konstruksi dan analisis kualitas pustaka genom … · belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada...
TRANSCRIPT
KONSTRUKSI DAN ANALISIS KUALITAS PUSTAKA
GENOM JAGUNG (Zea mays (L.)) UNTUK
SEKUENSING GENOM TOTAL
SYAHDAN SAYIDAH ULFAH
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Konstruksi dan
Analisis Kualitas Pustaka Genom Jagung (Zea mays (L.)) untuk Sekuensing
Genom Total adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Oktober 2014
Syahdan Sayidah Ulfah
NIM G84100059
2
ABSTRAK
SYAHDAN SAYIDAH ULFAH. Konstruksi dan Analisis Kualitas Pustaka
Genom Jagung (Zea mays (L.)) untuk Sekuensing Genom Total. Dibimbing oleh I
MADE ARTIKA dan I MADE TASMA.
Sekuensing genom total dan analisis genom jagung merupakan salah satu
cara untuk mempercepat peningkatan pemuliaan jagung serta untuk meningkatkan
pemahaman mengenai informasi genetik dan genomik jagung. Tujuan penelitian
ini adalah mengkonstruksi pustaka genom dari empat genotipe jagung di
Indonesia (Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50
(pulut)) dan menganalisis kualitas pustaka genom hasil sekuensing genom total.
Konstruksi pustaka genom dilakukan secara in vitro dengan menempelkan adapter
pada ujung fragmen DNA. Pustaka genom selanjutnya diklasterisasi dan
disekuensing menggunakan CBOT claster generation dan Next Generation
Sequencing HiSeq2000. Jumlah basa yang dihasilkan selama proses sekuensing
yaitu sebanyak 287.1 Gbp. Klaster pustaka genom yang dihasilkan dengan nilai Q
scores di atas 30 berkisar antara 80.8 – 87.9%. Tingkat kesalahan pembacaan basa
selama proses sekuensing berkisar antara 0.32 – 0.51%. Secara keseluruhan hasil
sekuensing menunjukkan bahwa kualitas klaster pustaka genom termasuk kategori
ideal.
Kata kunci: jagung, pustaka genom, sekuensing genom total, Next Generation
Sequencing
ABSTRACT
SYAHDAN SAYIDAH ULFAH. Construction and Quality Analysis of Maize
(Zea mays (L.)) Genomic Library for Whole Genome Sequencing. Supervised by I
MADE ARTIKA and I MADE TASMA.
Whole genome sequencing and analysis of the maize genome is one of the
ways to accelerate the increase in corn breeding and to improve the understanding
of the genetic and genomic information maize. The purpose of this study is to
construct genomic libraries of four maize genotypes in Indonesia (Sp010BB-3-2-
2-1-B, LK2-45, PSG59-8 (early maturing) and LBP54-50 (pulut)) and analyze the
quality of the results of genomic libraries total genome sequencing. Genomic
library construction performed in vitro by attaching adapters to the ends of DNA
fragments. Clasterization and sequencing of genomic library in this research were
conducted by using cBOT claster generation and Next Generation Sequencing
HiSeq2000. The amount of base produced during the sequencing process as many
as 287.1 Gbp. Cluster genomic library generated with Q values above 30 scores
ranged from 80.8 – 87.9%. Base reading error rate during the sequencing process
was 0.32 – 0.51%. Over all sequencing results showed that quality of the genomic
library cluster was belong to the ideal category. Keywords: Maize (Zea mays (L.)), Genomic Library, Whole Genome Sequencing,
Next Generation Sequencing (NGS).
3
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
KONSTRUKSI DAN ANALISIS KUALITAS PUSTAKA
GENOM JAGUNG (Zea mays (L.)) UNTUK
SEKUENSING GENOM TOTAL
SYAHDAN SAYIDAH ULFAH
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
5
Judul Skripsi : Konstruksi dan Analisis Kualitas Pustaka Genom Jagung (Zea
mays (L.)) untuk Sekuensing Genom Total
Nama : Syahdan Sayidah Ulfah
NIM : G84100059
Disetujui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Pembimbing I
Dr Ir I Made Tasma, MSc
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
6
PRAKATA
Puji dan syukur kehadirat Allah SWT atas rahmat dan karunia-Nya
sehingga penelitian yang berjudul Konstruksi dan Analisis Kualitas Pustaka
Genom Jagung (Zea mays (L.)) untuk Sekuensing Genom Total ini dapat
diselesaikan dengan baik. Penelitian ini dilaksanakan selama enam bulan sejak
bulan Desember 2013 sampai Mei 2014, bertempat di Laboratorium Biologi
Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber
Daya Genetik Pertanian (BB Biogen), Cimanggu, Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada kedua pembimbing penelitian
yaitu Dr Ir I Made Artika MAppSc dan Dr Ir I Made Tasma MSc yang telah
memberikan saran serta kritik yang membangun demi kelancaran penelitian ini.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Ida Rosdianti MSi, Habib Rizjaani
MSi, Titin MSi, Fajar MSi serta Ihsan Mentaya SSi yang bersedia mendampingi
selama kegiatan penelitian serta memberikan masukan. Ucapan terima kasih juga
penulis sampaikan kepada kedua orang tua yang senantiasa memberikan motivasi
serta saran yang baik sehingga usulan penelitian ini dapat terselesaikan dengan
baik. Rekan-rekan terutama Yuliana dan Asep yang telah menjadi partner yang
baik selama kegiatan penelitian berlangsung serta Biokimia 47 yang telah
membantu serta memberikan motivasi, penulis juga mengucapkan terima kasih.
Penulis menyadari bahwa tulisan ini masih banyak kekurangan. Oleh
karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun untuk
memperbaiki tulisan ini. Atas kritik dan saran yang diberikan, penulis ucapkan
terima kasih. Semoga tulisan ini bermanfaat dalam bidang ilmu pengetahuan
khususnya biokimia.
Bogor, Oktober 2014
Syahdan Sayidah Ulfah
7
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL xi
DAFTAR GAMBAR xi
DAFTAR LAMPIRAN xi
PENDAHULUAN 1
METODE 2
Bahan 2
Alat 3
Prosedur Penelitian 3
HASIL 8
Isolasi DNA Genom Jagung secara Kualitatif 8
Isolasi DNA Genom Jagung secara Kuantitatif 8
Konsentrasi DNA double stranded untuk Pustaka Genom Jagung 9
Kuantitas Hasil Fragmentasi DNA Genom Jagung 10
Kuantitas Hasil Modifikasi Ujung Fragmen DNA Genom Jagung (End
Repair) 10
Kuantitas Hasil Ligasi Adapter DNA Genom Jagung 10
Kualitas Pustaka Genom Jagung 11
Sekuensing Pustaka Genom Jagung 12
PEMBAHASAN 16
Isolasi DNA Genom Jagung 16
Isolasi DNA Genom Jagung secara Kualitatif 16
Isolasi DNA Genom Jagung secara Kuantitatif 17
Konsentrasi DNA double stranded untuk Pustaka Genom Jagung 18
Kuantitas Hasil Fragmentasi DNA Genom Jagung 18
Kuantitas Hasil Modifikasi Ujung Fragmen DNA Genom Jagung (End
Repair) 19
Kuantitas Hasil Adenilasi Ujung 3’OH dan Ligasi Adapter DNA Genom
Jagung 20
Kualitas Pustaka Genom Jagung 21
Kuantitas Pustaka Genom Jagung 21
Klasterisasi dan Hasil Sekuensing Genom Total DNA Jagung 22
Jumlah Basa dan Kualitas Klaster Pustaka Genom Secara Umum 22
8
Densitas dan Kualitas Pustaka Genom pada Setiap Lajur dalam Flow Cell 23
Tingkat Kesalahan (error rate) dan Intensitas Basa Hasil Sekuensing 24
SIMPULAN DAN SARAN 24
Simpulan 24
Saran 25
DAFTAR PUSTAKA 25
LAMPIRAN 28
RIWAYAT HIDUP 36
9
DAFTAR TABEL
1 Kuantitas dan rasio kemurnian DNA genom total jagung menggunakan
spektrofotometer nanodrop thermoscientific 9
2 Kuantitas double stranded DNA genom total jagung menggunakan Qubit
2.0 fluorometer 9
3 Volume DNA genom jagung yang digunakan untuk uji pustaka genomik 9
4 Kuantitas dan rasio kemurnian DNA genom jagung hasil fragmentasi 10
5 Kuantitas dan rasio kemurnian fragmen DNA setelah tahapan modifikasi
ujung fragmen DNA pada preparasi konstruksi pustaka genom jagung 10
6 Kuantitas dan rasio kemurnian DNA cetakan setelah tahapan ligasi
adapter 11
7 Ukuran fragmen dan konsentrasi DNA hasil pustaka genom untuk
sekuensing 11
8 Jumlah basa dan kualitas klaster pustaka genom hasil sekuensing secara
umum 12
9 Densitas dan kualitas pustaka genom hasil sekuensing 13
10 Tingkat kesalahan (error rate) dan intensitas basa hasil sekuensing 16
DAFTAR GAMBAR
1 Elektroforegram DNA genom total jagung 8 2 Elektroforegram hasil pustaka genom jagung menggunakan agilent
bioanalyzer genotipe LK2-45 dan PSG59-8 (genjah) 11 3 Elektroforegram hasil pustaka genom yang sudah di qPCR genotipe
Sp010BB-3-2-2-1-B dan LBP54-50 (pulut) 12
4 Histrogram jumlah klaster genotipe Sp010BB-3-2-2-1 berdasarkan kualitas
sekuen yang dihasilkan 13 5 Histogram jumlah klaster genotipe LK2-45 berdasarkan kualitas sekuen
yang dihasilkan 13 6 Histogram jumlah klaster genotipe PSG59-8 (genjah) berdasarkan kualitas
sekuen yang dihasilkan 14 7 Histogram jumlah klaster genotipe LBP54-50 (pulut) berdasarkan kualitas
sekuen yang dihasilkan 14 8 Intensitas banyaknya larutan sekuensing yang tersisa selama proses
sekuensing berlangsung 14
9 Presentase basa-basa nitrogen selama proses sekuensing 15
DAFTAR LAMPIRAN
1 Strategi penelitian 28
2 Hasil analisis pustaka genom secara kuantitatif dengan qPCR 29
3 Tahapan klasterisasi pustaka genom (Illumina 2011) 31
4 Flow cell Illumina HiSeq2000 (Swiss Federal Institute of Technology
Zurich 2012) 32
5 Regenerasi Next Generation Sequencing HiSeq2000 33
10
6 Prinsip sekuensing menggunakan Next Generation Sequencing
HiSeq2000 34
7 Grafik jumlah densitas klaster setiap lajur 35
1
PENDAHULUAN
Jagung (Zea mays L.) merupakan salah satu tanaman serealia penting yang
tumbuh hampir di seluruh dunia dan digunakan sebagai bahan makanan. Di negara
maju, jagung banyak digunakan untuk pati sebagai bahan pemanis, sirup dan
produk fermentasi, termasuk alkohol. Jagung banyak digunakan untuk bahan baku
pakan di Amerika (Prasanna et al. 2001). Jagung dibutuhkan masyarakat
Indonesia dalam jumlah besar dan terus meningkat, namun tidak diikuti oleh
peningkatan produksi, sehingga terjadi kekurangan sekitar 1,3 juta ton setiap
tahun dan harus dipenuhi melalui import. Menutupi ketersediaan jagung perlu
diupayakan melalui peningkatan produksi. Perakitan varietas unggul baru, berdaya
hasil dan berkualitas tinggi merupakan salah satu upaya untuk mendorong
peningkatan produksi (Azrai 2004).
Produksi tanaman pangan jagung disajikan dalam Berita Resmi Statistik
(BRS) terdiri dari luas panen, produktivitas dan angka produksi jagung. Produksi
jagung pada tahun 2012 mengalami peningkatan sebesar 1,74 juta ton
dibandingkan tahun 2011. Produksi jagung pada tahun 2013 mengalami
penurunan sebesar 0,55 juta ton dibandingkan tahun 2012. Penurunan produksi
diperkirakan terjadi karena penurunan luas panen seluas 66,62 ribu hektar dan
penurunan produktivitas sebesar 0,57 kuintal/hektar (BPS 2013).
Ciri penting ketahanan genetik tanaman jagung terhadap suatu hama atau
penyakit adalah kestabilannya dalam berproduksi, baik pada saat ada hama atau
penyakit maupun pada saat tidak ada hama atau penyakit. Ketahanan genetik
harus dapat memberikan perlindungan yang baik dan menyeluruh dari
kemungkinan kerusakan yang dapat disebabkan oleh suatu penyakit. Penyakit
yang paling banyak menimbulkan kerusakan tanaman jagung di Indonesia adalah
penyakit bulai yang disebabkan oleh strain Peronosclerospora maydis. Penyakit
bulai menyerang di Indonesia secara khusus dan di Asia pada umumnya karena
kondisinya yang tropis (Yen et al. 2004).
