L’apoptose

Dominique Kerboeuf et Yves le VernINRA, IASP, 37380 Nouzilly

I. Définitions et processus

La mort cellulaire

• 2 types de mort cellulaire :–apoptose–Nécrose

• Apoptose = Mort cellulaire « programmée » ou « Programmed Cell Death » (PCD)

• PCD = phénomène essentiel dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques

Rôles de la mort cellulaire

• Elimination des « surplus » de cellules saines :– Embryologie (cavités, morphogénèse,

structures vestigiales, cellules « en trop »)– homéostasie = constance de la masse

cellulaire– processus physiologiques (cellules

mammaires, endomètre, cellules épithéliales…)

• Suppression des cellules endommagées (défauts génétiques, vieillissement, maladies, agents toxiques…)

• Régulation des populations cellulaires (ex. élimination régulée de certaines populations cellulaires immunitaires)

Apoptose et Nécrose

• Leurs mécanismes et modalités de déclenchement

• la morphologie des cellules• les conséquences tissulaires• leurs significations biologiques

Se différencient par :

Apoptose vs Nécrose

• Atrophie

• Intégrité organelles et membrane

• Condensation du noyau

• Bourgeonnement de la membrane

• Fragmentation (« corps apoptotiques »)

• Phagocytose / C voisines

• Pas d ’inflammation

• Turgescence

• Lyse des organelles et des membranes

• Pas de condensation

• Rupture des membranes

• Libération du contenu cellulaire

• Lyse de la chromatine

• Phagocytose tardive

• Inflammation

Nécrose

Apoptose

Photo Molecular Probes

1. Nécrose : membrane et organellesAltérées, noyau + conservéx 10 000 (TEM)

2. Apoptose (A) réarrangement de la chromatine (vs normal N), membrane ++ x 8000 (TEM)

3. Nécrose (SEM)x 5000

4. Apoptose (SEM) bourgeonnementsx 5000

5. Cellule normale : pores nucléairesx 30 000 (FF)

6. Apoptose : confluence des pores nucléairesx 35 000 (FF)

Remarques

• Etats intermédiaires : – facteurs déclenchants communs– importance des ressources énergétiques

(ATP)– succession apoptose puis nécrose

• Etat apoptotique « fugitif » inaperçu (phagocytose très rapide)

Un schéma simple : Caenorhabditis elegans

3 étapes :1) apparition de signaux (externes ou internes)2) activation de protéases cellulaires3) formation des « corps apoptotiques » et phagocytose

EGL-1 ----> CED-9 ----> CED-4 ----> CED-3 ----> Apoptose+ CED-3 activé

Membrane C Etape intra cellulaire

Inactivation Inactivation

Signal

Schéma général de l ’apoptose

Mitochondrie

AIFCytochrome C

Caspase 9

Caspases effectricesCaspase 3 (Caspases 6 et 7)

Bcl2-pro

Bcl2-anti

Conditions physico-chimiquesCa ++

ADN, noyau

P53

Cyclines

TNFFas

Caspase 8

NKPerforinGranzyme B

T cellCD8

Dégranulation

Récepteurs de mort

Les signaux déclencheurs

• Déclencheurs extra-cellulaires :– Souvent communications entre cellules– insuffisance de signaux suppresseurs de

« PCD »– augmentation de signaux inducteurs

• Déclencheurs intra-cellulaires– réponse à des stimuli ou à des perturbations

métaboliques

!

Combinaison des 2 types de signaux

Les récepteurs ont des rôles multiples(ex prolifération, différenciation, survie)

Rôle différent du récepteur selon type cellulaireex. récepteurs des stéroïdes

Différents mécanismes d ’inductionsouvent associés

Insuffisance de signaux suppresseurs

• Cultures cellulaires : concentration, sérum, diverses molécules solubles ou liées à la membrane (variations selon le type cellulaire)

• Liaison cellules cibles – ex. neurones = adaptation au nombre de cibles

Augmentation de signaux inducteurs

Ex = perte queue des têtards = rôle de l ’hormone thyroïdienne

Signaux extra-cellulaires

Signaux intra-cellulaires

= lésions de la cellule produites par :drogues, toxines, chaleur, radiations, hypoxie, virus…qui ne sont pas des « inducteurs » spécifiques

= « seuil de lésions » déclenchement de la PCD

= activation des caspases, de protéines proapoptotiques (voie p53 dépendante) ou protéines kinases

