P E LEENHEER(3) (I) (1) (1) (2) 0

(1) Laboratoire de Toxicologie, Universiteit Gent, Harelbekestraat 72, B-9000 Gent, Belgium (2) Laboratoire de Physiologie, Biochimie et Biomtrie, Universiteit Gent, Salisburylaan 133, B9820 Merelbeke, Belgium (3) Laboratoire de Chimie Mdicinale, Universiteit Gent, Harelbekestraat 72, B-9000 Gent, Belgium Objectif : Les benzodiazepines prsentent une activit hypnotique, sdative et anxiolytique et sont frquemment retrouves dans les cas de toxicologie clinique et mdico-lgale. L'objectif de cette tude a t d'tablir une nouvelle mthode, CPG / SM, de dpistage des benzodiazepines les plus frquemment prescrites, particulirement celles qui sont administres des doses faibles. Nous dcrivons une mthode permettant le dpistage simultan des composs principaux et leurs plus importants metabolites entre autres : alprazolam, a0H-alprazolam, flunitrazpam, 7-NH -flunitrazpam, flurazpam, N-dsalkylflurazpam, ktazolam, oxazepam, lorazpam, triazolam et a-OH-triazolam. Matriel et mthode : L'appareillage utilis est constitu d'une CPG HP 6890 munie d'un injecteur automatique et couple un dtecteur de masse filtre quadrupolaire HP 5973. L'injection est effectue en mode on-column pour am2

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liorer la sensibilit avec le programme de temprature suivant : T = 65 C pendant 1 min, rampe de 20 C/min, Tj=250 C durant 8 min, rampe de 10 C/min, T =300 C durant 2 min. La colonne capillaire est de type SGE-BP1(30 m, D.I. 0.25 mm, 0.25 pm d'paisseur de film) couple une prcolonne de type Restek hydroguard (5 m, D.I. 0.32 mm). Les extractions sont ralises en utilisant des cartouches d'extraction type PH, 100 mg/lml, Varan. Rsultats : Les benzodiazepines polaires ncessitent une drivation avant l'analyse par CPG, Trimthylsilylation et alkylation sont les techniques principalement dcrites. Seule V actylation par ajout de pyridine et d'anhydride actique (1/1 V/V, 20 min 18 C) permet le dpistage de toutes les benzodiazepines slectionnes avec une sensibilit satisfaisante. Les composs thermolabiles oxazepam et lorazpam sont bis-actyls et les drivs ne subissent pas de dcomposition au cours du processus chromatographique. La courbe est linaire de 0.1 5.0 ng/pl en mode SIM et de 2.5 30 ng/pl en mode SCAN avec un coefficient de corrlation toujours suprieur 0.995. Les coefficients de variation des tudes de rptabilit et de reproductibilit varient de 1.1 4.9 %. La mthode peut tre applique aussi 15 autres benzodiazepines administres des doses plus leves que celles initialement slectionnes. Conclusion : Une mthode sensible qui permet la recherche des benzodiazepines, qui varient considrablement de polarit, a t dveloppe. Les drivs obtenus sont stables pendant 4 journes au moins permettant l'application de la mthode en routine. Rfrences : 1- Valentine J.L., Middleton R., Sparks C. Identification of urinary benzodiazepines and their metabolites : comparison of automated HPLC and GC-MS after immunoassay screening of clinical specimens. J. Anal. Toxicol., 1996 ; 20 : 416-424.0 2

2- Meatherall R. GC-MS confirmation of urinary benzodiazepine metabolites. J. Anal. Toxicol., 1994 ; 18 : 369-381. 3- W. Sadee and E. Van Der Kleijn, Thermolysis of 1,4benzodiazepines during gas chromatography and mass spectroscopy. J. Pharm. Sci., 1971 ; 60 : 135-137. * Prsentation faite en anglais

Extraction automatise du flunitrazpam, 7-amino-flunitrazpam, desmthyl-flunitrazpam et 3-hydroxy-flunitrazpam. Dosages urinaires par CLHP-ES-SMN. JOURDIL. J. BESSARD, F. VINCENT, H. EYSSERIC, G. B E S S A R D Laboratoire de Pharmacologie CHU Grenoble-BP 217 G R E N O B L E Cedex France

Objectif : Il est trs difficile d'affirmer la consommation de flunitrazpam de par les faibles doses ingres (0.5-2 mg), les taux circulants particulirement bas et la faible reconnaissance de cette benzodiazepine par les tests immunochimiques classiques. De plus, bien que peu toxique, il est utile de rappeler la place part qu'occupe le flunitrazpam dans les toxicomanies et conduites dlictueuses de soumission chimique. Les auteurs proposent une technique automatise d'extraction de la molcule et de ses principaux metabolites dans les urines suivie de leur identification et quantification. Matriel et mthode : L'extraction est ralise l'aide d'un automate Aspee XL de Gilson sur cartouches SPE phase mixte Isolute Confirm-HCX 3ml. La sparation chromatographique est ralise sur colonne Nova-Pak Cl8 4 pm, 2 x 150 mm. La phase mobile se compose d'un mlange 55/45 de phase A (eau-actonitrile 90/10) et phase B (methanol) dlivr en mode isocratique (dbit 150 pl/mn). Les micro-pompes et l'injecteur automatique sont de marque Perkin-Elmer, srie 200. La dtection est ralise par spectromtrie de masse l'aide d'un appareil API 150 EX de Sciex. La source d'ionisation est de type Electrospray, utilise en mode positif et puis. La quantification est ralise en mode fragmentomtrique. Les ions permettant la quantification et la qualification sont : flunitrazpam 314,2 (268,2), flunitrazpam d7 321.2 (275,2), 7-amino-flunitrazpam 284,1 (227,1), 7amino-flunitrazpam d7 291,3 (244,1), desmthyl-flunitrazpam 300,2 (253,9), desmthyl-flunitrazpam d4 304.3 (257,9) et 3-hydroxy-flunitrazpam 330,2 (284,0). Rsultats : La mthode dcrite rvle de bonnes caractristiques analytiques : - Rendements d'extraction compris entre 81 et 100 %, - Linarits jusqu' 100 ng/ml pour l'ensemble des composs, - Rptabilits et reproductibilits comprises entre 0,83 et 7,84 % pour le flunitrazpam, le 7amino- flunitrazpam et le desmthyl-flunitrazpam, entre 5,05 et 13,81 % pour le 3-hydroxy-flunitrazpam, - Limites de quantification : 0,05 ng/ml pour le flunitrazpam et le 7-amino-flunitrazpam, 0,1 ng/ml pour le desmthyl-flunitrazpam, 0,4 ng/ml pour le 3hydroxy-flunitrazpam, - Limites de sensibilit : 0,025 ng/ml pour le flunitrazpam et le 7-amino-flunitrazpam, 0,04 ng/ml pour le desmthyl-flunitrazpam, 0,2 ng/ml pour le 3-hydroxyflunitrazpam. La technique a t transpose avec succs dans le plasma et applique essentiellement sur des prlvements de patients toxicomanes. Conclusion : L'extraction SPE automatise conduit d'excellents rendements (1). La CLHP-ES-SM s'avre tre une technique trs sensible et slective pour la dtermina-

is


tion du flunitrazpam et de ses metabolites dans les milieux biologiques (2). Elle a pu notamment rvler un cas de soumission chimique. Des investigations complmentaires sont en cours pour tendre son application d'autres benzodiazepines. Rfrences : 1- Deinl L, Mahr G., Von Meyer L., Determination of flunitrazpam and its main metabolites in serum and urine by HPLC after mixed-mode solid-phase extraction. J. Anal. Tox. 1998 ; 22 :197-202. 2- Bogusz M. J., Maier R.D., Krger K.D., Fruchnicht W., Determination of flunitrazpam and its metabolites in blood by high-performance liquid chromtographyatmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry. J. Chromatogr. B . 1998 ; 713 : 361-369.

