la modulation de l’apoptose dépendante du récepteur fas :
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La modulation de l’apoptose dépendante du récepteur Fas : Étude des événements précoces de la voie de signalisation apoptotique dans un modèle de lymphocytes T humains. Marie Bénéteau. UMR CNRS 5164 Bordeaux Pr Jean-François Moreau Directeur de thèse : Jean-Luc Taupin. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
La modulation de l’apoptose dépendante du récepteur Fas :
Étude des événements précoces de la voie de signalisation
apoptotique dans un modèle de lymphocytes T humains.
UMR CNRS 5164 BordeauxPr Jean-François Moreau
Directeur de thèse : Jean-Luc Taupin
Marie Bénéteau
Présentation Nice 08/03/07
FADDDISC
Caspase 8
Apaf-1Cytochrome c
ApoptosomeCaspase 9
Caspase 3
APOPTOSE
Fas
Introduction : le récepteur Fas et sa voie de signalisation apoptotique
N
C
1
66
112
149
214
298317
CRD1
CRD2
CRD3
DM
PLAD
D’après Bidère et al., Annul Rev Immunol, 2006
Mutations du gène Fas
Maladies auto-immunes (ALPS)Cancers (lymphomes)
Itoh et al., Cell, 1991.Oehm et al., J Biol Chem, 1992.
Voie de type II
Voie de type I
c-FLIPL c-FLIPS
APOPTOSE
Voie de type II
Voie de type I
Muppidi et Siegel, Nature Immunol, 2004.
Legembre et al., Mol Cell Biol, 2005.
Legembre et al., J Immunol, 2006.
Microdomaines :
Zones compactes flottant dans la membrane plasmiqueEnrichies en certains lipides et protéines
Implication des microdomaines dans le signal Fas
Introduction : le récepteur Fas et les microdomaines membranaires
I II
Problématique :
Étude des événements précoces de la voie de signalisation apoptotique
De la résistance à l’anticorps agoniste et de l’implication de c-FLIP
Dominant-negative Fas mutation is reversed by down-expression of c-FLIP.Cancer Res. 2007 Jan 1;67(1):108-15.
I.
FasLIgM
anti-Fas
95%
Fas
Cellule Jurkat
100%Maximum d’apoptose
5%
7C11
IgFasL
Concentration (ng/ml)
0
20
40
60
80
100
0,1 1 10 100 1000
% c
ellu
les
mort
es
JKR#2
Sélection de cellules résistantes
Constatation : différence anticorps agoniste et ligand de Fas
JK77JKR#2
IgFasL
0
20
40
60
80
100
0 100 200 300 400
Concentration (ng/ml)
I. 1. Sélection de cellules résistantes
Sensibilité à différents activateurs de Fas
Résistance aux anticorps agonistes.
Sensibilité maintenue mais diminuée au FasL.
7C11
0
20
40
60
80
100
0 100 200 300 400
% c
ellu
les
mort
es
Concentration (ng/ml)
• Pas de modification de la quantité de Fas à la membrane.• Pas de différence de quantité des protéines de la voie de signalisation apoptotique.• Pas d’activation de la caspase 8 dans les Jurkat R traitées par le 7C11
EAKIDEIKNDNVQDTAEQKVQLLRNWHQLHGKKEAYDTLIKDLKK 3 4 5
DTAEQKVQLLDTAEKKVQLLnormal
mutant
I. 2. Analyse de la résistance
2.1. Séquence du récepteur Fas
Présence d’une mutation au statut hétérozygote dans le domaine de mort : Q257K
Huang et al., Nature, 1996.
Intensité de fluorescence
contrôle Fas FasQ257K
WR19L Splénocytes murins
Anti-Fas
Isotype
Jurkat
Nom
bre
de c
ellu
les Marquage Fas murin
Cellules parent
Marquage Fas humainTransfection WR19L
0 200 400
7C11
0
20
40
60
80
100
WR19LsFasL
0 50 100 1500
20
40
60
80
100
Concentration (ng/ml)
% c
ellu
les
mort
es
WR19L FasQ257K
I. 2. Analyse de la résistance
2.2. Conséquences de la mutation Q257K
Dans un contexte homozygote, le Fas Q257K ne transmet aucun signal apoptotique.
Méthode : transfection des WR19L
WR19L Fas
Dans un contexte hétérozygote, résistance à l’apoptose plus marquée avec l’anticorps qu’avec FasL et selon le niveau d’expression de la forme mutée.
