lÊ xuÂn duy nghiÊn cỨu thÀnh phẦn hÓa hỌc vÀ xÂy dỰng …

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

LÊ XUÂN DUY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ XÂY DỰNG QUY

TRÌNH CÔNG NGHỆ CHIẾT XUẤT ĐỂ TẠO SẢN PHẨM CÓ

GIÁ TRỊ TỪ QUẢ TÁO MÈO (DOCYNIA INDICA (WALL.)

DECNE) Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học

Mã số: 9.52.03.01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC

HÀ NỘI – 2020

Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS. TS Vũ Đình Hoàng

Người hướng dẫn khoa học 2: PGS. TS Nguyễn Mạnh Cường

Phản biện 1: …

Phản biện 2: …

Phản biện 3: ….

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp

Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng …

năm 2020

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

BÀI BÁO QUỐC TẾ

1. Xuan Duy Le, Manh Cuong Nguyen, Dinh Hoang Vu, Minh Quan

Pham, Quoc Long Pham, Quang Tung Nguyen, Tuan Anh Nguyen,

Van Thinh Pham, Long Giang Bach, Tuong Van Nguyen.

“Optimization of Microwave-Assisted Extraction of Total Phenolic

and Total Flavonoid from Fruits of Docynia indica (Wall.) Decne.

Using Response Surface Methodology”. Processes 7.8 (2019): 485.

(SCI-E, Q2), Doi:10.3390/pr7080485. 2. Le Xuan Duy, Le Ba Vinh, Gao Dan, Vu Dinh Hoang, Tran

Quoc Toan, Young Ho Kim, Nguyen Manh Cuong “Soluble

epoxide hydrolase inhibitors from Docynia indica (Wall.)

Decne.”. Nat. Prod. Res. (2020): 1-6 (SCI-E, Q2), DOI:

10.1080/14786419.2020.1774759. BÀI BÁO TRONG NƯỚC

3. Lê Xuân Duy, Trần Quốc Toàn, Lê Tất Thành, Cầm Thị Ính,

Đỗ Hữu Nghị, Hà Việt Hải, Vũ Đình Hoàng, Đỗ Thị Nguyệt,

Phạm Quốc Long. “Một số kết quả nghiên cứu về thành phần

hóa học quả táo mèo (Docynia indica Wall.) Việt Nam”. Tạp

chí Khoa học công nghệ, tập 53 số 4C (2015) Tr 81-87.

4. Le Xuan Duy, Tran Quoc Toan, Do Huu Nghi, Le Tat Thanh,

Vu Dinh Hoang, Young Ho Kim, Nguyen Manh Cuong.

“Triterpene acids from Docynia indica fruits and their cytotoxic

activity”. Vietnam J. Technol 56 (2018): 199-204

5. Le Xuan Duy, Nguyen Manh Cuong, Vu Dinh Hoang, Pham

Minh Quan, Lai Phuong Phuong Thao, Pham Quoc Long, Tran

Quoc Toan. “Process optimization for the extraction of

phenolics from the fruits of Vietnam Docynia indica (Wall.)

Decne.” Proceeding of international workshop (2019), pp. 506-

513 (ISBN:978-604-965-263-9).

1

MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng nguồn thực vật tự nhiên để

chăm sóc sức khỏe, phòng ngừa và điều trị bệnh. Trong những năm trở lại đây, xu hướng sử dụng các loại thảo dược trong phòng và chữa bệnh ngày một gia tăng. Ngày nay, thảo dược không chỉ được sử dụng ở dạng thô theo y học cổ truyền mà đã được áp dụng những công nghệ hiện đại trong lĩnh vực Hóa học, Sinh học kết hợp công nghệ bào chế để tạo ra các sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, tính chất dược lý mạnh.

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa đặc thù nên có nguồn thực vật phong phú và đa dạng ước tính có trên 13.000 nghìn loài. Theo y học dân tộc, có hơn 4000 loài được sử dụng làm thuốc hoặc chăm sóc sức khỏe con người. Với định hướng phát triển các loài cây dược liệu để phục vụ đời sống, hiện nay ở nước ta đã hình thành nhiều khu vực canh tác, trồng cây dược liệu ở quy mô lớn. Đặc biệt, Tại một số Tỉnh Tây bắc như Yên bái, Sơn la, Điện biên những năm gần đây đang phát triển rất mạnh loài táo mèo để phục vụ nhu cầu của người tiêu dùng.

Táo mèo có tên khoa học là Docynia indica (Wall.) Decne, thuộc họ Hoa hồng (Rosaceae). Ở nước ta, táo mèo phân bố ở độ cao từ 1500m đến 2000m ở các tỉnh vùng núi Tây Bắc. Theo Y học cổ truyền, táo mèo có vị chua chát, hơi ngọt, tính ấm, có tác dụng kiện vị, thuộc nhóm tiêu thực hóa tích, chủ yếu điều trị các chứng rối loạn tiêu hóa do ăn nhiều thịt, dầu mỡ, ăn không tiêu, giúp ăn ngon miệng. Quả táo mèo khi sấy khô là một vị thuốc của Đông y giúp dịch vị tăng bài tiết axit mật và pepsin dịch vị, chống rối loạn chuyển hóa lipit và giảm mỡ máu… Các nghiên cứu hiện đại gần đây đã cho thấy dịch chiết quả táo mèo có tác dụng kháng khuẩn, chống rối loạn trao đổi glucid và lipid; Một số thành phần hóa học phân lập được từ quả táo mèo có tác dụng có tác dụng kháng viêm và hạ đường huyết.

Việc nghiên cứu, chế biến quả táo mèo tạo sản phẩm chăm sóc sức khỏe, hỗ trợ điều trị một số bệnh lý đang rất được quan tâm. Tuy nhiên cho đến nay, các nghiên cứu về quả táo mèo cả trong và ngoài nước còn rất khiêm tốn. Do đó, cần các nghiên cứu sâu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của quả táo mèo đồng thời mở rộng nghiên cứu các công nghệ khai thác, làm giàu các thành phần hóa học có hoạt tính sinh học cao (cụ thể là nhóm hoạt chất phenolic) trong quả táo mèo để đáp ứng yêu cầu về bào chế tạo các sản phẩm có chất lượng cao. Từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và

2

xây dựng quy trình công nghệ chiết xuất để tạo sản phẩm có giá trị từ quả táo mèo (Docynia indica (Wall.) Decne) ở Việt Nam”.

2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc hóa học và thăm dò hoạt tính

sinh học của các thành phần hóa học trong quả táo mèo; Nghiên cứu tối ưu quy trình công nghệ chiết xuất để tạo sản phẩm từ quả táo mèo.

3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc một số thành phần hóa

học ở phân đoạn cao chiết ethyl acetate của quả táo mèo Docynia indica (Wall.) Decne): Điều chế cặn chiết, phân lập các hợp chất bằng phương pháp sắc ký, xác định cấu trúc hóa học bằng các phương pháp hóa lý hiện đại.

Đánh giá hoạt tính sinh học: Tác dụng bảo vệ tim mạch, chống oxy hóa và ức chế một số dòng tế bào ung thư của cao chiết tổng, cao chiết phân đoạn và một số hợp chất phân lập được

Nghiên cứu, tối ưu hóa các quy trình công nghệ chiết xuất, sấy phun để tạo sản phẩm bột cao chiết táo mèo giàu phenolic quy mô phòng thí nghiệm

4. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 148 trang với 76 bảng và 63 hình. Bố cục luận án cụ

thể như sau: Mở đầu 2 trang, tổng quan 26 trang, đối tượng và phương pháp nghiên cứu 8 trang, thực nghiệm 11 trang, kết quả và thảo luận 87 trang, kết luận và kiến nghị 03 trang, danh mục các công trình công bố 01 trang, tài liệu tham khảo 10 trang

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

Phần tổng quan gồm 4 phần chính: Phần 1 giới thiệu về chi táo mèo (Docynia), họ hoa hồng (Rosaceae); các thông tin về cây táo mèo, quả táo mèo như phân bố và sản lượng quả táo mèo ở nước ta; thành phần hóa học và tác dụng sinh học của quá táo mèo. Phần 2 giới thiệu về tình hình khai thác, chế biến và sử dụng quả táo mèo ở nước ta, các công nghệ chế biến táo mèo hiện nay. Phần 3 giới thiệu về nhóm hoạt chất phenolic chiếm hàm lượng lớn trong quả táo mèo, đặc điểm chung và các phương pháp chiết xuất phenolic hiện đại. Phần 4 giới thiệu về phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) và tối ưu hóa quy trình công nghệ.

