la mucoviscidose et le gene cftr i- historique ii...

Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology

La MUCOVISCIDOSE et le GENE CFTR

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I- HistoriqueII- EpidémiologieIII- CliniqueIV- Diagnostic biologiqueV- Le gène CFTR et ses mutations

V- 1. Introduction V- 2. La mutation ∆F508 V- 3. Spectre des mutations du gène CFTR V- 4. Corrélations génotype-phénotype

VI- La protéine CFTR et ses fonctions VI- 1. Structure de la protéine CFTR VI- 2. Fonctions de la protéine VI- 3. Corrélations des mutations du gène CFTR avec la fonction

canal Cl- VI- 3. 1. Classe 1 : mutations altérant la production de la protéine VI- 3. 2. Classe 2 : mutations perturbant le processus de maturation

cellulaire de la protéine VI- 3. 3. Classe 3 : mutations perturbant la régulation du canal Cl- VI- 3. 4. Classe 4 : mutations altérant la conduction du canal Cl- VI- 4. La protéine CFTR, une protéine multi-fonctionnelle

VII- Références

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I- Historique

La description de la mucoviscidose en tant qu'affection autonome date de la fin des années 30.

Mucoviscidose sur 15

http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/IntroItems/CisticFibFr2.html 24/01/2006

http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/index.html

http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/Genes/Geneliste.html

http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/Anomalies/Anomliste.html

http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/Tumors/Tumorliste.html

http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/Kprones/Kproneliste.html

http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/Deep/deeplist.html

http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/dblinks.html

http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/GeneticEng.html

En 1936, Fanconi identifie l'association "fibrose kystique congénitale du pancréas et bronchectasies" et, en 1938, Andersen donne la description anatomo-pathologique complète de la mucoviscidose.En 1953, Di Sant'Agnese met en évidence un excès de chlorure de sodium dans la sueur des enfants atteints de mucoviscidose. Cette découverte conduira, peu après, à la mise au point du "test de la sueur", seul test de diagnostic positif de la maladie actuellement disponible.Dans les années 80, l'anomalie du transport de sels fut précisée par Quinton (Quinton 1983) qui décrivit le défaut de perméabilité aux ions chlorure (Cl-) affectant les cellules épithéliales des glandes sudoripares, et par Knowles (Knowles 1983) qui observa le même phénomène au niveau de l'épithélium respiratoire.

II- EpidémiologieLa mucoviscidose est la plus fréquente des maladies héréditaires autosomiques récessives graves dans les populations d'origine européenne, touchant en moyenne un nouveau-né sur 2500 (= q2), ce qui permet d'évaluer à un sur 25 (= 2pq) le nombre d'individus transmetteurs. Cependant la fréquence de l'affection varie selon l'origine géographique et ethnique des patients. En France, il y a plus de deux millions de personnes porteuses. En Europe, selon les régions, un enfant pour 1800 à 3500 naissances vivantes est atteint.

En France, environ 250 nouveaux cas sont pris en charge chaque année. Ceci permet d'évaluer entre 4000 et 6000 le nombre actuel des sujets atteints dans notre pays.

III- CliniqueLa présentation clinique de la mucoviscidose est très polymorphe tant entre les différentes familles qu'au sein d'une même famille. Chez la plupart des patients le diagnostic est posé avant l'adolescence, mais quelques uns restent asymptomatiques jusqu'à l'âge adulte. Cliniquement et biologiquement, il n'est pas possible de distinguer les hétérozygotes des sujets non porteurs d'allèle muté (allèle CF).

Les circonstances de découverte de la maladie sont variables selon l'âge. Elle est parfois révélée dès la naissance par un iléus méconial (occlusion intestinale due à un méconium anormalement épais) rencontré chez 10% des nouveaux-nés atteints. Plus tard la symptomatologie peut être plus riche touchant les deux pôles, respiratoire et digestif, et associant des infections respiratoires à répétition avec des signes en rapport avec une malabsorption.

L'atteinte respiratoire prédomine. Elle est liée à une obstruction des bronchioles par un mucus épais et visqueux propice à la croissance des micro-organismes. Ceci explique en partie les infections répétées à germes opportunistes, d'abord Staphylococcus aureus et Haemophilus influenzae puis Pseudomonas aeruginosa, bactérie naturellement résistante à de nombreux antibiotiques et qui devient peu à peu l'unique agent pathogène des voies respiratoires.

