lampiran esti
DESCRIPTION
LAMPIRAN SKRIPSITRANSCRIPT
69
Lampiran 1. Surat Identifikasi dan Determinasi tanaman
Gambar lampiran 1. Surat identifikasi dan determinasi tanaman sidaguri
70
Lampiran 2. Dokumentasi Penelitian
Gambar lampiran 2. Proses maserasi dengan alat stirer dan Penyaringan vakum
Gambar lampiran 2. Ekstrak Etanol Akar Sidaguri dan Pembuatan Fraksi Air dan Etil Asetat
71
Lampiran 2. Dokumentasi Penelitian (Lanjutan)
Gambar lampiran 2. Fraksi Air EEAS kental dan Enzim Xanthine Oxidase
Gambar lampiran 2. Larutan substrat Xanthine, Dapar fosfat dan Allopurinol
Lampiran 2. Dokumentasi Penelitian (Lanjutan)
72
Gambar lampiran 2. Larutan uji Ekstrak Etanol Akar Sidaguri dan Fraksi Air EEAS
Lampiran 3. Sertifikat Allopurinol Murni
73
Gambar lampiran 3. Sertifikat Allopurinol Murni
Lampiran 4. Perhitungan enzim Xanthine Oxidase, Larutan Buffer, Larutan Induk, Larutan Uji, dan Pembanding (allopurinol)
A. Xanthine Oxidase from bovine milk grade I (X1875 SIGMA)
74
Dalam kemasan enzim xanthine oxidase tertulis:
Pembuatan xanthine oxidase 100 mU/ml
Di dalam labu takar, larutan suspensi enzim xanthine oxidase dalam
ammonium sulfat sebanyak 50 l dicampur dengan larutan buffer fosfat 0,05
M pH 7.5 hingga 5,0 ml. Jumlah larutan induk yang digunakan dihitung
dengan persamaan :
V x 10000.0 mU/ml = 100 mU/ml x 5,0 ml
V = 0,05 ml = 50 µl
Kadar xanthine oxidase dalam campuran larutan pada kuvet:
100 l x 100 mU/ml = 9,76 mU/ml
1025 l
Lampiran 4. Perhitungan enzim Xanthine Oxidase, Larutan Buffer, Larutan Induk, Larutan Uji, dan Pembanding (allopurinol) (Lanjutan)
B. Pembuatan larutan buffer fosfat 0,05 M pH 7,5
5 unit Xanthine Oxidase bovine milk grade 1 dalam suspensi ammonium sulfat 0,4 unit/mg protein dengan volume 0,5 ml ~ 13 mg protein/ml. 0,8 unit/mg protein disimpan di suhu 2-8 C
75
Dipipet 81,4 ml larutan Na2HPO4 1 M dan 18,6 ml larutan KH2PO4 1 M
dimasukkan ke dalam gelas piala yang telah dikalibrasi 2000,0 ml dan telah diisi
500 ml aqua demineralisata bebas CO2, aduk rata kemudian volumenya
dicukupkan hingga volume akhir. pH larutan diperiksa dengan pH meter dan
ditambahkan dengan larutan Na2HPO4/ KH2PO4.
C. Pembuatan larutan induk fraksi air EEAS 10000,0 µg/ml
Di dalam labu takar fraksi air EEAS sebanyak 50,00 mg dilarutkan dalam
beberapa tetes DMSO, ditambah larutan buffer fosfat 0,05 M pH 7,5 hingga 5,0 ml.
D. Pembuatan larutan uji fraksi butanol 400 µg/ml, 500 µg/ml, 800 µg/ml dan
1000 µg/ml
1) Fraksi air EEAS 500 µg/ml.
Di dalam labu takar, larutan induk sebanyak 0,25 ml dicampur dengan larutan
buffer fosfat 0,05 M pH 7,5 hingga 5,0 ml. Jumlah larutan induk yang digunakan
dihitung dengan persamaan :
V x 10000,0 µg/ml = 500 µg/ml x 5,0 ml
V = 0,25 ml = 250 µl
Lampiran 4. Perhitungan mg solid Xanthine Oxidase, Larutan Buffer, Larutan Induk, Larutan Uji, dan Pembanding (allopurinol) (Lanjutan)
2) Fraksi air EEAS 800 µg/ml.
76
Di dalam labu takar, larutan induk sebanyak 0,4 ml dicampur dengan larutan
buffer fosfat 0,05 M pH 7,5 hingga 5,0 ml. Jumlah larutan induk yang digunakan
dihitung dengan persamaan :
V x 10000,0 µg/ml = 800 µg/ml x 5,0 ml
V = 0,4 ml = 400 µl
3) Fraksi air EEAS 1000 µg/ml.
