1

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

FACULDADE DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

VETERINÁRIAS

ÁTILLA HOLANDA DE ALBUQUERQUE

INFECÇÃO EXPERIMENTAL POR Salmonella Enteritidis EM POMBOS

(Columba livia): AVALIAÇÃO DA VIA E PERÍODO DE EXCREÇÃO AO MEIO

AMBIENTE

Fortaleza, Ceará

2011

2

ÁTILLA HOLANDA DE ALBUQUERQUE

INFECÇÃO EXPERIMENTAL POR Salmonella Enteritidis EM POMBOS

(Columba livia): AVALIAÇÃO DA VIA E PERÍODO DE EXCREÇÃO AO MEIO

AMBIENTE

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de

Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como

requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre

em Ciências Veterinárias.

Área de Concentração: Reprodução e Sanidade

Animal.

Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade Animal

Orientador: Prof. Dr. William Cardoso Maciel

Fortaleza, Ceará

2011

3

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Estadual do Ceará

Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho

A345i Albuquerque, Atilla Holanda Infecção experimental por Salmonella Enteritidis em pombos

(Columba Livia): avaliação da via e período de excreção ao meio ambiente / Atilla Holanda Albuquerque. – 2011.

76 f. , enc. ; 30 cm. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual do Ceará,

Faculdade de Medicina Veterinária, Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Veterinárias, Fortaleza, 2011.

Área de Concentração: Reprodução e Sanidade animal. Orientação: Prof. Dr. William Cardoso Maciel. Co-orientação: Prof. Dr. Régis Siqueira de Castro Teixeira. 1. Pombos. 2. Inoculação. 3. Salmonella Enteritidis. I. Título.

CDD: 636.089

4

ÁTILLA HOLANDA DE ALBUQUERQUE

INFECÇÃO EXPERIMENTAL POR Salmonella Enteritidis EM POMBOS

(Columba livia): AVALIAÇÃO DA VIA E PERÍODO DE EXCREÇÃO AO MEIO

AMBIENTE

.

Defesa em: 09/12/2011 Conceito obtido:

Banca Examinadora

_______________________________________ _____________________________________

Prof. Dr. William Cardoso Maciel Dr. Régis Siqueira de Castro Teixeira

(Orientador) (Examinador Co- orientador)

_______________________________________ _____________________________________

Profa. Dra. Rosa Patricia Ramos Salles Profa. Dra. Salette Lobão Torres Santiago

(Examinador) (Examinador)

BIOLAB Universidade Estadual do Ceará- UECE

e

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade

de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará,

como requisito parcial para a obtenção do título de

Mestre em Ciências Veterinárias.

5

A minha Mãe

Maria Holanda Gomes que

sempre me incentivou e me

apoia a investir no que há de

bom e importante na vida!

Dedico

6

AGRADECIMENTOS

Quero inicialmente agradecer a DEUS por ter me dado forças e

determinação de cumprir essa etapa da minha vida que foi concluir o mestrado.

À Universidade Estadual do Ceará – UECE representada pelo Programa de

Pós-Graduação em Ciências Veterinárias – PPGCV- e seu corpo docente, pela

competência e conduta na transmissão de seus ensinamentos.

Ao Laboratório de Estudos Ornitológicos - LABEO, pela oportunidade de

conhecer o mundo das aves e da pesquisa científica.

Ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e

Tecnológico), pelo apoio financeiro com a manutenção da bolsa de auxilio durante o

curso de mestrado, contribuindo para a conclusão de uma importante etapa da minha

vida.

Ao Laboratório de Ornitopatologia da UNESP Jaboticabal por contribuir no

meu trabalho de mestrado e também ceder à cepa de Salmonella a qual foi utilizada

neste trabalho.

Aos professores e funcionários do Programa de Pós-Graduação em Ciências

Veterinárias (PPGCV).

Ao meu orientador Prof. Dr. William Cardoso Maciel que me concedeu a

oportunidade de realizar o mestrado, e sempre apostando na minha capacidade diante de

tantos momentos difíceis, orientando não só como um professor, mas também como um

amigo.

À Rosa Patrícia Ramos Salles que me ajudou com seus ensinamentos, pela

compreensão, companheirismo, carinho, apoio nos momentos mais difíceis da minha

vida.

Ao Isaac Neto Goes da Silva que me ajudou em vários momentos durante

meu mestrado com seus ensinamentos e companheirismo.

7

Ao meu amigo Régis Siqueira de Castro Teixeira pela capacidade de ajudar

a me deixar louco com tantas perguntas na escrita do meu projeto, estas que agradeço,

pois contribuíram bastante para enriquecê-lo.

A minha grande amiga e quase segunda mãe ou irmã inseparável Elisângela

de Souza Lopes por ter me ajudado nas coletas, execução do trabalho e por me fazer ter

paciência até comigo mesmo.

Aos amigos Roberta Cristina da Rocha e Silva, Windleyanne Gonçalves

Amorim Bezerra, Valdez Juval Rocha Gomes Filho.

Aos estudantes de iniciação científica do LABEO: Camila Muniz

Cavalcanti, Ricardo José Pimenta Felício Sales.

Aos novos integrantes do LABEO Débora Nishi Machado, Isabel Cristina

Lima Santos, Clarice Pessoa Almeida, Suzan Vitória Girão Lima, Pablo Perón, Manuel

Rafael Felipe Rocha, Karen Denise Macambira, Valdiana da Silva Gomes pela ajuda

durante a realização da parte prática do trabalho.

Aos ex-integrantes do LABEO Josué Moura Romão, Thania Gislaine

Vasconcelos de Moraes, Emanuella Evangelista da Silva, José Daniel Mores de

Andrade, Samuel Bezerra de Castro, Adonai Aragão de Siqueira, Pedro Emídio Leite

Moraes Ferreira, Lalucha Duarte Bezerra e Helda Vilma Posser Neto.

Aos meus pais José Amadeu de Albuquerque (in memoriam) e Maria

Holanda Gomes de Albuquerque que permitiram que eu buscasse sempre o

conhecimento.

Ao meu grande amigo Daniel da Costa Negreiros que incentivou e

acompanhou meus primeiros passos para a realização do meu mestrado, compartilhando

a sua fé na minha capacidade em conseguir tudo o que eu queira tentar na minha vida

quando eu mesmo ainda não tinha.

8

Aos meus amigos de todas as horas que me deram grande apoio e me

ajudaram bastante no final do meu trabalho, Carlos Henrique Pinheiro, Graziano

Moraes e Alex Sousa Bezerra.

E não podia esquecer as aves (pombos), que ajudaram na concretização desse

trabalho.

Agradeço aos membros da banca examinadora composta pelo Dr. Régis

Siqueira de Castro Teixeira, Profa. Dra. Rosa Patricia Ramos Salles e Profa. Dra.

Salette Lobão Torres Santiago pelas contribuições e competências na análise deste

trabalho.

E todos aqueles que direta ou indiretamente ajudaram na execução desse

trabalho meus sinceros agradecimentos.

9

Nada lhe posso dar que já não exista em

você mesmo. Não posso abrir-lhe outro

mundo e imagens, além daquele que há

em sua própria alma. Nada lhe posso dar a

não ser a oportunidade, o impulso, a

chave. Eu o ajudarei a tornar visível o seu

próprio mundo, e isso é tudo.

Hermann Hesse

10

RESUMO

Os pombos domésticos (Columba livia) pertencem à Ordem columbiformes,

família Columbidae. A alimentação dos pombos é bastante variada (sementes, restos de

alimentos) o que favorece a multiplicação dessas aves, resultando em transtornos de

caráter ambiental e de saúde publica, pois os mesmos podem transmitir enfermidades

virais, fúngicas e bacterianas. Dentre as bacterianas destaca-se a Salmonelose, zoonose

de grande importância em saúde pública. A cepa Salmonella Enteritidis (SE) é

responsável pelo maior número de surtos em humanos. As aves têm um papel

importante na disseminação de salmonelas e podem atuar como portadores

assintomáticos, excretando continuamente o patógeno nas fezes. Nos columbídeos o

comportamento da SE ainda é pouco elucidado, portanto, este trabalho teve como

objetivo inocular em pombos por via oral uma cepa de Salmonella Enteritidis resistente

ao ácido nalidíxico (SENarl) isolada de galinhas, para avaliar a via e o período de

eliminação da mesma ao meio ambiente. Utilizou-se 64 pombos adultos (F4) alojados

em pares por gaiola, divididos em dois grupos: A (n=32) e B (n=32) com doses de

1,9x106 UFC/mL e 1,9x10

8 UFC/mL respectivamente. Cada grupo foi dividido em dois

subgrupos para análise swabs cloacais e concentração de SE em órgãos como fígado e

baço (n=24) e concentração de SENarl em fezes (n=8), subgrupo 1 e subgrupo 2

respectivamente. Nos dias 3, 7, 14, 21, 28 e 35 pós-inoculação (Dpi), foram coletadas

amostras de fezes e foram eutanaziados quatro pombos de cada grupo para coleta de

fígado e baço para análise de UFCs e frequência de positividade para SENalr após

enriquecimento dos órgãos macerados e incubados em caldo Selenito Cistina contendo

40μg/mL de novobiocina (SCNov). Nos dias 3, 5, 7, 10, 14, 17, 21, 24, 28, 31 e 35

foram coletados os swabs cloacais para avaliar a positividade do patógeno. Observou-se

que não houve óbito das aves durante todo o experimento. Não foi possivel realizar a

contagem UFCs de SENalr nos órgãos, porém, foi possível recuperar SENalr nos

órgãos dos pombos do grupo B com 7 Dpi após enriquecimento seletivo em SCNov

com posterior plaqueamento em ágar verde brilhante com ácido nalidíxico (25 µg / mL)

e novobiocina (2 µg / mL). Outra consequência ocorrida em função da dosagem

administrada foi a não detecção do patógeno no fígado ou baço a partir de 14 Dpi.

Observou-se nos swabs a excreção do patógeno até 14 Dpi, sendo que de maior

dosagem (grupo B) teve maior excreção do patógeno (p<0,05) em relação ao grupo A

apenas nos dias 3 e 5 Dpi. A utilização de uma cepa não adaptada aos pombos parece ter

11

influenciado na baixa frequência de SENalr nas amostras obtidas de swabs cloacais.

Como também apresentar excreções intermitentes de SENarl, devido aos achados do

patógeno nas fezes até 14 Dpi, fazendo necessário programas mais eficazes de controle

de Salmonella em pombos, não adotando apenas o método de cultura de swab cloacal

como determinante de um diagnóstico, assim como utilizar maiores amostragens de

pombos e periodicidade dessas coletas em tais casos, para assim saber o estado real das

aves.

Palavras-chave: Pombos. Inoculação. Salmonella Enteritidis.

12

ABSTRACT

The domestic pigeon (Columba livia) belong to the Order Columbiformes, family

Columbidae. The feeding of pigeons is quite varied (seeds, food scraps) which favors

the multiplication of these birds, resulting in disorders related to the environment and

human health, as they may transmit viral diseases, fungal and bacterial infections.

Among the highlights is a bacterial salmonellosis, zoonosis of major public health

importance. The strain Salmonella Enteritidis (SE) is responsible for the largest number

of outbreaks in humans. Birds have an important role in the spread of salmonella and

can act as asymptomatic carriers, continuously excreting the pathogen in the stool. In

columbídeos the behavior of the SE is still poorly understood, therefore, this study

aimed to inoculate in pigeons by an oral strain of Salmonella Enteritidis resistant to

nalidixic acid (SENarl) isolated from chickens to evaluate the route and timing of

disposal of the same the environment. We used 64 adult pigeons (F4) housed in pairs

per cage, divided into two groups: A (n = 32) and B (n = 32) at doses of 1,9 x 106 CFU /

mL and 1,9 x108 CFU / mL, respectively . Each group was divided into two subgroups

for analysis cloacal swabs and concentration of SE in organs such as liver and spleen

(n=24) and SENarl concentration in feces (n=8), subgroup 1 and subgroup 2

respectively. On days 3, 7, 14, 21, 28 and 35 post-inoculation (dpi), stool samples were

collected and four pigeons were euthanized from each group to collect liver and spleen

CFUs and frequency analysis of positive SENalr after enrichment of organs macerated

and incubated in Selenite Cystine broth containing 40μg/mL of novobiocin (SCNov).

