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الجمھوریة الجزائریة الدیمقراطیة الشعبیة وزارة التعلیم العالي و البحث العلمي

République Algérienne Démocratique et PopulaireMinistère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

UNIVERSITE D’ORANFACULTE DES SCIENCES

DEPARTEMENT DE PHYSIQUE

Thèse de MAGISTER

En Biotechnologie

Option : Intérêt des microorganismesEn Agriculture et en Agro-alimentaire

Présentée par

Khadidja BELKHEIRIntitulée

PROTEOLYSE ET AUTOLYSE CHEZ DEUX LACTOBACILLESISOLES DE LAIT CAMELIN.

CARACTERISATION D’UNE AMINOPEPTIDASE

Soutenue le : 19/11/2008Devant le jury :

Président : Pr. Z. FORTAS Université d’OranExaminateur : Pr. H. ZADI KARAM Université d’Oran

Dr. F. DALACHE Université de MostaganemDr. A. MAAROUF Université d’Oran

Rapporteur : Pr. N-E. KARAM Université d’OranCo-Rapporteur : C.C. S. ROUDJ Université d’Oran

Année Universitaire 2007/2008

Introduction

La flore lactique des levains utilisés en industrie fromagère joue, d’un point

de vue technologique, trois grands rôles. Elle est responsable de l’acidification du

lait (fermentation lactique au cours de laquelle le lactose est dégradé en acide

lactique), elle est également à l’origine des modifications de la flaveur,

principalement du fait de son activité protéolytique, enfin elle permet de limiter le

développement des germes indésirables, du fait de la production d’acide(s) et

d’éventuelles substances inhibitrices.

Pour pouvoir jouer tous ces rôles, la flore lactique doit atteindre un niveau de

population important. Dans le lait, le seul facteur susceptible de limiter leur

croissance est leur nutrition azotée. En effet ces bactéries présentent plusieurs

exigences nutritionnelles (Juillard et al., 1996).

Les bactéries lactiques, dont le genre Lactobacillus, nécessitent l’apport exogène

de multiples facteurs de croissances tels que les bases purines et pyrimidines,

vitamines et acides aminés libres comme l’arginine, leucine, isoleucine,

méthionine, lysine, valine, glutamate, aspartate, tyrosine, thréonine, tryptophane

et parfois l’alanine, l’histidine, la proline, la glycine et la sérine (Khalid et Marth,

1990).

Pour pouvoir se développer dans le lait, qui est un milieu riche en protéines et

pauvre en acides aminés libres et peptides (Mills et Thomas, 1981), les

lactobacilles comme les autres bactéries lactiques, déploient un système

protéolytique complexe dégradant la caséine, protéine majoritaire du lait, en

acides aminés et peptides nécessaires à leur croissance.

Les connaissances acquises sur le système protéolytique des bactéries lactiques

concernent surtout la flore starter constituée essentiellement de lactocoques. Les

lactobacilles sont généralement introduits dans le caillé fromager sous forme

d’additifs à de basses densités cellulaires. Chez cette flore la protéolyse est peu

étudiée car les travaux se concentrent surtout sur leur pouvoir autolytique et la

libération des peptidases, deux phénomènes très sollicités lors de la maturation

fromagère (El Soda et al., 2000 ; Swearingen et al., 2001 ; Banks et Williams,

2004).

Notre travail est une contribution aux travaux effectués au laboratoire de biologie

des microorganismes et biotechnologie d’Oran (LBMB) dont le but est la

constitution d’un souchier de bactéries lactiques indigènes performantes. Ces

bactéries ont été isolées à partir d’échantillons de lait de multiples espèces

animales ou de produits artisanaux collectés dans différentes régions du territoire

algérien (Karam, 1995).

Le présent travail porte sur l’activité protéolytique et le pouvoir autolytique des

deux souches CHTD27 et BH14 du genre Lactobacillus, qui ont été isolées de deux

échantillons de lait de chamelle, collectés respectivement dans les régions de

Tindouf et Timimoun.

Pour cela dans un premier temps nous avons confirmé le caractère protéolytique

(Prt+) des souches sélectionnées, en établissant le profil électrophorétique de

dégradation de la caséine (caséinolyse) en fonction du temps. Nous nous sommes

orientés ensuite vers la recherche de variants protéolytiques déficients (Prt-) par

mutagenèse UV.

Dans un deuxième temps, nous avons recherché l’activité L-leucyl aminopeptidase

des deux bactéries. Nous avons alors entamé la purification et la caractérisation

physico-chimique de l’enzyme.

Dans une troisième étape, nous avons étudié le pouvoir autolytique spontané des

deux souches sur milieu MRS puis tenté de l’induire en modifiant les conditions de

milieu.

Les différentes manipulations pratiques et les résultats obtenus sont décrits après

une brève analyse bibliographique.

1.1 Généralités sur les bactéries lactiques :

De nombreux produits alimentaires subissent une fermentation lactique avant leur

consommation ce qui leur assure des caractéristiques bien particulières d’arome et

de texture, mais aussi une bonne sécurité alimentaire grâce aux acides organiques

produits. Les bactéries qui en sont responsables sont regroupées sous l’appellation

de bactéries lactiques. Ce sont des bactéries à Gram positif qui regroupent 12

genres dont les plus étudiés sont Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus,

Leuconostoc, Enterococcus et Pediococcus.

Ces bactéries peuvent avoir des formes de bâtonnet ou de coque, isolés ou en

chaînettes quelque fois très longues. Elles sont très généralement immobiles mais

quelques espèces sont mobiles grâce à des flagelles péritriches et ne sporulent

pas ; elles sont anaérobies facultatives ou microaérotolérantes et ne produisent

pas de catalase. Inaptes à réduire les nitrates et à hydrolyser la gélatine les

bactéries lactiques ont en commun la capacité de fermenter les sucres en acide

lactique : certaines sont dites homofermentaires car elles ne produisent que l’acide

lactique alors que d’autres sont dites hétérofermentaires et produisent en plus de

l’acide lactique d’autres composés tels que l’acétate et l’éthanol (De Roissart in

Luquet, 1986 ; Dronault, 2001).

Les lactobacilles regroupent de nombreuses espèces bactériennes sous forme de

bâtonnet ou coccobacilles, omniprésents dans la nature, rarement pathogènes et

colonisent différentes niches écologiques comme le lait et ses dérivés, les

végétaux, les viandes fermentées, les muqueuses humaines et animales et le

tractus digestif.

Le genre Lactobacillus a été divisé selon des caractéristiques biochimiques et

physiologiques en trois sous genres. La classification revue et développée par les

technique moléculaires subdivise les lactobacilles en trois groupes (Bourgeois et

Leveau, 1980 ; De Roissart et Luquet, 1994) :

• Groupe I : regroupe toutes les espèces thermophiles homofermentaires

strictes.

• Groupe II : comprend des espèces mésophiles hétérofermentaires

facultatives.

• GroupeIII : représenté par des espèces hétérofermentaires strictes.

1.2 Effet des bactéries lactiques sur la santé humaine :

En alimentation humaine les bactéries lactiques sont consommées

quotidiennement et en grande quantité : dans les yaourts par exemple deux

espèces de bactéries lactiques (Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus

thermophilus) sont présentes à une concentration de 108-109germes /gramme

(Desmazeaud, 1996 ; Yildirim et Yildirim, 2001 ; Courtin et al., 2002).

En plus de leur intérêt dans la fabrication et la préservation des produits

alimentaires, les bactéries lactiques jouent un rôle dans l’amélioration de la

digestion du lactose chez les sujets déficients en lactase, ainsi que dans la

prévention et le traitement des diarrhées infectieuses dues à Clostridium difficile

(Bifidobacterium bifidium et Streptococcus thermophilus) ou le traitement des

troubles digestifs liés à l’antibiothérapie (Lactobacillus rhamnosus), dans la

diminution du cholestérol sérique surtout sous l’effet des probiotiques dénommés

«LactoSacc» (Lactobacillus acidophilus, Enterococcus feacium, Saccharomyces

cerevisiae) (Le Loire et al., 2001 ; Dronault et Corthier, 2001 ).

Les bactéries lactiques ont un rôle aussi dans la prévention des cancers : (tumeurs

coliques diminuées par Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum et

vésicales diminuées par Lactobacillus casei). L’inhibition de la prolifération des

lignées cancéreuses HT29 est due aux peptides bioactifs issus de l’hydrolyse des

caséines. En effet deux séquences peptidiques dérivées des caséines β (séquence

β 145-155) et αS1 (séquence α 31-48) inhibent in vitro les ‘’matrix

métalloprotéinases’’, protéases qui jouent un rôle essentiel dans la progression des

tumeurs et particulièrement dans la propagation métastastasique du cancer

(Dronault et Corthier, 2001 ; Miclo et al., 2001 ; Robert, 2002.)

Les effets bénéfiques de certaines souches du genre Lactobacillus sont résumés

dans le tableau 1.

