laporan mikro isolasi bakteri1
TRANSCRIPT
-
8/10/2019 Laporan Mikro Isolasi Bakteri1
1/22
LAPORANPRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI
ISOLASIBAKTERI
Oleh:
Sri Lestari
Nim.11630052
JURUSANKIMIA
FAKULTASSAINSDANTEKNOLOGI
UNIVERSITASISLAMNEGERIMAULANAMALIKIBRAHIM
MALANG
2014
-
8/10/2019 Laporan Mikro Isolasi Bakteri1
2/22
BAB I
PENDAHULUAN
1.1Latar Belakang
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan
sifat-sifat yang khas, termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna
dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu
cara untuk melihat dan mengamati bentuk sel bakteri dalam keadaan hidup sangat
sulit, sehingga untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan
sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Hal tersebut juga
berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel
bakteri melalui serangkaian pengecatan. Oleh karena itu teknik pewarnaan selbakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi.
Oleh karena itu praktikum ini dilakukan agar dapat mengetahui dan mengerti
cara mengisolasi, pertumbuhan, serta morfologi bakteri selulolitik dengan cara yang
benar.
1.2Rumusan Masalah
1.Bagaimana isolasi bakteri selulolitik dari bekatul sehingga diperoleh isolat
murni ?
2.Bagaimana menguji isolat bakteri selulolitik dalam hal kemampuannya untuk
menghasilkan enzim selulase?
3.Bagaimana mengidentifikasi dan mengetahui morfologi isolat bakteri selulolitik
dengan pewarnaan gram?
-
8/10/2019 Laporan Mikro Isolasi Bakteri1
3/22
1.3Tujuan
1.Untuk mengisolasi bakteri selulolitik dari bekatul sehingga diperoleh isolat
murni.
2 Untuk menguji isolat bakteri selulolitik dalam hal kemampuannya untuk
menghasilkan enzim selulase.
3 Untuk mengidentifikasi dan mengetahui morfologi isolat bakteri selulolitik
dengan pewarnaan gram.
-
8/10/2019 Laporan Mikro Isolasi Bakteri1
4/22
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Isolasi Bakteri Dari Bekatul
Bekatul mempunyai kandungan komponen-komponen nutrisi yang
dibutuhkan bakteri proteolitik. Bekatul mengandung protein tinggi, karbohidrat,
lemak, vitamin, asam lemak esensial, serat pangan, oryzanol, dan asam ferulat
(www.gizi.net, 15 Februari 2006). Bekatul mempunyai sumber karbon dan nitrogen
lebih kompleks dibandingkan media lain. Keunggulan lain yaitu harganya lebih
murah, mudah diperoleh dan tersedia secara melimpah, bahkan merupakan limbah
yang dapat mencemari lingkungan.
Isolasi Bakteri adalah proses pemurnian bakteri dari sekelompok bakteri yang
terdapat dalam habitat yang sama. Pemurnian ini bertujuan untuk mendapatkan
bakteri murni yang hanya terdiri dari satu species saja. Bakteri yang sudah
dimurnikan, kemudian akan dibiakkan dalam media buatan untuk mendapatkan kultur
bakteri murni dalam jumlah banyak. Fardiaz (1988) menyebutkan bahwa terdapat tiga
jenis isolasi yang umum dilakukan yaitu isolasi pada media cawan, isolasi pada
medium cair, dan isolasi sel tunggal. Isolasi agar cawan dilakukan dengan
menggunakan goresan kuadran atau metode agar tuang. Keberhasilan metode ini
sangat tinggi karena kebanyakan bakteri, kapang dan khamir dapat membentuk koloni
pada media padat sehingga mudah diisolasi dengan cara menyebarkan sel sel
tersebut pada agar cawan sehingga timbul koloni koloni yang terpisah. Isolasi
medium cair digunakan untuk beberapa bakteri yang ukuran selnya besar, tidak dapat
tumbuh pada agar cawan, hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Metode yang
digunakan adalah metode pengenceran. Metode ini mempunyai kelemahan karena
hanya dapat digunakan untuk mengisolasi mikroba yang jumlahnya dominan dalam
suatu campuran populasi mikroba. Isolasi sel tunggal digunakan untuk mengisolasi
sel mikroba yangukurannya besar serta tidak dapat diisolasi dengan metode cawan
maupun pengenceran.