> Mutation responsable du phénomène de résistance.
Nom
bre
de c
ellu
les
Hypothèse : seuil de sensibilité
FADD
Fas
Caspase 8
ARN interfére
nt
Apoptose
Mutant
c-FLIP
Apoptose Apoptose
Normal
7C11
II. 3. Restauration de la sensibilité
Inhibition de c-FLIP : analyse de la sensibilité à l’apoptose
L’inhibition de c-FLIP restaure la sensibilité à l’apoptose.(restaure l’activation des caspases et la formation du DISC)
Méthode : ARN interférent
Jurkat-R/ ARNi FLIP #1
Jurkat-R/ ARNi FLIP #2
Jurkat-R/ ARNi contrôle
Transfection stable
7C11
0
20
40
60
80
0 100 200 300 400
Concentration (ng/ml)
% A
DN
fra
gm
en
té
100
C ARNi
Jurkat-R
FLIPL -
Casp-8
FLIPs -
Conclusion et perspectives (I) :
Différences entre anticorps agoniste et FasL
Agrégation versus conformationSeuil d’activation du récepteur Fas
Implication dans la physio-pathologie des ALPS :
Syndrome multi-factoriel
Agrégation nécessaire :
- Anticorps agoniste IgM ou IgG3
- FasL soluble multimérique
Normal Mutant
7C11
Conformation importante :
Anticorps agoniste ne joue pas sur la conformation.
Perspectives :• Sensibilisation par d’autres molécules ? Ex. : banques de molécules
chimiques• Accessibilité de c-FLIP au DISC ? Immunoprécipitation
- ultracentrifugation sur gradient de saccharose- microscopie à fluorescence
De la relocalisation de Fas dans les microdomaines par l’inhibition de la PI3K
II.
Le récepteur Fas et la voie PI3K
Gajate et Mollinedo, Blood, 2001.
EdelfosineL’édelfosine induit un signal de mort dépendant
de Fas et impliquant les microdomaines.
1.
L’édelfosine est un inhibiteur de la PI3K.
LY294002Wortmannine
P-Akt
Akt
- + - + 2.
PIP3PIP2
AKTp85 p110
PI3K
P
P
PAKTVoie PI3K
Edelfosine
- +
Question : L’inhibition de la PI3K induit la relocalisation de Fas dans les microdomaines ?
• Apoptose induite par inhibition de la PI3K (LY294002 et wortmannine)• Localisation de Fas par rapport aux microdomaines
?
CEM JurkatH9 (Type I)
Type II
Edelfosine
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10 12
(µg/ml)
LY294002
0
20
40
60
0 20 40 60 80 100 120
10
30
50
% c
ellu
les m
ort
es
(µM)
70
concentration
Spécificité de l’inhibition
Type II Type I
CEM JK H9
P-Akt
Akt
L’inhibition de la PI3K conduit à la mort cellulaire,
préférentiellement dans les cellules de type II.
II. 1. Apoptose induite par inhibition de la PI3K
0
20
40
60
0 10 20
LY294002 Wortmannine0
20
40
0 10 20 30
% A
DN
fra
gm
en
téConcentration (µM)
Isotype Fas
CEM
CEM IRC
Intensité de fluorescence
Nom
bre
de c
ellu
les
Analyse de la sensibilité de cellules déficientes en Fas
Le signal de mort nécessite une voie Fas fonctionnelle.
sFasL
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60concentration (ng/ml)
% c
ellu
les m
ort
es
CEMCEM IRC
II. 1. Apoptose induite par inhibition de la PI3K
LY2940020
20
40
60
0 20 40 60
Wortmannine0
20
40
60
0 5 10 15 20
Jurkat FasQ257KJurkat
25concentration (µM)
% C
ellu
les m
ort
es
ContrôleAnti-FasL
0
20
40
60
80
100
% c
ellu
les
mort
es
sFasL0
20
40
60
80
100
120
ContrôleAnti-Fas
sFasL
Analyse de l’interaction entre Fas et FasL
Le signal de mort est indépendant :
- de l’expression de FasL
- de l’interaction entre Fas et FasL.
