L’àcid maslínic: de fitoalexina a

nutracèutic?

M. Emília Juan i Joana M. Planas

Departament de Fisiologia & INSA,

Universitat de Barcelona

Barcelona, 3 de novembre de 2015

Introducció

Milloren el benestar físic i mental

Redueixen el risc de sofrir

malalties

Compostos bioactius

Recerca en els efectes

beneficiosos

Nutrients No-Nutrients

Àcid maslínic

Adaptada d’Stiti et al. (2007)

Àcid maslínic

Triterpens

no

esteroïdals

Esterols

2,3-Oxidoescualè

β-Amirina

Eritrodiol

À. oleanòlic

Catió

Oleanil

OH

OH

CH3

CH3CH3

CH3 CH3

CH3CH3

OH

O

L’àcid maslínic al mon vegetal

Lozano-Mena et al. Molecules, 19, 11538-11559, 2014

L’àcid maslínic és sintetitzat en

nombroses espècies vegetals com

un compost no nutritiu amb activitat

protectora en front:

• Estrés

• Lesió

• Infecció fúngica

• Radiació ultraviolada

Fitoalexina

Lesió

Atac per insectes

Temperatures baixes

(extremes)

Bacteris

Radiació

UV

Estrès

Concentracions

baixes de

nutrients

Banaba

Espino blanco

Olea europaea L.

Àcid maslínic

Ácid maslínico (MA)

Ácido 2α,3β-dihidroxiolean-12-en-28-oico

Crataegus oxyacantha L.

Ácido cratególico

Lozano-Mena et al. Molecules, 19, 11538-11559, 2014

1,18 mg/kg Li et al. (2011)

840 mg/kg Lin et al. (2011)

1260 mg/kg Lin et al. (2011)

Ácid maslínic

10,76 mg/kg Li et al. (2011)

287 – 1318 mg/kg Romero et al. (2010)

145 – 251 mg/kg Pérez-Camino y Cert

(1999)

61,9 mg/kg Kalogeropoulos et al. (2011) Ácid maslínico (MA)

Ácido 2α,3β-dihidroxiolean-12-en-28-oico

C30H48O4

Ácido cratególico

6

Efectes biològics de l’àcid maslínic

Antitumoral Juan et al. (2008)

Reyes-Zurita et al. (2011)

Villar et al. (2014)

Antidiabètic Wen et al. (2005)

Liu et al. (2007) Antiparasitari

De Pablos et al. (2010)

Moneriz et al. (2011)

Estimulant del creixement

Fernández-Navarro et al. (2006)

Fernández-Navarro et al. (2008)

Neuroprotector Qian et al. (2011a)

Qian et al. (2011b)

Antioxidant i antiinflamatori

Montilla et al. (2003)

Márquez-Martín et al. (2006)

Allouche et al. (2010)

Cardioprotector Liu et al. (2007)

Hussain Shaik et al. (2012)

Lozano-Mena et al. Molecules, 19, 11538-11559, 2014

OH

OH

CH3

CH3CH3

CH3 CH3

CH3CH3

OH

O

Distribución

y eliminación

• Aguda

• Subaguda

• Subcrónica

Toxicidad

A

100 µm

Digestión

Cáncer de colon

Sangre

Bio

dis

po

nib

ilid

ad

Absorción y

Metabolismo

• Magnitudes

hematológicas y

bioquímicas

• Estudio histopatológico

de los órganos vitales

Efectos biológicos

Ácid maslínic

Ácido maslínico

0 3 6 9 1 2 1 5

0

3 0

3 2

3 4

3 6

3 8

C o n t r o l

Á c id o m a s l ín ic o 1 g / k g

T ie m p o (d ía s )

Pe

so

(g

)

Peso corporal Peso relativo de los órganos

Híg

a d o

Riñ

ó n

P u lmó n

T e s t íc u lo

Ba zo

Co ra

zó n

E n cé falo

0

1

2

3

4

5 C o n t r o l

Á c id o m a s lín ic o 1 g / k g

Pe

so

re

lati

vo

(%

)

Estudi de la toxicitat

0 4 8 1 2 1 6 2 0 2 4 2 8

0

3 0

3 2

3 4

3 6

3 8

C o n t r o l

Á c id o m a s lín ic o 5 0 m g / k g

T ie m p o (d ía s )

Pe

so

(g

)