Soumission chimique : hypothses neurobiologiquesM. M A L L A R E T CEIP, Laboratoire de Pharmacologie, CHU, 38043 Grenoble cedex 09 La soumission chimique incluant toutes les substances psychoactives (mdicamenteuses et toxiques) est un concept rcent, mme si l'usage criminel de substances psychoactives (alcool thylique, par exemple) est connu depuis fort longtemps. Auparavant sous-estime par le monde mdical, la soumission chimique fait l'objet de nombreuses informations auprs du grand public ; elle induit des inquitudes souvent justifies, et donne lieu de grandes campagnes de prvention, en particulier aux Etats-Unis. La grande diversit des substances concernes, l'absence de certitudes sur les mcanismes physiopathologiques, la crainte d'une dclaration abusive de soumission chimique et la multiplicit des intervenants devant collaborer ont ralenti le processus de notification et d'exploration de ce syndrome. Objectifs : Emettre des hypothses sur les mcanismes neurobiologiques mis en jeu dans le syndrome de la soumission chimique (en excluant les aspects "purement" psychologiques, psychanalytiques et sociologiques) devrait permettre de prciser le mode d'action des substances psychoactives dans la gense de ces troubles. Matriel et mthode : Cette valuation est base sur les donnes de la littrature. Rsultats : La soumission chimique fait intervenir l'agresseur, la victime et la substance psychoactive. L'agresseur peut ventuellement "crer" un environnement psychologique favorable son acte. Sous l'effet chimique, les diffrentes capacits cognitives de la victime (sa mmoire, ses capacits d'veil, d'attention et de rponse une agression) vont tre perturbes. L'implication de neuromdiateurs comme le GABA, le glutamate et Vacetyl choline, semble prdominante dans le fonctionnement cognitifde l'individu et dans les phnomnes de 120

soumission chimique. Les tudes fonctionnelles (IRM fonctionnelles,...) du comportement humain devraient, dans l'avenir, prciser l'effet des substances psychoactives. Les donnes sur les mcanismes d'action de substances aussi diffrentes que l'alcool thylique, les benzodiazepines (flunitrazpam,...), les antagonistes du NMD A (ktamine, gammahydroxybutyrate de sodium, phencyclidine), les anticholinergiques (atropine, datura) permettent d'expliquer la similitude de certains effets pouvant favoriser une soumission chimique, mais aussi les diffrences smiologiques (les diffrences pharmacocintiques seront abordes par un autre orateur). Les altrations mnsiques induites par les diffrentes substances chimiques sont les mieux explores. L'alcool thylique, en dehors de sa toxicit chronique, a des effets amnsiants (troubles du rappel), en raison de son action sur le rcepteur au GABA et aux benzodiazepines. Parmi les cinq formes de mmoire faisant l'objet d'un consensus scientifique (mmoire de travail, mmoire pisodique, mmoire smantique, mmoire procdurale, et phnomnes d'amorage perceptif), les benzodiazepines altrent essentiellement la mmoire pisodique et l'amorage perceptif. Des diffrences d'effets peuvent exister parmi des mdicaments de mme classe : si le diazepam et le lorazpam altrent tous les deux la mmoire pisodique, le lorazpam perturbe seul l'amorage perceptif. Les effets amnsiants de la ktamine ont t prciss. Les troubles de l'attention expliquent d'autres aspects de la soumission chimique. Les consquences intracellulaires (gniques et protiques) sont, en revanche, encore hypothtiques. Conclusion : La soumission chimique est un syndrome complexe, interaction entre un agresseur, une victime de cet acte criminel, et des substances psychoactives trs diverses ayant en commun des proprits amnsiantes et sdatives. Outre l'indispensable rpression de cet acte, il faut prvenir ce syndrome en informant les nombreux intervenants concerns, les victimes potentielles mais aussi en augmentant le contrle des substances risque et le dveloppement de substances (au potentiel thrapeutique conserv) dnues de ce risque devenu inacceptable.

La soumission chimique. Aspects analytiques et expertises mdico-lgalesR KINTZ Institut de Mdecine Lgale, 11, rue Humann, 67085 Strasbourg Objectif : La soumission chimique peut tre dfinie comme l'administration de substances psycho-actives une personne des fins dlictueuses ou criminelles. A l'occasion de cette confrence, l'auteur fera, partir de son exprience d'expert judiciaire une synthse sur les circonstances des agressions, les produits utiliss, les pr-

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lvements effectuer sur les victimes et les aspects analytiques les plus performants. Matriel et mthode : Les dossiers d'expertises judiciaires effectues depuis 1990 l'Institut de Mdecine lgale de Strasbourg ont t revus pour en extraire les informations les plus significatives en terme de moyen d'introduction du produit dans l'organisme, d'identit chimique du produit, d'intrt du recueil de diffrents prlvements biologiques et de difficults analytiques. Rsultats : Les femmes, les enfants et les personnes ges apparaissent comme les victimes les plus usuelles. L'empoisonnement par un membre de la famille est frquent chez les enfants (pour obtenir une sedation, soit vise pdophile, soit simplement pour "avoir la paix") et les personnes ges (pour dtourner leur vigilance). Ces cas reprsentent moins de 10 % de nos observations. La majorit des observations concernent des filles jeunes, qui leur agresseur administre une substance afin de diminuer leur rsistance l'acte sexuel. Les produits sont majoritairement incorpors dans des boissons, essentiellement le caf ou les prparations alcoolises. Les aliments, comme les ptisseries sont peu utiliss. Le Zolpidem est le compos le plus frquemment rencontr, suivi par les benzodiazepines (lorazpam, bromazpam, flunitrazpam ...), les neuroleptiques (halopridol, promethazine ...) et les produits stupfiants (cannabis, MDMA, LSD, ktamine ...). Le GHB n'a pas encore t observ. Trs (trop) souvent, il n'y a pas eu de prlvement biologique effectu lors de la prise en charge et l'expert doit alors travailler sur dossier, ce qui peut tre trs difficile. Idalement, l'analyse toxicologique devrait s'appuyer sur du sang, des urines et des cheveux, en proscrivant l'immuno-chimie et en faisant des couplages la spectromtrie de masse, la rgle absolue. Conclusion : Chaque cas de soumission chimique (relevant des assises) doit tre document au mieux, mais le diagnostic toxicologique est difficile. Souvent, les produits utiliss ont des demi-vies courtes, les concentrations circulantes sont faibles, les prlvements sont tardifs et les laboratoires d'analyse sont sous-quips. Il conviendrait, pour ce domaine spcifique, de n'accrditer que quelques laboratoires sur le territoire national.

Soumission mdicamenteuse : analyse d'une srie de rsultats toxicologiques urinairesF. QUESTED '. O. DIAMANT-BHRGER , G. LAGJJER , (1) Urgences mdico-judiciaires, Htel-Dieu - Paris. France (2) Centre Rgional de pharmacovigilance. Hpital Fernand Widal - PARIS - France12 (I) (2)

Objectifs : Analyse des rsultats toxicologiques urinaires provenant des observations de "soumissions mdicamenteuses" notifies ou centre rgional de pharmacovigilance de l'Hpital Fernand-Widal durant l'anne 1999. Matriel et mthodes : 54 chantillons urinaires de victimes "drogues" leur insu, examines pour 70 % d'entre elles aux Urgences Mdico-Judiciaires de l'Htel Dieu de Paris, ont t analyss simultanment en immunochimie et en chromatographie gazeuse couple la spectromtrie de masse (CG/SM). La sensibilit et la spcificit des deux techniques sont compares. Leur intrt respectif d'un point de vue mdico-judiciaire est discut. Rsultats : Les analyses toxicologiques urinaires ont t pratiques en moyenne 23 heures aprs l'ingestion (2h - 4J). Les benzodiazepines sont trs majoritairement retrouves (48 dossiers/54 soit 87 % des dossiers). La chromatographie gazeuse couple la spectromtrie de masse (CG/SM) a permis leur identification prcise dans 1/3 des cas (13 dossiers/48) et la dtection de metabolites communs (35 dossiers/48). Pratiquement toutes les benzodiazepines sont reprsentes (bromazpam, clorazpate, diazepam, lorazpam, clobazam, flunitrazpam, oxazepam). D'autres psychotropes sont plus rarement incrimins (anti-histaminiques (5 dossiers), phnothiazines (1 dossier), gamma-hydroxybutyrate ( 1 dossier)). Dans 7 dossiers, des molcules passes inaperues en immunochimie ont pu tre dtectes dans les urines grce aux techniques chromatographiques (hydroxizine (3 dossiers), Doxy lamine (2 dossiers), clobazam (1 dossier), acpromazine (1 dossier). L'association l'alcool est retrouve dans 1 dossier sur 4. Conclusion : l'administration de psychotropes l'insu d'une victime des fins dlictueuses (vol) ou criminelles (agression sexuelle) est un mode d'agression mconnu du corps mdical. Les produits sont incorpors majoritairement dans des boissons, plus rarement dans des aliments (bonbons, ptisseries). L'ampleur du phnomne est probablement sous-estime. La mise en place d'un systme efficace de recensement des cas est ncessaire. Les produits utiliss retrouvs dans notre srie sont majoritairement des benzodiazepines, mais d'autres produits psychotropes peuvent tre en cause. Leur identification prcise est un lment de preuve indispensable l'enqute judiciaire. La prise en charge efficace des victimes suppose la reconnaissance du tableau clinique, des prlvements biologiques prcoces et le recours des techniques analytiques chromatographiques plus sensibles et plus spcifiques que les techniques immunochimiques. Celles-ci restent nanmoins des examens de dpistage indispensables. L'identification de laboratoires quips parat souhaitable (1). Rfrences : 1- LagierG, Questel F., Elkharrat D., Diamant-Berger 121


O., Prise en charge des victimes drogues leur insu. Mdecine Lgale Hospitalire 1999 ; 2 (6) : 113-114.

