kuliah v -...
TRANSCRIPT
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
PCR,
Sekuensing
KULIAH V
Bioteknologi Tanaman
Copyright Statement:
Dengan ini dinyatakan, bahwa seluruh material (teks, gambar, grafik dan seluruh alat bantu penjelas lainnya)
bahan kuliah dalam format .ppt sebagaimana tercantum disini memiliki hak eksklusif intelektual bagi penyusun.
Penggunaan diluar untuk keperluan pembelajaran sebagaimana disepakati dalam pemberian material harus mendapatkan izin tertulis dari penyusun dan pelanggaran dalam hal ini akan dikenakan sanksi hukum sebagaimana
berlaku di Negara Kesatuan Republik Indonesia.
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Bioteknologi Tanaman
PCR
(Polymerase Chain Reaction)
Reaksi Berantai Polymerase
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Bioteknologi Tanaman
PCR : Reaksi amplifikasi/penggandaan molekul DNA secara in-vitro dengan menggunakan bantuan enzim DNA-Polymerase
Prinsip Kerja Mesin PCR:
menyediakan kondisi reaksi optimal untuk terjadinya denaturasi ds-DNA, pengikatan primer (annealing), dan ekstensi primer
dengan menggunakan molekul dNTPs bebas melalui bantuan enzim DNA-Polymerase.
PCR
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Bioteknologi Tanaman
PCR
Ditemukan oleh: Kary Mullis pada tahun 1984-5 (USA)
Gambar: T-Gradient PCR produksi Biometra-Gmbh.-Jerman
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Bioteknologi Tanaman
Prasyarat:
1. DNA Template, DNA yang akan diamplifikasi
2. Primer (Oligonukleotida), (8-35 basa nukleotid) (spesifik, arbitrary).
3. Enzim Taq-Polymerase, untuk mensintesis (memperpanjang
rantai DNA dengan kecepatan 150 nukleotid/detik.
4. dNTPs (dCTP, dGTP, dTTP, dATP), baik yang mixed atau single
5. MgCl2
Taq-Polymerase ditemukan oleh: David Gelfant dan Susanne Stoffel
Diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus.
PCR
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Bioteknologi Tanaman
5‘
3‘
5‘
3‘
3‘
5‘
3‘
5‘
Siklus 1
Siklus 2
Siklus 3
Templet
Primer /
Oligonukleotid
PCR
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Bioteknologi Tanaman
PCR
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Bioteknologi Tanaman
Tm = ((G+C) x 4°C) + ((A + T) x 2°C).
Suhu Annealing
CATAAGTCTGATACTTGCTG
Contoh:
suhu annealing sekitar 54-58°C
PCR
dimana:
jumlah basa C = 4, G = 4, A = 5, T = 7,
maka besarnya Tm adalah:
Tm = ((4+4)x4) + ((5+7)x2) = 32 + 24 = 56°C
Test of designed specific primer Cg
Gradient PCR
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Bioteknologi Tanaman
Primer yang ideal :
1. Memiliki panjang sekitar 15-35 nukleotid2. Memiliki titik didih yang relatif tinggi3. Sekuens primer hanya hadir satu kali pada templet DNA4. Tidak berkomplementer dengan primer pasangannya5. Tidak membentuk struktur sekunder dengan primer pasangannya6. Memiliki proporsi GC dan AT yang seimbang7. Primer pasangannya memiliki titik didih yang relatif sama
PCR
Oligos V. 3.0
Universitas di Helsinki, Finlandia (Kalendar, 2002 )
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Bioteknologi Tanaman
X = 2n
Jumlah perbanyakan molekul DNA sintetis
PCR
Dimana:
X = Jumlah molekul yang dihasilkan setelah n siklus
n = Jumlah siklus yang digunakan
Contoh :
Jika n = 30, maka jumlah molekul yang dihasilkan adalah:
1.024.000.000
Sekuensing
Diperkenalkan pada tahun 70-an oleh Maxam dan Gilbert, kemudian disusul oleh Sanger
et al (Nobel, 80-an)
Teknik identifikasi urutan nukleotida-nukleotida dari susunan DNA
Teknik Maxam dan Gilbert disamping sangat
complicated juga banyak menggunakan bahan kimia
yang toxic, karena itu teknik dari Sanger dianggap lebih
efisien dan berkembang sampai saat ini
Prinsip Sekuensing Metode Sanger
• Menggunakan ddNTPs sebagai DNA chain terminator
• Komponen yang dibutuhkan: 1. single-stranded DNA template, 2. DNA primer, 3. DNA polymerase, 4. radioactively or fluorescently labeled nucleotides5. modified nucleotides that terminate DNA strand
elongation (ddNTPs)6. dNTPs
Chain termination method
Semi Automated Sekuensing5‘ TGCATTGAATATGACGTTGACTAGCTAACGTTTAACTA 3‘
3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘
TGCATTG+
5‘ TGCATTGAATATGACGTTGACTAGCTAACGTTTAACTA 3‘
3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘TGCATTG
+ Polymerase; dA, dC, dG, dT, ddT
3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘TGCATTGAAT
3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘TGCATTGAATAT
3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘TGCATTGAATAAGACGT
… dst …
3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘TGCATTGAATATGACGTTGACTAGCTAACGTTTAACT
Full Automated Sequencing(Dye-Terminator Sequencing)
Sumber: Charoen Phokphand
Perbandingan penampilan antara sekuensing manual dengan sekuensing automatis
Sumber: Charoen Phokphand
Tampilan Elektrophoregram dari sekuenser automatis
Contoh data sekuens dan elektrophoregram utk kontrol kualitas
A
B
Megabace1000 produced byAmersham &Molecular-Dynamic.
Automated Sequencer
• ABI Prism 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA).
• 4-Capillary Systems
Beckmann Coulter-Ge XP System
Sekuensing
Elektrophoregram hasil pembacaan Megabace yang diolah dengan software DNAstar. DNA template berasal beet gula
Sumber: Jamsari
Analisis Sekuens
Gen databank (Genbank), DNA databank
http:// www.ncbi. http:// www.embl-heidelberg.de.http:// www.ebi.ac.uk.http:// www.expasy.org.
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).BLASTn, BLASTp
SELESAI