Induction in vitro

Fas ou Ac anti Fas (CD95)TNF ou ligands du TCR

Pas de sérum ou de facteur de croissanceUVH2O2

GlucocorticoidesIonophore calciumCamptothecine

Contact lymphocytes T cytotoxiques ou NK activés

+ concentration cellulaire, équilibre de populations

Temps nécessaire = 2 à 6 h

Voie Fas-L (CD 95) Fas

Membrane cellulaire

Fas-Ligand

Fas (trimérisation)

FADD Fas Associated protein with Death Domain

Pro Cas 8

Cas 8Pro Cas 3 Autres Cas

Apoptosome

(AIF)

m

Cytochrome C

dATP

Apaf-1Apaf-1

Pro Cas 9

Pro Cas 9

Cyt C

Cyt CCaspase 9

AIF = Apoptosis Inducing FactorApaf-1 = Apoptosis protease activating factor 1

Les caspases

= C aspases

14 caspases et pro-caspases

Cystéines protéases, résidus acide aspartique

3 groupes, selon affinité de substrat I = 1, 4, 5 ---> inflammationII= 2, 3, 7 + CED-3 ---> apoptoseIII = 6, 8, 9 ---> « 

Activation des caspases « entre elles » = « cascade » irréversible

Rôle très important de la caspase 3exécuteur-clé (qq soit le stimulus)

Régulation de la cascade par des protéines activatrices inhibitrices

APAF1 Bcl2 FADDRIPFLASHBcl2

Activation en présence de : ATP + cytochrome C(rôle de la mitochondrie)

La famille des Bcl2

Action sur les membranes mitochondriales = libération ou non du cytochrome C (proApo ou antiApo)

Bax Bak Bok Bik Bin Bad Bid…Mbrane mitochondrie(Bad Bid = cytosol)

Bcl2* Bclxl* Bclw Mcl1 Nr13 Al/Bfl1(*= inhibe Cas9)

+ formation homodimères ou hétérodimères= régulation

II. Méthodes d’analyse de l’apoptose

* Membranes cellulaires= Translocation des phosphatidylsérines (Annexin V)

* Mitochondries= Potentiel de membranes (sondes fluorescentes)= Libération du cytochrome C (Ac ELISA)= Libération de AIF « Apoptosis inducing factor » (Ac ELISA)

* Noyau= Clivage de l ’ADN

- Ac anti-histones- fragments (180 pb) : gel d ’agarose (« DNA ladder »)- TUNEL ou TdT : extrêmités 3’OH- nucléosomes (ELISA)

= Libération des « Nuclear Matrix Proteins » (NMPs) Ac

* Dosages de molécules= Récepteurs des signaux Ac FAS-L (ou Apo-1 ou CD95) TNF

= CaspasesAc ou activités enzymatiques (substrats spécifiques) ==> fluorescence)

= Protéines régulatrices (pro ou anti) Ac

= Glutathion

= calcium

* Gènes impliqués

Cytométrie en flux et étude de l’apoptose

Principe de la cytométrie en flux

• Plusieurs paramètres simultanément pour chaque cellule (jusqu'à 11 paramètres dont 8 fluorescences)

• Sélection de populations (analyse et tri)

• Analyse de cellules vivantes, grand nombre en peu de temps

• Cellule par cellule, quantification de la fluorescence

2 types de signaux

• Signaux de diffusion de lumière

diffusion frontale de la lumière = FSC = Forward Scatter

diffusion latérale de la lumière = SSC = Side Scatter

• Signaux de fluorescence

couleur d’émission de fluorescence : violet, bleu, vert, jaune, orange, rouge

Spectres d’excitation et d’émission de la fluorescéine

Spectre d’excitation

Spectre d’émission

Invitrogen Molecular Probes

Analyse monoparamétrique : exemple la fluorescence

Intensité de fluorescence verte => échelle exprimée en unités arbitraires ou canaux

Nom

bre

de c

ellu

les

par

class

e d

’inte

nsi

té

(« c

anal »)