A propos de deux cas d'utilisation originale de la soumission chimiqueG. PEPIN. Y. G A I L L A R D Laboratoire d'Expertises TOXLAB, 18 rue Andr Del Sarte, 75018 Paris Objectifs : La soumission chimique a des aspects inattendus ; dans certains cas, les agresseurs peuvent en vivre pendant des annes, dans d'autres cas la police peut y avoir recours en vue de sauver de nombreuses vies. Le laboratoire d'expertises judiciaires en toxicologie doit pouvoir utiliser des mthodes ddies sophistiques afin de rpondre aux exigences de la sensibilit et de la spcificit requises dans le cadre d'affaires judiciaires. Seules ces mthodes, parfois, permettent d'clairer la ralit des faits. Matriel et mthode : Dans les deux affaires prsentes, nous avons utilis la CPG couple la spectromtrie de masse tandem en ionisation chimique ngative ainsi que la CLHP couple la spectromtrie de masse. C'est cette condition seule que nous avons t mme de rsoudre les deux cas suivants. Rsultats : Premier cas : Un homme d'une cinquantaine d'annes est retrouv mort d'hypothermie, en hiver, sous une porte cochre, sans veste, par une nuit trs froide. Il a absorb la veille au soir, une bire dans un bar voisin en compagnie d'un autre homme. L'enqute montre que la carte bancaire de la victime a t utilise aprs le dcs. L'analyse toxicologique rvle la prsence dans les urines de la victime de midazolam 15 ng/ml, administr par le SAMU. Il a aussi t relev une concentration de 13 pg/ml de 7-aminoflunitrazpam. L'auteur interpell avouera ultrieurement avoir ajout un comprim de Rohypnol dans la bire de sa victime. C'tait sa quarantime victime depuis environ 10 ans. Celui-ci en vivait mais, a-t-il dit, c'tait le premier cas de dcs parmi ses "clients ". Deuxime cas : le 15 mai 1993, dans une affaire clbre, le preneur d'otage de l'cole maternelle de Neuilly a t tu par les forces de l'ordre. Une tentative de neutralisation au moyen d'une tasse de caf prpare ( la demande des autorits de police) par un mdecin et contenant du Gamma-OH et de l'Hypnovel avait t entreprise. L'infirmire qui a propos ce caf au preneur d'otages avouera que ce dernier a commenc le boire puis l'a recrach, pressentant manifestement une action de ce genre. Afin de prouver l'opinion publique, que le preneur d'otage n 'avait pas t tu alors qu 'il tait dj hors de combat, une analyse toxicologique a t mene afin de vrifier l'absence d'incapacitant dans le sang du criminel.

Les analyses effectues montrrent un taux physiologique de GHB infrieurs 2 pg/ml par CPG-SM et l'absence de midazolam par CLHP-SM (< 0,1 ng/ml). Conclusions : La varit des produits utiliss, leur demi-vie parfois courte et pour certains, leur rapidit de dgradation aprs prlvement, mais aussi le dlai parfois long entre l'administration et l'chantillonnage, obligent l'analyste d'avoir recours des mthodes ddies, trs sensibles telles que la CPG-SM-SM ou la CLHP-SM.

La soumission chimique : de la difficult d'apprhender l'tendue du phnomne.M.H. GHYSEL. O. SALVADORE, F. DESCAMPS, S. BOUDJADA, A. COUVREUR Laboratoire de police scientifique - 7 Boulevard Vauban 59800 - Lille France Objectif : Quoi de plus sduisant pour un criminel que de commettre son forfait l'insu de tous, sur une victime aractive, soumise, conciliante voire cooprante. Des produits psychotropes ont t utiliss pour mettre les individus dans ces tats ; nous avons essay d'valuer l'tendue du phnomne en France. Matriel et mthode : Nous nous sommes rapprochs des services de police afin de connatre le nombre de cas de soumission chimique enregistrs. Puis nous avons recens les affaires que nous avions eues traiter au sein du LPS de Lille. Rsultats : Les services de police, interrogs sur le nombre de cas de soumission chimique constats, ne pouvaient pas citer de chiffre prcis. Pour notre part, les analyses aux fins de recherche de soumission chimique ont reprsent 5 cas pour les 10 premiers mois de l'anne 2000. Ces cas ainsi que 2 cas plus anciens, particulirement marquants vont tre prsents. 1- En 1984, un jeune enfant recevait journellement de sa mre des doses de phnothiazines et de mprobamatepour tre "tranquille". L'enfant est dcd. Un mois plus tard, le corps a t exhum. De la lvompromazine, de la primtazine, du mprobamate ont t retrouvs dans les prlvements de foie, poumons et intestin raliss l'autopsie. 2- En 1993, dans un caf, une jeune femme veut voler l'argent d'un transporteur routier. Pour l'endormir, elle introduit des comprims de Tranxne dans sa bire. Le camionneur, qui avait gar son vhicule prs du canal, est retrouv noy. Du nordiazpam a t retrouv dans les cannettes de bire et de Voxazepam dans les urines de la victime. 3- Aprs avoir consomm des cocktails dans un bar, deux jeunes femmes se retrouvent sans force ni nergie, et finalement se rveillent le lendemain dans leur appartement, sans aucun souvenir de ce qui s'est pass. Il n'a pas t retrouv de traces de mdicaments ni de GHB dans les

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prlvements de sang et d'urines effectus 48 heures plus tard. 4- Dans le verre d'une femme qui consommait du ros avec des "amis ", a t introduit du Tranxne. La victime s'est endormie et a t viole. Conduite rapidement l'hpital, un prlvement de sang a t effectu. L'alcoolmie tait de 2,87 g/l, le taux sanguin de nordiazpam de 368 ng/ml. 5- Une femme a t enleve Bruxelles et retrouve deux jours plus tard Amiens. Elle ne se souvient de rien. A part du paracetamol, il n'a pas t retrouv de produits mdicamenteux ou toxiques dans ses urines. 6- Le lendemain d'une soire qu 'elle organisait son domicile, une femme, consommatrice de cannabis, se retrouve dans son lit, pensant avoir t viole. Elle porte plainte. Des prlvements de sang et d'urines sont raliss deux jours aprs les faits. Du THC-COOH et du paracetamol ont t retrouvs dans ses urines. Il n'a pas t retrouv d'autres produits toxiques ou mdicamenteux. 7- L'analyse du contenu d'une bouteille d'eau minrale utilise par un cambrioleur a montr la prsence de Zolpidem dans le liquide. Les techniques analytiques utilises seront prsentes. Conclusion : Ces quelques cas cits montrent la varit des formes que peut prendre la soumission chimique. La preuve scientifique de la soumission n 'est pas toujours faite et c'est plus les dclarations des victimes qu'il faut considrer. Avec le dveloppement des saisies informatiques des procdures, ces informations devraient prochainement tre mieux connues. Cependant, la preuve scientifique de la soumission n 'est pas souvent facile raliser par les toxicologues devant travailler sur des prlvements effectus parfois trop longtemps aprs les faits et pas toujours bien conservs.

ngatifs a permis de dgager les concentrations physiologiques dans cette matrice. Une patiente ayant reu une dose de 60 mg/kg de GHB a t tudie ainsi qu 'un consommateur rgulier de cette molcule. Rsultats : Chez les personnes vivantes, les concentrations physiologiques pouvant aller jusqu' 2 pg/ml dans le sang et 10 pg/ml dans les urines ont t releves (3). Les urines permettent d'authentifier la prise chez le cadavre, des concentrations dans le sang allant jusqu ' 15 pg/ml ont t enregistres sans qu 'il y ait eu consommation. Dans les cheveux de tmoins ngatifs, le taux moyen mesur tait de 0,84 ng/mg (extrmes de 0,41 1,79 ng/mg) avec la rpartition suivante selon la coloration : 0,60 ng/mg (valeur moyenne) pour les cheveux blonds (n = 12) ; 0,90 ng/mg pour les cheveux chtains (n = 30) et 0,90 ng/mg pour les cheveux bruns (n = 19). Le taux toute teinte de cheveux confondue, pour lequel on peut tablir un seuil de positivit correspond 1,6 ng/mg que nous proposerons 2 ng/mg. Chez une personne consommant rgulirement du GHB dans un but addictif, des concentrations allant jusqu' 14 ng/mg ont t mesures. Chez une personne ayant reu une fois du GHB dans le cadre d'une anesthsie, les concentrations dans ses cheveux avant et aprs l'opration taient de 0,57 et 0,88 ng/mg respectivement. Conclusions :Matrice Sang Urine Cheveux Physiologique 300 >300 62,8 53,4 50,7 Arsenic unitaire 12879 3818 1952 2818 1486 1544 (fig/l)

(m'i)Fentanyl Cyaminazine, Oxazepam Nordazpam Diazepam Buprnorphine Norbuprnorphine ND : Non Detect 33 100 974 69 ND ND 0,8