On days 3, 5, 7, 10, 14, 17, 21, 24, 28, 31 and 35 cloacal swabs were collected to assess

the positivity of the pathogen. It was observed that there were no deaths of birds

throughout the experiment. Unable to count SENalr of CFUs in the organs, however,

was able to recover the bodies of pigeons SENalr Group B with 7 dpi after selective

enrichment in SCNov with subsequent plating on brilliant green agar with nalidixic acid

(25 µg / mL) and novobiocin (2 µg / mL). Another consequence occurred due to the

dosage administered was not to detect the pathogen in the liver or spleen from 14 dpi.

Swabs was observed in the excretion of the pathogen up to 14 DPI, with the highest

dose (group B) had increased excretion of the pathogen (p <0.05) compared to group A

only on days 3 and 5 dpi. The use of a strain not adapted to pigeons appears to have

influenced the low frequency of SENalr in samples obtained from cloacal swabs. But

also make excretions SENarl intermittent, due to the findings of the pathogen in feces

13

up to 14 DPI, making necessary the most effective programs for control of Salmonella

in birds, not only by adopting the method of cloacal swab culture as a determinant of a

diagnosis, as well as use larger samples of pigeons and frequency of these collections in

such cases, in order to know the real state of the birds.

Keywords: Pigeons. Inoculation. Salmonella Enteritidis.

14

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

DNA – Ácido Desoxirribonucléico

H2S - Ácido sulfídrico

IgA – Imunoglobulina A

LABEO - Laboratório de Estudos Ornitológicos da FAVET/UECE

LIA - Agar Lisina-Ferro

mg - Miligrama

µg – Micrograma

OMS – Organização Mundial de Saúde

PCR – Reação em Cadeia pela Polimerase

pH - potencial hidrogeniônico

RV – Rapapport-Vassiliadis

SIM - Sulfeto, Indol e Motilidade

SC – Selenito-Cistina

SE – Salmonella Enteritidis

SG – Salmonella Gallinarum

SP – Salmonella Pullorum

SPF – Livres de Patógenos Específico

TSI - Tríplice Açúcar Ferro

15

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 Salmonella Enteritidis isolated from liver and spleen samples of inoculated

pigeons………………………………………………………........................................49

TABELA 2 Absolute (n) and relative (%) frequencies of positive swabs for Salmonella

sp. in the post-inoculation period……........................................................................51

TABELA 3 Recovery of Salmonella Enteritidis in feces of pigeons post-inoculation

(cfu/g)............................................................................................................................. 52

16

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO...........................................................................................

17

2. REVISÃO DE LITERATURA..................................................................

18

2.1 Pombos........................................................................................................ 18

2.2 Gênero Salmonella...................................................................................... 19

2.2.1 Histórico................................................................................................... 19

2.2.2 Etiologia................................................................................................... 21

2.2.3 Epidemiologia (Transmissão).................................................................. 24

2.2.4 Patogenia.................................................................................................. 28

2.2.5 Patologia.................................................................................................. 29

2.2.6 Sinais Clínicos......................................................................................... 33

2.2.7 Métodos de diagnósticos.......................................................................... 34

2.2.8 Controle................................................................................................... 36

2.2.9 Imunidade e Vacinação...........................................................................

38

3. JUSTIFICATIVA........................................................................................

40

4. HIPÓTESE CIENTÍFICA.........................................................................

41

5. OBJETIVO..................................................................................................

42

5.1 Objetivo Geral............................................................................................. 42

5.2 Objetivos Específicos..................................................................................

42

6. CAPÍTULO 1. Dissemination of Salmonella Enteritidis in

Experimentally Infected Pigeon……………………………………….……

43

7. CONCLUSÕES...........................................................................................

58

8. PERSPECTIVA...........................................................................................

59

9. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA...........................................................

60

17

1 INTRODUÇÃO

Os pombos são aves pertencentes à Ordem columbiformes, família

Columbidae, gênero Columba que compreende uma única espécie, Columba livia,

conhecido popularmente como pombo doméstico (HARRISON & GREEN SMITH,

1994). Sua alimentação é constituída essencialmente por grãos e sementes, entretanto,

pão, ração de animais e sobras alimentares em lixo pode fazer parte de sua dieta

(SOUZA, 1987; ARAÚJO, 1999). Adaptaram-se perfeitamente ao ambiente urbano e

convívio com seres humanos, encontrando alimento nas ruas, praças, escolas habitando

diversas formas de esconderijo, como por exemplo, debaixo de telhados, forros de

casas, peitorais de janelas, em cima de aparelhos de ar condicionado e obras

abandonadas.

A disponibilidade de alimentação e local para refúgio, associada a sua

expressiva capacidade de adaptação, favorecem intensamente a reprodução dessas aves,

tornando-as uma praga urbana, o que resulta em problemas de contaminação ambiental

por meio das suas fezes excretadas. Essa situação torna-se preocupante para os seres

humanos, pois os pombos podem ser afetados por uma variedade de enfermidades

infecciosas virais, fúngicas, parasitárias e bacterianas, sendo algumas de caráter

zoonóticos (RITCHIE et al., 1994; RUPIPER, 1998; TIZARD, 2004). Também estão

sujeitos a servir como reservatórios, portadores e transmissores de diversos agentes

patogênicos de importância para criação de outras aves, apresentando, portanto,

relevante risco para saúde pública (CUBAS et al., 2006).

Dentre os possíveis agentes microbianos que podem atingir os pombos,

destacam-se as bactérias do gênero Salmonella, principalmente a do sorotipo Enteritidis,

que possui importância mundial e pode ser transmitida ao homem ou a outros animais

através desses columbídeos (ACHA e SZYFRES, 2003). Segundo Tauxe (1991), as

aves são consideradas a principal fonte de disseminação da salmonelose para os

humanos.

Vários autores vêm pesquisando e conseguindo isolar Salmonella através de

fezes e swabs cloacais em pombos. Casanovas et al. (1995) analisaram 400 amostras de

swabs cloacais de pombos urbanos na cidade de Barcelona e encontraram um

percentual de 1,5% das aves contaminadas por salmonelas. Na cidade de Santiago,

Chile, Toro et al. (1999) coletaram fezes diretamente do reto de 100 pombos submetidos

a eutanásia e verificaram que 3% das aves eram positivas para Salmonella spp. Nessa

18

mesma cidade, González-Acuña et al. (2007), além de fezes retais, isolaram Salmonella

spp. em diversos órgãos de 100 pombos, encontrando um total de 4% de contaminação

bacteriana. Adesiyun et al. (1998) detectaram 5% de positividade para Salmonella sp.

nas fezes de pombos pertencentes à Trinidad. Passamonti et al. (2000), conseguiram

isolar Salmonella spp. em pombos em 2,3% de 130 cidades italianas averiguadas.

O comportamento de columbídeos infectados com bactérias do gênero

Salmonella spp. ainda é pouco elucidado, principalmente a respeito da Salmonella

Enteritidis (SE). Dessa forma, faz-se necessário conhecer o comportamento da SE em

pombos inoculados infectados por esse agente, e analisar a via de excreção e o período de

eliminação do patógeno ao meio ambiente.

19

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Pombos

A ordem Columbiformes é composta por 8 famílias, 67 gêneros e 296

espécies vivas, bem como onze extintas (incluindo três espécies do gênero Dodo)

(LEVI, 1963). Existem pelo menos 800 variedades columbídeas domesticados

globalmente pertencentes a esta ordem. Estas podem ser sistematicamente diferenciadas

do pombo da rocha pela morfologia corporal, tamanho e peso, desvios do esqueleto,

musculatura bico e cere, coloração e desenho da plumagem (em estrutura de penas

particular) e morfologia de penas (VOGEL et al, 1992).

O tamanho dos Columbiformes varia desde o pequeno porte, como o de

pardais, ao de grande porte, como os de galinhas. Eles podem se mover de forma eficaz

no chão e no ar. Sua morfologia aerodinâmica e sua plumagem fechada, que cobre

quase todo o corpo, reduz a resistência do ar durante de vôo e permite que o ar passe ao

redor do corpo. Eles têm um pescoço relativamente curto, cabeça pequena, pequena

cauda e quatro (em algumas espécies, cinco) dedos curtos. Os Columbiformes

produzem vocalizações variadas, incluindo sons de cooing, uivos, zumbidos, risonhas

ou assobiando (ABS, 1983). São encontrados em todo o mundo, exceto no Ártico e

Antártico.

A maioria deles possuem grande habilidade de vôo, capazes de voar sobre

grandes extensões de água para colonizar as ilhas oceânicas. Os ancestrais dos pombos

encontrados nas Ilhas Galápagos atravessaram quase 1000 km do oceano. Essas aves

ocupam habitats que variam de florestas densas para grandes campos abertos. Essas

regiões podem ser arbóreas, parcialmente terrestre ou exclusivamente terrestre. Os

columbídeos também podem ser encontrados em regiões áridas, assim como mangue e

pântanos. São na grande maioria monogâmicos, fazem seus ninhos de forma oval

ninhos utilizando folhas e galhos em arbustos e também podem fazer em abrigos

rochosos. De acordo com o habito alimentar podem ser divididos em dois grupos, os

que se alimentam principalmente de sementes e os que consomem frutas, no entanto,

existem muitas espécies que pode também se alimentar de pequenos invertebrados. O

pombo doméstico existe em todo o mundo próximo a pessoas em regiões rurais e

urbanas. Existem 13 subespécies de C. livia e mais de 100 raças (FOWLER e CUBAS,

2001).

20

Embora os historiadores e os cientistas não estejam de acordo sobre a data

exata da domesticação do pombo pelo homem, estima-se que isso aconteceu durante

cinco ou seis mil anos. Os babilônios, egípcios, líbios são considerados como os

primeiros povos a domesticarem os pombos. Esse processo ocorreu quase que

simultaneamente em cada uma dessas regiões, isso foi possível devido aos laços de

proximidade que existia entre estes povos com tais aves. O pombo da rocha viveu no sul

do Mediterrâneo, este foi quem deu origem ao conhecido pombo doméstico. Vários

tipos de pombos de vida livre são distribuídos em todo o mundo, a capacidade de

adaptação dessa espécie é observada, pois são vistos diariamente em todos os países

(PIÑEIRO et al., 2009).

Após sua domesticação se disseminaram por todo o planeta. Sua utilização

inicial era envio de mensagens quando criados por reis e campanhas militares, e seguida

pela sua beleza cativante. Hoje o pombo doméstico, independentemente de raça, tem

sido utilizado pelo homem para alimentação, comunicação, pesquisa e entretenimento,

como aves ornamentais ou animais de estimação. Ele tem sido um símbolo de pureza,

paz, liberdade e dignidade que aparecem nos textos religiosos, fábulas, histórias infantis

populares (PIÑEIRO et al., 2009).

2.2 GÊNERO Salmonella

2.2.1 Histórico

O tifo, enfermidade humana, já era conhecido antes da medicina histórica,

mas somente cerca do século XIX, com a descoberta do Bacterium typhi por Eberth e

Gaffky, foi descrita sua verdadeira etiologia, anteriormente amplamente controvertida.