3

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Quả táo mèo Docynia indica (Wall.) Decne, thu hái tại Huyện Bắc

Yên, Tỉnh Sơn La vào tháng 9 năm 2014 và tháng 10 năm 2017. Mẫu nghiên cứu được định danh khoa học bởi TS Nguyễn Quôc Bình, Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam - VAST.

2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp định lượng một số thành phần hóa học 2.2.1.1. Phương pháp định lượng phenolic tổng Hàm lượng tổng phenolic được xác định theo phương pháp của

Singleton và cộng sự (1999) bằng cách sử dụng thuốc thử Folin – Ciocalteu và chất chuẩn là acid gallic.

Hàm lượng phenolic tổng = C.V/m; Với C: Nồng độ phenolic xác định theo đường chuẩn (µg/mL); V: Thể tích dịch chiết tổng (mL); m: Khối lượng cao chiết thu được ứng với lượng mẫu đem chiết (g)

2.2.1.2. Phương pháp định lượng flavonoid tổng Hàm lượng flavonoid tổng được xác định theo phương pháp của

Zhishen và cộng sự (1999). Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên sự tạo phức màu vàng giữa flavonoid với dung dịch AlCl3. Cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng flavonoid được xác định ở bước sóng 415 nm. Quercetin được dùng làm chất chuẩn tham chiếu

Hàm lượng flavonoid tổng = C.V/m; Với C: Nồng độ flavonoid xác định theo đường chuẩn (µg/mL); V: Thể tích dịch chiết tổng (mL); m: Khối lượng cao chiết thu được ứng với lượng mẫu đem chiết (g)

2.2.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc hóa học 2.2.2.1. Phương pháp chiết xuất + Phương pháp chiết vi sóng: Chiết xuất có hỗ trợ của vi sóng + Phương pháp chiết siêu âm: Chiết xuất có hỗ trợ của siêu âm + Phương pháp chiết hồi lưu: Chiết xuất có gia nhiệt bằng bếp điện,

dung môi được hồi lưu bằng hệ thống sinh hàn + Phương pháp chiết soxhlet: Sử dụng thiết bị chiết soxhlet để chiết

xuất nhằm định lượng cao chiết toàn phần. 2.2.2.2. Phương pháp phân lập các thành phần hóa học + Sắc ký cột: silica gel pha thường, pha đảo, selphadex... + Sắc ký lớp mỏng: thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn, phát hiện vệt

chất bằng soi đèn UV ở bước sóng 254 và 365 nm hoặc hiện màu bằng thuốc thử.

4

2.2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học Kết hợp giữa các thông số hóa lý (điểm nóng chảy, độ quay cực) với

các phương pháp phổ hiện đại như phổ khối lượng (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (1H-, 13C-NMR và DEPT) 2 chiều ( HSQC, HMBC, NOESY...).

2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học + Hoạt tính bảo vệ tim mạch (sEH) thông qua cơ chế ức chế enzyme

soluble epoxide hydrolase được đánh giá dựa trên việc phân tích huỳnh quang với chất đối chứng dương sử dụng là Auda.

+ Xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl). Sự hấp thụ của DPPH ở bước sóng λ = 515 nm được xác định bằng máy đọc ELISA sau khi nhỏ DPPH vào dung dịch mẫu thử trên phiên vi lượng 96 giếng.

+ Hoạt tính gây độc tế bào được thử nghiệm bằng phương pháp MTT [3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide] trên hai dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), và ung thư cổ tử cung (HeLa)

Các thử nghiệm được thực hiện Khoa Dược, Trường Đại học Chungnam, Hàn Quốc và Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - VAST.

2.2.4. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quy trình công nghệ

Phương pháp quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quy trình công nghệ được áp dụng theo mô hình bậc hai của Box-Willson hoặc Box-Behnken tùy vào từng bài toán cụ thể. Sau khi xây dựng được mô hình ta cần đánh sự hội tụ của mô hình thông qua phân tích phương sai. Nếu mô hình hội tụ thì ta xác định phương trình hồi quy và tiến hành tối ưu hóa thông số công nghệ bằng phương pháp hàm nguyện vọng của Harrington (1965). Sử dụng phần mềm Design Expert 7.0.0 để xây dựng mô hình và tối ưu hóa thông số công nghệ quá trình.

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM

3.1. Điều chế cao chiết tổng và cao chiết phân đoạn Quả táo mèo tươi 15 kg được phân loại, rửa sạch và thái lát. Sấy

diệt men ở 1100C trong 20 phút và sấy mẫu tới khô ở 600C (hàm ẩm ≤ 10%). Táo mèo khô được nghiền mịn bằng máy nghiền (đường kính lỗ sàng 0.2 mm) thu dược 5 kg bột. Bột nguyên liệu táo mèo 2 kg được chiết siêu âm với methanol ở nhiệt độ phòng, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (3/1, v/w). Lọc dịch chiết và cô đặc bằng máy cô quay áp suất giảm thu

5

được 652 g cặn chiết methanol. Hòa tan cặn methanol với nước cất và chiết phân bố lần lượt với các dung môi các độ phân cực tăng dần là n-hexan, dichloromethane và ethyl acetate. Tiến hành lọc và cô đặc các dịch chiết phân bố thu được các cặn chiết tương ứng là cặn n-hexan (36,2 g); cặn dichloromethane (65 g); cặn ethyl acetate (258,8 g) và cặn nước (289,4 g).

3.1.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn EtOAc quả táo mèo Lấy 114 g cặn chiết ethyl acetate (EtOAc), tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải gradient CH2Cl2/MeOH (100:0 0/100) chia thành 8 phân đoạn ký hiệu từ E1 đến E8. Kiểm tra các phân đoạn thu được bằng sắc ký lớp mỏng (TLC), hiện màu bằng thuốc thử H2SO4 5% hoặc kiểm tra bằng máy soi UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm. Gom các phân đoạn giống nhau rồi cô quay đuổi dung môi thu được cao chiết các phân đoạn. Từ các phân đoạn E1 đến E8 tiếp tục tiến hành các phương pháp sắc ký để phân lập, thu các hợp chất sạch. Sơ đồ phân lập được thể hiện ở hình 3.1.1.

