i

İÇİNDEKİLER DİZİNİ Sayfa İÇİNDEKİLER DİZİNİ ............................................................................................. i 

ÖZET ...................................................................................................................... iii 

ABSTRACT ............................................................................................................. iv 

TEŞEKKÜR .............................................................................................................. v 

ŞEKİLLER DİZİNİ .................................................................................................. vi 

ÇİZELGELERİ DİZİNİ .......................................................................................... vii 

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ.......................................................... viii 

1.  GİRİŞ .................................................................................................................... 1 

2.  KAYNAK ÖZETLERİ ......................................................................................... 3 

2.1.  Çimlendirme Çalışmaları ................................................................................. 9 

2.2.  Kotiledon Çalışmaları .................................................................................... 11 

2.3.  Yaprak Çalışmaları ........................................................................................ 13 

3.  MATERYAL VE YÖNTEM ............................................................................. 17 

3.1.  Materyal ......................................................................................................... 17 

3.1.1. Bitkisel materyal ............................................................................................ 17 

3.1.1.1.  ‘0900 Ziraat’ ............................................................................................. 18 

3.1.1.2.  ‘Sweetheart’ .............................................................................................. 18 

3.1.2.  Besin ortamı ................................................................................................ 19 

3.2.  Yöntem .......................................................................................................... 20 

3.2.1.  Kültür odası şartları ..................................................................................... 21 

3.2.2.  Çimlendirme denemeleri ............................................................................. 21 

3.2.2.1.  Tohumların toplanması ve eksplant hazırlanması ..................................... 21 

3.2.2.2.  Katlama uygulaması .................................................................................. 23 

3.2.3.  In vitro çimlendirme denemeleri ................................................................. 24 

3.2.4.  Kotiledon eksplantından rejenerasyon denemeleri ..................................... 25 

3.2.4.1.  Tohumların toplanması ve eksplant hazırlanması ..................................... 25 

3.2.4.2.  Karanlık uygulamasının rejenerasyona etkisi ........................................... 27 

3.2.4.3.  TDZ ile ön muamelenin rejenerasyona etkisi ........................................... 27 

3.2.5.  Yaprak eksplantından rejenerasyon denemeleri .......................................... 27 

3.2.5.1.  Yaprakların toplanması ve eksplant hazırlanması .................................... 27 

ii

3.2.5.2.  Bitki büyümeyi düzenleyicilerin rejenerasyona etkilerinin belirlenmesi . 28 

3.2.5.3.  Karanlık uygulamasının rejenerasyona etkisi ........................................... 29 

3.2.6.  Deneme deseni ve istatistiki analiz ............................................................. 30 

4.  ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA................................................. 31 

4.1.  Çimlendirme Denemeleri .............................................................................. 31 

4.1.1.  Katlama uygulaması .................................................................................... 31 

4.1.1.1.  Tohum kabuğuyla katlama uygulaması .................................................... 31 

4.1.1.2.  Tohum kabuğu kırılarak katlama uygulaması ........................................... 31 

4.1.2.  In vitro çimlendirme denemeleri ................................................................. 32 

4.2.  Kotiledon Eksplantından Rejenerasyon Denemeleri ..................................... 33 

4.2.1.  Karanlık uygulamasının rejenerasyona etkisi ............................................. 35 

4.2.2.  TDZ ile ön muamelenin rejenerasyona etkisi ............................................. 35 

4.3.  Yaprak Eksplantından Rejenerasyon Denemeleri ......................................... 36 

4.3.1.  Bitki büyüme düzenleyicilerin rejenerasyona etkisi ................................... 36 

4.3.2.  Karanlık uygulamasının rejenerasyona etkisi ............................................. 37 

5.  SONUÇ .............................................................................................................. 40 

6.  KAYNAKLAR ................................................................................................... 42 

ÖZGEÇMİŞ ............................................................................................................ 50 

iii

ÖZET

Yüksek Lisans Tezi

KİRAZIN (Prunus avium L.) in vitro REJENERASYONU VE

ÇİMLENDİRİLMESİ

Nurettin TEMURTAŞ

Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü

Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı

Danışman: Doç. Dr. Fatih Ali CANLI

Bu tez çalışması ile ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ kiraz çeşitlerinin yapraklarından ve olgun

kotiledonlardan yüksek frekanslı in vitro rejenerasyon protokolü ve ıslah çalışmalarında

kullanılmak üzere yüksek çimlenmeye imkân sağlayan bir in vitro çimlendirme protokolü

geliştirilmesi amaçlanmıştır. Çimlendirme denemelerinde in vitro (Agar, Agar+ 1 mgl-1 BA,

WPM, WPM+ 1 mgl-1 BA ve WPM+ 1 mgl-1 BA+ 0,5 mgl-1 GA3) ile katlama uygulaması

kıyaslanmıştır. WPM+BA+GA3 ortamına ekilen tohumlar iki çeşitte de %69,8 çimlenme

yüzdesiyle en başarılı sonucu vermiştir. Çıtlatılarak katlanan tohumların çıkış yüzdeleri

‘Sweetheart’ çeşidinde % 42 olurken, ‘0900 Ziraat’ çeşidinde bu oran % 12,5 olmuştur.

Kotileden eksplantlarından rejenerasyon denemelerinde 1mgl-1 TDZ ve 0,1 mgl-1 NAA ilave

edilerek hazırlanan WPM ortamı kullanılmıştır. Karanlık uygulamasının (5, 10, 15 gün)

rejenerasyona etkisi araştırılmıştır. ‘0900 Ziraat’ için % 26,3 rejenerasyon oranı ile 10 gün

karanlık uygulaması, ‘Sweetheart’ için % 15,8 rejenerasyon oranı ile 5 gün karanlık

uygulaması en iyi sonucu vermiştir. Yine 0,8 mgl-1 TDZ ile 4 ve 8 saat ön muameleye

tutulması da incelenen konular arasındadır. Her iki uygulamanın da rejenerasyona olumlu

etkileri olmuş ve istatistikî açıdan önemli bulunmuştur. Yaprak eksplantlarından bitki eldesi

için WPM ortamına TDZ’nin 0,5, 1 ve 1,5 mgl-1 dozlarının eklenmesi çalışılmıştır. Sürekli

aydınlık altına konulan eksplantlar, 10 gün karanlık uygulamasıyla kıyaslanmıştır. Çalışma

sonucunda oluşan kallusların çapları ölçülmüş, analiz sonucu kallus çapları arasında fark

önemli bulunmuştur. Ancak yaprak eksplantından yeni bitki elde edilememiştir.

Anahtar Kelimeler: P.avium L., rejenerasyon, çimlendirme, karanlık, TDZ, WPM

2011, 50 sayfa

iv

ABSTRACT

M. Sc. Thesis

IN VITRO REGENERATION AND GERMINATION OF SWEET CHERRY (Prunus avium L.)

Nurettin TEMURTAŞ

Süleyman Demirel University

Graduate School of Applied and Natural Sciences Horticulture Department

Supervisor: Doç. Dr. Fatih Ali CANLI

The objective of this thesis was to develop high frequency in vitro regeneration protocol

from sweet cherry leaves and cotyledon explants. Another aim of the thesis was to develop

an in vitro germination protocol for breeding studies. Seeds of ‘0900 Ziraat’ and

‘Sweetheart’ sweet cherry varieties, mature cotyledon and leaf explants were used in the

regeneration studies. Explants were taken from Eğirdir Horticulture Research Institute

different media, different concentrations of plant growth regulators and pre-soaks on

regeneration were investigated. Germination media were Agar, Agar+ 1 mgl-1 BA, WPM,

WPM+1 mgl-1 BA, WPM+ 1 mgl-1 BA+ 0,5 mgl-1 GA3. These conditions were compared by

seeds which were crached and non-crached stored at +4 ºC for 120 days. Seeds resulted best

in WPM+ 1 mgl-1 BA+ 0,5 mgl-1 GA3 media ‘Sweetheart’ variety germinated 69,8% and

’0900 Ziraat’ variety germinated 69,8%. Stored seeds of ‘Sweetheart’ variety germinated

42% and ‘0900 Ziraat’ variety germinated 12,5%. 1mgl-1 TDZ and 0,1 mgl-1 NAA were

added to WPM and this media was used in regeneration studies from cotyledon explants.

Petri dishes were wropped in aliminium folio and were were stored in dark for 5-10-15 days.

They were compared to light condition 0,8 mgl-1 TDZ and 4 and 8 hours applications were

researched in the study. Dark application and pre-TDZ applications were evaluated good for

regeneration and were determined statistically important. 0,1 mgl-1 NAA and 0,5- 1- 1,5 mgl-

1 TDZ dosages in WPM were studied for plant regeneration from leaf explants. Explants

which were in contionusly in light conditions were compared with the explants were stored

in dark condition for 10 days. However, the new plant could not be obtained from leaves.

Key Words: P.avium L., regeneration, germination, darkness, TDZ, WPM

2011, 50 pages

v

TEŞEKKÜR

‘Kirazın (Prunus avium L.) in vitro rejenerasyonu ve çimlendirilmesi’ isimli

çalışmayı tez konusu olarak öneren danışman hocam sayın Doç. Dr. Fatih Ali

CANLI’ya çalışmam süresince gördüğüm değerli yardımları ve maddi-manevi

desteklerinden dolayı yürekten teşekkür eder, sevgi ve saygılarımı sunarım.

Yine çalışmam sırasında desteğinden her zaman istifade ettiğim mesai arkadaşım

Ziraat Yüksek Mühendisi Mustafa PEKTAŞ’a, laboratuar çalışmalarımdaki

yardımlarından dolayı Özgür YILMAZ’a, materyal teminindeki katkılarından dolayı

İsmail DEMİRTAŞ’a, yazım aşamasındaki yardımlarından dolayı Mehmet DEMİR

ve Salih BAKICI’ya bu vesile ile teşekkür ederim. Araştırmanın yürütülmesinde

maddi ve manevi yardımlarını gördüğüm tüm Eğirdir Meyvecilik Araştırma

İstasyonu personeline teşekkür ederim.

“Kirazın (Prunus avium L.) in vitro rejenerasyonu ve çimlendirilmesi” adlı ve 1928-

YL-09 No’lu Proje ile tezimi maddi olarak destekleyen Süleyman Demirel

Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Yönetim Birimi Başkanlığı’na teşekkür

ederim.

Tezimin her aşamasında varlıklarını ve dualarını yanımda hissettiğim annem Hacer

TEMURTAŞ’a, babam Sinan TEMURTAŞ’a, sevgili eşim Türkan TEMURTAŞ’a,

kıymetli oğullarım İhsan Sinan ve Osman Yüksel’e sonsuz sevgi ve saygılarımı

sunarım.

Nurettin TEMURTAŞ ISPARTA 2011

vi

ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 3.1. ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ çeşitlerine ait tohum örnekleri ............... 17 

Şekil 3.2. ‘0900 Ziraat’ kiraz çeşidinin meyveleri ................................................. 18 

Şekil 3.3. ‘Sweetheart’ kiraz çeşidinin meyveleri .................................................. 19 

Şekil 3.4. Çalışmada kullanılan TDZ ..................................................................... 20 

Şekil 3.5. Transfer işlemlerinin gerçekleştirildiği yatay ve dikey hava akışlı

steril kabinler ......................................................................................... 21 

Şekil 3.6. Kültür odasından bir görünüş ................................................................ 21 

Şekil 3.7. Çalışmada kullanılan tohumların kabuklarının kırılarak içlerinden

sağlam ve dolgun olanlarının seçilmesi ................................................. 22 

Şekil 3.8. Katlamaya tabi tutulacak tohumların konulacağı altı delikli plastik

kaplar ..................................................................................................... 22 

Şekil 3.9. ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ kiraz tohumlarının katlama ortamına

konulması............................................................................................... 23 

Şekil 3.10. Katlama sonrası çimlenen ‘Sweatheart’ tohumları .............................. 24 

Şekil 3.11. Katlama uygulaması sonrası ekimi yapılan tohumların viollerde

çıkışları .................................................................................................. 24 

Şekil 3.12. ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ tohumlarının in vitro da çimlenmeleri . 25 

Şekil 3.13. Kotiledon dokusundan rejenerasyon denemesinin kurulması.............. 26 

Şekil 3.14. Saksıdaki fidanlardan alınan yaprak eksplantlarının deterjanla

yıkanması ............................................................................................... 28 

Şekil 3.15. Yapraklarda kallus oluşumu ................................................................ 29 

Şekil 3.16. Karanlık uygulaması yapılan petri kapları ........................................... 30 

Şekil 4.1. ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ kiraz çeşitlerinin katlama sonunda

çıtlamış hali............................................................................................ 31 

Şekil 4.2. Katlama sonrası tohum gömleğini yırtarak filizlenen tohumlar ............ 32 

Şekil 4.3. Rejenere olan kotiledon dokuları ‘Sweetheart’ (solda) ve ‘0900

Ziraat’ (sağda) ........................................................................................ 34 

vii

ÇİZELGELERİ DİZİNİ Çizelge 1.1. Dünyadaki önemli kiraz üretici ülkeler ve 2004–2009 yıllarına ait

üretim miktarları (ton). ................................................................................. 2 Çizelge 2.1. Prunus türlerinin çeşitli eksplantları kullanılarak geliştirilen

rejenerasyon protokolleri .............................................................................. 5 Çizelge 3.1. Lloyd and McCown 1980 (WPM) besin ortamının bileşimi ............ 20 Çizelge 4.1. ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ çeşitlerinin iki yılın ortalamasına ait

in vitro ve katlama uygulamalarının çimlenme oranları ............................ 33 Çizelge 4.2. Karanlık uygulamasının ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ çeşitlerine

ait kotiledon eksplantlarında eksplant başına sürgün sayısı ve rejenerasyon oranına etkisi ......................................................................... 35 

Çizelge 4.3. TDZ ile ön muamele uygulamasının ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ çeşitlerinin kotiledon eksplantlarında eksplant başına sürgün sayısı ve rejenerasyon oranına etkisi ......................................................................... 36 

Çizelge 4.4. Farklı TDZ dozları neticesinde yapraklarda oluşan kallus çapları .... 37 Çizelge 4.5. Karanlık uygulaması sonunda ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’

çeşitlerinin yapraklarında oluşan kallus çapları ......................................... 37 

viii

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ

2,4-D: 2,4-dikloro fenoksi acetic acid

2iP: İzopentil Adenin

ABA: Abscisic Acid

BA: Benzyladenin

BAP: Benzylaminopurin

ddH2O: Çift distile saf su

DKW: Driver and Kuniyuki (1984)

GA3: Giberellic acid

IAA: Indole Asetic Acid

IBA: Indole-3-Butyric Acid

KIN: Kinetin

M: Molar

mg: Miligram

ml: Mililitre

mM: Milimolar

MS: Murashige and Skoog (1962)

NAA: Naphtalene Asetic Acid

PG: Phloroglucinol

pH: Hidrojen konsantrasyonunun eksi logaritması

ppm: mgl-1

QL: Quoirin and Lepoivre (1977)

rpm: Dakikada dönüş sayısı

STS: Silver thiosulfate

TDZ: Thidiaziroun

UV: Ultraviole

WPM: Loyd and McCown (1980)

μl: Mikrolitre

μM: Mikromolar

1

1. GİRİŞ

Kiraz, kışın yaprağını döken meyve türleri içerisinde meyvelerini en erken

olgunlaştıran türdür. İri, kaliteli, sert etli, uzun ve yeşil saplı, yola dayanıklı, uzun raf

ömrüne sahip çeşitler arzu edilmektedir. Türkiye ve dünyada ılıman iklim meyve

türleri içerisinde önemli bir yere sahip olan kiraz (Prunus avium L.) tür olarak

botanik sınıflandırmada Rosales takımının, Rosaceae familyasının, Prunoidae alt

familyasının, Prunus cinsi ve Cerasus alt cinsi içerisinde yer almaktadır (Öz, 1988).