Em 1880, Eberth descobriu a bactéria no baço e linfonodos de pessoas com tifo e

Gaffky (1884) a isolou em cultivo puro, descrevendo-a morfológica e biologicamente

(CORRÊA e CORRÊA, 1992). Em 1885, o Médico Veterinário Dr. Daniel Elmer

Salmon isolou e descreveu pela primeira vez o micro-organismo denominando-o de

bacilo da peste suína (Bacterium suipestifer) hoje, conhecida como Salmonella

cholerae-suis. Em 1900 Lignières denominou o gênero Salmonella deste agente do

paratifo em homenagem ao Dr Salmon. Na Alemanha, em 1888, foi isolada a Bacterium

enteritidis de um surto de toxinfecção alimentar onde 58 pessoas foram afetadas devido

à ingestão de carne bovina contaminada (BARROW, 1993). Depois de 1900,

21

Schottmüller designou como paratifo as enfermidades abdominais do homem similares

ao tifo.

Em aves, a primeira descrição documentada de salmonelose foi feita no ano

de 1885 em pombos e, somente, entre os anos 1920 e 1930, foram descritos os

primeiros surtos em galinhas e perus (SILVA, 1991). Com o tempo, diversos autores

vêm isolando numerosos agentes do grupo, com maior incidência, às Salmonella

enterica sorovar Typhimurium (ST) e Salmonella enterica sorovar Enteritidis (SE),

espécies particularmente responsáveis pelas toxinfecções alimentares no homem. A

Salmonella foi identificada como uma importante causa de doenças há 100 anos e tem

sido objeto de extensivos estudos (LAX et al., 1995).

No início do século XX, a caracterização das bactérias do gênero

Salmonella ainda era confusa, mas com a utilização de provas sorológicas a partir de

1925, começou a ficar mais clara. Posteriormente, foram descritos vários sorotipos de

Salmonella, aproximadamente 900, classificados através da terminologia de White, que

deu origem ao esquema de Kaufmann-White, o qual foi reconhecido a partir de 1932

(CORRÊA e CORRÊA, 1992). Nos séculos XIX e XX, a febre tifóide, causada por S.

Typhi predominou entre as salmoneloses humanas, tornando-se rara a partir de 1950. As

manifestações clínicas da salmonelose em seres humanos passaram de uma infecção

sistêmica para uma gastroenterite de origem alimentar, provocada por vários sorotipos,

marcada por diarreia, febre e dor abdominal, com rara invasão sistêmica (TIETJEN,

1995).

A partir de 1980, ocorreram surtos humanos causados pelo sorovar

Enteritidis nos EUA, Grã – Bretanha e outros países da Europa, chamando atenção pelas

fontes comuns de infecção. As investigações epidemiológicas identificaram o consumo

de ovos ou alimentos contendo ovos como responsáveis pela maioria dos surtos devido

a sorovares específicos de SE. Estas informações foram divulgadas com grande alarde

pelos veículos de comunicação, causando grandes prejuízos aos produtores de ovos

(SILVA e DUARTE, 2002). A SE foi inicialmente introduzida em granjas avícolas

através de ratos, que são considerados um reservatório natural desta bactéria. A SE foi

isolada de roedores presentes em áreas urbanas já em 1930, no entanto, somente na

década de 80, a SE se disseminou em grandes proporções em planteis avícolas

(BÄUMLER et al., 2000). Uma provável razão para este fato seria a infecção de lotes de

aves reprodutoras, que através da via vertical disseminou-a para a progênie (LISTER,

1988).

22

2.2.2 Etiologia

Salmonella é uma bactéria pertencente à família das Enterobactereaceae

que inclui mais de 2500 sorotipos, entre os quais 1367 pertencem à subespécie enterica

(CAMPOS, 2002). Estão amplamente difundidas na natureza, sendo capazes de infectar

o trato intestinal de animais, tanto de sangue frio quanto de sangue quente, entre eles o

homem.

São bactérias móveis, exceto as salmonelas específicas das aves: Salmonella

enterica sorovar Pullorum (SP), causadora da pulorose e a Salmonella enterica sorovar

Gallinarum (SG) causadora do tifo aviário. São bastonetes curtos, Gram negativos,

aeróbios e anaeróbios facultativos de fácil crescimento em meios comuns (BIER, 1981).

São relativamente resistentes ao calor e substâncias químicas, porém não sobrevivem à

temperatura de 55 ºC em 1 h ou 60 ºC de 15 a 20 minutos (GAMA, 2001). As

salmonelas são bactérias mesófilas, com temperatura de crescimento ótimo entre 35 º C

e 37 º C, possuem forma de bacilos pequenos medindo 0,7 a 1,5µ de diâmetro por 2,0 a

5,0µ de comprimento. A maioria dos sorotipos é produtora de gás, a partir da

fermentação da glicose, podendo utilizar também o citrato como fonte de carbono, tendo

a maioria dos sorovares capacidade de produzir H2S (JONES et al., 2000). Apresentam

lisina e ornitina descarboxilase positiva, são urease e indol negativos e reduzem o

nitrato a nitrito (CAMPOS, 2002).

Temperaturas reduzidas retardam o crescimento, portanto o controle dessa

variável é expressivo no comércio de produtos de origem avícola (GAST e HOLT,

2001). Este fato, é colocado em prática em diversos países, citando o Canadá por

exemplo, que a inspeção federal exige temperaturas entre 2° e 3º C na conservação de

carcaças, 1º C para miúdos, 10º C para cortes, sala de desossa, setor de embalagens e

sala de gotejamento (COSTA, 1996)

No Brasil (Brasil, 1998) a portaria 210 do Ministério da Agricultura,

Pecuária e Abastecimento estabelece os critérios técnicos da inspeção tecnológica e

higiênico-sanitária de carne de aves. Esta estabelece no processamento das carcaças a

vazão de água dos tanques de resfriamento (chillers) deve ser monitorada, sendo que a

temperatura de água de entrada ser inferior a 16 oC na entrada e, inferior a 4

oC na saída

a fim de que a temperatura das carcaças seja igual ou inferior a 7 oC no final do

processo.

23

Em relação ao pH, a Salmonella spp. cresce em intervalo de 4,5 a 9,0, com

crescimento ótimo na entre 6,5 a 7,5, sendo este o pH da maioria dos alimentos de

origem animal. Segundo Costa (1996), geralmente em pH abaixo de 4,0 e acima de 9,0

as salmonelas são destruídas lentamente.

Para a distinção dos sorovares, são utilizados antissoros que reagem com

antígenos presentes na célula bacteriana. Existem três diferentes tipos de antígenos que

podem identificar os sorovares de Salmonella spp. : antígeno somático (O), antígeno

flagelar (H) e o antígeno capsular de virulência (Vi). Composto por repetidas

subunidades de oligossacarídeos, existindo um tipo imunológico de antígeno ”Vi”,

encontrado somente nas S. Typhi, S. Dublin, S. Paratyphi C (CAMPOS, 2002) e

S. Hirschfeldii (FRANCO e LANDGRAF, 1996). O antígeno somático O apresenta-se

na porção mais externa da parede bacteriana e corresponde à parte antigênica da camada

de lipopolissacarídeos (LPS), presentes na membrana celular de todas as bactérias Gram

negativas como Salmonella spp. (REEVES et al., 1996; SELANDER et al., 2002).

O antígeno H é localizado na porção média, sendo o filamento flagelar, a

Salmonella ssp. possui dois tipos de antígeno H, os da fase 1 e de fase 2. Os antígenos H

da fase 1, são homólogos a outras bactérias entéricas , enquanto antígenos H de fase 2

são específicos do gênero Salmonella (CAMPOS, 2005).

Essas subunidades formam regiões altamente variáveis, em que os tipos de

arranjos dos açúcares determinam diferentes epítopos e assim, a especificidade de cada

sorovar (KONEMAN et al., 2001). Devido à presença dos antígenos na camada de

lipopolissacarídeos (LPS), estes facilitam o contato direto da bactéria com o ambiente,

contribuindo na interação do agente com o hospedeiro. Isso faz com que Salmonella

spp. possa resistir em diferentes condições como nas fezes, poeira, ambientes secos,

acidez do estômago, lúmen do intestino, espaço extracelular dos tecidos do hospedeiro e

dentro de macrófagos (RYCROFT, 2000). O autor também descreve que uma mutação

no formato da cadeia LPS modifica o formato de crescimento da colônia em placa,

fazendo com que deixe de crescer em formato liso (S) passando para um crescimento

irregular, e assim denominado de cepa rugosa (R). Os antígenos da membrana celular

mais comuns dentro da subespécie enterica são aqueles encontrados nas salmonelas dos

sorogrupos A, B, C1, C2, D e E (UZZAU et al., 2000; GRIMONT e WEILL, 2007).

Atualmente, a Organização Mundial de Saúde (OMS), através do Centro de

Referência e Pesquisa de Salmonella, recomenda uma nomenclatura que reflete os

recentes avanços na taxonomia do gênero, consistindo de duas espécies, Salmonella

24

enterica classificada em seis subespécies (enterica, salamae, arizonae, diarizonae,

houtenae e indica) e Salmonella bongori (POPOFF et al. 1996). Os nomes foram

mantidos somente para os sorotipos da subespécie enterica, que devem ser escritos com

a primeira letra maiúscula e não devem ser de forma itálica (CAMPOS, 2002). Logo, a

denominação de Salmonella “enteritidis” passando a ser Salmonella enterica

subespécie enterica sorotipo (ou sorovar) Enteritidis, ou de forma simplificadamente de

Salmonella Enteritidis (POPOFF et al., 1996).

Sabe-se que a Salmonella enterica, subespécie enterica, representa o maior

número de sorotipos (RODRIGUES, 2005) e dentre estes, cerca de 80 a 90 são os mais

relatados em casos de infecção dos seres humanos e animais e em alguns casos podem

infectar as aves, causando o ou não o paratifo aviário que de forma horizontal, por meio

de produtos alimentícios de origem avícola, estão associados a casos de toxinfecção

alimentar em humanos (BERCHIERI JÚNIOR, 2000). Sorotipos pertencentes a

subespécie entérica podem provocar as seguintes enfermidades em aves industriais:

pulorose, causada por S. enterica sorovar Pullorum; tifo aviário, causada pela S.

enterica sorovar Gallinarum; e o paratifo aviário, causado por qualquer Salmonella que

não seja um dos agentes da pulorose ou do tifo aviário. Entre as paratifóides, destacam-

se Salmonella enterica sorovares Enteritidis, Typhimurium e Agona, que ocasionam

salmoneloses em diversos animais (LAX et al., 1995). Em pombos a salmonelose

constitui uma infecção por cepas Salmonella patogênica específica (PASMANS et al.,

2003), em particular a Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Typhimurium

variante Copenhague bacteriófagos 2 e 99 (POHL et al., 1983, PASMANS et al., 2004).

A Salmonella Typhimurium e Salmonella Enteritidis foram dos sorotipos

mais isolados de seres humanos nos Estados Unidos, em 2005 (CDC, 2007). Em termos

financeiros, os prejuízos causados pelas salmoneloses em seres humanos nos Estados

Unidos da América estão estimados em 3,5 bilhões de dólares anuais, cálculo

contabilizando em perdas de produtividade e gastos com medicamentos (UNITED

STATES, 1995). Na Inglaterra e no País de Gales, um surto ocasionado por Salmonella

Enteritidis em 1.482 indivíduos, 73% dos prejuizos formam diretamente associados com

o diagnóstico, tratamento e faltas ao trabalho (ROBERTS e SOCKETT, 1994).

A Salmonella Enteritidis é comumente isolada de materiais avícolas

enquadrando-se como principal responsável pela ocorrência de infecções humanas

(PERESI et al., 1998; MUNRO et al., 1999) e a Salmonella Typhimurium adquiriu

caráter relevante sendo microrganismo emergencial, principalmente em países europeus

25

(FISHER, 1997), sendo ampliado o monitoramento da presença de Salmonella spp. em

carcaças de frangos para a identificação dos sorovares (ALEXANDRE et al., 2000;

BRASIL, 2003). No Brasil, a S. Enteritidis (SE) é o sorotipo mais identificado nos

casos de toxinfecção alimentar em seres humanos desde a década 1990. Nos Estados

Unidos, entre 1985 e 1995, foram descritos 582 surtos provocados por SE, relacionados

com 24.000 doentes, 2.200 internações e 70 óbitos, incluindo crianças e idosos

(DICKEL, 2004).

