Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội

Viện Công Nghệ Sinh Học- Công Nghệ Thực Phẩm

Tiểu luận kháng sinh

Gentamicin

SV : Nguyễn Trọng Hưng MSSV:20081289

Lớp : Kỹ Thuật Sinh Học- K53

A.Tổng quan

1. Đại cương

- Lịch sử : Gentamicin là chất kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid, lần đầu tiên được chiết tách năm 1963 trong môi trường nuôi cấy chủng xạ khuẩn Micromonospora purpurea, đến năm 1969 nó được công nhận sử dụng là một chất kháng sinh và là một trong những chất kháng sinh đầu tiên được sản xuất thương mại vì thời điểm đó, gentamicin gần như là chất kháng sinh duy nhất được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm trùng.

- Gentamicin có phổ diệt khuẩn mạnh và rộng kể cả trên tụ cầu khuẩn đặc biệt là trên vi khuẩn Gram (-), không có khả năng chống lại các vi khuẩn yếm khí, các nhóm Streptococus hemolyticus và Pneumococcus.

2. Cấu trúc và tính chất

- Gentamicin là một phức hợp sulfat chủ yếu của 3 chất có cấu trúc gần giống nhau tạm gọi là gentamicin C1, gentamicin C1a, gentamicin C2, ngoài ra còn có thêm một số các thành phần khác

- Gentamicin có màu trắng, không mùi, có tính hút ẩm, tan tốt trong các dung môi hữu cơ phân cực như methanol, ethanol và acetone.

- Gentamicin không hấp thụ qua đường tiêu hóa mà chủ yếu được đưa vào cơ thể bằng cách tiêm, hoặc truyền dịch.

- Trong cơ thể gentamincin không được chuyển hóa, nó có thời gian bán thải là 2-4 giờ qua đường nước tiểu.

3. Phương thức tác dụng

- Gentamicin tác động lên tiểu đơn vị 30S ribosome của vi khuẩn protein và 16S rRNA ngăn ngừa khả năng liên kết với RNA, khiến các mRNA đọc sai trình tự axit amin.

- Ức chế sự chuyển giữa các liên kết A và P của tRNA trong ribosome- Làm gián đoạn polysome, giảm hiệu quả quá trình tổng hợp protein dẫn tới việc gây rối

loạn quá trình sinh hóa của tế bào vi khuẩn.

B. Quy trình lên men sinh tổng hợp

1. Chủng giống

Gentamicin do một số chủng xạ khuẩn thuộc chi Micromonospora tạo ra. Trong thực tế chủng M. purpurea var. nigrecens và M. echinospora là những chủng quan trọng nhất được ứng dụng trong sản xuất lên men công nghiệp.

Chủng Micromonospora echinospora là chủng được phân lập từ Pisum sativummonospora trong họ Micromonosporaceae

M. purpurea var. nigrecens là chủng vi sinh vật hiếu khí có màu vàng nâu hoặc đỏ tùy vào điều kiện môi trường, phát triển tạo hệ sợi, do đó giống cần giữ trong điều kiện lạnh sâu tới -20o đến -30oC.

2. Quy trình lên men

Chủng giống mẫu → hoạt hóa giống → nhân cấp giống → lên men

Xét quy trình tối ưu hóa điều kiện lên men chủng Micromonospora echinospora

Giống được hoạt hóa trong điều kiện thích hợp trong 4 – 5 ngày rồi cho vào môi trường nhân giống đến khi đạt số lượng sinh khối theo yêu cầu. Lượng giống cho vào nồi lên men khoảng 10 – 15%, quá trình lên men chìm.

- Trong quá trình lên men M. echinospora, tùy vào từng nguồn cacbon được sử dụng khác nhau mà vsv sẽ tăng được khả năng sản sinh gentamicin. Tinh bột được coi là nguồn cacbon tốt nhất cho quá trình lên men vì vsv có khả năng phát triển mạnh đồng thời khả năng tạo gentamicin cũng đạt mức tối đa (328 mg/l), các nguồn cacbon khác như lactose, fructose thì tốt cho quá trình tăng trưởng của vsv nhưng khả năng tiết gentamicin kém hơn, trong khi các nguồn cacbon khác cho hiệu quả lên men kém hơn nhiều.