Ülkemizde bulunan başlıca kiraz-vişne grubu türler P. avium, P. cerasus, P.

mahaleb, P. laurocerasus, P. prostrata, P. brachypetala, P. incana, P. angustifolia,

P. hippophaeoides ve P. microcarpa’ dır (Ercişli, 2004).

Ülkemize döviz girdisi sağlayan en önemli meyve türlerinden olan kiraz, Türkiye’de

yetiştiriciliği yapılan sert çekirdekli meyveler içerisinde kayısı (% 36) ve şeftali-

nektarın (% 26) den sonra % 16 ile üçüncü sırada gelmektedir. 1.875.618 ton olan

dünya kiraz üretiminin %18,04 lük kısmı Türkiye’de üretilmekte olup, ülkemizi %

12 ve % 7,17 ile ABD ve İtalya izlemektedir. Yine dünya kiraz ticaretinin % 23,64 ü

ülkemize aittir. Son yıllarda Avrupa’da oluşan ‘Türk Kirazı’ kavramı ile ülkemiz

kiraz ihracatında önemli bir fırsat yakalamıştır (Kaşka, 2001). Önceleri ABD’nin

elinde bulundurduğu AB pazarında söz sahibi olmaya başlamıştır (Burak vd., 2002).

Son yıllarda mevsimsel dalgalanmalar göz ardı edildiğinde Türkiye’de kiraz

üretiminde (Çizelge 1.1) devamlı bir artış görülmektedir (Anonim, 2011). Bu artış

dikim alanlarının artmasından çok üreticinin kültürel işlemlere önem vermesi ve

dolayısı ile kalite ve verim artışı şeklinde karşımıza çıkmaktadır. Ülkemizde,

özellikle fidancılık ve sulama olanaklarının gelişmesi, hasat sonrası işlemleri ile

derin dondurma ve şoklama endüstrilerindeki gelişmeler kiraz yetiştiriciliğinin

yaygınlaşmasına katkıda bulunmuştur. Ülkemizde özellikle son 10 yıldır kiraz

üretiminde görülen artış; esas olarak dış pazarda yakaladığı taleple açıklanmaktadır.

2

Çizelge 1.1. Dünyadaki önemli kiraz üretici ülkeler ve 2004–2009 yıllarına ait üretim miktarları (ton).

2004 2005 2006 2007 2008 2009 Türkiye 245 000 280 000 310 254 398 141 338 361 417 694 ABD 256 824 227 522 266 349 281 862 225 073 390 000 İran 174 576 224 892 225 000 200 000 198 768 225 000 İtalya 95 169 101 295 110 910 106 189 134 407 116 200 Ukrayna 85 300 100 200 48 900 68 200 74 700 53 000 İspanya 83 467 95 726 91 672 75 738 72 466 96400 Romanya 50 988 117 859 104 791 65 163 67 664 67 874 Rusya 100 000 93 000 50 000 100 000 63 000 69 000 Yunanistan 46 714 44 201 43 700 52 595 42 000 48 051

Doğal olarak kendine uyuşmaz bir tür olan kirazda, kendiyle uyuşurluk çok nadir

görülen bir olaydır (Wünsch and Hormaza 2004). Ülkemizin en önemli kiraz çeşidi

olan ‘0900 Ziraat’ çeşidi de genetik olarak kendine uyuşmazdır. ‘Türk kirazı’ olarak

anılan ‘0900 Ziraat’ kiraz çeşidimizin kendine verimsizlik gibi önemli bir sorununu

ortadan kaldırmak üzere Yalova Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma Enstitüsü’nde

‘Melezleme ve Mutasyon Islahı Yolu ile Kendine Verimli ve İhracata Uygun Kiraz

Çeşitlerinin Elde Edilmesi’ adlı proje 2001 yılında başlatılmıştır. Yine Eğirdir

Meyvecilik Araştırma İstasyonu’nda da bu amaca yönelik devam eden ıslah

çalışmaları bulunmaktadır.

Prunus türlerinde geleneksel yöntemlerle yeni çeşit ıslahı; bu türlerin heterozigot

yapıda olmaları, jenerasyon sürelerinin uzun olması, poliploidi, kısırlıklar,

uyuşmazlıklar gibi faktörlerin getirdiği zorluklar yanında, geniş popülasyonlardan

ümitvar olanların seçimini ve bunların arazi değerlendirmelerini içeren zaman alıcı,

zor ve pahalı bir işlemdir. Üstün özelliklere sahip yeni çeşitlerin ıslahı genetik

mühendisliği yöntemlerinin ıslah programlarına dâhil edilmesi ile önemli ölçüde

kolaylaştırılabilir ve kısaltılabilir (Canlı and Tian, 2008b).

Herhangi bir tür için gen transfer teknolojisi geliştirilebilmesinin ön şartı,

transformasyon denemelerinde kullanılabilecek düzeyde frekansa sahip bir

rejenerasyon protokolünün varlığıdır (Canlı and Tian, 2008a). ‘0900 Ziraat’ kiraz

çeşidine kendine verimlilik geni aktarmak için ön şart olan rejenerasyon protokolü

geliştirilmesi, bu çalışmanın amaçları arasındadır.

3

2. KAYNAK ÖZETLERİ

Odunsu bitkilerin genetik transformasyon yolu ile iyileştirilmesi, otsu bitkilere

nazaran rejenerasyon kabiliyetlerinin çok düşük olmasından dolayı daha zordur.

Bitkilerde gen transferi frekansının artırılması gen transferini etkileyen birçok

faktörün optimizasyonu ile artırılabilir. Bu faktörlerden en önemlileri arasında

rejenerasyon ve transient eksprasyon faktörlerinin optimize edilmesi gelmektedir.

Kiraz hariç diğer Prunus türlerinde gen transferi başarılmış ve gen tranfer

protokolleri geliştirilmiştir. Ancak bu Prunus türlerinden sadece Avrupa eriklerinde

hipokotil dokuları kullanılarak gen transferi rutin olarak uygulanabilmektedir. Ayrıca

(Avrupa erikleri de dahil) söz konusu türlerin hepsinde transformasyon frekansı çok

düşüktür. Diğer türlerde rapor edilen genetik transformasyon protokolleri, bir defaya

mahsus başarı raporları olup rutin olarak uygulanamamaktadır. Bu nedenle hala

rejenerasyon ve gen transformasyon protokollerinin geliştirilerek frekanslarının

artırılması gerekmektedir (Canlı and Tian, 2008a).

Tohum kaynaklı dokular mevcut kendini ispatlamış bir çeşidin bir karekter

bakımından genetik olarak geliştirilmesi için uygun değildir. Ancak bu dokular,

markır gen değerlendirmeleri ve optimizasyonu, gen eksprasyon çalışmaları,

promötor değerlendirmeleri, böcek ve virüslere dayanım ve gen susturma

teknolojileri gibi birçok çalışmada kullanılmakta olduğundan gen mühendisliği

teknikleri açısından önemli bir yere sahiptir. Olgun olmayan kotiledonlar sadece kısa

bir zaman kullanıma elverişli olduklarından ve depolanamadıklarından dolayı gen

transferi çalışmalarında yer alma şansları azdır (Canlı and Tian, 2008a).

Ayrıca çoğu Prunus türleri için geliştirilen transformasyon protokollerinde tohum

kaynaklı dokular kullanılmıştır. Tohum kaynaklı dokular; genetik transformasyon

teknolojisinde yukarıda değinilen önemli kullanım alanlarına sahip olmalarına karşın

tohumların kullanıldığı gen transfer protokolleri, özellikle yabancı döllenen odunsu

türlerde kendini ispatlamış mevcut çeşitlerin bir karakter bakımından genetik olarak

geliştirilmesi için uygun değildirler. Bu yüzden Prunus türlerinin gen transferi

alanında, özellikle yaprak dokuları gibi vegetatif organların kullanıldığı yüksek

4

frekanslı rejenerasyon protokollerine ve bu vegetatif dokuların kullanıldığı yüksek

frekanslı gen transfer protokollerinin geliştirilmesine ihtiyaç vardır (Canlı and Tian,

2008a).

Rejenerasyon birçok faktör tarafından etkilenmektedir. Bunlar arasında bitkinin

genotipi, doku türü, dokuların olgunluk durumu ve yaşı, büyümeyi düzenleyici

maddeler ve bunların birbirlerine olan oranları, ışık rejimleri, yaralamalar, besin

ortamındaki mineral tuzlar, ön muameleler sayılabilir (Canlı and Tian, 2008a). Aynı

türün farklı çeşitleri arasında rejenerasyon kabiliyeti ve yüzdesi bakımından çok

önemli farklılıklar gözlemlenebilir (Canlı, 2009). Bu da rejenerasyon kabiliyetinin

önemli düzeyde genetiğe bağlı olduğunu göstermektedir. Bu nedenle bir tür için

rejeneasyon protokolü geliştirilirken ya da mevcut rejenerasyon protokolleri optimize

edilirken birden fazla çeşit kullanılması önem kazanmaktadır.

Kiraz ve vişne yapraklarında yaralama yapılmasını rejenerasyon frekansını önemli

ölçüde artırmıştır. Kültürlerin başında explantların belirli sürelerle karanlıkta

tutulmasının Prunus türlerinden P. dulcis, P. avium, P. salicina ve P. armeniaca’nın

kotiledon dokularında rejenerasyon frekansını artırdığı bildirilmiştir (Canlı and Tian,

2008a). Ayrıca in vitro kültürlerinin karanlıkta inkübasyonunun P. serotina’nın

yaprak dokularında rejenerasyon frekansını artırdığı saptanmıştır (Hammatt and

Grant, 1998). Karanlık uygulamasının içsel indol asetik asit (IAA) in seviyesini

arttırdığı ve artan IAA nın dışardan uygulanan bitki büyümeyi düzenleyicilerle

etkileşerek rejenerasyonu olumlu yönde teşvik ettiği düşünülmektedir. TDZ

kullanımının BAP’dan daha etkili sürgün rejenerasyonu sağladığını belirten

araştırmacılar olduğu gibi (Leblay et al., 1990; Korban et al., 1992; Escalette and

Dosba, 1993; DeBond et al., 1996; Sarwar and Sirvin, 1997; Hammatt and Grant,

1998), BAP’ın TDZ’den daha etkili olduğunu kaydedenler (Tang et al., 2002) ve

ikisi arasında fark bulunmadığını söyleyenler (Yang and Schmidt, 1992) de vardır.

Çizelge 1.2’de farklı dokular kullanılarak geliştirilen rejenerasyon protokollerinden

bir kısmının adı verilmiştir. Ancak bütün Prunus türlerinde kullanılabilen ve genel

bir başarı sağlanabilecek ortak bir doku tipi şu an için bulunmamaktadır.

5

Çizelge 2.1. Prunus türlerinin çeşitli eksplantları kullanılarak geliştirilen rejenerasyon protokolleri

Eksplant tipi Tür Literatür

Yaprak

Kiraz (Prunus avium L.) Tang et al., 2002; Bhagwat and Lane, 2004; Blando et al., 2007; Matt and Jahle, 2005

Avrupa eriği (P. domestica L.) Nowak and Miczynski 1997 Siyah kiraz (P. serotina Ehrh) Hammatt and Grant, 1998

Erik (P. domestica L.) Bassi and Cossio, 1994; Nowak and Miczynski, 1997

Vişne (P. cerasus L.) Dolgov and Firsov, 1999 Olgun kotiledon

Kiraz (Prunus avium L.) Canlı and Tian, 2008 Japon eriği (P. salicina) Canlı and Tian, 2008 Şeftali (P. persica) Pooler and Scorza, 1995 Süs kirazı (Prunus spp.) Hokanson and Pooler, 2000 Kayısı (P. armeniaca) Paris et al., 2004

Olgunlaşmamış kotiledon

Vişne (P. cerasus L.) Tang et al., 2000 Badem (P. dulcis Mill.) Ainsley et al., 2001 Kiraz (Prunus avium L.) Lane and Coscio, 1986 Şeftali (P. persica) Yan and Zhou, 2002

Hipokotil Avrupa eriği (P. domestica L.) Mante et al., 1991 Yabani kiraz (P.microcarpa) Nas et al., 2010

Boğum arası Kiraz (Prunus avium L.) Matt and Jahle, 2005

Bitki doku kültürü; aseptik şartlarda, yapay besi ortamında, bütün bir bitki, hücre

(meristematik hücreler, süspansiyon veya kallus hücreleri), doku (çeşitli bitki

kısımları = eksplant) veya organ (apikal meristem, kök vb.) gibi bitki kısımlarından

yeni doku, bitki veya bitkisel ürünlerin (metabolitler gibi ) üretilmesidir. Yeni çeşit

geliştirmek ve mevcut çeşitlerde genetik varyabilite oluşturmak doku kültürünün

temel amaçları arasında sayılabilir. Bu nedenle bitki doku kültürleri genetiksel

iyileştirme çalışmalarında önemli bir rol oynamaktadır. Ayrıca kaybolmakta olan

türlerin korunması ve çoğaltılması zor olan türlerin üretiminde, çeşitli doku kültürü

yöntemleri de rutin olarak uygulanmaktadır (Babaoğlu vd., 2001).

Sürgün ucu, sürgünün en ucundaki meristemi ve en yeni oluşan yaprak

primordiyumunu içeren kısımdır. Bürün ve Türkoğlu (1996)’nun bildirdiğine göre

sürgün ucu kültürü virüssüz materyal elde etmek, mikroçoğaltım, bakteri ve

mantarlardan ari bitkilerin üretilmesi amacıyla yapılmaktadır (Çetin vd., 2007).

Kallus, ana bitkiden kesilip çıkartılan ve bölünme özelliğini yitirmemiş organ ve

doku parçalarının, karbon kaynağı ve bitki büyüme düzenleyicileri içeren yarı katı

besin ortamında büyütülmesi sonucu oluşan morfolojik düzensizliğe sahip kütleler

6

olarak tanımlanmaktadır (Sökmen ve Gürel, 2001). Bir diğer deyişle farklılaşmamış

bitki hücrelerinin düzensiz büyüme ürünüdür (Taiz and Zeiger, 2008). Kallustan

başlatılan kültürler virüsten ari bitki rejenerasyonunda da kullanılabileceğine dair

raporlar bulunmaktadır ancak kallus kaynaklı bitkiler genetik olarak orijinal bitkiye

benzemeyebilir (Baydar, 2008).

Oksinler, doku kültürlerinde tek başına kullanıldıklarında kallus uyarımını, hücre

süspansiyonlarının elde edilmesini ve somatik embriyo oluşumunun uyarımını,

sitokininlerle birlikte yine kallus oluşumunu, sürgün rejenerasyonunu ve somatik

embriyo oluşumunun uyarılmasını sağlayabilirler. Ayrıca elde edilen sürgünlerin

köklendirilmesinde vazgeçilmez bir kullanıma sahiptirler (Babaoğlu vd., 2001).

Sitokininler hücre bölünmesi, yeniden farklılaşma, bitki rejenerasyonu ve sürgün

çoğaltımında etkili olup, antioksidan etki göstererek yaşlanmayı da geciktirirler.