Tableau 1: Effets bénéfiques de souches probiotiques de Lactobacillus (Grattepanche, 2005)

Souches Produits Effets observés Références

Yaourts à boire Prévention des allergies Kallliomäki et al., 2001 Rautava et al., 2002

Yaourts Traitement des allergies Majama et al., 1997 Isolauri et al., 2000

Stimulation de la production d’IL-10 Pessi et al., 2000

Diminution de l’incidence des diarrhées

Vanderhoof et al., 1999

Lb. rhamnosus GG

Capsules

Diminution des diarrhées à rotavirus

Majama et al., 1995

Yaourts à boire Inhibition du développement d’Helicobacter pylori

Michetti et al., 1999 Lb. Johnsonii La1 (Lj1)

Yaourts Stimulation de l’activité phagocytaire

Schiffrin et al., 1997

Yaourts à boire Augmentation de l’activité des cellules NK

Nagao et al., 2000 Lb. casei Shirota

Laits fermentés Diminution des diarrhées à rotavirus

Marteau et al., 2001

Stimulation de la production d’IgA Faure et al., 2001 Lb. casei DN-114 001 Yaourts à boire


Pedone et al., 2000

Laits fermentés Yaourts

Lb. acidophilus NCFM

Formules infantiles Capsules

Diminution des diarrhées infantiles Facilite la digestion du lactose

Sanders et al., 2001

Lb. plantarum 229v Jus de fruits Prévention des maladies cardiovasculaires

Naruszewicz et al., 2002

Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus

Yogurt, fermented infant formula

young children with acute watery diarrhea

Boudraa et al., 2001

1.3 Les caséines

Les caséines constituent les protéines majeures du lait, elles représentent environ

80% du total protéique. Elles sont représentées par les caséines αS1, caséine αS2,

caséine β et caséine κ. Ce sont des phosphoprotéines présentes dans le lait sous

forme micellaire. Chacune des caséines se différencie des autres par sa

composition en acides aminés, sa structure et ses propriétés. Le point

isoélectrique des caséines est de 4.6.

Puisqu’elles sont phosphorylées, les caséines précipitent en présence d’ions

calcium, à l'exception de la caséine κ qui ne possède qu'un seul résidu

phosphosérine.

La caséine αS1 est représentée par une chaîne de polypeptidique composée de 199

acides aminés. Son poids moléculaire est de 23 614 Da. La caséine αS1 forme des

interactions hydrophobes pour former l’unité fondamentale de la structure

micellaire. De plus, la caséine αS1 est moins susceptible à l'action de la plasmine

que la caséine β, en raison de son plus fort degré d'association à la structure de la

micelle (Gaumond, 2005).

La caséine αS2 est composée de 207 acides aminés pour un poids moléculaire de

25 230 Da. C'est la moins abondante des caséines majeures du lait. La caséine αS2

est la plus hydrophile de toutes les caséines car la plus phosphorylée (10 à 13

phosphates/mol) et la plus riche en résidus cationiques.

La caséine β est composée de 209 acides aminés et possède un poids moléculaire

de 23 983 Da. C'est la plus hydrophobe de toutes les caséines. L’hydrolyse de la

partie C-terminale de la caséine β sous l’action de la plasmine conduit à la

formation des caséines γ1, γ2 et γ3 (Thivierge, 1999). Une très grande quantité de

résidus prolines caractérise les caséines, particulièrement la caséine β (De

Roissard et Luquet, 1994 ; Gaumond, 2005).

La caséine κ est formée de 169 acides aminés et possède un poids moléculaire de

19 007 Da. En raison de la faible quantité de phosphosérine au niveau de sa

structure primaire (un seul groupement), la caséine k ne fixe que deux moles de

calcium par mole de protéines à pH neutre. Contrairement aux autres caséines, sa

solubilité est peu affectée par la présence de calcium. Par conséquent, la caséine κ

est un agent stabilisateur de la micelle (Léonil et al., 2007).

Les micelles de caséines sont élaborées dans la cellule épithéliale mammaire au

cours d’un processus compartimenté. Celui-ci est initié dans le réticulum

endoplasmique, se poursuit dans l’appareil de Golgi et se termine dans les

vésicules de sécrétion où les micelles sont transportées vers la membrane apicale

des cellules épithéliales mammaires. Les observations morphologiques indiquent

que des structures pré-micellaires semblent déjà exister dans le cis Golgi. Ces

micelles sont des colloïdes édifiés à partir de quatre types de caséines (αs1, αs2,

β et κ) en interaction avec une fraction minérale dont le composant prédominant

est le phosphate de calcium. Elles se présentent sous la forme d'édifices

supramoléculaires polydisperses, de 180nm de diamètre moyen. Cette

organisation propre aux caséines confère au lait des propriétés très spécifiques

tant sur le plan biologique que technologique (Léonil et al., 2007).

Les bactéries lactiques peuvent croître sur le lait grâce à leur système

protéolytique qui permet l’hydrolyse de ces caséines en composés assimilables.

1.3 Croissance des bactéries lactiques dans le lait et protéolyse:

Les bactéries lactiques se caractérisent par des besoins nutritionnels

particulièrement complexes, outre la présence d’une source fermentescible, elles

ont besoin pour croître de plusieurs acides aminés qu’elles ne peuvent pas

synthétiser à partir d’une source azotée simple (Monnet et Grippon in De Roissart

et Luquet, 1994). Ces demandes varient de 4 à14 acides aminés différents (Kunji

et al., 1996). Parmi les bactéries lactiques, les leuconostocs et les lactobacilles

sont connus pour leurs exigences multiples en acides aminés, vitamines, des bases

purines et pyrimidines (Morishita et al., 1974 ; Desmazeaud et al., 1996 ; Hebert

et al.,2000).

Le lait cru tel qu’il sort de la mamelle n’est pas un milieu de culture optimal pour

les bactéries lactiques. Quelle que soit son origine, il contient toujours un excès de

sucres fermentescibles (50mg/ml par rapport aux 5mg/ml nécessaires aux

bactéries pour atteindre une densité cellulaire de 109cellules/ml), par contre il est

pauvre en nutriments azotés assimilables (De Roissart in Luquet, 1986).

Le lait de vache contient environ 37mg/ml de protéines dont la plupart sont de

poids moléculaires élevés (caséines et protéines du lactosérum), mais il ne

renferme que très peu d’acides aminés libres et de peptides (0.04 à 0.01mg/ml,

soit de 8 à 16% de la quantité nécessaire aux bactéries lactiques pour atteindre

une densité cellulaire maximale). Cela signifie que le lait contient généralement

des substances azotées assimilables suffisantes pour assurer le démarrage du

métabolisme bactérien mais un fractionnement des protéines est indispensable

pour que la croissance se poursuive (De Roissart in Luquet ; 1986, Monnet et

Grippon in De Roissart et Luquet, 1994 ; Juillard et al., 1995 et 1996).

Mills et Thomas (1981), ont étudié la croissance de certaines souches de

Lactococcus dans un lait additionné de protéines et peptides marqués au 14C.

Lors de l’introduction des peptides marqués, la radioactivité des protéines

bactériennes d’une souche de Lactococcus lactis ssp cremoris reste identique au

cours des 5 premières générations de croissance, suggérant que les peptides du

lait procurent une proportion constante de l’azote utilisé pour la croissance, la

contribution de la fraction peptidique restant faible par rapport aux besoins azotés

totaux.

Lors de l’introduction des protéines marquées dans le lait, la radioactivité des

protéines bactériennes augmente régulièrement au cours des 5 premières

générations (figure 1), indiquant que les protéines du lait représentent une source

d’azote de plus en plus importante.

Lorsque les protéines radioactives sont ajoutées individuellement au lait, la

radioactivité est incorporée dans les protéines bactériennes, et ceci quelle que soit

la protéine marquée ajoutée. Ceci indique que toutes les protéines du lait (caséine

mais aussi les protéines du lactosérum) sont utilisées comme source d’azote.

Les bactéries lactiques utilisent toutes ces protéines grâce à leur système

protéolytique.

Figure1

Radioactivité spécifique des protéines bactériennes des souches de Lactococcus cultivées sur lait enrichi en protéines marquées au 14C

(Mills et Thomas, 1981)

1.4 Le système protéolytique des bactéries lactiques :

La protéolyse a été étudiée de façon approfondie chez les lactocoques, surtout

chez Lactococcus lactis (Kunji et al., 1996 ; Thiele, 2003) pour l’importance qu’elle

joue sur le plan industriel (Juillard et al., 1996), cependant peu d’informations sont

disponibles sur le système protéolytique de Lactobacillus (Fira et al., 2001 ;

Courtin et al., 2002 ; Kabadjova-Hristova et al., 2006). Les études génétiques,

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1 2 3 4 Nombre de générations

Radioactivité spécifique des protéines bactériennes(1000 dmp/g) Lc lactis ssp cremoris E8

Lc. lactis ssp cremoris AM2

biochimiques et ultrastructurales ont permis de conclure que les systèmes

protéolytiques des lactobacilles et des lactocoques sont remarquablement

similaires, en ce qui concerne leurs composants et leur mode d’action (Kunji et al.,

1996).

Le système protéolytique consiste en une protéase à sérine extracellulaire, un

système de transport pour les di- ou tripeptides et oligopeptides et une multitude

de peptidases intracellulaires (figure 2) (Kunji et al., 1996).

Paroi Membrane

cytoplasme

Caséines

Oligopeptides

Dipeptides

Dipeptides

Acides aminés

Figure 2

Schéma récapitulatif de la protéolyse du lait par les bactéries lactiques (Exterkate, 1976 ; Law et al., 1978 in Novel,1993)

1.4.1 Les protéases de paroi :

Protéase

Perméase

Perméase

Perméase

Dipeptidase

peptides protéases peptidases protéines intracellulaires Acides aminés

Les caséines du lait représentent la principale source d’azote pour les

lactocoques : en effet 90% de la croissance bactérienne lui est imputable et son

utilisation met en œuvre un système complexe qui fait intervenir plusieurs

enzymes agissant séquentiellement. Les protéases de paroi assurent la première

étape dans la cascade des réactions permettant la dégradation des caséines du

lait (Juillard et al., 1996).

