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Knowledgeによる疾患標的探索と既存薬の再検証

1

2015年10月29日（木）

CBI 学会 2015年大会ランチョンセミナー


ランチョンセミナーの内容

• LSKBとは

• Driver Geneを探す

– 発現解析から遺伝子の優先順位付

– Variant解析

• 疾患から治療標的と阻害・結合化合物などの探

索

• 化合物構造からのターゲット探索

2


LSKBとは

3


60 種以上のデータを約 1000 ステップの処理でデータベースを構築

LSKB データベース概要

化合物と遺伝子やタンパク質との相互作用

7500万件の重複を除いた構造とアノテーション

購入可能な ZINC の化合物情報を含む

年3回のアップデートと機能更新

要望の多いカスタム機能の追加が可能

Interactions

Phenotypes &

Functions


構造データベースと Molecular Framework

LSKB では重複を除いた構造データベースを構築し、molecular frameworkを保有しています。

LSKB では最大のmolecular frameworks のみならず部分的な frameworkも保持しています。 LSKBでは構造検索に1) exact match, 2) similarity search 3) substructure search に加えて 4) molecular framework search が可能です。

多様な確度の構造を組み合わせて統合的なナリッジにアクセスできます。

Patented 3rd Party

Patent

PDB

ZINC

ChEMBL

PubChem

Public Data source

Dictionary

Literature

Keywords

Annotation

Non-Redundant

Structures

Structure Search

Keyword Search

PDB Ligand

ZINC

ChEMBL

Chem in

Literature

PubChem

Import by customer

75M compounds

・・・



• LSKBとは


– 発現解析から標的遺伝子の優先順位付

• 疾患から治療標的と阻害・結合化合物などの探索


6


Driver Geneを探す発現解析から標的遺伝子の優先順位付

Expressionアノテーター

7


この過程でタンパク質と活性

化合物の情報を付与する

遺伝子と関係がある活性化合物を取得 ⇒化合物による活性制御が可能な遺伝子(タンパク)を特定

1, 実測されたアッセイ情報を用いて遺伝子の化合物標的としての評価を迅速化 2, in vitro assayに用いる化合物の探索を通じてGene-Phenotype間の相関解析 3,情報の少ない遺伝子・タンパクの機能を結合化合物の作用から推定 Human Transcript

RNA-Seq

FDR<0.05, Fold change>±2

400

Annotation filter

?

RNA-Seq


500

400

Human Ortholog Gene

Annotation filter

?


Mouse, Rat, Zebrafish etc

Transcript

9


Pathway & GO

アノテーション情報付与

10

RNA-seq Microarry 解析データ



早期のびまん型強皮症（diffuse SSc） RNA-Seq

サンプルレイノー症状を伴わない早期のびまん型強皮症（diffuse SSc）発症患者4名の病変前腕皮膚および健常人4名の正常皮膚からRNA シーケンサー Illumina HiSeq 2000 リード 50 bp paired-end

レイノー症状：冷たいものに触れると手指が蒼白～紫色になる症状

出典：難病情報センター：http://www.nanbyou.or.jp/entry/75

強皮症（ scleroderma ）全身の皮膚が硬くなる他、内臓にも病変を発症する原因不明の慢性疾患である。古典的五大膠原病のひとつ。病因全身性強皮症では3つの異常が病因と深く関連していると考えられている。 (1)線維芽細胞の活性化（その結果、膠原線維が多量に産生され、皮膚や内臓の硬化が生じる）、 (2)血管障害（その結果、レイノー症状や指尖部の潰瘍などが生じる）、 (3)免疫異常（その結果、自己抗体が産生される）。

解析例

11


有意差検定（EdgeR）

発現解析発現解析

解析ステップ

マッピング

Fastq

マッピング

Fastq

Expression アノテーター


1693

Annotation filter

?