2.2.3 Epidemiologia (Transmissão)

Bactérias do gênero Salmonella são isoladas em todo o mundo, no entanto,

em áreas de criação animal intensiva, principalmente de suínos, bovinos e aves, os

relatos são ainda mais frequentes (OIE, 2004). Répteis, aves e mamíferos podem ser

afetados por salmonelose. Tanto as salmonelas específicas das aves quanto as paratíficas

podem causar infecção do ovário e gerar problemas na produção, resultando em baixos

índices zootécnicos e prejudicar a comercialização dos produtos de origem avícola no

mercado interno e externo (BERCHIERI JÚNIOR e BARROW, 1999). A justificativa

para a sua presença são os carreadores crônicos assintomáticos e a aptidão que a

bactéria possui em se manter viável no meio ambiente por longos períodos e até mesmo

de se multiplicar, quando em condições favoráveis de umidade, pH e nutrientes

(STELLMACHER, 1999).

A epidemiologia da Salmonella spp. é bastante complexa devido aos formas de

transmissão (HINTON, 1988). Aves, mamíferos e répteis são carreadores em estado

latente ou assintomáticos, e todos podem excretar a bactéria pelas fezes, são portanto,

reservatório e fonte de infecção para outros animais e seres humanos, assim como,

fonte de contaminação para o meio ambiente (POPPE, 2000). Ao se tratar de aves de

produção é difícil determinar como um lote foi infectado ou como ocorre a

disseminação bacteriana no plantel. Seres humanos, aves domesticas e silvestres

contaminadas, assim como, equipamentos e água contaminados podem fazer parte do

mecanismo de transmissão da salmonela (SILVA e DUARTE, 2002). Incubação de

ovos e aerossol contaminados com Salmonella spp.(HOLLINGER, 2000; KINDE et al.,

2004; BERCHIERI JÚNIOR e FREITAS NETO, 2009)

26

Animais domésticos e insetos como pulgas, baratas e moscas (JOVER, 1968).

Segundo Berchieri Junior e Barrow (1999) a SE pode sobreviver através do ciclo vital

das moscas. Holt et al. (2007) realizaram uma pesquisa em que forneciam mosca

(Musca domestica) contaminadas com SE para galinhas livres de patógenos específicos

(SPF). Monitorando a excreção fecal de SE nas aves durante três semanas, obtiveram

103 a 107 células/g de fezes, após a primeira semana do desafio. Concluíram que moscas

contaminadas com SE podem transmitir a bactéria para as aves. No mesmo estudo,

observou-se também que moscas livres de Salmonella spp. foram colocadas em contato

com aves desafiadas com SE e que após 48h de exposição, aproximadamente 50% das

moscas estavam contaminadas, concluindo que podem se contaminar por meio do

contato com aves infectadas e com isso, disseminar a bactéria para outras aves e meio

ambiente.

O gênero Salmonella não tem sido descrito como agente casual nas

infecções em animais domésticos, porém, Ribeiro et al. (2003) em um relato de caso,

identificaram a SE como possível responsável de infecção do trato urinário de um cão,

confirmando as condições dos cães como reservatórios do gênero Salmonella.

A contaminação de matérias primas e rações para aves contribuem para a

introdução de Salmonella nos planteis (GIRÃO, 1985). O isolamento de Salmonella é

possível em ração pronta como também em seus ingredientes. A matéria que compõem

a ração, tanto as de origem animal como as de origem vegetal (milho e soja), são fontes

potenciais do patógeno para aves de granja (DAVIES, 1992). Vários sorovares foram

isolados de matérias-primas utilizadas para produção de ração para aves. Dentre eles

estão: S. Agona e S. Typhimurium (grupo B), S. Mbandaka e S. Ohio (grupo C1), S.

Panama (grupo D1), S. Cubana e S. Havana (grupo G), além de outros sorovares como,

S. 4,12:i:-, S. Inganda, S. Infantis, S. Mbandaka O14+, S. Grumpensis (HUGH-JONES et

al., 1975; YOSHIMURA et al., 1979; BERCHIERI JÚNIOR et al., 1984; BERCHIERI

JÚNIOR et al., 1989; HOFER et al., 1997; SOUZA et al., 2002).

Relatos de presença de mais de um sorovar, principalmente em ingredientes

de origem animal como farinha de carne, há tempos, também tem sido relatada na

literatura (MIRANDA et al., 1978; BERCHIERI JÚNIOR et al., 1984). A detecção de

bactérias em matérias-primas e rações prontas demonstra ser este um meio de

transmissão considerado de grande importância para a disseminação (BERCHIERI

JUNIOR. et al., 1984). Silva e Duarte (2002) relataram que praticamente todos os

levantamentos realizados em uma retrospectiva de Salmonella no Brasil, não houve a

27

ocorrência dos sorovares adaptados às aves como: Salmonela Pullorum (SP),

Salmoenlla Gallinarum (SG) nem Salmonella Enteritidis (SE), mas mesmo assim, as

matérias primas de origem animal têm sido retiradas das formulações de rações como

forma de controle de Salmonella ou as mesmas têm sofrido processo de peletização

(BERCHIERI JUNIOR. et al., 1984). Segundo Gama (2001), com a peletização da

ração a uma temperatura superior a 60º C pode ocorrer a eliminação da Salmonella spp.

da ração, desde que não ocorra recontaminação pelo manuseio, por ratos ou insetos. A

porta de entrada da bactéria é geralmente a via oral e ou respiratória (TANNOCK e

SMITH, 1971) e a via vertical (BARROW e LOVELL, 1991).

Os alimentos de origem animal são as principais fontes causadoras de

infecção humana, dentre eles os de origem avícola (OLIVEIRA e SILVA, 2000), em

destaque estão os ovos e seus derivados (RODRIGUE et al.,1990; HUMPHREY,1994),

principalmente o consumo de maionese caseira (DUARTE e SILVA, 2002). A SE pode

infectar um lote de aves e invadir lotes vizinhos sem apresentar nenhum sintoma da

doença. Causar infecção inaparente não limitar-se ao intestino, estendendo-se aos

órgãos internos, incluindo o sistema reprodutivo, com consequente contaminação da

progênie ou de ovos comerciais para consumo humano (PEREIRA et al., 1999).

O primeiro relato de envolvimento de SE com infecção originada do

consumo de alimentos preparados com ovos, ocorreu em 1986 em um surto nos Estados

Unidos, relacionado a uma massa comercial congelada e recheada com uma mistura de

queijo, condimentos esterilizados e ovos crus (SILVA E DUARTE, 2002).

Baú et al. (2001), analisando amostras de produtos procedentes de frangos

encontraram prevalência de 10,48% de amostras contaminadas por Salmonella.

Descrevendo ser 77% destas amostras contaminadas com SE. Este alto índice confirma

uma tendência de contaminação que vem ocorrendo mundialmente (RODRIGUE et al.,

1990).

A contaminação de ovos por Salmonella pode ocorrer de duas formas,

através da forma vertical – via transovariana (BARROW e LOVELL 1991; METHNER

et al., 1995) e/ou através de infecção horizontal, ocorrência frequente na contaminação

de ovo nos ninhos ou cama (CARRIQUE-MAS e DAVIES, 2008). Na transmissão

vertical a Salmonella spp. quando coloniza os órgãos do trato reprodutivo como ovário,

oviduto e folículos ovarianos, o ovo pode ser contaminado antes da oviposição e se esse

estiver fértil, a progênie poderá nascer infectada (POPPE, 2000). Já a transmissão

28

horizontal a contaminação de ovos por salmonelas paratíficas pode acontecer por meio

da penetração do patógeno pela casca, quando o ambiente em que as aves estão

inseridas esteja contaminado (CARRIQUE-MAS e DAVIES, 2008). As fezes das

galinhas de postura ao eliminarem Salmonella spp.. Também são consideradas um

importante meio de propagação da bactéria, uma vez que os ovos livres do patógeno ao

entrarem em contato com fezes de galinhas infectadas podem ser contaminados

(BARROW, 1999; GAST, 2003). A contaminação de alimentos por fezes é fonte de

infecção de Salmonella sp. para seres humanos (FORSHELL e WIERUP, 2006).

O agente localizado na vagina se adere à casca, ultrapassando-a e

contaminando o conteúdo interno do ovo (MIYAMOTO et al., 1997). A contaminação

horizontal dentro das incubadoras também é freqüente, ocorrendo a contaminação

externa da casca e consequentemente a penetração da bactéria através dos poros

(BAILEY et al., 1994; CASON et al., 1994).

A contaminação vertical (transovariana) pode ocorrer diretamente na gema

ou albúmen através dos órgãos reprodutivos antes da formação da casca

(SHIVAPRASAD et al., 1990). Tanto a SE como a Salmonella Typhimurium (ST)

possuem um potencial igual para colonizar o tecido do trato reprodutivo e os ovos em

formação no oviduto antes da postura (KELLER et al., 1997). Sorovares de Salmonella

altamente invasivos também podem infectar o trato genital da galinha conduzindo à

contaminação dos ovos que no caso de SP pode persistir por meses (BARROW, 1999).

Trabalhos realizados por Cox et al. (1990) mostraram que 75 % das

amostras de fragmentos dos ovos, pool de material e materiais de papel em incubadoras

comerciais continham Salmonella, indicando muitas oportunidades para a contaminação

de ovos recém incubados.

Em pombos, a Salmonella Typhimurium (juntamente com Streptococcus

gallolyticus) é a doença bacteriana mais importante, sendo os animais silvestres

considerados uma fonte de infecção. Os columbídeos infectados podem tornar

portadores do patógeno e excretar a bactéria de forma intermitente por longos períodos

nas fezes. Embora a infecção em humanos com cepas de Salmonella relacionadas ao

pombo seja rara, estas cepas são capazes de causar doenças graves em camundongos

(PASMANS et al., 2004).

A colonização do patógeno das aves é dose dependente e varia com idade em

que a ave é desafiada. Sabe-se que aves de um dia de idade podem ser colonizadas com

menos do que cinco células de Salmonella e que a colonização em aves mais velhas se

29

dá de forma irregular requerendo doses maiores. Apenas um ovo contaminado com uma

única Salmonella pode substancialmente, contaminar outros ovos e aves em uma

incubadora (BAILEY et al., 1994).

2.2.4 Patogenia

A principal forma de infecção por salmonella é a via oral, porém há

confirmação experimental da transmissão aerógena em frangos (Lever e Willians,

1996). Em seguida ocorre a colonização do intestino e tecidos internos, mas pouco sabe-

se sobre os detalhes da colonização e invasão bacteriana (DESMIDT at al., 1998). Os

micro-organismos invadem rapidamente os tecidos dos hospedeiros, através do tecido

linfóide, inclusive as placas de Peyer, no caso das galinhas (BARROW, 1999). Tonsilas

cecais (CHADFIELD et al, 2003). E possivelmente também os enterócitos da mucosa

intestinal (BARROW, 1999).