-
8/10/2019 Laporan Mikro Isolasi Bakteri1
5/22
2.2 Bakteri Selulolitik
Selulolitik merupakan aktivitas bakteri dalam perombakan selullosa dengan
bantuan enzim selulase. Enzim selulolitik dibentuk oleh sebagian besar
mikroorganisme. Mikroorganisme banyak ditemukan pada fungi, actinomycetes,
myxobacteria dan bakteri sejati (Enari, 1983 dalam(Widyastuti,2005). Beberapa
mikroorganisme mengeluarkan enzim selulase didalam media kultur. Enzim selulase
benar-benar ekstra selular dalam banyak kasus tingginya aktivitas selulase ditemukan
didalam filtrat pada fase pertumbuhan strasioner dan dapat diduga bahwa enzim
dilepaskan secara otomatis. Secara jelasnya bahwa enzim harus berada diluar sel
tetapi enzim ini masih terikat pada permukaan. Hal ini meimbulkan dugaan bahwa
degradasi selulosa lebih efisien ketika kontak secara langsung antara sel mikroba dansubstrat. Dengan maksud ini konsentrasi enzim dan kondisi ruang yang baik telah
terpenuhi.
Pemanfaatan bakteri selulolitik sebagai penghasil enzim selulase digunakan
untuk menghidrolisis selulosa karena bakteri tersebut menghasilkan enzim selulase
sebagairespon terhadap adanya selulosa pada lingkungannya. Proses ini berlangsung
apabila terjadi kontak langsung antara sel bakteri dan permukaan selulosa (Hartanti,
2010). Enzim selulase dapat dihasilkan oleh bakteri dan fungi. Salah satu bakteri
yang dapat menghasilkan enzim selulase adalah Bacillus sp. (Sadhu et al., 2013).
Selulase dapat diaplikasikan untuk memperhalus bubur kertas pada industri kertas,
menjaga warna kain agar tetap cemerlang pada industi tekstil, meningkatkan kualitas
pada industri pangan, sebagai dekomposer bahanbahan organik, meningkatkan nutrisi
pakan ternak, berperan penting dalam biokonversi selulosa menjadi berbagai
komoditas senyawa kimia dan dapat mengurangi dampak negatif dari polusi limbah
terhadap lingkungan(Hartanti, 2010). Enzim selulase merupakan enzim ekstrakseluler
yang dihasilkan di dalam sel kemudian dikeluarkan ke media tumbuhnya. Selulase
dapat menghidrolisis ikatan -1,4- glikosidikpada selulosa. Enzim Selulase dapat
diklasifikasikan menjadi tiga kelompok, yaituendo-1,4--Dglukanase,eksoo-1,4--D-
glukanase, dan -D-glukosidase. Ketiga komponen enzim tersebut bekerjasama
-
8/10/2019 Laporan Mikro Isolasi Bakteri1
6/22
dalam menghidrolisis selulosa yang tidak dapat larut menjadi glukosa (Fikrinda,
2000).
2.3 Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram ini bertujuan untuk mlihat bakteri bersifat gram positif atau
negatif dan bentuknya. Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode
empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram
positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka.
Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian
Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk
membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Pada uji
pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metilungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah
muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini
berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. Dalam pewarnaan gram
diperlukan empat reagen yaitu :
1. Zat warna utama (violet kristal)
2. Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan
warna utama.
3. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang
digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.
4. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-
sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.
a. Bakteri Gram Negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan
warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negative
tidak. Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 1015 mm, berlapis tiga atau multilayer.
-
8/10/2019 Laporan Mikro Isolasi Bakteri1
7/22
2. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat
didalam
3. lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak
mengandung asam tekoat.
4. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
5. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal
violet.
6. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
7. Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
8. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
9. Peka terhadap streptomisin
10. Toksin yang dibentuk Endotoksin
b. Bakteri Gram Positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu
sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di
bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda.
Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada
perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010) Ciri-ciri bakteri gram positif
yaitu:
1. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada
yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat
ringan. Mengandung asam tekoat.
3. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
4. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
6. Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
7. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
8. Tidak peka terhadap streptomisin
9. Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin.
-
8/10/2019 Laporan Mikro Isolasi Bakteri1
8/22
BAB IV
PEMBAHASAN
4.1 Data Pengamatan
4.1.1 Isolasi Bakteri Selulolitik dari Bekatul
Perlakuan Hasil
1. Ditimbang 11 gr serbuk
bekatul
2. Dimasukkan ke dalam
erlenmeyer yang berisi 100
ml media Nutrient Broth (pH
8-11) dengan cara : Dibuka tutup kapas
erlenmeyer
Dibakar mulut erlenmeyer
(proses berlangsung
dalam laminar)
Dimasukkan bekatul
sebanyak 11 gram
Dibakar kembali mulut
erlenmeyer
Ditutup kembali dengan
kapas
Di wraping
3. Diinkubasi pada suhu 450C
selama 48 jam
4. Dibuat media (CMC) untuk
penanaman bakteri pada
cawan petri
5. Diambil sampel bekatul yang
telah melalui proses dalam
inkubator
6.
Dilakukan pengenceranbertingkat dari 10
-1sampai
10-5
dengan cara :
Dibuka tutup kapas
tabung reaksi
Dibakar mulut tabung
Diperoleh 11 gr bekatul
Bekatul bercampur dengan Nutrien
Broth
Nutrien broth berwarna bening
Sampel dalam inkubator
CMC siap digunakan sebagai media
penanaman bakteri
Bekatul keluar dari inkubator
Pengenceran dengan konsentrasi
bertingkat dari 10-1
sampai 10-2
-
8/10/2019 Laporan Mikro Isolasi Bakteri1
9/22
reaksi diatas bunsen
Dibuka tutup kapas
erlenmeyer yang berisi
bekatul
Dipanaskan muluterlenmeyer
Diambil 1 ml sampel
bekatul
Dimasukkan sampel
bekatul dalam tabung
reaksi yang berisi NaCl
Di vortex
Diulangi langkah yang
sama dari dari 10-1
sampai
10
-5
7. Di ambil sampel yang sudah
bercampur dengan NaCl
8. Dimasukkan ke dalam cawan
petri yang berisi media CMC
agar untuk ditanam secara
pour plate
9. Diinkubasi pada suhu 70oC
selama 24 jam
10.Diambil cawan petri yang
berisi sampel dari inkubator
11.
Diamati bakteri yang muncul
pada masing-masing cawan
petri
12.Dilakukan pemurnian dengan
cara :
Disiapkan kawat ose dan
disterilkan dengan
disemprot menggunakan
alkohol
Dibakar kawat ose pada
nyala api bunsen spiritussampai kawat berwarna
merah
Diambil satu ose isolat
mikroba yang terpisah dari
koloni dengan
Sampel bercampur dengan NaCl
Penanaman bakteri dengan media
CMC agar dalam cawan petri
Cawan petri dalam inkubator
Cawan petri keluar dari inkubator
Bakteri yang muncul 10-1
, 10-2
,10-4
,
10-5
. bakteri yang tidak muncul 10-3
Kawat ose steril
Kawat ose panas
Didapat satu isolat mikroba
-
8/10/2019 Laporan Mikro Isolasi Bakteri1
10/22
menggunakan kawat ose
Di taruh dalam tabung
reaksi yang berisi media
CYPEagar dengan
metode streak kuadran(zig-zag)
Ditutup kembali tabung
reaksi
Disimpan isolat murni
yang didapatkan pada
media miring CYPEagar
untuk perlakuan
selanjutnya
Satu isolat mikroba berada dalam
media CYPEagar
Tabung reaksi tertutup
Di dapat isolat murni
4.1.2 Uji Bakteri Selulolitik secara Kualitatif
Perlakuan Hasil
1. Diambil satu ose isolat
dengan kawat ose yang
telah dibakar pada nyala
api bunsen sampai
berwarna merah
2.