Hình 3.1.1. Sơ đồ phân lập các thành phần hóa học từ quả táo mèo

3.1.2. Thông số vật lý và dữ kiện phổ các hợp chất (xem luận án) 3.2. Quy trình chiết phenolic và thiết lập mô hình nghiên cứu 3.2.1. Chiết xuất bằng phương pháp soxhlet Chuẩn bị bộ dụng cụ chiết soxhlet. Cân chính xác 10g bột nguyên

liệu táo mèo cho vào túi giấy lọc, buộc kín. Đưa túi lọc chứa nguyên liệu vào ngăn chiết. Nạp 500 mL ethanol thực phẩm 96% vào bình cầu 1000 mL. Tiến hành lắp sinh hàn hồi lưu kết nối thiết bị chiết soxhlet. Bật bếp

6

điện gia nhiệt lên 650C, thời gian chiết là 10 giờ. Kết thúc quá trình chiết, dịch chiết được cô quay đuổi dung môi để thu cao chiết tổng. Sau đó sẽ tiến hành định lượng và phân tích hàm lượng phenolic tổng, flavonoid tổng. Hàm lượng cao chiết tổng Y (%) được tính theo khối lượng mẫu đem chiết. Kết quả nghiên cứu được sử dụng làm tiêu chuẩn để so sánh với các phương pháp chiết phenolic dưới đây

3.2.2. Chiết xuất sử dụng vi sóng 3.2.2.1. Tiến hành thí nghiệm 100g bột nguyên liệu táo mèo được cho vào bình cầu 1000 mL, thêm

500 ml dung môi (được pha với nồng độ ethanol và độ pH cần nghiên cứu) vào bình cầu. Đưa bình cầu vào lò vi sóng và tiến hành lắp sinh hàn hồi lưu. Bật sinh hàn, bật lò vi sóng ở các mức công suất cần nghiên cứu. Thời gian chiết xuất được tính bắt đầu khi bật lò vi sóng. Kết thúc quá trình chiết, dịch chiết được lọc qua phễu lọc buchner và cô đặc sẽ thu được cao chiết tổng. Xác định hàm lượng cao chiết tổng (%); hàm lượng phenolic tổng (mg GAE/g cao chiết) và flavonoid tổng (mg QE/g cao chiết) trong cao chiết.

3.2.2.2. Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm Các yếu tố công nghệ nghiên cứu gồm 4 yếu tố là Z1: Thời gian chiết

xuất (phút); Z2: Nồng độ ethanol chiết xuất (%); Z3: Công suất vi sóng (W) và Z4: Độ pH dung môi chiết. Hàm mục tiêu là Y1 (hàm lượng phenolic tổng), Y2 (Hàm lượng flavonoid tổng) và Y3 (Hàm lương cao chiết tổng). Các biến mã hóa của Z1, Z2, Z3 và Z4 lần lượt ký hiệu là A, B, C và D. Lựa chọn mô hình khảo sát theo Box-Willson với k = 4, chọn cánh tay đòn α = 1.414 và số thí nghiệm tại tâm là 3. Tổng số thí nghiệm của ma trận là 27 thí nghiệm.

3.2.3. Chiết xuất sử dụng siêu âm 3.2.3.1. Tiến hành thí nghiệm 100g bột nguyên liệu táo mèo được cho vào bình cầu 1000 mL hoặc

2000 mL loại 3 cổ, dung môi chiết sử dụng ethanol 65%, pH dung môi là 5.4 được thêm vào bình cầu ở các tỷ lệ nghiên cứu (theo bố trí thí nghiệm). Lắp sinh hàn, nhiệt kế và thiết bị siêu âm đầu dò sau đó tiến hành gia nhiệt bằng bếp điện, chiết siêu âm ở các điều kiện nhiệt độ, công suất siêu âm và thời gian cần nghiên cứu. Kết thúc quá trình chiết, dịch chiết được lọc qua phễu lọc buchner và cô đặc sẽ thu được cao chiết tổng. Xác định hàm lượng cao chiết tổng (%); hàm lượng phenolic tổng (mg GAE/g cao chiết) và flavonoid tổng (mg QE/g cao chiết) trong cao chiết.

7

3.2.3.2. Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm Các yếu tố công nghệ nghiên cứu gồm 4 yếu tố là Z1: Tỷ lệ dung

môi/nguyên liệu (v/w), Z2: Nhiệt độ chiết siêu âm (0C), Z3: Công suất siêu âm (W) và Z4: Thời gian chiết (phút). Hàm mục tiêu là Y1 (hàm lượng phenolic tổng), Y2 (Hàm lương cao chiết tổng). Các biến mã hóa của Z1, Z2, Z3 và Z4 lần lượt ký hiệu là A, B, C và D. Lựa chọn mô hình khảo sát theo Box-Behnken với k = 4, số thí nghiệm tại tâm là 3. Tổng số thí nghiệm của ma trận là 27 thí nghiệm.

3.2.4. Chiết xuất bằng phương pháp hồi lưu 3.2.4.1. Tiến hành thí nghiệm 100g bột nguyên liệu táo mèo được cho vào bình cầu 2000 mL,

dung môi chiết sử dụng ethanol 65%, pH dung môi là 5.4 được thêm vào bình cầu ở các tỷ lệ nghiên cứu. Lắp sinh hàn và tiến hành gia nhiệt bằng bếp điện, chiết hồi lưu ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian cần nghiên cứu. Kết thúc quá trình chiết, dịch chiết được lọc qua phễu lọc buchner và cô đặc sẽ thu được cao chiết tổng. Xác định hàm lượng cao chiết tổng (%); hàm lượng phenolic tổng (mg GAE/g cao chiết) và flavonoid tổng (mg QE/g cao chiết) trong cao chiết.

3.2.4.2. Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm Các yếu tố công nghệ nghiên cứu gồm 3 yếu tố là Z1: Thời gian

chiết xuất (phút), Z2: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) và Z3: Nhiệt độ chiết xuất (0C). Hàm mục tiêu là Y1 (hàm lượng phenolic tổng), Y2 (Hàm lương cao chiết tổng). Các biến mã hóa của Z1, Z2 và Z3 lần lượt ký hiệu là A, B, và C. Với k = 3, lựa chọn cánh tay đòn α = 1.215 và số thí nghiệm tại tâm là 1. Tổng số thí nghiệm của ma trận là 15 thí nghiệm

3.3. Quy trình sấy phun và thiết kế mô hình 3.3.1. Tiến hành thí nghiệm Dịch sau chiết được lọc và cô đặc thu được 2.1 lít dịch có hàm lượng

chất khô đạt 15-20%. Bổ sung chất trợ sấy maltodextrin với tỷ lệ nghiên cứu vào dịch chiết cô đặc. Bật máy khuấy dịch chiết, bật bơm lưu lượng, điều chỉnh lưu lượng dòng cấp ứng với điều kiện nghiên cứu và tiến hành quá trình sấy phun, tác nhân sấy (khí nóng) được thổi vào buồng phun dịch. Nhiệt độ tác nhân sấy được thay đổi theo điều kiện nghiên cứu. Thiết bị sử dụng nghiên cứu là máy sấy phun Buchi B290 mini spray dryer, tốc độ bơm dịch (15-35 mL/phút), nhiệt độ khí nóng đầu vào (120 – 2200C), lưu lượng khí nóng tối đa 35 m3/giờ, công suất bay hơi 1 L H2O/giờ (Viện Công nghệ sinh học – Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà nội). Bột sau sấy phun được phân tích hàm lượng phenolic tổng và hàm ẩm.

8

3.3.2. Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm Các yếu tố công nghệ nghiên cứu gồm 3 yếu tố là Z1: Hàm lượng

chất trợ sấy maltodextrin (%, w/w), Z2: Nhiệt độ khí nóng đầu vào (0C) và Z3: Tốc độ phun dịch (mL/phút). Hàm mục tiêu là Y1 (hàm lượng phenolic tổng của sản phẩm sau sấy phun), Y2 (độ ẩm của sản phẩm sau sấy phun). Các biến mã hóa của Z1, Z2 và Z3 lần lượt ký hiệu là A, B, và C. Lựa chọn mô hình khảo sát theo Box-Behnken với k = 3, số thí nghiệm tại tâm là 1. Tổng số thí nghiệm của ma trận là 15 thí nghiệm.