Berbagai usaha telah dilakukan untuk meningkatkan produktivitas jagung.
Salah satu cara untuk meningkatkan produktivitas jagung nasional adalah dengan
perbaikan genetik tanaman. Perbaikan genetik tanaman dipengaruhi oleh isolasi
dan karakterisasi gen. Tahapan tersebut dapat dilakukan dengan memanfaatkan
informasi genomik dan genetik jagung yang diperoleh melalui sekuensing genom
total. Produksi pangan pada masa mendatang akan lebih banyak bergantung pada
penerapan teknologi daripada peningkatan luas lahan pertanian.
Sekuensing genom total (whole genome sequencing) merupakan proses
penentuan urutan genom suatu organisme yang dilakukan dalam satu waktu.
Sekuensing genom total digunakan untuk mengetahui informasi genomik dan
genetik suatu organisme secara menyeluruh. Instrumen NGS yang digunakan
dalam penelitian ini yaitu HiSeq 2000 yang dikembangkan oleh Illumina Metode
yang digunakan pada HiSeq 2000 sama seperti pada instrumen NGS yang lainnya
yaitu dengan menggunakan metode sequencing by synthesis. HiSeq 2000
mempunyai kemampuan mengurutkan lebih dari lima genom manusia dalam 30
kali cakupan secara bersamaan, serta mengurutkan lebih dari 192 ekspresi gen.
Instrumen ini menghasilkan 540-600 Gb dengan panjang fragmen 2 x 100 bp
selama 11 hari. Secara umum, terdapat empat tahapan yang dilakukan dalam
sekuensing DNA menggunakan HiSeq 2000 adalah preparasi sampel pustaka
2
DNA, klasterisasi cetakan DNA, sekuensing dan analisis data sekuens (Illumina
2010).
Sekuensing genom total jagung diawali dengan mengkonstruksi pustaka
genom kentang menggunakan Low Throughput Protocol dari illumina dan
disekuensing menggunakan NGS Illumina Hiseq 2000. Konstruksi pustaka ini
relatif sangat mudah dan singkat karena tidak membutuhkan vektor untuk
menyisipkan fragmen DNA dan juga tidak membutuhkan ruangan khusus untuk
penyimpanan serta tidak membutuhkan DNA dalam jumlah banyak, namun DNA
yang digunakan merupakan DNA double stranded (dsDNA) dengan konsentrasi
rendah (20 ng/uL). Metode konstruksi yang digunakan memiliki prinsip yang
sama dengan konstruksi genom menggunakan metode shotgun sequencing yaitu
fragmen DNA yang dihasilkan dari pemotongan DNA genom tidak disisipkan
dalam suatu vektor pada sel inang, namun tahapan setelah fragmentasi DNA
berbeda. Metode shotgun sequencing, DNA yang telah difragmentasi tidak
dilakukan ligasi adapter tetapi langsung dilakukan sekuensing. Fragmen DNA
yang dihasilkan sebelum disekuens, dipreparasi dengan menempelkan adapter
pada ujung fragmen DNA. adapter tersebut pada tahapan selanjutnya (klasterisasi)
akan menempel pada flow cell untuk amplifikasi fragmen DNA melalui metode
bridge amplification (Mardis 2008, Metzker 2010, Commins et al. 2011).
Penelitian ini bertujuan mengkontruksi dan menganalisis kualitas pustaka
genom tanaman jagung empat genotipe yaitu Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45,
PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut) yang pada tahapan selanjutnya dapat
digunakan untuk pemetaan genom jagung melalui sekuensing dengan
menggunakan NGS (Next Generation Sequencing) HiSeq 2000. Hipotesis
penelitian ini adalah dapat mengkonstruksi pustaka genom jagung empat genotipe
yaitu Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut),
kemudian disekuensing menggunakan NGS (Next Generation Sequencing) HiSeq
2000. Manfaat yang diperoleh dari penelitian ini yaitu diperoleh informasi genetika
dan studi tentang keseluruhan genom jagung. Manfaat lain yaitu urutan DNA yang
dihasilkan diharapkan mampu untuk pemetaan gen secara fisik pada tahapan
selanjutnya.
METODE
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA adalah daun jagung empat
genotipe (Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50
(pulut)), es batu, etanol teknis, nitrogen cair, bufer ekstraksi CTAB (Cetil Trimetil
Amonium Bromida), NaOAc (natrium asetat), Chisam (kloroform : isoamil
alkohol dengan perbandingan 24 : 1), isopropanol, bufer TE, etanol absolut dan
etanol 70%, 0.2 % beta merkaptoetanol dan natrium bisulfit. Bahan-bahan yang
digunakan untuk elektroforesis adalah serbuk agarosa, 1 x TAE, SyBr Gold,
loading dye dan DNA ladder. Bahan-bahan yang digunakan untuk fragmentasi
adalah isolat DNA dan resuspension buffer. Bahan-bahan yang digunakan untuk
modifikasi ujung fragmen DNA adalah end repair control, end repair mix, Sample
Purification Beads, etanol 80 % dan resuspension buffer. Bahan-bahan yang
3
digunakan untuk adenilasi ujung 3’ DNA adalah A-tailing control dan A-tailing
mix. Bahan-bahan yang digunakan untuk penempelan adapter adalah ligase
control, DNA ligase mix, DNA adapter index, stop ligase mix, Sample Purification
Beads, etanol 80 %, dan resuspension buffer. Bahan-bahan yang digunakan untuk
uji kualitas pustaka genom dengan agilent 2100 bioanalyzer adalah sampel DNA
yang sudah dipustaka, dye mix dan ladder. Bahan-bahan yang digunakan untuk uji
kualitas pustaka genom menggunakan qPCR adalah sampel yang sudah dipustaka,
buffer qPCR, reagen qPCR dan larutan standar. Bahan-bahan yang digunakan
untuk klasterisasi dan sekuensing genom jagung adalah 2 N NaOH, buffer
hibridisasi, Tris-Cl, buffer library, TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS, Truseq SBS
Kit-HS (200 cycle).
Alat
Alat-alat yang digunakan meliputi mortar, tabung 15 mL, tabung 2 mL,
tabung 1.5 mL, penangas air, inkubator thermostat, sentrifus 5810X, thermolyne
vortex mixer maxi II, mikropipet, tip pipet, nanodrop thermoscientific 2000c, qubit
2.0 fluorometer, tabung covaris AFA Fiber Snap Cap 6x16mm, Covaris M220,
microwave panasonic, microfuge, kotak es, sarung tangan karet, termos, neraca
analitik, cetakan gel, sisir, alat pengering, thermal cycler biometra T1, sudip, gelas
piala, parafilm, power supply, perangkat elektroforesis, kolom elusi gel minElute
Spin, UV Transilluminator DigiDoc-It Imaging System, magnetic stand, mesin
pendingin tropicalized Sansio, cBot Cluster Generation, Agilent 2100
Bioanalyzer, qPCR, High Sensitivity DNA Chip dan Illumina Hiseq 2000.
Prosedur Penelitian
Isolasi DNA Doyle & Doyle (1987) yang dimodifikasi
Daun jagung ditimbang 100 mg tanpa tulang daun lalu diletakkan dalam
mortar pestel dan ditambah nitrogen cair dan digerus sampai halus sempurna,
kemudian dimasukan ke dalam Eppendorf 2 ml. Ditambahkan 0,5 ml bufer
ekstraksi CTAB (CTAB: 2%, 1 M Tris-HCl pH 8, 0.5 M EDTA pH 8, NaCl 5 M,
akuades, 0,20% ß-mercaptoetanol dan natrium disulfit. Lima belas menit sebelum
proses ekstraksi, bufer dipanaskan dalam waterbath dengan suhu 65°C, lalu
contoh daun yang telah ditambah bufer ekstraksi CTAB.
Proses lisis dinding sel dilakukan dengan menginkubasi tabung berisi
contoh ke dalam waterbath suhu 65°C selama 60 menit atau sampai fase padat
terpisah dari fase cair. Selanjutnya, tabung diangkat dari waterbath dan dibiarkan
beberapa menit sampai suhu contoh menurun. Tabung berisi contoh yang telah
diinkubasi lalu ditambah khloroform: isoamil-alkohol (CIA 24:1) 500 μl. Tabung
lalu dikocok menggunakan vortex mixer sampai contoh dann CIA 24:1 tercampur,
kemudian disentrifus pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Bagian atas
contoh yang berupa cairan jernih (supernatan) dipindahkan 500 μl ke dalam
tabung baru.
Supernatan yang sudah bersih dipindahkan ke tabung baru, kemudian
ditambah 500 μl isopropanol dingin. Selanjutnya tabung dibolak-balik secara hati-
hati untuk melarutkan supernatan dan isopropanol. Tabung contoh lalu disimpan
pada suhu -20°C selama semalam dan tidak boleh kena guncangan. Kemudian
tabung dibolak-balik perlahan dan disentrifus pada kecepatan 12.000 rpm selama
4
10 menit. Fase cair dibuang secara perlahan, sedangkan pelet yang tertinggal di
dalam Eppendorf dicuci dengan 500 μl etanol absolut, kemudian dilarutkan
dengan cara membolak-balik tabung secara perlahan-lahan. Larutan kemudian
disentrifus pada kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit. Fase cair dibuang secara
perlahan, sedangkan pelet dicuci lagi dengan 200 μl etanol 70% dingin,
selanjutnya dilarutkan dengan cara membolak-balik tabung secara perlahan-lahan.
Larutan kemudian disentrifus pada kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit. DNA
dikeringkan di udara selama semalam.
Setelah cukup kering, pelet DNA dilarutkan dengan menambahkan 100 μl
bufer TE (1M Tris-HCl pH 8,0, 12,11 g Trisma Base, 0,50 M EDTA pH 8,0,
18,61 g disodium etilen diamin tetra asetat 2H2O). Larutan DNA diinkubasi 65oC
selama 15 menit. Larutan kemudian ditambahkan 2 μl RNAse pada dinding
Eppendorf dan di-spin down dan diinkubasi lagi pada suhu 37oC selama 30 menit.
Jika tidak langsung digunakan, DNA disimpan pada suhu -20°C. Penyimpanan
pada suhu -20°C ini dilakukan agar DNA tidak rusak dan dalam kualitas yang
baik.
Analisis Kualitas dan Kuantitas Isolasi DNA
Analisis kualitatif isolasi DNA (Sambrook & Russel 2001 yang
dimodifikasi). Uji ini menggunakan metode elektroforesis gel agarosa. Sampel
DNA diambil sebanyak 3 μL dan dielektroforesis dengan konsentrasi 1 % selama
30 menit pada kuat arus 100 V ke dalam bak elektroforesis yang berisi TAE 1x.
Selanjutnya dibuat loading buffer dengan campuran loading dye 6x, SyBr Gold
100x dan molecular water. Setelah itu marker dibuat dengan campuran DNA
ladder 100 bp plus dan SyBr Gold 100x. Loading buffer dan marker ini divorteks.
Kemudian diinjeksikan ke dalam sumur elektroforesis beserta sampel yang telah
diisolasi.
Analisis kuantitatif isolasi DNA (Invitrogen 2010). Uji kuantitatif ini
menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific dan Qubit 2.0
fluorometer. Metode menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific
sebanyak 1 μL sampel diambil dan dianalisis. Metode menggunakan fluorometer,
sebanyak 200 μL buffer Qubit disiapkan masing-masing untuk dua larutan standar
dan larutan yang berisi sampel. Sebanyak 190 μL working solution ditambahkan
10 μL larutan standar 0 ng, kemudian untuk larutan standar 2 sebanyak 190 μL
working solution ditambahkan 10 μL larutan standar 10 ng. Sebanyak 198 μL
working solution ditambahkan 2 μL sampel. Kemudian semua larutan divortex
selama 3 detik dan diinkubasi selama 2 menit. Larutan standar 1 dan standar 2
serta sampel dibaca pada alat fluorometer.
Konstruksi Pustaka Genom (TruSeq DNA low throughput protocol 2010)
Fragmentasi DNA. Fragmentasi DNA dilakukan dengan menggunakan
metode sonikasi DNA. DNA yang sudah dilarutkan dengan Resuspension Buffer
sampai 55 μL diletakkan dalam tabung covaris sebanyak 52.5 μL. Kemudian
difragmentasi menggunakan alat covaris. Sebanyak 50 μL sampel yang telah
difragmentasi, dipindahkan ke dalam tabung PCR 0.3 ml. Kemudian sebanyak 80
μL Sample Purification Beads yang telah divortex, ditambahkan ke dalam sampel
tersebut dan diaduk dengan pipet mikro sebanyak 10 kali. Sampel tersebut
diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit dan diinkubasi pada magnetic stand
5
selama 8 menit. Sampel tetap berada pada magnetic stand, kemudian buang 125
μL supernatan tanpa menggangu beads. Kemudian pencucian pelet dilakukan
secara duplo, sebanyak 200 μL etanol 80% ditambahkan dan diinkubasi selama 30
detik, selanjutnya, etanol 80% dibuang. Pelet kemudian dikeringkan selama 5
menit pada suhu ruang dan dipindahkan dari magnetic stand. Setelah itu,
tambahkan 52.5 μL Resuspension Buffer dan tabung PCR diangkat dari magnetic
stand. Sampel diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit dan diinkubasi pada
magnetic stand selama 5 menit. Supernatan dipindahkan sebanyak 50 μL ke dalam
tabung PCR 0.3 ml yang baru.