L'atteinte digestive avec insuffisance pancréatique exocrine (défaut de production des enzymes) est notée chez 85% des patients, conséquence de l'obstruction des canaux excréteurs et à l'origine d'une maldigestion lipidoprotidique et d'une malabsorption. L'état de la fonction pancréatique exocrine, déficiente (PI ou pancreatic insufficiency) ou conservée (PS ou pancreatic sufficiency), permet d'apprécier la gravité du phénotype des patients : phénotype grave dans le premier cas ou modéré dans le second (Kerem 1990).



Les anomalies des glandes sudoripares conduisent à un excès de chlorure de sodium dans la sueur, cette perte de sel pouvant être responsable de déshydratation aiguë en cas d'exposition à la chaleur.

D'autres organes peuvent être touchés en particulier l'appareil génital et le foie.98% des hommes atteints sont stériles en raison d'une azoospermie obstructive par agénésie des canaux déférents, tandis que 80% des femmes atteintes sont fertiles. La stérilité féminine s'explique par une anomalie du mucus cervical que l'insémination endo-utérine permet de pallier.

L'atteinte hépatique se résume dans 30% des cas à une hépatomégalie et dans 9% des cas à une insuffisance hépatique. Cette atteinte est liée à l'obstruction des voies biliaires intra-hépatiques ou extra-hépatiques par compression au niveau du pancréas. Dans 2 à 5% des cas ces lésions conduisent à une cirrhose biliaire dans des délais variables.

En l'absence de traitement, la médiane de survie est de 3 à 5 ans. Il n'existe toujours pas de traitement efficace de la mucoviscidose mais la précocité du diagnostic ainsi que l'efficacité de l'antibiothérapie et de la kinésithérapie permettent d'augmenter l'espérance de vie des malades, qui est actuellement de 25 à 30 ans en moyenne. Les traitements actuels sont symptomatiques : kinésithérapie respiratoire, antibiothérapie, nébulisation de bronchodilatateurs et mucolytiques, administration d'inhibiteurs de protéases pour les manifestations pulmonaires et apport d'enzymes pancréatiques de substitution et de vitamines pour pallier à l'insuffisance pancréatique. Le recours à une transplantation coeur-poumon voire triple coeur-poumons-foie n'a eu lieu que dans les atteintes très évoluées mais les résultats sont encourageants, le problème majeur restant le nombre insuffisant d'organes disponibles. Parmi les voies thérapeutiques d'avenir, la thérapie génique de la mucoviscidose, stratégie fondée sur l'apport aux cellules épithéliales respiratoires des patients de séquences géniques assurant l'expression du gène CFTR sauvage, rencontre de nombreux obstacles : i) expression du transgène à des niveaux beaucoup plus faibles que dans les modèles in vitro et in vivo ; ii) expression transitoire ; iii) réadministration impossible ; iv) aucune amélioration ni des symptômes relatif à l'infection, l'inflammation et l'obstruction des voies aériennes, ni de la fonction respiratoire, cependant près de 20 essais cliniques de thérapie génique de la mucoviscidose ont été entrepris à ce jour. D'autres stratégies prometteuses sont actuellement à l'étude avec pour objectif de compenser le déficit de production et/ou de fonction de la protéine CFTR intervenant selon le type de mutation du gène.

IV- Diagnostic biologiqueLe diagnostic positif de la mucoviscidose repose sur le test de la sueur. C'est encore aujourd'hui l'examen le plus fiable pour dépister la maladie. Les techniques utilisées actuellement sont simples mais le facteur limitant est la quantité de sueur recueillie qui peut être insuffisante chez le nourrisson de moins de deux mois, le risque d'erreur pouvant alors atteindre 30%. Les valeurs de ce test peuvent varier en fonction des laboratoires ; un taux sudoral de chlorures inférieur à 40 mmoles/l est généralement considéré comme normal. Pour des taux compris entre 40 et 60 mmoles/l, l'interprétation est douteuse et il faut recommencer le test. Le diagnostic est positif lorsque des taux supérieurs à 60 mmoles/l sont retrouvés sur plusieurs examens successifs. Il existe cependant d'autres tests, utilisés en particulier chez le nouveau-né, et pouvant orienter le clinicien. Le plus ancien, le BM test (dosage de l'albumine dans le méconium) est peu fiable et tend à être abandonné. Le dosage de la trypsine immunoréactive dans le plasma est de bonne valeur en cas de suspicion diagnostique chez le nouveau-né. L'hypertrypsinémie n'est cependant pas pathognomonique de la mucoviscidose ; il existe