- Nguồn N : Soyabean meal và sodium glutamate là nguồn cung cấp nitơ tốt nhất, các nguồn nitơ vô cơ khác như (NH4)2SO4, NH4Cl, NH4NO3, (NH4)2HPO4 đề cho hiệu quả kém hơn nguồn nitơ có nguồn gốc hưu cơ casein, dịch chiết nấm men, v.v... Khi nồng độ soyabean meal trong khoảng 5 – 10% thì khả năng tạo gentamicin có thể lên tới 435 mg/l

- Nguồn P : nồng độ K2HPO4 cũng ảnh hưởng đến khả năng tạo gentamicin, ở mức 1,2 g/l thì gentamicin cho được tối đa 452 mg/l. Tuy nhiên nồng độ K2HPO4 tối ưu cho quá trình lên men là 1 g/l và chủng M. echinospora có mức tăng trưởng mạnh nhất, khi nồng độ K2HPO4 quá cao hoặc quá thấp thì vsv phát triển kém, thậm chí còn ức chế khả năng sinh tổng hợp gentamicin.

- Tối ưu hóa điều kiện môi trường : khi các thành phần trong môi trường lên men đạt yêu cầu người ta sẽ điều chỉnh pH ở mức 7,3 – 8 trong thời gian nuôi. Quá trình sinh tổng hợp gentamicin sẽ bắt đầu từ giai đoạn logarit trong thời gian 3 ngày của chu kỳ và đạt mức tối đa ở ngày thứ 6 của quá trình lên men, nồng độ gentamicin bắt đầu giảm từ ngày thứ 8 trở đi.

Kết luận : thành phần môi trường dinh dưỡng để vsv phát triển và sinh tổng hợp gentamicin tốt nhất là 0.75% tinh bột; 0.5%, soyabean meal; 0.12%, K2HPO4; 0.4%, CaCO3;

0.003%, FeSO4 và 0.0001%, CoCl2. Khả năng tổng hợp của chủng M. echinospora ( có thời gian nuôi cấy truyền khoảng 72 giờ)có thể đạt tới 410 mg/l cao hơn nhiều so với chủng gốc (190 mg/l)

Lên men : vsv sẽ được cho vào bình lên men với tỷ lệ thể tích 1,2 g/l (6% v/v) và nuôi trong môi trường dinh dưỡng thích hợp.

C. Tinh sạch và bảo quản1. Tinh sạch

Bước 1 : kết thúc quá trình lên men, dịch sẽ được hút ra khỏi thùng lên men, sau đó dịch sẽ được bổ xung axit H2SO4 4N đến khi pH đạt khoảng 2÷2,5 để giải phóng hoàn toàn dịch kháng sinh ra khỏi ty thể. Sau đó dịch lên men sẽ đi qua lọc khung bảng để loại bỏ tạp chất.

Bước 2 : trung hòa dịch lọc bằng NaOH 40% đến pH = 7. Tiếp tục lọc dịch loại hoàn toàn tủa, rồi cho dịch sau lọc đem đi chiết tách kháng sinh bằng nhựa trao đổi ion (thường sử dụng Amberlit IRC50 đã được hoạt hóa ở dạng R-COO -Na+). Rửa cột đã bão hòa bằng nước khử ion, rồi phản hấp phụ chất kháng sinh bằng dung dịch axit H2SO4 4N.

Bước 3 : dịch được điều chỉnh pH = 4,5 bằng trietylamin, rồi khử màu bằng than hoạt tính. Cuối cùng, dùng methanol tủa lấy sản phẩm thô với tỷ lệ dung dịch kháng sinh:methanol là 1:8,5. Lọc rủa tủa thô bằng dung dịch methanol và aceton, rồi sấy chân không (30 – 70 mmHg) ở 40oC, sản phẩm là gentamicin thô ở dạng muối sunfat.

2. Tinh chế và bảo quản

- Tinh chế : gentamicin sulfat thô được hòa tan vào nước cất rồi cho dịch chạy qua cột sắc ký trao đổi ion với nhựa cationit Amberlit CG50 dạng hoạt hóa NH4, phản hấp phụ bằng dung dịch NH4OH 0,3N. Lấy dịch lúc đậm đặc nhất rồi đem đi cô chân không, tiếp tục tẩy màu bằng than hoạt tính rồi tủa kháng sinh bằng methanol. Rửa tủa bằng aceton, ta thu được gentamicin dạng tinh sạch.