Híg

a d o

Riñ

ó n

P u lmó n

T imo

T e s t íc u lo

Ba zo

Co ra

zó n

E n cé falo

0

1

2

3

4

5 C o n t r o l

Á c id o m a s lín ic o 5 0 m g / k g

* *

Pe

so

re

lati

vo

(%

)50 mg/kg

Vía oral

Repetida 28

TOXICIDAD SUBAGUDA

TOXICIDAD AGUDA

1 g/kg

Vía oral

Única 14

Ratones

Sánchez-González et al. Mol. Nutr. Food Res., 57, 339-346, 2013

Co

ntr

ol

Ác

ido

m

as

lín

ico

Estudi de la toxicitat

Sánchez-González et al. Mol. Nutr. Food Res., 57, 339-346, 2013

Ausencia de

efectos adversos

Administració i obtenció de muestres

Vena safena

Mostra de sang

(0-24 hores)

SANG

Administració oral (50 mg/kg)

Solvent: 40 % ciclodextrina i

0,5% carboximetilcel·lulosa

Administració endovenosa (1 mg/kg)

Solvent: 20 % ciclodextrina i

0,5% carboximetilcel·lulosa

Sánchez-González et al. Food Chem., 141, 4375-4381, 2013; Mol. Nutr. Food Res., 58, 1970-1979, 2014

Determinació de l’àcid maslínic

Reconstitució

(vòrtex 30 s) 3 min Evaporació a

sequedat

2500xg, 15 min, 4°C

200 µL plasma/orina

2 mL acetat d’etil 100 µL metanol 80%

1500xg, 30 min, 4°C

Segona extracció

Sánchez-González et al. Food Chem., 141, 4375-4381, 2013; Mol. Nutr. Food Res., 58, 1970-1979, 2014

Condicions HPLC

Columna Luna C18 en fase reversa, T = 40°C

Elució en gradient: aigua-acetonitril

Flux: 0.8 mL/min

Condicions MS

Font APCI at 500ºC, mode negatiu

Àcid maslínic: m/z 471.3

Àcid betulínic: m/z 455.3

HPLC-MS

Parámetro Unidades Análisis no

compartimental

Anàlisis

compartimental

Concentración máxima (Cmax) µM 5,36 4,03

Tiempo máximo (Tmax) h 0,513 0,500

Área bajo la curva (AUCO-∞) µmol·h/L 14,87 12,43

Tiempo medio de residencia (MRT) h 4,60 3,68

Biodisponibilidad (F) % 6,25 5,13

Constante de absorción (Ka) 1/h 0,519

Farmacocinética del ácido maslínico

Sánchez-González et al. Mol. Nutr. Food Res., 58, 1970-1979, 2014

0 2 0 4 0 6 0

0

1

2

3

4

5

6

9 0 2 2 5 4 5 0 9 5 0 1 4 5 0

T ie m p o (m in )

Ác

ido

ma

slí

nic

o (

µM

)

Administración oral

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0

0

2

4

6

8

1 0

1 2

1 4

1 6

1 8

T ie m p o (m in )

Ác

ido

ma

slí

nic

o (

µM

)

Administración endovenosa

Metabolisme de xenobiótics

Àcid maslínic

Metabòlits

Membrana

basolateral

Membrana

apical

Fase I

Oxidación/reducción

Fase II

Conjugación

Xenobiótico

Metabolito

CYPs

Transferasas

Conjugado

O2

GSH UGT PAPS

OH

O gluc

ATP ADP

ATP ADP

OATPs

OATs

NTCP

MRP2

MDR1

BCRP

MRP3 OCT1

Fase 0

Entrada

Fase 3

Excreción

Xenobiótico

Fase 3

Excreción

Fase 0

Entrada

HPLC-LTQ-ORBITRAP

MODIFICACIÓN COMPUESTO TIEMPO DE

RETENCIÓN m/z

LOCALIZACIÓN

PLASMA ORINA DUODENO

Y YEYUNO ÍLEON CIEGO COLON

(C30H48O4) Ácido

maslínico 9.22 min 471,3479 + + + + + +

Hidroxilación

(C30H48O5)

M1 4.39 min 487,3425 ND ND - + + + M2 4.77 min 487,3426 + + - + + + M3 5.33 min 487,3425 + ND - + - + M4 6.61 min 487,3425 + ND - - - - M5 7.13 min 487,3424 + + - - - -

Hidroxilación +

Dehidrogenación

(C30H46O5)

M6 4.62 min 485,3273 ND ND - - + + M7 5.38 min 485,3270 ND ND - + + + M8 7.75 min 485,3271 + + - - - +

Dihidroxilación

(C30H48O6)

M9 3.34 min 503,3378 ND ND - + + + M10 3.69 min 503,3375 ND ND - - + + M11 3.98 min 503,3373 ND ND - - + +

Dihidroxilación +

Deshidrogenación

(C30H46O6)

M12 3.39 min 501,3219 ND ND - + + + M13 4.25 min 501,3216 + + - - + + M14 4.63 min 501,3218 + ND - - - +

Deshidrogenación

(C30H46O4) M15 4.75 min 469,3320 - - - - - +

Metabolits de l’àcid maslínic

METABOLITOS DE FASE I Sánchez-González et al. J. Agric. Food Chem., 63, 1126-1132, 2015

Àcid maslínic

Bomba

peristàltica

Paret intestinal

Sangr

?