+ND ND ND ND ND ND

Discussion : La concentration sanguine de fentanyl est compatible avec la survenue d'effets toxiques ltaux dans un tel contexte (1, 2). La prsence concomitante de buprnorphine, de benzodiazepines, voire de cyammazine, n'a pu qu'accrotre l'effet dpresseur respiratoire du fentanyl. La prsence de fentanyl dans les seringues ainsi que dans la cuillre laisse suggrer un dconditionnement de patch fins d'injection ; cette utilisation dtourne par voie parentrale vient se surajouter au surdosage d l'apposition simultane de 2 patchs de fort dosage sur le corps. Une quarantaine de cas de dcs ont t rapports dans la littrature (2,3). Conclusion : Cette intoxication mortelle par fentanyl (qui semble tre le troisime cas rapport d'usage dtourn pouvant tre rattach un dconditionnement suivi d'une administration parentrale de Durogsic) vient souligner la toxicomanie lie cette spcialit (3). Rfrences : 1- Jeal W., Benfield P., Transdermal fentanyl. A review of its pharmacological properties and therapeutic efficacy in pain control. Drugs 1997 ; 53 : 109-138. 2- Anderson D.T., Muto J.J., Duragesic transdermal patch: postmortem tissue distribution of fentanyl in 25 cases. J. Anal. Tox. 2000 ; 24 : 627-634. 3- Roberge R.J., Krenzelok E.P., Mrvos R, Transdermal drug delivery system exposure outcomes. J. Emerg. Med. 2000 ; 18 : 147-151.

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H 82 H130 H154 H178 H 202

32,3 24,7 < 20 60 %) sauf pour nouveau les 3 molcules ci-dessus et les valeurs de la fluoxetine sont fluctuantes selon les centres. Des rsultats comparables sont observs avec les autres extractions LS l'exception des cartouches Oasis MCX qui donnent des valeurs suprieures 50 % pour les 9 molcules dtectes. Discussion : Cette tude ponctuelle mene sur quelques molcules et sur un nombre d'essais par centre trs faible (1 3) montre une grande diversit de rsultats selon la prparation de l'chantillon. Cette disparit est peut-tre galement lie la diffrence d'approche analytique et laisse penser que les procdures de screening sont ingales selon les centres. Les extractions LL semblent mieux adaptes une recherche large que les extractions LS l'exception, peut-tre, des Oasis MCX . Estil possible d'envisager une standardisation unique pour l'extraction soit LL soit LS ?

(4) Laboratoire de Pharmacologie-Toxicologie, CH Le Havre 76083 (5) Laboratoire de Biochimie, Hpital Edouard Herriot Lyon 69437 Objectif: La rduction de la dure de prparation des chantillons, associe une amlioration de l'efficacit de l'extraction est une proccupation constante de la Toxicologie d'urgence. Dans cette optique, la commission de Toxicologie Hospitalire a men une tude sur la sonification applique l'extraction liquide-liquide. Matriel et mthodes : Un sonificateur syntonisation automatique Fisher Bioblock de 130 Watt et une microsonde de 3mm de diamtre ont t utiliss sur des volumes infrieurs 10ml dans des tubes borosilicats 16 x 100 mm. Les chantillons retenus sont des plasmas sanguins surchargs en fluoxetine et norfluoxtine, deux mlanges de 5 substances chacun (sol. A : Zolpidem, nordiazpam, cyammazine, alprazolam, hydroxyzine ; sol. B : amisulpride, propanolol, fluoxetine, clomipramine, miansrine) et des prlvements sanguins envoys pour une recherche toxicologique. La technique de comparaison est une extraction liquide-liquide mcanique (70 AR/min) utilisant les mmes solvants que ceux utiliss lors de la sonification. L'tude a t conduite en deux tapes : recherche des meilleures conditions d'utilisation puis comparaison des rsultats obtenus avec une extraction classique par agitation. Cinq centres ont test ce type d'extraction sur les diffrents types d'chantillons et plusieurs solvants (dichloromthane, hexane, chloroforme, chlorobutane). Rsultats : La hauteur d'immersion de la sonde s'est rvle un paramtre important dans l'efficacit de l'extraction et doit tre dtermine pour chaque type d'extraction. Il en est de mme pour l'amplitude de vibration et la dure d'agitation. La comparaison des rendements d'une extraction par sonification en moins de 10 secondes avec ceux de l'extraction mcanique en 15 minutes montre des rsultats similaires. Lors des essais de rptabilit, la dispersion des valeurs par sonification a t sensiblement le double de celles obtenues en extraction mcanique. Discussion : Les rendements obtenus sont diffrents selon le type de molcule. Une tude est en cours pour prciser le rle de la nature des molcules, des solvants et du tampon de pH utiliss. Ces premiers rsultats montrent l'intrt d'une mthode nouvelle sans consommable qui peut apporter une amlioration dans la prparation des chantillons et qui mrite une attention plus approfondie de la part de la communaut toxicologique.

Extraction liquide-liquide par sonificationP. LEVILLADSP. B. CAPOLAGHI . M. F. KER(l2)

GUERIS , C. LACROrX , M . MOULSMA(2) Laboratoire de Biochimie-Toxicologie, Bel-Air C H R Metz-Thionville 57100

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(1) Commission Toxicologie Hospitalire, SFTA Hpital

(3) Laboratoire de Pharmacologie-Toxicologie, Hotel Dieu Nantes 44035 132

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Recommandations pour la technique d'extraction des 1RS en toxicologie hospitalireD. L A M I A B L E . B. CAPOLAGHI , M.F. KERGUERIS , M. LAVIT ', J. ARPITI , C. LACROLX , M. MOULSMA , N. HOUPRET, C. CHARLIER , A. TURCANT(2) 2 (2) (2) (2) (2) 0 2) (2)

(1) Laboratoire de Pharmacologie et Toxicologie, CHU de Reims , (2) Commission de Toxicologie Hospitalire de la S.RT.A. Objectif : L'augmentation de la prescription des antidpresseurs inhibiteurs de la srotonine et la mise disposition des cliniciens d'un nombre croissant de spcialits vont de pair avec l'apparition de plus en plus frquente d'intoxications impliquant ces mdicaments. Ce fait n 'est pas sans crer quelques difficults en toxicologie hospitalire car il n'existe ni de technique rapide d'identification de ces molcules par mthode immunologique, comme c'est le cas pour les antidpresseurs tricycliques, ni de technique standardise. Trois tudes ponctuelles de qualit sur la fluoxetine, la paroxetine, le milnacipran, et ralises entre 10 laboratoires utilisant leurs procdures habituelles, ont montr une dispersion importante des rsultats (CV=40 %), et la ncessit d'une harmonisation de la technique d'extraction face l'imprcision des rsultats. Matriel et mthode : Une valuation interlaboratoires (n=10) de la mthode d'extraction retenue a t ralise et a permis de proposer le schma suivant avec comme talon interne le paramthylmilnacipran :SrumP E : 1ml A j o u t talon interne et N a O H 4 M Liquide/liquide

nique CLHP est de l'ordre de 15 % aux deux niveaux de concentrations et pour les 7 molcules. Une plus grande variabilit est observe pour l'ensemble des dosages raliss en phase gazeuse, un des centres ayant tendance surdoser et l'autre sousdoser. Conclusion : Cette tude illustre l'importance d'une standardisation des procdures pour les dosages de mdicaments par chromatographie et le rle indispensable d'un contrle de qualit pour la mise en place et le suivi de ces techniques.

Intoxication mortelle par le sulfure d'hydrogne : propos de deux casV.CIRIMELE . P.KINTZ >, C. P O C H E , M.VILL A I N , F. BILLAULI, G. PEPIN< , B.LUPES>0) 3) 0) (1 (2)

(1) Institut de Mdecine Lgale, 11, rue Humann, 67085 Strasbourg (2) Service de Biochimie, CH de Chambry, BP 1125, 73011 Chambry (3) Toxlab, 18, rue Andr P e l Sarte, 75018 Paris Objectifs : Le dosage des ions sulfures est gnralement ralis par ionomtrie mais la sensibilit de cette technique peut tre parfois insuffisante. Les mthodes de dosage par titration sont peu spcifiques et donc peu recommandables en toxicologie mdico-lgale. Le dosage par chromatographie en phase gazeuse couple un dtecteur capture d'lectrons ou de masse ncessite gnralement une prparation longue et fastidieuse (extraction, drivation complexe). Ce travail a pour objectif de dvelopper un procd rapide, sensible et spcifique pour le dosage directe du sulfure d'hydrogne dans le sang par le couplage espace de tte-chromatographie en phase gazeuse-spectromtrie de masse. Cette technique a t applique deux cas d'intoxication mortelle par sulfure d'hydrogne. Matriel et mthode : L'chantillon de sang (1 ml) est introduit dans un flacon en verre et hermtiquement scell. Aprs addition d'acide orthophosphorique concentr ( 1 ml), le flacon est incub 15 min 80 C dans un systme HS 40 (Perkin Elmer). Sous une pression d'hlium de 15 psi, un aliquot de la phase vapeur est transfr au systme chromatographique (Hewlett Packard 5890). La sparation est ralise sur colonne Supel-Q plot (30 m x 0,32 mm), aprs division dans un injecteur chauff 250 C (pression en tte de colonne 6 psi) et programmation en temprature du four (35 C, 25 C/min jusqu' 250 C). L'acquisition est ralise en mode "ions slectionns" (H S : temps de rtention 1,59 min, m/z 32, 33, 34) sur un dtecteur de masse Hewlett Packard 5971. La quantification est ralise aprs talonnage externe de l'appareil pour des concentrations variant de 0,1 25 pl H S/ml de sang.2 2

