Kromatografi merupakan suatu pemisahan zat berkhasiat dan zat lain yang ada dalam bahan atau sediaan dengan jalan penyarian berfraksi, penyerapan, atau penukaran ion pada zat berpori, menggunakan cairan atau gas mengalir.Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan dengan menggunakan salah satu dari empat teknik kromatografi atau gabungan teknik tersebut. Keempat teknik kromatografi itu adalah : Kromatografi Kertas (KKt), Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Kromatografi Gas Cair (KGC) dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa ini membentuk lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan fasa lainnya merembes melewati dan melalui lapisan stasioner tersebut. Pemisahan secara kromatografi memanfaatkan sifat fisika umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat adalah kecenderungan molekul untuk larut dalam cairan (kelarutan), kecenderungan molekul untuk melekat dalam cairan (adsorpsi), dan kecenderungan molekul untuk menguap (keatsirian)Sampel yang digunakan dalam praktikum ini adalahdaun bunga terompet (Mandivella sanderi). Dalam fitokimia dilakukan suatu proses ekstraksi, isolasi dan identifikasi dari suatu komponen kimia dari tumbuhan dan biota laut yang banyak digunakan dalam pengobatan tradisional yang berkembang menjadi obat modern. Menggunakan cara yang bervariasi tergantung dari sifat fisika dan kimia komponen tersebut. Kemudian dilanjutkan dengan proses pemurnian dengan kristalisasi dengan tujuan mendapatkan senyawa kimia yang penampakannya bagus dan kelihatan lebih banyak. Metode fitokimia sangat penting artinya dalam bidang farmasi sebagai salah satu cara meneliti senyawa aktif yang terdapat dalam tumbuhan.Dalamkromatografi,eluentadalahfasagerakyangberperanpentingpadaproses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fasa diam(adsorbent). Interaksi antara adsorbent eluent sangat menentukan terjadinyapemisahan komponen. Oleh sebab itu pemisahankomponen secarakromatografidipengaruhiolehlajualir eluentdanjumlahumpan.Sebagian besar dasar teori kromatografi kolom juga dapat diterapkan pada KLT. Konsep lempeng teori lebih sukar digambarkan, tetapi pemisahan ini dilakukan oleh keseimbangan berturutan cuplikan dalam dua fasa, satu diantaranya bergerak terhadap yang lainnya. Terjadi proses penyebaran molekul cuplikan karena proses nonideal.Sifat kromofor dari struktur senyawa ini mudah dikenali di bawah lampu UV sehingga memudahkan identifikasi dalam kromatografi lapis tipis.Pada metode isolasi senyawa-karotendengan cara refluks yaitu tejadipenarikan komponen kimia yang dilakukan dengan cara sampel dimasukkan ke dalam labu alas bulat bersama-sama dengan zat pelarut(kloroform)lalu dipanaskandan diberikan batu didih agar pemanasan berlangsung secara merata.Uap-uap pelarut terkondensasi pada kondensor menjadi molekul-molekul pelarut yang akan turun kembali menuju labu alas bulat, dan akan akan menyari kembali sampel yang berada pada labu alas bulat. Demikian seterusnya berlangsung secara berkesinambungan sampai penyarian sempurna, setelah itufiltrat yang diperoleh dipekatkandengan cara evaporasi. Evaporasiyaitu proses pemisahan ekstrak dari cairan penyarinya dengan pemanasan yang dipercepat oleh putaran dari labu alas bulat. Dengan bantuan pompa vakum, uap larutan penyari akan menguap naik ke kondensor dan mengalami kondensasi menjadi molekul-molekul cairan pelarut murni yang ditampung dalam labu alas bulat.a.Kromatografi Kolom Konvensional (KKK)Pada metode ini, kolom diisikan dengan adsorben yang berupa padatandalam hal ini adalah silika gel yang dicampurkan dengan pelarut n heksan hingga membentuk bubur silika (slurry).Slurry dimasukkan dengan hati-hati kedalam kolom kromatografi yang telahdiisikan n-heksan yangsebelumnya telah disumbat dengan kapas dan kertas saring yang berfungsi sebagai penahan adsorben agar tidak keluar bersama eluen. Pengisian kolom harus dikerjakan secara seragam dan sepadat mungkin untuk menghindari terjadinya gelembung-gelembung udara. Jika terdapat gelembung-gelembung udara dalam kolom maka akan berpotensi menyebabkan pecahnya kolom.Prinsip dari kromatografi kolom jenis ini adalah kecenderungan komponen kimia untuk terdistribusi ke dalam fase diam atau fase gerak dengan proses elusi berdasarkan gaya gravitasi. Kolom kromatografi atau tabung untuk pengaloran karena gaya tarik bumi (gravitasi) atau system bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi dengan kran.Hal lain yang dapat dilakukan agar tidak terjadi pemecahan kolom adalah dengan menambahkan eluen secara kontinu agar udara tidak masuk kedalam kolom. Kolom yang padat diindikasikan dengan warna slurry yang semakin memutih dan kecepatan alir eluen yang semakin lambat. Jika kolom sudah memadat,larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom. Mekanisme yang terjadi pada kromatografi kolom ialah sample akan terelusioleh eluen (n-heksan) melalui fase diam silika gel. Senyawa organik terelusi oleh eluen proses elusi terjadi karena keseimbangan distribusi zat analit pada fase gerak n-heksan dan fase diam selika gel. Elusi terus berlangsung hingga tidak ada lagi yang tinggal dalam kolom. Proses elusi ini menghasilkan eluat yang diharapkan mengandung banyak betakaroten.Kelebihan kromatografi kolom :1. Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative2.Digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran3. Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansiKekurangan kromatografi kolom :1.Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual2.Metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama (time consuming)Berdasarkan hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa daun bunga terompet (Mandevillae folium) didapatlan hasil kromatografi kolom dengan jumlah fraksi 9 dan menggunakan 7 eluen berdasarkan tingkat kepolaran yang lebih tinggi yang selanjutnya akan diisolasi kembali dengan metode yang cocok. Pada sinar UV tidak menampakkan noda, hal tersebut dapat disebabkan adanya faktor kesalahanb.Kromatografi Cair VakumKromatografi Cair Vakum (KCV) merupakan salah satu metode fraksinasi yaitu dengan memisahkancrude extractmenjadi fraksi-fraksinya yang lebih sederhana. Pemisahan tersebut memanfaatkan kolom yang berisi fasa diam dan aliran fasa geraknya dibantu dengan pompa vakum. Fasa diam yang digunakan dapat berupa silika gel atau alumunium oksidaSetelah ekstrak dievaporasi kemudian dilanjutkan proses pemisahan dengan menggunakan metode kromatografi kolom.Adapun cara kerja kromatografi cair vakum yaitu kolom kromatografi dikemas kering dengan penjerap silika gel KL 254 dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah (n-heksana) dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom dipisah sampai kering dan sekarang siap dipakai. Sampel dilarutkan dalam pelarut yang cocok, dimasukkan langsung pada bagian atas kolom dan dihisap perlahan-lahan ke dalam kemasan dengan mengvakumkannya. Kolom, dielusi dengan campuran pelarut yang cocok, mulai dengan pelarut yang kepolarannya rendah (n-heksana) lalu kepolaran ditingkatkan perlahan-lahan dengan cara elusi gradien antara n-heksana:etil asetat:metanol, kolom dihisap sampai kering pada setiap pengumpulan fraksi.Pengaruh lebarnya kolom pada KVC mengakibatkan fraksi sampel turun satu persatu, dan bila pelarutnya telah habis maka harus dibuat pelarut dengan kosentrasi sama, dan diturunkan kembali fraksinya. Sedangkan panjang kolom, mengakibatkan semakin panjang kolom maka waktu atau cepat lambatnya turun fraksi senyawa.Adapun keuntungan dan kerugian dari kromatografi kolom adalahsebagai berikut :a.Keuntungan1.Konsumsi fase gerak KCV hanya 80% atau lebih kecil disbandingdengan kolom konvensional karena pada kolom mikroborkecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100l/menit)2.Adanya aliran fase gerak lebih lambat membuat kolom mikroborlebih ideal jika digabung dengan spectrometer massa.3.Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih pekatkarenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampelterbatas missal sampel klinisb.Kerugian KCV (Kromatografi Vakum Cair) :1.Membutuhkan waktu yang cukup lama2.Sampel yang dapat digunakan terbatasBerdasarkan hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa daun bunga terompet (Mandevillae folium) didapatkan hasil kromatografi kolom dengan jumlah fraksi 9 dan menggunakan 7 eluen. Berdasarkan hasil noda yang tampak ada 2 fraksi yang menampakkan noda pada fraksi 4, noda 1 : 4,1 cm memiliki nilai Rf = 0,745, noda 2 : 4,6 cm memiliki nilai Rf = 0,836, noda 3 : 5,1 cm memiliki nilai Rf = 0,927. Sedangkan pada fraksi 5, noda 1 : 4,8 cm memiliki nilai Rf = 0,872, dan pada noda 2 : 5,1 cm memiliki nilai Rf = 0,927. Senyawa tersebut selanjutnya akan diisolasi kembali dengan menggunakan metode pemisahan yang cocok, sepertiKromatografi Preparatif.C.Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP)Kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) adalah salah satu metode yang memerlukan pembiayaan paling murah dan memakai peralatan paling dasar. Walaupun KLTP dapat memisahkan bahan dalam jumlah gram, sebagian besar pemakainya hanya dalam jumlah miligram.KLTP bersama-sama dengan kromatografi kolom terbuka, masih dijumpai dalam sebagian besar publikasi mengenai isolasi bahan alam.Cuplikan pada KLTP dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada pelat KLTP. Pelarut yang baik adalah pelarut atsiri ( heksana, diklorometana, etil asetat), karena jika pelarut kurang atsiri akan terjadi pelebaran pita. Konsentrasi cuplikan harus sekitar 5% - 10%. Cuplikan ditotolkan berupa pita yang harus sesempit mungkin karena pemisahan tergantung pada lebar pita.KLTP klasik mempunyai beberapa kekurangan, kekurangan yang utama adalah pengambilan senyawa dari pelat yang dilanjutkan dengan pengekstrasian dari penjerap. Jika senyawa beracun harus dikerok dari pelat, dapat menimbulkan masalah yang serius (misalnya Adolf dkk. 1982). Kekurangan yang lainya ialah jangka waktu yang diperlukn untuk pemisahan dan adanya pencemar dan sisa dari pelat sendiri setelah pengekstrasian pita yang mengandung senyawa yang dipisahkan dengan pelarut (Szekely 1983).Untuk mengatasi beberapa masalah tersebut, beberapa pendekatan yang melibatkan kromatografi sentrifugal telah dicoba. Pada prinsipnya kromatografi sentrifugal adalah kromatografi klasik dengan aliran fase gerak yang dipercepat oleh gaya sentrifugal.Adapun keuntungan dan kerugiaan KLTP yaitu :keuntungan :Salah satu pemisahan yang memerlukan pembiayaan paling murah danmemakai peralatan paling dasar adalah kromatografi lapis tipis preparatif.Kerugian:Ketebalan dari lempeng menyebabkan waktu yang dibutuhkan menjadilebih lama dibadingkan dengan KLTpada umumnya.Setelah fraksi senyawa didapatkan, selanjutnya dengan menggunakan KLT kita menghitung Rf(retention fraksion), dimana bila didapat senyawa yang Rfnya sama atau pola nodanya sama, maka kemungkinan senyawa itu adalah sama. Dan terakhir, kita uji fitokimia dari senyawa tersebut (ekstraks n- heksana kulit batang nangka). Namun langkah ini tidak dapat dilakukan karena waktu yang tidak mengizinkan lagi.Adapun mekanisme dan prinsip penampakan noda pada pegujian Kromatigrafi yaitu:a. Pada UV 254 nm Pada UV 254 nm, lempeng akan berflouresensi sedangkan sampel akan tampak berwarna gelap.Penampakan noda pada lampu UV 254 nm adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan indikator fluoresensi yang terdapat pada lempeng. Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energi.

b. Pada UV 366 nmPada UV 366 nm noda akan berflouresensi dan lempeng akan berwarna gelap. Penampakan noda pada lampu UV 366 nm adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan gugus kromofor yang terikat oleh auksokrom yang ada pada noda tersebut. Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energi. Sehingga noda yang tampak pada lampu UV 366 terlihat terang karena silika gel yang digunakan tidak berfluororesensi pada sinar UV 366 nm.c.Penyemprotan denganDPPHSalah satu metode yang digunakan untuk pengujian aktivitas antioksidan adalah metode DPPH. Metode DPPH didasarkan pada kemampuan antioksidan untuk menghambat radikal bebas dengan mendonorkanatom hidrogen. Perubahan warna ungu DPPH menjadi ungu kemerahan dimanfaatkan untuk mengetahui aktivitas senyawa antioksidan.Metode ini menggunakankontrol positifsebagai pembanding untuk mengetahui aktivitas antioksidan sampel.

Noda-noda yang diperoleh biasanya berekor disebabkan karena :1.Penotolan yang berulang-ulang dan letaknya tidak tepat2.Kandungan senyawa yang terlalu asam atau basa3.Lempeng yang tidak rata

BAB VPENUTUPV.1 KesimpulanA. Kromatografi Kolom KonvensionalBerdasarkan hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa daun bunga terompet (Mandevillae folium) didapatlan hasil kromatografi kolom dengan jumlah fraksi 9 dan menggunakan 7 eluen berdasarkan tingkat kepolaran yang lebih tinggi yang selanjutnya akan diisolasi kembali dengan metode yang cocok. Pada sinar UV tidak menampakkan noda, hal tersebut dapat disebabkan adanya faktor kesalahan.B.Kromatografi Cair Vakum (KCV)Berdasarkan hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa daun bunga terompet (Mandevillae folium) didapatkan hasil kromatografi kolom dengan jumlah fraksi 9 dan menggunakan 7 eluen. Berdasarkan hasil noda yang tampak terdapat 2 fraksi yang menampakkan noda yaitu pada fraksi 4 dan fraksi 5 .Pada Fraksi 4, noda 1 memiliki nilai Rf = 0,745, noda 2 memiliki nilai Rf = 0,836, dannoda 3 memiliki nilai Rf = 0,927. Sedangkan pada fraksi 5, noda 1 memiliki nilai Rf = 0,872, dan pada noda 2 memiliki nilai Rf = 0,927. Senyawa tersebut selanjutnya akan diisolasi kembali dengan menggunakan metode pemisahan yang cocok, sepertiKromatografi Preparatif.

V.2 SaranDiharapkankebersihan dan bahan lebih dilengkapi dilaboratorium agar praktikum lebih lancar.