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"EL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES. PLANEACION,
ORGANIZACION Y NORMAS DE TRABAJO" Y "PREPARACION DE LOS MEDIOS DE
CULTIVO"
Presentado a:
ALINA K. SIGARROA RIECHE
UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS Y AGRARIAS DEL AMBIENTE
INGENIERIA BIOTECNOLOGICA
COLOMBIA
2015
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"EL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES. PLANEACION,
ORGANIZACION Y NORMAS DE TRABAJO" Y "PREPARACION DE LOS MEDIOS DE
CULTIVO"
Presentado por:
PAOLA ALEJANDRA ANGARITA 1610591
JOSE EDELBERTO DIAZ MARIN 1610705
LEIDY XIMENA CAMARGO URIBE 1610740
MARIA ALEJANDRA DUGARTE BOHORQUEZ 1610753
Presentado a:
ALINA K. SIGARROA RIECHE
UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS Y AGRARIAS DEL AMBIENTE
INGENIERIA BIOTECNOLOGICA
COLOMBIA
2015
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Contenido
Introducción .................................................................................................................................................. 4
Objetivos ....................................................................................................................................................... 4
Materiales ...................................................................................................................................................... 5
Metodología .................................................................................................................................................. 5
Diseño, organización y normas de trabajo ................................................................................................ 5
Preparación de soluciones madres o soluciones stock. para el medio basal de murashige y skoog (1962).
................................................................................................................................................................... 6
Preparación del medio de cultivo .............................................................................................................. 6
Conclusiones ................................................................................................................................................. 7
Cuestionario .................................................................................................................................................. 8
Cuestionario 1. .......................................................................................................................................... 8
Cuestionario 2. ........................................................................................................................................ 10
Bibliografía .................................................................................................................................................. 12
Anexos ......................................................................................................................................................... 13
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Introducción
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en
condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos, estos medios son
esenciales en el laboratorio por lo que un control en su fabricación, preparación, conservación y
uso, asegurar la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos.
Un medio de cultivo es una solución acuosa en donde se encuentran disueltas sales minerales
que aportan los elementos esenciales Macronutrientes (N, P, K, S. Ca y Mg) y Micronutrientes
(Fe, B, Mn, Zn, Cu, Mo, y Co). Normalmente es imprescindible una fuente de carbono,
generalmente la sacarosa, debido a la escasa actividad fotosintética de los tejido in vitro. Además,
el medio puede ser enriquecido con Aminoácidos, Vitaminas y Reguladores del Crecimiento. Los
medios de cultivo se preparan a partir de soluciones concentradas 10 o 100 veces (Soluciones
Madre o Stock). En la solución madre se pueden mezclar varias sales minerales siempre que no
se produzcan problemas de precipitación. Algunos elementos, como el Fe, se utilizan en forma de
quelatos para mantener su disponibilidad durante el cultivo. Los medios de cultivo se pueden
utilizar de forma líquida o con un agente gelificante como el agar.
La elaboración de los medios de cultivo se realiza diluyendo las soluciones madre
previamente realizadas. Además, se añade la fuente de carbono y el agente gelificante, que
normalmente es agar. Se pueden hacer distintos medios de cultivo manteniendo la misma
concentración de algunas sustancias, por ejemplo sales minerales y vitaminas, y modificando o
eliminando otras como los reguladores de crecimiento. Tomando como base las sales minerales,
vitaminas y fuente de carbono de Murashige y Skoog se pueden realizar múltiples medios de
cultivo variando los reguladores de crecimiento o su concentración (Murashige y Skoog, 1962)
Objetivos
Dominar todo lo referente a la planeación, organización, equipos necesarios y las normas de
trabajo a seguir en un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales.
Conocer y preparar las soluciones Stock más usadas para medios de cultivo básicos para la
ejecución de los trabajos de cultivo de tejidos vegetales.