Extraction

Hexane alcool n-amylique 98/2

Phase aqueuseEliminer

Phase organiqueH C I 0,01 M

Rextraction Phase aqueuse CLHP

CPG

1 Phase organiqueEliminer

L'tude de qualit de cette recommandation a t effectue partir de srum surcharg deux niveaux de concentration avec 7 1RS : citalopram, fluoxetine, fluvoxamine, milnacipran, paroxetine, sertraline et venlafaxine. Sur les dix centres participant, 8 ont ralis la sparation par chromatographie en phase liquide, la lecture se faisant en U.V. ou sur une barrette de diodes et deux par chromatographie en phase gazeuse couple un spectromtre de masse. Rsultats : La moyenne de la prcision intersite obtenue en tech-

133


Rsultats et conclusion : Le technique de dosage du sulfure d'hydrogne dans le sang est linaire (r = 0,98) pour des concentrations variant de 0,1 (0,2 mg/L) 25 pl/ml (38,5 mg/L) de sang, rptable (coefficient de variation de 5,8 % 1 pl/ml ou 1,5392 mg/L) et sensible (S/N = 100 0,1 pl/ml ou 0,2 mg/L). Par ce procd, il est donc possible dfaire la diffrence entre une concentration physiologique (< 0,05 mg/L) et une concentration potentiellement ltale. Le dosage du sulfure d'hydrogne dans le sang de deux victimes (gouttiers) a permis de doser ce toxique des concentrations de 0,7 pl/ml (1,1 mg/L) et 5,5 pl/ml (8,5 mg/L). Ces concentrations sont compatibles avec les concentrations mortelles (0,92 14,2 mg/L) dj publies (1,2). La mthode dveloppe est simple (sans extraction, ni drivation), rapide (20 min), sensible (taux physiologiques dtectables) et spcifique pour le dosage du sulfure d'hydrogne dans le sang. Rfrences : 1- Winelc et al. Death from hydrogen-sulphide fumes, Lancet 1968 ; 1 : 1096. 2- Tracqui et al. Intoxication mortelle par l'hydrogne sulfur. J. Md. Strasbourg 1991 ; 22 : 172-175.

Dpistage et quantification de toxiques ou mdicaments dans le sang total par lectrophorse capillaire (*)J.C. H U D S O N R.C.M. Police, Forensic Laboratory, P.O. Box 6500, 6106 Dewdney Ave. W., Regina, Saskatchewan, S4P 3J7, Canada Objectif : U lectrophorse capillaire (CZE) est maintenant utilise pour I 'analyse qualitative et quantitative de mdicaments ou de toxiques dans le sang total. Cette prsentation traite de l'utilit de cette technique dans un laboratoire de toxicologie. L'identification de toxique peut tre dtermine avec prcision en utilisant les mobilits lectrophortiques couples au spectre UVde chaque molcule. Des exemples provenant de plus de 500 molcules analyses dans ce laboratoire judiciaire vont dmontrer Vavantage de mettre en pratique Vlectrophorse capillaire dans un laboratoire de toxicologie. Matriel et mthode : La procdure de dpistage des toxiques inclut l'analyse par lectrophorse capillaire de zone des toxiques basiques aprs extraction en phase liquide et des toxiques acides aprs extraction en phase solide (1). Ces analyses ont t effectues sur des systmes P/ACE 5500 et P/ACE MDQ (Beckman Coulter, Fullerton, USA) avec dtecteur barrettes de diode. Les conditions d'analyse sont les suivantes : - pour les composs basiques : capillaire de silice vierge (50 cm x 75 pm D.I.), tampon de sparation : 100 134

mM phosphate pH = 2,38, tension : 18kV, T : 25 C, injection lectrocintique : 10 kV x 8 sec, dtection UV : 200 nm (spectre de 190 350 nm), - pour les toxiques acides : capillaire de silice vierge (50 cm x 75 pm D.I.), tampon de sparation : 100 mM borate pH = 8,5, tension : 16,5 kV, T : 25C, injection pression 34,5 mBar pour 16 secondes, dtection UV : 200 nm (spectre de 190 350 nm). Rsultats : Les travaux ont t raliss pour 550 composs basiques ainsi que pour plus de 100 molcules acides. La combinaison des mobilits lectrophortiques et des spectres UV permet une identification prcise de ces diffrents toxiques. En effet, des tudes de reproductibilit ralises pendant 4 mois ont montr des coefficients de variation sur les mobilits lectrophortiques infrieurs 0,3 % (2). Des tudes de cas (analyse de sang putrfi par exemple) ont galement t effectues, mettant en vidence la robustesse de Vlectrophorse capillaire (2). Conclusion : L'lectrophorse capillaire est utilise en routine dans ce laboratoire depuis 1994. Cette technique a t intgre aux procdures de dpistage telles que la technique EMIT et les techniques de chromatographie. Les rsultats obtenus par lectrophorse capillaire sont devenus les premiers pris en compte dans la dtermination des cas positifs ou ngatifs. La CZE pourrait rentrer en comptition directe avec les techniques conventionnelles de chromatographic en tant que technique de dpistage de choix en mdecine lgale. Rfrences : 1- Hudson J.C, Golin M. and Malcom M. Capillary Zone Electropheris in a Comprehensive Screen for Basic Drugs in Whole Blood. Can. Forens. Sci. J. 1995 ; 28 : 137-152. 2- Hudson J.C, Capillary Zone Screen for Drugs Can. Forens. Sci. * Prsentation Golin M, Malcom M.J., Whiting C, Electropheris in a Comprehensive of Forensic Interest in Whole Blood. J. 1998 ; 31 : 1-29.

faite en anglais

Importance des proprits acidobasiques de la mirtazapine dans les techniques sparativesL. LABAT. P. DALLET, M.H. LANGLOIS, E. KUMMER, J.P. DUBOST Laboratoire de Chimie Analytique, UFR des Sciences Pharmaceutiques, 3 place de la Victoire, F-33076 Bordeaux cedex. Objectif : La mirtazapine (M) est un antidpresseur de nouvelle gnration d'action centrale, antagoniste des rcepteurs G2 prsynaptiques, l'origine d'une augmentation de la neurotransmission noradrnergique et sro-


toninergique. L'identification et le dosage de la M et de son metabolite actif, la dmthylmirtazapine (DMM), dans les milieux biologiques peuvent tre raliss par chromatographie liquide haute performance (CLHP) (1, 2) ou en lectrophorse capillaire (EC) (3). Ces deux molcules possdent deux fonctions amine de basicit trs diffrente. Nous en tudions l'incidence sur leur comportement analytique en CLHP et EC. Matriel et mthodes : Nous avons dtermin les deux pKa de la M en potentiomtrie et en spectrophotomtrie UV. La sparation d'un mlange de 12 antidpresseurs, dont la M et la DMM, a t effectue en CLHP sur une colonne Satisfaction RP 18AB (250 mm x 4,6 mm, 5 pm) (CIL Cluzeau Info Labo) 45 C avec une phase mobile actonitrile/tampon pH 4,8 (35/65, v/v) (1). En EC, la sparation a t optimise 25 C sur un capillaire en silice fondue conditionn par un tampon borate 42 mM (pH 9,5) 20 % de methanol et une tension applique de 15 kV(3). Pour les deux techniques, nous avons tudi l'influence de diffrents paramtres (composition des phases mobiles en CLHP et des tampons de migration en EC, temprature d'analyse) sur les temps de rtention (tR) en CLHP et sur les temps de migration (tM) en EC. Rsultats : Le pKa du groupement amino-2-pyridine de la M est de 3,6 et celui de la fonction amine tertiaire, de 7,5. En CLHP, nous avons mis en vidence l'influence particulirement importante du pH de la phase mobile (pH 3 5) et de la temprature (25 C 50 C) sur les tR des deux molcules. En EC, les augmentations du pH du tampon de migration (pH 9,2 9,9) et du pourcentage en methanol (0 30 %) sont l'origine d'un allongement des tM de l'ensemble des molcules. L'augmentation est cependant beaucoup plus importante au del de 20 % de methanol pour la M et la DMM. Une augmentation de la tension applique ou de la temprature montre une diminution des tM de toutes les molcules. Conclusion : Les comportements analytiques de la M et de la DMM sont trs dpendants des variations de pH dans des zones proches des deux pKa. Ainsi, le changement de l'tat d'ionisation de la M et de la DMM entre pH 3 et 5 esta l'origine d'une modification importante de leurs temps de rtention en CLHP. Les deux molcules sont beaucoup moins sensibles aux variations de pH dans les zones plus basiques utilises en EC Rfrences : 1- Dallet P. et al. Sparation des antidpresseurs de nouvelle gnration par CLHP sur colonnes Satisfaction RP18 AB et Stability C 8. 38 Congrs Socit de Toxicologie Clinique, 7-8 Dcembre 2000, Bruxelles.me

sant mirtazapine and its demethyl metabolite in human plasma. J. Chromatogr B 1999 ; 721 : 309-16. 3- Labat L. et al. Intoxications par les nouveaux antidpresseurs : screening en ECZ. 38 Congrs Socit de Toxicologie Clinique, 7-8 Dcembre 2000, Bruxelles.me

