khdak tedavisinde moleküler patolojinin -...

Dr Büge Öz

İÜ Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Patoloji AD

Ulusal Kanser Kongresi 19-23 Nisan 2013

KHDAK tedavisinde

moleküler patolojinin yeri

Hiçbir çıkar ilişkim yoktur.

Akciğer adenokarsinomlarında genetik değişiklik ile ilgili son durum

3

KRAS

EGFR

ALK

Her2

BRAF

PI3KCA

MET

AKT

MAP2KI

ROS1

KIF5B-RET

WT

KRAS

EGFR

ALK

WT

Hedefe yönelik tedavi

KHDAK için moleküler testler için klinik pratik rehberi;

12 Şubat 2013’de yayına kabul edildi 3 resmi derneğin desteği ile;

CAP: Collage of American Pathologist IASLC: International Association for the Study of Lung Cancer AMP :Association for Moleculer Pathology

Ocak 2004- Şubat 2012 aralığında literatür tarama Meta-analiz, randomize–kontrollü araştırmalar, cohort çalışmaları, vaka serileri, karşılaştırmalı metot araştırmaları 1533 özet 521 yayın Yayınlanmadan önce sonuçlar: FDA, NCI, ASCO,NCCN ile tartışıldı.

Tüm çalışmalar/ çalışmaların çoğunluğunda ortak sonuç var; Grade A ve B düzeyinde Kanıt değeri = Recommendation (KD: A / B)

Grade C düzeyinde kanıt var ; Suggestion 2. derece Öneri = 2. Ö

Grade D düzeyinde kanıt/ kanıt net değil ; Uzman fikir birliği = UFB

ANA Sorular

I: KHDAK hastalarında ne zaman moleküler test yapılmalı?

II: EGFR Mutasyonu testi nasıl yapılmalı?

III: ALK testi nasıl yapılmalı?

IV: Akciğer adenokarsinomlarında diğer genler için test yapılmalı mıdır?

V: Akc AdenoKA moleküler testleri nasıl uygulanmalı ve optimize edilmelidir?

ANA Soru I: KHDAK hastalarında ne zaman moleküler test yapılmalı?

Soru 1: Hangi hasta EGFR mutasyonu ve ALK yeni gen düzenlenmesi için test edilmeli?

Soru 2: Ne zaman EGFR mutasyonu ve ALK yeni gen düzenlenmesi test edilmeli?

Soru 3: Bu testler hangi zaman aralığında yapılıp sonuçlanmalı/ sonuçlanabilir?

Soru 1: Hangi hasta, EGFR mutayonu ve ALK yeni gen düzenlenmesi için test edilmeli?

ÖNERİLER 1.1a: EGFR-TKI tedavisi düşünülen tüm hastalar klinik karakteristiklerine bakılmadan EGFR için moleküler olarak test edilmelidir. KD: A 1.1b: ALK –hedef tedavisi düşünülen tüm hastalar klinik karakteristiklerine bakılmadan ALK gen düzenlenmesi için test edilmelidir. KD: B 1.2 EGFR ve ALK için Akc adenoKAları/ AdenoKA komponentli tm.ler histolojik dereceye bakılmaksızın test edilmeli, saf SHK, KHK yada İHK ile adenoKA komponenti olmayan BHK’lar test edilmemelidir. KD:A

(Kanıt değeri= KD) 2. Derece Öneri :Ö (Uzman fikir birliği:UFB)

Soru 1 : Hangi hasta, EGFR mutayonu ve ALK yeni gen düzenlenmesi için test edilmeli?

ÖNERİLER 1.3 Biyopsi/ sitoloji gibi sınırlı materyallerde AdenoKa olasılığı tamamen dışlanamadığından (özellikle sigara içmemiş genç hasta) SHK ve KHK da test edilebilir. KD: A

1.4 Tedavi seçiminde EGFR / ALK statüsü belirlerken primer yada metastatik tm örnekleri her ikisi de çalışılabilir (aralarında fark yok). KD: A

1.5 Birbirinden ayrı multipl primer AdenoKa her biri ayrı ayrı test edilir, ancak aynı tm.ün farklı alanlarının test edilmesi gerekmez. UFB