Modifikasi Ujung Fragmen DNA. Sebanyak 10 μL End repair control
dan 40 μL End Repair Mix ditambahkan dalam tabung hasil fragmentasi. Sampel
dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10
kali. Tabung yang berisi sampel ditutup dan diinkubasi dalam thermal cycler
selama 30 menit pada suhu 30oC. Kemudian tabung diangkat dari thermal cycler.
Diluted beads mixture dibuat terlebih dahulu dengan komposisi 109.25 μL sample
purification buffer dan 74.75 μL nuclease free water untuk 1 sampel. Sebanyak
160 μL diluted beads mixture yang telah divortex ditambahkan ke dalam sampel,
kemudian diaduk dengan pipet mikro sebanyak 10 kali. Sampel tersebut
diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit dan diinkubasi pada magnetic stand
selama 5 menit. Sampel tetap berada pada magnetic stand, kemudian transfer 125
μL supernatan tanpa menggangu beads dan lakukan sebanyak 2 kali. Kemudian
30 μL sample purification beads yang telah divortex selama 1 menit ditambahkan
ke dalam sampel. Setelah itu diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit dan
diinkubasi pada magnetic stand selama 5 menit. Supernatan dibuang sebanyak
276 μL. Pencucian pelet dilakukan secara duplo, sebanyak 200 μL etanol 80%
ditambahkan dan diinkubasi selama 30 detik, selanjutnya etanol 80% dibuang.
Pelet kemudian dikeringkan selama 5 menit pada suhu ruang dan dipindahkan dari
magnetic stand. Kemudian tambahkan 17.5 μL Resuspension Buffer dan tabung
PCR diangkat dari magnetic stand. Sampel diinkubasi pada suhu ruang selama 2
menit dan diinkubasi pada magnetic stand selama 5 menit. Supernatan
dipindahkan sebanyak 15 μL ke dalam tabung PCR 0.3 ml yang baru.
Adenilasi Ujung 3’ DNA. A-tailing control 2.5 μL dan A-tailing mix 12.5
μL ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sampel. Sampel dicampurkan
menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Tabung
yang berisi sampel ditutup dan diinkubasi dalam thermal cycler selama 30 menit
pada suhu 37oC, 70
oC selama 5 menit dan 4
oC selama 5 menit.
Penempelan Adapter. Ligase control 2.5 μL, DNA Ligase Mix 2 2.5 μL
dan DNA Adapter Index 2.5 μL ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sampel.
Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan
sebanyak 10 kali. Tabung yang berisi sampel ditutup dan diinkubasi dalam
thermal cycler selama 10 menit pada suhu 30oC. Sebanyak 5 μL Stop Ligase Mix
ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sampel. Kemudian,sampel dicampurkan
menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Langkah
selanjutnya yaitu pemurnan sampel yang diawali dengan penambahan 42.5 μL
Sample Purification Beads yang telah divorteks ke dalam sampel. Sampel
dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10
kali. Campuran sampel dan Sample Purification Beads diinkubasi selama 5 menit
pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian dipindahkan dalam
6
magnetic stand pada suhu ruang selama 5 menit. Sebanyak 80 μL supernatan
dibuang dengan hati-hati jangan sampai mengenai pelet yang terletak pada
dinding tabung.
Ulangi tahapan sebelumnya untuk menghilangkan supernatan yang masih
tersisa. Pencucian pelet dilakukan secara duplo, sebanyak 200 μL etanol 80%
ditambahkan dan diinkubasi selama 30 detik, selanjutnya etanol 80%. Pelet
kemudian dikeringkan selama 5 menit pada suhu ruang dan dipindahkan dari
magnetic stand. Resuspension buffer sebanyak 52.5 μL ditambahkan ke dalam
tabung yang berisi pelet. Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan
cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Selanjutnya, sampel diinkubasi selama 2
menit pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian dipindahkan dalam
magnetic stand pada suhu ruang selama 5 menit untuk memisahkan supernatan
dengan pelet. Sample purification beads ditambahkan sebanyak 50 μL dan
diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian
dipindahkan dalam magnetic stand pada suhu ruang selama 5 menit.
Kemudian sebanyak 95 μL supernatan dibuang dengan hati-hati jangan
sampai mengenai pelet yang terletak pada dinding tabung. Pencucian pelet,
sebanyak 200 μL etanol 80% ditambahkan dan diinkubasi selama 30 detik.
Selanjutnya, etanol 80% yang telah ditambahkan dibuang dan tahapan
penambahan etanol 80% diulangi kembali satu kali. Pelet kemudian dikeringkan
selama 5 menit pada suhu ruang. Sample purification beads ditambahkan
sebanyak 22.5 μL dan diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang. Tabung yang
berisi sampel kemudian dipindahkan dalam magnetic stand pada suhu ruang
selama 5 menit. Sebanyak 20 μL supernatan dipindahkan ke dalam tabung PCR
0.3 ml yang baru dan disimpan dalam mesin pendingin.
Analisis Pustaka Genom Jagung
Analisis pustaka genom dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif untuk
mengecek ukuran pustaka genom dan mengetahui konsentrasi dari pustaka genom
yang dihasilkan memenuhi persyaratan untuk sekuensing menggunakan next
generation sequencing HiSeq 2000. Syarat-syarat tersebut yaitu memiliki panjang
fragmen sekitar 300-500 bp dengan konsentrasi 10 nM.
Analisis kualitas pustaka genom (Agilent Technologies 2003). Uji ini
digunakan untuk mengetahui ukuran fragmen DNA hasil pemotongan yang
dilakukan dengan mengikuti protokol Agilent High Sensitivity DNA Assay. High
Sensitivity DNA Chip diletakkan di atas priming station chip dan kemudian ke
dalam lubang berlabel G ditambahkan 9 μL dye mix kemudian ditekan
menggunakan priming station selama 1 menit. Setelah dibuka kemudian ke dalam
lubang lain yang berlabel G ditambahkan 9 μL dye mix dan marker pada masing-
masing lubang kecuali lubang ladder, kemudian ke dalam lubang ladder
ditambahkan 1 μL High Sensitivity DNA ladder. Selanjutnya 1 μL sampel
dimasukkan ke dalam lubang sampel. Chip kemudian divorteks selama 1 menit
dan kemudian di-running pada alat agilent 2100 bioanalyzer yang terhubung
dengan komputer. Kualitas ukuran pustaka juga menggunakan metode
elektroforesis agarose 2 %. Sampel yang digunakan merupakan sampel hasil dari
qPCR. Kemudian hasil elektroforegram dianalisis dengan menggunakan software
bioinformatika photocap molecule weight.
7
Analisis kuantitas pustaka genom (Sigma 2008). Tahapan ini dilakukan
untuk mengetahui jumlah atau konsentrasi pustaka genom yang mencukupi
sebagai syarat untuk proses klasterisasi. Sampel dibuat sebanyak triplo dan setiap
ulangan dibuat tiga pengenceran berbeda, yaitu 1:1000, 1:2000 dan 1:4000.
Sebanyak 1 μL sampel dilarutkan dalam 999 μL buffer qPCR, kemudian divorteks
selama 10 detik. Pada ulangan ke dua yaitu sebanyak 100 μL sampel yang telah
dilarutkan ditambahkan ke dalam 100 μL buffer qPCR dan untuk ulangan ketiga
sebanyak 100 μL sampel dari ulangan 2 ditambahkan ke dalam 100 μL buffer
qPCR. Setiap sampel yang telah diencerkan ini kemudian diambil sebanyak 4 ul
dan ditambahkan 16 ul reagen qPCR dan dimasukkan ke dalam tabung PCR.
Standar larutan juga dibuat sebanyak 3 ulangan. Kemudian tabung PCR
dimasukkan ke dalam alat qPCR dan di-running selama 2 jam. Hasil yang
diperoleh akan digunakan untuk perhitungan klasterisasi pustaka genom. Sebelum
klasterisasi pustaka terlebih dahulu dihitung konsentrasi pustaka genom yang
dibutuhkan yaitu sebanyak 2 nM yang diencerkan ke dalam buffer pustaka (Tris-
Cl 10 mM pH 8.5 dan 0.1 % tween 20).
Klasterisasi Pustaka Genom Jagung (cBot cluster generation protocol 2010)
Klaterisasi DNA diawali dari preparasi sampel yang terdiri dari dua
tahapan, yaitu denaturasi dengan menggunakan 2 N NaOH dan pelarutan DNA
dalam buffer hibridisasi. Denaturasi diawali dengan penambahan 17 μL Tris-Cl 10
mM, pH 8.5 dan 1 μL 2 N NaOH ke dalam 2 μL sampel DNA sehingga diperoleh
konsentrasi DNA sebesar 1 nM. Campuran tersebut kemudian divorteks sampai
homogen. Sampel diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang untuk
mendenaturasi utas ganda DNA menjadi utas tunggal. DNA yang telah
didenaturasi disimpan dalam mesin pendingin sampai proses pelarutan DNA akan
dilakukan.
Tahapan preparasi sampel selanjutnya yaitu pelarutan DNA dalam buffer
hibridisasi. Tahapan ini diawali dengan pengenceran 1 nM DNA hasil denaturasi
menjadi DNA yang memiliki konsentrasi 5 pM, 6 pM, 7 pM dan 8 pM.
Konsentrasi tersebut didapat dari pengenceran 5 μL dalam 995 μL (5 pM), 6 μL
dalam 994 μL (6 pM), 7 μL dalam 993 μL (7 pM) dan 8 μL dalam 992 μL (8 pM).
Sebanyak 120 μL control library disiapkan dalam tabung pertama dalam suatu
lajur yang memiliki 8 tabung untuk digunakan sebagai kontrol dalam flow cell.
Sampel DNA yang telah diencerkan sebelumnya kemudian dipindahkan dalam
tabung yang lain dalam lajur tersebut. Posisi sampel dicatat dan tabung disimpan
dalam mesin pendingin sampai sampel akan dimasukkan kedalam cBot Cluster
Generation.
Sekuensing Pustaka Genom Jagung (HiSeq 2000 protocol 2011) Sekuensing pustaka genom menggunakan Illumina HiSeq 2000 terdiri dari
beberapa tahap yaitu persiapan reagen, pemilihan parameter untuk sekuensing,
pemasangan flow cell, sekuensing, dan post-run sequencing (maintenance wash).
Reagen yang digunakan selama sekuensing diantaranya SBS reagen (TruSeq SBS
kit), multiplexing reagen dan paired end reagen. Reagen-reagen tersebut
dimasukkan kedalam rak reagen compartment yang terdapat dalam Illumina
Hiseq 2000. Pemilihan parameter untuk sekuensing dilakukan melalui Hiseq
control software interface. Parameter yang tersedia diantaranya flow cell ID,
8
experiment, user name, flow cell type, control lane, output folder,confirm first
base, keep intensity files, existing recipe, save image dan align lanes. Tahapan
selanjutnya yaitu pemasangan flow cell yang telah diklasterisasi melalui cBot
cluster generation pada flow cell stage. Sekuensing dilakukan selama sekitar 11
hari dengan panjang pembacaan DNA 2 x 101 siklus. Tahapan terakhir setelah
proses sekuensing selesai dilakukan yaitu dengan dipindahkannya flow cell dari
flow cell stage dan dilakukannya post-run sequencing yaitu maintenance wash.
Tahapan maintenance wash terdiri dari pembilasan dengan menggunakan air dan
NaOH.
HASIL
Isolasi DNA Genom Jagung secara Kualitatif
Isolasi DNA genom jagung empat genotipe yaitu Sp010BB-3-2-2-1-B,
LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut) diuji secara kualitatif
menggunakan metode elektroforesis gel agarose dengan konsentrasi 1%. Keempat
genotipe ini menunjukkan hasil yang baik. Hal ini ditunjukkan dengan intensitas
pita DNA yang jelas dan terang. Masih terdapatnya RNA ditunjukkan dengan
adanya intensitas pita DNA pada dasar sumur gel. DNA yang dihasilkan juga
merupakan DNA genom karena DNA yang dihasilkan berukuran besar, yaitu
lebih dari 1500 bp (Gambar 1).
Gambar 1 Elektroforegram DNA genom total jagung. DNA marker (a), Sp010BB-
3-2-2-1-B (b), LK2-45 (c), PSG59-8 (genjah) (d) dan LBP54-50
(pulut) (e).