Dosage des CLHP/SM

cyanures

sanguins

par

A. TRACQUI. J.S. RAUL, A. GRAUT, P. KINTZ, B. LUDES Institut de Mdecine Lgale, 11 rue Humann, 67085 Strasbourg (France) Objectif: Dvelopper une mthode de dosage des cyanures sanguins par CLHP/SM. Matriel et mthodes : I ) Extraction. Dans un tube headspace utilis comme cellule de microdiffusion, ajouter a) 2 ml de sang total, 50 pl de K' C N (1,43 mM, standard interne [Aldrich, Rf. 49,053-9]) et 2 ml de H S0 concentr, b) un godet de recueil (tube Eppendorff) avec 200 pl de methanol/ammoniaque (90 :10, v/v). Sertir, agiter doucement (30 min). Ouvrir, ajouter dans le godet 30 pl de 2,3naphtalne-dialdhyde (NDA, 10 mM) et 30 pl de taurine (50 mM). Laisser ragir 20 min, pipetter le contenu du godet, vaporer 45 C. Reprendre l'extrait sec avec 30 pl de methanol, injecter 2 pl. 2) Chromatographie. Colonne CLHP : NovaPak Cl8, 4 pm (Waters), 150 x 2,0 mm, i.d. + pr-colonne OptiGuard Cl8 (Interchim), 15 x 1,0 mm, i.d. ; phase mobile : actonitrile/tampon 2 mM NHjCOOH, pH 3,0 ; gradient 35-80 % en 9 min, dbit 200 pl/min, split postcolonne 1 : 3. 3) Dtection. Spectromtre de masse Perkin-Elmer Sciex API-100, interface ionspray ; tension d'ionisation (capillaire) - 4500 V ; tension d'orifice - 50 V ; lectromultiplicateur + 2200 V ; acquisition en TIC ou en SIM sur les masses m/z 299,0 et 191,0 (complexe form avec CN), 301,0 et 193,0 (complexe form avec C' N).3 I5 2 4 I3 5

2- Maris F.A. et al. HPLC assay with fluorescence detection for the routine monitoring of the antidepres-

Rsultats : Cette mthode apparat fiable, sensible et hautement spcifique. Les limites de dtection et de quantification pour CN sont de 10 et 30 ng/ml dans le sang (0,38 et 1,15 pM). La calibration est linaire de 30 ng/ml 6 pg/ml. La variabilit intra- et inter-analyses (teste 500 ng/ml) est toujours < 10 %. Conclusion : II s'agit de la premire mthode CLHP/SM dcrite dans la littrature pour le dosage des cyanures sanguins. Inspire de travaux antrieurs faisant appel la complexation de CN par NDA + taurine pour former un driv fluorescent (1,2), elle s'en distingue par l'tape pralable de microdiffusion et par la dtection SM ; ces modifications permettent de l'appliquer des matrices 135


fortement dgrades et surtout lui confrent la spcificit absolue souhaitable dans les applications mdicolgales. Une autre amlioration dcisive rside dans l'utilisation d'un analogue isotopique du cyanure comme standard interne ; galement dcrite pour la premire fois dans la littrature, cette innovation fournit une solution lgante et efficace aux problmes poss par la quantification prcise des cyanures dans le sang. Rfrences : 1- Sano A. et ai- High-performance liquid chromatographie determination of cyanide in human red blood cells by pre-column fluorescence derivatization. J. Chromatogr., 1992 ; 582 : 131-135. 2- Lacroix C. et ai- Dosage des cyanures par HPLC. Application des prlvements mdico-lgaux. Comm. prsente au VIIme Congrs de la SFTA, Marseille, 23 juin 1999.

Intrt de la CPG-SM-SM compare la CLHP-SM pour la dtection du LSD dans les phanresM. C H E Z E . F. VAYSSETTE, G. PEPIN Laboratoire d'expertise TOXLAB, 18 rue Andr Del Sarte, 75 018 Paris Objectifs : Le LSD est un puissant hallucinogne qui agit des doses trs faibles. Il est habituellement vendu sous forme de buvards imprgns 50 pg en moyenne. Les concentrations conscutives dans les phanres sont de l'ordre du picogramme rendant sa dtection particulirement difficile. Les deux mthodes de dosage disponibles ce jour sont soit peu sensibles, soit pas assez spcifiques pour la toxicologie mdico-lgale. Nous avons utilis avec succs des colonnes d'immunoextraction pour le LSD associes des techniques suffisamment sensibles et spcifiques telles que la chromatographie liquide couple la spectromtrie de masse (CLHP-SM) et la chromatographie en phase gazeuse couple la spectromtrie de masse tandem (CPG-SMSM) dont nous avons pu comparer les limites de dtection. Ces techniques ont t appliques l'analyse des poils pubiens d'un jeune homme, consommateur avr de LSD interpell en possession de 1500 buvards. Matriel et mthode : A 100 mg de phanres dcontamins puis broys extemporanment sont ajouts 5 ng de LSD-d3 (Radian) comme talon interne deutr. L'extraction de la matrice est conduite par sonication mthanolique (4 heures 50 C). L'extrait est filtr avant d'tre vapor puis repris par 5 ml de tampon phosphate 0,1 M (pH6) et 300 pl d'albumine bovine (Ortho Clinical Diagnostic) pour extraction par immunoaffinit sur colonnes LSD ImmunElute (Microgenics, France). L'extrait est vapor puis repris par 15 pl de methanol

pour injection directe en CLHP-SM ou driv par 15pl de BSTFA (Rgis) 70 C pour injection de 2ul en CPG-SM-SM. Le systme de CLHP-SM est un API Sciex 165 muni de micro pompes relies une colonne Cl 8 Kromasil 150 x 1 mm, 5pm d ;p ; (Higgins Analytical) munie d'une pr-colonne. La sparation s'effectue en mode isocratique (75 % tampon formiate 5mM pH3, 25 % d'actonitrile enrichi au methanol). La dtection se fait en mode positif pour une tension d'orifice de + 40V et une tension de spray de + 5,8 kV en mode SIM m/z 327.3 (LSD-d3), 324.3 (LSD) pour la quantification et m/z 223.2 (LSD) pour la confirmation. Pour une meilleure sensibilit on utilise la CPGSM-SM constitue d'un systme HP 5890II sur colonne CP-SU-8CB (30m x 0.25 mm- Chrompack) utilisant un gradient de temprature standard. Le spectromtre de masse est un TSQ 7000 (Thermoquest) utilis en mode impact lectronique et pour une nergie de collision de -17 eV. L'acquisition se fait en mode SRM m/z 253 et 297, ions fils du m/z 398 (LSD-d3) et m/z 253 et 294, ions fils du m/z 395 (LSD). Rsultats : Nos analyses ont permis de mettre en vidence la prsence de LSD dans les poils pubiens d'un jeune homme dont la consommation dclare tait de 15 buvards par semaine un taux de 26 pg/mg par CLHP-SM confirm 29 pg/mg en CPG-SM-SM. Les limites de dtections obtenues sont trs satisfaisantes, de 4 pg/mg en CLHP-SM et de 0,5 pg/mg en CPG-SM-SM. Conclusion : La limite de dtection obtenue en CPG-SM-SM laisse prvoir la mise en vidence dans les phanres de consommations bien moindres, environ 40 50 fois infrieures celle prsente ici et aussi l'largissement de la fentre de dtection, limite quelques jours dans l'urine, quelques semaines voire plusieurs mois. Rfrences : 1- Nakahara et al. Detection of LSD and metabolite in rat hair and human hair. J. Anal. Toxicol., 1996 ; 20 : 323-329. 2- Rrich et al. Analysis of LSD in human body fluids and hair samples applying ImmunElute columns. For. Sci. Int., 2000 ; 107 : 181-190.