en effet des hypertrypsinémies néonatales transitoires (associées à une hypoxie ou à une souffrance foetale) ou persistantes (associées aux trisomies 13, 18 ou 21, aux insuffisances rénales, aux pathologies pancréatiques, hépatiques ou intestinales) ; aussi, en cas de positivité, et notamment en l'absence d'autre pathologie associée, seul le test de la sueur permet de trancher.

Une autre technique consiste à mesurer la différence de potentiel transépithélial (DDPTE) qui existe entre la peau et la muqueuse nasale. Cette valeur est significativement augmentée en cas de mucoviscidose. Cette technique a été mise au point par Knowles (Knowles 1981), puis modifiée et simplifiée par Alton (Alton 1987; Alton 1990). Son intérêt concerne essentiellement trois types de situations :

1. le diagnostic précoce chez le nouveau-né présentant une pathologie digestive suspecte, alors que le test de la sueur est encore difficile à réaliser,

2. les diagnostics douteux où sont associés des signes cliniques évocateurs avec des tests de la sueur intermédiaires ou négatifs,

3. le suivi évolutif des patients puisqu'il existe une corrélation entre la gravité de l'atteinte respiratoire mesurée par l'étude du VEMS (volume expiré maximal par seconde) et les mesures de DDPTE.

La méthode est simple d'emploi, peu coûteuse et facile à maîtriser. L'examen est bien toléré mais les résultats sont difficilement interprétables en cas d'inflammation de la muqueuse nasale ou en présence de polypes nasaux.

V- Le gène CFTR et ses mutationsV-1. introductionLa nature biochimique du défaut à l'origine de la mucoviscidose est restée longtemps inconnue, ce qui a exclu toute possibilité d'isoler le gène responsable par l'approche génétique classique et a contraint les chercheurs à employer les outils de la "génétique inverse" (ou clonage positionnel).

En 1985, le locus CF fut localisé sur le bras long du chromosome 7 grâce à la découverte d'une liaison avec un site polymorphe exploré par une sonde anonyme située sur ce chromosome.

En 1989, le gène impliqué dans la mucoviscidose a été isolé (Kerem 1989; Riordan 1989; Rommens 1989). Ce gène, dont l'analyse génétique a démontré la responsabilité dans la pathologie, contient 27 exons s'étendant sur 250 kb du chromosome 7 (7q31) et code un ARNm de 6,5kb.

V-2. La mutation ∆F508La mutation la plus fréquente, une délétion de trois nucléotides aboutissant à l'élimination de la phénylalanine en position 508 (∆F508) rend compte de 70% des allèles CF. La description de cette mutation qui n'a jamais été retrouvée à l'état homozygote chez des sujets sains a été un argument clé d'authentification du gène isolé.

Une étude collaborative européenne (EWGCFG 1990) portant sur 4871 chromosomes CF et 3539 chromosomes normaux a montré la grande hétérogénéité de répartition de cette anomalie. Il existe un gradient nord-ouest/sud-est avec, par exemple 88% de ∆F508 au Danemark et 50% en Italie. Dans la