Isolasi DNA Genom Jagung secara Kuantitatif
Uji kuantitatif menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific
dilakukan untuk mengetahui konsentrasi DNA serta kemurnian DNA terhadap
protein dan polisakarida. Keempat genotipe jagung yaitu Sp010BB-3-2-2-1-B,
LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut) menunjukkan hasil yang baik
dengan konsentrasi DNA yang tinggi berkisar 745.10 ng/µL – 2547.20 ng/µL
serta rasio kemurnian A260/A280 (terhadap protein) dan A260/A230 (terhadap
polisakarida) masing-masing berkisar 1.97 – 2.03 dan 2.03 – 2.17 (Tabel 1). Rasio
kemurnian terhadap protein dan polisakarida ditunjukkan dengan hasil yang baik.
1500 bp
a b c d e
9
Tabel 1 Kuantitas dan rasio kemurnian DNA genom total jagung menggunakan
spektrofotometer nanodrop thermoscientific Genotipe [DNA] (ng/µL) A260 A280 A260/A280 A260/A230
Sp010BB-3-2-2-1-B
LK2-45
PSG59-8 (Genjah)
LBP54-50 (Pulut)
1303.00
2547.20
1788.40
745.10
26.06
50.94
35.77
14.90
12.85
25.76
17.68
7.55
2.03
1.98
2.02
1.97
2.03
2.06
2.17
2.15
Uji kuantitas DNA menggunakan Qubit 2.0 fluorometer dilakukan untuk
mengetahui konsentrasi DNA double stranded yang menjadi tolak ukur dalam
pustaka genom dengan konsentrasi minimal 20 ng/µL. Qubit 2.0 fluorometer
berbeda dengan spektrofotometer nanodrop thermoscientific karena Qubit 2.0
fluorometer hanya menghitung double stranded DNA yang akan digunakan untuk
konstruksi pustaka genom, kemudian disekuensing. Qubit 2.0 fluorometer
memiliki akurasi yang baik karena mampu mendeteksi konsentrasi double
stranded DNA dalam konsentrasi yang rendah. Konsentrasi double stranded DNA
memenuhi prasyarat tersebut dengan kisaran 55.60 – 112.00 ng/µL (Tabel 2).
Tabel 2 Kuantitas double stranded DNA genom total jagung menggunakan Qubit
2.0 fluorometer Genotipe [DNA]
(µg/mL)
Faktor
Dilusi
[dsDNA]
(ng/µL)
Sp010BB-3-2-2-1-B
LK2-45
PSG59-8 (Genjah)
LBP54-50 (Pulut)
1.12
0.57
0.63
0.55
100.00
100.00
100.00
100.00
112.00
57.20
63.40
55.60
Konsentrasi DNA double stranded untuk Pustaka Genom Jagung
DNA genom yang dibutuhkan untuk konstruksi pustaka genom harus
memiliki kualitas dan kuantitas yang baik. DNA genom yang digunakan harus
utuh, sedikit mengandung fragmen DNA yang berukuran kecil serta memiliki
konsentrasi yang tinggi. Konsentrasi DNA double stranded yang telah diukur
menggunakan Qubit 2.0 fluorometer, diencerkan dengan buffer resuspensi
mencapai volume 55 µL untuk memulai proses fragmentasi. Buffer resuspensi ini
akan tetap menjaga DNA dalam kondisi yang baik dan stabil serta dapat
melarutkan kembali DNA. DNA diencerkan dengan konsentrasi 20 ng/ µL.
Volume DNA yang digunakan berkisar antara 9.82 – 19.78 µL (Tabel 3). Volume
DNA yang dibutuhkan untuk pengenceran diperoleh dengan perhitungan :
( )
Tabel 3 Volume DNA genom jagung yang digunakan untuk uji pustaka genomik Genotipe
[dsDNA]
(ng/µL)
Volume DNA
(µL)
Volume Buffer
Resuspensi (µL)
Volume Total
(µL)
Sp010BB-3-2-2-1-B
LK2-45
PSG59-8 (Genjah)
LBP54-50 (Pulut)
112.00
57.20
63.40
55.60
9.82
19.23
17.35
19.78
45.18
35.77
37.65
35.22
55.00
55.00
55.00
55.00
10
Kuantitas Hasil Fragmentasi DNA Genom Jagung
Fragmentasi yang digunakan dalam penelitian ini yaitu fragmentasi secara
fisik dengan cara sonikasi menggunakan covaris M220. Covaris M220 akan
memotong dan menghasilkan fragmen double stranded DNA dengan ujung 3’
atau 5’ overhang. Setelah difragmentasi dengan teknik sonikasi menggunakan
covaris M220, kemudian dilihat kuantitas DNA dan kemurniannya menggunakan
spektrofotometer nanodrop thermoscientific. Konsentrasi DNA menurun drastis
karena DNA yang sudah terpotong-potong pada proses fragmentasi ini. Hasil
fragmentasi juga memiliki konsentrasi DNA yang menurun drastis dibandingkan
dengan DNA hasil isolasi. DNA genom hasil fragmentasi memiliki rasio A260/A280
berkisar 1.86 - 2.15 dan rasio A260/A230 berkisar 1.61 – 2.03 yang menunjukkan
kemurnian yang baik (Tabel 4).
Tabel 4 Kuantitas dan rasio kemurnian DNA genom jagung hasil fragmentasi Genotipe [DNA] (ng/µL) A260 A280 A260/A280 A260/ A230
Sp010BB-3-2-2-1-B
LK2-45
PSG59-8 (Genjah)
LBP54-50 (Pulut)
13.00
19.10
13.40
18.10
0.26
0.38
0.27
0.36
0.12
0.21
0.13
0.19
2.15
1.86
2.06
1.89
1.83
1.61
2.03
1.75
Kuantitas Hasil Modifikasi Ujung Fragmen DNA Genom Jagung (End
Repair)
Tahapan modifikasi ujung fragmen DNA setelah fragmentasi bertujuan
mengubah ujung lengket pada fragmen DNA menjadi ujung tumpul (blunt end).
Hasil end repair diuji secara kuantitas menggunakan spektrofotometer nanodrop
thermoscientific untuk mengetahui konsentrasi DNA dan kemurniannya.
Konsentrasi DNA meningkat drastis dari tahapan fragmentasi. Konsentrasi DNA
tahapan fragmentasi berkisar 13.00 – 19.10 ng/µL meningkat pada tahapan end
repair menjadi kisaran 562.00 – 590.00 ng/µL (Tabel 5). Konsentrasi DNA yang
meningkat dapat disebabkan karena penambahan sample purification beads
sebanyak dua kali. Sample purification beads mengandung manik-manik
paramagnetik yang akan mengikat fragmen DNA dan memisahkannya dari
kelebihan pereaksi-pereaksi yang digunakan sehingga DNA yang terjerap semakin
banyak dan konsentrasinya meningkat. Rasio A260/A280 tergolong baik karena
masih dikisaran 1.80 – 2.00.
Tabel 5 Kuantitas dan rasio kemurnian fragmen DNA setelah tahapan modifikasi
ujung fragmen DNA pada preparasi konstruksi pustaka genom jagung Genotipe [DNA] (ng/µL) A260 A280 A260/A280 A260/ A230
Sp010BB-3-2-2-1-B
LK2-45
PSG59-8 (Genjah)
LBP54-50 (Pulut)
580.00
562.00
590.00
580.70
11.60
11.24
11.80
11.61
5.28
5.08
5.38
5.36
2.20
2.21
2.19
2.39
2.36
2.38
2.36
2.39
Kuantitas Hasil Ligasi Adapter DNA Genom Jagung
Ligasi merupakan tahapan terakhir pada pustaka genom. Ligasi adapter
merupakan proses pelekatan indeks atau adapter pada ujung fragmen DNA dan
menyiapkan pengikatan pustaka untuk hibridisasi pada flow cell saat tahapan
11
klasterisasi pustaka genom. Konsentrasi DNA berkisar 4.50 – 13.00 ng/µL dengan
rasio A260/A280 dengan kisaran 1.98 – 4.54 (Tabel 6). Kemurnian yang didapat
tidak murni. Hal ini dapat dikarenakan kontaminasi protein maupun polisakarida
atau dapat dikarenakan beads masih tercampur dengan DNA ketika injeksi ke
spektrofotometer nanodrop thermoscientific.
Tabel 6 Kuantitas dan rasio kemurnian DNA cetakan setelah tahapan ligasi
adapter Genotipe [DNA] (ng/µL) A260 A280 A260/A280 A260/ A230
Sp010BB-3-2-2-1-B
LK2-45
PSG59-8 (Genjah)
LBP54-50 (Pulut)
13.00
4.50
6.10
9.60
0.26
0.09
0.12
0.19
0.08
0.02
0.03
0.10
3.12
4.54
3.51
1.98
1.16
0.82
1.58
0.79
Kualitas Pustaka DNA Genom Jagung
Pustaka genom divisualisasikan melalui elektroforegram hasil pengukuran
menggunakan agilent bioanalyzer. Agilent bioanalyzer mengukur semua hasil
pustaka berdasarkan potongan fragmen yang ditempeli adaptor pada salah satu
ujungnya atau pada kedua ujungnya. Genotipe LK2-45 berukuran 638 bp
sedangkan PSG59-8 berukuran 970 bp (Gambar 2). Fragmen DNA yang
dibutuhkan untuk klasterisasi yaitu berukuran kurang dari 800 bp untuk
mendapatkan hasil sekuensing yang baik karena dapat mempengaruhi intensitas
basa yang dihasilkan. Genotipe PSG59-8 yang berukuran lebih dari 800 bp tetap
diklasterisasi untuk melihat perbandingan hasil sekuensing.
Gambar 2 Elektroforegram hasil pustaka genom jagung menggunakan agilent
bioanalyzer genotipe LK2-45 dan PSG59-8 (genjah).
Analisis kualitatif pustaka genom jagung menggunakan agilent
bioanalyzer juga menghasilkan tabel yang memuat ukuran fragmen dan molaritas
sampel hasil pustaka. Molaritas untuk genotipe LK2-45 dan PSG59-8 masing-
masing adalah 6.88 dan 10.80 nmol/L (Tabel 7).
Tabel 7 Ukuran fragmen dan konsentrasi DNA hasil pustaka genom untuk
sekuensing Genotipe Ukuran Fragmen (bp) Molaritas (nmol/L)
LK2-45
PSG59-8 (Genjah)
638.00
970.00
6.88
10.80
12
Analisis kualitatif pustaka genom juga menggunakan elektroforesis
agarose dengan konsentrasi 2 %. Setelah dilektroforesis, hasilnya dianalisis
menggunakan software bioinformatika photocap molecule weight. Kedua genotipe
ini memiliki ukuran yang sama yaitu 658 bp (Gambar 3).
Gambar 3 Elektroforegram hasil pustaka genom yang sudah di qPCR genotipe
Sp010BB-3-2-2-1-B (a) dan LBP54-50 (Pulut) (b).
Sekuensing Pustaka Genom Jagung
Jumlah basa hasil sekuensing empat genotipe jagung (Sp010BB-3-2-2-1-
B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut)) secara total diperoleh
sebanyak 287.1 Gbp atau 287.1 x 109
bp dan memiliki jumlah yang sama dengan
nilai yang diprediksi selama proses sekuensing (projected total yield) 287.1 Gbp
atau 287.1 x 109
bp (Tabel 8). Kualitas klaster pustaka genom hasil sekuensing
ditunjukkan dengan nilai yield perfect dan yield <=3 errors. Hasil yield perfect
menunjukkan sebanyak 5.1 Gbp basa yang melewati passing filter dan yield <=3
errors yang menunjukkan bahwa sebanyak 6.1 Gbp basa pada lajur kontrol
memiliki tingkat kesalahan 1-3 basa (Tabel 8). Passing filter adalah sejenis
algoritma yang dipakai oleh komputer untuk menentukan keakuratan pembacaan
basa saat sekuensing. Nilai % perfect menunjukkan presentase tingkat kesamaan
antara basa yang dihasilkan dengan sekuen PhiX dalam 99 siklus bernilai 82%.
Nilai % <=3 errors menunjukkan sebanyak 97.6% dari total basa yang dihasilkan
memiliki tingkat kesalahan kurang dari 3 basa (Tabel 8).
Tabel 8 Jumlah basa dan kualitas klaster pustaka genom hasil sekuensing secara
umum
Yield
Total
(Gbp)
Projected
Total
Yield
(Gbp)
Yield
Perfect
(Gbp)
Yield <=3
errors
(Gbp)
% Perfect
[Num
cycles]
% <=3
errors [Num
Cycles]
287.1 287.1 5.1 6.1 82 [99] 97.6 [99]
Densitas (kerapatan klaster) yang didapat untuk keempat genotipe sangat
rapat yaitu pada kisaran 673 – 875 K/mm2, sedangkan densitas yang ideal berkisar
antara 400-600 K/mm2 (Tabel 9). Klaster PF menunjukkan sebanyak 87.2 –
93.3 % jumlah klaster yang melewati passing filter. Phasing menunjukkan sekitar
0.197 – 0.208% pembacaan basa berjalan lebih lambat pada saat sekuensing,
1500 bp
a b
13
sedangkan prepashing menunjukkan 0.241 – 0.324% sekitar pembacaan basa
berjalan lebih cepat. Reads menunjukkan sebanyak 186.05 – 241.86 M urutan
basa yang terbaca pada klaster, sedangkan reads PF menunjukkan 173.12 –
210.16 M urutan basa yang berhasil melewati passing filter. Nilai %>=Q30
menunjukkan pada kisaran 80.8 – 87.8% kesalahan pembacaan hanya terjadi pada
1 basa dari 1000 basa. Nilai klaster PF, phasing, prepashing dan %>=Q30
menunjukkan hasil yang ideal. Nilai %>=Q30 dan jumlah klaster yang dihasilkan
keempat geotipe selama proses sekuensing divisualisasikan melalui histogram
untuk genotipe Sp010BB-3-2-2-1-B (Gambar 4), genotipe LK2-45 (Gambar 5),
genotipe PSG59-8 (genjah) (Gambar 6) dan LBP54-50 (pulut) (Gambar 7).