A invasão ocorre especialmente via superfície apical, onde no interior de

uma distância crítica da célula, a Salmonella induz um rompimento e elongação da

microvilosidade procedendo endocitose (BARROW, 1999). A invasão mostra

alterações teciduais, incluindo infiltrações de linfócitos polimorfonucleares e monócitos

que contribuem para erosão da mucosa intestinal (DARWIN et al., 1999). A salmonela

atinge o intestino delgado onde invade a mucosa, atravessando a barreira epitelial

através das células M sobrejacente aos folículos linfóides das Placas de Peyer

(DARWIN et al., 1999). As células fazem parte da mucosa intestinal e localizam-se

sobre uma coleção de folículos linfóides denominada Placas de Peyer, as mesmas

ingerem bactérias e outros antígenos por fagocitose e os transportam através da barreira

intestinal para os macrófagos do tecido subjacente. Nessa fase acontece a multiplicação

bacteriana em uma taxa que reflete a virulência da linhagem em questão e a genética do

hospedeiro. A patogenicidade da Salmonella sp. está relacionada com o tipo sorológico

da bactéria e adaptação ao hospedeiro. (HUMPHREY, 2000). A S. Typhi é disseminada

nas fezes após infecção da vesícula biliar diferentemente da SG e SP em galinhas que

podem ser disseminadas nas fezes após a infecção do tecido linfóide da parede do

intestino delgado. Em sorotipos mais invasivos, a infecção pode se dar através do trato

reprodutivo, a como exemplo a SE que coloniza os folículos pré-ovulatórios e pode

interagir com as células da granulosa ovariana (THIAGARAJAN et al., 1994).

30

Os pombos com salmonelose excretam as bactérias nas fezes, ocorrendo

assim à disseminação horizontal da doença. Estes se infectam pela ingestão do agente

em alimentos, água de beber, comedouros contaminados. Inicialmente a Salmonella

coloniza o trato intestinal do pombo e a partir deste sitio primário de replicação

comumente invade a corrente sanguínea, causando bacteremia. Durante a disseminação

hematógena, a bactéria alcança diferentes tecidos do organismo, tais como pulmões,

fígado, baço, testículos, ovários, cérebro, músculos, olhos, pele e articulações, onde elas

também se multiplicam. A localização da Salmonella nas gônadas, assim como a

contaminação da casca do ovo, pode eventualmente causar a disseminação vertical da

doença (HERDT e PASMANS, 2010).

Os columbídeos podem se recuperar clinicamente da infecção por

Salmonella, tanto de maneira espontânea como após antibioticoterapia. Entretanto,

alguns desses não conseguem eliminar todas as bactérias, tornando-se portadores

assintomáticos. A Salmonella pode sobreviver dentro de diferentes tipos celulares,

como macrófagos, ou dentro de lesões necróticas. Os portadores tem um papel

importante na patogênese da salmonelose de pombos, uma vez que disseminam a

bactéria de forma intermitente, infectando outros pombos. Dessa forma, a salmonelose

se faz cronicamente presente em planteis de pombos (HERDT e PASMANS, 2010).

A replicação da Salmonella geralmente induz lesões e sinais clínicos,

contudo as lesões também podem surgir na ausência das bactérias. Típico a esse respeito

é o aumento acentuado da articulação do cotovelo que pode se desenvolver meses a

anos após a bactéria ser eliminada do plantel. A patogênese desse tipo de lesão é

desconhecida. O fluido obtido dessas articulações contém com frequência uma grande

quantidade de anticorpos contra Salmonella (HERDT e PASMANS, 2010) .

2.2.5 Patologia

Após a ingestão, a bactéria coloniza o íleo e cólon, invade o epitélio

intestinal, e prolifera para dentro do epitélio e folículos linfoides, onde se instala e

reproduz, conforme as espécies afetadas e o sorotipo do agente (HALE; FORMAL,

1988). Após entrar na corrente sanguínea pode ocorrer septicemia, podendo se observar

lesões hepáticas com aumento de volume do órgão e formação dos nódulos paratíficos,

embora esses achados não sejam patognomônicos. Existe a possibilidade de ser

31

observado o patógeno nos pulmões provocando uma pneumonia lobular geralmente

grave (SATO, 1997).

Em observações macroscópicas pode ser visível sinais de desidratação,

flacidez da pele, saco da gema coagulado ou não absorvido, presença de congestão do

fígado, rins e baço com presença de pequenos pontos branco-acinzentados de áreas de

necrose, perihepatite, pericardite com aderências, peritonite acompanhada

ocasionalmente por focos necróticos e exsudato caseoso nos cecos (SILVA, 1991).

A infecção pode resultar em gastroenterites, peritonites, hemorragias na

camada serosa, no pericárdio e peritônio com inflamação deste, estando os órgãos

contidos na cavidade abdominal, fígado, baço, intestinos recobertos por uma capa fina

de fibrina, inflamação congestiva da mucosa intestinal, focos de necrose e degeneração

do fígado. Em casos de uma severa doença sistêmica, na maioria dos casos, leva o

hospedeiro à morte (BERCHIERI JUNIOR e BARROW, 1995; VAN IMMERSEEL et

al., 2005).

A pulorose está seguramente relacionada com a idade, nível de

contaminação, linhagem das aves e o manejo. A forma aguda e superaguda ocorrem em

pintos com poucos dias de idade, surgindo após a eclosão, pode evoluir rapidamente e

causar alta mortalidade na segunda semana de vida. Após duas semanas, a mortalidade

pode cessar e as aves podem se recuperar (ROCA, 1991). A mortalidade pode em

alguns casos ser de 25 a 30 %, sendo variável devido ao sistema imune das aves e das

condições de manejo utilizado. Aves mais velhas apresentam pulorose na forma crônica,

sendo observada queda de postura de galinhas e em desenvolvimento lento e irregular

das aves jovens.

Na forma superaguda da pulorose não é observada lesões macroscópicas,

porém na forma aguda há aumento do volume e congestão do fígado, baço e rins. Os

pintos apresentam saco da gema mal absorvido, com conteúdo de consistência cremosa

ou caseosa, nódulos branco-amarelados podem aparecer no trato digestório, músculo

cardíaco, pulmão e pâncreas. O pericárdio se torna espesso com exsudato amarelado ou

fibrinoso. Os cecos poderão conter material caseoso e os órgãos internos congestos com

a presença de líquido viscoso no peritôneo, espessamento da parede intestinal e

exsudato na câmera anterior do olho (BERCHIERI JUNIOR, 2000).

Em aves adultas pode ser observado alterações dos folículos ovarianos

como regressão, aparecimento de folículos císticos, hemorrágicos, atrofiados, de

contorno irregular com material caseoso, hemorrágico ou necrosado em seu interior,

32

peritonite fibrinosa, peri-hepatite e pericardite, também são observadas. Nos machos

podem ocorrer pontos ou nódulos esbranquiçados nos testículos. (BERCHIERI

JUNIOR, 2000).

Em termos microscópicos pode-se citar na forma superaguda uma congestão

vascular em vários órgãos como fígado, baço e rins. Na forma aguda e subaguda há

pontos necróticos no fígado, congestão renal e nos cecos de aves jovens há extensiva

necrose da mucosa e submucosa com o lúmen contendo debris celulares necrosados,

misturado com fibrina e heterófilos (BERCHIERI JUNIOR, 2000). Há serosites no

pericárdio, pleuroperitôneo. Em casos agudos, observam-se lesões heterofílicas e

fibrina, já em estágios mais tardios encontram-se apenas linfócitos, plamócitos e células

histiocíticas. No aparelho reprodutivo, são observados ooforites que resultam em

degeneração folicular.

O tifo aviário causado pela SG é uma enfermidade aguda com curto período

de incubação, sendo a mortalidade altamente variável. Roca (1991) cita que há relatos

de percentual de mortalidade em cerca de 100 %. No mesmo lote, pode haver aves com

o quadro clínico da doença e aves com aspecto normal de saúde. Esta enfermidade

apresenta características septicêmicas e toxêmicas. Há congestão dos órgãos internos e

destruição das hemácias pelo sistema retículo-endotelial com conseguinte anemia.

Confirmada por Deshmukh et al. (2005a), ao realizar uma infecção experimental de SG

associada com à micotoxina Fumonisina B1 em codornas japonesas. Em outra pesquisa,

estes mesmos autores verificaram alta mortalidade nos grupos em que havia a infecção

por Salmonella associada à micotoxinas e, além de altas taxas de anemia no grupo

infectado somente com SG (DESHMUKH et al., 2005b).

Segundo Berchieri Junior (2000) também poderá ocorrer esplenomegalia e

hepatomegalia nos quadros agudos. O fígado torna-se friável com coloração atípica

(esverdeado) com pontos necróticos (esbranquiçados) e hemorrágicos. Podem ser

observados pontos necróticos no coração e no baço e este último apresentar ainda

pontos de hemorragia. Na pulorose pode-se observar um processo inflamatório com

formação de nódulos em diversos órgão, assim como o ovário pode estar atrofiado ou

com os folículos hemorrágicos. Em aves acometidas por salmonelas paratifóides, a

infecção do trato digestório é mais eficaz e persistente nos cecos, reto e inglúvio, nesta

ordem (HARGIS et al., 1995).

33

O paratifo causado pelas demais salmonelas que não sejam a SP e SG, dentre

elas podemos citar a Salmonella Enteritidis, que pode ocasionalmente infectar os vários,

oviduto e conteúdo dosovos (POPPE,1999). Autores como DESMIDT et al. (1997)

afirmam que aves com quatro semanas de idade, podem apresentar infiltrações de

heterófilos, mostrando a tendência de S. Enteritidis se localizar nos ovários podendo

contaminar os ovos e conseqüentemente a progênie e causar também peritonites,

pericardite, onfalite e tiflite com nódulos granulomatos, lesões nos cecos, caracterizando

tiflite com nódulos granulomatosos.

THIAGARAJAN et al. (1994) em trabalhos com poedeiras mostraram que S.

Enteritidis pode colonizar as membranas dos folículos pré-ovulatórios através de

interação com as células da camada granulosa.

A capacidade da Salmonella de replicar em diversos órgãos se reflete na

variedade de lesões encontradas nas aves acometidas. Dependendo do órgão acometido

e da extensão da lesão, diversos sinais clínicos gerais e específicos podem ocorrer de

maneira simultânea ou isolada (HERDT e PASMANS, 2010).

Na salmonelose aguda, lesões intestinais com enterite fibrinosa e ulceração

focal estão presentes constantemente, quando ocorre septicemia, observa-se um

aumento do tamanho dos órgãos internos, causado pela atividade inflamatória de

granulocíticos heterófilos e macrófagos. Clinicamente, essa forma aguda da doença em

geral começa com um único pombo do plantel que se recusa a se alimentar e,

eventualmente, apresenta uma diarreia verde viscosa ou sanguinolenta. Apenas

pequenas quantidades de excreções são produzidas, e estas consistem quase que

exclusivamente em urato de cor esverdeada. Poliúria pode estar presente. Após alguns

dias, o columbídeo acometido morre ou começa a se recuperar. Nesse meio tempo,

outros pombos geralmente começam a desenvolver sinais clínicos similares (HERDT e

PASMANS, 2010).

As lesões agudas dos órgãos podem evoluir para necrose focal e formação

de abcessos e granulomas. Os pombos acometidos com tais lesões apresentam estado

geral ruim, até eventualmente sucumbirem. Quando órgãos específicos estão envolvidos

no percurso da doença, sinais dependentes das lesões podem ocorrer. Artrite nas

articulações das pernas e asas pode resultar em claudicação e inabilidade de voar,

respectivamente. O extenso aumento de volume do cotovelo é quase um sinal

patognomônico, embora a articulação escapulo-umeral e o canalis triosseus também

possam estar envolvidos. A infertilidade e/ou morte embrionária são associadas com a

34

multiplicação da bacteria nas gônadas, e a cegueira pode ser atribuída à panoftalmite por

Salmonella. As lesões dermatológicas incluem pequenos abcessos nas pálpebras ou na

região subcutânea do pescoço, assim como ocasional dermatite exsudativa na face

interna da asa. Esporadicamente, ocorre opistótono quando a infecção está localizada no

cérebro. Os sinais respiratórios não são associados com salmonelose, todavia necrose e

formação de abcessos nos pulmões e sacos aéreos são lesões frequentemente

características (HERDT e PASMANS, 2010).