Sürgünlerde köklenmeyi ve embriyogenesisi engeller. Özellikle tohum

çimlenmesinde sitokininlerin, ABA gibi engelleyicilerin etkisini azaltıcı veya

kaldırıcı etki yaparak dolaylı şekilde olumlu etki yaptığı belirtilmektedir (Hartmann

et al., 1990). Tohum çimlenmesinde ve bitki büyümesinde engelleyici rol oynayan

ABA’nın embriyonun zayıf gelişmesinden de sorumlu olduğu belirtilmektedir

(Hartmann et al., 1990).

Sitokininler, kimyasal yapılarına göre yapay fenil-ürea kaynaklı olanlar ve doğal

adenin kaynaklı olanlar diye başlıca iki gruba ayrılır. Her ne kadar fonksiyonları tam

olarak bilinmese de ürea temelli bir sitokinin olan TDZ, rejenerasyon çalışmalarında

adenin temelli BA’ya tercih edilmektedir (Heuttemann and Preece, 1993). Prunus

spp. türlerinden sürgün rejenerasyonu için TDZ çalışılmaya devam edilmekte,

optimum konsantrasyon denemeleri yapılmaktadır (Mante et al., 1989; Yang and

Schmidt, 1992; Escalattes and Dosba, 1993).

Gibberelinler; sürgünlerin boylarının uzatılmasında, embriyo ve ovül kültürlerinde

kullanılmaktadır. Kallus gelişimini, organogenesisi ve adventif kök oluşumunu

engellerler (Babaoğlu vd., 2001). Gibberelinler tohum çimlenmesini artırırlar. Bunu

7

embriyoda vejetatif büyümeyi aktifleştirerek, embriyoyu kuşatan ve büyümeyi

sınırlandıran endosperm tabakasını zayıflatarak ve endospermdeki depo besinleri

harekete geçirerek yaparlar. Tohumlarda görülen dormansinin aşılmasında

gibberelinler kullanılabilir (Taiz and Zeiger, 2008). Gelişen tohumlarda yüksek

miktarda oluşan gibberelinlerin, tohum çimlenmesinde ve dormansinin kırılmasında

önemli fonksiyonları vardır.

GA embriyonun büyüme potansiyelini uyarır ve embriyoyu çevreleyen yapıları

zayıflatır. GA’ya bağlı olarak endospermde üretilen endo-β-mannanaz endosperm

hücre duvarlarının bozulmasını sağlayarak çimlenmeye yardımcı olabilmektedir.

Gibberalinler tohum çimlenmesi üzerinde bu süreçte rol alan enzimlerin uyartılması

ve çimlenmenin sonraki aşamasında embriyodan endosperme taşınarak α-amilaz

enzimini uyararak gerekli enerjiyi sağlamak için nişastanın şekere dönüşmesinde rol

oynamaktadır (Hartmann et al., 1990; Hilhorst and Karssen, 1992). GA noksanlığı

görülen çimlenmeyen mutantlar GA’nın tohum çimlenmesini nasıl uyardığını

çalışmak için yararlı olmuştur (Yamaguchi et al., 2002).

Meyvecilikte kullanılan fidanlar aşılama metoduyla elde edildiği için anaç kullanma

zorunluluğu ortaya çıkmaktadır (Güleryüz, 1991). Kullanılan anaçların büyük bir

çoğunlu da çöğür anaçlardır (Çelik ve Sakin, 1991). Yıldırım ve Koyuncu

(2005)’nun Isparta ilinde üretilen 140.855 adet fidanın 115.855 adedinin (% 82)

çöğür anaca aşılı olduğunu belirttikleri çalışmaları da bunu desteklemektedir. Kuş

kirazı (Prunus avium L.), vişne (Prunus cerasus) ve idris (Prunus mahalep) gibi

kiraz için çöğür anacı olarak kullanılmaktadır ve tohumla çoğaltılmaktadır (Özbek,

1978; Westwood, 1995; Hartmann et al., 1997). Genel olarak birçok meyve türünün

olgunlaşmış sağlam tohumları sıcaklık, nem, oksijen ve ışık gibi çevre koşullarının

uygun olmasına rağmen çimlenmezler. Bu olaya dormansi denir ve kayısı, badem,

erik, şeftali, kiraz gibi hemen hemen tüm ılıman iklim meyve türlerinin tohumlarında

görülür (Kaşka ve Yılmaz, 1974; Agrawal and Dadlani, 1995; Malcolm et al., 2003;

Çetinbaş ve Koyuncu, 2005).

8

Embriyonun bünyesinde ve dış kabuğun etkisiyle oluşan dormansi birbirinden

farklıdır. Embriyoyu çevreleyen katmanların uzaklaştırılması dış kabuğun

oluşturduğu dormansiyi kaldırmaktadır. Dormant tohumlar çimlenme için gerekli

şartlar yeterli olmadığından çimlenemez. Dormansi durumu içsel Giberelik asit (GA)

ve Absisik asit (ABA) ile ilişkilidir ve dormant olmayan tohumlar eğer çimlenme

için gerekli şartlar sağlanırsa çimlenirler (Karakurt vd., 2010).

Dormansinin kırılması amacıyla çeşitli metotlar uygulanmaktadır. Bunlar arasında

osmotik çözeltilerde (osmopriming) ve suda (hidropriming) bekletme, hormon

uygulamaları, su ile ıslatma-kurutma uygulamaları, düşük ve yüksek sıcaklık

uygulaması, çeşitli asitlerle aşındırma uygulamaları, trikantanol uygulaması,

liposchitooligosakkarit (lco) uygulaması, sıvı ekim uygulaması ve bu uygulamaların

kombinasyonu sayılabilir (Karakurt vd., 2010). Tohum kabuğunun mekanik veya

kimyasal yolla aşındırılması, soğukta katlama, kuru saklama, sabit sıcaklıkta,

karanlıkta veya alternatif ortamda çimlendirme ile potasyum nitrat ve büyümeyi

düzenleyici maddelerin kullanılması gibi uygulamaların tek başına veya

kombinasyon şeklinde çimlenmeyi uyardığı çeşitli meyve ve sebze türlerinin

tohumlarında yapılan çalışmalar ile saptanmıştır (Gerçekçioğlu ve Çekiç, 1997).

Meyve türlerinin tohumlarındaki dormansinin kırılması için uygulanan ana yöntem

katlamadır. Katlama için optimum 5ºC olmak üzere 0-10 ºC arasında değişen

sıcaklıklar etkilidir (Sharma and Singh, 1980; Güleryüz, 1982; Mehanna and Martin,

1985; Chopra et al., 1989; Koyuncu vd., 1999; Malcolm et al., 2003). Ilıman iklim

kuşağında bulunan bitkilerin tohumlarının çimlenebilmesi için tür ve çeşide göre

değişen belli sürelerde düşük sıcaklıkta (3-4°C) katlamaya tabi tutulmaları

gerekmektedir (Hartmann et al., 1990). Kiraz tohumlarında en uygun soğukta nemli

katlama sıcaklığı 1-5 ºC arasında ve tercihen 3ºC olduğu bildirilmiştir (Finch-

Savage, 1998). Tohum kabuğunun mekanik olarak kaldırılması ve katlama

uygulamaları kombine edilebilmektedir (Kaşka ve Yılmaz, 1974; Mehanna et al.,

1985; Martinez-Gomez and Dicenta, 2001). Ilıman iklim meyve türlerinin

tohumlarının katlamaya alınmadan hormon uygulaması ile tohumların çimlenme

oranlarını arttırmak için de çalışmalar yapılmaktadır (Yüce, 1979). Bitkilerde tohum

9

kabuğu ve embriyonun ışığa hassasiyet gösteren sensör özelliğinde oldukları ve

bunların uzaklaştırılması ile ışığın etkisinin kaybolduğu da bildirilenler arasındadır

(Hartmann et al., 1990).

2.1. Çimlendirme Çalışmaları

Edizer vd. (2009)’nin Kastamonu yöresinde yetişen bazı kuş kirazı (Prunus avium

L.) tiplerinin çimlenme özelliklerinin belirlenmesi amacıyla 2007–2008 yıllarında

yürütmüş oldukları çalışmada tohumlar, canlılık testinin ardından GA3 ün 0-500-

1000 ve 1500 ppm. lik dozlarıyla 24 saat inkübe edilerek katlama ortamına

alınmıştır. 60, 75, 90, 105 ve 120 gün sonra katlama ortamından alınan tohumlarda

çimlenme yüzdeleri tespit edilerek çalışılan 4 tipde genel olarak 1000 ppm GA3

çözeltisinde 24 saat beklettikten sonra 105 gün boyunca +4°C’de katlama

uygulamasının tavsiye edilebileceği sonucuna varılmıştır.

Çetinbaş ve Koyuncu (2005)’nun bildirdiğine göre tohum kabuğunun ve katlama

uygulamalarının kuş kirazı (Prunus avium L.) tohumlarında dormansi mekanizması

üzerine etkilerini belirlemek amacıyla yürütülen çalışmada tohumlar 3 farklı sürede

katlamaya alındıktan sonra kabuklu ve kabuksuz olarak çimlendirilmişlerdir.

Çimlenme oranları, 120 gün süre ile katlanan kabuklu ve kabuksuz tohumlarda

sırasıyla % 44.53 ve % 56,91 olarak gerçekleşmiştir. Kabuksuz tohumlarda

çimlenme daha erken başlamış ve daha hızlı olmuştur.

Ercişli vd. (1999), kayısıların tohum çimlenmesi üzerine vitaminlerin etkisini

araştırdıkları çalışmasında ‘Şekerpare’, ‘Hasanbey’ ve ‘Hacıhaliloğlu’ kayısı çeşitleri

ile ‘Zerdali A’ ve ‘Zerdali B’ yabani kayısı tipleri kullanılmıştır. Değişik dozlarda

farklı vitaminlerin denendiği çalışmada vitamin uygulamaları (Riboflavin, Thiamin,

Pyridoksin, Ca-pantothenate, Nikotinik asit ve Askorbik asit) kontrol ile

karşılaştırıldığında tohumlarda çimlenme oranlarını artırdığı bildirilmiştir.

Uygulamalar arasında ise %50 çimlenme oranı ile askorbik asit en yüksek sonucu

verirken, thiamin %38,33 ile en düşük çimlenme oranında kalmıştır.

10

Ergenoğlu vd. (1996), ‘Tarsus Beyazı’ ‘Cardinal’ ve ‘İtalya’ üzüm çeşitlerinde

katlama, GA3, hidrojen siyanamid (HCN), laktik asit ve asetik asidin, bu üç çeşit

üzüm tohumlarının çimlenmeleri üzerine etkilerini araştırmışlardır. 5°C’de 30, 60, 90

gün katlama, 1000 ve 2000 ppm GA3 uygulamaları, tek ve kombinasyon şeklinde

tatbik edilmiştir. 21 günde 5°C katlama ile GA uygulamaları çimlenme oranı ve

hızını artırdığı bildirilmiş, GA3 uygulanan fidelerin daha uzun fakat zayıf oldukları

rapor edilmiştir.

Güneş ve Gübbük (2006), Papaya meyvesinde yaptıkları çalışmada tohumların

ekimden önce belli sürelerde su, sıcak su, H2SO4, alkol, GA, etilen, sitokinin, KNO3

ve vitamin içerisinde bekletilmelerinin çimlenme yüzdesini artırdığını

bildirmişlerdir. Sözkonusu uygulamalar içerisinde en yüksek olumlu sonuç GA3

uygulamasından elde edilmiştir.

Çekiç (1996), Mahlep’de tohum kabuğunun kırılması, sıcak suda ve çeşme suyunda

bekletme, arazide katlama, GA3 uygulamaları, asitle (H2SO4) aşındırma, soğuk (2-

4°C) ve sıcak (20-24°C) ortamlarda tutma uygulamalarını araştırmıştır. En yüksek

tohum çimlenmesi 1000ppm’lik GA3 solüsyonunda 24 saat tutulduktan sonra 12

hafta süre ile katlamada tutulan kabuksuz tohumlardan % 93,3 olarak elde edilmiştir.

GA3 uygulanan kabuklu tohumların ancak dormansinin 56. gününde çimlenmeye

başladığı gözlenmiştir.

Yüce (1979), bazı zeytin tohumlarında yürütmüş olduğu çalışmada tohumları 3 gruba

ayırmıştır. 1. gruptakilerin tohum kabukları çıkarılarak laboratuar koşullarında GA

ve İndol Asetik Asit (IAA) içeren kültür ortamlarına ekim yapmıştır. 2. grup

katlamaya tabi tutarak yarısını sıcak diğer yarısını soğuk yastıklara ekmiştir. 3. grup

tohumlara hiç muamele yapmamıştır. Çalışmanın sonucunda GA ve IAA içeren

ortama ekilen tohumlar, çimlenme süresini kısaltmanın yanı sıra diğer uygulamalara

göre daha yüksek çimlenme oranı göstermiştir.

Keçiboynuzu tohumlarına ekimden önce +4°C’de 80 ve 100 gün kumda katlama,

+4°C’de 80 ve 100 gün perlitte katlama, 40°C’deki sıcak suda 2 saat bekletme, +18

11

°C suda 2 gün bekletme uygulamaları tatbik edilmiş ve sonuçta en yüksek çimlenme

oranının % 77.8 ile +40°C suda bekletme uygulamasından, en düşük oranın %44,62

ile kontrol uygulamasından elde edildiği bildirilmiştir (Anonim, 2008b).

Değişik dozlarda GA3 uygulamalarının in vitro ve in vivo koşullarda karanfil

tohumlarının çimlenmeleri üzerine etkisi araştırılmıştır. Bitki tohumları 24 saat

süreyle 0, 10, 50, 100, 250 ppm GA3 konsantrasyonlarında bekletilmiştir. Tohumlar

daha sonra in vitro koşullar için MS ortamına, in vivo koşullar için ise torf,

torf+perlit (1:1) ve perlitten oluşan 3 farklı ortama ekilmiştir. Hem in vitro hem de in

vivo koşullarda çimlenme oranı bakımından en iyi sonuç kontrol grubu

tohumlarından elde edilmiş, GA3 dozlarının çimlenme oranını azaltıcı etki yaptığı

bildirilmiştir (Anonim, 2008a).

2.2. Kotiledon Çalışmaları

Canlı ve Tian (2008a), kirazın olgun kotiledonlarından ilk adventif sürgün

rejenerasyonu olma özelliği taşıyan bu çalışmalarında BA ve TDZ ve

konsantrasyonları, ilk 10 gün karanlık uygulaması ve thidiaziroun (TDZ) ile ön

muamelenin etkilerini araştırmışlardır. Besin ortamı olarak QL (Quoirin ve Lepoivre,

1977) kullanılmıştır. TDZ ilave edilen ve ilk 10 gün karanlıkta tutulan bütün çeşitler

rejenere olmuş, karanlık uygulamasının bulunmadığı üç çeşitte ise rejenerasyon

frekansı düşük kalmıştır. TDZ’nin, BA’dan daha etkili sürgün rejenerasyonu

sağladığı belirtilmiş, en yüksek rejenerasyon, TDZ’nın 0.8 mgl-1 ve 1.58 mgl-1 ilave

edilen ve karanlık uygulanan kombinasyonundan elde edilmiştir. Çeşitlerin

rejenerasyon frekansları ise ‘Vista’ %70, ‘Sunburst’ %53.3, ‘Tehranivee’ %23.3,

‘Vouge’ %30 ve ‘Heidelfingen’ %26.6 olarak bulunmuştur. Prunus türünün zor

köklendiği bildirilen çalışmada ‘Tehranivee’ çeşidinde köklenme olmazken, diğer

çeşitlerde bu oran çok düşük kalmıştır.