Témoin : autofluorescence des cellules

Après marquage spécifique

Population pure => une gausssienne

Analyse biparamétrique : exemple de deux fluorescences

• double marquage : amélioration de la discrimination entre les populations

• cellules positionnées en fonction coordonnées sur les 2 axes

Intensité de fluorescence verte

Inte

nsi

té d

e fl

uore

scence

ro

uge

Population doublement marquée

Populations simplement marquées

Population non marquée

Analyse multiparamétrique

Sélection des cellules sur les paramètres de diffusion de lumière

Analyse multiparamétrique

Marquage avec un anticorps un anti-lymphocytes T

Cellules vivantes

Cellules vivantes

Cellules en apoptose

Cellules en apoptose

Cellules mortes

Cellules mortes

Intensité de fluorescence orange

Nom

bre

de c

ellu

les

par

class

e d

’inte

nsi

té (

« c

anal »)

région 1

région 2

• Pourquoi trier ? Vérification des analyses Autres analyses (cytométrie ou autre méthodologie) Mise en culture (tri « stérile »)

• Comment trier ? Une à quatre populations différentes Vitesse de tri maximum 50000 Cellules/s Support : lames, tubes, plaques à microtitration Milieu : « coussin », PBS, RPMI… (+ SVF) La pureté, la viabilité, la stérilité

Le tri et ses options

Principe du tri par cytométrie

Buse

Drop delay

Rayon laser

Gouttelettes détachées

Plaques de déflection

+ 2500 V- 2500 V

AnalyseF

A

« Break off »

Exemple de tri par cytométrie

Analyse avant tri Réanalyse après tri

Drouet-Viard (2001)

99.6 % de pureté

Etapes principales de l’apoptose analysées en cytométrie

Récepteurs de mort

caspaseidentification activité

noyauFragmentation

« Nuclear Matrix Protein (NMP)

mitochondriemembrane

récepteursaltérations

Potentiel de membrane

calcium

Pro Bcl2AntiBcl2

Mise en évidence des récepteurs de mort

Anticorps dirigés contre lesrécepteurs de mort

fonctionnels :

• anti Fas (anti CD95)

• anti TRAIL (anti DR3,DR4,DR5…)

• anti DCR2, DCR3…

=> réaction immunofluorescence directe ou indirecte

Kyung-Mi Kim et al (2000). Experimental and molecular medicine 32, 246-254.

Fixation ligand spécifique => formation complexe multiprotéique

Mise en évidence des protéines agissant au niveau mitochondrial

Anticorps dirigés contre

• les protéines proapoptotiques: Bax

• les protéines antiapoptotiques : Bcl2

• la forme tronquée de Bid (obtenu après action caspase 8)

Perianayagam et al (2003). European Journal of Clinical Investigation 33, 905-911.

Variation du calcium intracellulaire

• mesure du flux de Ca++ => Fluo3

• mesure quantitative du Ca++ :

- Fura-2 modification spectre d’excitation

- Indo-1 modification spectre d’émission fluorochrome libre : émission 475nm (B)fluorochrome lié : émission 400nm (A)

mesure ratiométrique sonde liée/sonde libre

Etape précoce de l’apoptose => augmentation du calcium

intra-cellulaire

Spectre d ’émission de l ’indo-1

Variation de calcium intracellulaire utilisation du fluo-3

Cao QZ et al (2005). World J Gastroenterol Apr 21;11(15):2255-9.

Cellules témoins

Cellules traitéesVérapamil

WangXJ, Xu JX (2005). Neuroscience Letter Mar 11, 376(2) : 127-32.

Induction apoptose par la roténone sur des cellules neuronales

Modifications membranaires

• Modification graduelle de la perméabilité membranairepénétration plus facile : Hoechst 33342 ou Yo-Pro1

• Perte de l’assymétrie membranaire : externalisation des phospholipidesAnnexineV reconnaît les phosphatidylsérines

• Etude du désordre lipidique membranaireexternalisation des phosphatidylsérines => modification organisation membranaire => augmentation fixation merocyanine 540

discrimination cellules mortes-cellules vivantes

Externalisation des phosphatidylsérines

Intensité de fluorescence verte (annexine V FITC)

Inte

nsi

té d

e

fluore

scence

rouge (

7A

AD

)

Résultats A-M Chaussé (1996)

Cellules vivantes

Cellules mortes

Cellules en apoptose

Externalisation des phosphatidylsérines

Lignée de cellules T humaines, coloration annexineV Alexa 488 et Iodure de propidiumPhoto : Molecular Probes

Cellule en nécrose

Cellule en apoptose

Modifications dans la mitochondrie

Action protéines proapoptotiques (Bax…)