1.4.1.1 Propriétés biochimiques et génétiques des protéases de paroi:

Due à leur importance dans le processus de fermentation, les protéases des

lactocoques ont fait l’objet de nombreuses études biochimiques (Buist et al.,

1998 ; Drouault et al., 1998). Ce sont des enzymes monomériques à sérine

ressemblent aux subtilases de paroi, ayant des poids moléculaires élevés, entre

180 et 190 kDa (Kunji et al., 1996), assez différents du poids moléculaire de 145

kDa estimé pour une protéase de paroi purifiée à partir de Lactobacillus

acidophilus (Kojic et al., 1991).

Leur maximum d’activité est obtenu dans un spectre de pH allant de 5.5 jusqu’à

6.5 ; la température optimale pour l’activité diffère pour chaque protéase, elle se

situe généralement entre 30°C et 40°C (Kok et al., 1990). Cependant une

protéase de paroi de Lactobacillus casei a montré un maximum d’activité à pH8.0

et à température 50°C (Sharmin et al., 2004). Certaines souches de Lactobacillus

delbruekii ssp bulgaricus possède une métalloenzyme de paroi insensible au PMSF

(Gobbeti et al., 1996).

La majorité des protéases de paroi des bactéries lactiques sont Ca+2 dépendantes

(Kok, 1990) ; ces ions jouent un rôle dans l’attachement des protéases à la paroi

et dans la stabilisation des sites catalytiques (Exterkate et Alting, 1999). Ces

enzymes sont libérées dans le milieu à la suite d’un traitement des cellules par le

lysozyme ou la glycine ou par un lavage par un tampon contenant des ions Ca+2

(Espla et al., 2000).

Les gènes codant pour les protéases de paroi sont généralement plasmidiques

chez les lactocoques (Kok, 1990 ; Kunji et al., 1996 ; Espla et al., 2000) et sont

chromosomiques chez les lactobacilles (Kojic et al., 1991 ; De Palencia et al.,

1997).

Les protéases de paroi des lactocoques sont produites sous forme de pré-

protéines de poids moléculaire voisin de 200 kDa. Elles subissent une maturation

par libération d’un peptide de 18 kDa résultant de l’hydrolyse de la partie N

terminale sous l’action de la lipoprotéine PrtM dont le gène se trouve juste en

amont du gène prtP. (Espla et al., 2000 ; Savijoki et al., 2006).

Aucune protéine homologue à PrtM n’a été détectée chez les lactobacilles. Chez ce

genre, les protéases ne sont pas libérées par autoprotéolyse mais après un

traitement des cellules par une muramidase (lysozyme) suivi d’un choc osmotique.

(Kok, 1990 ; Atlan, 1996).

Quatre gènes codant pour des protéases de paroi ont été décrits chez les

lactobacilles , les gènes prtB et prtH chez Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus

NCDO1489 et Lactobacillus heveticus CNRZ32 respectivement, le gène prtR chez

Lactobacillus rhamnosus, et le gène prtP chez Lactobacillus paracasei (figure 3).

Le gène prtP code pour une protéase identique à celle des lactocoques. Les gènes

prtH, prtB et prtR codent pour des protéases non solubilisées par les ions Ca+2

ayant des propriétés ressemblant à celles observées chez les subtilases de paroi

(Courtin et al., 2002 ; Pastar et al., 2006 ; Savijoki et al., 2006).

CW M C

Lc lactis Lb paracasei PrtP

Lb helveticus PrtH

Lb bulgaricus PrtB

Lb rhamnosus PrtR

Figure 3

W

W

W

AN H

H

A B Pr

B A

B A

Pr

Pr PP

PP

PP

B A Pr PP W AN

I

I

I

I

Protéases de paroi de quelques souches de bactéries lactiques (Savijoki et al., 2006)

CW : paroi cellulaire ; H : domaine en hélice ; M : membrane ; B : domaine B ; C : cytoplasme ; A : domaine A ; I : domaine d’insertion ; W : domaine inter membranaire ; PP : pré domaine ; AN: domaine d’attachement ; Pr : domaine catalytique ; : signal court

La transcription des gènes prtP est influencée par la composition du milieu : la

production de la protéase de paroi est induite par la présence de caséine dans le

milieu et est réprimée par une concentration élevée de peptides (Ohmiya et Sato,

1975 ; Hebert et al., 2000). Cette répression n’est possible qu’après diffusion des

peptides dans la cellule et leur dégradation dans le cytoplasme (Meijer et al.,

1996 ; Kok et al., 2005 ; Larsen et al., 2006).

Guedon et al. (2001) ont proposé un modèle simple de régulation des gènes

pepN, pepC, prtP et l’opéron opp-pepO1 chez Lactococcus lactis, faisant intervenir

la protéine répresseur CodY. Ce modèle a été établi en étudiant des mutants

déprimés obtenus par mutagenèse aléatoire par transposition. L’expression des

gènes est réprimée par CodY en fonction de la concentration des trois acides

aminés leucine, isoleucine et valine (ILV) (figure 4).

Peptides contenant Caséines des ILV PrtP Peptides contenant ILV Peptidases Concentration élevée en ILV ou d’un produit de dégradation

Figure4

Opp DtpTp

Dtpp

CodY

Régulation protéolytique Opp-PepO1 PepN PepC PrtP

Activation Répression

Modèle représentant la régulation de l’expression des gènes du régulon protéolytique de Lactococcus lactis

(Drouault et al., 1998 ; Guédon et al., 2001)

ILV : isoleucine, leucine et valine

1.4.1.2 Classification des protéases de paroi

Deux classes de protéases de paroi ont été décrites chez les lactocoques selon

leur spécificité pour le substrat : les protéases de type PI ayant une préférence

pour la β caséine et les protéases de type PIII qui dégradent les 3 types de

caséine : αs1caséine, β caséine et κ caséine, (Kok, 1990, Reid et al., 1995, Kunji et

al., 1996).

Chez les lactobacilles, un troisième type de protéase de paroi a été décrit. Ce sont

des protéases intermédiaires appartenant au type P1 tout en ayant une activité

sur la caséine αS1 (Juillard et al., 1995 ; Kabadjova-Hristova et al.,2006).

1.4.2 Protéinases intracellulaires :

Les bactéries lactiques possèdent aussi un équipement protéolytique intracellulaire

important. Différentes protéases intracellulaires ont été décrites chez des souches

du genre Lactobacillus. Ces protéases semblent avoir un rôle important dans la

production fromagère (Masuda et al., 2005).

D’autres rôles ont été décrits pour ces protéases : en plus de leur rôle strictement

nutritionnel qui permet aux bactéries d’utiliser les peptides ayant franchi les

enveloppes microbiennes, les enzymes protéolytiques intracellulaires interviennent

dans l’hydrolyse de peptides éventuellement toxiques (résistance aux

antibiotiques) ainsi que dans la maturation des protéines intracellulaires (Ohmiya

et Sato, 1975 ; Desmazeaud, 1983).

1.4.3 Impact technologique de la protéolyse :

La dégradation progressive des protéines du lait constitue l’un des trois

évènements biochimiques principaux de la maturation et l’affinage des fromages

(Mc Sweeney et Sousa, 2000). La protéolyse contribue en grande partie au

changement de la texture via l’hydrolyse du réseau protéinique, contribue

directement à la saveur (peptides libérés) dont l’amertume (défaut redouté en

fabrication, due à des peptides hydrophobes), et enfin permet la libération

d’acides aminés précurseurs d’aromes (Thivierge, 2001).

1.4.4 Systèmes de transport des acides aminés et peptides chez les bactéries lactiques :

1.4.4.1 Systèmes de transport des acides aminés :

Trois systèmes de transport des acides aminés ont été isolés et décrits chez les

lactocoques (Kok, 1990 ; Kunji et al., 1996) :

• Transport couplé à une force promotrice : c’est un système utilisant une

force promotrice générée par un potentiel électrique et un gradient

chimique de proton (H+) à travers la membrane ; il est spécifique au

transport des acides aminés leucine, thréonine, isoleucine, alanine, valine,

glycine et méthionine.

• Transport par échange (type antiport) : ce type de transport est décrit

surtout pour le couple d’acides aminés ornithine/arginine ; ce mécanisme

dépend de la concentration de l’un des deux acides aminés dans le milieu.

• Transport ATP dépendant : l’énergie nécessaire pour ce type de transport

est fournie par hydrolyse de liaisons phosphates de l’ATP ; il catalyse le

transport spécifique des acides aminés glutamate, glutamine, aspartate,

proline et glycine-bétaine.

Aucun résultat n’a rapporté une éventuelle similitude entre le système de

transport chez les lactocoques et celui des lactobacilles (Kunji et al., 1996).

1.4.4.2 Transport des di- et tripeptides (DtpT) :

En général, il s’agit d’un transport lié à une force promotrice ; c’est un système

spécifique aux di- et tripeptides hydrophiles (Hagting et al., 1997).

Un second système de transport spécifique aux di- et tripeptides hydrophobes a

été mis en évidence chez des mutants de Lc. lactis (Focaud et al., 1995).