population française, la principale mutation (∆F508) représente approximativement 65-70% des chromosomes CF, avec de fortes variations régionales allant de 64% en Languedoc-Roussillon à 81% en Bretagne occidentale. Cette fréquence élevée suggère l'existence possible, dans les populations nord-européennes, d'un mécanisme de sélection des hétérozygotes et d'un important effet fondateur. L'analyse de marqueurs intra-géniques associés à ∆F508 suggère qu'un seul événement mutationnel est survenu dans le passé (Morral 1994). Pour expliquer la dispersion de la mutation dans les populations européennes, l'hypothèse d'un avantage sélectif des hétérozygotes a été avancée. Les hétérozygotes seraient protégés contre la déperdition hydrique et saline au cours des diarrhées dues à des entérotoxines d'Escherichia coli et du Vibrio cholerae, par exemple (Baxter 1988). Ces souches ont en commun la production de toxines qui augmentent la concentration d'AMPc ou de GMPc dans les entérocytes et entrainent une augmentation de la sécrétion de chlorure. Si on admet que les hétérozygotes ont 50% d'activité de la protéine CFTR, leur sécrétion de chlorure en réponse aux toxines bactériennes sera moins élevée que celle des sujets non transmetteurs : la déperdition hydrique sera donc moins importante et la survie prolongée. Pier et al. ont suggéré récemment que la 1ère boucle extracellulaire de CFTR est nécessaire à l'internalisation de S. typhi dans les cellules épithéliales intestinales (Pier et al., 1998). La protéine DF508, associée à une diminution de l'expression de CFTR à la surface des épithélium, diminuerait l'entrée du pathogène dans l'épithélium intestinal assurant une protection vis à vis de l'infection.

V-3. Spectre des mutations du gène CFTR Depuis la découverte du gène CFTR , de nombreux laboratoires tentent de caractériser les diverses mutations responsables de la mucoviscidose. Ils se sont regroupés au sein d'un réseau d'échange d'informations, créé à l'initiative des découvreurs du gène, le "Consortium International d'Analyse Génétique de la Mucoviscidose" (http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/). Cette structure a permis d'établir rapidement le spectre des mutations rencontrées dans les différentes populations étudiées dans le monde.

Paradoxalement, alors que les résultats des études génétiques effectuées avant la découverte du gène avaient fait postuler l'existence d'un petit nombre de mutations, celles-ci s'avèrent très nombreuses. Plus de 900 mutations ont été décrites depuis le clonage du gène dont quatre, excepté ∆F508, sont représentées à plus de 2%. Toutes les autres mutations sont rares, voire détectées seulement dans une famille. La fréquence de certaines mutations peut varier énormément d'un groupe géographique à l'autre. Ainsi la mutation non-sens W1282X touche 48% des allèles CF chez les Juifs ashkénazes et seulement 2% des allèles CF totaux (Kerem 1995). De même, la fréquence de la mutation G551D représente environ 5% des allèles dans les populations d'origine celte (Irlande, Écosse, Bretagne) (Hamosh 1992).

La majorité des défauts moléculaires du gène CFTR sont des mutations ponctuelles réparties comme suit : 42% de mutations faux-sens, 24% de microinsertions et microdélétions entrainant un décalage de la phase de lecture, 16% de mutations non-sens, 16% de mutations d'épissage et 2% de délétion d'un acide aminé. Quelques grandes délétions sont également reportées.

Une des particularités du gène CFTR est l'existence de transcrits délétés d'un ou de plusieurs exons chez des sujets normaux. Ces transcrits sont dus à des anomalies conduisant à un épissage alternatif dont le plus étudié et le plus fréquent est le transcrit délété de l'exon 9 (9-). La présence ou l'absence de cet exon est corrélé avec un "polymorphisme" de séquence de l'intron 8 situé près du site accepteur



http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/

d'épissage. Cette séquence polypyrimidique est constituée de 5, 7 ou 9 thymidines (5T, 7T ou 9T). Si la présence de 7T ou de 9T permet d'assurer un épissage normal à 90%, la présence de 5T ne permet de produire que 10 à 40% d'ARNm normal, les 60 à 90% d'ARNm 9- ne donnant pas de protéine CFTR fonctionnelle (Chu 1991; Chu 1992; Chu 1993).