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Các hợp chất phân lập được từ cặn EtOAC quả táo mèo Từ cặn chiết ethyl actate quả táo mèo đã phân lập và xác định được

25 hợp chất trong đó gồm: + 19 hợp chất phenolic (TM1, TM2, TM3, TM5, TM7, TM8, TM9,

TM10, TM12, TM13, TM15, TM16, TM17, TM18, TM30, TM33, TM35, TM36, TM37). Trong đó có 1 hợp chất mới có tên là 3S-thunberginol C 6-O-β- D-glucopyranoside (TM17)

+ 5 hợp chất triterpenoid (TM20, TM22, TM23, TM24, TM25) + 1 dẫn xuất của axit mạch thẳng: (TM6)

Bảng 4.1. Các hợp chất phân lập từ cặn chiết EtOAC quả táo mèo

TT

Kí hiệu

Tên chất Khối lượng (mg)

1 TM1 Chlorogenic acid methyl ester 45,5 2 TM2 Quercetin 21,0 3 TM3 Protocatechuic acid 6,8 4 TM5 Hyperin 13,5 5 TM6 4-methyl malate 32,0 6 TM7 Naringenin-7-O- β-D-glucopyranoside 11,0 7 TM8 Phlorizin 10,8 8 TM9 3-methoxy, 4-hydroxy-benzoic acid 12,2 9 TM10 Astilbin 22,0 10 TM12 Gallic acid 19,0 11 TM13 Methyl gallate 6,5 12 TM15 Chrysin 9,5 13 TM16 Naringenin 5,6 14 TM17

(Chất mới) 3S-Thunberginol C 6-O-β- D-glucopyranoside 6,5

15 TM18 1-O-coumaroyl-β-D-glucopyranose 12,0

916 TM20 Pomolic acid 8,0 17 TM22 Euscaphic acid 7,6 18 TM23 23-Hydroxy ursolic acid 10,5 19 TM24 Ursolic acid 22,0 20 TM25 Maslinic acid 11,2 21 TM30 (2R/S)-5,7,3’,5’-tetrahydroxy-flavanone 7-O-β-D

glucopyranosie 8,2

22 TM33 Phloretin-2’-O-(β-D-xylopyranosyl-(16)-O-β-D glucopyranoside)

11,3

23 TM35 Cis-p-coumaric acid 4-O-β-D-glucopyranoside 7,6 24 TM36 Myricitrin 7,2 25 TM37 2’,6’-dihydroxy-3’,4’- dimethoxychalcone 4,4

4.1.1. Hợp chất 3S-thunberginol C 6-O-β- D-glucopyranoside (TM17) – Hợp chất mới

Hợp chất TM17 thu được ở dạng chất rắn màu trắng. Trên phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của TM17 xuất hiện các píc ion giả phân tử lần lượt là [M - H]¯ tại m/z 433.1119, [M + 35Cl]¯ tại m/z 469.0890 và [M + 37Cl]¯ tại m/z 471.0870. Tính toán lý thuyết cho ion [C21H21O10]¯có m/z 433.1129, ion [C21H22ClO10]¯ có m/z 469.0896 tương ứng với đồng vị 35Cl và 471.0876 tương ứng với đồng vị 37Cl. Từ các dữ kiện trên phổ khối phân giải cao, CTPT của TM17 được xác định là C21H22O10. Độ quay cực của hợp chất TM17 là [α]D = - 690 (c = 0.1, MeOH)

Hình 4.1.1.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất TM17

Trên phổ 1H-NMR của hợp chất TM17 xuất hiện hệ spin AABB [δH

6.80 (d, J= 8.5 Hz, H-3′, 5′); 7.32 (d, J= 8.0 Hz, H-2′, 6′)] cho phép xác định vòng phenyl thế 2 lần trong hợp chất TM17. Bên cạnh đó, vòng thơm của nhân isocoumarin đặc trưng bởi tín hiệu cộng hưởng có độ chuyển

[M + 35Cl]¯

[M - H]¯

[M + 37Cl]¯

CTPT: C21H22O10

10

dịch hóa học [δH 6.54 (br s, H-5); 6.52 (d, J= 2 Hz, H-7, TM17a); 6.51 (d, J= 2 Hz, H-7, TM17b)], trong khi vòng lactone xuất hiện với các tín hiệu cộng hưởng ở δH 5.61 (t, J= 2.5 Hz, H-3, TM17a); 5.59 (t, J= 2.5 Hz, H-3, TM17b); 3.11 và 3.07 (H-4a); 3.34 (m, H-4b).

Hình 4.1.1.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất TM17

Phổ 13C-NMR kết hợp phổ DEPT cho thấy có 21 tín hiệu của nguyên tử carbon bao gồm 2 carbon nhóm methylene (-CH2), 12 carbon nhóm methine (-CH) và 7 carbon không liên kết với hydro. Trong đó có 1 tín hiệu của nhóm keton liên kết với nguyên tử oxy (O-C=O) đặc trưng của khung dihydroisocoumarin xuất hiện tại δC 169.25/169.18 ppm, 2 cặp tín hiệu carbon đối xứng của vòng B tại δC (ppm) 128.22/ 128.20 và 115.18 chứng tỏ vòng B bị thế ở 2 vị trí đối xứng nhau trên vòng (C-1’ và C4’), 2 tín hiệu carbon đặc trưng của vòng lactone tại δC (ppm) 80.0 và 33.66; Bên cạnh đó sự xuất hiện của 6 tín hiệu carbon ở độ chuyển dịch hóa học δC

(ppm) 99.77/99.67; 73.06; 76.44; 69.51; 77.11 và 60.52 gợi ý đây là 6 tín hiệu carbon của 1 cấu tử đường.

Trên phổ 2 chiều HMBC đã thể hiện sự tương tác của proton anomeric δH (ppm) 4.99 (1H, d, J = 7.5 Hz)/4.97 (1H, d, J = 8.0 Hz) với nguyên tử carbon C-6 của phần aglycon. Hằng số tương tác của proton anomer J= 7.5 – 8.0 Hz cho phép khẳng định đây là đường dạng beta. Phổ HMBC cũng thể hiện các tương tác giữa H-7 (δH 5.51/5.52) với C-5 (δC 107.37/107.27), C-9 (δC 102.56/102.54); H-4 (δH 3.08/3.34) với C-5 (δC 107.37/107.27), C-9 (δC 102.56/102.54); H-5 (δH 6.55) với C-4 (δC 33.66); H-3 (δH 5.61/5.59) với C-10 (δC 142.15), C-6’ (δC 128.22/ 128.20), C-2’(δC 128.22/128.20); H-2’(δH 7.32), H-6’(δH 7.32) với C-4’ (δC 157.76);

11

H3’(δH 6.80), H-5’(δH 6.80) với C-1’(δC 128.47/128,45). Các tương tác trên cho phép xác định vị trí 2 nhóm thế hydroxyl tại C-8 và C-4’.

Hình 4.1.1.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất TM17

Hình 4.1.1.5. Phổ HSQC và HMBC của hợp chất TM17

Các tín hiệu trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR nêu trên có thể khẳng định phần aglycon của TM17 chính là thunberbinol C [72]

Tiến hành thủy phân TM17 và chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao với các đối chứng chuẩn đã xác định được cấu tử đường trong phân tử TM17 là đường β-D-glucose.