1.4.4.3 Transport des oligopeptides (Opp) :

Il s’agit d’un système transportant des peptides comportant de 4 à 8 résidus et

plus ; c’est un système ATP dépendant. Le gène de l’Opp comporte cinq cadres de

lecture ouverts (ORFs) dont les produits correspondent aux protéines de fixation

de l’ATP (figure 5) (Kunji et al., 1995 ; Kunji et al., 1996).

P P P

Figure5

Organisation des Opp et di/tripeptides systèmes de transport chez Lc lactis (Kunji et al., 1996)

D, F, B, C et A : ORFs P : promoteurs

1.4.5 Les peptidases des bactéries lactiques :

1.4.5.1 Définition et propriétés des peptidases

Les peptides issus de l’hydrolyse des caséines par les protéases de paroi sont

dégradés grâce aux peptidases en acides aminés et oligopeptides capables d’être

transportés à l’intérieur de la cellule via le système de transport membranaire actif

(Monnet et al., 1993).

D F B C A DtpT

D F B C A

Les peptidases des bactéries lactiques sont divisées en deux groupes majeurs, les

endopeptidases, qui coupent à l’intérieur des chaînes peptidiques, et les

exopeptidases, qui dégradent les extrémités du peptide.

Les exopeptidases sont représentées généralement chez les bactéries lactiques

par les aminopeptidases car aucune carboxypeptidase n’a été identifiée chez les

lactocoques (Mierau et al., 1996) ni chez les lactobacilles (El Soda et al., 1983 ;

Atlan et al., 1989 ; Khalid et Marth, 1990a).

Les aminopeptidases regroupent les enzymes hydrolysant les liaisons peptidiques

du coté N-terminal de plusieurs oligopeptides, di et tripeptides. Elles sont divisées

selon le degré de spécificité envers leurs substrats en aminopeptidases générales

et aminopeptidases de spécificité restreinte.

La leucyl-aminopeptidase appartient au groupe des aminopeptidases N (PepN), qui

sont des peptidases à spécificité large jouant un rôle physiologique très important

(Mierau et al., 1996 ; Christensen et Steele, 2003). Leur détection est facilitée par

l’emploi de substrats chromogènes (acide aminé p-nitroanilide ou β-

naphtylamide).

Les enzymes appartenant à ce groupe sont généralement des métalloenzymes

inhibées par l’EDTA ; cependant certaines peptidases isolées chez le genre

Lactobacillus montrent une sensibilité à d’autres agents tels que le

paraméthylsulfonate (PMSF) et le phénanthroline (Tsakalidou et al., 1993 ;

Magboul et Mc Sweeney, 1999). L’activité des peptidases de type N est liée à la

présence de cations métalliques divalents ; le cation Zn+2 est le plus fréquemment

associé à ces enzymes.

Différentes localisations ont été décrites pour ce type d’enzymes, elles sont

généralement intracellulaires ou membranaires (Altan et al., 1989 ; Atlan et al.,

1990 ;Van Alen Boerrigter et al., 1991). Les chercheurs ne rapportent aucune

localisation extracellulaire de ces enzymes en se basant sur le fait que la bactérie

utiliserait plutôt les peptides se trouvant dans le milieu et jamais les caséines. De

plus, leur instabilité très élevée conduit à leur dénaturation lors de leur relargage

dans le milieu extracellulaire. (Monnet et al., 1993).

1.4.5.2 Intérêt technologique des peptidases :

Outre leur rôle dans la nutrition azotée, les peptidases des bactéries lactiques

permettent l’hydrolyse des peptides amers dans les fromages et la libération

d’acides aminés et peptides précurseurs de composés d’aromes (figure 6) (Monnet

et al., 1993 ; Jakob et Piccinali, 2006).

1.1 Généralités sur les bactéries lactiques :














Caséine Protéase

Polypeptide Endopeptidases Oligopeptide Exopeptidases Di et tripeptidases Exopeptidases Acides aminés









tractus digestif.






strictes.


facultatives.



























dans le tableau 1.


Souches Produits Effets observés Références Yaourts à boire Prévention des allergies Kallliomäki et al., 2001

Rautava et al., 2002





Lb. rhamnosus GG

Capsules


Majama et al., 1995











Pedone et al., 2000












1.3 Les caséines









phosphosérine.


















et al.,2000).






















totaux.










protéolytique.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90




Figure1












1996).




Paroi Membrane

cytoplasme

Caséines

Oligopeptides

Dipeptides

Protéase

Perméase

Perméase peptides protéases peptidases protéines intracellulaires Acides aminés

Dipeptides

Acides aminés

Figure 2

































1997).









(Kok, 1990 ; Atlan, 1996).









CW M C


Lb helveticus PrtH

Lb bulgaricus PrtB

Lb rhamnosus PrtR

Figure 3 Protéases de paroi de quelques souches de bactéries lactiques

(Savijoki et al., 2006) CW : paroi cellulaire ; H : domaine en hélice ; M : membrane ; B : domaine B ; C : cytoplasme ; A : domaine A ; I : domaine d’insertion ; W : domaine inter membranaire ; PP : pré domaine ; AN: domaine d’attachement ; Pr : domaine catalytique ; : signal court













Peptides contenant Caséines

W

W

W

AN H

H

A B Pr

B A

B A

Pr

Pr PP

PP

PP

B A Pr PP W AN

I

I

I

I

des ILV PrtP Peptides contenant ILV Peptidases Concentration élevée en ILV ou d’un produit de dégradation

Figure4 Modèle représentant la régulation de l’expression des gènes du régulon

protéolytique de Lactococcus lactis (Drouault et al., 1998 ; Guédon et al., 2001)







al., 1996).





Opp DtpTp

Dtpp

CodY
























P P P

D F B C A DtpT

D F B C A

Figure5 Organisation des Opp et di/tripeptides systèmes de transport chez Lc lactis

(Kunji et al., 1996)























naphtylamide).




















Figure6 Enzymes impliquées dans la protéolyse dans le fromage.

(Jakob et Piccinali, 2006).

Caséine Protéase


Quelques peptidases du genre Lactobacillus ainsi que leurs propriétés sont

résumés dans le tableau 2. La figure7 représente les différentes étapes de la

dégradation des caséines et le système de régulation de l’activité des différentes

enzymes qui y interviennent.

Tableau 2 Peptidases de Lactobacillus

Peptidase Souche Propriétés Références T°C pH Substrat PM Classe

d’enzyme

Pep N

Lb lactis 47.5°C

6.2 Large spécificité

78kDa monomère

Métallo

Eggimann et Bachmann, 1980

Lb helveticus 45°C 6.5 // - Métallo

Chollete et Mc Kellar, 1990

Lb plantarum ESB5004

37°C 6.5 // 70kDa dimérique

Métallo Macedo et al., 2003

Lb helveticus JCM 1004

40°C 7.0 // 129kDa trimérique

Métallo Pan et Tanokura, 2004

Lb curvatus DPC2024


Métallo Magboul et Mc Sweeney, 1999a

Lb delbrueckii ssp bulgarius ACADC233

40°C 6.0 // 98kDa monomère

Métallo

Tsakalidou et al., 1993

Lb helveticus LHE 511


Métallo Miyakawa et al., 1992

Lb sanfrancisco CB1

30°C

7.5

// 75kDa monomère

Métallo

Gobbetti et al., 1996

Lb sake 37°C 5.0 // 180kDa trimérique

Enzyme à cystéine

Sanz et Toldra, 2002

Lb delbrueckii ssp bulgaricus CNRZ397

50°C 6.0 X-Pro di peptide

82kDa monomère

Métallo Morel et al., 1999


50°C 7.0 Dipeptide 50kDa monomère

Enzyme à cystéine

Atlan et al., 1990

Pep C

Lb sake 40°C 7.6 Large spécificité

50kDa monomère

Métallo Montel et al., 1995

Pep Q Lb helveticu SBT 2171


Métallo Tan et al., 1995

Lb casei ssp casei IFPL731

60 à 70°C

7.5 // 65kDa monomère

Métallo Espla et Hernandez, 1997

Lb sanfrancisco CB1

30 ° 7.5 // 72kDa monomère

Métallo Gobetti et al., 1996

Dipeptidase

Lb helveticus CNRZ 32

40°C

7.0

Spécificité restreinte

140kDa tétramérique

Métallo Khalid et Marth, 1990b

Oligo- peptidase

Lb paracasei LC01

40°C 8.0 Oligo- peptide

Métallo Tobassen et al., 1997

Acides aminés libres

Dpp : transporteur de peptides de 2 à 9 acides aminés ; CodY : gène répresseur ; PepI : proline iminopeptidase ; PepD, PepV : dipeptidase ; PepX : Xprolyl dipeptidyl aminopeptidase ; PepN, PepC, PepP : aminopeptidases générales ; PepO, PepF : endopeptidases.

PrtM PrtP Opp Dpp DTpt

A Paroi Membrane cellulaire B Cytoplasme C

PepO PepF

PepN

PepC PepX

PepL

PepQ

PepR PepI

PepT

PepP

PepV

PepD

Ile Val Leuu

Caséine

Oligopeptide Dipeptide tripeptide

CodY

CodY PrtM PrtP OppO1 DTpt PepN

1.4.6 Souches protéases négatives ou prtP- définition et intérêt technologique :

Les systèmes protéolytiques des bactéries lactiques sont complexes de par leur

nombre et la nature des protéases et peptidases présentes mais aussi de par leur

localisation cellulaire. Les protéases sont localisées pour l’essentiel au niveau de la

paroi, une faible activité intracellulaire est toute fois détectable (Monnet et Gripon

in De Roissart et Luquet, 1994).