V-4. Corrélations génotype-phénotypeEnviron la moitié des patients atteints de la mucoviscidose sont homozygotes pour la mutation DF508. A l'état homozygote, DF508 est associée à la forme classique de la maladie avec une augmentation des électrolytes dans la sueur, une insuffisance pancréatique et une atteinte obstructive des poumons le plus souvent sévère. Comparer la présentation clinique des patients homozygotes DF508 avec des patients de génotypes différents permet d'évaluer les conséquences phénotypiques de ces autres mutations. Etant donné la fréquence élevée de DF508 (66 %), 40 % des patients sont hétérozygotes composites avec DF508 sur un allèle et une autre mutation du gène CFTR sur l'autre chromosome.D'une manière générale, la fonction pulmonaire, l'âge de début de la maladie et le taux de chlore sudoral sont difficilement corrélés à un génotype particulier. D'autre part, la gravité et la variété des symptômes observés au sein d'une même fratrie laissent prévoir que le génotype seul, au niveau du gène CFTR , ne pourrait expliquer totalement le phénotype (Zielenski 2000), hormis pour l'état de la fonction pancréatique exocrine qui est identique chez tous les membres atteints d'une même famille (Corey 1989).

Seule la mutation A455E a été fortement associée à l'état de la fonction pulmonaire. Aux Pays-Bas, la mutation A455E est relativement fréquente. L'analyse de 33 patients hétérozygotes composites DF508 / A455E a révélé des tests de la fonction pulmonaire améliorés et un taux de colonisation par P. aeruginosa réduits par rapport aux homozygotes DF508 issus de la même population (Gan 1995). Ces résultats suggèrent que la mutation A455E produit une atteinte pulmonaire moins sévère que DF508 chez les patients aux Pays-Bas. Une étude similaire sur 9 malades canadiens hétérozygotes composites DF508 / A455E a révélé une fonction pulmonaire moins atteinte que celle de 5 homozygotes DF508 issus de la même population (De Braekeleer 1997). Ces études indiquent que A455E produit une atteinte pulmonaire modérée et que A455E a un effet dominant sur les allèles sévères comme DF508.

Concernant la fonction pancréatique, une étude canadienne montre que les patients portant une ou deux mutations faux-sens telles que R117H, R334W, R347P, A455E ou P574H ont une fonction pancréatique exocrine conservée (PS ou pancreatic sufficiency), alors que ceux qui portent deux allèles de mutations d'épissage, non-sens ou décalant la phase de lecture et de quelques mutations faux-sens sont toujours insuffisants pancréatiques (PI ou pancreatic insufficiency) (Kristidis 1992). Les mutations associées à une fonction pancréatique normale sont considérées modérées alors que celles associées à une insuffisance pancréatique sont considérées sévères. Ainsi, les patients ayant une mutation PI sur un allèle et une mutation PS sur l'autre allèle ont un phénotype PS. Avec une mutation PS, l'activité de la protéine CFTR est suffisante pour conférer une fonction pancréatique. Cependant, une étude multicentrique a montré que sur 396 homozygotes DF508, 10 conservaient une fonction pancréatique (Consortium, 1993).Ce type d'analyse est compliqué par plusieurs phénomènes. L'effet d'une mutation peut être modulé par une deuxième mutation héritée en cis sur le même allèle. Deux cas ont été décrits : d'une part le polymorphisme de la séquence polypyrimidique de l'intron 8, et d'autre part, des associations sur un



même allèle de deux substitutions nucléotidiques. L'équipe de Tümmler à Hanovre a décrit un patient porteur d'un génotype avec un allèle complexe : R553X / DF508-R553Q (Dork 1991). Ce patient présente une insuffisance pancréatique associée à une atteinte pulmonaire typique mais un test de la sueur anormalement bas comparé à ceux de 9 patients R553X / DF508, suggérant que la mutation R553Q pourrait moduler l'effet de DF508. Cette hypothèse a été en partie validée in vitro (Teem 1993). Cette même équipe a également décrit deux patients non apparentés porteurs du génotype suivant : DF508 / S1251N-F508C. Ils proposent que le polymorphisme F508C pourrait aggraver l'effet de S1251N (Kalin 1992).Le polymorphisme de la séquence polypyrimidique de l'intron 8 module la pénétrance de la mutation faux-sens R117H de l'exon 4. Cette mutation a été associée à un phénotype modéré (PS) (Kristidis 1992), mais aussi à une absence bilatérale congénitale des canaux déférents (ABCD) (Rigot 1991). Cette anomalie qui s'observe chez la quasi-totalité des patients CF, est dans ce cas isolée, en absence de tout autre symptôme de mucoviscidose chez des hommes infertiles. En 1993, l'équipe de Cutting a démontré l'importance du polymorphisme de l'intron 8 dans la modulation du phénotype d'un patient (Kiesewetter 1993). En effet, selon que la mutation R117H est liée en cis avec l'allèle 5T ou 7T, le même génotype R117H / DF508, est associée soit à une mucoviscidose modérée, soit à une ABCD et peut, à l'extrême, n'avoir aucune conséquence phénotypique.