Dimasukkan kedalam 25 mlmedia CMC broth
3. Dishaker selama 24 jam
4. Dimasukkan kertas cakram
dalam biakan isolat bakteri
5. Diletakkan kertas cakram
tersebut diatas media CMC
agar dalam cawan petri
6. Diinkubasi selama 24 jam
pada suhu 37C
7. Ditambahkan congo red 0,3
% dengan pipet tetes
secukupnya (jangan sampai
terkena kertas cakram)
8. Didiamkan selama 15 menit
9. Dibilas dengan NaCl 1 M
sampai terendam
Satu ose isolat terambil
Satu ose isolat dalam CMCbroth
Homogen
Kertas cakram dalam isolat
bakteri
Kertas cakram berada diatas
media CMC
Sampel dalam inkubator
Congo red berwarna merah ,
sampel putih keruh
-
8/10/2019 Laporan Mikro Isolasi Bakteri1
11/22
10.Dibuang hasil sisa
pencucian NaCl
11.Diukur zona bening dan
diameter koloni dengan
menggunakan jangkasorong
Zona bening tampak
4.1.3 Identifikasi Bakteri Selulolitik dengan Pewarnaan Gram
Perlakuan Hasil
1. Disemprot alkohol
2. Ditetesi aquades
3.
Dimasukkan bakteri ( 3 10-1b)4. Difiksasi sampai kering
5. Ditetesi dengan 1 tetes kristal
violet
6. Ditunggu sampai 60 s
7. Dibilas dengan aquades dan
dikeringkan
8. Ditetesi 1 tetes iodin
9. Ditunggu sampai 60 s
10. Dibilas dengan aquades dan
dikeringkan11. Ditetesi 1 tetes etil alkohol
12. Ditunggu sampai 30 s
13. Dibilas dengan aquades dan
dikeringkan
14. Ditetesi 1 tetes safranin
15. Ditunggu sampai 60 s
16. Dibilas dengan alkohol dan
dikeringkan
17. Diberi minyak imersi jika tidak bisa
terlihat dalam mikroskop
18.
Diamati pada mikroskop
19. Dilakukan ulang dengan perlakuan
yang sama pada bakteri (3 10-2
a, 3
10-1
4, 1 10-4
, 3 10-1
a)
Bakteri selesai difiksasi
Bakteri berwarna ungu
Bakteri tetap berwarna ungu
Bakteri tetap berwarna ungu
Bakteri tidak berwarna
Bakteri berwarna merah
Bakteri uji gram negatif
-
8/10/2019 Laporan Mikro Isolasi Bakteri1
12/22
4.2 Pembahasan
4.2.1 Isolasi Bakteri Selulolitik dari Bekatul
Isolasi bakteri selulolitik dari bekatul ini bertujuan untuk mengisolasi
bakteri selulolitik dari bekatul, sehingga diperoleh isolat murni.
Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan
menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba
adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari
campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan
menumbuhkannya dalam suatu media padat sel-sel mikroba akan membentuk
suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya.
Adapun langkah-langkah yang dilakukan dalam isolasi bakteri selulolitik
yaitu, pertama menimbang 11 gram serbuk bekatul dengan neraca analitik.
Bekatul digunakan sebagai sampel yang akan diisolasi bakteri selulolitiknya
untuk diambil isolat murninya yang nantinya akan dilakukan beberapa uji untuk
menguji kemampuannya menghasilkan enzim selulase dan mengetahui morfologi
dari isolat bakteri tersebut. Langkah selanjutnya yaitu memasukkan sampel ke
dalam erlenmeyer yang berisi 100ml Nutrient Broth dalam laminar dengan cara
membuka tutup kapas erlenmeyer yang berisi nutrient broth, kemudian
membakar mulut erlenmeyer. Fungsi pembakaran disini adalah untuk
mensterilkan. Selanjutnya memasukkan 11 gram bekatul, membakar kembali
mulut erlenmeyer dan menutupnya dengan kapas lalu diwrapin agar sampel tidak
terkontaminasi dengan lingkungan luar. Nutrient broth merupakan media yang
berfungsi sebagai nutrisi untuk mencukupi kebutuhan hidup dari bakteri. Berikut
gambar dari nutrient broth sebelum dan sesudah bercampur dengan sampel.
-
8/10/2019 Laporan Mikro Isolasi Bakteri1
13/22
-
8/10/2019 Laporan Mikro Isolasi Bakteri1
14/22
disediakan. Setelah itu, memvortex agar didapatkan campuran yang homogen.