La production de protéases est un caractère indispensable à la croissance des

bactéries lactiques (Juillard et al., 1996) ; cependant des variants négatifs

apparaissent parfois spontanément et avec des fréquences considérables, surtout

chez les lactocoques (Kok, 1990). Il s’agit de souches qui ont perdu généralement

le gène codant pour la synthèse de la protéase de paroi (PrtP-) tout en gardant

une activité peptidasique et un système de transport des acides aminés et

peptides semblable à celui des souches normales c'est-à-dire (PrtP+) (Thivierge,

1999).

Les variants PrtP- se développent dans le lait avec la même vitesse initiale que les

souches mères PrtP+ lors des premières générations, mais elles n’atteignent que

10 à 25% des densités cellulaires de ces dernières. La croissance devient

semblable à celle des souches PrtP+ sur un milieu de culture synthétique riche tel

que le milieu MRS (de Palencia et al., 1997) ou sur un lait additionné d’hydrolysats

de caséine (figure8). Ceci indique que ces acides aminés et peptides proviennent

de l’hydrolyse de la caséine du lait par la protéase de paroi (Monnet et Gripon in

De Roissart et Luquet , 1994 ; Christensen et Steele, 2003).

L’étude des variants protéolytiques déficients permet de comprendre le rôle

physiologique, technologique et la régulation de la synthèse de chaque composant

de ce système complexe (Mierau et al., 1996 ; de Palencia et al., 1997 ;

Christensen et Steele, 2003 ; Savijoki et al., 2006).

En production fromagère, l’utilisation de cultures mixtes de souches PrtP- et PrtP+

présente plusieurs avantages : tout d’abord l’utilisation des souches PrtP- réduit le

problème d’amertume dû à l’hydrolyse des caséines β ou αs1 par la protéase de la

paroi en peptides hydrophobes amers. En outre ce sont des souches qui semblent

être moins acidifiantes et moins sensibles à l’attaque des phages car elles se

développent très lentement (Juillart et al., 1996 ; Thivierge, 1999).

0

2

4

6

8

10

12

1 2 3 4 5 6

Heures

dens

ité c

ellu

laire

DO

480n

m

Prt-Prt+Prt- ou Prt+

Figure8 Croissance de variants Prt+ et Prt- de Lactococcus lactis

ssp cremoris à 30°C dans le lait (Monnet et Gripon in De Roissart et Luquet, 1994)

La dégradation successive des caséines du lait constitue l’un des phénomènes

majeurs de développement des aromes et l’affinage des fromages. En effet le

catabolisme des acides aminés, issus de la dégradation des caséines du lait,

conduit à la production d’une large gamme de composés aromatiques. Les voies

menant de la dégradation des caséines au catabolisme des acides aminés sont

présentées sur la figure 9.

Les oligopeptides générés après action de la protéinase sont susceptibles d’être

dégradés en di- et tripeptides ainsi qu’en acides aminés à l’extérieur de la cellule.

5 1 0.5 0.1

Lait + hydrolysats de caséines prt+ prt-

1 3 5 7 9 11

Cependant, la synthèse de peptidases extracellulaires n'a pas été démontrée. Un

système de transport, Opp, assure le passage des oligopeptides d’une taille

maximale de 10 résidus d’acides aminés à travers la membrane plasmique. Les

oligopeptides sont ensuite dégradés dans le cytoplasme en di- et tri-peptides puis

en acides aminés par des mécanismes faisant intervenir de nombreuses

enzymes (Figure 9). Une partie de ces acides aminés, notamment ceux pour

lesquels les bactéries lactiques sont auxotrophes, servira à la synthèse de

nouvelles protéines, et l’autre partie participera à la formation des arômes (Figure

9).

La protéolyse est parfois à l’origine d’un défaut de saveur: l’amertume. Ce défaut

résulte de l’accumulation de peptides de petite taille, ayant une hydrophobicité

élevée et dont la partie C terminale est constituée soit de leucine, de

phénylalanine ou de tyrosine. Le choix des souches est particulièrement important

pour éviter ce défaut. Les variants lents de lactocoques déficients en protéinase de

paroi (Prt-) ne produisent pas d’amertume. De plus, ces souches dites «non

amères» possèdent des activités enzymatiques capables de dégrader les peptides

amers en peptides non amers et acides aminés libres. La spécificité des

protéinases de paroi pour les caséines joue également un rôle sur le

développement de l’amertume, car la majorité des peptides amers sont issus de

l’hydrolyse de la caséine β.

Acide aminés caséine di- et tri-peptides

Oligopeptides Oligopeptides (> 10aa) (<10 aa et > 3aa)

Acides aminés di- et tripeptides

Dipeptidase V Endopeptidases O, F1 et F2 Proline iminopeptidase XPDAP Prolidase Q Aminopeptidases A, C et N Tripeptidase T (non classée) Prolinase P -Transamination -Déshydrogénation -Décarboxylation -Dégradation -Réduction -Désamination

Figure 9 Catabolisme des acides aminés par Lc. lactis sp.

Aat, Dpp et Opp représentent respectivement les systèmes de transport des acides aminés, di- et tripeptides et oligopeptides (Grattepanche, 2005).

Lait

Protéinase

Peptidases extracellulaires ?

Paroi cellulaire

Aat Dpp Opp

Acides aminés Di et Tripeptides Oligopeptides (<10 aa et > 3aa)

Membrane

Aldéhydes Alcools Acides organiques volatils Composées aromatiques Composés soufrés Amines Ammoniac

Cytoplasme

1.5 Autolyse bactérienne :

Durant la phase de déclin, après l’épuisement des réserves énergiques et

accumulation de déchets toxiques les cellules se lysent et libèrent leur contenu

cytoplasmique dans le milieu : c’est l’autolyse bactérienne spontanée (De Roissart

in Luquet, 1986 ; Thivierge, 1999).

L’autolyse cellulaire est un phénomène, induit ou spontané, qui résulte en la perte

de l’intégrité de la paroi bactérienne par hydrolyse du peptidoglycane sous l’action

d’enzymes endogènes appelées de part cette particularité les autolysines (Chapot

Chartier, 1996 ; Lortal et Chapot Chartier, 2005). Elle est étudiée chez de

nombreuses espèces bactériennes lactiques et non lactiques telles que les

propinibactéries (Lortal et al., 1997 ; Gagnaire et al., 1999), les lactocoques

(Thivierge, 1999 ; Huard et al., 2004 ; Hannon et al., 2006), les lactobacilles (El

Sallami et al., 1987 ; Valence et Lortal, 1995 ; Kang et al., 1998 ; Kang, 1998 ;

Lazure Demers, 2000 ; Weinrichter et al., 2001), les entérocoques (El Dina et al.,

2002 ; Deutsch et al., 2002 ; El Soda et al., 2003 ; Deutsch et al., 2003), les

oenocoques et les pediocoques (Garbay et Lonvaud Funel, 1990 ; Leroy et al.,

1990).

1.5.1 Les autolysines

Les autolysines sont des enzymes localisées dans la paroi bactérienne, elles jouent

un rôle positif au sein de la cellule en lui permettant de s’allonger et se diviser en

deux cellules filles en effectuant des coupures limitées en certains sites du

peptidoglycane. Ces enzymes sont impliquées aussi dans la formation des

flagelles, la sporulation (Lortal et al., 1989) et la tolérance à certains antibiotiques

(Kim et al., 1982,). Cependant sous l’effet de certains facteurs, les autolysines

hydrolysent d’une manière inadéquate le peptidoglycane ce qui provoque la

désintégration des membranes et la déstabilisation de la structure cellulaire : les

bactéries s’autolysent (Valence et Lortal, 1995 ; Kang et al., 1998 ; Thieverge,

1999).

1.5.2 Classification des autolysines :

Trois classes d’autolysines ont été décrites selon leurs sites d’action sur le

peptidoglycane (figure 10) (Valence et Lortal, 1995 ; Chapot Chartier, 1996 ;

Kang, 1998 ; Lazure Demers, 2000 ; Lortal et Chapot Chartier, 2005):

• les glycosidases qui exercent une activité lytique sur la chaîne

polysaccharidique,

• les amidases qui agissent sur le lien amide entre les ponts peptidiques et

l’acide N-acétyl muramique du polysaccharide

• les peptidases qui sont actives sur les chaînes peptidiques agissant comme

ponts entre les chaînes polysaccharidiques.

1.5.2.1 Les glycosidases :

Elles représentent un ensemble d’enzymes ayant pour substrat la chaîne

polysaccharidique du peptidoglycane. Cette chaîne est toujours composée d’une

alternance entre résidus d’acide N-acétylmuramique et de N-acétylglycosamine.

Les autolysines de type glycosidases se trouvent dans l’une ou l’autre des deux

classes suivantes :

• N-acétylmuramidases (muramidasesI) : elles hydrolysent la liaison β1-4

entre l’acide N-acétylmuramique et le N- acétylglycosamine, déstabilisant

ainsi la paroi bactérienne.

• N-acétylglycosaminases : elles hydrolysent les liaisons β1-4 entre le N-

acétylglycosamine et l’acide N-acétylmuramique. L’activité de ces enzymes

complète celle des N-acétylmuramidases puisque les deux types d’enzymes

hydrolysent les deux liaisons possibles qui unissent les résidus entre eux à

l’intérieur des chaînes polysaccharidiques. Ces enzymes sont aussi appelées

les muramidases II.