VI- La protéine CFTR et ses fonctions

VI-1. Structure de la protéine CFTRLa séquence protéique déduite à partir du gène CFTR correspond à une protéine composée de 1480 acides aminés. L'analyse de sa séquence primaire a permis de reconstituer la structure tertiaire probable de la protéine CFTR d'après le profil hydropathique de ses acides aminés (Riordan 1989). Elle contient deux motifs répétés constitués chacun d'un domaine hydrophobe transmembranaire (TMD) contenant six hélices a et d'une importante région hydrophile contenant des séquences susceptibles de lier l'ATP (NBF ou Nucleotide Binding fold). Ces deux motifs sont reliés par un domaine cytoplasmique (domaine R) codé par l'exon 13, contenant de nombreux résidus chargés et la majorité des sites potentiels de phosphorylation (substrats probables des protéines kinases A et/ou C) (figure 1). Une homologie de séquence primaire existe entre la protéine CFTR et les membres d'une famille de protéines membranaires, la famille des transporteurs ABC (ATP-binding cassette). De nombreux membres de la famille des protéines ABC transportent activement des substrats au travers des membranes cellulaires, l'hydrolyse de l'ATP fournissant de l'énergie à ce transport.



Figure 1: Structure prédictive de la protéine CFTR, díaprès Riordan et al. 1989 - Pascale Fanen.

VI-2. Fonction canal Cl-

Les premières hypothèses émises sur la fonction de la protéine CFTR s'orientaient vers deux possibilités. La première postulait que la protéine CFTR était un canal Cl-. Cette hypothèse était compatible avec le défaut de perméabilité aux ions Cl- de la membrane apicale des épithéliums CF. L'autre proposait que la protéine CFTR n'était pas un canal ionique mais qu'il agissait sur la régulation des canaux Cl- soit en s'y associant, soit en transportant, hors ou dans la cellule, un facteur régulateur des canaux Cl-. La dernière hypothèse semblait plus vraisemblable compte tenu des observations suivantes :

● De nombreuses anomalies phénotypiques sont observées dans les épithéliums CF, en particulier une augmentation de l'absorption de sodium par l'épithélium respiratoire. Il semblait difficile de réconcilier des anomalies phénotypiques multiples avec un défaut unique de canal Cl-.● La séquence primaire de la protéine CFTR ne ressemblait à celle d'aucun canal ionique connu alors.

Dans les premières études fonctionnelles, l'ADNc du gène CFTR sauvage a été exprimé dans des cellules épithéliales respiratoires (Rich 1990) et pancréatiques (Drumm 1990) provenant de patients homozygotes pour la mutation ∆F508. L'expression du gène CFTR sauvage restaure la perméabilité au Cl- régulée par l'AMPc de ces cellules déficientes alors que l'introduction de l'ADNc CFTR∆F508



ne corrige pas le défaut (Rich 1990). Ces expériences mirent en évidence une relation causale entre les mutations du gène CFTR et le phénotype mucoviscidose. Ce fut la première preuve non génétique que le gène CFTR est à l'origine de la mucoviscidose. Mais ces résultats n'identifiaient pas la fonction de la protéine CFTR. Tout au plus permettaient-ils de suggérer que si la protéine CFTR n'était pas elle-même un canal Cl-, sa présence dans ces cellules permettait l'activation par l'AMPc, de canaux Cl- endogènes. Les données obtenues depuis ont procuré des preuves irréfutables de la fonction canal Cl- de la protéine CFTR.