KHDAK’larında küçük materyal ile değerlendirme

Skuamöz hücreli karsinom KHDAK-NOS Adenokarsinom

IHK: TTF-1 + NapsinA CK 7 + (Müsin +)

IHK «-» Müsin «-»

KHDAK sınıflanamayan

IHK: P63/ N p63 (p40) SK 5-6 Desmokollin3 Müsin «-»

Literatürde oran % 5-10

KHDAK’larında küçük materyal değerlendirme-raporlama

Skuamöz hücreli karsinom (Histo-morfolojik tanı, immunhistokimya gerekli değil)

Adenokarsinom (Histo-morfolojik tanı, immunhistokimya gerekli değil)

KHDAK – büyük olasılıkla Skuamöz H. Ka (İmmunhistokimya ile )

KHDAK – büyük olasılıkla Adenokarsinom (İmmunhistokimya ile )

KHDAK – NOS (immunhistokimya kesin değil/ yapılamamış)

Diğer tip KHDAK (tükrük bezi tipi , vb)

Soru 1 : Hangi hasta, EGFR mutayonu ve ALK yeni gen düzenlenmesi için test edilmeli?

ÖNERİLER 1.3 Biyopsi/ sitoloji gibi sınırlı materyallerde AdenoKa olasılığı tamamen dışlanamadığından (özellikle sigara içmemiş genç hasta) SHK ve KHK da test edilebilir. KD: A

1.4 Tedavi seçiminde EGFR / ALK statüsü belirlerken primer yada metastatik tm örnekleri her ikisi de çalışılabilir (aralarında fark yok). KD: A

1.5 Birbirinden ayrı multipl primer AdenoKa her biri ayrı ayrı test edilir, ancak aynı tm.ün farklı alanlarının test edilmesi gerekmez. UFB


EGFR mutasyon dağılımı

Yatabe Y et al. JCO 2011;29:2972-2977

AKC Adenokarsinomları

EGFR mutasyonlarında psödo-heterogenite

Yatabe Y et al. JCO 2011;29:2972-2977

Soru 2: Ne zaman EGFR mutasyonu ve ALK yeni gen düzenlenmesi test edilmeli?

ÖNERİLER 2.1a : (7. Evreleme sistemine göre) ileri evredeki hastalar için EGFR mutasyon testi hemen tanı sırasında istenmelidir. Daha düşük evreli hastalar için tümör nüksünde/ progresyonunda da test edilebilir. KD: A 2.1b: 2.Ö (7. Evreleme sistemine göre) ileri evredeki hastalar için ALK gen düzenlemesi testi hemen tanı sırasında istenmelidir. Daha önce test edilmemiş, düşük evreli hastalar tümör nüksünde/progresyonunda da test edilebilir. KD:C


Soru 2: Ne zaman EGFR mutayonu ve ALK yeni gen düzenlenmesi test edilmeli?

ÖNERİLER 2.2a UFB Evre I, II, ve III hastalarda EGFR testinin tanı sırasında yapılması desteklenmelidir, ancak son karar bölgesel onkoloji- patoloji takımına bırakılmalıdır. 2.2b UFB Evre I, II, ve III hastalarda ALK testinin tanı sırasında yapılması desteklenmelidir, ancak son karar bölgesel onkoloji- patoloji takımına bırakılmalıdır. 2.3 Dokular EGFR ve ALK testi yapımı öngörülerek değerlendirilmelidir. (EGFR için KD:A, ALK için KD:B)


Patolojiye gelen örnekler Eksfolyatif sitoloji

balgam Bronşiyal yıkama Bronşio-alveolar lavaj

Aspiraston sitolojisi TTİİAB EBUS EUS

Biyopsi Bronş biyopsisi Transbronşiyal biyopsi

Metastatik alandan aspirasyon, tru-cut biyopsi

Hücre bloğu

İmmunhistokimya ; nereye kadar??

Adeno / skuamöz için birer belirleyici, tercihan nükleer boyalar

Yeterli gelmez ise iki sitoplazmik (birbirini dışlayan) primer antikor

Daha fazla doku harcanmadan raporlanmalı

Çift sorgulama yapan primer antikor yakında ticari olarak edinilebilecek (tek kesit ile adeno/skuamöz ayrımı )

March 2-8, 2013 Baltimore Convention Center Baltimore

http://www.uscap.org/index.htm?newsarc.htm

Soru 3: Bu testler hangi zaman aralığında yapılıp sonuçlanmalı/ sonuçlanabilir?