Diffuse SSc (n=4） Control (n=4）

UP:918

Down:478

解析例

GO

pathway

12

NGS 基本

パイプライン


解析結果1 Top 10 Gene ontology (GO) enrichment analysis

Accession GO Term Count P-value

5515 protein binding 327 1.06E-74

8201 heparin binding 34 4.44E-28

5509 calcium ion binding 62 2.83E-25

4872 receptor activity 36 8.25E-24

5201 extracellular matrix structural constituent 21 8.56E-22

5102 receptor binding 38 2.64E-20

5178 integrin binding 22 1.41E-17

8009 chemokine activity 16 1.05E-16

5518 collagen binding 16 4.65E-15


6954 inflammatory response 71 3.65E-55 30198 extracellular matrix organization 68 2.10E-52

6955 immune response 70 3.33E-52 45087 innate immune response 88 1.24E-46

7165 signal transduction 103 1.26E-46 7155 cell adhesion 68 3.70E-42

22617 extracellular matrix disassembly 35 5.56E-33 6935 chemotaxis 31 3.62E-27

30574 collagen catabolic process 26 1.04E-26 7267 cell-cell signaling 39 1.75E-25


5576 extracellular region 195 4.30E-112 5615 extracellular space 167 6.71E-99 5886 plasma membrane 257 2.39E-82

70062 extracellular vesicular exosome 195 3.56E-62

5887 integral component of plasma membrane

107 1.67E-45

31012 extracellular matrix 48 2.35E-42

16021 integral component of membrane 190 6.90E-37

5578 proteinaceous extracellular matrix 45 4.93E-33

9986 cell surface 60 4.62E-32

5829 cytosol 140 9.31E-30

●Cellular Component

● Biological Process

● Molecular Function

解析例

13


解析結果2 Reactome Pathway

BSID Name Count No of

Genes in Pathway

730306 Assembly of collagen fibrils and other multimeric structures 21 55

730309 Collagen degradation 12 39

771578 FCGR activation 11 36

645288 Collagen formation 26 88

645289 Collagen biosynthesis and modifying enzymes 19 65

106359 Chemokine receptors bind chemokines 16 60

106406 Initial triggering of complement 11 42

119557 PD-1 signaling 8 31

106110 Integrin cell surface interactions 17 66

106405 Complement cascade 15 60

187104 Interferon alpha/beta signaling 17 69

730310 Elastic fibre formation 10 41

105697 NCAM1 interactions 9 37

576262 Extracellular matrix organization 63 266

106407 Creation of C4 and C2 activators 8 35

解析例

14


GO解析ならびにPathway解析の結果、コ

ラーゲン合成系と分解系に関連する遺伝子

群が変動しているとことが推測された。

それに着目して、化合物による活性制御が

可能な遺伝子(タンパク)を特定をおこなった。

解析例

15


コラーゲン合成系と分解系に関連している変動遺伝子遺伝子リスト

ChEMBL AssayでpAct >= 5のInhibtor

遺伝子ごとに活性値を伴った化合物情報が表示される

pAct=活性値の-log

解析例

16


コラーゲン合成系と分解系に関連する発現変動遺伝子

ChEMBL Assay

Entrez GeneID Gene Symbol UniProt Entry

Name Target ID and Name #Activities

#Inhibitors (pAct>5)

#Binders (pAct>5)