Tabel 9 Densitas dan kualitas pustaka genom hasil sekuensing
Lajur Densitas
(K/mm2)
Klaster
PF (%)
Phasing
(%)
Prepashing
(%)
Reads
(M)
Reads
PF (M)
%>=
Q30
Sp010BB-3-2-2-1-B
LK2-45
PSG59-8 (Genjah)
LBP54-50 (Pulut)
875
855
762
673
87.2
87.5
91.2
93.3
0.208
0.206
0.209
0.197
0.318
0.324
0.265
0.241
241.86
236.38
210.61
186.05
210.16
206.17
191.50
173.12
81.8
80.8
86.3
87.9
Gambar 4 Histogram jumlah klaster genotipe Sp010BB-3-2-2-1-B berdasarkan
kualitas sekuen yang dihasilkan.
Gambar 5 Histogram jumlah klaster genotipe LK2-45 berdasarkan kualitas sekuen
yang dihasilkan.
Skor Q
Skor Q
14
.
Gambar 6 Histogram jumlah klaster genotipe PSG59-8 (genjah) berdasarkan
kualitas sekuen yang dihasilkan.
Gambar 7 Histogram jumlah klaster genotipe LBP54-50 (pulut) berdasarkan
kualitas sekuen yang dihasilkan.
Larutan sekuensing yang terpakai dapat dilihat dari grafik untuk empat
genotipe jagung (Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50
(pulut)) (Gambar 8). Selama proses sekuensing, semakin banyak siklus, maka
larutan sekuensing yang dipakai semakin banyak dan stok di dalam alat
sekuensing semakin sedikit. Grafik ini membantu proses sekuensing agar berjalan
baik karena dapat mengontrol jumlah larutan yang berada di dalam alat. Jika
larutan sekuensing berada dalam keadaan kritis (stok hamper habis), maka proses
sekuensing dapat dihentikan dahulu, kemudian larutan sekuensing ditambahkan
dan proses sekuensing dapat dilanjutkan kembali.
a b
Skor Q
Skor Q
Siklus Siklus
15
Gambar 8 Intensitas banyaknya larutan sekuensing yang tersisa selama proses
sekuensing berlangsung genotipe Sp010BB-3-2-2-1-B (a), LK2-45
(b), PSG59-8 (genjah) (c) dan LBP54-50 (pulut) (d).
Jumlah basa-basa nitrogen empat genotipe jagung (Sp010BB-3-2-2-1-B,
LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut)) selama proses sekuensing
seperti adenin, timin, guanin dan sitosin dapat dilihat melalui grafik. Grafik
tersebut berbentuk garis lurus yang menyatakan bahwa jumlah basa-basa nitrogen
tersebut stabil selama proses sekuensing (Gambar 9).
Gambar 9 Presentase basa-basa nitrogen yang terbaca selama proses sekuensing
genotipe Sp010BB-3-2-2-1-B (a), LK2-45 (b), PSG59-8 (genjah) (c)
dan LBP54-50 (pulut) (d).
Tingkat kesalahan (error rate) yang dinyatakan dalam persen
menunjukkan presentase perbandingan kesalahan pembacaan basa antara pustaka
genom dengan kontrol. Nilai error rate yang dihasilkan berkisar 0.32 – 0.51%.
Intensitas keempat basa dideteksi melalui hasil pendaran flourescen yang
dihasilkan dari sintesis basa selama proses sekuensing (Tabel 10). Intensitas basa
yang dihasilkan pada setiap lajur flow cell pada siklus pertama memiliki nilai lebih
c d
a b
c d
Siklus Siklus
16
dari 3000 (Tabel 10). Nilai error rate dan intensitas basa yang dihasilkan pada
siklus pertama untuk empat genotipe jagung (Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45,
PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut)) bernilai ideal.
Tabel 10 Tingkat kesalahan (error rate) dan intensitas basa hasil sekuensing
Lajur Error Rate (%) Intensity Cycle 1
Sp010BB-3-2-2-1-B
LK2-45
PSG59-8 (Genjah)
LBP54-50 (Pulut)
0.51
0.47
0.35
0.32
3695
3762
3991
4022
PEMBAHASAN
Isolasi DNA Genom Jagung
Isolasi DNA genom jagung empat genotipe yaitu Sp010BB-3-2-2-1-B,
LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut) menggunakan metode
Doyle&Doyle (1987) yang dimodifikasi. Cetil trimetil ammonium bromida
(CTAB) yang digunakan dalam ekstraksi DNA ini berfungsi untuk mendegradasi
senyawa-senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam tanaman. CTAB
bersifat sebagai detergen kationik akan membentuk kompleks tak larut dengan
asam nukleat sehingga dapat memisahkan kontaminan polisakarida dan polifenol
dari asam nukleat serta dapat menghambat aktivitas nuklease. Metode
Doyle&Doyle (1987) yang dimodifikasinya adalah penambahan natrium disulfit
pada buffer CTAB.
Ekstraksi DNA pada penelitian ini menggunakan nitrogen cair untuk
melisis dinding sel dapat mengeluarkan semua isi sel yang kemudian ditampung
dalam larutan penyangga yang berisi Tris HCl dan EDTA. Dinding sel juga dapat
dipecahkan dengan penggerusan menggunakan bufer ekstraksi diikuti dengan
penghangatan pada suhu 65°C (Subandiyah 2006). Isopropanol merupakan
alternatif dari etanol absolut. Isopropanol lebih efisien dalam persipitasi DNA
dibandingkan etanol. Namun, isopropanol kurang volatil sehingga membutuhkan
waktu yang lebih lama untuk mengeringkan pellet (Sambrook et al. 2001).
Berbagai metode telah dilakukan sebelumnya untuk mendapatkan kualitas
DNA yang diinginkan agar dapat memenuhi persyaratan untuk pustaka genom dan
metode ini yang tepat untuk menghasilkan kualitas DNA yang mengandung
double stranded DNA dengan konsentrasi yang tinggi. Banyak faktor yang
mempengaruhi keberhasilan isolasi DNA untuk menghasilkan kualitas dengan
konsentrasi double stranded DNA yang tinggi, salah satunya adalah tanaman yang
digunakan berumur tidak terlalu tua (masih muda) dan dalam keadaan yang segar.
Protokol Doyle & Doyle (1987) sering digunakan untuk ekstraksi DNA tanaman
(Ribeiro et al. 2007).
Isolasi DNA Genom Jagung secara Kualitatif
Hasil isolasi DNA divisualisasikan melalui elektroforegram yang
sebelumnya dilakukan elektroforesis terlebih dahulu (Gambar 1). Uji kualitatif
yang divisualisasikan melalui elektroforegram menggunakan elektroforesis gel
agarosa 1%. Agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA yang
17
ukurannya memiliki rentang beberapa ratus hingga sekitar 20000 kb. Konsentrasi
gel yang sangat encer (0.1-0.2%) dapat meningkatkan daya pisah elektroforesis
tetapi hal tersebut sulit dilakukan karena gel yang encer sangat mudah pecah. Pada
konsentrasi 1% bobot per volume, gel yang berada dalam buffer yang
mengandung air dalam kadar tinggi menghasilkan struktur serat yang baik dengan
ukuran pori besar dan tahan terhadap gesekan. Agarosa bersifat tidak toksik,
kompleks berupa bubuk yang terdiri dari campuran polimer dengan dua unit dasar
galaktosa, agarosa dan agaropektin (Bintang 2010).
Hasil isolasi DNA genom jagung dari empat genotipe jagung
menunjukkan hasil yang baik, terlihat dari intensitas pita DNA yang jelas. Terlihat
intensitas terdapat pada dasar elektroforegram empat genotipe. Intensitas tersebut
merupakan konsentrasi RNA. Hal ini dapat disebabkan karena penggunaan
RNAse yang terlalu sedikit sehingga masih terdapat RNA (Gambar 2). Hasil
elektroforesis juga menunjukkan bahwa keempat pita DNA yang dihasilkan
merupakan DNA genom, karena ukuran pita DNA yang cukup besar (lebih dari
1500 bp). Sesuai dengan pernyataan Brown (2007) bahwa elektroforesis gel akan
memisahkan molekul DNA sesuai dengan ukurannya, semakin besar molekul
DNA maka pita DNA yang dihasilkan semakin dekat dengan sumur gel.
Isolasi DNA Genom Jagung secara Kuantitatif Selain diuji secara kualitatif, DNA hasil isolasi juga diuji secara
kuantitatif. Uji kuantitatif ini bertujuan untuk mengetahui konsentrasi DNA dan
tingkat kemurnian DNA dari kontaminan polisakarida, dan protein. Uji kuantitatif
dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific pada
panjang gelombang 230, 260 dan 280 nm. Panjang gelombang 230 nm merupakan
serapan maksimum untuk polisakarida, panjang gelombang 260 nm merupakan
serapan maksimum untuk asam nukleat dan panjang gelombang 280 nm
merupakan serapan maksimum untuk protein. Kemurnian DNA ditentukan
melalui rasio A260/A280 dan A260/A230. Rasio A260/A280 menunjukkan kemurnian
DNA terhadap protein, sedangkan rasio A260/A230 menunjukkan kemurnian DNA
terhadap polisakarida. Hasil uji kuantitatif genom total DNA jagung yang
dihasilkan memiliki kisaran 745.10 – 2547.20 ng/µL dengan rasio A260/A280
berkisar antara 1.97 - 2.03 ng/µL dan rasio A260/A280 berkisar antara 2.03 – 2.17
ng/µL (Tabel 1). Menurut Walker&Wilson (2000), nilai kemurnian yang lebih
dari 2.00 menujukkan adanya kontaminasi RNA, sedangkan nilai kemurnian yang
kurang dari 1.80 menunjukkan sampel terkontaminasi polisakarida dan protein
(Yuwono 2005). Hal ini menunjukkan hasil isolasi DNA tergolong baik meskipun
ada kontaminasi RNA karena rasio lebih dari 2.00.
Uji kuantitatif juga dilakukan dengan menggunakan Qubit 2.0 fluorometer.
Uji kuantitatif ini berbeda dengan uji kuantitatif sebelumnya yang menggunakan
spektrofotometer nanodrop thermoscientific, karena Qubit 2.0 fluorometer hanya
menghitung konsentrasi double stranded DNA (dsDNA). Double stranded DNA
(dsDNA) ini dijadikan tolak ukur untuk ke tahapan selanjutnya yaitu pustaka
genom yang mempunyai persyaratan bernilai 20 ng/µL. Qubit 2.0 fluorometer
memiliki nilai ketelitian yang tinggi sehingga mampu mendeteksi konsentrasi
yang sangat rendah (Invitrogen 2010). Kosentrasi double stranded DNA berkisar
antara 55.60 – 112.00 ng/µL. Berdasarkan uji kualitatif dan kuantitatif, DNA
genom jagung yang telah diisolasi berhasil memenuhi persyaratan untuk
18
digunakan sebagai bahan konstruksi pustaka genom. DNA genom yang
dibutuhkan untuk konstruksi pustaka genom harus memiliki kualitas dan kuantitas
yang baik. DNA genom yang digunakan harus utuh dan memiliki konsentrasi
yang tinggi (Michiels et al. 2003).
Konsentrasi DNA double stranded untuk Pustaka Genom Jagung
Konsentrasi double stranded DNA yang didapat dari pengukuran dengan
menggunakan Qubit 2.0 fluorometer diencerkan dengan buffer resuspensi untuk
difragmentasi menggunakan covaris M220. Buffer resuspensi ini digunakan untuk
menjaga DNA agar selalu dalam kondisi yang baik dan stabil serta untuk
melarutkan kembali DNA. Sampel DNA dicairkan sampai volume 55 µL dengan
konsentrasi 20 ng/µL. Volume DNA yang akan diencerkan didapatkan dengan
cara konsentrasi minimal pustaka genom yaitu 20 ng/µL dikalikan dengan volume
55 µL dibagi dengan konsentrasi DNA double stranded dengan satuan ng/µL
sehingga didapat konsentrasi double stranded DNA yang diencerkan berkisar
antara 9.82 – 19.78 µL (Tabel 3). Semakin besar konsentrasi double stranded
DNA, maka semakin sedikit buffer resuspensi yang digunakan untuk
mengencerkan (Covaris 2012).