ÖNERİLER

3.1 UFB EGFR ve ALK test sonuçları 2 hafta (10 işgünü içinde verilmelidir. 3.2 UFB Bu testleri ortalama 2 haftada gerçekleştiremeyen laboratuvarlar ya bu testleri 2 haftaya çekmeli yada 2 haftada yapacak laboratuvara yönlendirmelidir. 3.3UFB Final histopatolojik tanıdan sonra ortalama 3 iş gününde moleküler test lab. gönderilmeli yada aynı lab ise 24 saat içinde bu lab.da işleme başlanmalıdır.


ANA Soru II: EGFR Mutasyonu testi nasıl yapılmalı?

Soru 4. EGFR mutasyonu araştırılacak materyaller nasıl işlem görmeli? Soru 5: EGFR testi için gereken materyal nedir/ ne kadardır? Soru 6: EGFR testi nasıl yapılmalıdır? Soru 7: Hastalarda EGFR –TKI tedavi seçiminde KRAS analizinin rolü nedir? Soru 8: Sekonder/edinsel EGFR- TKI tedavi direncinin oluşumunda önem kazanan ek test nelerdir?

Soru 4. EGFR mutasyonu araştırılacak materyaller nasıl işlem görmeli?

ÖNERİLER

4.1 UFB Patolog PCR bazlı EGFR testi için FFPG taze, donmuş yada alkol fikse doku kullanabilir. Diğer (dekalsifikasyon işlemi görmüş doku ,

asitli yada ağır metal içeren fiksatiften geçmiş ) doku örneklerinden kaçınılmalıdır.

4.2 UFB EGFR yada ALK testi için sitolojik materyal (hücre bloğu, smear preparatları ) da uygundur.


Hangi fiksatif????

Moleküler çalışma için uyumlu

%10 tamponlu formalin, paraformaldehit, Karnovsky fiksatifi

Moleküler çalışma için uyumsuz

Bouvin, B5 , Zenker fiksatifi, sitolojik materyalde sadece Alkol fiksatifi, civa klorid fiksatifi, Holand fiksatifi, Asit bazlı dekalsifikasyon

Kemik biyopileri için EDTA dekalsifikasyonu (hızlı ve DNA hasarı daha az )

March 2-8, 2013 Baltimore Convention Center Baltimore

http://www.uscap.org/index.htm?newsarc.htm

Soru 5: EGFR testi için gereken materyal nedir/ ne kadardır?

ÖNERİLER

5.1 UFB EGFR testi için materyalde yeterli miktar tümör olup olmadığına ve materyalin kalitesinin yeterliliğine patolog karar vermelidir.

5.2 UFB Testin validasyonu sırasında en az ne kadar tümör miktarının gerektiğine her lab kendisi karar vermelidir.

5.3 UFB Patolog her örnekte ne kadar tümör olduğunu kendi saptamalı yada bunu yapacak lab. teknisyenleri için eğitim rehberi oluşturmalıdır.


Materyal seçiminde Önemli noktalar, Test duyarlılığını negatif etkileyenler Materyalde tümör hücre oranı %40’ın altında ise mutasyonu saptayamayabilir Tümör hücrelerinin en çok olduğu blok seçilmeli (%50’den fazla) ve alan işaretlenip sadece o alan çalışılmalı Enflamasyon ve nekrotik alanlar olmamalı Kemik metaz. biyopsisi dekalsifikasyon nedeniyle sorun !! Fiksasyon çok önemli; küçük doku için 6-12 sa. ve büyük

dokular için 12-48 saat. %10 tamponlu Formalin fiksasyonu

Alkol (sitolojik materyalde) özellikle FISH uygulamasını olumsuz etkiliyor

Soru 6: EGFR testi nasıl yapılmalıdır?