Conocer todo el proceso de preparación del medio de cultivo para la ejecución de los trabajos
de cultivo de tejidos vegetales
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Materiales
Bata de Laboratorio
Cuaderno de laboratorio
1 rollo de papel aluminio (Todo el grupo)
Cinta tirro (de enmascarar) o marcador permanente para vidrio
Metodología
Diseño, organización y normas de trabajo
Durante la práctica se discutió sobre los materiales que debemos usar. Las Cuales se dividen en 2:
1. Personales : Uniforme completo, jabón antibacterial
2. Grupal: Alcohol 96%, Hipoclorito 13%, Algodón, Papel aluminio, Envoplasr, Toalla,
Jeringas, etc.
Además también se habló sobre las áreas en las que se divide el laboratorio de biotecnología
vegetal.
1. Área NO estéril.
2. Área Estéril
3. Área Vivero
Cuarto zona de lavado
Cuarto Zona preparación de medios
Cocinas
Dispensador de medios de cultivos
Agitador magnético
Zona de autoclave
Autoclave
Horno
Control de calidad
Cuartos de siembra
Cuartos de crecimiento
Cabinas de flujo laminar
ZONA TRAMPA
ZONA TRAMPA
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Solución A. Macronutrientes:
Nitrato de Amonio 66.0 g/l
Nitrato de Potasio 76.0 g/l
Sulfato de Magnesio x7 H2O 14.8 g/l
Hidrógeno fosfato de Potasio 6.8 g/l
Solución C. Calcio:
Cloruro de Calcio x 2 H2O 150 g/l
Solución E. Hierro en forma de
quelato:
EDTA Na 3.73 g/l
Sulfato de Hierro x 7 H2O 2.78 g/l
Solución D. Yoduro de Potasio:
Yoduro de Potasio 0.83 g/l Solución B. Micronutrientes:
Ácido Bórico 6.2 g/l
Sulfato de Manganeso x 5 H2O 22.3g/l
ó
Sulfato de Manganeso x 1 H2O 16.0 g/l
Sulfato de Cinc x 5 H2O 8.6 g/l
ó
Sulfato de Cinc x 6 H2O 10.5 g/l
Molibdato de Sodio x 2 H2O 0.25 g/l
Sulfato de Cobre x 5 H2O 0.025 g/l
Cloruro de Cobalto x 6 H2O 0.025 g/l
Preparación de soluciones madres o soluciones stock. para el medio basal de murashige y
skoog (1962).
1. Estudie detenidamente la composición del medio MS.
2. Se lavan los frascos, y se llevan al horno
3. Se preparan, por separado, 500 ml de cada una de las soluciones madres que a
continuación se señalan:
Solvente común: Agua destilada
Preparación del medio de cultivo
1.
La los frascos del
cultivo Se esteriliza en horno (155° a 2h)
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2.
Conclusiones
Es importante aprender sobre las diferentes Áreas en las que se divide el laboratorio de
Biotecnología Vegetal, Ya que con esta información se puede obtener un mejor manejo y orden
en el momento de la práctica.
De acuerdo con lo realizado en la presente práctica se concluye que es de gran importancia
preparar adecuadamente los medios de cultivo, añadir la cantidad de solución exacta y disolverla
correctamente para obtener los resultados esperados
Preparar El medio de cultivo
Guardar en el área trampa a T°
ambiente o refrigerada si se
deja por mas de 4 Dias.
Se disuelve con H2O
destilada
Distribuir el medio en los
frascos, Tapar y Rotular
Macronutrientes 25 ml/l
Micronutrientes 1 ml/l
CaCl2 3.0 ml/l
IK 1 ml/l
EDTA-Fe 5 ml/l
Suplementación
Vitaminas MS 2 ml/l
Azúcar 30 gr/l
AJUSTAR pH 6.0
Agar 6 gr/l
2,4 D 0.5 mg/l
El agar se debe añadir una vez
que se ajuste el pH
Sales al
100%
Esterilizar en el autoclave
(120° a 20min)
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El pH debía de estar en un rango de 5.7 a 6.0, empleando el potenciómetro. En este caso se le
agrego NaOH hidróxido sódico y HCL ácido clorhídrico 0.1 N. para nivelar el pH esperado, pues
ya que si el pH era bajo se le agregaba HCL para subirlo
Durante la práctica se logró de forma positiva la elaboración del medio de cultivo para
tejidos vegetales, se obtuvo de igual forma el conocimiento para realizar los cálculos necesarios
para aplicar a este las cantidades que se requiere para dicha elaboración; cálculos los en los
cuales se necesita de la tabla de valores asignada para cada componente.