Kualitas Hasil Fragmentasi DNA Genom Jagung
Fragmentasi DNA genom merupakan tahapan pertama dalam konstruksi
pustaka genom. Pustaka genom merupakan kumpulan sekuens (urutan) DNA dari
suatu organisme. Bagian-bagian spesifik dari genom kemudian dapat disub-klon
untuk memperoleh pustaka sub-genom (Wulandari 2009). Pustaka genom
merupakan bagian yang sangat penting dalam program perbaikan genetika
tanaman secara molekuler maupun melalui pemuliaan konvensional karena sangat
bermanfaat dalam usaha isolasi dan karakterisasi suatu gen dan dapat digunakan
untuk pemetaan gen secara fisik (Suharsono 2003). Pustaka genom menggunakan
DNA genomik atau kromosom sebagai sumber DNA yang digunakannya. Hal
yang perlu diperhatikan ketika melakukan konstruksi suatu perpustakaan gen
adalah perpustakaan tersebut harus merepresentasikan semua gen yang ada di
dalam sumber DNA asalnya. Perpustakaan gen dikatakan representatif apabila
berisi semua sekuens aslinya. Perpustakaan genom yang representatif dapat dibuat
dengan cara memurnikan DNA genomik, kemudian dipotong secara acak menjadi
fragmen-fragmen yang ukurannya sesuai dengan keperluan kloning menggunakan
vektor yang dipilih. Pemurnian DNA genomik eukariot biasanya dilakukan
dengan terlebih dahulu mengisolasi nukleus dan menghilangkan protein, lemak,
serta makromolekul lain yang tidak diinginkan dengan memberikan protease dan
melakukan ekstraksi fenol-kloroform. Sementara itu, DNA prokariot dapat
diekstraksi langsung (Wahyudi 2001).
Menurut Wahyudi (2001), DNA genomik hasil pemurnian tersebut
selanjutnya dipotong-potong secara acak. Pada dasarnya ada dua cara
pemotongan, yaitu pemotongan fisik seperti sonikasi dan digesti menggunakan
enzim restriksi. Fragmentasi yang dilakukan dalam penelitian ini dengan cara
sonikasi dengan memotong DNA genom secara acak pada kisaran pemotongan
300-400 bp. Fragmentasi dengan teknik sonikasi ini menggunakan insrumen
covaris M220. Covaris M220 ini memiliki fokus ultrasonikator dengan proses
AFA (adaptive focused acoustic) yang memiliki kekuatan memotong DNA secara
19
hidrodinamik menjadi potongan acak. Proses ini berlangsung dalam keadaan
isothermal untuk memastikan kedua fragmen dalam potongan yang sama dan
memiliki konsentrasi double stranded DNA yang tinggi (Covaris 2012). Konstruksi pustaka genom jagung pada penelitian ini mengikuti protokol
TruSeq DNA low troughput protocol dari Illumina yang dimodifikasi pada beberapa
tahapannya. Tujuan dari protokol ini yaitu menambahkan sekuen adaptor ke dalam
ujung fragmen DNA untuk menghasilkan pembacaan ganda atau sekuen ujung
pasangan pustaka. Tahapan awal konstruksi pustaka genom jagung ini adalah isolasi
DNA genom utuh dari jagung , kemudian dilakukan pemotongan DNA pada panjang
tertentu yang diharapkan potongan tersebut telah dapat mewakilkan gen-gen penyandi
genom jagung, modifikasi ujung DNA, adenilasi ujung 3’OH dan ligasi adaptor. Hasil
konstruksi dari pustaka genom nantinya dapat dianalisis agar dapat dilanjutkan ke
tahap berikutnya (Illumina 2010c).
Selanjutnya hasil fragmentasi dengan covaris M220 diuji secara kuantitatif
dengan menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific. Konsentrasi
DNA mengalami penurunan dari kisaran 55.60 – 112.00 (ng/µL) (hasil isolasi
DNA genom) menjadi kisaran 13.00 – 19.10 ng/µL (setelah dilakukan
fragmentasi) (Tabel 4). Hasil konsentrasi DNA yang mengalami penurunan
tersebut menunjukkan bahwa DNA sudah terpotong-potong. Rasio A260/A280
berkisar antara 1.85 – 2.15 menunjukkan DNA masih memiliki kemurnian yang
baik karena rasio A260/A280 masih berada dalam kisaran 1.8 – 2.0 (Walker &
Wilson 2000).
Kuantitas Hasil Modifikasi Ujung Fragmen DNA Genom Jagung (End
Repair)
Modifikasi ujung fragmen DNA merupakan tahapan kedua setelah
fragmentasi dalam konstruksi pustaka genom. Modifikasi ujung fragmen DNA
atau end repair memiliki tujuan untuk mengubah ujung lengket pada fragmen
DNA menjadi ujung tumpul (blunt end). Tahapan end repair ditambahkan end
repair mix yang mengandung enzim eksonuklease dan enzim polymerase. Kerja
kedua enzim ini bergantung pada letak ujung lengket. Jika ujung lengket terletak
pada 3’OH dari fragmen DNA, maka enzim eksonuklease akan memotong ujung
lengket tersebut. Tapi jika ujung lengket terletak pada ujung 5’P dari fragmen
DNA maka enzim polimerase akan membentuk utas DNA baru yang bersifat
komplemen dengan utas DNA pada ujung lengket (Illumina 2010a).
Fragmen DNA yang telah mengalami modifikasi dipurifikasi
menggunakan Sample Purification Beads. Purifikasi menggunakan Sample
Purification Beads juga dilakukan pada tahapan adenilasi ujung 3’OH dan ligasi.
Sample Purification Beads efektif dalam mengikat fragmen DNA dan
menghilangkan kelebihan pereaksi-pereaksi yang digunakan selama preparasi
konstruksi pustaka genom karena terdapat manik-manik paramagnetik. Magnetic
stand yang membantu kerja Sample Purification Beads dalam mengikat DNA
yang akan menempel pada dinding tabung saat inkubasi dan memisahkannya dari
pereaksi yang masih terlarut. Inkubasi ini dilakukan untuk mengoptimalkan
penempelan fragmen DNA pada dinding tabung yang tertarik oleh manik-manik
paramagnetic sehingga larutan menjadi jernih. Pencucian dengan etanol 80%
bertujuan untuk menghilangkan pereaksi-pereaksi yang masih tersisa setelah tahap
inkubasi, sedangkan buffer resuspensi ditambahkan untuk melarutkan fragmen-
20
fragmen DNA yang masih menempel pada dinding tabung (Agencourt Bioscience
Corp 2009).
Hasil modifikasi ujung fragmen atau end repair diuji secara kuantitatif
menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific. Konsentrasi DNA
pada tahapan fragmentasi berkisar antara 13.00 – 19.10 ng/µL dan pada tahapan
end repair mengalami peningkatan dengan kisaran 562 – 590 ng/µL (Tabel 5).
Peningkatan konsentrasi DNA ini dapat disebabkan karena penambahan Sample
Purification Beads sebanyak 2x. Pertama berupa dilute beads mix yang
merupakan campuran antara Sample Purification Beads dengan buffer resuspensi
dan kedua dengan Sample Purification Beads. Agencourt Bioscience Corp (2009)
menyatakan bahwa Sample Purification Beads berfungsi untuk mengikat DNA
sehingga banyak DNA yang terjerap oleh manik-manik paramagnetik dan pada
akhir tahapan end repair hanya dilarutkan dengan 17.5 µL buffer resuspensi.
Berbeda pada tahapan fragmentasi sebanyak 55 µL sehingga konsentrasi larutan
menjadi pekat. Hal ini yang dapat menyebabkan konsentrasi DNA meningkat
pada tahapan modifikasi ujung fragmen atau end repair. Rasio A260/A280 pada
tahapan end repair berkisar antara 2.19 – 2.39. Nilai Rasio A260/A280 masih
tergolong baik meskipun nilainya di atas 2, namun tidak terlalu besar nilai
selisihnya (Walker & Wilson 2000).
Kuantitas Hasil Adenilasi Ujung 3’OH dan Ligasi Adapter DNA Genom
Jagung
Tahapan adenilasi ujung 3’OH dan ligase adapter, kedua ujung 3’OH pada
fragmen DNA berikatan dengan basa tunggal adenin. Tujuan dari tahapan ini
adalah mencegah ligasi antar fragmen DNA dan mempersiapkan fragmen DNA
sebelum dilakukan ligasi adapter. Basa tunggal timin pada ujung adapter berikatan
dengan basa adenin pada ujung fragmen DNA. Ligasi adapter pada preparasi
konstruksi pustaka genom bertujuan untuk membantu pengikatan pustaka genom
pada flow cell saat tahapan klasterisasi pustaka genom (Illumina 2010b). Tahap
adenilasi menggunakan a tailing mix bertujuan untuk membuat fragmen DNA
menjadi kompatibel dengan adaptor dan mencegah ligasi sendiri (self ligation)
dengan penambahan adenin tersebut pada 3’. Tahap adenilasi juga didukung
dengan pengoptimasian inkubasi menggunakan thermocycle dengan suhu dan
waktu yang telah ditentukan dalam TruSeq DNA low troughput protocol dari
Illumina (Illumina 2010c).
Indeks adaptor juga ditambahkan dengan tujuan sebagai indeks atau
adaptor penunjuk pada ujung fragmen DNA dan menyiapkan pengikatan pustaka
untuk hibridisasi pada flow cell. Salah satu contoh indeks adaptor yang digunakan
adalah indeks adaptor nomor 2 (AD002) yang berisi sekuen nukleotida CGATGT
(A) serta ligation mix ditambahkan dengan tujuan menghubungkan adaptor untuk
disisipkan (Illumina 2010c). Proses ligasi dihentikan dengan menambahkan stop
ligation buffer. Stop ligation buffer segera ditambahkan karena proses ligasi yang
masih aktif menyebabkan adanya interaksi antar nukleotida bahkan
mengakibatkan adaptor saling menempel satu sama lain sehingga tidak
menghasilkan pustaka dengan kualitas yang baik yang akan berpengaruh pada
hasil sekuensing. Uji kuantitatif dilakukan menggunakan spektrofotometer
nanodrop thermoscientific. Terjadi penurunan konsentrasi pada tahap ligasi.
21
Kualitas Pustaka Genom Jagung
Setelah konstruksi pustaka genom dilakukan, langkah selanjutnya adalah
pengujian hasil pustaka secara kuantitatif menggunakan quantitative PCR (qPCR),
sedangkan secara kualitatif menggunakan agilent bioanalyzer. qPCR memiliki
fungsi yang berbeda dengan agilent bioanalyzer, yaitu qPCR memiliki akurasi
yang lebih baik dibandingkan agilent bioanalyzer, karena qPCR hanya
menghitung pustaka yang memiliki fragmen dengan ditempeli adaptor pada kedua
ujungnya dan menggunakan dua primer sehingga konsentrasi atau molaritas yang
dihasilkan lebih sedikit. Berbeda dengan qPCR, agilent bioanalyzer mengukur
semua hasil pustaka berdasarkan potongannya meskipun fragmen hanya ditempeli
adaptor pada salah satu ujungnya sehingga konsentrasi atau molaritas yang
dihasilkan jauh lebih besar dibandingkan dengan qPCR (Sigma 2008).
Prinsip pengujian elektroforesis yang didasarkan pada prinsip gel
elektroforesis yang dipindahkan ke dalam bentuk chip atau lempengan. Bentuk
lempengan akan mengurangi penggunaan waktu dan penggunaan sampel. Untuk
pengujian kuantitas DNA dan protein dapat diselesaikan dengan bantuan “upper
marker”. Peak sampel berada dibawah daerah upper marker dan karena
konsentrasi upper marker telah diketahui maka konsentrasi tiap sampel juga dapat
dihitung (Agilent Technologies 2003). Berdasarkan (Tabel 7) yang didapat dari
agilent bioanalyzer, ukuran fragmen DNA hasil pustaka berada pada kisaran 638
dan 970 bp. Kualitas pustaka yang baik memiliki ukuran fragmen <800 bp.
Genotipe PSG59-8 (genjah) memiliki ukuran fragmen >800 bp namun memiliki
konsentrasi yang paling tinggi sebesar 10.80 (nmol/L). Meskipun genotipe
PSG59-8 (genjah) kurang memenuhi persyaratan, namun klasterisasi dan
sekuensing tetap dilakukan untuk melihat hasilnya.
Penghitungan ukuran basa juga dilakukan menggunakan elektroforesis
2 %. Sampel yang digunakan merupakan hasil dari qPCR. Genotipe yang diuji
menggunakan elektroforesis yaitu Sp010BB-3-2-2-1-B dan LBP54-50 (pulut).