ÖNERİLER

6.1 Laboratuvarlar EGFR için valide edilmiş ve yeterli performansı olduğu kanıtlanmış herhangi bir test yöntemi kullanabilir. KD:B 6.2 UFB Lab. en az %50 tümör içeren materyalden EGFR testi yapabilmeli, gerektiğinde %10 kadar tm içeren materyal var ise daha hassas metotlar uygulanabilmeli-yada böyle bir lab’a gönderilmeli. 6.3 UFB Mutasyonu saptayacak yöntem %1 yada daha fazla klinik önem taşıyan tüm mutasyonları gösterebilecek bir yöntem olmalıdır. 6.4 EGFR- TKI tedavisi belirlemede EGFR için İHK yöntemi kullanılamaz. KD:A 6.5 EGFR- TKI tedavisi belirlemede gen kopya sayısı saptanması (FISH yada CISH) önerilmez. KD:B


Tanısal materyal için biyopsi teknikleri ve elde edilen doku volümü

21g asp. iğnesi

19g asp iğnesi

Tran b biyopsi

BT eşliğinde İAB

Biyopsi başına hücre sayısı

100 150

300

500

Önerilen Biyopsi sayısı

4 4 4 2-3

50 ml reak 75 ng DNA

Sonunda 3-6 pmol. DNA

DAHA FAZLA tümör hücresine gereksinim var!

Mutation araştırma metotları

Method

Sensitivity

(% of mutant

DNA )

Comments

PCR direct

sequencing

10-30 % Require at least 50

neoplastic cells in the

sample

Pyrosequencing 5-10 %

PCR / dHPLC / HRMA

(Melt analysis )

5% Only screening for

mutation

Fragment analysis

Genscan- PCR/SSCP

5% Only screening for

mutation

Scorpion arms 1%

Chip micro-array 1%

PNA/ LNA Clamp 0.1-1 %

Me PCR-sequencing 0.1-1%

Sec Gen sequencing 0.01 %

Screening

technologies

Targeting

technologies

Soru 7: Hastalarda EGFR –TKI tedavi seçimi için KRAS analizinin rolü nedir?

ÖNERİLER

7.1 EGFR –TKI tedavisi belirlenirken KRAS mutasyonu statüsünü belirlenmesi şartı aranmaz. KD:B


Soru 8: Sekonder/edinsel EGFR- TKI tedavi direncinin oluşumunda önem kazanan ek testler nelerdir?

ÖNERİLER

8.1 Eğer laboratuvar EGFR kinaz inhibitörlerine sekonder direnç gösteren durumları örneğin %5 kadar hücrede görülebilen EGFR T790M mutasyonu gibi mutasyonları saptayabiliyorsa bunlara bakılabilir. KD:B


EGFR inhibitörlerine sekonder direnç

31

EGFR T790M +/-

amplification 50%

Her2 amplification

12%

MAPK1 amplification 5%

PIK3CA 5%

MET amplification 4%

SCLC transformation 6%

Unknown 15%

Soru 9. ALK testi için hangi yöntem kullanılmalıdır? ÖNERİLER

9.1 Lab ALK testi için dual break-apart probu içeren FISH testi uygulamalıdır. İmmunhistokimya, eğer dikkatlice valide edildiyse FISH’e gidecek materyalin seçimi için kullanılabilir. KD:B

9.2 RT-PCR’ın FISH yöntemi yerine kullanılması önerilmez. KD:B

ANA Soru III: ALK testi nasıl yapılmalıdır?


ALK İmmunhistokimya değerlendirmesi

Histo-skor

=(H-Skoru)

semi-kantitatif;

Yaygınlık ve yoğunluk derecelendirilmesi

+,++,+++ pozitif

0 1+ 2+ 3+

0 1+ 2+ 3+

Soru 9. ALK testi için hangi yöntem kullanılmalıdır?

ÖNERİLER

9.3 UFB Patolog ALK FISH testinin uygulanacağı kesitlerin seçiminde, tümör paterninin algılanması, sitoloji ve materyalin kalitesinin tayininde mutlaka rol almalıdır. 9.4 UFB Patolog ALK FISH preparatının yorumlanmasında ya direkt olarak yada solid tümör FISH uygulaması yapacak olan sitogenetik/ teknisyeninin eğitiminde yer almalıdır. 9.5 UFB ALK inhibitörlerine sekonder direncin geliştiği durumda ALK ilişkili sekonder mutasyonların saptanması için test uygulanması gerekmez.