Os surtos repentinos e patogênicos de salmonelose são observados

exclusivamente em filhotes. Estes que podem ser infectados durante um surto de

salmonelose aguda no plantel ou quando pombos portadores assintomáticos são

utilizados para reprodução, uma vez que os reprodutores podem infectar sua progênie

pela transmissão vertical ou neonatal, resultando na mortalidade em massa dos filhotes

normalmente a partir do quinto dia de vida. Em casos menos agudos os filhotes podem

apresentar crescimento retardado, paralisia e penas que não se desenvolvem. (HERDT e

PASMANS, 2010).

2.2.6 Sinais clínicos

Aves acometidas por salmonelose podem apresentar como sinais gerais:

sonolência, fraqueza, anorexia, diminuição da curva de crescimento e amontoamento

das aves. Os ovos contaminados pela bactéria podem favorecer o aparecimento de

pintainhos moribundos e mortos já na incubadora. Em alguns casos, não são observados

sinais evidentes da infecção nos cinco a dez dias após o nascimento dos pintos, no

entanto a doença parece ganhar impulso nos próximos sete a dez dias, chegando com

pico de mortalidade durante a segunda ou terceira semana de vida, período que é

observado o amontoamento das as aves, estas buscando aquecimento (JOHNSON et al.,

1992).

As aves acometidas com pulorose em seus primeiros dias apresentam diarreia

branca a branco–amarelada com morte posterior, resultado da transmissão

transovariana. (BERCHIERI JUNIOR, 2000).

Clinicamente os pintinhos e frangas, oriundos de ovos infectados, logo após o

nascimento, apresentam sonolência, fraqueza, anorexia e podem morrer repentinamente

(SILVA,1994; NASCIMENTO, 1994 ). Observando o pico de mortalidade das aves

acometidas durante a 2ª e 3ª semana de vida (BERCHIERI JUNIOR, 2000).

35

Os pintos nascidos de ovos infectados com o tifo aviário podem nascer

moribundos e mesmo mortos após a eclosão dos ovos, outros podem apresentar

sonolência, fraqueza, inapetência, mau crescimento e desenvolvimento, e cloaca com

matéria fecal aderida de coloração esbranquiçada, já em aves adultas, há uma queda

repentina de consumo alimentar, aves tristes e apáticas, cristas pálidas e encolhidas,

com diarreia amarelo – esverdeada (SILVA,1994; NASCIMENTO, 1994 ).

As aves contaminadas por Salmonella paratíficas podem apresentar sinais

clínicos semelhantes àqueles aos observados na pulorose, e no tifo aviário,

especialmente em aves jovens. Há amontoamento próximo à fonte de calor, perda de

apetite e aumento do consumo de água, diarreia aquosa profusa e emplastramento da

cloaca (BERCHIERI JUNIOR e BARROW, 1999). Nos surtos agudos as mortes

iniciam-se no incubatório nos primeiros dias de idade. Entre o sexto e décimo dia a

mortalidade pode atingir 80% e por vezes, na ausência de sinais clínicos, é alto o

número de ovos bicados e não bicados contendo embriões mortos. Em aves adultas é

observada inapetência, queda de postura e diarreia, sendo predispostas a infecção, as

aves submetidas a um estresse como a muda forçada (BERCHIERI JUNIOR, 2000).

Contudo, a doença em aves com mais de quatro semanas, raramente causa mortalidade,

resultando em altos índices percentuais de aves portadoras/excretoras assintomáticas

(SILVA,1994).

Em seres humanos cometidos por salmonelose, os sintomas variam desde

leves sinais como dores abdominais, cólicas, febre, náuseas, vômito e dor de cabeça

assim como apresentar quadro de septicemia, com óbitos em geral restritos a recém-

nascidos, idosos e pessoas imunocomprometidas. (SILVA, 1991).

2.2.7 Método Diagnóstico

É comum a utilização de swabs cloacal e de órgãos ou fragmentos de

órgãos, para realizar o diagnóstico por isolamento bacteriano de aves com sinais

clínicos da doença ou com suspeitas sorológica. Na monitoria de lotes é mais utilizado

swabs cloacais, swabs de arrasto ambiental, cama, fezes frescas, conteúdo de

comedouros, água, e no caso de poedeiras comerciais e reprodutoras, ovos e embriões

também podem ser cultivados, respectivamente (BERCHIERI JUNIOR e BARROW,

1999).

36

A escolha do procedimento laboratorial adequado é um pré-requisito

essencial para o isolamento de qualquer micro-organismo, pois existem diversos fatores

que podem afetar os resultados de isolamento de Salmonella. Albuquerque et al. (2000)

testaram diferentes meios de cultivo para o isolamento de Salmonella em matérias-

primas, concluíram que para o isolamento de salmonelas, a partir de amostras

naturalmente contaminadas, o caldo de enriquecimento Tetrationato Hajna se mostrou

superior aos caldos Selenito Cistina e Rappaport Vassiliadis , sendo que sua incubação

a 42ºC é vantajosa em relação a 37ºC, e os meios sólidos de plaqueamento em ágar

Verde Brilhante e Xilose Lisina Desoxicolato apresentaram eficiência semelhante. Entre

os exames mais utilizados podemos citar: os testes sorológicos (ELISA, hemaglutinação

rápida em placas) e os meios de cultivo bacteriano (Caldo Tetrationato, Ágar Verde

Brilhante, Ágar de MacConkey, Ágar Salmonella-Shigela, entre outros).

Para o diagnóstico de aves portadoras da pulorose, usa-se o teste de

hemoaglutinação no próprio aviário, usando antígeno de laboratório idôneo controlado

com soros positivos e negativos (Oliveira,1984). O soro e o antígeno devem estar na

mesma temperatura, o resultado é lido depois de misturar uma gota de antígeno e uma

gota de sangue colhido da ave por um período de 1 minuto as reações positivas são as

que apresentarem aglutinação em toda à área da superfície. O teste de soroaglutinação

rápida em placas pode encontrar resultado falso-positivo devido o teste apresentar uma

baixa especificidade e falso-negativo em consequência, também, da baixa sensibilidade

(GAST e BEARD, 1990).

ROCA (1991) cita que pintainhos com SP em fase aguda o patógeno pode

ser isolado a partir de qualquer órgão parenquimatoso. Autores com Berchieri Junior

(2000) enfatizam que os órgãos de eleição para isolamento de Salmonella nos meios de

cultivo são: baço, fígado, coração, ovário, conteúdo intestinal, saco da gema, medula

óssea, pulmão e locais lesionados (articulação-artrite, sacos aéreos-aerossaculite).

Para a identificação do agente do tifo aviário diferenciando-o do agente

causador da pulorose se faz necessário o isolamento e identificação da Salmonella. No

caso do paratifo aviário a produção de H2S é mais intensa e as salmonelas são móveis.

As pesquisas de Salmonella em materiais que podem estar veiculando a bactéria, como

as farinhas de origem animal e ração, iniciam-se com uma etapa anterior ao cultivo em

caldo enriquecido, denominada de pré-enriquecimento. Os caldos de pré –

enriquecimento são água peptonada tamponada, solução de Ringer ¼, caldo lactosado,

entre outros (BERCHIERI JUNIOR, 2000).

37

Os columbídeos que morrem por salmonelose, o agente etiológico pode ser

isolado a partir de órgãos colhidos durante a necropsia. Em animais vivos, o diagnóstico

pode ser confirmado pelo exame bacteriológico das fezes, porém esse método não é

muito seguro para pombos afetados cronicamente, uma vez que eles podem excretar a

bacteria intermitentemente. Desse modo, recomenda-se coletar durante um período de

cinco dias amostras de pool fecal para analise bacteriológica. A Salmonella pode ser

detectada igualmente na inoculação direta na placa de cultura e/ou após enriquecimento

(HERDT e PASMANS, 2010).

Para um diagnóstico rápido de salmonelose, pode ser utilizado o teste de

aglutinação em placa (HERDT e PASMANS, 2010). Neste teste, uma gota de

Salmonella inativada em formaldeído é misturada com uma gota do plasma do pombo

suspeito e colocada sobre placa. A placa é então homogeneizada lentamente por dois

minutos, e uma reação positiva demostrará a presença de anticorpos resultantes da

infecção ou possível vacinação contra salmonelose. Podem ocorrer reações falso-

negativas. E são principalmente os pombos acometidos pela salmonelose aguda com

sinais clínicos graves os que reagem positivamente no teste de aglutinação em placa. Os

cronicamente infectados, assim como os portadores assintomáticos, normalmente

permanecem negativos. O teste de aglutinação em placa também pode ser realizado com

fluidos obtidos das articulações de pombos com artrite.

2.2.8 Controle

O controle da infecção provocada por salmonelas é muito difícil e de resultados

imprecisos, devido ocorrer disseminação cruzada entre as aves e o meio ambiente

(GAMBIRAGI et al., 2003). A habilidade de o sorovar colonizar o trato gastrointestinal

parece estar relacionada à imunidade inata do hospedeiro e à carga genética da espécie,

(BARROW et al. 1994; KINGSLEY & BAUMLER 2000). O estabelecimento da

microbiota intestinal com a idade (CORRIER et al., 1991), assim como o mecanismo de

resistência idade-dependente (DESMIDT et al., 1998b) são fatores que restringem a

colonização intestinal. Entretanto, mesmo sendo poucas as aves que permaneçam com

colonização cecal positiva para a Salmonella spp., estas podem se constituir em

portadoras inaparentes do patógeno até o ciclo final de produção. Desta forma, para

melhor conhecimento da disseminação da Salmonella spp. alguns pesquisadores (MUIR

et al., 1998), inocularam ST em aves industriais adultas por via oral e obtiveram um

38

decréscimo na porcentagem de isolamento em amostras de órgãos após certo período,

contudo a excreção via fezes continuou por longo tempo. Aves infectadas por outros

sorovares como S. Infantis, S. Heidelberg e S. Menstson, também foram capazes de

excretar a bactéria por período de até 41 dias após inoculação. Smith e Tucker (1980)

inocularam ST, SE, S. Senftenberg, S. Oranienburg, S. Montevideo e S. Anatum em

aves adultas e demonstraram que estas excretavam os microrganismos por um período

não muito superior a 15 dias. Autores como Ishola et al. (2009) utilizando uma cepa de

Salmonella Enteritidis em galinhas poedeiras observaram que a maior frequência de

positividade para salmonela nas fezes em cinco semanas de avaliação experimental foi

de 100% e a menor de 40%. Andrade et al . (2007) inoculando Salmonella Enteritidis

em pintos de duas linhagens de corte com um, sete, quatorze e 21 dias pós-eclosão,

observaram que o patógeno invadiu e colonizou o trato gastrintestinal das duas

linhagens, mas a infecção declinou com a idade, sendo mais persistente na linhagem

Ross. O patógeno foi excretado de uma única ave ISA Label até 22 dias de vida e em

quatro aves da linhagem Ross até 35 dias.

O controle da salmonelose é possível, porém difícil. Os programas de

erradicação de plantéis infectados incluem quatro pontos que precisam ser

rigorosamente seguidos: medidas sanitárias, tratamento antimicrobiano, vacinação e

exame bacteriológico das fezes. As medidas sanitárias devem ser realizadas como

primeira medida, e isso inclui a eutanásia de pombos clinicamente doentes, uma vez que

esses animais podem desenvolver lesões crônicas e se tornar portadores assintomáticos.

Pombos valiosos, os quais o proprietário se recusa a sacrificar, devem ser tratados em

quarentena e podem ser reintroduzidos no plantel somente quando for provado estarem

livres de Salmonella pela realização de exames bacteriológicos de amostras fecais.

Medidas sanitárias adicionais incluem a completa limpeza e desinfecção das instalações.

A reprodução deve ser interrompida e a superpopulação evitada. Após as medidas

sanitárias, os pombos restantes devem ser tratados com antibióticos por, no minino 10

dias. In vitro as bactérias são sensíveis a um grande número de antimicrobianos, porém

in vivo os melhores resultados são obtidos com enrofloxacina (200mg/L) ou trimetoprim

(200mg/L) (UYTTEBROEK et al., 1991).