Intoxication aigu par le 2,4 D (acide 2,4 dichlorophnoxyactique)M. CANAL, J.-M. GAULIER, E. LACASSIE. L. LIRON, P. M A R Q U E T , G. L A C H T R E0 (I3)

(1) Service de Pharmacologie et Toxicologie, CHU Dupuytren, Limoges (2) Service de Ranimation, Centre Hospitalier de Villefranche sur Sane (3) Laboratoire de Toxicologie, Facult de Pharmacie, Limoges

136


Objectif : Nous rapportons le cas d'une intoxication aigu par ingestion volontaire d'acide 2,4 dichlorophnoxyactique ou 2,4 D Cas clinique : Une femme de 44 ans a t admise en Service de Ranimation la suite d'une tentative d'autolyse par absorption d'un flacon de 250 mL d'herbicide ("Gamme KB JARDIN") contenant du 2,4 D. Elle prsentait de graves troubles lectrolytiques et hmodynamiques qui ont ncessit l'utilisation d'amines pressives ainsi qu'une hmodialyse. Des chantillons de srum et d'urine ont t prlevs pour l'analyse toxicologique. Matriel et mthode : Les dosages urinaires et sanguins du 2,4 D ont t raliss par chromatographic en phase liquide couple la spectromtrie de masse en tandem (CLHP-ES-SMSM) avec une source d'ionisation pression atmosphrique de type turbo-ionspray (API 2000, Applied Biosystems). Aprs une simple dprotinisation (par le methanol) des chantillons biologiques (prise d'essai de 100 pL) et addition de l'talon interne (indomtacine), la sparation est ralise sur une colonne nuclosil C , 5 pm (150 x 1 mm d.i.) l'aide d'un gradient de concentration formiate d'ammonium (2,5 mM, pH 3) / actonitrile et la dtection en mode d'ionisation ngative sur la base des paramtres suivants :18

Forensic Sci 1984 ; 29 :1237-41. 3- Prescott LF, Park J, Darrien I, Treatment of severe 2,4-D and mecoprop intoxication with alkaline diuresis. Br J Clin Pharmacol 1979 ; 7 : 111-6.

tude cas-tmoins inclusion prospective de l'usage de cannabis chez des conducteurs impliqus dans un accident corporel de la circulation routire. Rsultats prliminaires obtenus chez 420 conducteurs et 381 sujets tmoinsP. MURA . P. KINTZ , J.M. GAULIER >, F. VINCENT ', J.P. GOULLE , M . MOULSMA< , F. MAIROT *, S. MARTIN-DUPONT ', A. CADOUR , J. NOUVEAU, S. TILHET-COARTET , O. POURRAT4 (5) 6) 2 3 (4) 6) (1) (2) (3

(1) Centre Hospitalier Universitaire de Poitiers ; (2) Institut de Mdecine Lgale de Strasbourg ; (3) Centre Hospitalier Universitaire de Limoges ; (4) Centre Hospitalier Universitaire de Grenoble ; (5) Centre Hospitalier du Havre ; (6) Centre Hospitalier Universitaire de Lyon Objectif: La prsence de delta-9 tetrahydrocannabinol, metabolite psychoactif principal du cannabis, est frquemment mentionne dans les rapports d'analyses toxicologiques effectues chez des conducteurs impliqus dans un accident de la circulation routire (1). Cependant, une analyse fine de la littrature internationale montre qu ' ce jour, les rsultats des tudes pidmiologiques ne permettent pas de prciser la part de responsabilit du cannabis dans la survenue des accidents car trop parcellaires et/ou ralises sur l'urine et/ou par des mthodes non spcifiques et surtout sans comparaison avec une population tmoin. L'objet de la prsente tude est de dterminer la frquence de l'usage de cannabis chez les conducteurs impliqus dans un accident corporel, en analysant le sang des conducteurs et des tmoins par CPG-SM et en tenant compte du sexe, de l'ge et de l'association ventuelle d'autres produits psychoactifs. Matriel et mthodes : L'tude a t mene paralllement Grenoble, Le Havre, Limoges, Lyon, Poitiers et Strasbourg. A ce jour, ont t inclus 420 conducteurs impliqus dans un accident corporel, l'exclusion de ceux qui avaient reu une administration de produits psychotropes dans le cadre de la prise en charge thrapeutique. Les 381 tmoins recruts ce jour taient constitus de patients admis aux urgences hospitalires pour un motif autre qu'un accident de la voie publique. Les cannabinodes taient recherchs et doss dans le sang par CPG-SM, selon la procdure recommande par la SFTA (2). Les

,

Dtection slective par Multiple Reaction Monitoring Temps de rtention Temps de Paire d'ions de Paire d'ions d e (min) rtention relatif quantification confirmation (urna) (urna)4,0! 5.35 75 1 219.1/161 356/312,2 211.1/162,8 -

2.4 D

Indomtacine

La limite de quantification est de 0,1 m g / L et la linarit a t vrifie j u s q u ' 200 m g / L (dans le srum et l ' u r i n e ) .

RESULTATS : J u des Prlvements oril J4 ill

Concentration d 2,4 D (mg/L) e Sr m u Urine156 66 20 0^7 31 7 22 0,7

JI9

Conclusion : Les rares cas d'intoxications mortelles par le 2,4 D dcrits ont permis de dterminer par CLHP/UV-BD des concentrations plasmatiques de 750 mg/L (1), sanguines de 389 mg/L (1) et urinaires de 670 mg/L (2) ; dans un cas d'intoxication svre, la concentration plasmatique mesure tait de 400 mg/L (3). La mthode CLHP-ES-SM-SM prsente s'est avre simple, trs efficace pour le diagnostic toxicologique et surtout pour le suivi de cette intoxication par un produit dont l'limination tait longue et en particulier pour une faible concentration urinaire. Rfrences : 1- Keller T, Skopp G, Wu M, Aderjan R, Fatal overdose of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Forensic Sci Int 1994 ; 65 : 13-8. 2- Fraser AD, Isner AF, Perry RA, Toxicologie studies in a fatal overdose of2,4-D, mecoprop, and dicamba. J

137


produits associs taient recherchs et doss par CPG (alcool) et CLHP-BD (autres substances). Rsultats : Une analyse globale des rsultats (tous sexes et ges confondus) montre que la prsence d'au moins un cannabinode (THC et/ou THC-COOH) tait retrouve chez 47 conducteurs ( 11,2 %) et chez 41 tmoins (10,8 %). En ne considrant que les cas dans lesquels du THC tait prsent ( > 1 ng/ml de sang), le nombre de conducteurs positifs tait alors de 29 soit 6,9 % et de 22 pour les tmoins soit 5,8 %. La prise en compte de l'ge des sujets a conduit des rsultats trs significatifs pour certaines tranches d'ge. En effet, dans la tranche 18 20 ans (n = 80), du THC tait retrouv chez 18,6 % des conducteurs et chez 8,1 % des tmoins. Cette forte prvalence chez les conducteurs tait observe pour toutes les tranches d'ge infrieures 27 ans (15,9 23 %) avec une diffrence significative par rapport aux tmoins (5,9 14,8 %). Parmi les conducteurs positifs au THC, celui-ci tait seul prsent chez 49 % d'entre-eux. Les plus fortes prevalences d'usage taient observes Strasbourg, puis par ordre dcroissant Grenoble, Poitiers, Limoges, Le Havre et Lyon. Conclusion : Ces rsultats prliminaires confirment une forte prvalence de l'usage de cannabis en particulier chez les moins de 30 ans, et indiquent que la prsence de son principe actif dans le sang constitue un facteur de risque d'accidents de la circulation, cela tant particulirement significatif chez les jeunes conducteurs. Rfrences : 1- Mura P., Ppin G., Marquet P., et coll. Place des stupfiants dans les accidents mortels et corporels de la voie publique. Rsultats de 169 analyses sanguines ralises en 1998 et 1999 la demande d'une autorit judiciaire. Toxicorama 1999 ; 11 : 225-31. 2- Kintz P., Cirimele V, Ppin G., et coll. Identification et dosage des cannabinodes dans le sang total. Toxicorama 1996 ; 8 : 29-33.