Di dalam labu takar, larutan induk sebanyak 0,5 ml dicampur dengan larutan
buffer fosfat 0,05 M pH 7,5 hingga 5,0 ml. Jumlah larutan induk yang digunakan
dihitung dengan persamaan :
V x 10000,0 µg/ml = 1000 µg/ml x 5, 0 ml
V = 0,5 ml = 500 µl
E. Pembuatan larutan induk allopurinol 1000,0 µg/ml
Di dalam labu takar, allopurinol sebanyak 50,00 mg dilarutkan dalam
beberapa tetes NaOH 1 N, ditambah larutan buffer fosfat 0,05 M pH 7,5 hingga 50,0
ml.
F. Pembuatan larutan allopurinol 10 µg/ml; 12,5 µg/ml; 15 µg/ml
1) Allopurinol 10 µg/ml
Di dalam labu takar, larutan induk sebanyak 0,05 ml dicampur dengan larutan
buffer fosfat pH 7,5 hingga 10,0 ml. Jumlah larutan induk yang digunakan dihitung
dengan persamaan :
V x 1000,0 µg/ml = 10 µg/ml x 10 ml
V = 0,05 ml= 50 µl
Lampiran 4. Perhitungan mg solid Xanthine Oxidase, Larutan Buffer, Larutan Induk, Larutan Uji, dan Pembanding (allopurinol) (Lanjutan)
2) Allopurinol 12,5 µg/ml
77
Di dalam labu takar, larutan induk sebanyak 0,0625 ml dicampur dengan
larutan buffer fosfat pH 7,5 hingga 5,0 ml. Jumlah larutan induk yang digunakan
dihitung dengan persamaan :
V x 1000,0 µg/ml = 12,5 µg/ml x 5 ml
V = 0,0625 ml= 62,5 l
3) Allopurinol 15 µg/ml
Di dalam labu takar, larutan induk sebanyak 0,075 ml dicampur dengan
larutan buffer fosfat pH 7,5 hingga 5,0 ml. Jumlah larutan induk yang digunakan
dihitung dengan persamaan :
V x 1000,0 µg/ml = 15 µg/ml x 5 ml
V = 0,075 ml= 75 l
Lampiran 5. Data Perhitungan Aktivitas Xanthine Oxidase
Bahan Uji Konsentrasi(g/ml)
Absorbansi
Aktivitas(A/menit)
Aktivitas (mU/ml)
Inhibisi(%)
78
Kontrol Negatif
0 0,46000,50400,5680
0,09200,10080,1136
77,3084,6995,44
0
Rata-rata 0,5107 0,1021 85,81Allopurinol 10 0,1900
0,18900,1910
0,03800,03780,0382
31,9331,7632,09
62,7962,9962,60
Rata-rata 0,1900 0,0380 31,93 62,7912,5 0,1390
0,15500,1500
0,02780,03100,0300
23,3626,0525,20
72,77 69,64 70,63
Rata-rata 0,1480 0,0296 24,87 71,0215 0,0690
0,07000.0670
0,01380,01400,0134
11,6011,7611,26
86,48 86,30 86,88
Rata-rata 0,0687 0,0137 11,54 86,55Ekstrak
Etanol Akar
Sidaguri
100 0,25000,25300,2540
0,05000,05060,0508
42,0142,5142,68
50,0450,4650,26
Rata-rata 0,0252 0,0505 42,40 50,25200 0,1860
0,18700,1880
0,03720,03740,0376
31,2531,4231,59
63,5863,3863,19
Rata-rata 0,1870 0,0374 31,42 63,38400 0,1310
0,12900,1320
0,02620,02580,0264
22,0121,6822,18
74,3574,7374,15
Rata-rata 0,1307 0,0261 21,96 74,41
Lampiran 5. Data Perhitungan Aktivitas Xanthine Oxidase (lanjutan)
Bahan Uji Konsentrasi(g/ml)
Absorbansi
Aktivitas(A/menit)
Aktivitas (unit/ml)
Inhibisi(%)
79
Fraksi Air Ekstrak
Etanol Akar Sidaguri
500 0,42400,42800,4260
0,08480,08560,0852
71,2571,9271,58
16,9716,1916,58
Rata-rata 0,4260 0,0852 71,58 16,58800 0,3420
0,34400,3450
0,06840,06880,0690
57,4757,8057,97
33,0232,6432,44
Rata-rata 0,3437 0,0687 57,75 32,771000 0,1270
0,12400,1250
0,02540,02480,0250
21,3420,8421,00
75,1375,7175,53
Rata-rata 0,1253 0,0251 21,06 75,46
Lampiran 6. Contoh Perhitungan Aktivitas Xanthine Oxidase
Rumus :
80
Aktivitas (unit/ml enzim) = (A/menit larutan uji - A/menit larutan blanko) (V) (df)
(12,2) (0,1)
Contoh perhitungan aktivitas xanthine oxidase oleh fraksi air ekstrak etanol akar
sidaguri 500 µg/ml :
Aktivitas (unit/ml enzim) = 0,0852 x 1,025
12,2 x 0,1
= 0,07158 unit/ml enzim x1000
= 71,58 mU/ml enzim
Lampiran 7. Perhitungan Persen Inhibisi Aktivitas XO dari Fraksi air ekstrak etanol akar sidaguri Dan Allopurinol
Rumus :
81
Contoh perhitungan % inhibisi fraksi air ekstrak etanol akar sidaguri 500 µg/ml.