A vacina quando aplicada como medida preventiva, essa não protege os

pombos da colonização por Salmonella, mas reduz a eliminação fecal do agente e limita

os sinais clínicos, incluindo a mortalidade.

39

2.2.9 Imunidade e Vacinação

A resposta imune para Salmonella depende da espécie hospedeira e do

sorotipo infectante. Os conhecimentos sobre a imunidade contra Salmonella são

oriundos de estudos com infecção experimental de camundongos utilizando Salmonella

Typhimurium e os resultados obtidos são extrapoladas para infecções por Salmonella

Enteritidis em aves (VAN IMMERSEEL et al., 2005).

A primeira linha de defesa contra infecções causadas por Salmonella

Enteritidis é constituída pelos leucócitos, linfócitos e imunoglobulina A (IgA)

associados à mucosa (SHEELA et al.,2003). A secreção de IgA limita a colonização da

mucosa intestinal por SE, prevenindo a adesão invasão e multiplicação da bactéria no

intestino (SHROFF et al., 1995). Aves com 28 dias pós-inoculadas oralmente com SE

apresentaram pico de secreção de IgA, produzindo uma redução de lesões na mucosa

intestinal, implicando que esta imunoglobulina pode ter um importante papel no

controle da infecção por SE no intestino (SHEELA et al., 2003).

O significante progresso no desenvolvimento de vacinas contra as

salmonelas vem sendo devido ao gene manipulado no estudo da Salmonella (LAX et al.,

1995). As vacinas inativadas e atenuadas estão sendo empregadas em animais

domésticos, mas a avaliação da eficácia ainda não é muito clara. As vacinas inativadas

de Salmonella têm sido largamente utilizadas para proteção contra as salmoneloses em

experimento animal, entretanto o nível e duração da proteção são baixos (LAX et al.,

1995).

A utilização de vacinas atenuadas é um meio eficiente para aumentar a

resistência contra a infecção por SG, quando outros métodos de controle não são

possíveis. BARROW (1999) afirma que vacinas contra SG poderiam ser eficazes contra

a SE. Trabalhos realizados por Penha Filho et al. (2010), ao utilizarem uma cepa

mutante atenuada de SG, obtiveram uma proteção em frangos desafiados com cepas de

SG selvagem, como também uma proteção cruzada eficiente na redução de infecção por

SE em aves vacinadas com duas doses.

Quando aplicada de forma curativa, a vacina estimula a imunidade celular

de pombos infectados, logo a infecção será eliminada espontaneamente. Após a

vacinação, os pombos podem tornar-se sorologicamente positivos por 3-18 meses.

Podem ocorrer efeitos colaterais resultantes de uma resposta imunológica intensa aos

antígenos vacinais de Salmonella, principalmente em pombos previamente infectados

40

com Salmonella. Ocasionalmente, um pombo morre dentro de 24 horas da vacinação.

Em alguns planteis, grandes nódulos subcutâneos com acúmulo histiocitário do

tipo”corpo estranho” podem se desenvolver no local da injeção de 7 a 10 dias após a

vacinação. Esses granulomas causam dor, anorexia, piora do estado geral e,

eventualmente, a morte. Em casos graves precisam ser removidos cirurgicamente. O

resultado do programa de controle precisa ser monitorado com base na realização

periódica de exames bacteriológicos de amostras de pool fecal, por exemplo, um mês

após o tratamento e, subsequentemente, a cada seis meses e quando houver amostras

positivas, todo o protocolo de tratamento deve ser repetido (HERDT e PASMANS,

2010).

41

3 JUSTIFICATIVA

A grande presença de pombos nas regiões urbanas e rurais, seja de forma

livre ou em criatórios, facilita o contato destas aves com os serres humanos, entretanto,

apesar de alguns achados de alguns relatos científicos sobre Salmonella spp. em

pombos, ainda não há publicações de alto impacto em relação à via e o período de

eliminação de Salmonella Enteritidis por tais aves.

Sendo a salmonelose a zoonose aviária de maior importância em saúde

pública em nível mundial, faz-se necessário o conhecimento da disseminação destes

patógenos através dos pombos.

42

4 HIPÓTESE CIENTÍFICA

Os pombos são transmissores de várias doenças provocadas por enterobactérias,

portanto eles podem eliminar Salmonella Enteritidis através das fezes ao meio ambiente

43

5 OBJETIVOS

5.1 Objetivo Geral

Realizar a inoculação de Salmonella enterica sorovar Enteritidis em pombos (Columba

livia) para avaliar a via e o período de eliminação ao meio ambiente

5.2 Objetivos Específicos

1- Avaliar a relação entre o tempo da inoculação de Salmonella Enteritidis (SE) por

via oral e sua eliminação através das fezes dos pombos inoculados

2- Avaliar a excreção da SE através de swabs cloacais dos pombos inoculados

3- Isolar o patógeno no fígado e baço das aves infectadas por SE

44

6 Capitulo 1

Dissemination of Salmonella Enteritidis in Experimentally Infected Pigeon

[Disseminação de Salmonella Enteritidis em Pombos infectados

experimentalmente]

Periódico: Brazilian Journal of Microbiology

45

Dissemination of Salmonella Enteritidis in Experimentally Infected Pigeon

Átilla Holanda de Albuquerque, William Cardoso Maciel*, Régis Siqueira de Castro

Teixeira, Elisângela de Souza Lopes, Camila Muniz Cavalcanti, Ricardo José Pimenta

Felício Sales, Ruben Horn Vasconcelos, Roberta Cristina da Rocha e Silva,

Windleyanne Gonçalves Amorim Bezerra, Tânia Elizabeth Sampaio Oliveira

Laboratório de Estudos Ornitológicos, Universidade Estadual do Ceará (UECE),

Fortaleza, CE, Brasil.

*Corresponding Author. Mailing address: Av. Rogaciano Leite, 200 Aptº 1303 Bl.

Tulipe, Bairro Salinas, Fortaleza, CE, Brasil.; CEP 60810-000.; Phone/Fax: (085) 3241

1307 or 31019848 or 9989 4742.; E-mail: william.maciel@uol.com.br

46

Resumo

Dois grupos de pombos dométicos (Columba livia) foram experimentalmente

infectados, por via oral, com doses de 1,9 x106 e 1,9x10

8UFC/mL (grupo A e B) de uma

cepa de Salmonella Enteritidis (SE) isolada de galinhas. Verificou-se que nenhumas das

doses utilizadas foram capazes de provocar mortalidade nos pombos inoculados,

entretanto, foi possível recuperar SE no fígado e baço das aves no 7°dia de observação

pós-inoculação (dpi). A frequência de eliminação do patógeno averiguada por meio de

swabs clocais revelou que a excreção do patógeno ocorreu, em ambos os grupos, até o

14o. dia de observação (p<0,05). Entre todas as amostras de fezes coletadas no grupo B

utilizadas para análise da excreção de SE (n=4), verificou-se que três diferentes aves

eliminaram o patógeno, sendo duas no 3°dpi e uma no 7° dpi. O mesmo número de

amostras de fezes foi avaliada no grupo A, sendo constatada que apenas uma ave

eliminou o patógeno, nos dias 7 e 14 dpi, e a concentração do micro-organismo nas

fezes foi inferior a qualquer isolado ocorrido no grupo B. Apesar da baixa frequência de

SE isolada nos órgão e fezes, assim como, o número reduzido de pombos com bactérias

quantificáveis em fezes durante o período avaliado, conclui-se que estas aves, quando

infectadas, podem excretar cepa de Salmonella Enteritidis não adaptada à sua espécie.

Palavras chave: Pombos, Inoculação, Salmonella Enteritidis

47

ABSTRACT

Two groups of domestic pigeons (Columba livia) were experimentally infected orally at

doses of 1.9 x106 and 1.9 x10

8 cfu/mL (group A and B, respectively) with strain of

Salmonella Enteritidis (SE) isolated from chickens. None of the doses used was capable

of causing mortality in the inoculated birds, however, there has been successful

recovery of the pathogen in the liver and spleen on the 7th

day of post-inoculation (dpi).

The elimination of the pathogen often ascertained through cloacal swabs revealed that

the shedding occurred in both groups until the 14th

day of observation (p <0.05). Among

all the stool samples collected in group B (n=4), three different birds eliminated the

pathogen in their feces, but two on the 3rd

dpi and one in the 7th

dpi. The same number

of stool samples was evaluated in group A and only one bird eliminated the pathogen,

on the 7th

and 14th

dpi, and the concentration of micro-organism in the feces was lower

than any sample from Group B. Despite the low SE frequency in organs and stool, as

well as the small number of pigeons with quantifiable bacteria in feces during the study

period, it is clear that these birds, when infected, can shed Salmonella Enteritidis strain

not adapted to their species.

Keywords: Pigeons, inoculation, Salmonella Enteritidis

48

INTRODUCTION

The domestic pigeon (Columba livia) belongs to the order of Columbiformes

and family Columbidae (17). Its reproduction is rapid in environments that offer plenty

of shelter and large quantities of food available, but also lack of predators (23). Their

food consists mainly of grains and seeds, however, foods such as bread, animal feed and

food scraps in trash may also be a part of its diet (28, 3). Such a varied diet favors the

multiplication of these birds, resulting in environmental disorders caused in the places

they inhabit by the accumulation of feathers, feces and remains of nests, leading to

blockages in gutters or storm drain pipes (23).

Concerning the public health, pigeons play an important role in the transmission

of diseases that affect humans and domestic animals, such as toxoplasmosis (21),

Newcastle disease (2), aspergillosis (25), avian tuberculosis (9) and salmonellosis (29).

According to Tauxe (30), birds are considered the main source of salmonellosis

dissemination in humans. Several authors have been researching and isolating

Salmonella spp. through feces, cloacal swabs and organs of pigeons (8, 31, 15, 1, 26,

29). Salmonella Enteritidis has been considered the serovar responsible for the largest

number of outbreaks in humans and birds due to its wide distribution in nature, while

the intestinal tract of animals are the main natural reservoir of this pathogen. The birds

have a particularly important role in the spread of bacteria and may act as asymptomatic

carriers, shedding the pathogen continuously in their feces (10).

The Columbidae birds’ behavior when infected with Salmonella spp. is still

poorly understood, especially regarding the Salmonella Enteritidis, therefore this study

aimed to carry out the inoculation of Salmonella enterica serovar Enteritidis in domestic

pigeons (Columba livia) to evaluate the route and duration of shedding in the

environment.

MATERIAL AND METHODS

Experimental Groups

The study was approved by the Ethics Committee for Animal Use in the registry

number 10244384-0/22 (CEUA-UECE). For this experiment we used 56 domestic

pigeons (Columba livia) from the Laboratory of Ornithological Studies (LABEO). We

selected the fourth generation of pigeons in captivity aged six to twelve months. These

were housed in pairs per cage and separated into two groups which received orally two

49

different inoculum concentration of Salmonella Enteritidis: Group A (low dose) and

Group B (high dose). In these groups we analyzed: the SE concentration of elimination

in feces and in organs, frequency of positive swabs, organs and feces samples. The

inoculation and evaluation of the concentration of Salmonella Enteritidis in organs and

feces was performed according to the methodology adopted by Oliveira et al.(24).

Inoculum Preparation

We prepared a broth containing a Salmonella Enteritidis strain resistant to

nalidixic acid (SENalr) incubated overnight at a temperature of 37 ° C. The birds in

group A received 1 mL of inoculum obtained from culture SENalr diluted by a factor of

about 10-7

containing 1.9x108 colony forming units / mL (cfu/ mL) and group B’s

culture was diluted by a factor of 10-5

, containing approximately 1.9 x 106 cfu / mL.

Microbiological Evaluations

On the 3rd

, 7th

, 14th

, 21st, 28

th and 35

th day post-inoculation (dpi), stool samples

were collected from each cage, four birds from each group were euthanized with spleen

and liver collected for analysis of cfus and frequency of positive SENalr. For the first

step, organs were individually homogenized and diluted in decimal series (1:10) in PBS.