Absorció intestinal: perfusió

3,6 mL/min

12 mL

5 min

Juan et al., J. Nutr., 140, 489-495, 2010

Absorció d’àcid maslínic

Anestèsia de la rata (ketamina

90 mg/kg i xilacina 10 mg/kg)

Laparotomia, selecció i canulació

d’un segment de jeju (30 cm)

Perfusió de les soluciones d’àcid

maslínic (0,010 – 20 µM)

Juan et al., J. Nutr., 140, 489-495, 2010; Lozano-Mena et al., XXXVI Congreso de la SEBBM, 2013

0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

1 6 0

1 8 0

C o n s ta n te a p a re n te d e d ifu s ió n (K d ) =

6 ,9 5 ± 0 ,3 7 µ L / 5 m in ·m g p e s o s e c o

C o n c e n t r a c ió n p e r fu n d id a (µ M )

De

sa

pa

ric

ión

de

l á

cid

o m

as

lín

ico

(pm

ol/

5 m

in ·

mg

pe

so

se

co

)

0 .0 1 0 .5 2 .5 2 0

0 .0

0 .1

0 .2

0 .3

5

1 5

1 0 0

2 0 0

3 0 0 S in D N P

+ D N P 1 m M

C o n c e n t r a c ió n p e r fu n d id a (µ M )

De

sa

pa

ric

ión

de

l á

cid

o m

as

lín

ico

(pm

ol/

5 m

in·m

g p

es

o s

ec

o)

Absència de

transport

mediat

Absència de

transport

actiu

Absorció d’àcid maslínic

DIFUSIÓ

SIMPLE

Lozano-Mena et al., XXXVI Congreso de la SEBBM, 2013

Efecto antitumoral in vitro

Juan et al., Brit. J. Nutr., 100, 36-43, 2008

Citotoxicitat

0 1 1 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0

0

1 0

2 0

3 0

4 0

C o n c e n tra c ió ( M )

Nú

me

ro d

e c

èl·

lule

s

(%

cè

l·lu

les

mo

rte

s)

À c id o le a n ò lic

À c id m a s lín ic

E x tra c te o liv e s

Proliferació

1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3

0

2 5

5 0

7 5

1 0 0

1 2 5

C o n c e n tra c ió ( lo g M )

Nú

me

ro d

e c

èl·

lule

s

(% c

èl·

lule

s m

ort

es

)

À c id o le a n ò lic

À c id m a s lín ic

E x tra c te o liv e s EC50 = 74,0 ± 3,2 M

EC50 = 160,6 ± 10,6 μM

EC50 = 101,2 ± 7,8 μM

Efecto antitumoral in vitro

Juan et al., Brit. J. Nutr., 100, 36-43, 2008 Juan et al., Brit. J. Nutr., 100, 36-43, 2008

Efecte sobre les espècies reactives d’oxigen

Efecto antitumoral in vitro

Juan et al., Nutr., 136, 2553-2557, 2006; Brit. J. Nutr., 100, 36-43, 2008; Mol. Nutr. Food Res., 52, 595-599, 2008

Caspasa-3

0 2 5 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

6 0 0 0

7 0 0 0

8 0 0 0E xtra c te o liv e s

À c id o le a n ò lic

À c id m a s lín ic

C o n c e n tra c ió (M )

Ac

tiv

ita

t C

as

pa

se

-3

(% d

el

co

ntr

ol)

Efecto antitumoral in vitro

Juan et al., Brit. J. Nutr., 100, 36-43, 2008

CANVIS EN LA PERMEABILITAT DE LA MEMBRANA (Hoechst 33342)

FRAGMENTACIÓ NUCLEAR (Hoechst 33258)

23

Model de càncer de còlon

Focus amb depleció

de mucines (FDM)

Focus de criptes

aberrants (FCA)

Lesiones preneoplàstiques

Tinció amb blau de metilè 2 % en PBS

Tinció amb diamines/ ferro/ blau alcià

Epiteli control

Johnson y Fleet (2013)