12

Hình 4.1.1.6. Sắc ký đồ HPLC xác định cấu tử đường Trong cấu trúc hóa học của hợp chất TM17, vị trí carbon C-3 là

carbon bất đối. Do đó, để xác định cấu hình tuyệt đối của hợp chất TM17, chúng tôi tiến hành đo phổ lưỡng sắc tròn (phổ CD). Kết quả trên phổ CD cho các hiệu ứng cotton âm xảy ra ở các bước sóng 227 nm (Δε -2.29), 255 nm (Δε -4.85) và 305 nm (Δε -1.21). Trong đó hiệu ứng cotton âm xảy ra mạnh nhất ở bước sóng 255 nm (Δε -4.85) (Hình 4.1.1.9). Tiến hành so sánh phổ CD của hợp chất TM17 với các hợp chất có cấu trúc hóa học và vị trí carbon bất đối tương tự hợp chất TM17 như các hợp chất: 3S-hydrangenol 4’-O-glucoside, 3S-thunberginol I 4’-O-glucoside và 3S-florahydroside. Ở 3 hợp chất vừa nêu, trên phổ CD của chúng đều xảy ra hiệu ứng cotton âm mạnh nhất lần lượt tại 260 nm (Δε -3.76), 255 nm (Δε -8.30) và 255 nm (Δε -0.79) [72-74]. Điều này chỉ ra hợp chất TM17 phù hợp với cấu hình dạng 3S của 3-aryl dihydroisocoumarin. Do đó, hợp chất TM17 được khẳng định là 3S-thunberginol C 6-O-β-D-glucopyranoside. Đây là hợp chất mới lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên.

Tuy nhiên, trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR xuất hiện các tín hiệu kép xuất hiện theo các cặp tín hiệu rất sát nhau (như trong bảng dữ liệu phổ 4.1.1). Chúng tôi đặt giả thuyết hợp chất TM17 tồn tại đồng thời ở 2 cấu dạng bền khác nhau nên khi đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân sẽ xảy ra hiện tượng như trên. Để chứng minh cho giả thuyết này, chúng tôi tiến hành tính toán lý thuyết năng lượng bền của các cấu dạng có thể của hợp chất TM17 thông qua việc tính toán enthalpy tương đối (ΔH) của hợp chất này, sử dụng phương pháp DFT (density functional theory method). Kết quả tính toán lý thuyết đã cho thấy 02 cấu dạng nửa thuyền tồn tại ở trạng thái năng lượng bền với ethalpy tương đối lần lượt là H = 0.0 kcal/mol và H = 0.2 kcal/mol. Điều này đã làm sáng tỏ giả thuyết nêu trên của chúng tôi rằng hợp chất 3S-Thunberginol C 6-O-β- D-glucopyranoside tồn tại ở 2 loại cấu dạng bền khác nhau (a/b).

13

Hình 4.1.1.7. Cấu trúc hóa học của TM17

Hình 4.1.1.8. Phổ CD của TM17

(a) (b)

Hình 4.1.1.9. Hai cấu dạng bền kiểu nửa thuyền của hợp chất TM17

Bảng 4.1.1. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM17 và chất so sánh thunberginol C

Vị trí C

TLTK (DMSO-d6) [72] TM17 (DMSO-d6) δH (ppm) δC

(ppm) δH (ppm) δC (ppm)

1 169.4 169.25 / 169.18

3 5.54 (1H, t, J= 3.0 Hz) 79.7 5.61 (1H, t, J = 2.5 Hz) / 5.59 (1H, t, J = 2.5 Hz)

80.0

4 3.03 (1H, dd, J= 3.0; 17.0 Hz, H-4a)

3.24 (1H, dd, J= 3.0; 17.0 Hz, H-4b)

33.6 3.11 (1H, t, J= 2.5 Hz, H-4a)/3.07 (1H, t, J= 2.5

Hz, H-4a) 3.35 (overlap, H-4b)

33.66

5 6.3 (1H, d, J= 2.0 Hz) 106.8 6.55 (1H, br s) 107.37 / 107.27

6 164.4 162.99 7 6.22 (1H, d, J = 2.0

Hz) 100.9 6.52 (1H, d, J= 2.0 Hz) /

6.51 (1H, d, J = 2.0 Hz) 101.76

148 11.1 (-OH) 163.3 11.09 (-OH) 163.28 9 100.3 102.56 /

102.54 10 142.2 142.15 1’ 128.6 128.47 /

128.45 2’ 7.31 (1H, d, J=9.0 Hz) 128.0 7.32 (1H, d, J = 8.0 Hz) 128.22 /

128.20 3’ 6.8 (1H, d, J=9.0 Hz) 115.1 6.80 (1H, d, J = 8.5 Hz) 115.18 4’ 157.6 157.76 5’ 6.8 (1H, d, J=9.0 Hz) 115.1 6.80 (1H, d, J = 8.5 Hz) 115.18 6’ 7.31 (1H, d, J=9.0 Hz) 128.0 7.32 (1H, d, J = 8.0 Hz) 128.22 /

128.20 1’’ 4.99 (1H, d, J = 7.5 Hz)/

4.97 (1H, d, J = 8.0 Hz) 99.77 / 99.67

2’’ 3.24, m 73.06 3’’ 3.37, m 76.44 4’’ 3.18, m 69.51 5’’ 3.2, m 77.11 6’’ 3.46 (1H, m)

3.76 (1H, m) 60.52

4.2. Đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết và các hợp chất phân lập được

4.2.1. Đánh giá hoạt tính bảo vệ tim mạch (sEH) 4.2.1.1. Đối với cao chiết Cao chiết phân đoan n-hexan thì không thể hiện hoạt tính ở nồng độ

37.5 và 75 µM, thể hiện hoạt tính thấp ở 150 µM. Các phân đoạn còn lại thể hiện hoạt tính giảm dần: cao ethyl acetate > cao dichloromethane > cặn nước > cao tổng methanol.

Bảng 4.2.2.1. Kết quả đánh giá hoạt tính sEH với cao chiết TT Phân Đoạn cao

chiết

Nồng độ thử

(µM)

Phần trăm ức

chế I (%)

1 Dichloromethane 37.5 28.0 ± 3.4

2 75 57.9 ± 0.1

3 150 83.8 ± 2.7

4 Ethyl acetate 37.5 36.7 ± 2.5

5 75 68.7 ± 3.5

6 150 92.7 ± 1.2

7 Cặn nước 37.5 25.4 ± 1.2

15

8 75 45.9 ± 0.2

9 150 68.4 ± 0.1

10 Cao tổng methanol 37.5 4.9 ± 0.5

11 75 12.8 ± 1.7

12 150 21.1 ± 2.2

4.2.2.2. Đối với các hợp chất phân lập được Có 8 trên 25 hợp chất thể hiện hoạt tính bao gồm các chất là TM1,

TM5, TM8, TM10, TM16, TM24, TM33 và TM37. Giá trị IC50 (µM) của 8 hợp chất này nằm trong khoảng từ 10.0 ± 0.6 đến 88.4 ± 0.2. Trong đó, 2 hợp chất TM9 và TM37 thể hiện hoạt tính mạnh nhất khi có các giá trị IC50 lần lượt là 19.3 ± 2.2 và 10.0 ± 0.6 µM. Bảng 4.2.2.2. Kết quả thử hoạt tính sEH với các hợp chất phân lập được

TT Kí hiệu Phần trăm ức chế tại

nồng độ 100 µM (%)

IC50 (µM)

đối chứng (+)

Auda

16.8 ± 0.5 nM

1 TM1 73.3 ± 1.1 41.9 ± 1.1

2 TM5 72.8 ± 0.2 30.5 ± 0.1

3 TM9 >100 19.3 ± 2.2

4 TM10 79.9 ± 0.4 22.9 ± 0.2

5 TM16 76.8 ± 0.06 24.7 ± 2.5

6 TM24 74.0 ± 2.8 36.1 ± 0.6

7 TM33 52.7 ± 0.2 88.4 ± 0.2

8 TM37 >100 10.0 ± 0.6

4.2.2. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa Trong tổng số 25 hợp chất đem thử thì có tới 14 hợp chất thể hiện

hoạt tính với giá trị SC50 (µg/mL) nằm trong khoảng (18.05 ± 0.69 đến 49.34 ± 1.22). Đặc biệt trong 14 hợp chất thể hiện hoạt tính có 1 hợp chất thể hiện hoạt tính mạnh hơn cả đối chứng dương là hợp chất TM12 có giá trị SC50 là 18.05 (µg/mL).