Canlı ve Tian (2008b), (Prunus salicina Lind1) in olgun kotiledonlarından adventif

sürgün amacıyla yaptıkları çalışmada TDZ’nin, benzyladenin (BA)’den daha etkili

sonuç verdiğini bildirmişlerdir. Karanlık uygulamasının rejenerasyonu artırdığı

12

bildirilen çalışmada kullanılan ‘Bruce’, ‘Shira’, Redheart’, ‘Gladstone’ ve ‘Early

Golden’ çeşitlerinden sırasıyla %66.7, %46.7, %43.3, %26.7 ve %6.7 rejenerasyon

frekansı elde edilmiştir.

Mante vd. (1989), Prunus persica ‘nın (‘Boone County’, ‘Bailey’, ‘Belle’, ‘Loring’

‘Suncrest’, şeftali x badem melezi olan ‘Hann’ olgunlaşmamış kotiledonlarıyla P.

domestica (‘Stanley’)ve P. cerasus’un (‘Montmorecy’) olgun kotiledonlarından bitki

rejenerasyonu için MS ortamı kullanmışlar ve explantların alt ya da üst yüzeyinin

ortama konulmasının morfogenesise açık bir etkisi olmadığını belirtmişlerdir.

‘Suncrest’ çeşitinin ortalama sürgün sayısı (15,5±7,1) ve kotiledonların sürgün

yüzdesi % 67 ile 2,5 µM IBA ve 2,75 mgl-1 TDZ ilave edilen MS ortamında

gerçekleşmiştir. Eksplant tipi olarak şeftalide olgunlaşmamış kotiledonların (çiçekten

70 ve 100 gün sonra) olgun kotiledonlara (çiçekten 130 gün sonra) nazaran daha iyi

rejenere olduğunun belirtildiği çalışmada erik ve şeftali kotiledon dokularının

özellikle bağlanma (uç) kısımlarda rejenerasyon olduğu bildirilmiştir. P.cerasus’un

olgun kotiledonları 2,5 µM IBA ve 1,650 mgl-1 - 2,2 mgl-1 TDZ içeren MS ortamında

kültüre alınmış, ilk 7 gün tohumlarda büyüme olmuş, 14 gün sonra yeşil renge dönen

tohumlarda sürgün başlangıcı görülmüştür. Explantların üst yüzeyinden gelişen

sürgünler izole edilerek köklenme ortamına aktarılmıştır. Yine Mante vd. (1991),

depolanmış olgun tohum materyallerinin, olgunlaşmamış embriyoların aksine bütün

bir sene transformasyon ve genetik mühendisliği çalışmalarında kullanmaya elverişli

olduğunu bildirmişlerdir.

Nas vd. (2010), Prunus microcarpa’nın rejenerasyonunda kök, kotiledon ve

hipokotil eksplantları ile sitokininlerden meta-Topolin (mT), BA ve TDZ’nin farklı

konsantrasyonlarını Nas ve Read ortamınına (NRM) ilave etmişlerdir. Kök

eksplantlarının rejenerasyon için kullanışlı olmadığı ve çok az eksplantın kallus ya da

rejenerasyon sağladığı belirtilen çalışmada kotiledon yapraklardan % 51, hipokotil

eksplantlarından % 21 rejenerasyon elde edilmiştir. BA ilave edilen ortamdan % 46,

mT ilave edilen ortamdan % 42 olarak gerçekleşen rejenerasyon oranı, TDZ katılan

ortamda % 21 de kalmıştır. En yüksek rejenerasyon oranı kotiledon eksplantının

kullanıldığı ve NRM ortamına 12.5 µM BA katılan ortamdan %77 olarak

13

bulunurken, bunu %73 ile 12.5 µM mT ilave edilen ortam izlemiştir. TDZ kullanılan

kotiledon eksplantında bu oran % 53’de kalmıştır. Hipokotil eksplantlarının

kullanıldığı ve BA, mT ve TDZ kullanılan ortamlarda gerçekleşen rejenerasyon

oranları sırasıyla % 48, % 45 ve % 10 olmuştur.

2.3. Yaprak Çalışmaları

Hammatt ve Grant (1998), Prunus serotina Ehrh. ve Prunus avium L.’nin

yapraklarından sürgün rejenerasyonu için yaptıkları çalışmada WPM besin ortamına

BA veya TDZ ilave etmişler, P. avium 1908 ve P. serotina genotipi için TDZ’nin

BA’den daha etkili olduğunu belirtmişlerdir. P. serotina yapraklarının

rejenerasyonunda WPM, modifiye edilmiş DKW (Driver ve Kuniyuki, 1984)

ortamından daha iyi sonuç vermiştir.

Takashina vd. (2003), yaptıkları bir çalışmada Prunus avium L.’nin ‘Benisyuhou’,

‘Benitemari’, ‘Benisayaka’ ve ‘Satonishiki’ çeşitlerinin in vitro da yaprak

ekspantından rejenerasyon sağlamak için, sürgün uçlarından 1 mM phloroglucinol

(PG) ile 0,5 mgl-1 6-benzylaminopurine (BA) ve 0,1 mgl-1 indolebutyric acid (IBA)

ilave edilmiş modifiye MS temel ortamında kültürü başlatmışlardır. Burada gelişen

sürgünlerin gelişmiş yaprakları alınarak içine 5 mgl-1 2,4-D ilave edilmiş sıvı Woody

Plant Medium (WPM) besi ortamında bir gün süreyle bekletildikten sonra yapraklar

tekrar sabunlu su ile yıkanmıştır. Sonra rejenerasyon için içine 5 mgl-1 thidiazuron

(TDZ) ilave edilmiş yarı katı WPM ortamına inoküle etmişlerdir. ‘Benisyuhou’

çeşidinde üç ay içinde her yapraktan oluşmuş adventif sürgün oranları ve sayılarını

tespit etmişlerdir. Sonuç olarak kıvrık yapraklardan sürgün rejenerasyonu

(%77.3±5.1) geniş yapraklardan sürgün rejenerasyonundan (%26.2±5.6) daha yüksek

elde edildiğini; aynı zamanda kıvrık yapraklardan axillary sürgün sayısı 0.6-

2.7/yaprak arasında olduğunu bildirmişlerdir. Genç yaprakların rejenerasyona

cevabının yaşlı yapraklardan daha yüksek olduğu, buna ilave olarak explantların 2,4-

D içeren ortamda ön kültüre tabi tutulmasının yapraklardan adventif sürgün

oluşmasında pozitif etki yaptığını kaydetmişlerdir. Çeşitlerin rejenerasyonunda ise,

14

‘Satonishiki’ ve ‘Benisayaka’ (%20–30) çeşitlerine göre ‘Benisyuhou’ ve

‘Benitemari’ (80%) çeşitlerinden daha yüksek rejenerasyon oranı elde edilmiştir.

Bhagwad ve Lane (2004), yaptıkları çalışmada (Prunus avium L.)’ un ‘Lapins’ ve

‘Sweetheart’ çeşitlerinin yaprak parçalarından in vitro’da NAA ve TDZ

(Thidiazuron) veya BA (Benzyladenin) ilave edilmiş WPM ortamında rejenerasyon

üzerine bitki büyümeyi düzenleyiciler, explant tipi, yaprağın besin ortamına temas

yüzeyi ve yaralamanın etkili olduğunu; optimal rejenerasyonun 0,5 mgl-1 veya 1 mgl-

1 TDZ’ ye ilave olarak 0,05 mgl-1 NAA içeren besin ortamında bütün bir yaprağın

ortadamara dik biçimde gerçekleştirilen yaralama sonucu ve yaprağın üst yüzeyinin

kültüre alınması sonucu elde edildiğini; bitki rejenerasyonunda sonuçta her

explanttan bir veya daha fazla sürgün elde edilmesinde Lapins’te %71.4 ve

Sweetheart çeşidinde % 54 başarı sağlandığını belirtmişlerdir.

Espinosa vd. (2006), Prunus serotina’nın in vitro köklenme ve sürgün rejenerasyonu

geliştirmek amacıyla yaptıkları çalışmada MS besin ortamına 4.44 µM BA, 0.49 µM

IBA, 0,29 µM GA3 ilave etmişler ve bitkinin nodal kısımlarından kültürü

başlatmışlardır. Yaprak parçasından sürgün elde etmek amacıyla in vitro dan

aldıkları yaprakları WPM besin ortamına inoküle etmişlerdir. Bu aşamada WPM

ortamına TDZ’nin 0, 0,5, 1, 1,5 mgl-1 dozları ile NAA’nın 0, 0.54, 1.07 ve 5.37 µM

dozlarını kullanmışlardır. Diğer bir kombinasyonda 0- 4,44- 8,88 veya 13,32 µM BA

ile NAA’nın 0, 0.54, 1.07 ve 5.37 µM dozlarını denemişlerdir. Kültürler 3 ya da 5

hafta karanlık uygulamasından sonra 16 saat aydınlık ortama transfer edilmiştir.

Sürgün rejenerasyon sayısı üzerinde TDZ ve genotipin önemli olduğunu

bildirmişlerdir. Ortalama sürgün rejenerasyon sayısında en iyi sonucu eksplant

başına (5,05±1,14) ile 0,5 mgl-1 TDZ ve 0,54 µM NAA ilave edilen ve ilk 3 hafta

karanlıkta tutulan WPM ortamından almışlardır. En yüksek sürgün rejenerasyon

yüzdesinin %38.3 ve (4,13±0,97) ortalama sürgün sayısı ile 1,5 mgl-1 TDZ ve 1,07

µM NAA ilave edilen ortamda gerçekleştiğini bildirmişlerdir. Adventif sürgünlerin

en yüksek köklenmesi %27 ile 2,5 µM IBA katılan ortamdan alınmış, bunlar 7 gün

karanlıktan sonra 16 saat fotoperiyot ortamına alınmıştır. Bitkilerin dış ortama

alıştırılmasında serada hayatta kalan bitki sayısı %86 olmuştur.

15

Blando vd. (2007), ‘Giorgia’ kiraz çeşidinin in vitro’da yetişen yapraklarından

adventif sürgün rejenerasyonu sağlamak amacıyla yürüttükleri çalışmada donör

bitkiler için phloroglucinol (PG) ilave edilen MS ortamı kullanmışlar, rejenerasyon

ortamı olarak kullandıkları WPM ortamından en iyi rejenerasyon oranını ise 5 mgl-1

TDZ ilave edilen ve yapraklara yaralama uygulanan denemeden aldıklarını

bildirmişlerdir.

Liu ve Pijut (2008), P.serotina’nın 1 genç ve 2 olgun genotipinin yaprak

eksplantlarından rejenerasyon protokolü geliştirdikleri çalışmalarında TDZ ve NAA

ilave ettikleri WPM ortamı kullanmışlardır. En yüksek rejenerasyon oranının % 91,4

ile 2 mgl-1 TDZ ve 0,2 mgl-1 NAA katılan ortamdan elde edildiğini, en yüksek

sürgün sayısının ise 8,2 adet ile 2 mgl-1 TDZ ve 0,1 mgl-1 NAA bulunan ortamdan

sağlandığını bildirmişlerdir. STS’nin 60 veya 80 µM dozunda besin ortamına

katılmasının olgun siyah kiraz genotiplerinde rejenerasyonu artırdığını ve Genotip

3’de (%75) ve Genotip 4’de (%58) rejenerasyon oranı elde edildiğini belirtmişlerdir.

Prunus türünün rejenerasyon çalışmalarında BA ve TDZ’nin, 2iP ve KIN’den daha

çok kullanıldığının belirtildiği ve bu dört sitokininin farklı konsantrasyonlarının

denendiği çalışmada ‘Lapins’ kiraz çeşidinin multiplikasyonunda en etkili sitokininin

BA olduğu bildirilmiştir (Ruzic and Vujovic, 2008).

Petri ve Scorza (2009), ‘Improved French’ erik çeşidinin yapraklarından adventif

sürgün rejenerasyon için çeşitli faktörlerinin optimizasyonu amacıyla yürüttükleri

çalışmada 3µM BA ve 0,25µM IBA ilave edilen MS ortamından %52 rejenerasyon

elde ederlerken, 8,9 µM BA ve 0,49 µM IBA ileve edilen QL ortamından %5’in

altında bir oran elde etmişlerdir. Katılaştırıcı jel olarak 7 g/l Bacto agar, 7 g/l TC agar

ve 4,5 g/l Agargel™ kullanmışlar ve organogenesise en çok Bacto agarın katkı

yaptığını belirmişlerdir. Karanlık inkübasyonunun rejenerasyona etkisi de araştırılan

çalışmada 16:8 saat fotoperiyot uygulanan yapraklar ile 1 hafta, 2 hafta ve 3 hafta

karanlık uygulanan yapraklar karşılaştırılmış, 1 hafta karanlık uygulamasının en iyi

sonucu verdiği görülmüştür. Etilen inhibütörü olan silver thiosülfat (STS)’ın 0, 30,

16

60 ve 120 µM dozlarının organogenesise en iyi cevabı ise 60 µM ile 120 µM

konsantrasyonları vermiştir.

Bu literatür ışığında çalışmamızın amaçları arasında, ıslah çalışmalarında

kullanılmak üzere ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ çeşitlerinin tohumlarından yüksek

frekanslı in vitro çimlendirme protokolü geliştirilmesi ile olgun kotiledon ve yaprak

dokuları kullanılarak gen transferine imkan sağlayan yüksek frekanslı in vitro

rejenerasyon protokolü geliştirilmesi bulunmaktadır.

17

3. MATERYAL VE YÖNTEM

3.1. Materyal

3.1.1. Bitkisel materyal

Çalışmada kullanılan ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ kiraz çeşitlerine ait tohum ve

yaprak materyali, Eğirdir Meyvecilik Araştırma İstasyonu arazisinden alınmıştır.

İstasyon arazileri Eğirdir-Kovada Gölleri arasında Boğazova olarak adlandırılan

vadi üzerindedir. Deniz seviyesinden yüksekliği 835 m' dir. 2009–2011 yılları

arasında yürütülen bu çalışma Eğirdir Meyvecilik Araştırma İstasyonu Doku Kültürü

Laboratuarı ve SDÜ Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Doku Kültürü

Laboratuarında yürütülmüştür. Bu çalışmada bitkisel materyal olarak istasyon

arazisinde bulunan ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ çeşitlerine ait ağaçlardan alınan

tohum (Şekil 3.1) ve yaprak örnekleri kullanılmıştır.

Şekil 3.1. ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ çeşitlerine ait tohum örnekleri

18

3.1.1.1. ‘0900 Ziraat’

Ülkemizde çok yaygın ve kabul edilen bir çeşittir. Bakteriyel kansere dayanıklı

gözükmekte ve geç çiçeklenmektedir. Meyve çatlaması görülmez. S3 S12 allelerine

sahiptir. ‘0900 Ziraat’ değişik sinonimleriyle ülkemizde yaygındır. Uluborlu

Napolyonu, Dereçine Napolyonu, Akşehir Napolyonu, Malatya Dalbastı, Allahdiyen,

Salihli ve Mustafa Kemal Paşa Napolyonu gibi değişik adlarla anılmaktadır.

Dölleyicileri de genellikle Starks Gold, Lambert, Vista, Merton Late, Bigerreau

Gaucher, Noble, Jübile’dir (Kaşka, 2001). ‘0900 Ziraat’ çeşidi Türkiye kiraz

ihracatının % 80 ini, ayrıca dünya kiraz ticaretinin % 12,5 ini oluşturmaktadır ve

ülkemiz çiftçisi için önemli bir istihdam alanı, gelir kaynağıdır (Ergun ve Burak,

2001).