1.5.2.2 Les amidases :

Elles font partie du groupe enzymatique à fonction très spécifique qui consiste à

couper le lien amide entre le groupement carboxyle de l’acide N-acétylmuramique

et le groupement α amine de la L-alanine, premier acide aminé des chaînes

peptidiques formant les ponts entre les chaînes polysaccharidiques adjacentes.

1.5.2.3 Les peptidases :

Elles regroupent les carboxypeptidases qui ont une action exopeptidasique

hydrolysant le lien entre la D-alanyl-D-alanine terminale des chaînes peptidiques

du peptidoglycane et les endopeptidases qui exercent une action lytique sur les

liens D-D peptidiques reliant les différentes chaînes peptidiques entre elles.

Figure10 Schéma représentant les sites d’action des différentes

autolysines sur le peptidoglycane (Kang, 1998)

N-actéylglucosaminidases

Amidases

N-acétylglucosaminidases

Peptidases

N-acétylmuramidases


L-Ala

D-Glu D-Ala

L-Lys

D-Glu

L-Lys

L-Ala

D-Ala

GlcNAc---------MurNAc-----------GlcNAc

---GlcNAc-------MurNAc-------GlcNAc----

D-Asp NH2

NH2

1.5.3 Les facteurs induisant l’activité autolytique :

Des facteurs physiques, chimiques, enzymatiques ou autres peuvent induire

l’autolyse des bactéries lactiques.

1.5.3.1 Facteurs physiques et chimiques :

Parmi les facteurs non enzymatiques favorisant l’autolyse bactérienne on trouve

une multitude de combinaisons ayant trait à la température et le choc osmotique

(El Dine et al., 2002), la force ionique (Lortal et al., 1989 ; Weinrichter et al.,

2001), le pH (Lortal et al., 1997) ou la mise en présence de différents agents

chimiques tels que les détergents ioniques, agents chélateurs et Triton X100

(Kang et al., 1998). D’une manière générale ces facteurs stimulent l’autolyse

bactérienne en déstabilisant le métabolisme et/ou la structure de la paroi

bactérienne.

1.5.3.2 Facteurs enzymatiques :

Le lysozyme est l’une des enzymes ayant une action hydrolytique envers les

membranes de plusieurs espèces bactériennes car elle possède à la fois une

activité gluconohydrolase semblable à celle des autolysines de type N-

acétylglycosaminidases (Kang, 1998) et une activité chitinase (Neujhar et al.,

1973).

1.5.3.3 Autres facteurs :

D’autres facteurs peuvent largement influencer sur l’activité autolytique

bactérienne. L’âge de la culture est l’un des facteurs les plus étudiés : il a été

montré que la lyse cellulaire est généralement maximale pendant la phase

exponentielle de croissance. Ceci confirme l’implication des autolysines dans la

séparation des deux cellules filles lors de la division cellulaire (Lortal et al., 1997).

Le travail de Buist et al. (1998) a montré l’effet de la protéase extracellulaire PI de

Lc lactis sur son activité autolytique.

L’effet de la bactériocine nisine Z de Lc. diacetylactis sur l’induction de l’activité

autolytique de Lb. casei sup casei IFPL731 a été démontré par El Sallami et al.,

1987.

1.5.4 Impact industriel de l’autolyse :

La rupture de l’enveloppe cellulaire (membrane et paroi) avec libération

du contenu cytoplasmique dans le milieu extracellulaire présente un

intérêt particulier quant à son utilisation potentielle dans la fabrication

des produits laitiers fermentés. En effet le contenu enzymatique

intracellulaire des bactéries du levain joue un rôle important dans le

développement de la flaveur et la texture des fromages (Hannon et al.,

2006). Parmi ces enzymes, les plus caractérisées sont les peptidases qui

libèrent des petits peptides et des acides aminés libres qui sont des

précurseurs d’aromes. L’action des peptidases contribue également à

diminuer l’amertume. Les connaissances acquises sur le système

peptidasique des bactéries lactiques (lactocoques, streptocoques

thermophiles et lactobacilles) suggèrent que les peptidases sont

généralement intracellulaires (Lortal et al., 1997) et ne sont mises au

contact du substrat qu’après autolyse cellulaire (Gagnaire et al., 1999).

L’action d’autres enzymes intracellulaires intervenant dans le

développement de la flaveur telles que les estérases, lipases et les

enzymes de dégradation des acides aminés pourrait être amplifiée dans

le caillé fromager par lyse bactérienne (El Sallami et al., 1987 ; Lortal et

al., 1988 ; Chapot Chartier, 1996 ; Zambonelli et al., 2002 ; Huard et al.,

2004).





d’enzyme

Pep N

Lb lactis 47.5°C


78kDa monomère

Métallo










Lb curvatus DPC2024





Métallo





Lb sanfrancisco CB1

30°C

7.5

// 75kDa monomère

Métallo



Enzyme à cystéine




82kDa monomère




Enzyme à cystéine

Atlan et al., 1990

Pep C


50kDa monomère






60 à 70°C



Lb sanfrancisco CB1



Dipeptidase


40°C

7.0




Oligo- peptidase

Lb paracasei LC01







PepO PepF

PepN

PepC PepX

PepL

PepQ

PepR PepI

PepT

PepP

PepV

PepD

Ile Val Leuu

Caséine


CodY















1999).



















0

2

4

6

8

10

12

1 2 3 4 5 6

Heures

dens

ité c

ellu

laire

DO

480n

m












5 1 0.5 0.1


1 3 5 7 9 11









9).


















Lait

Protéinase


Paroi cellulaire

Aat Dpp Opp


Membrane


Cytoplasme

















1990).











1999).






polysaccharidique,










classes suivantes :









les muramidases II.






1.5.2.3 Les peptidases :1.1 Généralités sur les bactéries lactiques :






















tractus digestif.






strictes.


facultatives.



























dans le tableau 1.








Lb. rhamnosus GG

Capsules


Majama et al., 1995











Pedone et al., 2000












1.3 Les caséines









phosphosérine.


















et al.,2000).






















totaux.










protéolytique.

Figure1




0

10

20

30

40

50

60

70

80

90












1996).




Paroi Membrane

cytoplasme

Caséines

Oligopeptides

Dipeptides

Dipeptides

Acides aminés

Figure 2

Schéma récapitulatif de la protéolyse du lait par les bactéries lactiques

Protéase

Perméase

Perméase

Perméase

Dipeptidase


(Exterkate, 1976 ; Law et al., 1978 in Novel,1993)
































1997).









(Kok, 1990 ; Atlan, 1996).









CW M C


Lb helveticus PrtH

W

W

W

AN H

H

A B Pr

B A

B A

Pr

Pr PP

PP

PP

AN

I

I

I

I

Lb bulgaricus PrtB

Lb rhamnosus PrtR

Figure 3 Protéases de paroi de quelques souches de bactéries lactiques

(Savijoki et al., 2006) CW : paroi cellulaire ; H : domaine en hélice ; M : membrane ; B : domaine B ; C : cytoplasme ; A : domaine A ; I : domaine d’insertion ; W : domaine inter membranaire ; PP : pré domaine ; AN: domaine d’attachement ; Pr : domaine catalytique ; : signal court













Peptides contenant Caséines des ILV PrtP Peptides contenant ILV Peptidases

Opp DtpTp

Dtpp

CodY



Concentration élevée en ILV ou d’un produit de dégradation

Figure4 Modèle représentant la régulation de l’expression des gènes du régulon

protéolytique de Lactococcus lactis (Drouault et al., 1998 ; Guédon et al., 2001)







al., 1996).





























P P P

Figure5





D F B C A DtpT

D F B C A




















naphtylamide).


























Caséine Protéase




d’enzyme

Pep N

Lb lactis 47.5°C


78kDa monomère

Métallo










Lb curvatus DPC2024





Métallo





Lb sanfrancisco CB1

30°C

7.5

// 75kDa monomère

Métallo



Enzyme à cystéine




82kDa monomère




Enzyme à cystéine

Atlan et al., 1990

Pep C


50kDa monomère






60 à 70°C



Lb sanfrancisco CB1



Dipeptidase


40°C

7.0




Oligo- peptidase

Lb paracasei LC01







PepO PepF

PepN

PepC PepX

PepL

PepQ

PepR PepI

PepT

PepP

PepV

PepD

Ile Val Leuu

Caséine


CodY















1999).



















0

2

4

6

8

10

12

1 2 3 4 5 6

Heures

dens

ité c

ellu

laire

DO

480n

m












5 1 0.5 0.1


1 3 5 7 9 11









9).


















Lait

Protéinase


Paroi cellulaire

Aat Dpp Opp


Membrane


Cytoplasme

















1990).











1999).






polysaccharidique,










classes suivantes :









les muramidases II.














Amidases


Peptidases



L-Ala

D-Glu D-Ala

L-Lys

D-Glu

L-Lys

L-Ala

D-Ala



D-Asp NH2

NH2












bactérienne.






1973).











1987.


La rupture de l’enveloppe cellulaire (membrane et paroi) avec libération

du contenu cytoplasmique dans le milieu extracellulaire présente un

intérêt particulier quant à son utilisation potentielle dans la fabrication

des produits laitiers fermentés. En effet le contenu enzymatique

intracellulaire des bactéries du levain joue un rôle important dans le

développement de la flaveur et la texture des fromages (Hannon et al.,

2006). Parmi ces enzymes, les plus caractérisées sont les peptidases qui

libèrent des petits peptides et des acides aminés libres qui sont des

précurseurs d’aromes. L’action des peptidases contribue également à

diminuer l’amertume. Les connaissances acquises sur le système

peptidasique des bactéries lactiques (lactocoques, streptocoques

thermophiles et lactobacilles) suggèrent que les peptidases sont

généralement intracellulaires (Lortal et al., 1997) et ne sont mises au

contact du substrat qu’après autolyse cellulaire (Gagnaire et al., 1999).