The dilutions were plated on brilliant green agar (Oxoid CM265) containing nalidixic

acid (25 mg / mL) and novobiocin (2 mg / mL) (BGNNov). The plates were incubated

overnight at 42 ° C and the CFU / mL were transformed into log10 for analysis

characterizing the first step. In the second stage, a part from the remaining macerated

organ samples were removed and incubated in selenite broth (CM395 Oxoid.) with

novobiocin (40 mg / L) overnight at 42 ° C, and then were plated in BGNNov and

incubated at 42 ° C for 24 hours to enhance the potential Salmonella growth in the

organs, if the CFUs counting was not possible. The methodology used for the stool

samples was the same as the cited for the first stage of organ samples. Also, two

samples of cloacal swabs were collected per week, and the methodology for the second

stage of organ samples was used again. Before starting the experiment all birds were

inspected according to Zancan et al. (32) to confirm that they were free of Salmonella.

Statistical Analysis

The results of the swabs and stool frequencies from both groups were compared

using the χ2 test with significance p <0.05.

50

RESULTS AND DISCUSSION

During the experiment, there was no mortality in birds. Corroborating Ishola

(20), who used a SE strain previously isolated from chickens and inoculated two

different doses (1,3x104

and 1,3x108

cfu) in chickens 33 weeks of age, not reporting any

mortality. Unlike the findings of Gorham (16), because they isolated a strain of SE from

chicken environment and inoculated (1 X 107 cfu) in chicks from one to seven days old,

and reported a mortality of 11/53 (21%) in one-day-old chicks, of which two in 2 days

post-inoculation (dpi), three in 3 dpi, two in 4 dpi, three in 6 dpi and one at 7 dpi, and in

the group of 7-day-old birds sustained a 2 / 28 (7%) mortality, of which one died in 4

dpi and the other at 7 dpi. The use of a strain not adapted to pigeons may be the

responsible for the absent mortality in the inoculated birds, since S. Enteritidis seems to

evolve and acquire strategies to resist and overcome the host innate immune defenses

(4,13).

Table 01 presents the results concerning the number of Salmonella Enteritidis isolated

from liver and spleen samples of inoculated pigeons.

Table 1. Viable number (log10) of Salmonella organisms per gram of sample after any time post

infection.

Viable number (log10) of Salmonella organisms per gram of sample after any time post infection

3 days 7 days 14 days 21 days 28 days 35 days

Pigeon No L S L S L S L S L S L S

1 - - - - - - - - - - - -

2 - - - - - - - - - - - -

3 - - - - - - - - - - - -

4 - - - - - - - - - - - -

5 - - + - - - - - - - - -

6 - - - - - - - - - - - -

7 - - + + - - - - - - - -

8 - - + + - - - - - - - -

L: líver, S: Spleen;

51

Group A: Birds 1-4: inoculated with 1mL of diluted broth overnight 10-3

(1,9 x 106 cfu / mL); Group B:

birds 5-8: inoculated with 1mL of diluted broth overnight 10-7

(1,9 x 108 cfu / mL);

+ / -: Positive / negative after incubation in selenite broth;

We noted that in the concentration of organ’s SENalr evaluation stage, there was

no bacterial growth and therefore the colony-forming units in the spleen and liver of

both groups could not be quantified. However, we did recover the organs’ SENalr

submitted to enrichment in Selenite Cystine with subsequent plating on BGNNov,

which shows that there was bacterial invasion in the liver and spleen, although greatly

reduced. Gast et al. (14) reported that both the frequency of microbial invasion and the

recovery of the number of pathogen cells in the liver can vary significantly depending

on the exposure dose administered. For the period of time required for the pathogen to

colonize the spleen and liver of pigeons, our results show that the recovery occurred

only in the 7th dpi, which differs from those of He et al. (19), whom testing in hens

found that Salmonella invasion from intestinal tract to internal organs such as liver and

spleen, occurred within a few hours after the initial oral exposure. Other studies may

explain this divergence that occurred when compared to the results obtained in pigeons.

Oliveira et al.(24) in his study showed that hens inoculated orally with a lower dose of

Salmonella (8.5 x 105 cfu / mL) presented the pathogen in the liver and spleen only in

the seventh day dpi, while birds inoculated with the highest concentration (8.5 x 108)

already did on the third dpi. This shows that both the concentrations used in pigeons

were not sufficient to promote invasion in the liver and spleen by the pathogen on the

third dpi.

Another consequence that occurred due to the dosage administered was the non-

detection of the pathogen in the liver or spleen beyond the fourteenth dpi. Both appear

to be relatively low dosages if the objective is to detect the pathogen throughout the

experiment, even when using a strain not adapted to pigeons. The literature shows that

strains not adapted to certain bird species may behave differently even using a dose

close to that used in this work. Ribeiro et al. (27) injected two doses (1.2 x105 and 1.2

x108) of a Salmonella Kottbus strain isolated from ducks in one-day-old chicks, and

analyzed the presence of the pathogen in the liver and spleen in the 15th

and 42nd

dpi,

but they also noted that the lower dose group had lower results compared to the group

with the highest inoculum. Another explanation to the findings in the organs’ SENarl

52

with reduced time seems to be the pathogenicity of the strain, so as this strain may not

be so virulent for pigeons. According to Barrow et al., (5) virulent strains, after their

multiplication, spread to the organs producing a systemic infection.

Table 2. Absolute (n) and relative (%) frequencies of positive swabs for

Salmonella sp. in the post-inoculation period

Dose/ UFC/mL

1,9x106

Dose/ UFC/mL

1,9x108

n (%) n (%)

3rd

Day 2/24 a 8,3 8/24 b 33,3

5th

Day 2/20a 10,0 8/20 b 40,0

7th

Day 5/20 25 10/20 50,0

14th

Day 2/16 12,5 1/16 6,3

21st Day 0/8 0 0/8 0

28th

Day 0/8 0 0/8 0

35th

Day 0/4 0 0/4 0

Table 2 presents the absolute (n) and relative (%) frequencies of positive swabs

for Salmonella sp. in the post-inoculation period. By analyzing the frequency of cloacal

swabs of the two groups of pigeons, we found that pathogen excretion occurred up to

the 14th

dpi, the results showed that in group B (1.9 x108 cfu/ mL) the frequency of

bacteria excretion was significantly higher (p <0.05) when compared to group A (1.9 x

106 cfu / mL) only on 3

rd and 7

th dpi. The use of a strain not adapted to pigeons also

seems to have influenced the low frequency of Salmonella in samples obtained from

cloacal swabs. The use of strains adapted to the species can result in higher rates of

fecal excretion. Ishola et al. (20) inoculated adapted strains in laying hens (10-8

cfu) and

found that the greater frequency of positive results for Salmonella in feces within five

weeks of experimental evaluation was 100% and the lower was 40%. The absence of

major findings with swabs in our work appears to be due to false negatives. Authors

such as Gast (12) highlighted this possibility in the results with paratyphoid infections

when working with chickens reported the possibility of sub-clinical infection where the

infected chickens continued harboring the bacteria in their bodies and feces excreting it

in a variable period of time. Which requires Salmonella control programs to be more

53

effective, not only by adopting the method of cloacal swab incubation as a determinant,

but also by increasing the quantity of samples and the frequency of these collections in

such cases, in order to know the real state of the birds (22).

Table 3 Presents the recovery rates of Salmonella Enteritidis in feces of pigeons

post-inoculation (cfu/g).

Table 3. Recovery of Salmonella Enteritidis in feces of pigeons post-inoculation (cfu/g)

3rd

dpi 7th

dpi 14th

dpi 21st dpi 28

th dpi 35

th dpi

Cages UFC UFC UFC UFC UFC UFC

2 0 0 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0 0

7 0 0 0 0 0 0

10 0 3x102 4x10

3 0 0 0

16 0 0 0 0 0 0

18 0 2x105 0 0 0 0

19 3,8x105 0 0 0 0 0

23 4x107 0 0 0 0 0

Group A: cages 2, 5, 7 and 10: pigeons inoculated with 1mL of a diluted broth overnight 10-3

(1,9 x 106 ufc /

mL); Group B: cages 16, 18, 19 and 23: pigeons inoculated with 1mL of diluted broth overnight 10-7

(1,9 x 108

cfu / mL)

We can see that a group of pigeons that received a low concentration of SE

initiated the shedding in the feces only in the 7th

dpi (3x102), this occurrence was

observed until the 14th

dpi (4x103). Among the birds that received high concentrations

of SE, pigeons from two cages presented bacterial shedding in the 3rd

dpi (3.8 x105 and

4x107) and from one cage in the 7

th (2x10

5), but cell counts were not observed in the

other days of observation. When a micro-organism is detected in the feces, the

colonization of a part or all of the digestive tract may be implied. Barrow et al., (6)

claimed that the colonization of bacteria in the digestive tract can be observed through

54

the excretion in feces and detection of the pathogen is carried out by incubation of feces

or cloacal swabs.

Because it is a strain not adapted to the experimental species used, the doses

administered in this study do not appear sufficient to generate a greater systemic

dissemination, as no bird presented excretion in greater quantity or frequency

considering all the pigeons assessed. Gast (12) stated that inoculated chickens and

turkeys can excrete in the first two weeks after experimental oral infection and

paratyphoid Salmonella can be isolated from the intestinal tract, however, there may be

a high percentage of null contaminated feces.

The short period of pathogen excretion in feces of pigeons can be justified

possibly by the not colonization of the intestine or just a temporary occurrence of the

pathogen in the intestinal tract (6). Another hypothesis for the decline in the frequency

of SENalr excretion in the feces of pigeons seems to be an indication that the birds were

able to reduce the level of systemic infection, probably through a humoral immune

response. (18, 22). However, even if it is a small amount of contaminated feces,

González-Acunã et al.,(15), argued that the dried and fresh pigeon stool pose a high risk

of transmitting to humans, particularly children, elderly, or individuals

immunocompromised, as well as domestic animals.

The doses administrated in pigeons, although relatively low considering the

results found in the organs, cloacal swabs and feces along the 35 dpi, show that these

birds can excrete Salmonella Enteritidis strain not adapted to their species. Since the birds

have access to rural and urban settings, there is the possibility that these birds invade

industrial sheds, defecate on the poultry litter and cause major economic losses and

public health. Experiments with chickens on the litter, showed that reinfection may play a

more important role in the persistence of the infection (7, 11).

ACKNOWLEDGMENTS

We acknowledge the National Council of research and technology development

(CNPq) and the Laboratory of Ornithological Studies (LABEO/FAVET/UECE) for their

support to this study.

55

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59

7 CONCLUSÕES

- As doses administradas nos pombos embora relativamente baixas, demonstram que

estas aves podem excretar cepa de Salmonella Enteritidis não adaptada à sua espécie

- Pombos contaminados com SE podem defecar sobre a cama do aviário e contaminar

as aves, pondendo ser causa de grandes prejuízos econômicos e de saúde pública

- A pesquisa realizada mostrou que cepa de Salmonella Enteritidis não adaptada ao

organismo do pombo doméstico, quando inoculadas nestas aves, podem ser eliminada

através das fezes e re-isoladas através de swabs cloacais e em órgãos

60

8 PERSPECTIVA

A importância do pombo na transmissão da Salmonella sp. para humanos e

animais ainda é um tema que necessita de maiores esclarecimentos. Isso porque essas

aves são consideradas disseminadoras em potencial de diversos patógenos, entre eles

a Salmonella sp., mas escassas são as pesquisas científicas que elucidem o real papel do

pombo na cadeia epidemiológica desta enfermidade.

Faz-se necessário novas pesquisas que empreguem doses infectantes de maiores

concentrações, com o objetivo de esclarecer os possíveis danos causados por esse

patógeno no organismo do pombo e os riscos de transmissão a outros animais e

humanos.

61

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