Çok sert, gevrek, sulu, çok lezzetli, çok iyi kalitede olan meyveleri parlak koyu

kırmızı renkte olup, geniş kalp şeklindedir (Şekil 3.2). Meyvelerinin ağırlığı 8–10 g.

arasında, 22–28 mm eninde ve 22–28 mm boyundadır. Çok iri (0,350–0,400 g.) olan

çekirdeği, ete çok az bağlıdır. Çekirdek eni 8–10 mm ve çekirdek boyu 10–12 mm

dir. Uzun ve ince olan meyve sapı yaklaşık 45–50 mm uzunluğundadır.

Şekil 3.2. ‘0900 Ziraat’ kiraz çeşidinin meyveleri

3.1.1.2. ‘Sweetheart’

Çok iyi kalitede, parlak koyu kırmızı renkli olan bu kiraz çeşidinin meyvesi (Şekil

3.3) sert olup tadı iyidir. Çok geç olgunlaşır. Yayvan formda gelişim gösterir ve

19

yüksek verimlidir. Çatlamaya orta derecede hassastır. Kendine verimli ve orta erken

dönemde çiçeklenir (Lang et al, 2003). Summerland’da Van melezlemesiyle elde

edilmiştir (Nugent, 1999).

Şekil 3.3. ‘Sweetheart’ kiraz çeşidinin meyveleri

3.1.2. Besin ortamı

Bu çalışmada tohumların kotiledonlarından ve bitki yaprak dokularından sürgün

rejenerasyonu çalışmaları için WPM (Lloyd ve McCown 1980) besin ortamı

kullanılmıştır. Odunsu bitkiler için geliştirilen bu ortamın makro besin elementi

içeriği, MS besin ortamından ve Prunus spp. için geliştirilen QL (Quoirin ve

Lepoivre, 1977)’den düşüktür. Yine WPM, QL ortamından daha düşük NO3 içerir.

Bhagwat ve Lane (2004) ile Tang vd., (2002) kiraz yapraklarının rejenerasyonunda,

optimal besin ortamı olarak WPM ortamını bildirmişlerdir. WPM besin ortamının

makro ve mikro elementler ile vitamin içeriği Çizelge 3.1’de görüldüğü gibidir.

Çalışmada WPM makro ve mikro elementlerinin bulunduğu hazır ortama Gamborg

vd., (1968)’nin geliştirdiği B5 ortamının vitaminleri eklenmiştir. Bu vitaminlerin

konsantrasyonları ise myo-inositol 100 mgl-1, nikotinik asit 1 mgl-1, pyridoksin-HCL

1 mgl-1 ve tiamin-HCL 10 mgl-1 şeklindedir. B5 ortamında glisin bulunmazken,

nikotinik asit ve pyridoksin WPM içeriğinden 2 kat fazla bulunmaktadır.

20

Çizelge 3.1. Lloyd and McCown 1980 (WPM) besin ortamının bileşimi

İnorganik Tuzlar

Makroelementler Miktar (mgl-1) Mikroelementler Miktar (mgl-1) Amonyum Nitrat 400 Borik Asit 6.2 Kalsiyum Klorit 96 Sodyum EDTA 37.2 Magnezyum Sülfat 370 Bakır Sülfat 0.25 Potasyum Sülfat 990 Demir Sülfat 27.8 Potasyum Fosfat 170 Manganez Sülfat 22.3 Kalsiyum Nitrat 556 Çinko Sülfat 8.6 Sodyum Molibdat 0.25

Organik İlaveler Myo-Inositol 100 Nikotinik Asit 0.5 Pridoksin HCl 0.5 Tiamin HCl 1.0 Glisin 2.0

Şekil 3.4. Çalışmada kullanılan TDZ

3.2. Yöntem

Çalışmada inokulasyon işlemleri için yatay ve dikey hava akışlı steril kabinler

kullanılmış (Şekil 3.5), kullanımdan önce UV lambaları açılmış ve çalışmadan en az

15 dk. önce % 70 lik etil alkolle (C2H5OH) kabin içi silinmek suretiyle steril hale

getirilmiştir.

21

Şekil 3.5. Transfer işlemlerinin gerçekleştirildiği yatay ve dikey hava akışlı steril

kabinler

3.2.1. Kültür odası şartları

Ekimi yapılan petri kapları 24±1 0C sıcaklık ve beyaz floresan lamba ile sağlanan

16/8 (aydınlık/karanlık) saatlik fotoperiyotta (40 uMm–2 s -1, Li-cor, Inc. integrating

quantum/radiometer/photometer model LI-188B ile ölçülen) tutulan bir kültür

odasında raflara yerleştirilerek muhafaza edilmiştir. Kültürlerin ışık kaynağından

uzaklığı 45 cm.’dir.

Şekil 3.6. Kültür odasından bir görünüş

3.2.2. Çimlendirme denemeleri

3.2.2.1. Tohumların toplanması ve eksplant hazırlanması

Çimlendirme çalışmalarında materyal olarak kullanılmak üzere Haziran sonunda

derimi yapılan ‘Sweetheart’ ve ‘0900 Ziraat’ çeşitlerinin tohumları toplanmıştır.

22

Eğirdir Meyvecilik Araştırma İstasyonu’nda bulunan ağaçların olgun meyvelerinden

elde edilen tohumlar meyve etinden ayrıldıktan sonra musluk suyu altında yıkanmış,

daha sonra % 20 lik sodyum hipoklorit çözeltisinde 15 dk. dezenfekte edildikten

sonra musluk suyu ile 3 kez tekrar yıkanıp kuruması için oda sıcaklığında 2 gün

kurumaya bırakılmıştır. Kabuğundan çıkarılan tohumlardan çok zayıf olanlar (Şekil

3.7) materyal olarak kullanılmamıştır. Kabuklu ve kabuğu kırılarak çıkartılmış olan

tohumlar %3’lük mantar ilacına (Captan) batırıldıktan sonra alt kısmı delikli plastik

kaplar içerinde katlamaya alınmıştır (Şekil 3.8). Tarım perliti içerisinde nemli

katlamaya alınan tohumlar 4 tekerrür ve her tekerrürde 25 tohum olacak şekilde +4

°C de 120 gün boyunca buzdolabında saklanmıştır.

Şekil 3.7. Çalışmada kullanılan tohumların kabuklarının kırılarak içlerinden sağlam

ve dolgun olanlarının seçilmesi

Şekil 3.8. Katlamaya tabi tutulacak tohumların konulacağı altı delikli plastik kaplar

23

3.2.2.2. Katlama uygulaması

Tohum kabuğu kırılmadan katlama uygulaması

Tohum kabuğuyla 23 Temmuz 2009 tarihinde katlamaya alınan tohumlar 120 gün

sonunda çıtlamamış, deneme 5 Ocak 2010 tarihinde tekrar kurulmuştur. Geçen süre

zarfında tohumlar hava alan delikli filelerde +4 ºC de buzdolabında muhafaza

edilmiştir. Katlama kaplarına alınan kabuklu tohumlar Şekil 3.9’da görülmektedir.

Şekil 3.9. ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ kiraz tohumlarının katlama ortamına

konulması

Tohum kabuğu kırılarak katlama uygulaması

‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweatheart’ çeşitlerinin hasatı 15 Temmuz 2009 tarihinde

tamamlanarak çekirdeklerin meyve etinden ayrılması sağlanmıştır. % 20 lik ticari

çamaşır suyunda 15 dk. süreyle dezenfekte edilen tohumlar kurumaya bırakılmış,

ardından hava almasına olanak sağlayan filelere konarak +4 derecede muhafaza

altına alınmıştır.

Her iki çeşitten 25 er tohum bulanacak şekilde 1 Ağustos 2009 tarihinde 4 tekerrür

olarak katlamaya alınan tohumlar Aralık ayının sekizinde torf/perlit (1:1) ortamına

ekilmiş, 13 gün sonra ‘Sweatheart’ çeşidinden 2 adet tohumda çimlenme

gözlemlenmiştir (Şekil 3.10).

24

Şekil 3.10. Katlama sonrası çimlenen ‘Sweatheart’ tohumları

Katlama uygulamasının tekrarı olmak üzere 25 Şubat 2010 tarihinde deneme

tekrarlanmıştır. 90 gün sonra katlamadan çıkarılan tohumların torf/perlit (1:1)

karışımına ekimi yapılmış ve çimlenen tohumlar gözlemlenmiştir (Şekil 3.11).

Şekil 3.11. Katlama uygulaması sonrası ekimi yapılan tohumların viollerde çıkışları

3.2.3. In vitro çimlendirme denemeleri Hasadı müteakip 5 farklı besin ortamına ekimi yapılan tohumların çimlenme

yüzdeleri alınmış, bu veriler katlama uygulamasına tabi tutulan tohumların çimlenme

yüzdeleri ile kıyaslanmıştır. Çimlendirme denemeleri için in vitro için Agar, Agar+ 1

mgl-1 BA, WPM, WPM+ 1mgl-1 BA ve WPM+ 1mgl-1 BA+ 0,5 mgl-1 GA3 ortamları

kullanılmıştır. Şekil 3.12’de in vitro da çimlenen tohumlardan bir kısmı

görülmektedir.

25

Şekil 3.12. ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ tohumlarının in vitro da çimlenmeleri

3.2.4. Kotiledon eksplantından rejenerasyon denemeleri

3.2.4.1. Tohumların toplanması ve eksplant hazırlanması

Kotiledon eksplantlarından rejenerasyon çalışmalarında materyal olarak kullanılmak

üzere Haziran sonunda derimi yapılan ‘Sweetheart’ ve ‘0900 Ziraat’ çeşitlerinin

tohumları toplanmıştır. Eğirdir Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitütüsü’nde bulunan

ağaçların olgun meyvelerinden elde edilen tohumlar meyve etinden ayrıldıktan sonra

musluk suyu altında yıkanmış, daha sonra % 20 lik sodyum hipoklorit çözeltisinde

26

15 dk. dezenfekte edildikten sonra musluk suyu ile 3 kez tekrar yıkanıp kuruması

için oda sıcaklığında 2 gün kurumaya bırakılmıştır. Daha sonra tohumlar filelere

konularak +4 °C de deneme zamanına kadar muhafaza edilmiştir.

Denemeler kurulmadan önce endokarp tabakası kırılarak % 20 lik sodyum hipoklorit

çözeltinde 15 dakika yüzey sterilizasyonu yapılarak ve distile suyla 5 kez

yıkanmıştır. Tohum kabuğu uzaklaştırıldıktan sonra tohumun yaklaşık 1/5 lik kısmı

arkasından kesilmiş, testa tabakası kaldırılmıştır. Embriyonun kotiledondan

ayrılmasından sonra tohum dış yüzeyi ortama temas edecek biçimde ekim

yapılmıştır. Deneme, 6 tekerrür ve her tekerrür de 8 eksplant olacak şekilde

kurulmuştur (Şekil 3.13).

Şekil 3.13. Kotiledon dokusundan rejenerasyon denemesinin kurulması

Kotiledondan rejenerasyon denemelerinde 1 mgl-1 TDZ ve 0,1 mgl-1 NAA ilave

edilen WPM besin ortamına konulan eksplantların 5-10-15 gün alüminyum folyo ile

sarılmak suretiyle karanlıkla inkübe edilerek, karanlığa tabi tutulmayan eksplantlarla

karşılaştırılması denemesi kurulmuştur. TDZ ile ön muamelenin rejenerasyona

etkisinin araştırıldığı çalışmada ise 0,8 mgl-1 TDZ de 4 ve 8 saat bekletilen

tohumların rejenerasyon sonuçları gözlenmiştir. Ön muamele uygulanmayan

tohumların 24 Eylül 2010 tarihinde ekimi yapılmış, 20 Ekim 2010 tarihinde rejenere

olan sürgünlerin ve yeşillenen tohumların sayımı yapılmış, eksplant başına sürgün

sayısı ve rejenerasyon oranı hesaplanmıştır.

27

3.2.4.2. Karanlık uygulamasının rejenerasyona etkisi

Karanlık uygulamasının rejenerasyonu artırdığı bildirildiğinden (Canlı ve Tian,

2008a) ekim sonrası 16:8 saat fotoperiyot uygulanan tohumlarla, 5 gün, 10 gün ve 15

gün karanlıkta tutularak fotoperiyot uygulanan tohumlarda rejenerasyon oranı ve

eksplant başına sürgün sayısı incelenmiştir. Karanlık uygulamasına tabi tutulan petri

kapları, alüminyum folyo ile sarılarak ışıkla teması kesilmiş, süre bitiminde

alüminyum folyo kaldırılmıştır.

3.2.4.3. TDZ ile ön muamelenin rejenerasyona etkisi

Thidiazuron ile ön muamele uygulamasında 0,8 mgl-1 TDZ ile 4 saat ve 8 saat

manyetik karıştırıcı üzerinde muamele edilen tohumların, ön muamele

uygulanmayan tohumlarla karşılaştırılması yapılmıştır.

3.2.5. Yaprak eksplantından rejenerasyon denemeleri

3.2.5.1. Yaprakların toplanması ve eksplant hazırlanması

Yapraktan rejenerasyon denemeleri için saksıda yetiştirilen fidanlardan yaprak

örneği alınmıştır. Bu örnekler deterjanlı su şişelerine alınarak, bir çalkalayıcı

üzerinde 10 dakika yıkanmıştır (Şekil 3.14). Daha sonra musluk suyu altında

durulanmış, eksplantlar % 10’ luk çamaşır suyu (% 0.787 sodyum hipoklorit) ile 15

dakika dezenfekte edildikten sonra steril kabin içerisinde 5 kez steril deiyonize su ile

yıkanmıştır. Hazırlanan WPM ortamı pH’ı otoklavdan önce HCl veya NaOH ile

5,78’e ayarlanmış ve 121 °C ve 106 kPa de 15 dakika otoklav edilmiştir. Sonra ortam

her kaba 15 ml olacak şekilde 100 X 20 mm’lik steril petri kaplarına dağıtılmıştır.

Deneme 6 tekerrür (petri kabı) ve her tekerrürde 5 yaprak parçacığı olacak şekilde

kurulmuştur. Yaprak örneklerinin orta damarına dik olacak şekilde 4 adet yaralama

yapılmıştır ve yaprak alt yüzeyi ortama temas edecek şekilde ekim işlemi yapılmıştır

(Şekil 3.15).

28

Şekil 3.14. Saksıdaki fidanlardan alınan yaprak eksplantlarının deterjanla yıkanması

3.2.5.2. Bitki büyümeyi düzenleyicilerin rejenerasyona etkilerinin belirlenmesi

Kiraz türünün yapraklarından rejenerasyonunda WPM (Lloyd and McCown, 1980)

besin ortamı iyi sonuçlar verdiği rapor edildiğinden (Bahgwat ve Lane, 2004), bitki

büyümeyi düzenleyicilerin rejenerasyona etkilerinin belirlenmesi denemeleri WPM

basal tuzlarının karışımından oluşan besin ortamında yapılmıştır. Vitamin olarak

Gamborg vd., (1968)’nin geliştirdiği B5 ortamının vitamin kombinasyonu ve

konsantrasyonu kullanılmıştır. Önce optimum TDZ konsantrasyonun belirlenmesi

amacıyla NAA’nın 0.1 mgl-1 konsantrasyonu ile TDZ’nin (0.5, 1 ve 1.5 mgl-1)

konsantrasyonlarından oluşan kombinasyonları ortama ilave edilmiştir. Otoklav

işleminden sonra hazırlanan besi ortamları, her kapta 15 ml ortam olacak şekilde

steril petri kaplarına dağıtılmıştır. Yaprak parçaları yaprak ana damarına dik

vaziyette 4 kez yaralanmış ve yaprak alt yüzeyi besin ortamına temas edecek şekilde

ekimi yapılmıştır (Şekil 3.15). Ekimi yapılan petriler parafilm ile kapatılıp büyüme

29

odasına alınmıştır. On birinci günden itibaren yapraklarda kallus oluşumu görülmüş,

kırkıncı gün dijital kumpasla kallus çapları ölçülmüştür.