L’action d’autres enzymes intracellulaires intervenant dans le

développement de la flaveur telles que les estérases, lipases et les

enzymes de dégradation des acides aminés pourrait être amplifiée dans

le caillé fromager par lyse bactérienne (El Sallami et al., 1987 ; Lortal et

al., 1988 ; Chapot Chartier, 1996 ; Zambonelli et al., 2002 ; Huard et al.,

2004).















Amidases


Peptidases



L-Ala

D-Glu D-Ala

L-Lys

D-Glu

L-Lys

L-Ala

D-Ala



D-Asp NH2

NH2





bactérienne.






1973).


D’autres facteurs peuvent largem1.1 Généralités sur les bactéries lactiques :






















tractus digestif.






strictes.


facultatives.



























dans le tableau 1.








Lb. rhamnosus GG

Capsules


Majama et al., 1995









Lb. casei DN-114 001 Yaourts à boire Stimulation de la production d’IgA Faure et al., 2001


Pedone et al., 2000












1.3 Les caséines









phosphosérine.


















et al.,2000).






















totaux.










protéolytique.

Figure1








0

10

20

30

40

50

60

70

80

90


protéines bactériennes(1000 dmp/g) Lc lactis ssp cremoris E8






1996).




Paroi Membrane

cytoplasme

Caséines

Oligopeptides

Dipeptides

Dipeptides

Acides aminés

Figure 2



Protéase

Perméase

Perméase

Perméase

Dipeptidase



1997).









(Kok, 1990 ; Atlan, 1996).









CW M C


Lb helveticus PrtH

Lb bulgaricus PrtB

Lb rhamnosus PrtR

Figure 3

W

W

W

AN H

H

A B Pr

B A

B A

Pr

Pr PP

PP

PP

B A Pr PP W AN

I

I

I

I

Protéases de paroi de quelques souches de bactéries lactiques (Savijoki et al., 2006)

CW : paroi cellulaire ; H : domaine en hélice ; M : membrane ; B : domaine B ; C : cytoplasme ; A : domaine A ; I : domaine d’insertion ; W : domaine inter membranaire ; PP : pré domaine ; AN: domaine d’attachement ; Pr : domaine catalytique ; : signal court













Peptides contenant Caséines des ILV PrtP Peptides contenant ILV Peptidases Concentration élevée en ILV ou d’un produit de dégradation

Figure4

Opp DtpTp

Dtpp

CodY



Modèle représentant la régulation de l’expression des gènes du régulon protéolytique de Lactococcus lactis

(Drouault et al., 1998 ; Guédon et al., 2001)







al., 1996).




























P P P

Figure5









D F B C A DtpT

D F B C A
















naphtylamide).


























Caséine Protéase




d’enzyme

Pep N

Lb lactis 47.5°C


78kDa monomère

Métallo










Lb curvatus DPC2024





Métallo





Lb sanfrancisco CB1

30°C

7.5

// 75kDa monomère

Métallo



Enzyme à cystéine




82kDa monomère




Enzyme à cystéine

Atlan et al., 1990

Pep C


50kDa monomère






60 à 70°C



Lb sanfrancisco CB1



Dipeptidase


40°C

7.0




Oligo- peptidase

Lb paracasei LC01







PepO PepF

PepN

PepC PepX

PepL

PepQ

PepR PepI

PepT

PepP

PepV

PepD

Ile Val Leuu

Caséine


CodY















1999).



















0

2

4

6

8

10

12

1 2 3 4 5 6

Heures

dens

ité c

ellu

laire

DO

480n

m












5 1 0.5 0.1


1 3 5 7 9 11









9).


















Lait

Protéinase


Paroi cellulaire

Aat Dpp Opp


Membrane


Cytoplasme

















1990).











1999).






polysaccharidique,










classes suivantes :









les muramidases II.














Amidases


Peptidases



L-Ala

D-Glu D-Ala

L-Lys

D-Glu

L-Lys

L-Ala

D-Ala



D-Asp NH2

NH2












bactérienne.






1973).











1987.


La rupture de l’enveloppe cellulaire (membrane et paroi) avec libération du

contenu cytoplasmique dans le milieu extracellulaire présente un intérêt particulier

quant à son utilisation potentielle dans la fabrication des produits laitiers

fermentés. En effet le contenu enzymatique intracellulaire des bactéries du levain

joue un rôle important dans le développement de la flaveur et la texture des

fromages (Hannon et al., 2006). Parmi ces enzymes, les plus caractérisées sont

les peptidases qui libèrent des petits peptides et des acides aminés libres qui sont

des précurseurs d’aromes. L’action des peptidases contribue également à diminuer

l’amertume. Les connaissances acquises sur le système peptidasique des bactéries

lactiques (lactocoques, streptocoques thermophiles et lactobacilles) suggèrent que

les peptidases sont généralement intracellulaires (Lortal et al., 1997) et ne sont

mises au contact du substrat qu’après autolyse cellulaire (Gagnaire et al., 1999).

L’action d’autres enzymes intracellulaires intervenant dans le développement de la

flaveur telles que les estérases, lipases et les enzymes de dégradation des acides

aminés pourrait être amplifiée dans le caillé fromager par lyse bactérienne (El

Sallami et al., 1987 ; Lortal et al., 1988 ; Chapot Chartier, 1996 ; Zambonelli et al.,

2002 ; Huard et al., 2004).ent influencer sur l’activité autolytique bactérienne.

L’âge de la culture est l’un des facteurs les plus étudiés : il a été montré que la

lyse cellulaire est généralement maximale pendant la phase exponentielle de

croissance. Ceci confirme l’implication des autolysines dans la séparation des deux

cellules filles lors de la division cellulaire (Lortal et al., 1997).





1987.


La rupture de l’enveloppe cellulaire (membrane et paroi) avec libération du

contenu cytoplasmique dans le milieu extracellulaire présente un intérêt particulier

quant à son utilisation potentielle dans la fabrication des produits laitiers

fermentés. En effet le contenu enzymatique intracellulaire des bactéries du levain

joue un rôle important dans le développement de la flaveur et la texture des

fromages (Hannon et al., 2006). Parmi ces enzymes, les plus caractérisées sont

les peptidases qui libèrent des petits peptides et des acides aminés libres qui sont

des précurseurs d’aromes. L’action des peptidases contribue également à diminuer

l’amertume. Les connaissances acquises sur le système peptidasique des bactéries

lactiques (lactocoques, streptocoques thermophiles et lactobacilles) suggèrent que

les peptidases sont généralement intracellulaires (Lortal et al., 1997) et ne sont

mises au contact du substrat qu’après autolyse cellulaire (Gagnaire et al., 1999).

L’action d’autres enzymes intracellulaires intervenant dans le développement de la

flaveur telles que les estérases, lipases et les enzymes de dégradation des acides

aminés pourrait être amplifiée dans le caillé fromager par lyse bactérienne (El

Sallami et al., 1987 ; Lortal et al., 1988 ; Chapot Chartier, 1996 ; Zambonelli et al.,

2002 ; Huard et al., 2004).

Matériel et méthodes :

1) Matériel biologique

Les souches bactériennes étudiées sont deux lactobacilles appartenant à la collection des

bactéries lactiques du laboratoire de biologie des microorganismes et biotechnologie et

sont codées CHTD27 et BH14.

Elles ont été isolées du lait de chamelle et ont été préalablement sélectionnées

protéolytiques.

Les deux souches ont été identifiées par les méthodes biochimiques à Lactobacillus brevis

pour la souche CHTD27 (Samake,2004,Belkheir,2004) et Lactobacillus plantarum pour la

souche BH14(Benaissa et Chouiref,2007)

tableau 3 : caractéristiques des deux souches.

code Identifiées à l’espèce origine

CHTD27 Lactobacillus brevis (Belkheir2004) Lait de chamelle de Tindouf

BH14 Lactobacillus plantarum

(Benaissa et Chouiref, 2007)

Lait de chamelle d’Illizi

2) Milieux de culture :

Le milieu utilisé pour la préparation des précultures bactériennes est le milieu MRS de

Man Rogosa et Sharpe,(1960) .

3) Confirmation de l’aptitude protéolytique des souches :

3.1) Caractère protéolytique des cellules :

L’aptitude à la protéolyse des cellules est mise en évidence sur milieu solide MRS

tamponné par le tampon(KH2PO4/Na2HPO4 0.1M pH7.0) additionné de lait écrémé

reconstitué à une concentration finale de 2%, selon la méthode décrite par Van Den Berg et

al (1993) et adoptée au laboratoire de biologie des microorganismes et biotechnologie

(Hassaine et Beloufa,1998 et Zadi Karam, 1998).

Le milieu est ensemencé par touches par une préculture jeune (18h).Après incubation à

30°C pendant 48 heures, l’activité protéolytique est détectée par l’apparition d’une

clarification autour des touches.