4312 MMP1 MMP1_HUMAN CHEMBL332 Matrix metalloproteinase-1

6350 2102 18

1514 CTSL CATL1_HUMAN CHEMBL3837 Cathepsin L

2185 1009 0

4319 MMP10 MMP10_HUMAN CHEMBL4270 Matrix metalloproteinase 10

48 12 0

4067 LYN LYN_HUMAN CHEMBL3905 Tyrosine-protein kinase Lyn

2868 175 42


1357 870 0

1508 CTSB CATB_HUMAN CHEMBL4072 Cathepsin B

2010 726 2

8754 ADAM9 ADAM9_HUMAN CHEMBL5982 ADAM9

49 33 0

1520 CTSS CATS_HUMAN CHEMBL2954 Cathepsin S

2202 1478 48


2815 1574 3


9 5 0

1513 CTSK CATK_HUMAN CHEMBL268 Cathepsin K

2202 1464 0

解析例

化合物アッセイ情報がある遺伝子：11

MMP Family：5

17


Gene ID Symbol Gene Name Fold

change FDR

4312 MMP1 matrix metallopeptidase 1 (interstitial collagenase) 790.73 1.28E-17

4314 MMP3 matrix metallopeptidase 3 (stromelysin 1, progelatinase) 14.32 8.01E-03

4317 MMP8 matrix metallopeptidase 8 (neutrophil collagenase) 9.09 4.47E-03

4319 MMP10 matrix metallopeptidase 10 (stromelysin 2) 12.79 3.97E-04

4320 MMP11 matrix metallopeptidase 11 (stromelysin 3) 7.53 1.79E-02

MMP (マトリックスメタロプロテアーゼ)

diffuse SScで発現↑していたMMP

変動が大きいMMP1 をターゲットとする化合物と

これらのマルチターゲットを対象とする化合物の

探索を行った

解析例

18


MMP1は、interstitial collagenase とも呼ばれる各種癌や変形性関節症の標的にもなりうるタンパク質

MMP1 (diffuse SScで発現↑)の活性

を阻害する化合物のリスト

購入可能な化合物：40

Drug：13

解析例

19


MMP Family をターゲットとする化合物

SSCにおいて発現が上昇した

MMPをマルチターゲットとシ

ングルターゲットの阻害活性

化合物を探索可能

解析例

20


Driver Geneを探す

21

Expression data

Gene Function

Pathway

Active Compounds

Disease

Driver Gene

Candidate

Assay



• LSKBとは





22


疾患から治療標的と阻害・結合

化合物などの探索

Disease Suite

Known/unknown

therapeutic target

Gene/Protein

23


Disease Suite

24

Summary: • Disease Classification • Clinical Trial • Therapeutic Target

• Synonyms • Symptom • Rare Disease • Drug & Candidates

Gene: • Text-Mining • Known Target • Gene Expression

• Active Compounds

Protein: • Known Target • Related PDB • Active Compounds

SNP: • dbSNP • ClinVar • Known Related

Diseases • 3D Viewer for SNP

Position

Related Drug: • ATC • ICD10 • Considerable Target

• Clinical Trial Stage


疾患から治療標的と阻害・結合化合物などの探索

Disease

Gene

SNPs

Drug

Micro organism

Therapeutic Target

Candidate

Active Compounds

Protein

Drug/Clinical Trials

Gene Expression

SRA



• LSKBとは



– Variant解析



– 構造検索

– Target Prediction

– Target Confirmation

26


Unique Structure Search in LSKB

• Exact Match

• Similarity Search

• Substructure Search

• Molecular Framework Search

-> Target Prediction

27


Molecular Framework – Chemical Structure

28

Tyrosine-protein kinase ITK/TSK

Hepatitis C

virus

Lysyl-tRNA synthetase

mTOR

4jt5


Target Prediction

• 化合物構造による Target Prediction: – 化合物の類似性 – アッセイの標的タンパク質とその活性値を利用

– molecular framework によるフィルタリング

– 予測値の算出：similarity による加重平均

– “binding” assays において活性値の決まったデータを利用:

• 140万化合物

• 5500 の標的タンパク質

• 500万相互作用

• 予測精度予測範囲の拡大

– LSKB のアップデートと同時に参照する化合物・タンパク質・アッセイデータ数が増加

29


Ex1) Antifungal Active Compound: Arasertaconazole

Predicted Value

The Evidence

Predicted ADME-related target

30


Ex 3) Novel Sigma1 Receptor Antagonists

J Med Chem. 2015 Mar 12;58(5):2441-51. doi: 10.1021/jm501920g. Epub 2015 Feb 19.

LSKB predicted correct targets with high accuracy to structures on latest publication.