Bảng 4.2.1. Kết quả hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập Ký hiệu Giá trị SC50

(µg/mL) Ký hiệu Giá trị SC50

(µg/mL) Đối chứng (+) Ascorbic acid

26.40 ± 0.44 TM12 18.05 ± 0.69

TM1 35.48 ± 2.02 TM15 30.12 ± 0,15 TM2 31.37 ± 0.12 TM16 33.47 ± 0,51

16TM3 28.18 ± 1.18 TM17 40.51 ± 0.78 TM5 29.17 ± 1.67 TM30 41.81 ± 0.45 TM7 49.34 ± 1.22 TM36 42.76 ± 2.12 TM9 29.11 ± 0.17 TM37 29,12 ± 0.38

TM10 42.32 ± 0.42

4.2.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết Chỉ có 2 cao chiết phân đoạn n-hexan và dicholoromethane (CH2Cl2)

là thể hiện hoạt tính ức chế tế bào ung thư cổ tử cung hela với giá trị IC50

lần lượt là 99.24 µg/mL và 67.2 µg/mL. Các cao chiết phân đoạn còn lại không thể hiện hoạt tính.

4.3. Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chiết phenolic từ quả táo mèo quy mô phòng thí nghiệm.

4.3.1. Kết quả chiết soxhlet thu cao chiết toàn phần Phương pháp chiết soxhet cho hiệu suất chiết rất cao do đây là

phương pháp chiết kiệt nhất. Hàm lượng cao chiết tổng thu được trung bình đạt 36,07%. Hàm lượng phenolic tổng và hàm lượng flavonoid tổng cũng rất cao với giá trị trung bình lần lượt là 28,9 (mg GAE/g cao chiết) và 20,0 (mg QE/g cao chiết).

4.3.2. Mô hình nghiên cứu và tối ưu quy trình chiết xuất phenolic bằng phương pháp chiết vi sóng

4.3.2.1. Ảnh hưởng của các yếu tố đơn biến đến hàm mục tiêu 4.3.2.2. Thiết lập mô hình và xác định phương trình hồi quy hàm

mục tiêu. Từ các số liệu thí nghiệm ảnh hưởng của các thông số công nghệ

đơn biến đến hàm mục tiêu, chúng tôi lựa chọn mô hình nghiên cứu theo mô hình bậc 2 của Box-Willson. Các mức gốc (hay mức cơ bản) của các yếu tố và hệ số α = 1.414 (với k= 4) được thể hiện ở bảng 4.3.2.2a

Bảng 4.3.2.2a. Các mức thí nghiệm của các biến biến công nghệ

Tên biến, khoảng biến thiên Mức nghiên cứu

Biến thực

Biến

mã

Khoảng biến

thiên (Δ) -α -1 0 1 +α

Z1: thời gian chiết (phút) A 15 9 15 30 45 51

Z2: Nồng độ ethanol (%) B 20 32 40 60 80 88

Z3: Công suất máy vi

sóng (W) C 160 175 240 400 560 625

Z4: độ pH D 2 1.2 2 4 6 6.8

17

Sử dụng phần mềm design expert để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm với 27 thí nghiệm và đánh giá sự hội tụ của mô hình thông qua phân tích phương sai. Kết quả mô hình nghiên cứu được xác định là tương hợp với thực nghiệm.

Sau khi loại bỏ các yếu tố không có ý nghĩa. Hàm mục tiêu được xác định và biểu diễn bằng phương trình hồi quy bậc 2 như sau: + Y1 = 29.42 + 2.93A + 0.88B + 1.78C + 0.76D – 0.89AB + 1.09AD –

1.02BC – 1.3B2 – 1.1D2 (1) + Y2 = 21.22 + 2.32A + 0.68B + 0.99C + 0.41D – 0.59AB + 0.62AD –

1.11BC + 0.39BD – 0.92B2 – 0.57D2 (2) + Y3 = 29.65 + 2.55A + 1.06B + 1.05C + 0.61D – 0.46AC + 0.49AD –

0.97BC – 0.91B2 (3) 4.3.2.3. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất Quá trình chiết xuất cần được tối ưu sao cho cả 3 hàm mục tiêu Y1,

Y2 và Y3 đều đạt giá trị lớn nhất. Điều này được giải quyết bằng việc giải bài toán tối ưu bằng phần mềm Design expert 7.0 theo phương pháp hàm nguyện vọng với các mức độ ưu tiên (từ 1 đến 5). Trong bài toán này, với các mục tiêu đặt ra, chúng tôi lựa chọn mức độ ưu tiên cho các hàm mục tiêu như sau: Hàm Y1 (mức 5); hàm Y2 (mức 3); hàm Y3 (mức 2). Tại điều kiện các thông số công nghệ như bảng 4.3.2.4, giá trị dự đoán của các hàm mục tiêu lần lượt là Y1 = 33.64 (mg GAE/g); Y2 = 25.1 (mg QE/g) và Y3 = 33.33 (%).

Bảng 4.3.2.3a. Kết quả tối ưu các biến công nghệ Biến mã hóa Biến thực

A B C D Thời

gian

(phút)

Nồng độ

ethanol

(%,v/v)

Công

suất vi

sóng (W)

Độ pH

dung

môi

1.34 0.23 0.26 0.7 50.1 64.6 441.6 5.4

Tại điều kiện tối ưu, tiến hành thực nghiệm so sánh kết quả thực nghiệm với kết quả tính toán lý thuyết cho thấy mức độ sai khác là rất nhỏ. Chứng tỏ mô hình xây dựng có độ chính xác cao.

4.3.3. Mô hình nghiên cứu và tối ưu quy trình chiết xuất phenolic bằng phương pháp chiết siêu âm


mục tiêu.

18

Bài toán này dựa vào các số liệu thí nghiệm ảnh hưởng của các thông số công nghệ đơn biến đến hàm mục tiêu, chúng lựa chọn mô hình nghiên cứu theo mô hình bậc 2 của Box-Behnken. Các mức gốc (0), mức thấp (-1) và mức cao (+1), của các yếu tố (với k= 4) và khoảng biến thiên được thể hiện ở bảng 4.3.3.2a.

Bảng 4.3.3.2a. Các mức thí nghiệm của các biến biến công nghệ Biến thực Biến

mã Khoảng biến

thiên (Δ) Mức nghiên cứu -1 0 1

Z1: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w)

A 2 5 7 9

Z2: Nhiệt độ chiết (0C) B 15 30 45 60 Z3: Công suất siêu âm (W) C 40 100 140 180 Z4: Thời gian chiết (phút) D 15 45 60 75


Sau khi loại bỏ các yếu tố không có ý nghĩa. Hàm mục tiêu được xác định và biểu diễn bằng phương trình hồi quy bậc 2 như sau: + Y1 = 33.60 + 1.35B – 0.94C + 1.1D – 1.52AC + 1.7BC + 2.49BD +

1.63CD – 2.45A2 – 4.8B2 – 4.58C2 – 3.30D2 (1) + Y2 = 28.59 + 2.44A + 1.75C + 5.97D + 2.39AB + 5.33AD – 2.27BC –

4.72A2 – 2.75B2 – 2.9C2 – 2.17D2 (2) 4.3.3.3. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất Tương tự như bài toán trước đó, quá trình chiết xuất nguyên liệu táo

mèo cần được tối ưu sao cho cả 2 hàm mục tiêu Y1 và Y2 đều đạt giá trị lớn nhất. Điều này được giải quyết bằng việc tiến hành giải bài toán tối ưu bằng phần mềm Design expert 7.0 theo phương pháp hàm nguyện vọng với các mức độ ưu tiên (từ 1 đến 5). Trong bài toán này, với các mục tiêu đặt ra, nghiên cứu sinh lựa chọn mức độ ưu tiên cho các hàm mục tiêu như sau: Hàm Y1 (mức 5), hàm Y2 (mức 3). Tại điều kiện các thông số công nghệ như bảng 4.3.3.4, giá trị dự đoán của các hàm mục tiêu lần lượt là Y1 = 33.0 (mg GAE/g) và Y2 = 32.83 (%).