Şekil 3.15. Yapraklarda kallus oluşumu

3.2.5.3. Karanlık uygulamasının rejenerasyona etkisi

10 gün karanlıkta bekletilen yaprak parçacıkları ile karanlık uygulanmayan

eksplantlar birbirleri ile karşılaştırılmış ve karanlık uygulamasının rejenerasyona

etkisi araştırılmıştır (Şekil 3.16).

30

Şekil 3.16. Karanlık uygulaması yapılan petri kapları

3.2.6. Deneme deseni ve istatistiki analiz

Çalışmadaki tüm ortam denemeleri tesadüf parselleri deneme desenine göre

kurulmuştur. Sonuçlar kotiledon eksplantından rejenerasyon denemelerinde eksplant

başına sürgün sayısı ve rejenerasyon oranı olarak, çimlendirme denemelerinde ise

çimlenen tohum yüzdesi olarak verilmiştir. Yaprak eksplantında ise oluşan kallus

çaplarının ölçümü yapılmıştır. Ortalamalar JMP istatistik programı kullanılarak % 5

seviyesinde analize tabi tutulmuştur.

31

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA

4.1. Çimlendirme Denemeleri

4.1.1. Katlama uygulaması

4.1.1.1. Tohum kabuğuyla katlama uygulaması

Kabuğuyla katlama uygulaması yapılan tohumlardan ‘Sweetheart’ çeşidinde % 2,

‘0900 Ziraat’ çeşitinde ise %1 çimlenme gerçekleşmiştir (Şekil 4.1). Tohumların

suyu absorbe ederek şişmesi ve tohum kabuğunu çıtlatması, ‘0900 Ziraat’ gibi

büzüşük tohumlarda zor olmaktadır. Kiraz tohumlarında en uygun soğukta nemli

katlama sıcaklığı 1-5 ºC arasında ve tercihen 3ºC olduğu bildirilmiştir (Finch-

Savage, 1998). Meyve türlerinin tohumlarındaki dormansinin kırılması için

uygulanan ana yöntem katlamadır. Katlama için optimum 5ºC olmak üzere 0-10 ºC

arasında değişen sıcaklıklar etkilidir (Sharma and Singh, 1980; Güleryüz, 1982;

Mehanna and Martin, 1985; Chopra et al., 1989; Koyuncu vd., 1999; Malcolm et al.,

2003).

Şekil 4.1. ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ kiraz çeşitlerinin katlama sonunda çıtlamış

hali

4.1.1.2. Tohum kabuğu kırılarak katlama uygulaması Katlama süresi bitiminde gömleğini yırtan tohumlardan 1 mm. ve üzerinde süren

tohumlar (Şekil 4.2) sayılmış daha sonra viollere ekimleri yapılmıştır. Viollerde

32

sürmüş olan bu tohumlar tam bitkiye dönüşmüş, ‘0900 Ziraat’ çeşidinde % 12,5

çimlenme gerçekleşirken ‘Sweetheart’ çeşidinde bu oran % 42 olmuştur.

Şekil 4.2. Katlama sonrası tohum gömleğini yırtarak filizlenen tohumlar

4.1.2. In vitro çimlendirme denemeleri

In vitro çimlendirme denemelerinde Agar, Agar+ 1 mgl-1 BA, WPM, WPM+ 1 mgl-1

BA, WPM+ 1mgl-1 BA+ 0,5 mgl-1 GA3 olmak üzere 5 farklı ortam kullanılmış ve en

yüksek çimlenme yüzdesi, her iki çeşit içinde WPM+ 1mgl-1 BA+ 0,5 mgl-1 GA3

kompozisyonundan elde edilmiştir. İstatistik analiz neticesinde her iki çeşittede

ortamların etkisi çok önemli çıkmıştır. Çeşitlerin, besin ortamlarına yanıtı da farklı

olmuş, WPM ortamı tek başına kullanıldığında ‘0900 Ziraat’ çeşidinde, BA ilave

edilerek kullanıldığında ‘Sweetheart’ çeşidinde çok başarılı olmamıştır. Yalnızca

Agar ortamına ekilen tohumlardan dahi WPM’dan daha iyi ya da ona yakın sonuç

alınmıştır.

Ercişli vd. (1999)’nin, kayısıların tohum çimlenmesi üzerine vitaminlerin etkisini

araştırdıkları çalışmasında 3 kayısı çeşidi ve 2 yabani kayısı tiplerinde yaptıkları

çalışmada %50 çimlenme oranı ile askorbik asit en yüksek sonucu verirken, thiamin

%38,33 ile en düşük çimlenme oranında kalmıştır. WPM ortamına askorbik asit ilave

edilmesi çimlenme oranınına pozitif etki yapabilir.

‘0900 Ziraat’ çeşidi tohumların Agar ortamında %54,5 çimlenme yüzdesinin, ortama

1 mgl-1 BA ilave edilince % 61,4 e çıkması ve yine ‘Sweetheart’ çeşidi tohumlarının

33

Agar ortamında %55,2 çimlenirken BA ilavesi ile bu oranın %69,3 olması, BA’nın

çimlenme üzerine etkili olduğunu göstermektedir.

Çizelge 4.1. ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ çeşitlerinin iki yılın ortalamasına ait in

vitro ve katlama uygulamalarının çimlenme oranları

Ortam Çimlenme Yüzdeleri (%)

0900 Ziraat Sweetheart

WPM+ 1mg/l BA+ 0,5 mg/l GA3 69,8 a 69,8 a WPM+ 1mg/l BA 63,8 ab 22,9 c Agar+ 1 mg/l BA 61,4 ab 69,3 a Agar 54,5 b 55,2 b WPM 27,1 c 55,7 b Tohum kabuğu kırılarak katlama 12,5 cd 42 b Tohum kabuğuyla katlama 1 d 2 d

4.2. Kotiledon Eksplantından Rejenerasyon Denemeleri

‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ kiraz çeşitlerinin olgun kotiledonlarından meydana

gelen yeni bitkiler Şekil 4.3’de görülmektedir. Kotiledon dokularından rejenerasyon

sonuçlarında çeşitlerin rejenerasyona tepkileri farklı olmuştur. Bu durum,

rejenerasyonun bitkinin genotipi tarafından etkilendiği sonucu ile uyumludur (Canlı

and Tian, 2008). Eksplant başına sürgün sayısı ortalamaları göz önüne alındığında

‘0900 Ziraat’ çeşidinde 1,13 olan bu oran, ‘Sweetheart’’ta 1,02 olmuştur. Ön

muamele ve karanlık uygulamasının eksplant başına sürgün oranına etkisi istatistikî

olarak çok önemli bulunmuştur.

Rejenerasyon oranında çeşitlerin ve karanlık uygulamalarının etkisi istatistikî açıdan

çok önemli bulunmuş, ‘0900 Ziraat’ için 5, 10 ve 15 gün olmak üzere karanlığa tabi

tutulan tohumlar arasında fark bulunmamıştır. ‘Sweetheart’ çeşidinin 10 gün karanlık

uygulamasından ise % 15,83 ile en yüksek rejenerasyon oranı elde edilmiştir.

34

Şekil 4.3. Rejenere olan kotiledon dokuları ‘Sweetheart’ (solda) ve ‘0900 Ziraat’ (sağda)

35

4.2.1. Karanlık uygulamasının rejenerasyona etkisi

Karanlık uygulamasının çeşitlere göre eksplant başına sürgün sayısı ve rejenerasyona

oranı Çizelge 4.2’de görülmektedir. İstatistikî olarak önemli çıkan karanlık

uygulaması, her iki çeşidinde rejenerasyonunu artırmıştır. Hem ‘0900 Ziraat’, hem de

‘Sweetheart’’ın eksplant başına sürgün sayılarına bakıldığında 10 gün karanlık

uygulamasının en yüksek sonucu verdiği görülmektedir. Süre 15 güne çıktığında ise

bu oran düşmekte ve sürgün sayısı azalmaktadır. Bu açıdan bakıldığında kırılma

noktası yakalandığı söylenebilir. Rejenerasyon yüzdeleri incelendiğinde ise ‘0900

Ziraat’ çeşidinde 5, 10, ve 15 gün karanlık uygulaması arasında fark bulunmazken,

‘Sweetheart’ çeşidinde en yüksek oran %15,8 ile 10 gün karanlık uygulamasında

elde edilmiştir. Karanlık uygulamasının rejenerasyonu artırdığı görülen bu sonuçlar,

Canlı ve Tian (2008a)’nın bildirdiği sonuçlar ile uyumludur.

Çizelge 4.2. Karanlık uygulamasının ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ çeşitlerine ait

kotiledon eksplantlarında eksplant başına sürgün sayısı ve rejenerasyon oranına etkisi

Karanlık Uygulaması (Gün)

0900 Ziraat Sweetheart Eksplant

başına sürgün sayısı

Rejenerasyon oranı (%)

Eksplant başına sürgün sayısı

Rejenerasyon oranı (%)

0 0,54 b 6,94 b 0,4 b 5,83 b 5 1,06 a 26,39 a 0,79 ab 9,82 ab

10 1,13 a 24,22 a 1,02 a 15,83 a 15 1,09 a 25,89 a 0,67 ab 8,33 b

4.2.2. TDZ ile ön muamelenin rejenerasyona etkisi

Literatür ışığında TDZ ile ön muamele uygulamasının sonuçları Çizelge 4.3’de

verilmiştir. TDZ ile ön muamele yapılmasının ‘0900 Ziraat’ çeşidinde rejenerasyon

oranına etkisi istatistikî olarak önemsiz iken, 8 saat ön muamele ‘Sweetheart’

çeşidinde rejenerasyon oranını artırmıştır. TDZ ile ön muamele, her iki çeşitte de

eksplant başına sürgün sayısını artırmıştır. Ön muamele uygulanmayan ‘0900 Ziraat’

kotiledonlarının %17,5 olan rejenerasyon oranı, 8 saat TDZ ile muamele edilmesiyle

%23’e; ‘Sweetheart’ çeşidinde ise %5’ten %15,6’ya yükselmiştir. Ön muamelenin

rejenerasyon oranına etkisi göz önüne alındığında kırılma noktası yakalanamamıştır.

36

Ön muamele süresinin uzatılması ya da TDZ konsantrasyonunun artırılması ile bu

oran daha yükseklere çıkma ihtimali olabilir.

Çizelge 4.3. TDZ ile ön muamele uygulamasının ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ çeşitlerinin kotiledon eksplantlarında eksplant başına sürgün sayısı ve rejenerasyon

oranına etkisi

Ön muamele (TDZ 0,8

mg/l)

0900 Ziraat Sweetheart Eksplant

başına sürgün sayısı

Rejenerasyon oranı (%)

Eksplant başına

sürgün sayısı

Rejenerasyon oranı (%)

0 0,69 b 17,59 0,29 b 5,00 b 4 saat 1,2 a 21,87 0,76 a 9,21 b 8 saat 1,1 a 23,02 1,07 a 15,63 a

4.3. Yaprak Eksplantından Rejenerasyon Denemeleri

Yaprak eksplantı denemelerinden yeni bitki elde edilememiştir. Yapılan çalışmalar

sonucu oluşan kallusların çapları (mm) ölçülmüş ve istatistikî analize sokulmuştur.

Kallustan başlatılan kültürlerin virüsten ari bitki rejenerasyonunda da

kullanılabileceğine dair raporlar bulunmaktadır ancak kallus kaynaklı bitkiler genetik

olarak orijinal bitkiye benzemeyebilir (Baydar, 2008). Kalluslar alt kültüre

alınmamıştır. Yaprak eksplantından in vitro rejenerasyon protokolü geliştirme

çalışmasında kullanılan yaprak materyalleri, in vitro’dan değil, saksıda yetiştirilmiş

fidanlardan alınmıştır.

4.3.1. Bitki büyüme düzenleyicilerin rejenerasyona etkisi

Bitki büyüme düzenleyicilerin rejenerasyona etkisinin araştırıldığı bu bölümde TDZ

nin 0,5 mgl-1, 1 mgl-1 ve 1,5 mgl-1 olmak üzere üç farklı doz kullanılmıştır. Ortam

olarak WPM ortamı kullanılmış ve bu ortama 0,1 mgl-1 NAA ilave edilmiştir.

Çizelge 4.4’de ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ çeşitlerine ait kallus çapları görülmekte

olup ‘0900 Ziraat’ için 1mgl-1 ve 1,5 mgl-1 TDZ dozlarının aynı grupta yer aldığı ve

0,5 mgl-1 den iyi sonuç verdiği tespit edilmiştir.

37

Çizelge 4.4. Farklı TDZ dozları neticesinde yapraklarda oluşan kallus çapları

TDZ (mg/l)

Kallus çapı (mm) 0900 ziraat Sweetheart

0,5 2,97 b 3,11 1 3,91 a 3,96

1,5 3,99 a 3,87

4.3.2. Karanlık uygulamasının rejenerasyona etkisi

‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ çeşitlerinin karanlık uygulanmayan ve 10 gün

karanlığa tabi tutulan muameleler sonucunda yapraklardan meydana gelen kallus

çapları Çizelge 4.5’de görüldüğü gibi gerçekleşmiştir.

Çizelge 4.5. Karanlık uygulaması sonunda ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ çeşitlerinin

yapraklarında oluşan kallus çapları

Karanlık uygulaması Kallus çapı (mm) 0900 ziraat Sweetheart

0 gün karanlık 3,56 3,77 10 gün karanlık 3,69 3,53

Genellikle yaprak ve gövde parçaları, tohum kaynaklı dokulara göre daha güç

rejenere olmaktadır. Çalışmamızda kullanılan ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ kiraz

çeşitlerinin tohum kaynaklı kotiledon dokularından rejenerasyon sağlanırken, yaprak

dokusundan yeni bitki elde edilememiştir.

Günümüze kadar yapılan çalışmalar, odunsu bitkilerin yapraklarından rejenerasyon

çalışmalarında bitki büyüme düzenleyicilerin çok önemli olduğunu göstermektedir.

TDZ kullanımının BAP’dan daha etkili sürgün rejenerasyonu sağladığını belirten

araştırmacılar olduğu gibi (Leblay et al., 1990; Korban et al., 1992; Escalette and

Dosba, 1993; DeBond et al., 1996; Sarwar and Sirvin, 1997; Hammatt and Grant,

1998), BAP’ın TDZ’den daha etkili olduğunu kaydedenler (Tang et al., 2002) ve

ikisi arasında fark bulunmadığını söyleyenler (Yang and Schmidt, 1992) de vardır.

Matt ve Jahle (2005), TDZ yerine BAP kullanılmasının çalıştıkları kiraz çeşitleri

içerisinde yalnızca ‘Sweetheart’ çeşidinin rejenerasyonunda olumlu sonuç verdiğini

bildirmişlerdir. ‘Sweetheart’ çeşitinden en uygun neticeyi ise, boğum arası

38

eksplantının kullanıldığı ve 1,7 mgl-1 TDZ ile 0,1 mgl-1 IBA ilave edilen QL

ortamından aldıklarını bildirmişlerdir. Aynı araştırmacılar, kiraz çeşitlerinin yaprak

ve boğum arası eksplantı kullanarak rejenerasyon protokolü geliştirdikleri

çalışmalarında en iyi sonucu TDZ ve NAA ilave edilen (Driver ve Kuniyuki, 1984)

DKW/WPM (1:1) ortamından, ‘Schneiders’ ve ‘Regina’ çeşitlerinden elde etmişler,

diğer çeşitler için en uygun kompozisyonun TDZ ve IBA olduğunu belirtmişlerdir.