- Bảo quản : gentamicin được sấy chân không và đông khô ở nhiệt độ thấp rồi đóng gói.

Hiện nay, người ta còn sử dụng chất hữu cơ D2EHPA trong pha hữu cơ để có thể tinh sạch từ loại gentamicin C1, C1A, C2, C2A với tỉ lệ trong dịch lên men lần lượt là 31.92%, 24.2%, 20.43%, 23.45%.

Phương pháp này có ưu điểm là tính sạch được từng loại gentamicin với nồng độ tinh sạch cao, có thể lên tới gần 90%

D. Hoạt tính và tình hình sử dụng hiện nay

- Gentamicin sulfat là một chất kháng sinh phổ rộng, dễ dàng được hấp thụ bởi các tế bào sau khi được đưa vào trong cơ thể và có thể được sử dụng kết hợp với một số loại kháng sinh khác như penicillin để điều trị các bệnh liên cầu khuẩn, tuy nhiên không thể sử dụng bằng cách trộn lẫn.

- Thận trọng : gentamicin có tính độc, đặc biệt là ảnh hưởng đến thận và tai người dùng bởi gentamicin có thể làm suy giảm chức năng của thận, nếu nó tác động lên tại có thể dẫn tới giảm thính giác thậm chí gây điếc

- Liều lượng sử dụng : thuốc sẽ được tiêm vào bắp tay hoặc tĩnh mạch với liều lượng khoảng 3 mg/kg/ngày chia làm 2 lần với người lớn và 3 lần với trẻ em

- Tương tác : gentamicin có thể mất tác dụng in vitro bởi penicillin và cephalosporin khác nhau ro phản ứng với vòng beta lactam,nó cũng tương kị với furosemid, heparin và một số chất khác. Đặc biết gentamicin phản ứng với các chế phẩm kiềm và không ổn định ở pH axit.

- Ngày nay gentamicin không còn là chất kháng sinh tối ưu trong việc điều trị các bệnh truyền nhiễm nữa do các loại kháng sinh thế hệ mới có hoạt tính tương đương mà ít gây ra tác dụng phụ. Tuy vậy, trong một số trường hợp việc sử dụng gentamicin với liều lượng thích hợp theo hướng dẫn lại đem lại kết quả khả quan trong việc điều trị bệnh.

Tài liệu tham khảo

1. PGS.TS Từ Minh Koóng, Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, tập 2, NXB Y Học, 20072. Himabindu M & Annapurna Jetty, Indian Journal of Experimental Biology Vol. 44,

October 2006, pp. 842-848 ,Biochemical and Environmental Engineering Centre, Indian Institute of Chemical Technology, Hyderabad 500 007, India, Received 5 January 2006; revised 2 June 2006

3. DAVID P. SUNDIN, RUBEN SANDOVAL and BRUCE A. MOLITORIS, Gentamicin Inhibits Renal Protein and Phospholipid Metabolism in Rats: Implications Involving Intracellular Trafficking, 2000

4. PETER J. L. DANIELS, CHARLES LUCE, T. L. NAGABHUSHAN, Antibiotics and Antiinfectives Chemical Research Department

5. ROBERT S. JARET, DORIS SCHUMACHER, HANS REIMANN and JAN ILAVSKY, Chemical Process Research and Industrial Microbiology Departments, Schering Corporation, Bloomfield, N.J., 07003, U.S.A. (Received for publication November 5, 1974)

6. M.Rajasimman and S.Subathra, Optimization of Gentamicin Production: Comparison of ANN and RSM Techniques, World Academy of Science, Engineering and Technology 27 2009

7. Lorena C. Garcia, Eustoquio Martínez-Molina and Martha E. Trujillo, Micromonospora pisi sp. nov., isolated from root nodules of Pisum sativum

8. http://ebooks.unibuc.ro/biologie/RBL/lucr_4_cascaval%20bt.htm9. http://pathman.smpdb.ca/pathways/SMP00254/pathway