Bảng 4.3.3.3. Kết quả tối ưu các biến công nghệ Biến mã hóa Biến thực

A B C D Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w)

Nhiệt độ chiết siêu âm (0C)

Công suất chiết siêu âm (W)

Thời gian chiết

(phút)

0.29 0.27 0.05 0.61 7.58 49.05 142 69.15

19


4.3.4. Mô hình nghiên cứu và tối ưu quy trình chiết xuất phenolic bằng phương pháp chiết hồi lưu


mục tiêu Từ các số liệu thí nghiệm ảnh hưởng của các thông số công nghệ đơn

biến đến hàm mục tiêu Y1 và Y2, nghiên cứu sinh lựa chọn mô hình bậc 2, kế hoạch hóa thực nghiệm hỗn hợp trung tâm theo mô tả của Box-Willson. Các mức gốc (hay mức cơ bản) của các yếu tố và hệ số α = 1.215 (với k= 3) và khoảng biến thiên được thể hiện ở bảng 4.3.4.2a

Bảng 4.3.4.2a. Các mức thí nghiệm của các biến biến công nghệ

Tên biến, khoảng biến thiên Mức nghiên cứu

Biến thực

Biến

mã

Khoảng biến

thiên (Δ) -α -1 0 1 +α

Z1: thời gian chiết (phút) A 60 227 240 300 360 373 Z2: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w). B 2 4.57 5 7 9 9.43 Z3: Nhiệt độ chiết (0C) C 15 36.8 40 55 70 73.2


Sau khi loại bỏ các yếu tố không có ý nghĩa. Hàm mục tiêu được xác định và biểu diễn bằng phương trình hồi quy bậc 2 như sau: + Y1 = 31.28 + 2.82A + 3.4B + 2.63C + 1.32AC − 4.45A2 – 2.42B2 –

2.47C2 (1) + Y2 = 30.74 + 3.29A + 3.16B + 2.84C + 1.51AC − 4.34A2 – 2.2B2 –

2.4C2 (2) 4.3.4.3. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất Cũng tương tư như các bài toán trước, quá trình chiết xuất nguyên

liệu táo mèo cần được tối ưu sao cho cả 2 hàm mục tiêu Y1và Y2 đều đạt

20

giá trị lớn nhất. Trong bài toán này, với các mục tiêu đặt ra, nghiên cứu sinh lựa chọn mức độ ưu tiên cho các hàm mục tiêu như sau: Hàm Y1 (mức 4), hàm Y2 (mức 3). Tại điều kiện các thông số công nghệ như bảng 4.3.4.4, giá trị dự đoán của các hàm mục tiêu lần lượt là Y1 = 33.96 (mg GAE/g) và Y2 = 33.21 (%).

Bảng 4.3.4.3. Kết quả tối ưu các biến công nghệ Biến mã hóa Biến thực

A B C Thời gian

(phút)

Tỷ lệ dung môi/nguyên

liệu (v/w)

Nhiệt độ

chiết (0C)

0.17 0.81 0.46 310.2 8.62 61.9


4.3.5. So sánh, đánh giá các phương án công nghệ nghiên cứu Từ kết quả so sánh hiệu quả chiết suất và phân tích các yếu tố liên

quan đến công nghệ cũng như khả năng triển khai, nâng cấp quy mô công nghệ. Trong 3 phương pháp chiết xuất phenolic được nghiên cứu, chúng tôi đánh giá phương pháp chiết siêu âm là phù hợp nhất để triển khai công nghệ chiết xuất và có nhiều tiềm năng để áp dụng vào thực tế sản xuất.

4.4. Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình sấy phun dịch chiết táo mèo quy mô phòng thí nghiệm

4.4.1. Ảnh hưởng của các yếu tố đơn biến đến hàm mục tiêu 4.4.2. Thiết lập mô hình và xác định phương trình hồi quy hàm

mục tiêu Từ các số liệu thí nghiệm ảnh hưởng của các thông số công nghệ đơn

biến đến hàm mục tiêu Y1 và Y2, nghiên cứu sinh lựa chọn mô hình bậc 2, kế hoạch hóa thực nghiệm theo mô tả của Box- Behnken. Các mức gốc (0), mức thấp (-1) và mức cao (+1), của các yếu tố (với k= 3) và khoảng biến thiên được thể hiện ở bảng 4.4.2a.

Bảng 4.4.2a. Các mức thí nghiệm của các biến biến công nghệ Biến thực Biến

mã Khoảng biến

thiên (Δ) Mức nghiên cứu -1 0 1

Z1: Hàm lượng Maltodextrin bổ sung

(%, w/w)

A 2 7 9 11

Z2: Nhiệt độ khí sấy vào (0C)

B 20 120 140 160

21

Z3: tốc độ bơm dịch (mL/phút)

C 5 25 30 35

Sử dụng phần mềm design expert để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm với 15 thí nghiệm và đánh giá sự tương hợp của mô hình thông qua phân tích phương sai. Kết quả mô hình nghiên cứu được xác định là tương hợp với thực nghiệm.

Sau khi loại bỏ các yếu tố không có ý nghĩa. Hàm mục tiêu được xác định và biểu diễn bằng phương trình hồi quy bậc 2 như sau: + Y1 = 13.52 – 2.13A – 0.78B – 0.067C – 0.47AB + 0.36AC + 0.18BC –

0.36 A2 – 0.33C2 (1) + Y2 = 6.85 + 0.46A – 0.9B + 0.13C – 0.4AB – 0.64B2 + 0.22C2 (2)

4.4.3. Tối ưu hóa quy trình sấy phun Cũng tương tư như các bài toán trước, quá trình sấy phun dịch chiết táo

mèo cần được tối ưu để hàm mục tiêu Y1 (hàm lượng phenolic tổng) là lớn nhất và Y2 (độ ẩm sản phẩm) là nhỏ nhất. Trong bài toán này, với các mục tiêu đặt ra, nghiên cứu sinh lựa chọn mức độ ưu tiên cho các hàm mục tiêu là như nhau: Hàm Y1 (mức 3), hàm Y2 (mức 3). Tại điều kiện các thông số công nghệ như bảng 4.4.3, giá trị dự đoán của các hàm mục tiêu lần lượt là Y1 = 15.02 (mg GAE/g) và Y2 = 5.23(%).

Bảng 4.4.3. Kết quả tối ưu các biến công nghệ Biến mã hóa Biến thực

A B C Hàm lượng maltodextrin

(%, w/w)

Nhiệt độ khí sấy vào (0C)

Tốc độ bơm dịch (mL/phút)

-1 1 -0.36 7 160 28.2 Tại điều kiện tối ưu, tiến hành thực nghiệm so sánh kết quả thực

nghiệm với kết quả tính toán lý thuyết cho thấy mức độ sai khác là rất nhỏ. Chứng tỏ mô hình xây dựng có độ chính xác cao.