DKW/WPM ortamının tuz içeriği, bu çalışmamızda kullanılan WPM’den fazladır.

Eksplant olarak boğum arası materyalinin kullanılmasının, yaprak eksplantının

kullanılmasından daha iyi olduğunu söyleyen Matt ve Jahle (2005), bununla ‘Regina’

çeşitinden 2 kat, ‘Schneiders’ çeşitinden ise 5 kat fazla sürgün elde edildiğini

söylemişlerdir. Kullanılan boğum arası eksplantı başına 20 ve daha fazla sürgün

gözlemlenirken, yaprak eksplantında bu rakam 1 ya da 2 yi geçmemiştir. Yine

eksplant tipi olarak yaprak yerine boğum arası eksplantı kullanılması da ‘0900

Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ çeşitlerinin vejetatif dokusundan rejenerasyon protokolü

geliştirilmesinde çalışılması merak uyandıran konular arasındadır.

Bhagwat ve Lane (2004) ile Tang vd., (2002) kiraz yapraklarının rejenerasyonunda,

Hammatt ve Grant (1998) siyah kirazın rejenerasyonunda optimal besin ortamı

olarak WPM bildirmişlerdir. Yang ve Schmidt (1992) ise, kiraz yapraklarının

adventif sürgün rejenerasyonu niçin en başarılı ortam olarak N6 yı bulmuştur. Matt

ve Jahle (2005), kirazın yapraklarını ve boğum aralarını kullanarak rejenerasyon

çalışmalarında ise MS, QL ve N6 arasında fark bulamamışlar ancak B5 (Gamborg et

al., 1968) ortamının rejenerasyonu düşürdüğünü bildirmişlerdir.

Bhagwat ve Lane (2004), ‘Lapins’ ve ‘Sweetheart’ çeşitlerinin yaprakları ile

yürüttükleri rejenerasyon çalışmasında TDZ ve NAA kombinasyonunun çok etkili

olduğunu belirtmişler, NAA konsantrasyonunun artırılmasının rejenerasyonu

olumsuz etkilediğini bildirmişlerdir. Besin ortamına eklenen 0,1 mgl-1 NAA

konsantrayonun düşürülmesi, bu çeşitlerin sürgün rejenerasyonunu teşvik edebilir.

39

Oksinler hem rejenerasyonu hem de dokularda ki etilen sentezini uyarmaktadır (Yu

and Yang, 1979). Etilen üretimi ise bazı bitkilerde adventif göz uyanımını

engelleyebilir ya da kısıtlayabilir. Burgos ve Alburquerque (2003), etilen inhibitörü

olan silver thiosulfate (STS) kullanarak kayısıda rejenerasyon yüzdesini artırmıştır.

Aynı olumlu etki Matt ve Jahle (2005)’nin kiraz çalışmalarında görülmemiştir. Silver

thiosulfate’ın kombinasyonu ve konsantrasyonu da ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’

çeşitlerinde tatbik edilmesi gereken bir diğer faktör olarak görünmektedir.

Karbonhidratlar, organogenesiste sadece karbon ve enerji kaynağı olarak değil aynı

zamanda osmotik ajan olarak da görev yaparlar (Thorpe and Murashige, 1970;

Verma and Dougall, 1977). Bu osmotik etki, fizyolojik reaksiyon ve kallus oluşumu

ile ilişkilendirilebilir (Huang and Liu, 2002). Ucuz ve kolay ulaşılabilir olmasının

yanında kolayca çözünmesi gibi nedenlerle en yaygın kullanılan karbonhidrat

kaynağı sakkarozdur. Diğer bir karbonhidrat kaynağı olan sorbitol, Prunus mume

(Harada and Muarai, 1996)’nin mikroçoğaltımında ve Malus domestica (Karhu,

1997)’nın organogenesisinde başarı ile kullanılmaktadır. Matt ve Jahle (2005),

eksplant olarak yaprak kullanılan rejenerasyon çalışmalarında sakarozun sorbitolden

daha iyi sonuç verdiğini bildirmişler ancak boğum arası eksplantları ile ‘Sweetheart’

çeşitinde yaptıkları çalışmada ise sorbitolun daha etkili olduğunu bildirmişlerdir.

Elmanın yapraklarından rejenerasyon çalışmasında ise sakkaroz ve sorbitol benzer

etki göstermiş, boğum arası kullanıldığında sorbitol daha etkin bulunmuştur

(Montocelli et al., 2000). Lemos ve Baker (1998), farklı karbon kaynağı ve

konsantrasyonlarının (Annona muricata L.)’nın boğum arası eksplantlarından sürgün

ve kallus oluşumuna etkisini araştırdıkları çalışmalarında sorbitolün 10–30 gl-1

konsantrasyonlarında sürgün rejenerasyonunu uyardığını, en yüksek rejenerasyon

etkinliğinin 20 gl-1 dozunda olduğunu bildirmişlerdir. Aynı çalışmada 20 ve 30 gl-1

sakkaroz kullanımının kallus oluşumu sağladığı ve sürgün rejenerasyonu olmadığı da

belirtilmiştir. Biz bu çalışmada sakarozu kullandık ve Lemos ve Baker (1998)’ın

bildirdiğiyle paralel sonuç aldık. Sorbitolün bu çeşitlerde ne gibi bir etki yapacağı

ise merak konusudur.

40

5. SONUÇ

Bu çalışmada ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ kiraz çeşitlerinin tohum çimlenmeleri,

katlama uygulamaları ve in vitro koşullarda incelenmiş ve çimlenme yüzdesindeki

artışla birlikte zamandan tasarruf sunması gibi imkânlar nedeniyle in vitro

çimlendirme protokolünün pozitif katkıları görülmüştür.

Denemede, kabuklu olarak ve kabuğu kırılmış halde +4 ºC’de 120 gün katlanan

tohumlar ile in vitro şartlarda beş farklı besin ortamı (Agar, Agar+ 1 mgl-1 BA,

WPM, WPM+ 1 mgl-1 BA, WPM+ 1mgl-1 BA+ 0,5 mgl-1 GA3) karşılaştırılmıştır.

‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ çeşitlerinde kabuklu katlama yapılan tohumlarda % 1

ve % 2 oranında çimlenme elde edilmiş, kabuğu kırılarak katlamaya alınınca bu

oranlar % 12,5 ve % 42 olmuştur. Kuşkirazına nazaran daha kalın kabuğa sahip olan

tohumlarda çimlenme oldukça düşük seviyede gerçekleşmiştir. Her iki çeşit için en

yüksek çimlenme yüzdesi ise WPM+ 1 mgl-1 BA+ 0,5 mgl-1 GA3 ortamından % 69,8

olarak elde edilmiştir. ‘0900 Ziraat’ için bunu % 63,8 ile WPM+ 1mgl-1 BA,

‘Sweetheart’ için % 69,3 ile Agar+ 1mgl-1 BA izlemiştir. Bu sonuçtan hareketle

çimlendirme denemeleri sonucunda, in vitro çimlendirme tekniğinin katlama

uygulamasına göre hem daha yüksek çimlenme imkânı sağlaması, hem de zamandan

tasarruf imkânı gibi avantajları görülmüştür. 3 ay- 4 ay gibi katlama süresini

beklemeden, daha yüksek çimlenme yüzdesi, ıslah çalışmaları neticesinde elde edilen

melez tohumların in vitro çimlendirme tekniğiyle tam bir bitkiye dönüştürülmesinde

kullanılabilir.

Çalışmada yer alan diğer bir konu, ‘0900 Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ kiraz çeşitlerinin

depolanabilen olgun kotiledonlarından in vitro rejenerasyon protokolü

geliştirilmesidir. Kotiledon eksplantlarından rejenerasyon, her ne kadar kendini

ispatlamış bir çeşidin bir karekter bakımından genetik olarak geliştirilmesi için

uygun olmasa da, genetik mühendisliğinin değişik amaçlara hizmet eden

tekniklerinde kullanılmaktadır. Bunlar arasında markır gen değerlendirmeleri ve

optimizasyonu, gen eksprasyon çalışmaları, promötor değerlendirmeleri, böcek ve

virüslere dayanım ve gen susturma teknolojileri sayılabilir. Bu çalışma ile ‘0900

Ziraat’ ve ‘Sweetheart’ kiraz çeşitlerinin olgun kotiledonlarından sırasıyla % 26,3 ve

41

% 15,8 rejenerasyon frekansı elde edilmiştir. Besin ortamının, büyüme

düzenleyicilerin kompozisyonu ve konsantrasyonunun, ön muamelerde kullanılan

büyüme düzenleyicinin konsantrasyonu ya da uygulama süresinin uzatılmasıyla bu

oran daha da artırılabilir bulunmuştur.

Genetik mühendisliği teknikleri kullanılarak, diğer özelliklerinin bozmadan bir

çeşidin geliştirilmesi, ona yeni bir özellik kazandırılması günümüz teknolojisi ile

mümkün hale gelmiştir. ‘Türk kirazı’ olarak ün yapmış ve ihracatta çok önemli bir

değere sahip olan ‘0900 Ziraat’ kiraz çeşidimizin kalite özelliklerini bozmadan,

kendine verimlilik geni aktarmak ve ülke ekonomisine katma değer üretmek amacını

da taşıyan bu çalışmada gen transferinin ön koşulu olan yüksek frekanslı in vitro

rejenerasyon protokolü geliştirmek çalışmanın bir diğer ayağını oluşturmaktadır.

Vejetatif dokulardan geliştirilmesi gereken bu protokol için yaprak dokuları

kullanılmış ancak yeni bitki elde etme noktasında başarıya ulaşılamamıştır. Gerek

karanlık uygulamasının gerekse büyüme düzenleyici (TDZ) konsantrasyonunun

rejenerasyonu önemli derecede etkilediğini görülen çalışmada, ‘0900 Ziraat’

çeşidinin 1,5 mgl-1 TDZ konsantrasyonunda 3,99 mm. kallus çapı, ‘Sweetheart’

çeşidinin 1 mgl-1 TDZ dozunda 3,96 mm. kallus çapı elde edilmiştir. Boğum arası

gibi değişik vejetatif organların da bu amaçla denenmesi, farklı besin ortamları ile

büyüme düzenleyicilerin değişik kompozisyon ve konsantrasyonlarda kullanılması

gerekmektedir. Besin ortamı ve bitki büyüme düzenleyicilerin miktarı rejenerasyonu

etkileyen en önemli faktörlerden olup, tür ve çeşide göre optimize edilmesi

gerekmektedir.

42

6. KAYNAKLAR

Agrawal, P.K., and Dadlani, M., 1995. Techniques in Seed Science and Technology. Second Edition. South Asian Publishers Limited, India.

Ainsley, P.J., Hammerschlag, F.A., Bertozzi, T., Collins, G.G., Sedgley, M. 2001.

Regeneration of almond from immature seed cotyledons. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 67: 221-226.

Anonim. 2011. FAO, http//www.fao.org Erişim Tarihi: 21.06.2011 Anonim 2008a. Tunceli sarımsağı (Allium tuncelianum Kollman, Özhatay, Matthew,

Şiraneci) tohumlarındaki çimlenme probleminin çözülmesi üzerine araştırma. http://www.agri.ankara.edu.tr/bahce/1097_1183723932.doc. Erişim Tarihi: 20.07.2011

Anonim. 2008b. Keçiboynuzu (Ceratonia siliqua L.) tohumlarına yapılan bazı ön

uygulamaların tohumlarının çimlenme oranı ve süresi ile çöğür gelişimi üzerine etkileri. http://ziraat.harran.edu.tr/kongre/Bildiriler/192_DilekYASIN.pdf. Erişim Tarihi: 21.03.2011

Bahgwat, B., Lane, W.D., 2004. In vitro shoot regeneration from leaves of sweet

cherry (Prunus avium) 'Lapins' and 'Sweetheart'. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 78: 173-181.

Bassi, G., Cossio, F., 1994. Simplified protocol for in vitro shoot regeneration from

leaves of Prunus domestica L. (cv. ‘Susina di Dro’). In: Schmidt H & Kellerhals M (eds) Progress in Temperate Fruit Breeding (pp. 361-363). Kluwer Academic Publishers, Dordrecht.

Baydar, N. G., 2008. Süleyman Demirel Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri

Bölümü Bahçe Bitkilerinde Biyoteknoloji Uygulamaları Ders Notları, 17s. Blando, F., Chiriaco, L., Gerardi, C., Lucchesini, M., Rampino, P., 2007. Sweet

Cherry (Prunus avium L.) ‘Giorgia’. Adventitious regeneration from leaves of microplants. European Journal of Horticultural Sciences. S.72

Brown, S. K., Lezzoni, A.F., Fogle, H.W., 1996. Cherries: in Fruit Breeding, Volume

I: Tree and Tropical Fruits (Eds: Jules Janic and James N. Moore) John Wiloy NewYork. USA.

Burak, M., Ergun, M.E., Pezikoğlu, F., 2002. AB ülkelerinde sert çekirdekli meyve

türleri tarımı ve yakın gelecekte beklenen gelişmeler. Avrupa Birliğine uyum aşamasında bahçe bitkileri tarımı, 25-26 Nisan, Ankara, s.165-183.

43

Bürün, B., Türkoğlu, G., 1996. Meristem Ve Sürgün Ucu Kültürleri (II). Meristem Ve Sürgün Ucu Kültürü Uygulamaları. Yüzüncü Yıl Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi. 6(3):169-187.

Canli, F., Tian, L., 2008a. In vitro shoot regeneration from stored mature cotyledons

of sweet cherry (Prunus avium L.) cultivars. Scientia Horticulturae. 116: 34-40.

Canli, F. A., Tian, L., 2008b. Regeneration of adventitious shoots from mature stored

cotyledons of Japanese plum (Prunus salicina Lind1). Scientia Horticulturae. 120:64-69.

Canli, F. A., Skirvin, R.M., 2008. In vitro separation of a rose chimera. Plant Cell

Tissuse Organ Culture. 95: 353–361. Canli, F. A., 2009. Effects of standard basal salt mixtures and 1-Phenyl-3-(1,2,3-

thiadizazol-5-yl) urea pre-treatments on shoot regeneration from mature cotyledons of sweet cherry in vitro. A. J. of Chemistry. 21: 697-702.

Canli, F. A., Tian, L., 2009. Assessment of Regeneration and Transient Expression

Factors for Agrobacterium - Mediated Transformation of Prunus Salicina Lind1. European Journal of Horticultural Sciences. 74:66-72.

Chopra, H. R., Jawanda, J.S., Sandhu, A.S., 1989. Effect of Stratification and Seed

Coat on The Seed Germination of Subtropical Peach cv. Sharbatti. Crop Physiology, 015-22315.

Çekiç, Ç., 1996. Mahlep (Prunus Mahalep L.) Tohumlarının Çimlenmesi Üzerine

Bazı Uygulamaların Etkileri (Yüksek Lisans Tezi). Gazi Osman Paşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Tokat.

Çelik, M., Sakin, M., 1991. Ülkemizde Meyve Fidanı Üretiminin Bugünkü Durumu.

Türkiye I. Fidancılık Sempozyumu, 26-28 Ekim 1987, Ankara, 169-180. Çetin, E. S., Kazaz, S., Baydar, N. G., 2007. Farklı Besin Ortamlarının Karanfil

(dianthus caryophyllus l.) Sürgün Ucu Kültürü Üzerine Etkileri. Batı Akdeniz Tarımsal Araştırma Enstitüsü Derim Dergisi, 2007,24(2):01-08

Çetinbaş, M., Koyuncu, F., 2005. Soğukta nemli katlama ve tohum kabuğunun kuş

kirazı (Prunus avium L.) tohumlarında dormansinin kırılması üzerine etkileri. Akdeniz Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 18(3), 417-423.