Sigma1 receptor

Compound Ki (nM) (paper result) "-LOG(Ki)" Predicted(40%) (LSKB result) Diff

1 17 7.77 7.59 -0.18

2 10 8.00 7.62 -0.38

3 39 7.41 7.62 0.21

12a 5 8.30 7.8 -0.50

12b 31 7.51 7.73 0.22

12h 46 7.34 7.66 0.32

12i 781 6.11 7.6 1.49

13b 10 8.00 7.98 -0.02

13g 61 7.21 7.65 0.44

Ave 0.18

SD 0.59

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Synthesis+and+Structure%E2%88%92Activity+Relationship+Study+of+a+New+Series+of+Selective+%CF%83+1+Receptor+Ligands+for+the+Treatment+of+Pain:+4%E2%80%91Aminotriazoles


For Drug Repositioning for Alzheimer's Disease

Nimodipine

32

Acitretin

A4_HUMAN

BACE1_HUMAN

G3P_HUMAN

PGH1_HUMAN

PGH2_HUMAN

TAU_HUMAN

Alzheimer's disease

CAC1C_HUMAN

CAC1D_HUMAN

CAC1F_HUMAN

Q59GD8_HUMAN

Q59GU3_HUMAN

Q5V9X9_HUMAN

Alzheimer's disease

CAN1_HUMAN Alzheimer's disease

Minocycline

Predicted Target Pathway Disease

Candidates : Pharmaceuticals 2013, 6, 1304-1321

Alzheimer's disease

Alzheimer's disease

Alzheimer's disease

http://192.168.10.37:8080/lskb500/servlet/ChemicalSynonymList?chemid=110363528

http://192.168.10.37:8080/lskb500/servlet/SprotInfo?EntryName=A4_HUMAN

http://192.168.10.37:8080/lskb500/servlet/SprotInfo?EntryName=BACE1_HUMAN

http://192.168.10.37:8080/lskb500/servlet/SprotInfo?EntryName=G3P_HUMAN

http://192.168.10.37:8080/lskb500/servlet/SprotInfo?EntryName=PGH1_HUMAN

http://192.168.10.37:8080/lskb500/servlet/SprotInfo?EntryName=PGH2_HUMAN

http://192.168.10.37:8080/lskb500/servlet/SprotInfo?EntryName=TAU_HUMAN

http://192.168.10.37:8080/lskb500/servlet/SprotInfo?EntryName=CAC1C_HUMAN

http://192.168.10.37:8080/lskb500/servlet/SprotInfo?EntryName=CAC1D_HUMAN

http://192.168.10.37:8080/lskb500/servlet/SprotInfo?EntryName=CAC1F_HUMAN

http://192.168.10.37:8080/lskb500/servlet/TrEmblInfo?EntryName=Q59GD8_HUMAN

http://192.168.10.37:8080/lskb500/servlet/TrEmblInfo?EntryName=Q59GU3_HUMAN

http://192.168.10.37:8080/lskb500/servlet/TrEmblInfo?EntryName=Q5V9X9_HUMAN

http://192.168.10.37:8080/lskb500/servlet/SprotInfo?EntryName=CAN1_HUMAN


Target Confirmation

• Target Confirmation ：共通部分構造から標的タンパク質へ – 共通部分構造 – 標的タンパク質とその活性値を利用

– “binding” assays において活性値の決まったデータを利用:

• 140万化合物

• 5500 の標的タンパク質

• 500万相互作用

• 予測精度予測範囲の拡大

– LSKB のアップデートと同時に参照する化合物・タンパク質・アッセイデータ数が増加

33


Target Confirmation Example

34

COAGULATION FACTOR X

Ki = 9.05 Ki = 4.70 IC50 = 8.12

C-JUN N-TERMINAL KINASE 3

IC50 = 7.85 IC50 = 7.28

SEROTONIN TRANSPORTER

Ki = 7.60 IC50 = 7.40 Ki = 8.64

IC50 = 5.91

161 Targets


化合物構造からのターゲット探索

35

Structure

Molecular Framework

Target Prediction

Target Confirmation

Target Candidate

Lead Hopping

Drug Repositioning

Structure Search


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• Genome Variants and Protein Modifications

• Therapeutic Target Discovery

• Drug Target Discovery

• On/Off Target Discovery

• Diagnostics

• Microbiome

• Metabolome

• Transcriptome

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