Ouverture des pores de transition

• modification équilibre ionique : dépolarisation de la membrane mitochondriale

• libération cytoplasmique du cytochrome c

• libération cytoplasmique des protéines SMAC/Diablo

• libération cytoplasmique des AIF

Mise en évidence de la dépolarisation de la membrane

• mitochondries fonctionnelles = multimères => fluorescence rouge

•mitochondries non fonctionnelles = monomères => fluorescence verte

Intensité de fluorescence verte

Inte

nsi

té d

e

fluore

scence

rouge

D’après Salvioli S. et al. (2000) Cytometry 40:189_197

Cellules normales

Cellules en apoptose

Cellules mortes

fluorochromes cationiques et lipophiles incorporation potentielle dépendante=> variation du potentiel mitochondrial

exemple : DiOC6, Rhodamine 123, MitoTracker, JC-1…

JC-1

Incorporation d ’un fluorochrome cationique : le JC-1

Coloration d ’une lignée de fibroblastes au JC-1, différents temps de stimulation de l ’apoptose

Photo : Ildo Nicoletti, Perugia University Medical School.

Mise en évidence de la libération cytoplasmique du Cytochrome C

+ Act D

-Act D

Coloration d’une lignée de cellules T humainesPhoto et Histogramme : Merck Novagen

•Anticorps dirigés contre le Cytochrome C

Activité enzymatique des caspases

===>

• forme active : anticorps

• site actif de l’enzyme : Peptide spécifique (FLICA)

• quantification de l’activité enzymatique

Procaspases précurseurs inactifs

Caspases actives

Substrat non fluorescent produit fluorescent

Caspase active

Exemple de mesure de l’activité enzymatique

Activité caspase (FITC)

Quanti

t é d

 ’A

DN

(I

odure

de

Pro

pid

ium

)

F. Guérif, V. Cadoret et D. Royère (2001)

• monoparamétrique activité caspase

Cellules en apoptose

• biparamétrique : activité caspase et ploïdie

Fragmentation de l ’ADN

En fin de cascade apoptotique il y a activation de nucléases qui coupent l ’ADN entre les nucléosomes

• méthode TUNEL :Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling

• méthode du pic hypodiploïde :

Méthode TUNEL

Enzyme Tdt fixe des désoxynucléotides non fluorescents ou fluorescents sur l’extrémité 3’OH libre.

Photo Molecular probes

Cellule en nécrose

Cellule en apoptose

Méthode TUNEL

Utilisation de la ChromaTide BODIPY FL-14-dUTP • apoptose en cours => fluorescence verte

• apoptose terminale : fragmentation nucléaire intense => fluorescence jaune

Photo : Zbigniew Darzynkiewicz, Cancer Research Institute, New York Medical College.

Méthode du pic hypodiploïde

Intensité de fluorescence rouge (Iodure de Propidium)

Résultats M. Afanasieff (1993)

Nom

br e

de c

ellu

l es

par

c las s

e d

 ’in

tens i

t é

( «  c

anal »)

Cellules normales

Cellules en apoptose

Pic G0/G1

Pic G2/M

coupure entre les nucléosomes => quantité ADN < 2Cquantification ADN avec un fluorochrome intercalant spécifique (Iodure de propidium, Bromure d’éthidium…)

III. Apoptose et Infectiologie

Pathologies associées à l ’apoptose

Apoptose excessiveAlzheimerParkinsonSIDAHépatitesCertains diabètesMalformationsRejet de greffevirus, bactériesToxines

Apoptose insuffisanteMaladies autoimmunesLeucémiesSyndromes lymphoprolifératifsTumeursOstéoporoseMalformationsRejet de greffeMaladies virales (poxvirus, adenovirus)Maladies parasitaires (Toxoplasmose, Leishmaniose)

Trois exemples d’apoptose en pathologie infectieuse

• Mort du macrophage infecté par des salmonelles

• Rôle de l’apoptose dans les relations Plasmodium-vecteur

• Virus et régulation mitochondriale de l’apoptose

A) SalmonelloseK. HUEFFER and JE Galan,

Cell.Microbiol., 2004, 6, 1019-1025

• Co-évolution pathogène-hôte = modulation des relations (ex. fonctions/mort macrophage)

• SPI-1 : stimulée par faible O2 et forte osmolarité = phase d’invasion intestinale

• SPI-2 : stimulée par faible Mg++ et pH acide (intra-cellulaire) = infection systémique

• Les 2 protéines induisent la mort du macrophage mais différents mécanismes et temps : 45 min (SPI-1 ?) ou 24 h (SPI-2 ?)