Dpistage des drogues au bord de la route. Les rsultats de l'tude Europenne ROSITAA.VERSTRAETE Laboratoire de Biologie Clinique Hpital Universitaire, Gent, Belgique Toxicologie,

tre utiliss au bord de la route. Matriel et mthode : Dans le cadre du projet Rosita (1), 2968 sujets ont t tests dans 8 pays, dont 6 pays (Allemagne, Belgique, Espagne, Finlande, Italie et Norvge) o les tests ont t effectus au bord de la route et/ou au poste de police. Des immunoessais rapides ont t utiliss pour la dtection des drogues dans les urines, la salive et/ou la sueur. Les analyses de confirmation dans les urines, le sang, la salive ou la sueur ont t effectues en laboratoire. Rsultats : Les policiers n'ont pas eu d'objections majeures prlever les chantillons. Dans une majorit des pays, la salive est l'chantillon prfr. Les tests rapides de dpistage de drogues ont t trs apprcis par les policiers, qui ont parfois montr une grande crativit pour rsoudre les problmes pratiques rencontrs. Les tests rapides augmentent la confiance du policier, qui sera plus vite enclin commencer une procdure, et pargnent du temps et de l'argent. Un prlvement urinaire ne pose pas de problmes si l'infrastructure ncessaire (camion sanitaire) est prsente, mais est beaucoup plus difficile si ce n 'est pas le cas. Certains tests urinaires (Rapid Drug Screen, SYVA Rapidtest, Dipro Drugscreen 5, Triage) ont donn de bons rsultats (exactitude >95 % en comparaison avec les mthodes de rfrence), mais aucun test n'a donn de bon rsultat pour tous les paramtres. Pour la dtection des amphtamines (y compris le MDMA), la combinaison d'un test amphtamine et mthamphtamine donne souvent d'excellents rsultats. La salive et la sueur sont des chantillons prometteurs, qui donnent parfois de meilleurs rsultats que l'urine quand l'analyse est faite par CG-SM. La prise d'un chantillon de salive ou de sueur est mieux accepte par les automobilistes. Les tests rapides qui sont disponibles maintenant (Drugwipe, Cozart Rapiscan et Avitar Oralscreen) ne sont pas encore assez fiables (exactitude entre 50 et 81 % en comparaison avec le sang). De plus il reste encore beaucoup de progrs faire pour l'chantillonnage, la dure d'excution des tests, le volume de salive ncessaire et la fiabilit. Pour le cannabis et les benzodiazepines, les tests actuels ne sont pas assez sensibles. De nouveaux prototypes de tests rapides pour la dtection de drogues dans la salive sont annoncs, et de nouvelles tudes seront ncessaires pour leur valuation. Conclusion : Les test rapides de dpistage de drogues sont trs utiles. Dans l'avenir, l'usage de la salive semble le plus prometteur, mais les tests actuels ne sont pas encore satisfaisants. En attendant, les tests urinaires peuvent tre une solution acceptable. Rfrence : 1- Verstraete A, Puddu M. Evaluation of different roadside drug tests. Rosita consortium, Gent, Belgium. Peut tre tlcharg de www.rosita.org

Objectif : Selon les experts, une meilleure application de la lgislation drogues et scurit routire peut tre obtenue par une meilleure formation des officiers de police et par l'utilisation de tests permettant de dpister sur place, c'est--dire au bord de la route, la prsence de drogues dans les liquides biologiques des conducteurs. Le projet Rosita avait pour objectif de dterminer s'il existe des tests fiables de dtection de drogues, pouvant 138

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XITI, n 2, 2001

Identification de kavalactones dans le sang, la salive et l'urine par CLHP / BD, approche cintique et application la toxicologie clinique et mdico-lgaleY. BARGUIL \ A. MANDEAU . J. COLLIGNON , K. BEATA , D. D U H E T(,) 2) (1 (I) (1)

(1) Laboratoire de Biochimie, Centre Hospitalier de Nouvelle-Caldonie, Av. Paul Doumer - BP J5 - 98849 Nouma Nouvelle - Caldonie (2) IRD, laboratoire des substances naturelles terrestres, Promenade Roger Laroque BP A5 98848 Nouma Cedex Nouvelle - Caldonie Objectifs : Le kava est une boisson traditionnelle du Pacifique prpare partir de la racine du Piper methysticum Forst. Les principes actifs sont des a-pyrones : kavalactones (KL) aux activits psychotropes. Des cas de surdosages sont observs dans le Pacifique (bar kava) et en Europe (spcialits pharmaceutiques), entranant une symptomatologie diverse : troubles neurologiques, hpatiques et cutans. Nous avons mis au point une mthode rapide et spcifique de dtection des KL et de leurs metabolites par CLHP / BD dans diffrentes matrices biologiques : sang total, urine, sueur et salive. Matriel et Mthodes : Aprs extraction sur Toxitube A et B (ANSYS Diagnostics, Inc., CA), les KL et certains metabolites (KL dmthyles ou rduites, en cours d'identification) sont chromatographies sur une colonne Symetry C8 (5 pm, 4.6 x 250 mm Waters, actonitrile / tampon phosphate pH 3.6 en gradient de concentration) coupl un dtecteur barrette de diodes (M996). - Un extrait total thanolique de la boisson a t inject afin de pouvoir reconnatre les spectres et. les temps de rtention des diffrentes KL. - Chez huit volontaires ayant absorb du kava, sang, sueur, salive et urines ont t prlevs diffrents temps. Rsultats : Les longueurs maximales d'absorption (kmax) et les temps de rtention (tr) des KL (ou de leurs metabolites) dans les diffrentes matrices biologiques diffrents temps sont prsents dans le tableau ci-dessous :Extrait tot. Y* DHK* K* THY* DHM* M* 19.95 19.32 19.07 18.79 18.45 18.30 tr et fentre de dtection Xmax Sang Salive Urine (15 60 min) (30 60 min) (l 36 h) 19.56 20.03 12.41 (m*) 217,261,356 19.31 19.80 11.76 (m*), 19.17 235 19.04 19.55 11.59 (m*), 18.91 202,245 18.75 226,274 18.40 18.96 18.22 234,284 18.26 18.82 206,226,265,305

Sueur : KL non dtectes, leur lipophilic n'tant pas favorable au transfert passif depuis le plasma. Conclusion : Notre mthode d'identification de KL et de ses metabolites par CLHP / BD est suffisamment rapide (traitement d'un chantillon en moins d'une heure) pour tre utilise en toxicologie clinique d'urgence. Elle est non invasive (urine et salive) et permet de distinguer une consommation rcente (salive et sang) d'une consommation plus lointaine (urines).

Comparaison de cinq immunoessais pour la dtection des amphtaminesA .VERS TR AETE . P. PEZZATI , E. VAN VELDE(,) ( (2)

DE

(1) Laboratoire de Biologie Clinique - Toxicologie, Hpital Universitaire, Gent, Belgique et (2) Ospedale Santa Maria Nuova, Florence, Italie Objectif : La dtection des amphtaminiques de type ecstasy (XTC) par immunoessai est souvent problmatique (1,2). Pourtant, en Europe, l'XTC est une des drogues les plus populaires, et rcemment, l'intrt pour la dtection de ce type de molcules s'est accru aux EtatsUnis. Rcemment, un nouveau coffret CEDIA, qui serait beaucoup plus sensible pour le MDMA, est apparu, et nous l'avons compar quatre autres immunoessais. Matriel et mthode : Les immunoessais utiliss taient la polarisation de fluorescence (FPIA) sur ADx ou AxSYM, l'ancienne et la nouvelle version du "Cloned Enzyme Donor Immunoassay" (CEDIA, (respectivement CEDIA A et CEDIA N), l'EMIT II monoclonal amphtamine /mthamphtamine, et le "Kinetic Interaction of Microparticles in Solution" (KIMS) sur Cobas Integra. Les tests CEDIA et EMIT ont t adapts sur un Hitachi 917. La confirmation a t faite par CG/SM, aprs extraction en phase solide et drivation par HFBA, avec des talons internes deutrs. La comparaison a t effectue sur 217 chantillons urinaires, dont 94 taient positifs (c.--d. qu'ils contenaient plus de 200 ng/mL d'une amphtaminique) : 34 contenant seulement de l'amphtamine, 47 du MDMA, du MDEA et/ou du MDA et 13 contenant de l'amphtamine et une ou plusieurs des molcules suivantes : MDMA, MDEA ou MDA. Rsultats : La sensibilit et la spcificit un seuil de dpistage de 300 ng/mL, l'aire sous la courbe (AUC) ROC (pour la dtection de l'amphtamine ou de l'XTC) et le seuil optimal calcul sur base de la courbe ROC sont donns dans le tableau ci-dessous.

DHK = K = Kavane, m = metabolite, Dhydrokavane, Y = Yangonine, DHM = Dihydromthysticine, THY = Tetrahydroyangonine, M = Mthysticine

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Test CEDIA A CEDA N EMIT FPIA KIMS

Sensibilit 75 % 98% 89% 90% 91 %

Spcificit 80% 67% 85% 98% 65%

AUC ROC Seuil 'optimal' (ng/mL) 0.880 359 0.959 538 0.924 275 0.970 330 0.907 520

Conclusion : La nouvelle formulation CEDIA amliore sensiblement la dtection du MDMA et du MDEA, mais la spcificit n'est pas trs bonne. Les meilleurs rsultats sont obtenus avec FPIA, qui a une excellente spcificit. Un seuil de positivit plus lev amliore la spcificit, sans trop diminuer la sensibilit. Rfrences : 1 - Verstraete A, Van haute I. Spcificit des immunoessais pour la dtection des amphtamines. Toxicorama 1997 ; 9 : 65-71. 2- Ensslin HK, Kovar KA, Maurer HH. Toxicological detection of designer drug 3,4-methylenedioxy-ethylamphetamine and its metabolites in urine by GC-MS and FPIA. J. Chromatogr B Biomed Appl 1996 ;

le congrès annuel de la societé francaise de toxicologie analytique

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