Cuestionario
Cuestionario 1.
1. Elabore, mediante un esquema, un diseño propio para un laboratorio de cultivo de
tejidos vegetales. Tenga en cuenta y señale, con líneas de puntos, el flujo de trabajo.
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2. Señale dentro del medio de cultivo basal preparado los elementos esenciales estudiados.
a. Están presentes todos ellos? ¿Por qué ocurre esto?
Si están presentes todos los elementos esenciales para el medio de cultivo; componentes
inorgánicos (macro y micronutrientes), componentes orgánicos (fuente de carbono,
vitaminas, agente solidificante.), hormonas y las sustancias reguladoras de crecimiento y
desarrollo junto también con el solvente común; agua des ionizada y bidestilada. Esto se
debe a que estas sustancias y elementos químicos son los esenciales para el desarrollo y
crecimiento de las células del explante y además muchas no son capaces de sintetizarlos.
b. Qué consecuencias podría traer algún error en las cantidades pesadas de los
elementos químicos? Justifique su respuesta.
El error en la adición de la cantidad necesaria de un elemento nos podría causar simplemente
el no desarrollo normal del explante o bien la muerte más concisa de este, puesto que al pasar la
concentración del elemento o componente este causara la intoxicación del explante matándolo o
no dejándolo llegar al desarrollo de la formación foliar o radicular.
3. Qué son las soluciones madres o stock? Con qué fin se preparan en el laboratorio?
Cuales son los factores que deberán tenerse en cuenta para su preparación y conservación
en laboratorio?
Podemos decir que un método de hacer menos tedioso el trabajo para la elaboración de medios
de cultivo para tejidos vegetales y de otras prácticas consiste en preparar lo que se conoce como
"soluciones madre" de algunos de estos componentes (sales minerales, Vitaminas, hormonas,
etc…). Estas soluciones tienen una concentración que suele ser 10, 100 e incluso 1000 veces
superior a la concentración final del medio. Su ventaja no estriba sólo en el hecho de que hay que
pesar menos veces cada vez que se prepara el medio sino también la exactitud de la pesada ya
que algunos compuestos están tan diluidos en la solución final, que la pesada que habría que
hacer estaría por debajo de los límites de exactitud de las balanzas de precisión.
Las soluciones madre se conservan en frigorífico (una nevera con buena refrigeración.) y en
bote topacio (envase de vidrio color ámbar) el cual con unas buenas condiciones y manejo puede
conservarnos las soluciones madre durante algunos meses, desechándose ante cualquier señal de
precipitación.
Se suelen preparar soluciones madre de las sales minerales, los aminoácidos, hormonas,
vitaminas y hexitoles, mientras que la fuente de carbono y el agente gelificante se pesan cada vez
que se va a hacer la preparación del medio ya que se necesitan en cantidades muy elevadas y no
se conservan bien en solución.
4. Investigue sobre los pasos que continúan en la preparación del medio de cultivo final.
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La elaboración de los medios de cultivo se realiza diluyendo las soluciones madre previamente
realizadas. Además, se añade la fuente de carbono y el agente gelificante, que normalmente es
agar, Se pueden hacer distintos medios de cultivo manteniendo la misma concentración de
algunas sustancias, por ejemplo sales minerales y vitaminas, y modificando o eliminando otras
como los reguladores de crecimiento.