De Bondt, A., Eggermont, K., Pennickx, I., Goderis, I., Broekaert, W.F., 1996.

Agrobacterium-mediated transformation of apple (Malus×domestica Borkh.): An assessment of factors affecting regeneration of transgenic plants. Plant Cell Reports 15:549–554.

44

Dolgov, S. V., Firsov, A. P., 1999. Regeneration and Agrobacterium transformation of sour cherry leaf discs. Acta Horticulturae. 484: 577-580.

Driver, J. A., Kuniyuki, A.H., 1984. In vitro propagation of Paradox walnut

rootstock. Horticulturea Science19:507–509. Edizer, Y., Hancı, F., Güneş, M., 2009. Kastamonu Yöresinde Yetişen Bazı Kuş

Kirazı (Prunus avium L.) Tiplerinin Çimlenme Özelliklerinin Belirlenmesi. Gazi Osman Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 2009, 26(1), 7-11.

Ercişli, S., 2004. A Short Review of the Fruit Germplasm Resources of Turkey,

Genetic Resources and Crop Evolution, 51, 419-435. Ercişli, S., A. Eşitken, M. Güleryüz. 1999. The effect of vitamines on the seed

germination of apricots. Acta Horticulture, 488: 437-440. Ergenoğlu, F., S. Tangolar, S. Gök., 1996. The effects of some pre-treatments for

promoting germination of grape seeds. Acta Horticulture, 441. Ergun, M. E., Burak, M., 2001. I. Sert çekirdekliler meyve sempozyumu. 610 pp.

Yalova, Turkey. Escalettes, V., Dosba, F., 1993. In vitro adventitious shoot regeneration from leaves

of Prunus spp. Plant Sciences. 90, 201–209. Espinosa, A. C., Pijut, P.M., Michler, C.H., 2006. Adventitious shoot regeneration

and rooting of Prunus serotina in vitro cultures. Horticulture Science 41, 193–201.

Finch-Savage, W. E., 1998. Farm Woodland Tree Seed. Horticulture Research

International, Wellesbourne, Warwick CV35 9EF, United Kingdom. Gerçekçioğlu, R., Çekiç, Ç., 1997. Mahlep (Prunus mahaleb L.) Tohumlarının

çimlenmesi üzerine bazı uygulamaların etkileri. Turkısh Journal of Agriculture and Forestry, 23, Ek Sayı 1, 145-150.

Güleryüz, M., 1982. Bahçe Ziraatında Büyütücü ve Engelleyici Maddelerin

Kullanılması ve Önemi. Atatürk Üniversitesi Basımevi, 103 s., Erzurum. Güleryüz, M., 1991. Ülkemizde Meyve Fidancılığında Anaç Sorunu ve Dünyada

Anaç Islahı İle İlgili Çalışmalar. Türkiye I. Fidancılık Sempozyumu, 273-285, Ankara.

Güneş, E., Gübbük, H., 2006. Değişik papaya çeşitlerinde (Carica papaya L.)

tohumlara yapılan bazı ön işlemlerin tohum çimlenme oranı ve süresi üzerine etkileri. Akdeniz Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 19(1), 107-114.

45

Hammatt, N., Grant, N.J., 1998. Shoot regeneration from leaves of Prunus serotina Ehrh. (black cherry) and P. avium L. (wild cherry). Plant Cell Reports. 7: 526-530.

Harada, H., Murai, Y., 1996. Micropropagation of Prunus mume. Plant Cell, Tissue

Organ Culture 46:265–267. Hartmann, H.T., Kester, D.E., Davies, F.T., 1990. Plant Propagation. Principles of

Propagation by Seed. 647 p. Hartmann, H.T., Kester, D.E., Davies, Jr.F., Geneve, R.L., 1997. Plant Propagation

Principles and Practies. Sixth Edition, Prentice Hall, New Jersey. Hilhorst, H.W.M., Karssen, C.M., 1992. Seed dormancy and germination: The Role

of absisic acid and gibberalins and the importance of hormone mutants. Plant Growth Regulation, 11: 225-238.

Hokanson, K.E., Pooler, M.R., 2000. Regeneration of ornamental cherry (Prunus)

taxa from mature stored seed. HortScience. 35: 745-748. Huang, W.L., Liu, L.F., 2002. Carbohydrate metabolism in rice during callus

induction and shoot regeneration induced by osmotic stress. Botanical Bulletin of Academia Sinica, 43:107–113.

Huettemann, C.A., Preece, J.E., 1993. Thidiazuron: a potent cytokinin for woody

plant tissue culture. Plant Cell Tissue Organ Culture 33: 105-119. Karakurt, H., Aslantaş, R., Eşitken, A., 2010. Tohum Çimlenmesi ve Bitki Büyümesi

Üzerinde Etkili Olan Çevresel Faktörler ve Bazı Ön Uygulamalar. Uludağ Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, Cilt 24, Sayı 2, 115-128.

Karhu, S.T., 1997. Sugar use in relation to shoot induction by sorbitol and cytokinin

in apple. Journal of the American Society for Horticultural Science, 122:476–480.

Kaşka, N., Yılmaz, M., 1974. Bahçe Bitkileri Yetiştirme Tekniği. Çukurova

Üniversitesi. Ziraat Fak. Yayınları 79, Ders Kitabı 2. (Hartmann, H.T., Kester, D.E., Kester. Tercüme) Adana.

Kaşka, N., 2001. Türkiye’nin sert çekirdekli meyvelerde üretim hedefleri üzerine

öneriler. 1. Sert çekirdekli meyveler sempozyumu. Yalova. P:1-16. Korban, S.S., O’connor, P.A., Elobeiday, A., 1992. Effects of thidiazuron,

naphthaleneacetic acid, dark incubation and genotype on shoot organogenesis from Malus leaves. Journal of Horticultural Sciences & Biotechnology. 67: 341-349.

46

Koyuncu, F., Yıldız, K., Tekintaş, E., 1999. Cevizde (J. regia L.) Tohum Ağırlığının Çimlenme ve Çöğür Gelişimi Üzerine Etkisi. Türkiye III. Ulusal Bahçe Bitkileri Kongresi, 14-17 Eylül 1999, Ankara, 653-657.

Lane, W.D., Cossio, F., 1986. Adventitious shoots from cotyledons of immature

cherry and apricot embryos. Canadian Journal of Plant Science. 66: 953-959. Lang, G., Nugent, J., Andersen, R., 2003. Fresh market sweetcherry varieties for

Eastern North America. Published in “ The Fruit Grower News” Vol. 42(4). www.maes.msu.edu Erişim Tarihi: 20.07.2011.

Leblay, C., Chevreau, E., Raboin, L.M., 1990. Adventitious shoot regeneration from

in vitro leaves of several pear cultivars (Pyrus communis L.) Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 25: 99-105.

Lemos, E.E.P., Baker, D.A., 1998. Shoot regeneration in response to carbon source

on internodal explants of Annona muricata L. Plant Growth Regulators 25:105–112.

Liu, X., Pijut, P.M., 2008. Plant regeneration from in vitro leaves of mature black

cherry (Prunus serotina). Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 94, 113–123. Malcolm, P.J., Holford, P., McGlasson, Newman, S., 2003. Temperature and Seed

Weight Affect The Germination cn Peach Rootstock Seeds and Growth of Rootstock Seedlings. Scientia Horticulturae, 98, 247-256.

Mante, S., Morgens, P.H., ScorzA, R., Cordts, J.M., Callahan, A.M., 1991.

Agrobacterium-mediated transformation of plum (Prunus domestica L.) hypocotyl slices and regeneration of transgenic plants. Bio/Technology. 9: 853-857.

Mante, S., Scorza, R., Cordts, J.M., 1989. Plant regeneration from cotyledons of

Prunus persica, Prunus domestica, and Prunus cerasus. Plant Cell Tissue Organ Culture 19:1-11.

Martinez-Gomez, P., Dicenta, F., 2001. Mechanisms of Dormancy in Seeds of Peach

(Prunus persica (L.) Batsch) cv. GF 305. Scienta Horticulturae, 91, 51-58. Matt, A., Jehle, J.A., 2005. In vitro plant regeneration from leaves and internode

sections of sweet cherry cultivars (Prunus avium L.). Plant Cell Reports. 24: 468-476.

Mehanna, T.H., Martin, G.C., 1985. Effect of Seed Coat on Peach Seed Germination.

Scientia Horticulturae, 25, 247-254. Mehanna, T.H., George, C.M., Nishijıma, C., 1985. Effects of Temperature,

Chemical Treatments and Endogenous Hormone Content on Peach Seed

47

Germination and Subsequent Seedling Growth. Scientia Horticulturae, 27, 63-73.

Montecelli, S., Gentile, A., Damino, C., 2000. In vitro shoot regeneration of apple

cultivar ‘Gala’. Acta Hort 530:219–223. Murashige, T., Skoog, F.A., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays

with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15: 473–497. Nas, M. N., Bolek, Y., Sevgin, N., 2010. The effects of explant and cytokinin type on

regeneration of Prunus microcarpa. Scientia Horticulturae 126; 88–94. Nowak, B., Miczynski, K., 1997. Regeneration of plum (Prunus domestica L)

cultivars ‘Cacanska Rodna’, ‘Stanley’, and ‘Cacanska Najbolia’ from in vitro leaf explants. Folia Horticulturae. 9: 33-42.

Nugent, J.E., 1999. Comments on dark sweetcherry cultivars in approximate order of

ripening. District Horticulturist Michigan State University Extension. www.maes.msu.edu Erişim Tarihi:20.07.2011.

Öz, F., 1988. ‘Kiraz ve Vişne’. Tarımsal Araştırmaları Destekleme ve Geliştirme

Vakfı Yayınları. No:16, s:27, Yalova. Özbek, S., 1978. Özel Meyvecilik. Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Yayınları,

No: 28 Adana. Paris, R., Pratesi, D., Negri, P., 2004. In vitro morphogenic ability of mature or

embryonic apricot tissues. Acta Horticulturae. 663: 487-490. Petri, C., Scorza, R., 2010. Factors affecting adventitious regeneration from in vitro

leaf explants of ‘Improved French’ plum, the most important dried plum cultivar in the USA. Annals of Applied Biology. 156, 79–89.

Pooler, M.R., Scorza, R., 1995. Regeneration of peach [Prunus persica (L.) Batsch]

rootstock cultivars from cotyledons of mature stored seed. HortScience. 30: 355-356.

Quoirin, M., Lepoivre, P., 1977. Improved media for in vitro culture of Prunus sp.

Acta Hort 78: 437–442. Ruzic, Dj. V., Vujovic, T.I., 2008. The effects of cytokinin types and their

concentration on in vitro multiplication of sweet cherry cv. Lapins (Prunus avium L.) Horticultural Science 35 (1): 120-221.

Sarwar, M., Skirvin, R.M., 1997. Effect of thidiazuron and 6-benzylaminopurine on

adventitious shoot regeneration from leaves of three strains of ‘McIntosh’ apple (Malus X domestica Borkh.) in vitro. Scientia Horticulturae. 68: 95-100.

48

Sharma, H.C., Singh, R.N., 1980. Effect of Stratification Temperature And Duration

on The Level of Endogenous İnhibitor And Relationship With Dormancy in Seeds of Subtropical Peach (Prunus persica stock) cv. ‘Sharbati’ Indian journal plant physiology. 23, 26-32.

Sökmen, A., Gürel, E., 2001. Sekonder Metabolit Üretimi. “Bitki biyoteknolojisi. I-

Doku kültürü ve uygulamaları Cilt I, Ed.: M. Babaoğlu, E. Gürel, S. Özcan,” 211-61. Selçuk Üniversitesi Yayınları, Konya. 374 s.

Taiz L, Zeiger, E., 2008. Plant Physiology, Çeviri Editörü:Prof. Dr. İsmail Türkan.

Üçüncü Baskıdan Çeviri. 496-498 Palme Yayıncılık. 950 s. Takashina, T., Nakano, H., Kato, R., 2003. Efficient plant regeneration culture from

leaf explants of in vitro-grown sweet cherry. Acta Hortuculturae 622:123–127.

Tang, H., Zhenglong, R., Reustle, G., Krczal, G., 2002. Plant regeneration from

leaves of sweet and sour cherry cultivars. Scientia Horticulturae 93:235–244. Tang, H.R., Ren, Z.L., Krczal, G., 2000. Somatic embryogenesis and organogenesis

from immature embryo cotyledons of three sour cherry cultivars (Prunus cerasus L.). Scientia Horticulturae. 83: 109-126.

Thorpe, T.A., Murashige, T., 1970. Some histological changes underlying shoot

initiation in tobacco cultures. Physiol Plant 66:58– 62. Verma, D.C., Dougall, D.K., 1977. Influence of carbohydrates on quantitative

aspects of growth and embryo formation in wild carrot suspension cultures. Plant Physiology 59: 81–85.

Westwood, M.N., 1995. Temperate-Zone Pomology, Physiology and Culture. Third

Edition, Timber Pres, pp. 523, Oregon. Wünsch, A., Hormaza, J.I., 2004. Molecular Evaluation of Genetic Diversity and S

Allele Composition of Local Spanish Sweet Cherry (Prunus avium L.) Cultivars. Genetic Resources And Crop Evolution, 51, 635–641.

Yamaguchi, S., Kamiya, Y., 2002. Gibberalins and light-stimulated seed

germination. Journal of Plant Growth Regulators, 20: 369-376. Yan, G.H., Zhou, Y., 2002. Plant regeneration from excised immature embryos of

peach (Prunus persica L.). Acta Horticulturae Sinica. 29: 480-482. Yang, H.Y., Schmidt, H., 1992. Utersuchungen zur Adventivsproßregeneration in

vitro bei Kirschen. II. Adventivsproßbildung an in vitro-Blättern verschiedener Prunus avium-Idio-typen. Gartenbauwissenschaft. 57: 7-10.

49

Yıldırım, A., Koyuncu, F., 2005. Isparta İli Meyve Fidancılığı Üzerine Bir Çalışma. Derim Dergisi.

Yu, Y.B., Yang, S.F., 1979. Auxine-induced ethylene production and its inhibition

by aminoethoxyvinylglycine and cobalt ion Plant Physiology 64:1074–1077. Yüce, B., 1979. Zeytin tohumlarının değişik ortam ve zamanlarda çimlendirmesinin

çimlenme yüzdesine etkileri. htpp://www.magicfinger.net/. Erişim Tarihi 05.05.2011.

50

ÖZGEÇMİŞ

Adı Soyadı : Nurettin TEMURTAŞ Doğum Yeri ve Yılı : Şuhut – 1979 Medeni Hali : Evli Yabancı Dili : İngilizce Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl) Lise : Bursa Ziraat Meslek Lisesi – 1997 Lisans : Atatürk Üniv. Ziraat Fak. Tarım Ekonomisi Böl. – 2005 Yüksek Lisans : Çalıştığı Kurum/Kurumlar ve Yıl:

Doğu Anadolu Tarımsal Araştırma Enstitüsü Md./ERZURUM 1998 – 2007

Eğirdir Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü 2007 -

Yayınları (SCI ve diğer makaleler)

1- Canlı F.A, Pektaş M, Temurtaş N., 2009. Elma da Genetik Transformasyon Alanındaki Gelişmeler. Tarım Bilimleri Araştırma Dergisi 2 (1):81–86