ANA Soru IV: Akciğer adenokarsinomlarında diğer

genler için test yapılmalı mıdır?

10.1 EGFR testi tüm diğer genetik testler arasında önceliği almalıdır. KD:A, 10.2 2.Ö Bugün için Akc AdenoKa için EGFR testi ardından ALK testi dışında diğer literatürde yer alan moleküler testlerin yapılması için yeterli düzeyde kanıt yoktur. KD:C

Soru 10. Akciğer Kanserinde diğer moleküler testlerin yapımı uygun mudur?

ÖNERİLER (Kanıt değeri= KD) 2. Derece Öneri :Ö (Uzman fikir birliği:UFB)

ANA Soru V: Akc AdenoKA moleküler testleri nasıl

uygulanmalı ve optimize edilmelidir?

Soru 11. Tüm adenokarsinomlar hem EGFR hem de ALK için test edilmeli midir? Soru 12. EGFR ve ALK test sonuçları nasıl raporlanmalıdır? Soru 13. EGFR ve ALK testleri nasıl valide edilmelidir? Soru 14. Bu testlerle ilgili Kalite-kontrol güvencesi nasıl sürdürülmelidir?

Soru 11. Tüm adenokarsinomlar hem EGFR hem de ALK için test edilmeli midir?

ÖNERİLER

11.1 UFB Her lab kendi içinde testlerin efektifliğine göre testlerin algoritmasını belirleyebilir, testlerin sırasından çok tamamlanma süresi daha fazla önem taşır. Soru 12. EGFR ve ALK test sonuçları nasıl raporlanmalıdır?

ÖNERİLER

12.1 UFB EGFR test raporu ve ALK FISH raporu bir sonuç ve testin uygulaması ile ilgili verileri içermeli, onkologlar tarafından ve konunun uzmanı olmayan patologlar tarafından kolayca anlaşılabilmelidir.



Akc KHDAK’larında prediktif belirleyicilerin

saptanmasında CTF algoritması

Adenokarsinom, KHDAK,

AC fenotipi

( IHK)

EGFR mutasyon analizi,

KRAS (isteğe bağlı ???) mutasyon

analizi

ALK FISH

ALK IHK

Skorlama

Soru 13. EGFR ve ALK testleri nasıl valide edilmelidir?

ÖNERİLER

13.1 UFB EGFR testi ve ALK FISH testi validasyonu diğer moleküler test ve FISH testlerinde olduğu gibi yapılmalıdır.

Soru 14. Bu testlerle ilgili Kalite-kontrol güvencesi nasıl

sürdürülmelidir? ÖNERİLER

14.1 UFB Laboratuvarlar benzer şekilde kalite kontrol ve kalite güvencesi politikası ve prosedürleri oluşturmalıdır. Ayrıca diğer klinik lab. yöntemlere edinilenlere benzer yeterlilik belgesine sahip olmalıdır.



CTF Patoloji deneyimi Mart 2013

EGFR 456 hasta: pozitiflik %15.6

ALK 230 hasta: pozitiflik %5.9

%15.6

NEGATİF

POZİTİF

diğer

pozitif

Türkiye’de son durum;

KHDAK için tanı sırasında problemler: Kötü kalite fiksasyon- optimal olmayan doku işlemleri, Tümörlerde tip tayininde sorunlar Moleküler test için doku saklanmaması

Her test için ayrı ayrı lab.’a gönderilmesi Moleküler test için geçen sürenin uzunluğu Seçilmiş- kalifiye laboratuvar tayini/ istihdamı Laboratuvar kalite kontrol / sertifikasyon

Geri ödeme sorunları

Review and Analysis BioView’s unique Touch- Screen the ideal solution for easy and intuitive cell selection and segmentation

Per-cell analysis and report requires accurate cell segmentation as apposed to “ratio” based designed tests

Sample Characteristics

Auto fluorescence

3 Dimensional sample

Analysis ALK Hybridized FFPE Lung Tissue - Challenges

Review and Analysis - Cell Selection

Operator selects 50 cells from captured fields

Operator selects additional 50 cells from captured fields, in case equivocal result obtained after 50 cells are selected

Dikkatiniz için teşekkürler

khdak tedavisinde moleküler patolojinin -...

Documents