Para preparar 1L de estos medios se realiza el siguiente proceso: Colocar en un agitador
magnético una jarra de 1 L de capacidad con unos 400 ml de agua destilada y añadir los
elementos minerales y las vitaminas: - 100 ml del stock de macronutrientes. - 100 ml del stock de
Ca, - 1 ml del stock de micronutrientes, - 10 ml de la solución hierro EDTA (ó 0.2g/L de
secuestrene) - 10 ml del stock de vitaminas. - Adicionar la cantidad estimada de las soluciones de
fitohormonas. - 30 g sacarosa y esperar a que se disuelva. - Añadir agua destilada hasta un
volumen de 1L - Colocar la mezcla en una jarra y ajustar, en un pHmetro, el pH del medio (con
KOH, NaOH ó HCl) hasta 5.8. - Añadir 7,5 g de agar y disolverlo en el autoclave o en
microondas. - Agitar el medio, dosificarlo en los recipientes de cultivo y colocar las tapas. -
Esterilizar el medio en el autoclave durante 20 min a 120o C y 1 Kg/cm2 de presión. - Dejar
enfriar el medio antes de su utilización.
Si algún componente fuera termolábil habría que esterilizarlo por filtración con una jeringuilla
y un filtro de un tamaño de poro menor de 0.22 µm. Este proceso habría que realizarlo en una
cámara de flujo laminar y emplear material estéril.
Cuestionario 2.
1. Por qué se le añade al medio el 2,4 D? A qué grupo hormonal pertenece y que función
realizará en el medio de cultivo? Este medio de cultivo será para obtener plantas
completas? Justifique su respuesta.
El ácido 2,4 diclorofenoxiacetico ( 2,4D) es uno de los reguladores de crecimiento y desarrollo
que se le añade a los medios de cultivo para plantas in vitro; es una auxina de característica
artificial, es utilizada más comúnmente en los medios para la inducción a la formación de callos;
es una sustancia sintética reguladora de crecimiento que no posee estructura indolica pero que
presenta actividad auxinica, esto va a llevar a la formación rápida y alargamiento de los tejidos,
formación de raíces, en fin al desarrollo progresivo de la planta en condiciones de desarrollo
asexual (organogénesis indirecta) a partir de explantes constituidos por células ya diferenciadas.
No habrá formación de planta completa como tal, primero deberá seguir una serie de secuencias
de medios para lograr la planta completa, es decir; medios que favorezcan la caulogenesis,
formación foliar del explante; y rizogenesis, la etapa de formación radicular del explante.
2. Qué tipo de formación deberá esperar a partir de este medio de cultivo? Justifique su
respuesta.
Principalmente en la parte genética el medio esta predispuesto a la variación de este material
genético ya que el 2,4 D es una auxina artificial que va a generar variación genética en el
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explante ósea mutaciones, esto nos indica que las plantas no tendrán características de clones por
el contrario luego de que del callo se pase a la vitroplanta se verán diferencias tanto genotípicas
como fenotípicas en algunas especies. Habrá que tener en cuenta q por ser una organogénesis
indirecta deberá pasar por la secuencia de medios para la formación de la planta completa a partir
del callo formado por el explante con células diferenciadas.
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Bibliografía
http://ocw.uniovi.es/pluginfile.php/2621/mod_resource/content/1/practicas/Cuaderno_Pract_Biot
ec_11_OCW.pdf
http://annymojica.blogspot.com/2012/03/practica-no2-preparacion-de-soluciones.html
http://ocw.uniovi.es/pluginfile.php/2621/mod_resource/content/1/practicas/Cuaderno_Pract_Biot
ec_11_OCW.pdf
http://porquebiotecnologia.com.ar/index.php?action=cuaderno&opt=5&tipo=1¬e=35
http://www.tomate.org.mx/DemoChiles/Lecturas/Documentos/CHILES6.pdf
http://www.exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/Reguladores%20general.pdf
http://148.206.53.84/tesiuami/UAM4339.pdf
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Anexos
Figura 1 Peso de Reactivos
Figura 2 Soluciones para la preparación de medio MS
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Figura 3 Se Afora con Agua Destilada y se agrega el azucar
Figura 4 Mezcla del Medio
Figura 5 Ajustar pH
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Figura 6 Agregar el agar, Mezclar y calentar
Figura 7 Dejar Enfriar el medio, y agregarle las vitaminas y la hormona
Figura 8 Distribuir el medio, Tapar y Rotular