Setelah di vortex, mengambil 1 ml sampel dalam tabung reaksi dan
memasukkanya ke dalam cawan petri yang berisi media CMC. Inilah yang
disebut dengan penanaman (inokulasi). NaCl 10 -1dimasukkan kedalam NaCl 10-
2, mengulangi langkah-langkah seperti sebelumnya sampai 10
-5. Setelah itu,
diinkubasi pada suhu 70oC selama 24 jam.
Mengambil cawan petri yang berisi sampel dari inkubator dan mengamati
bakteri yang muncul pada masing-masing cawan petri. Berikut data hasil
pengamatan baik bentuk koloni, tepi koloni, dalam koloni dan elevasi.
No Nama Bentuk
Koloni
Tepi
Koloni
Dalam Koloni Elevasi
1. III 10-
Melingkar Seperti
Rambut
Transparan (tidak
tembus cahaya)
Cembung
2. III 10- Tidak
Beraturan
Tidak
Beraturan
Tidak Transparan Cembung
3. III 10- Melingkar Rata Tidak Transparan Cembung
4. I 10-
Melingkar Rata Transparan
Tembus Cahaya
Rata
5. IV 10-
Tidak
Beraturan
Berombak Transparan
Tembus Cahaya
Cembung
Selanjutnya dilakukan pemurnian dengan cara mempersiapkan kawat ose
dan mensterilkannya dengan menyemprot menggunakan alkohol. Kemudian
membakar kawat ose pada nyala api bunsen spiritus sampai kawat berwarna
merah menyala. Lalu, mengambil satu ose isolat mikroba yang terpisah dari
koloni dengan menggunakan kawat, saat pengambilan. Usahakan kawat ose
ditempelkan dulu pada media. Agar pada waktu pengambilan, bakteri tidak mati
akibat tingginya suhu (panas) dan menaruhnya dalam tabung reaksi yang berisi
media CYPE-agar dengan metode streak kuadran (zig-zag) yang mana ujung
kawat ose yang membawa bakteri digesekkan atau digoreskan dengan bentuk
zig-zag pada permukaan agar-agar dalam cawan petri sampai meliputi seluruh
permukaan. Metode ini yang dilakukan dengan baik kebanyakan akan
-
8/10/2019 Laporan Mikro Isolasi Bakteri1
15/22
menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan. Berikut gambar
metode metode streak kuadran :
4.2.2 Uji Bakteri Selulolitik Secara Kualitatif
Pengujian zona bening dilakukan dengan menggunakan larutan congo red
0,1% sebagai larutan penguji dan NaCl 1% sebagai larutan pencuci. Sebanyak 2 ml
larutan congo red 0,1% dituangkan ke dalam media yang berisi isolat, kemudian
didiamkan selama 2030 menit. Larutan dibuang dan dibilas dengan larutan NaCl
1%, kemudianbdiamati keberadaan zona bening (Clear zone). Hasil positif
dinyatakan dengan adanya zona bening (clear zone) di sekitar koloni.
Pengamatan bentuk sel dan pewarnaan cat gram merupakan langkah awal
dalam melakukan identifikasi. Bakteri diberi pewarnaan cat gram untuk mengetahui
sifat bakteri tersebut berkenaan dengan kandungan peptidoglikan di dalam dinding sel
bakteri yang dapat berikatan kuat dengan salah satu komponen cat gram yang akan
diberikan yaitu kristal violet sebagai pewarna utama, sedangkan sebagai pewarna
pembanding yaitu safranin. Maka akan diketahui bakteri tersebut termasuk gram
positif jika berwarna ungu, menunjukkan kandungan peptidoglikannya tinggi, dan
sebaliknya jika kandungan peptidoglikannya rendah maka sel bakteri akan berwarnamerah sebagai gram negatif. Selain itu, pengamatan morfologi koloni dan
karakteristik lain. Jika spesies suatu mikroorganisme itu diketahui dengan jelas,
tentunya penyediaan kondisi pertumbuhan yang sesuai dapat dipenuhi, sehingga laju
pertumbuhan akan maksimal dan hasil yang diperoleh pun akan optimal.