Kedua genotipe ini memiliki ukuran basa yang sama setelah dianalisis
menggunakan software bioinformatika yaitu photocap molecule weight, yaitu
bernilai 658 bp (Gambar 3). Kekurangan dari teknik menggunakan elektroforesis
dan dianalisis menggunakan software bioinformatika photocap adalah hasil yang
didapat kurang akurat dibandingkan dengan agilent bioanalyzer.
Kuantitas Pustaka Genom Jagung
Terdapat tiga faktor pengenceran yang berbeda, yaitu 1000, 2000 dan
4000. Tiap genotipe jagung ((Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45, PSG59-8 (genjah)
dan LBP54-50 (pulut)) dilakukan secara duplo atau triplo bertujuan untuk
menghindari pada saat pembacaan di instrumen qPCR. Konsentrasi pustaka
genom kentang yang dibutuhkan untuk klasterisasi yaitu minimal 2 nM yang
diencerkan ke dalam Tris-Cl 10 mM pH 8.5 dan 0.1% Tween 20 untuk mencegah
absorbsi template ke tabung saat siklus karena dapat menurunkan jumlah
klasterisasi. Genotipe PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut) memenuhi
persyaratan minimal konsentrasi untuk sekuensing, edangkan untuk genotipe
Sp010BB-3-2-2-1-B dan LK2-45 memiliki konsentrasi <2 nM, namun klasterisasi
dan sekuensing tetap dilakukan, karena konsentrasi paling minimal digunakan
yaitu 0.6 nM, 2 nM merupakan syarat yang paling baik untuk dilakukan ke proses
selanjutnya yaitu klasterisasi dan sekuensing (Lampiran 2). Proses klasterisasi
22
sendiri menggunakan pustaka DNA genom dengan konsentrasi 8 pM dan 13 pM,
hasil ini bisa diperoleh dari pengenceran stok pustaka DNA 2 nM.
Klasterisasi dan Hasil Sekuensing Genom Total DNA Jagung
Konstruksi pustaka genom yang telah dilakukan serta diuji hasilnya secara
kuantitatif dengan qPCR dan agilent bioanalyzer, kemudian diklasterisasi
menggunakan cBot Cluster Generation. Klasterisasi pustaka genom terdiri dari
lima tahapan, yaitu denaturasi, immobilisasi dan perpanjangan DNA, amplifikasi,
linearisasi dan hibridisasi (Lampiran 3). Klasterisasi ini bertujuan untuk
menghasilkan klaster atau kelompok salinan dari pustaka genom yang akan
disekuen (Mardis 2008).
Sekuensing genom total menggunakan Next Generation Sequencing
(NGS) memiliki beberapa kelebihan, diantaranya memiliki akurasi yang tinggi
yaitu 99% dan biaya yang dibutuhkan juga lebih murah dibandingkan dengan
metode Sanger. Instrumen NGS yang digunakan pada penelitian ini salah satunya
adalah HiSeq2000 (Lampiran 5). Kelebihan Hiseq2000 yaitu mampu
mengurutkan lebih dari lima genom manusia dalam 30 kali cakupan secara
bersamaan, serta mengurutkan lebih dari 192 ekspresi gen. instrument ini juga
menghasilkan 540-600 Gb dengan panjang fragmen 2 x 100 bp selama kurang
lebih 11 hari. Terdapat empat tahapan secara umum dalam sekuensing DNA
menggunakan HiSeq2000, yaitu preparasi sampel pustaka genom, klasterisasi
pustaka genom, sekuensing dan analisis data sekuens (Illumina 2010a).
Prinsip sekuensing menggunakan NGS HiSeq2000 adalah Sequencing by
Synthesis (SBS) (Lampiran 6). Selama proses sekuensing berlangsung, keempat
basa nitrogen penyusun DNA (adenin, timin, guanin dan sitosin) dialirkan secara
simultan ke dalam flow cell (Lampiran 7). Kemudian akan berikatan dengan
fragmen DNA polymerase. Secara spesifik, keempat basa tersebut membawa
penanda berupa fluorescen yang akan berpendar ketika basa-basa tersebut
berikatan membentuk utas DNA yang komplemen dengan fragmen DNA pada
klaster. Gugus 3’OH pada basa-basa tersebut mengalami modifikasi sehingga
tidak dapat berikatan dengan basa penyusunnya yang lain sebelum satu siklus
sintesis telah selesai dilakukan. Satu siklus telah selesai jika pendaran fluorescen
yang dihasilkan dari basa yang telah disintesis dideteksi oleh kamera CCD.
Kamera CCD ini akan menangkap pendaran fluorescen hasil reaksi pembentukan
utas DNA dan akan menampilkan hasilnya melalui tampilan Real Time Analysis
pada monitor NGS HiSeq2000. Berakhirnya satu siklus ditandai dengan putusnya
ikatan kimia penanda fluorescen dan gugus 3’OH termdifikasi yang selama
sintesis berikatan dengan fragmen DNA dalam klaster (Mardis 2008, Ansorge
2009, Metzker 2010).
Jumlah Basa dan Kualitas Klaster Pustaka Genom Secara Umum
Jumlah basa hasil sekuensing empat genotipe jagung ((Sp010BB-3-2-2-1-
B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut)) secara total diperoleh
sebanyak 287.1 Gbp (Tabel 8). Hasil ini memiliki kesamaan dengan jumlah basa
pada projected total yield. Projected total yield merupakan jumlah basa yang
diprediksikan selama proses sekuensing berlangsung serta hasil ini bergantung
pada tipe pembacaan basa yang dipilih selama proses sekuensing. NGS
HiSeq2000 memiliki empat tipe pembacaan yaitu single read, paired end,
23
multiplexed single read dan multiplexed paired end. Pada penelitian ini dilakukan
tipe pembacaan paired read dengan pembacaan sebanyak 200 siklus (Illumina
2010a). Yield perfect yang diperoleh selama proses sekuensing sebesar 5.1 Gbp
(Tabel 8). Nilai yield perfect menunjukan jumlah basa yang secara akurat
melewati passing filter. Passing filter merupakan sejenis algoritma yang dipakai
oleh komputer untuk menentukan kearutan pembacaan basa saat sekuensing.
Tingkat kesalahan selama proses sekuensing berlangsung dapat dilihat dari
yield <=3 errors, % perfect dan % <=3 errors. Yield <=3 errors menunjukkan
sebanyak 6.1 Gbp basa pada lajur kontrol yang memiliki tingkat kesalahan di
bawah 3 basa. Sebanyak 82% basa yang dihasilkan memiliki kesamaan dengan
sekuen PhiX pada % perfect. Sedangkan % <=3 errors menunjukkan sebanyak
97.6% dari total basa yang dihasilkan memilliki tingka kesalahan kurang dari 3
basa.
Densitas dan Kualitas Pustaka Genom pada Setiap Lajur dalam Flow Cell
Densitas atau kerapatan klaster dan kualitas selama proses sekuensing
dihitung dari proses klaster pustaka genom. Densitas klaster pustaka genom yang
dihasilkan berkisar antara 673 – 875 K/mm2 (Tabel 9). Hasil yang didapat tidak
ideal dengan Illumina (2009) yang menyatakan bahwa densitas atau kerapatan
klaster pustaka genom memiliki nilai ideal antara 400-600 K/mm2. Densitas tinggi
yang dihasilkan dapat disebabkan karena konsentrasi pustaka genom yang
digunakan pada proses klasterisasi lebih tinggi dari konsentrasi seharusnya yaitu 7
pM atau 13 pM (Quail et al. 2008). Presentase klaster PF menunjukkan kisaran
antara 87.2 - 93.3 % klaster yang melewati passing filter. Nilai ini dikategorikan
ideal karena >70% (Illumina 2009).
Kualitas hasil sekuensing juga dapat dilihat melalui presentase phasing
dan prepashing. Nilai phasing dan prepashing ini menunjukkan pembacaan basa
dari urutan salinan klaster kehilangan sinkronisasi. Presentase phasing yang
dihasilkan selama proses sekuensing berlangsung yaitu berkisar antara 0.197 –
0.209 % yang menunjukkan pada kisaran presentase tersebut pembacaan basa
berjalan lebih lambat. Sedangkan presentase prepashing berkisar antara 0.241 –
0.324 % yang menunjukkan pada kisaran presentase tersebut pembacaan basa
berjalan lebih cepat. Terjadi pashing dan prepashing ini dapat dipengaruhi oleh
aliran fluida reagen sekuensing dan reaksi kimia yang terjadi selama proses
sekuensing (Illumina 2009). Phasing ini dapat menyebabkan pada siklus
selanjutnya tidak ada penempelan basa pada klaster tersebut sehingga pendaran
fluorescen yang terbaca bukan berasal dari siklus sintesis basa yang baru
melainkan berasal dari pendaran fuorescen hasil sintesis basa sebelumnya.
Phasing dapat disebabkan karena tidak sempurnanya pemutusan ikatan kimia
penanda fuorescen pada proses terminasi gugus 3’OH dalam satu klaster.
Sedangkan prepashing disebabkan karena proses pemblokiran yang tidak efektif
saat penempelan pada basa 3’OH yang menyebabkan terjadinya penempelan dua
basa sekaligus dalam waktu yang bersamaan.
Nilai reads menunjukkan kisaran antara 186.05 – 241.86 M urutan basa
yang terbaca dalam klaster. Sedangkan reads PF menunjukkan kisaran antara
173.12 – 210.16 M urutan basa yang berhasil melewati passing filter. Perbedaan
nilai reads dengan reads PF menunjukkan tidak semua basa yang telah terbaca
selama proses sekuensing berhasil melewati passing filter. Nilai %>=Q30
24
menunjukkan kisaran antara 80.8 – 87.9 % akurasi kesalahan pembacaan hanya
terjadi pada 1 basa dari 1000 basa (Ewing & Green 1998, Voelkerderling et al.
2009). Nilai %>=Q30 paling besar pada genotipe LBP54-50 (pulut) dan
divisualisasikan melalui histogram dalam bentuk grafik (Gambar 8).
Tingkat Kesalahan (error rate) dan Intensitas Basa Hasil Sekuensing
Selama proses sekuensing berlangsung dihitung presentase kesalahan
pembacaan basa nitrogen. Hal ini dapat dilihat dari % error rate. Nilai % error
rate berada pada kisaran 0.32 – 0.51 % yang menyatakan pada kisaran presentase
tersebut terjadi kesalahan pembacaan basa antara pustaka genom dengan kontrol
(Tabel 10). Hasil tersebut menunjukkan bahwa sekuensing berjalan baik dengan
tingkat kesalahan yang kecil. Kontrol yang digunakan adalah PhiX. Hasil
sekuensing akan dibandingkan dengan sekuen PhiX pada database. PhiX
merupakan sejenis virus yang termasuk ke dalam Group II (ssDNA), Famili
Microviridae, Genus Microvirus dan spesies Fage PhiX174. PhiX yang digunakan
sebagai kontrol memiliki beberapa keunggulan, yaitu mempunyai ukuran genom
yang kecil, mengandung komposisi basa dan penyusun genom yang beragam
(45% GC dan 55% AT) dan memiliki urutan genom yang telah diketahui secara
lengkap (Kircher et al. 2011, Illumina 2012).
Basa adenin, timin, guanin dan sitosin yang dihasilkan selama proses
sekuensing dihitung intensitas setiap siklusnya. Intensitas basa-basa nitrogen
dideteksi melalui hasil pendaran fluorescen yang dihasilkan dari sintesis basa
selama proses sekuensing berlangsung. Secara keseluruhan, intensitas basa-basa
nitrogen setiap siklus dapat dilihat pada Gambar 10. Basa-basa nitrogen memiliki
intensitas antara 3695 – 4022 basa (Tabel 10). Kisaran tersebut bernilai ideal,
karena nilai intensitas yang ideal selama proses sekuensing sebesar 1000 (Illumina
2009). Nilai intensitas basa yang kecil dapat disebabkan oleh beberapa hal,
diantaranya klaster pustaka genom yang dihasilkan selama proses bridge
amplification, ukuran pustaka genom yang terlalu panjang, penempelan primer
yang tidak efisien, aktivitas enzim polimerase yang tidak optimal dan terjadi
gangguan dalam pendeteksian pendaran fluorescen (Kircher et al. 2011).
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Pada penelitian ini, pustaka genom empat genotipe jagung (Sp010BB-3-2-
2-1-B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut)) berhasil dikonstruksi
dan telah memenuhi persyaratan untuk sekuensing genom total menggunakan
Next Generation Sequencing HiSeq2000. Jumlah basa yang dihasilkan selama
proses sekuensing yaitu sebanyak 287.1 Gbp. Klaster pustaka genom yang
dihasilkan dengan nilai Q scores di atas 30 berkisar antara 80.8 – 87.9 %. Tingkat
kesalahan pembacaan basa selama proses sekuensing berkisar antara 0.32 –
0.51%. Nilai densitas, klaster, % klaster PF, intensitas basa, % phasing dan %
prepashing yang dihasilkan selama proses sekuensing menunjukkan bahwa
kualitas klaster pustaka genom termasuk kategori ideal.