Les TTSS de Salmonella• Salmonelles 2 « Type III protein secretion system » ou TTSS

Les questions

• S’agit-il d’une PCD ou d’une nécrose ?

• Mécanisme typique de PCD ?

• Mort identique pour tous les macrophages ?

• Conséquences pour le pathogène et pour l’hôte ?

PCD ou nécrose ?

- fragmentation chromatine- activation caspase 3- nucléosomes dans cytoplasme

- perte intégrité membrane- pas d’activation caspase 3- altération des organites

témoins

apoptose nécrose

Mécanisme typique de PCD ?

• Rôle clé de la Caspase 1

• Inhibiteurs de caspases inactifs

• Cytotoxicité courte ou longue

• Pas d’activation de la caspase 3

• Différences selon les macrophages

• Existe sans Caspase 1

• Action de protéines effectrices délivrées par TTSS ?

• Régulation pro ou anti-apoptotique ?

• Action indirecte (ex dégradation de l’actine

Conclusions = apoptose par différents mécanismes

Conséquences

• Stimulation du PCD / salmonelles pour limiter la réaction de l’hôte ?

• Réponse de l’hôte pour limiter l’invasion bactérienne ?

• Souris caspase-1- sont plus résistantes = moins pénétration des salmonelles dans la muqueuse ?

B) le Plasmodium et son vecteurH. Hurd and V. Carter, 2004, Int J Parasitol., 34, 1459-1472

PCD chez le parasite, le vecteur et l’hôte

- Chez le parasite et chez le vecteur :

* images caractéristiques de PCD * blocage par les inhibiteurs de caspases des métazoaires

- Chez l’hôte : * liaison présence du parasite et mort CD4+ et CD8+ ( du Fas)

Les observations

PCD chez le parasite

• Pas d’homologues de caspases dans le génome autres cystéine protéases ?

= «méta » et « para » caspases dont calpaine, cathepsine

• Différences pour l’étape mitochondriale (pas de p53, AIF, Apaf1 et Bcl2)

• Ressemblances pour les signaux inducteurs Heat shock, médicaments, lectines (con A),

sérum, ROS, NO (moustique et hôte producteurs +++)

PCD dans le tube digestif du moustique (1)

– Pas un type cellulaire précis

– Ensemble de caractéristiques communes post-invasion parasitaire (très lié à la chronologie du cycle et du stade parasitaire)

– Présence de caspase-3 like

– Déclenchement par simple contact parasitaire

– = élimination des cellules endommagées et/ou libération du parasite ?

– Le parasite s’échappe intact alors que sensible aux inducteurs et présence de NO (= seuils ?)

PCD chez le moustique (2)

• Réduction de fécondité du moustique / le parasite ( mRNA de vitellogénine) et PCD cellules folliculaires (reversible avec inhibiteur de caspase)

• = Réponse adaptative du vecteur vs stress de son parasitisme ? Un stress physiologique à la fois ?

• = Optimisation par le parasite de la survie de son hôte pour sa propre maturation ? Intérêt à « ménager » l’hôte

C) Virus et modulation de PCD dans la mitochondrie

P. Boya et al., 2004, Biochem. Biophys. Acta, 1659, 178-189

• Virus peuvent 1) augmenter PCD

(dissémination, immunosuppression); 2) réduire (réplication)

Variation selon les familles de virus

• Différentes voies d’action sur PCD (TNF, PKR, P53, caspases, mitochondries)

• Mitochondries => action « MMP », (Mitochondrial Membrane Permeabilisation)

= point central clé

• Virus avec : 1) induction; 2) inhibition de MMP (début du cycle) (fin du cycle infectieux)

• MMP déclenchée par :=> Voie externe : « death receptors

», caspases, MMP)=> Voie interne : action directe

mitochondriale« mitochondrial targeting sequence = MTS)

Mécanismes anti-apoptotiques

Exemple du KSHV (herpes virus : sarcome de Kaposi’ et maladies lymphoprolifératives)

• Différentes protéines virales anti-PCD dont 2 localisées dans mitochondries (K7 et K15)