Méthode : anticorps bloquants
II. 1. Apoptose induite par inhibition de la PI3K
LY294002 LY294002Edelfosine Edelfosine
Hypothèse :
l’inhibition de la PI3K permet la relocalisation de Fas dans les microdomaines
EdelfosineLY294002
Wortmannine
PIP3PIP2
AKT
p85 p110
PI3K
P
P
PAKT
Méthode : Immunofluorescence
Anticorps anti-FasAlexaRed
CTX-FITC
MicrodomainesFas Superposition
II. 2. Localisation de Fas et des microdomaines
Inte
nsi
té d
e
flu
ore
scen
ce
Distance (unités arbitraires)
L’inhibition de la PI3K induit la colocalisation de Fas et des microdomaines.
Edelfosine LY294002 WortmannineContrôle
Technique : Linescann
IECB F De Giorgi et F Ichas
APOPTOSE
Voie de type I
Activation de la transcription
Voie de type IIPI3K
2
1
Conclusion (II) : EdelfosineLY294002, Wortmannine
Restimulation TCR
Perspectives
1. Inhibition spécifique de la PI3K ?
- Utilisation de formes inhibitrices de la p85 (cellules de type II)
- Utilisation de formes constitutivement actives de la p110 (cellules de type I)
2. Implication de l’ezrine comme adaptateur entre Fas et actine :
- Utilisation de formes tronquées de l’ezrine
- Mise en évidence du domaine de liaison à l’ezrine dans le récepteur Fas. Actine
Fas
Ezrine
Journal of Immunology, 2003
Cutting Edge:
SDS-Stable Fas Microaggregates: An Early Event of Fas Activation Occurring with Agonistic Anti-Fas Antibody but Not with Fas Ligand
Patrick Legembre, Marie Beneteau, Sophie Daburon, Jean-François Moreau, and Jean-Luc Taupin.
Des agrégats de haut poids moléculaire du récepteur Fas
C 0 15 30 60 90 120 180 Temps (minutes)
JK 77 + anticorps agoniste
Monomère Fas
Agrégats Fas250
50
Constatation : présence de formes de haut poids moléculaire de Fas.
Les agrégats de Fas
Caractéristiques : - résistants aux SDS et au -mercapto-éthanol,
- résistants à la dénaturation thermique.
Questions :
1. Apparition avec le FasL ?
2. Corrélation à l’apoptose ?
3. Limitation aux cellules Jurkat ?
?
7C11
3 0,25 0,5 1 1,5 2 3 3 0,25 0,5 1 1,5 2 3 6 0,5 1,5 3 4,5 6
250
50
Temps (h)
IgFasL 1A12C C C
% a
pop
tose
L’apparition des agrégats de Fas : - est due à l’anticorps agoniste - n’est pas indispensable à l’apoptose.
Les agrégats de Fas
1. Dans les cellules Jurkat stimulées par différents activateurs
% a
popto
se
7C11
5 0,5 2 5 0 0,5 2 5
250
50
Temps (h)
C IgFasL 7C11
5 0,5 2 5 0 0,5 2 5
C IgFasL 7C11
5 0,5 2 5 0 0,5 2 5
C IgFasL
Les agrégats de Fas
Observation du même phénomène quelque soit les lignées testées.
2. Dans plusieurs lignées lymphocytaires
Type II Type I
CEM SKW6.4 H9
Les agrégats de Fas
Lymphocytes non activés Activés
3. Dans les lymphocytes sanguins
7C11C IgFasL7C11
5 0,5 2 5 0 0,5 2 5
C IgFasL
Temps (h) 5 0,5 2 5 0 0,5 2 5
Dans les lymphocytes, les agrégats apparaissent de la même manière
et ne sont pas corrélés avec l’apoptose.
% a
pop
tose
Conclusion
1) La formation des agrégats de Fas résistants au SDS dans la lignée cellulaire Jurkat est induite par l’anticorps agoniste mais pas par le FasL, qu’il soit sous forme soluble ou membranaire.
2) Les mêmes résultats sont obtenus avec plusieurs lignées lymphocytaires et les lymphocytes sanguins.
3) L’anticorps agoniste et le FasL fonctionnent différemment.
Lymphocytes et PI3K
Analyse de la voie PI3K au cours de l’activation
P-Akt
Akt
0 1 2 3 4 5 Temps (jours)
Isolement PHA IL2
Restimulation du TCR
Restimulation
Type II Type I
Anti-CD3C
P-Akt
Akt
0 6 0,5 1 3 6 h
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 2 4 6Incubation (heures)
rati
o P
-AK
T/A
KT
0
10
20
30
C CD3% A
DN
fra
gm
enté
Analyse de la voie PI3K au cours de la restimulation
La restimulation du TCR inhibe la voie PI3K.
Lymphocytes et PI3K