25
Saran
Pada penelitian selanjutnya, analisis bioinformatika perlu dilakukan untuk
menyusun basa-basa hasil sekuensing pustaka genom menjadi urutan basa genom
jagung yang utuh dan runut.
DAFTAR PUSTAKA
Agilent Technologies. 2003. Agilent 2100 Bioanalyzer 2100 expert user’s guide.
Deutchland (US): Agilent Technologies Inc.
Azrai M. 2004. Penampilan Varietas Jagung Unggul Baru Bermutu Protein Tinggi
di Jawa dan Bali. Buletin Plasma Nutfah. 10:49-50.
Badan Pusat Statistik. 2013. Produksi Padi, Jagung dan Kedelai (Angka Ramalan
I Tahun 2013). No. 45/07/ Th. XVI
Bintang M. 2010. Teknik Penelitian Biokimia. Jakarta: Erlangga.
Brown TA. 2007. Gene Cloning and DNA Analysis : An Introduction. Sixth
Edition. New York: John Wiley and Sons.
CABI. 2004. Crop protection compendium. 2004 edition
Clark W, Chistopher K. 2008. An Introduction to DNA: Spectrophotometry,
Degradation, and the 'Frankengel' Experiment. Tested studies for
laboratory teaching (22): 81-99.
Commins et al. 2011. Computational biology methods and their application to the
comparative genomics of endocellular symbiotic bacteria of insect.
Biological Procedures Online 11(1): 52-78.
Covaris. 2012. DNA-RNA shearing for Nex-Gen Sequencing.
http://covarisinc.com/applications/dnarna-shearing-for-NGS[I [Internet].
Akses 01 Juli 2014.
Doyle J.J. and J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small
quantities of fresh leaf tissue. Phytochem. Bull. 19: 11-15
Franca Lilian TC, Carrilho Emanuel, Kist Tarso BL. 2002. A review of DNA
sequencing techniques. Quaterly Reviews of Biophysics 35(2) : 169-200.
Illumina. 2009. Sequencing Analysis Software : User Guide. San Diego : Illumina
Inc.
Illumina. 2010a. HiSeq Sequencing Systems. San Diego : Illumina Inc.
Illumina. 2010b. cBot Quick Reference Guide. San Diego : Illumina Inc.
Illumina. 2010c. TruSeq DNA-Sample Preparation Low Throughput (LT
Protocol). San Diego (US) : Illumina Inc.
Illumina. 2011. HiSeq 2000 Quick Reference Guide. San Diego : Illumina Inc.
26
Illumina. 2012. Using PhiX Control for HiSeq® Sequencing Runs. San Diego
(US) : Illumina Inc.
Invitrogen. 2010. Qubit 2.0 Fluorometer-Catalog no. Q32866. California (US):
Invitrogen Life Technologies.
Kircher M, Heyn P, Kelso J. 2011. Addressing challanges in the production and
analysis of illumina sequencing data. BMC Genomics 12: 382-396.
Kosasih A. 2012. Konstruksi Dan Analisis Kualitas Pustaka Genom Kedelai
(Glycine Max (L.) Merr.) untuk Sekuensing Genom Total [Skripsi]. Bogor
(ID), Institut Pertanian Bogor.
Mardis ER. 2008. Next generation DNA sequencing methods. The Annual Review
of Genomics and Human Genetics 9 :387- 402.
Margulies M, Egholm M, Altman WE et al.2005. Genome sequencing in open
microfabricated high density picoliter reactors. Nature 437(7057) : 376-
380.
Metzker ML. 2010. Sequencing technologies the next generation. Nature Review
11. 31- 46.
Michiels AN, Ende WVD, Tucker M, Riet L, Laere V. 2003. Extraction of high
quality genomic DNA from latex containing plants. Analytical
Biochemistry 315 : 85-89.
Poirel L. Naas T. Nordmann P. 2006. Pyrosequencing as a rapid tool for
identification of GES-Type Extended-Spectrum lactamase. J.Clin
Microbiol 44(8) :3008-3011.
Prasanna B. M., S. K. Vasal. B. Kassahun dan N. N. Singh. 2001. Quality Protein
Maize. Current Science. 81: 1308-1319.
Sambrook J, Russel DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Edisi
ke-3. New York: Cold-Spring Harbor Laboratory Pr.
Schuster Stephan C. 2008. Next generation sequencing transform today’s biology.
Nature Method 5(1) : 16-18.
Sigma. 2008. qPCR Technical Guide. St. Louis (US): Sigma-aldrich, Inc.
Subandiyah S. 2006. Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi atau Identifikasi
Patogen Tumbuhan. Beberapa Metode Ekstraksi DNA. Pelatihan dan
Workshop Identifikasi DNA dengan Aplikasi PCR. Malang. hlm. 43-50.
Suharsono. 2002. Konstruksi Pustaka Genom Kedelai Kultivar Slamet. Hayati 9
(2): 67-70.
Telle S., R.G. Shivas, M.J. Ryley, and M. Thines. 2011. Molecular phylogenetic
analysis of Peronosclerospora (Oomycetes) reveals cryptic species and
genetically distinct species parasitic to maize. Eur. J. Plant Pathol.
130:521-528.
Voelkerding KV, Dames SH, Durtschi JD. 2009. Next generation sequencing :
from basic research to diagnostics. Clinical chemistry 55: 41-47.
27
Wahyudi AT. 2001. Perpustakaan gen : Bagaimana mengontruksinya? [ulasan].
Hayati 8: 27-30.
Wakman W. dan A. Hasanuddin. 2003. Penyakit bulai (Peronosclerospora
sorghi) pada jagung di dataran tinggi Karo Sumatera Utara. Makalah
disajikan pada Seminar Nasional Perhimpunan Fitopatologi Indonesia
(PFI) di Bandung.
Wakman W. 2004. Penyakit bulai pada tanaman jagung di Indonesia: masalah,
penelitian dan cara mengatasinya. Prosiding Seminar Tahunan PFI Komda
Sulsel.
Walker JM, Wilson K. 2000. Principles and Techniques of Practical
Biochemistry. UK: Cambridge University Press.
Westermeier. 2004. Electrophoresis in Practice: A Guide to Theory and Practice.
New Jersey: John Wiley & Sons inc.
Wulandari YRE. 2009. Konstruksi pustaka genom Tibouchina langsdorffiana
Baill [Tesis]. Bogor : Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Yen TTO, BM Prasanna, TAS Setty dan R.S. Rathore. 2004. Genetic variability
for resistance to sorghum downy mildew (Peronosclerospora sorghi) and
Rajasthan downy mildew (P.heteropogoni) in the tropical/sub-tropical
Asian maize germplasm. Euphytica 138:23-31.
28
Lampiran 1 Strategi penelitian
Isolasi DNA Jagung
Konstruksi genom jagung
(covaris, fragmentasi DNA, preparasi fragmen DNA cetakan, modifikasi ujung
fragmen DNA, adenilasi ujung 3’ DNA, penempelan adaptor, amplifikasi fragmen
DNA, Analisis pustaka genom)
Klaterisasi DNA
Sekuensing DNA
Analisis Sekuensing
29 Lampiran 2 Hasil Analisis pustaka genom secara kuantitatif dengan qPCR
Genotipe Ct
Qty
[Ukuran [Stok Pustaka
StdDev Rerata StdDev Faktor Ukuran Kesesuaian] tanpa [Stok
Ct Qty Qty Pengenceran fragmen (pM) pengenceran] rerata]
(nM) (nM)
JagungSp010-R1 15.58 0.062 7.63E-01 7.87E-01 3.35E-02 1000 658 0.39 0.39
0.39
JagungSp010-R1 15.49 0.062 8.10E-01 7.87E-01 3.35E-02
JagungSp010-R2 16.38 0.102 4.41E-01 4.21E-01 2.94E-02 2000 658 0.21 0.42
JagungSp010-R2 16.53 0.102 4.00E-01 4.21E-01 2.94E-02
JagungSp010-R3 17.82 0.139 1.66E-01 1.78E-01 1.68E-02 4000 658 0.09 0.35
JagungSp010-R3 17.62 0.139 1.89E-01 1.78E-01 1.68E-02
JagungLK2-45-R1 15.3 0.077 9.21E-01 9.57E-01 4.99E-02 1000 638 0.46 0.46
0.45
JagungLK2-45-R1 15.2 0.077 9.92E-01 9.57E-01 4.99E-02
JagungLK2-45-R2 16.12 0.135 5.27E-01 4.80E-01 4.45E-02 2000 638 0.23 0.46
JagungLK2-45-R2 16.27 0.135 4.75E-01 4.80E-01 4.45E-02
JagungLK2-45-R2 16.39 0.135 4.38E-01 4.80E-01 4.45E-02
JagungLK2-45-R3 17.44 0.026 2.14E-01 2.18E-01 3.87E-03 4000 638 0.1 0.42
JagungLK2-45-R3 17.42 0.026 2.18E-01 2.18E-01 3.87E-03
JagungLK2-45-R3 17.39 0.026 2.22E-01 2.18E-01 3.87E-03
JagungPSG-R1 12.21 0.269 7.6 9.24 1.69 1000 970 4.31 4.31
4.12
JagungPSG-R1 11.67 0.269 10.98 9.24 1.69
JagungPSG-R1 11.94 0.269 9.14 9.24 1.69
JagungPSG-R2 12.94 0.103 4.62 4.34 3.04E-01 2000 970 2.02 4.04
JagungPSG-R2 13.02 0.103 4.38 4.34 3.04E-01
JagungPSG-R2 13.14 0.103 4.02 4.34 3.04E-01
29
30
JagungPSG-R3 14.12 0.069 2.06 2.15 1.02E-01 4000 970 1 4.01
JagungPSG-R3 13.99 0.069 2.26 2.15 1.02E-01
JagungPSG-R3 14.08 0.069 2.13 2.15 1.02E-01
LPB54-R1 12.62 0.284 8.61 8.85 1.782 1000 658 6.08 6.08
5.77
LPB54-R1 12.88 0.284 7.19 8.85 1.782
LPB54-R1 12.31 0.284 10.73 8.85 1.782
LPB54-R2 13.8 0.101 3.76 3.98
2.88E-
001 2000 658 2.73 5.47
LPB54-R2 13.76 0.101 3.86 3.98
2.88E-
001
LPB54-R2 13.6 0.101 4.3 3.98
2.88E-
001
30
31
Lampiran 3 Tahapan klasterisasi pustaka genom (Illumina 2010)
Proses klasterisasi pustaka genom yang terjadi pada permukaan flow cell: (a) Immobilisasi dan perpanjangan DNA, (b) amplifikasi DNA
dengan prinsip bridge amplification, (c) liniearisasi dan hibridiasi
31
35
Lampiran 7 Grafik jumlah densitas klaster setiap lajur
Keterangan:
: Densitas klaster
: Klaster PF (passing filter)
: Median klaster
36
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bekasi pada tanggal 27 Juli 1993 dari ayah Herman Kiki
Ahyad dan ibu Jamilah. Penulis merupakan putri pertama dari ketiga bersaudara.
Penulis sekolah di SMA Negeri 1 Cikarang Utara dan lulus dari SMA
tersebut pada tahun 2010 dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB
melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis memilih mayor
Biokimia, Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam dan minor Komunikasi, Departemen Sains dan Komunikasi Pengembangan
Masyarakat, Fakultas Ekologi Manusia.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum
Biokimia Umum untuk mahasiswa Biologi 2013/2014 pada semester ganjil dan
mahasiswa Kedokteran Hewan 2013/2014 pada semester genap. Penulis juga aktif
dalam kegiatan kemahasiswaan di IPB, seperti mengikuti Unit Kegiatan
Mahasiswa (UKM) Agriaswara sebagai anggota dan pengurus serta aktif dalam
Himpunan Profesi Community of Research and Education in Biochemistry
(CREBs) sebagai staf divisi Creativity Core pada tahun 2011/2012 serta sebagai
staf Biro Fundrising pada tahun 2012/2013.
Penulis juga pernah aktif dalam berbagai kegiatan di kampus, diantaranya
menjadi Ketua Divisi Acara Biochemistry Champion League di Departemen
Biokimia Tahun 2012. Penulis juga aktif menjadi Steering Committee di beberapa
kegiatan kemahasiswaan, seperti SPIRIT pada tahun 2011, Seminar Nasional
Kesehatan pada tahun 2012, Masa Perkenalan Departemen Biokimia 2012.
Penulis juga beberapa kali menjadi Master of Ceremony pada Masa Perkenalan
Departemen Biokimia 2012, Lomba Karya Ilmiah Pelajar pada tahun 2012 dan
2013 dan Siang Keakraban Biokimia pada tahun 2014. Penulis pernah melakukan
Praktik Lapangan (PL) di Balai Besar Pasca Panen Jl. Tentara Pelajar no 12A,
Cimanggu, Bogor dengan judul Pembuatan dan Karakterisasi Sifat Fisikokimia
Gelatin dari Kulit Kaki Ayam.