L'expression du gène CFTR sauvage dans des systèmes hétérologues a permis dans un premier temps de rassembler un faisceau d'arguments indiquant que la protéine CFTR était un canal Cl-(Anderson 1991; Bear 1991; Berger 1991; Drumm 1991). La protéine CFTR a été purifiée à partir de cellules sf9, reconstituée dans des protéoliposomes et fusionnée dans une bicouche lipidique (Bear 1992). Dans ce système acellulaire, les propriétés observées sont les mêmes que celles des cellules des épithéliums sécrétoires. Cette reconstitution a représenté la preuve ultime que la protéine CFTR est au moins un canal Cl-.

Figure 3: CFTR, une protéine multifonctionnelle, díaprès Schwiebert et al. 1999 - Pascale Fanen.

VI-3. Corrélations des mutations du gène CFTR avec la fonction canal Cl-

Les anomalies moléculaires ont des conséquences variables sur la protéine CFTR et sa fonction. Welsh et Smith ont proposé une classification de ces anomalies par rapport à la fonction canal Cl-



(Welsh & Smith 1993) (figure 2).

Figure 2: Classification des mutations du gène CFTR, díaprès Welsh & Smith, 1993 - Pascale Fanen.

VI-3.1. Classe 1 : mutations altèrant la production de la protéine.Ces mutations résultent en une absence totale ou partielle de la protéine. Cette classe inclut les mutations non-sens et celles qui produisent un codon stop prématuré (anomalies d'épissage et mutations décalant la phase de lecture). Dans certains cas (R553X), l'ARNm muté est instable et ne produit pas de protéine (Hamosh 1991) . Dans les autres cas, la protéine anormale produite sera probablement instable et rapidement dégradée. C'est ce qui se produit quand la protéine est tronquée ou contient des séquences aberrantes (anomalies d'épissage ou de décalage de la phase de lecture).

Sur le plan fonctionnel, ces mutants devraient conduire à une perte de la conductance au Cl- du canal CFTR dans les épithéliums atteints.VI-3.2. Classe 2 : mutations perturbant le processus de maturation cellulaire de la protéine.

De nombreuses mutations altèrent la maturation de la protéine et son ciblage vers la membrane plasmique. Ainsi, la protéine est soit absente, soit présente en quantité réduite dans la membrane apicale. Les mutations de cette classe représentent la majorité des allèles CF (∆F508).VI-3.3. Classe 3 : mutations perturbant la régulation du canal Cl-.

Ces mutations sont le plus souvent situées dans les domaines de liaison à l'ATP (NBF1 et 2). L'exemple type est la mutation G551D qui a très peu de fonction résiduelle.

VI-3. 4. Classe 4 : mutations altèrant la conduction du canal Cl-.Certains segments des domaines transmembranaires participent à la formation du pore ionique. Les



mutations faux-sens situées dans ces régions produisent une protéine correctement positionnée qui présente une activité canal Cl--AMPc dépendante. Mais les caractéristiques de ces canaux sont différentes de celles du canal CFTR endogène avec une diminution du flux d'ions et une sélectivité modifiée.

Depuis la classification de Welsh et Smith, d'autres classes de mutations ont été proposées afin de disséquer les défauts biochimiques associés à diverses mutations. La classe I a ainsi été subdivisée en classe V comprenant des mutations altérant lla stabilité de l' ARNm CFTR et en classe VI comprenant des mutations altérant la stabilité de la protéine mature (Haardt 1999).

VI-3. La protéine CFTR, une protéine multi-fonctionnelleLes découvreurs du gène CFTR ont baptisé son produit "régulateur transmembranaire d'une conductance". Cette intuition a été conforté par la démonstration que la protéine CFTR régule d'autres canaux, le canal Cl- à rectification sortante (ORCC, outwardly rectifying chloride channel), le canal Na+ épithélial (ENaC, epithelial Na+ channel) et au moins deux canaux K+appartenant à la famille de canaux K+ à rectification entrante, ROMK1 et ROMK2 (Kir, K+ inwardly rectifying). Mais d'autres fonctions indépendantes de la régulation des canaux ont été décrites (transport d'ATP, modulation des phénomènes d'exocytose/endocytose, régulation du pH des organelles intracellulaires...). La figure 3 illustre ce concept de protéine CFTR multi-fonctionnelle.

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Contributeurs: Pascale Fanen




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