• K7 contient un MTS

• K7 bloque MMP induit par TNF-α, CD45 death receptor ligand, Bax…

• K7 a un domaine formant un pont Bcl-2 et caspase 3 activée

• K7 régule aussi la voie du calcium

Virus Protein Intracellular Localization

Partners Cellular homologs

Protects cells from

CMV vMIA M Bax, ANT

Oxidants, anti-Fas, Bax, tBid, TN, TG, STS, BFA, NFX, CPX, HCQ

Myxoma M11L M PBR STS, anti-Fas, PPIX

Vaccinia F1L M STS, anti-Fas

KSHV K7 or vIAP M, ER, PM CAML, Bcl-2, activated caspase 3

Survivin delta-Ex3

TG, TNF-α, anti Fas

K15 M, ER HAX-1

EBV BHRF1 M Bcl-2 TRAIL, t-BHP, DNA damage, virus infection

HCV NS2 ER (M with CIDE-B)

CIDE-B CIDE-B

Antiapoptotic viral proteins acting at the mitochondria

Abbreviations: ANT, adenine nucleotide translocase; BFA, brefeldin A; CIDE-B, cell death-inducing; CMV, cytomegalovirus; CPX, ciprofloxacin; DFF45-like effector-B; EBV, Epstein–Barr virus; ER, endoplasmic reticulum; HCQ, hydroxychloroquine; HCV, hepatitis C virus; KSHV; Kaposi's sarcoma-related herpes virus; M, mitochondria; N, nucleus; NFX, norfloxacin; PBR, peripheral benzodiazepin receptor; PM, plasma membrane; PPIX, protoporphyrin IX, TG, thapsigargin; TN, tunicamycin; STS, staurosporine; t-BHP, tert-butyt-hydroperoxide

Mécanismes pro-apoptotiques

Exemple du HBV (hépatite B) : Protéine X (HBx)

• Essentielle pour réplication virale, oncogène

• Sensibilisation des hépatocytes au PCD induit par # stimuli (TNF-α, TRAIL)

• Localisation mitochondriale, perte du ΔΨm, mort

• MTS identifiée et fonctions précisées

• HBx interagit avec 2 protéines mitochondriales (HSP60 et VDAC3)

• Protéines anti-PCD (Bcl2 et Bcl-Xl) protègent

• VDAC3 = rôle pathogène (hépatite chronique et carcinogénèse) ???

Virus Protein Intracellular localization

Partners Effect on mitochondrial morphology

HBV X M, N VDAC3, Hsp60, cFLIP, p53, survivin

Yes

HIV Vpr M, N ANT, cyclophilin A, 14-3-3 proteins, Gag, SP1, GR, TFIIB, p300/CREB-binding protein

Yes

IAV PB1-F2 M, N Yes

HTLV-1

P13 II M, N FPPS, C44, C254

Yes

BLV G4 M, N FPPS

AEV VP3 M Yes

2C M, N Yes

WDSV Orf C M, C Yes

HPV E1E4 M cytokeratin Yes

type 16

Proapoptotic viral proteins acting at the mitochondria

Abbreviations: AEV, avian encephalitis virus; ANT, adenine nucleotide translocase;BLV, bovine leukemia virus; C, cytosolic; ER, endoplasmic reticulum; FPPS, farnesylpyrophosphate synthetase; HBV, hepatitis B virus; HIV-1, human immundeficiency virus-1; HPV, human papillomavirus; HSP, heat shock protein; HTLV-1, human T leukemia virus-1; IAV, influenza A virus; M, mitochondria; N, nucleus; VDAC, voltage-dependent anion channel; WDSV, Walleye dermal sarcoma virus

Séquences en relation avec l’apoptose

1) Généralités sur l ’apoptose :http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/T/TOC.html voir « apoptosis »

2) Fournisseurs :Molecular Probes : sondes fluorescenteshttp://probes.invitrogen.com/handbook/

Roche www.roche-applied-science.com voir « cell biology » puis « apoptosis »

Genentech : www.researchApoptosis.com

Merck : http://www.merckbiosciences.co.uk/html/emd/ip_apoptosiskits.html

Quelques sites web intéressants

Laboratoire de Cytométrie Unité Infectiologie Animale Santé Publique (IASP-213)Centre de Tourstél 02-47-42-77-59

Dominique Kerboeuf, Yves Le Vern

E-mail :kerboeuf@tours.inra.fr levern@tours.inra.fr

Site web :http://www.tours.inra.fr/plates_formes/plate_forme_d_analyses_cellulaires_et_moleculaires

Notre adresse