4.5. Thuyết minh quy trình công nghệ tạo sản phẩm bột cao chiết táo mèo quy mô phòng thí nghiệm.

1 kg bột nguyên liệu táo mèo sau khi tiền xử lý (độ ẩm ≤ 12%, độ mịn d ≤ 2 mm) cho vào bình thủy tinh dung tích 15 lít. Thêm vào bình 7.6 lít ethanol thực phẩm 65%, độ pH 5.4 (pH dung môi được điều chỉnh bằng dung dịch axit citric 0.1M với hệ đệm axit citric/natri citrate). Khuấy đều 5 phút để dung môi ngấm đều vào nguyên liệu. Đưa bình chiết vào thiết bị bể siêu âm dung tích 20 lít (model: UCP-20, Jeiotech – Hàn quốc, công suất siêu âm tối đa 500W). Điều chỉnh công suất siêu âm ở chế độ trung

22

bình (140-150W), cài đặt nhiệt độ chiết 49 ± 20C. Tiến hành chiết siêu âm trong thời gian 70 phút. Kết thúc quá trình chiết xuất, tiến hành lọc thu dịch chiết bằng phễu buchner thu được 7.2 lít dịch chiết. Sử dụng máy cô cất chân không (model R300, Buchi – Thụy sĩ) cô đặc dịch chiết đến nồng độ chất khô 15%, lượng dịch chiết thu được là 2.1 lít. Quá trình sấy phun dịch chiết được thực hiện trên máy sấy phun mini Buchi B290 (Viện Công nghệ sinh học – Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội). Bật máy sấy phun, điều chỉnh và ổn định nhiệt độ tác nhân sấy đầu vào ở 1600C, đầu ra 900C. Chuẩn bị dịch sấy phun, bổ sung 7% (w/w) chất mang maltodextrin vào dịch chiết và khuấy đều. Bật bơm lưu lượng, điều chỉnh tốc độ bơm dịch đạt 28 mL/phút, tiến hành sấy phun. Kết thúc quá trình sấy phun thu được 320 g bột cao chiết táo mèo giàu phenolic. Sản phẩm bột táo mèo thu được có độ ẩm 5.2 %, hàm lượng phenolic tổng đạt 14.9 (mg GAE/g bột). Sản phẩm được đóng túi hút chân không và bảo quản ở nhiệt độ 250C.

KẾT LUẬN

Luận án đã thực hiện được những kết quả bao gồm 1. Nghiên cứu thành phần hóa học Từ phân đoạn cao chiết ethyl acetate của quả táo mèo (Docynia indica

(Wall.) Decne) đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 25 hợp chất bao gồm: 19 hợp chất phenolic, 5 hợp chất triterpenoid và 1 dẫn xuất của axit hữu cơ mạch thẳng. Trong đó có 1 hợp chất mới có tên là 3S-Thunberginol C 6-O-β- D-glucopyranoside và 16 hợp chất khác lần đầu phân lập từ quả táo mèo.

2. Nghiên cứu hoạt tính sinh học - Hoạt tính bảo vệ tim mạch

+ Các cao chiết phân đoạn: Cao chiết ethylcetate thể hiện hoạt tính mạnh nhất, tiếp đến lần lượt là cao chiết dichloromethane, cao nước và cao chiết methanol. Cao chiết n-hexan thể hiện hoạt tính thấp ở nồng độ 150 µg/mL. + Các hợp chất phân lập được: Có 8 trong số 25 hợp chất thể hiện hoạt tính với giá trị IC50 (µM) nằm trong khoảng từ 10.0 ± 0.6 đến 88.4 ± 0.2. Trong đó 2 hợp chất TM9 và TM37 thể hiện hoạt tính mạnh nhất khi có các giá trị IC50 lần lượt là 19.3 ± 2.2 và 10.0 ± 0.6 µM. - Hoạt tính chống oxy hóa: Có 14 trong số 25 hợp chất thể hiện

hoạt tính với giá trị SC50 (µg/mL) nằm trong khoảng (18.05 ± 0.69 đến 49.34 ± 1.22). Đặc biệt, 2 hợp chất thể hiện hoạt tính bảo vệ

23tim mạch nhất là TM9 và TM37 cũng thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh tương đương đối chứng dương với giá trị SC50 lần lượt là 29.11 ± 0.17 và 29.12 ± 0.38 (µg/mL).

- Hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) và ung thư cổ tử cung (Hela) Trong 6 cao chiết phân đoạn đem thử nghiệm thì có 2 cao chiết

phân đoạn n-hexan và dicholoromethane (CH2Cl2) là thể hiện hoạt tính ức chế tế bào ung thư cổ tử cung (Hela) với giá trị IC50 lần lượt là 99.24 µg/mL và 67.2 µg/mL. Các cao chiết phân đoạn còn lại không thể hiện hoạt tính đến nồng độ 100 µg/mL. 3. Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chiết xuất phenolic - Đã tiến hành nghiên cứu và tối ưu hóa quá trình chiết xuất

phenolic từ quả táo mèo sử dụng 3 phương pháp là chiết vi sóng, chiết siêu âm và chiết hồi lưu. Kết quả quá trình chiết xuất phenolic của 3 phương pháp tại điều kiện tối ưu đã được đánh giá. hàm lượng phenolic tổng dao động từ 32.05 – 34.1 (mg GAE/g cao chiết) và hàm lượng cao chiết tổng thu được dao động từ 32.9 – 33.4 (%).

- Trong 3 phương pháp chiết xuất được nghiên cứu, phương pháp chiết siêu âm được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu nâng cấp quy mô. Các thông số công nghệ tối ưu của phương pháp chiết siêu âm quy mô phòng thí nghiệm là: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 7.6/1 (v/w), nhiệt độ chiết siêu âm 49 (0C), công suất chiết siêu âm 140 (W), thời gian chiết 70 (phút) với dung môi chiết là ethanol 65% và độ pH dung môi là 5.4. Khi đó Hàm lượng phenolic tổng là 33.05 ± 0.33 (mg GAE/g), và hàm lượng cao chiết tổng là 32.9 ± 0.21 (%).

4. Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình sấy phun dịch chiết táo mèo Các thông số công nghệ tối ưu của quy trình sấy phun là: hàm

lượng chất mang maltodextrin 7 (%, w/w), nhiệt độ khí sấy vào 160 (0C) và tốc độ bơm dịch 28,2 (mL/phút). Khi đó hàm lượng phenolic tổng và độ ẩm của sản phẩm lần lượt là 14.98 ± 0.17 (mg GAE/g) và 5.17 ± 0.12 (%). Sản phẩm có màu sắc và mùi vị đặc trưng của táo mèo, dạng bột mịn, không vón cục.

24KIẾN NGHỊ

1. Tiếp tục nghiên cứu và phân lập một số thành phần hóa học từ các phân đoạn cao chiết khác của quả táo mèo như phân đoạn nước, dicholoromethane.

2. Tiếp tục nghiên cứu thăm dò hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được liên quan đến các bệnh tiểu đường, mỡ máu…

3. Tiếp tục nghiên cứu, nâng cấp quy mô và hoàn thiện công nghệ để có thể triển khai sản xuất ở quy mô lớn

ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN

1. Lần đầu tiên áp dụng mô hình khảo sát thành phần hóa học quả

táo mèo theo định hướng hoạt tính bảo vệ tim mạch. Từ phân đoạn ethyl acetate có tác dụng bảo vệ tim mạch mạnh nhất đã phân lập được 25 hợp chất trong đó có 1 hợp chất mới và 16 hợp chất khác lần đầu tiên phân lập từ quả táo mèo.

2. Lần đầu tiến hành nghiên cứu và tối ưu hóa thông số công nghệ quá trình chiết xuất phenolic bằng 3 phương pháp chiết khác nhau là chiết vi sóng, chiết siêu âm và chiết hồi lưu; Từ đó tiến hành so sánh, đánh giá và lựa chọn được phương pháp chiết suất phù hợp nhất.

3. Lần đầu tiến hành nghiên cứu và tối ưu hóa thông số công nghệ quá trình sấy phun dịch chiết táo mèo thu bột cao chiết táo mèo giàu phenolic sử dụng cho mục đích bào chế tạo sản phẩm chăm sóc sức khỏe.

lÊ xuÂn duy nghiÊn cỨu thÀnh phẦn hÓa hỌc vÀ xÂy dỰng …

Documents