% inhibisi = 85,81 – 71,58 x 100 % = 16,58 % 85,81
Contoh perhitungan % inhibisi allopurinol 12,5 µg/ml.
% inhibisi = 85,81 – 24,87 x 100 % = 71, 02 % 85,81
Lampiran 8. Perhitungan IC50
82
Berdasarkan besar inhibisi dari tiap-tiap bahan uji (data pada tabel III), dibuat
persamaan regresi linier untuk menentukan nilai IC50. Nilai IC50 diperoleh dari
persamaan regresi linier antara konsentrasi bahan uji (sumbu x) dengan persen
penghambatan aktivitas xanthine oxidase oleh bahan uji (sumbu y).
Persamaan regresi linier antara konsentrasi fraksi air EEAS dan % inhibisi :
Y = 0,1139x – 45,8645
50 = 0,1139x – 45,8645
0.1139x = 95,8645
x = 841,65µg/ml
Persamaan regresi linier antara konsentrasi allopurinol dan % inhibisi :
Y = 4,66x + 14,80
50 = 4,66x + 14,80
4,66x = 35,20
x = 7,55 µg/ml
Persamaan regresi linier antara konsentrasi allopurinol dan % inhibisi :
Y = 0,0775x + 44,79
50 = 0,0775x + 44,79
0,0775x = 5,21
x = 67,27 µg/ml
Lampiran 9. Hasil Uji Statistik IC50
1. Uji Homogenitas
83
Analisis:Digunakan taraf kepercayaan 95%, maka = 0,05
Pengambilan Keputusan :
Data IC50 homogen jika asymp.sig > 0,05
Data IC50 tidak homogen jika asymp.sig < 0,05
Keputusan : Karena nilai sig > 0,05; maka Data IC50 homogen
Kesimpulan : Data IC50 antara 3 kelompok yaitu fraksi air EEAS, EEAS dan
allopurinol homogen.
Lampiran 9. Hasil Uji Statistik IC50 (lanjutan)2. Uji Distribusi Normal
84
Analisis :Digunakan taraf kepercayaan 95%, maka = 0,05
Pengambilan Keputusan :
Data IC50 terdistribusi normal jika asymp.sig > 0,05
Data IC50 tidak terdistribusi normal jika asymp.sig < 0,05
Keputusan : Karena nilai sig > 0,05; maka Data IC50 terdistribusi normal
Kesimpulan : Data IC50 antara 3 kelompok yaitu fraksi air EEAS, EEAS dan
allopurinol terdistribusi normal.
Lampiran 9. Hasil Uji Statistik IC50 (lanjutan)
3. Uji Parametrik (Uji Anova)
85
Alasan dilakukan parametrik ini adalah karena data IC50 antara 3 kelompok
memenuhi uji homogen dan uji distribusi normal.
Analisis :
1) Ho : Kelompok Fraksi EEAS = EEAS = Allopurinol
2) Ha : Kelompok Fraksi EEAS EEAS Allopurinol
Digunakan taraf kepercayaan 95%, maka = 0,05
Pengambilan Keputusan :
Ho diterima jika asymp.sig > 0,05
Ho ditolak jika asymp.sig < 0,05
Keputusan : Karena nilai sig 0,00 < 0,05; maka Ho ditolak
Kesimpulan : Ada perbedaan data IC50 antara 3 kelompok
Lampiran 10. Data kecepatan Aktivitas Xanthine Oxidase, Ekstrak Etanol Akar
Sidaguri (EEAS), Fraksi Air EEAS dan Allopurinol Menggunakan Spektrofotometri
86
Lampiran 11. Hasil Penentuan Panjang Gelombang Maksimun Aktivitas Xanthine Oxidase
Sample ID(g/ml)
Absorbansi menit ke 0
Absorbansi menit ke 5
maks
(nm)Aktivitas
(A/menit)
K. Negatif0.01900.01000.0490
0.47900.51400.6170
294.50.09200.10080.1136
Allopurinol 100.01600.01300.0170
0.20600.20200.2080
294.50.03800.03780.0382
Allopurinol 12,5
0.05600.04400.0260
0.19500.19900.1760
294.50.02780.03100.0300
Allopurinol 150.08600.02100.0260
0.15500.09100.0930
294.50.01380.01400.0134
EEAS 1000.02700.01300.0480
0.27700.26600.3020
294.50.05000.05060.0508
EEAS 2000.04200.10100.0870
0.22800.28800.2750
294.50.03720.03740.0376
EEAS 4000.16000.17200.1950
0.29100.30100.3270
294.50.02620.02580.0264
Fraksi Air EEAS500
0.30800.41000.4030
0.73200.83800.8290
294.50.08480.08560.0852
Fraksi Air EEAS800
0.43500.44400.3950
0.77700.78800.7400
294.50.06840.06880.0690
Fraksi Air EEAS1000
0.71000.64200.5920
0.83700.76600.7170
294.50.02540.02480.0250