24

Perše y Cerar (2011)

Mucosa

normal

Criptes

displàsiques Adenoma Carcinoma

Criptes

hiperplàsiques

Model de càncer de còlon

Intraperitoneal

Dosis 20 mg/kg

Solvent EDTA 1 mM pH 6.5

Volumen administrat 1 mL/kg

n 6 rates/grup

Inductor del càncer de colon

por la seva activitat alquilant del ADN

1,2-Dimetilhidrazina

(DMH)

Disseny experimental

25

Inductor del càncer de colon

por la seva activitat alquilant del ADN

1,2-Dimetilhidrazina

(DMH)

26

Disseny experimental

Punción cardíaca Laparotomia

Admistración

Obtención del colon

Proximal

Medial

Distal Formalina neutra tamponada 10%

Fijación

Major intensitat tinció

Mida 2-3 cops més gran

Solen estar mes elevades

Presenten una obertura allargada

Tinció de blau de metilè

Focus de criptes aberrants (FCA)

Tinció de diamines i ferro, blau alcià i vermell neutre

Focus de criptes amb depleció de mucines (FDM)

Bird (1987)

Caderni et al. (2003)

Observació de lesions preneoplàstiques

Mida 2-3 cops més gran

Solen estar mes elevades

Presenten una obertura allargada

Absència de mucines

27

Efecto del ácido maslínico

0 1 2 3 4 5 6 7

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5

T ie m p o (s e m a n a s )

FC

E (

%)

0 7 14 21 28 35 42 490

50

100

150

200

250

300

350

400

450

Tiempo (días)

Pes

o c

orp

ora

l (g)

Pes

Taxa de conversió

dels aliments

Major intensitat tinció

Mida 2-3 cops més gran

Solen estar mes elevades

Presenten una obertura allargada

Tinció de blau de metilè

Focus de criptes aberrants (FCA)

Tinció de diamines i ferro, blau alcià i vermell neutre

Focus de criptes amb depleció de mucines (FDM)

Bird (1987)

Caderni et al. (2003)

Observació de lesions preneoplàstiques

Mida 2-3 cops més gran

Solen estar mes elevades

Presenten una obertura allargada

Absència de mucines

29

P ro x im a l M e d ia l D is ta l

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

*

Nú

me

ro d

e F

CA

/ á

rea

1 2 3 4 > 4

0

1

2

3

4

5

6

7

*

*

#

N ú m e r o d e c r ip t a s p o r f o c o

Nú

me

ro d

e F

CA

/ á

rea

D M H 5 m g / k g 1 0 m g / k g 2 5 m g / k g

0

3

6

9

1 2

1 5

*

Nú

me

ro d

e F

CA

/ á

rea 22% 24% 35%

Efecte de l’àcid maslínic

DMH

DMH – Àcid maslínic 5 mg/kg

DMH – Àcid maslínic 10 mg/kg

DMH – Àcid maslínic 25 mg/kg

30

P ro x im a l M e d ia l D is ta l

0

1

2

3

4

5

6

7

*

*

Nú

me

ro d

e F

DM

/ á

rea

DMH 5 mg/kg 10 mg/kg 25 mg/kg0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

*

Nú

me

ro d

e F

DM

/ á

rea

1 2 3 4 > 4

0 .0

0 .2

0 .4

0 .6

0 .8

1 .0

N ú m e r o d e c r ip t a s p o r f o c o

Nú

me

ro d

e F

DM

/ á

rea

38% 44% 39% DMH

DMH – Àcid maslínic 5 mg/kg

DMH – Àcid maslínic 10 mg/kg

DMH – Àcid maslínic 25 mg/kg

Efecte de l’àcid maslínic

31

Ácido maslínico

De un componente bioactivo… …a un nutracéutico?

Espectrometria de masses

Centres Científics i Tecnològics – UB

Olga Jáuregui

Isidre Casals

Servei d’Experimentació Animal

(Facultat de Farmàcia)

AGL2009-12866 y AGL2013-41188-R Ministerio de Economía y Competitividad

2009-SGR-00471 y 2014-SGR-1221 Generalitat de Catalunya

Anàlisis Clíniques

CAP Just Oliveras

(Hospitalet de Llobregat)

Grup de Fisiologia i Fisiopatologia

Nutricionals

(Departament de Fisiologia)

Joana M. Planas

M. Emília Juan

Marta Sánchez

Glòria Lozano

Agraïments

Unitat de Biofarmàcia i Farmacocinètica

(Departament de Farmàcia

i Tecnologia Farmacèutica)

Helena Colom