-
8/10/2019 Laporan Mikro Isolasi Bakteri1
16/22
Langkah-langkah yang dilakukan dalam pengujian ini yang pertama yaitu
mengambil satu ose isolat dengan kawat ose yang telah dibakar pada nyala api bunsen
sampai berwarna merah menyala. Kemudian memasukkannya kedalam 25ml media
CMC broth. Media CMC broth ini berwujud cair yang digunakan sebagai media
penanaman bakteri untuk menghasilkan bakteri selulolitik. Untuk menghomogenkan
antara CMC broth dan sampel dilakukan dalam shaker selama 24 jam. Lalu
memasukkan kertas cakram dalam biakan isolat bakteri dan meletakkan kertas
cakram diatas media CMC agar dalam cawan petri. Kertas cakram digunakan untuk
membantu pengukuran indeks bias . Kemudian menginkubasinya selama 24 jam pada
suhu 37oC dan menambahkan congo red 0,3% dengan pipet tetes secukupnya,
usahakan dalam penambahan congo red jangan sampai terkena kertas cakram.
Selanjutnya mendiamkannya selama 15 menit dan membilasnya dengan NaCl 1 M
sampai terendam yang selanjutnya membuang hasil sisa pencucian NaCl. Hasil
pencucian sampel tersebut siap untuk diukur zona bening dan diameter koloni yang
terbentuk dengan menggunakan jangka sorong. Uji aktivitas selulase dilihat dari
indeks selulase yang terbentuk. Indeks selulase merupakan nisbah antara diameter
zona bening dengan diameter koloni. Adanya zona bening menandakan adanya enzim
selulose pada bakteri selulolitik. Indeks selulase memperlihatkan besar kecilnya
enzim selulase. Semakin besar indeks selulolitik yang dihasilkan semakin besar
enzim yang dihasilkan oleh isolat bakteri tersebut. Berikut data hasil pengukuran
indeks selulase :
Nama Indeks selulase
III 10-
A 0,25
III 10- A 0,45
III 10-
A 0,35
III 10-
B Tak terbentuk
III 10-
B 0,15
III 10-
B 0,25
I 10- 0,35
I 10
-
0,45I 10
- 0,1
Dari hasil pengukuran diatas, indeks selulase yang terbentuk paling besar
yaitu pada III 10-2
A dan I 10-2
yang menghasilkan enzim selulase terbesar.
-
8/10/2019 Laporan Mikro Isolasi Bakteri1
17/22
Berikut gambar koloni bakteri sebelum dan sesudah ditambahkan congo red.
Adanya zona bening yang tampak :
4.2.3 Identifikasi Bakteri Selulolitik
a. Pewarnaan Gram
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak
digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk
mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan
pewarnaan pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka
dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnyabersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan
rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan
sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan
sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan. Berbagai macam tipe
morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan
menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan
satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-
pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa)
sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya
bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Tujuan pengecatan
sederhana ini adalah untuk melihat bentuk sel.
Zona Bening
-
8/10/2019 Laporan Mikro Isolasi Bakteri1
18/22
Tahap yang dilakukan dalam identifikasi ini antara lain pertama menyemprot
kaca preparat dengan alkohol agar steril, kemudian menetesinya dengan aquades dan
meletakkan bakteri ( 3 10-1
b) diatas kaca preparat. Penambahan aquades disini
bertujuan agar bakteri yang akan diamati merata pada kaca preparat. Karena apabila
sampel menggumpal, sulit diamati dalam mikroskop. Tahap selanjutnya memfiksasi
untuk melengketkan bakteri pada kaca preparat diatas nyala api sampai kering.
Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada objek
glass tanpa merusak struktur selnya. Pemanasan tidak boleh terlalu panas karena bisa
merusak sel bakteri. Kemudian menetesi sampel pada kaca preparat dengan 1 tetes
kristal violet ditunggu sampai 60 detik, dibilas dengan air dan ditiriskan. Crystal
violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini digunakan
sebagai histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri. Crystal violet
memiliki sifat sifat anti bakteri, jamur dan obat cacing,dan sebelumnya penting
sebagai antiseptik topikal (Sutedjo,1991). Langkah selanjutnya menetesi preparat
dengan setetes iodin sampai 1 menit, membilasnya dengan aquades dan
mengeringkannya. Iodin merupakan cat mordan yang berfungsi melekatkan atau
memfiksasi cat primer yang diserap bakteri. Sampel bakteri dalam preparat tetap
berwarna ungu. Kemudian menetesi setetes atil alkohol untuk melunturkan warna
sebelumnya sampai 30 detik, sehingga didapatkan hasil bakteri preparat tak berwarna.
membilasnya dengan aquades dan mengeringkannya. Langkah selanjutnya yaitu
menetesinya dengan satu tetes safranin yang merupakan cat sekunder atau kontras
berfungsi untuk memberikan warna bakteri non target sehingga bakteri berubah
warna menjadi merah selama 60 detik yang kemudian membilasnya dengan alkohol
dan mengeringkannya.
Setelah dilakukan pewarnaan gram diamati pada mikroskop dengan
perbesaran 1000 X agar terlihat dengan jelas bentuk dan warna sel bakteri.
Bakteri gram positif berwarna ungu dan gram negatif berwarna merah. hasil yang
diperoleh pada praktikum pewarnaan gram ini adalah sebagai berikut :
-
8/10/2019 Laporan Mikro Isolasi Bakteri1
19/22
nama Warna
bakteri
Jenis gram Gambar dalam mikroskop
III 10-b Merah Negatif
III 10
-
a Tak terdeteksi Tak terdeteksi
III 10-
4 Merah Negatif
I 10-
Merah Negatif
-
8/10/2019 Laporan Mikro Isolasi Bakteri1
20/22
III 10- a Merah Negatif
Dilakukan ulang dengan perlakuan yang sama pada bakteri (III 10-2
a, III
10-1b , III 10
-14, I 10
-4, dan III 10
-1a ).
-
8/10/2019 Laporan Mikro Isolasi Bakteri1
21/22
BAB V
KESIMPULAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat di simpulkan bahwa isolasi adalah
dengan cara mengisolasi (menuang) sampel untuk mendapatkan isolat campuran
dengan cara menuangkan sampel yang telah diencerkan ke dalam cawan petri, lalu
ditambahkan media, digoyang dan diinkubasi selama 48 jam, sehingga dapat
diamatikoloni bakteri dalam cawan petri.
Uji aktivitas selulase dilihat dari indeks selulase yang terbentuk. Indeks selulase
memperlihatkan besar kecilnya enzim selulase. Dari hasil pengukuran diatas, indeks
selulase yang terbentuk paling besar yaitu pada III 10-2
A dan I 10-2
yang
menghasilkan enzim selulase terbesar. Semakin besar indeks selulolitik yang
dihasilkan semakin besar enzim yang dihasilkan oleh isolat bakteri tersebut.
Pengecatan Gram adalah suatu pewarnaan diferensial yang mengelompokkan bakteri
menjadi gram positif dan gram negatif bergantung kepada kemampuan bakteri yang
bersangkutan untuk menahan pewarna primer (ungu kristal) ketika mengalami
perlakuan dengan bahan pengecat. Hasil pengamatan yang kami lakukan diperoleh
bakteri gram negatif dengan indikator warna merah.
5.2 SARAN
Terimakasih kepada assisten yang telah banyak membantu, semoga ilmunya
bermanfaat.
-
8/10/2019 Laporan Mikro Isolasi Bakteri1
22/22
DAFTAR PUSTAKA
Fikrinda, 2000. Isolasi dan karakterisasi Bakteri Penghasil Selulase Ekstermofilik
dari Ekosistem Air hitam. Tesis Program Pascasarjana IPB, Bogor.
Hartanti, 2010. Isolasi dan Seleksi Bakteri Selulolitik Termofilik dari Kawah Air
Panas Gunung Pancar, Bogor. Skripsi FMIPA IPB, Bogor.
Sadhu, S., Saha, P., Sen, S.K., Mayilraj, S., & Miti, T. 2013. Production, Purification
and Characterization of Novel Thermotolerant Endoglucanse (CMCase) from
Bacillus Strain Isolated from Cow Dung.Spingerplus Jurnal. India.