3.2) L’activité protéolytique dans les surnageants de culture :

La présence d’enzymes protéolytiques exocellulaires est recherchée dans les surnageants

de culture. Le bouillon MRS tamponné additionné de lait (2%) est inoculé à 1% par une

culture jeune. Après incubation pendant 48 heures à 30°C, la phase claire est récupérée

puis centrifugée à 12.000 tours pendant 10min à 4°C. Le surnageant ou l’extrait

enzymatique est testé pour l’activité protéolytique exocellulaire par la méthode des puits

sur gélose au lait 2% contenant 0.02% de NaN3.

L’activité apparaît par clarification après incubation à 30°C pendant 48 heures.

Les diamètres des halos clairs autour des puits de dépôt sont mesurés et rapportés au carré

(D²) (Chantawanackul et al, 2002).

4) Aptitude à la caséinolyse :

La caséinolyse par les cellules entières et par la fraction enzymatique extracellulaire est

étudiée selon la méthode décrite par Shin et al.,( 2004).

Une culture cellulaire jeune est centrifugée à 12 000trs pendant 10mn à 4°C. Les cellules

sont lavées 2 fois par la solution tampon phosphate de potassium 0.1M pH7.0,puis un

volume de suspension bactérienne ou un volume de fraction extracellulaire est mélangé

avec un volume de tampon phosphate potassium 0.1M pH 7.0 et un volume d’une solution

de caséines totales

(Préparée à 2 %).Le mélange réactionnel est incubé au bain marie à 37°C. Des

prélèvements sont réalisés à différents temps d’incubation (0h,30mn,2h,18h et 24h). La

réaction réalisée en présence de cellules est arrêtée par l’addition du tampon d’échantillon

d’électrophorèse. La réaction présence de l’extrait enzymatique extracellulaire est arrêtée

par l’addition de 6V d’une solution d’acide acétique (10%).Après 15mn d’incubation à

température ambiante, le mélange est centrifugé à12.000trs pendant 10mn.Le culot est

alors récupéré, dilué dans le tampon d’échantillon pour l’électrophorèse (annexe). Les

différents échantillons sont analysés sur gel polyacrylamide en condition dénaturantes,

c’est une technique très utilisée pour la séparation des protéines selon leur poids

moléculaire, dans ce cas elle nous permet de suivre la dégradation des caséines en fonction

du temps sur un gel de séparation (15%) (Tsakalidou et al 1998).

5) Aptitude des souches à l’activité aminopeptidasique :

L’activité aminopeptidasique est testée sur le substrat chromogène l.leucyl

paranitroanilide préparé dans du méthanol absolu à 20mM selon la méthode déjà décrite

par El Soda et al., (1982).

La réaction est réalisée dans 200µl de tampon phosphate potassium 0.1M pH 7.0,

additionné de 25µl de substrat (préalablement préparé) et 50µl d’enzyme. Le mélange

réactionnel est incubé au bain marie à 37°C pendant 24heures.

La réaction est arrêtée par l’addition de 300 µl d’une solution d’acide acétique préparée à

10%.

Après centrifugation à12000 tours pendant 10mn, l’absorbance des surnageants est lue à

410nm contre le blanc contenant le milieu réactionnel en absence d’enzyme. L’hydrolyse

du substrat par les aminopeptidases et la libération du nitroanilide donnent une coloration

jaune ayant le maximum d’absorbance à 410nm. Une nano mole de nitroanilide libéré

présente une unité d’aminopeptidases (UAP).

5.1) mise en évidence de l’activité aminopeptidasique par les cellules :

Un culot cellulaire obtenu après centrifugation d’une culture jeune (18heures) est lavé

deux fois dans le tampon phosphate de potassium 0.1M pH7.0,puis repris en suspension

dans le même tampon. Les cellules bactériennes sont alors testées pour l’activité

aminopeptidasique comme cela a été décrit dans le chapitre précédent.

5.2) Recherche de l’activité aminopeptidasique dans la fraction extracellulaire :

La libération des aminopeptidases dans le milieu extracellulaire est recherchée dans les

surnageants de culture obtenus comme décrit dans le chapitre (3.2.1).L’activité

enzymatique est dosée selon le protocole décrit précédemment.

5.3) expression de l’activité aminopeptidase durant la croissance :

L’expression de cette activité est déterminée par dosage enzymatique durant la croissance

bactérienne. Pour cela, des prélèvements sont réalisés dans les conditions stériles, chaque

2 heures d’incubation d’une culture cellulaire effectuée sur le bouillon MRS inoculé à 1%.

Les densités cellulaires sont déterminées à 640nm pour établir la courbe de croissance. Par

la suite, les cellules bactériennes sont récupérées, lavées deux fois dans le tampon

phosphate potassium 0.1M pH7.0, reprises en suspension dans le même tampon puis

testées pour leur activité aminopeptidasique. Le test a été réalisé en duplicata.

5.4) Détermination des conditions optimales pour la mesure de l’activité

aminopeptidasique des cellules :

Ces conditions sont déterminées pour permettre de poursuivre le travail dans les conditions

favorables pour un maximum d’activité.

5.4.1) Température optimale :

Les cellules en suspension dans le tampon phosphate de potassium 0.1M pH 7.0 sont

incubées en présence substrat l.leucyl paranitroanilide 20mM à différentes températures :

6°C, 20°C, 30°C,40°C,50°C et 60°C. L’activité est dosée après 24h d’incubation à 410 nm.

5.4.2) pH optimum :

Les cellules après deux lavages dans le tampon phosphate de potassium 0.1M pH7.0, sont

reprises en suspension dans le même tampon mais à des pH différents 5.6,6.1,6.9,7.3 et

8.3. L’hydrolyse du paranitroanilide est détectée par spectrophotométrie à 410nm après

24h d’incubation à 37°C au bain Marie.

6) : détermination de la localisation subcellulaire des aminopeptidases :

Plusieurs méthodes d’extraction des aminopeptidases ont été entreprises.

6.1: Utilisation du tampon phosphate sodium (Fira et al 2001) :

Cette technique utilise la présence d’ions tels que le sodium pour la solubilisation des

protéines membranaires.

Un culot cellulaire de 18 heures d’incubation est lavé deux fois par centrifugation dans le

tampon phosphate de sodium 0.1M pH 7.2, les surnageants sont collectés et l’activité

aminopeptidasique est recherchée dans cette fraction.

6.2 : Utilisation du toluène (El Soda et al 2003) :

Le toluène est un solvant organique qui interagit avec les lipides membranaires, en

provoquant des brèches dans la paroi. Cette dernière est fragilisée et les protéines sont

libérées.Un culot bactérien d’une culture jeune est lavé dans 50ml de tampon phosphate de

potassium0.01M pH7.0. Après centrifugation à 7.000 tours pendant 10mn à 4°C, le culot

est repris dans 1ml de toluène. Le mélange est agité au vortex puis congelé à -20°C

pendant une nuit. La suspension cellulaire est décongelée à température ambiante puis

centrifugée à 7.000 tours pendant 20mn à 4°C.Le surnageant est récupéré et testé pour

l’activité aminopeptidasique.

6.3 : Utilisation du NaCl ( Ohmiya et Sato 1975) :

Une concentration élevée en Na Cl augmente la force ionique ceci diminue les interactions

électrostatiques entre les protéines et les autres constituants de la paroi et facilite leur

libération dans le milieu extracellulaire.

Un culot cellulaire est repris dans une solution saline contenant de NaCl (0.9%).

Après 30mn d’incubation à 30°C, le mélange est centrifugé à10.000tours pendant 15mn,

L’activité aminopeptidasique est recherchée dans le surnageant..

6.4 : Extraction de l’enzyme à la glycine/lysozyme

En présence de concentrations élevées en glycine, les cellules en croissance incorporent

cette molécule dans leur paroi, la glycine remplace l’alanine à différentes positions dans

le peptidoglycane, la paroi est ainsi fragilisée et les protéases sont facilement libérées

(Hammes et al, 1973). Cette étape est suivie par un traitement au lysozyme qui hydrolyse

les liaisons osidiques.

L’extraction des aminopeptidases est réalisée selon le protocole décrit par Karam (1995)

et utilisé pour la lyse des lactobacilles.

Une culture cellulaire est réalisée en présence de glycine (4%), après 18 heures

d’incubation (DO≈1) les cellules sont récupérées par centrifugation à 12.000 tours

pendant 10mn à 4°C, lavées deux fois par le tampon phosphate de potassium 0.1M pH7.0

puis reprises en suspension dans le même tampon contenant du lysozyme (10mM). Le

mélange est incubé à 37°C pendant 2 heures.

Après centrifugation à 12.000 tours pendant 10mn à 4°C, le surnageant constitue l’extrait

enzymatique.

L’activité aminopeptidasique du culot (protoplastes et cellules non lysées) est également

dosée.

7 : Purification partielle de l’enzyme extraite:

7.1 : Précipitation au sulfate d’ammonium :

Cette technique utilise la solubilité différentielle des protéines.

Une force ionique élevée a deux effets sur la solubilité des protéines : la neutralisation de

certaines charges ioniques requises en surface pour le maintien de la solubilité et la

compétitivité pour les molécules d’eau disponibles en solution.

En présence des concentrations élevées en sel les protéines sont privées des molécules

d’eau qui l’hydratent, précipitent c’est ce qu’on appelle le phénomène de salting-out.

Les aminopeptidases sont fractionnées par utilisation de deux concentrations en sulfate

d’ammonium : 50% de saturation et 80% de saturation.

Le sulfate d’ammonium solide (cristaux) est ajouté à la fraction enzymatique extraite

jusqu’à une saturation de 50% sous agitation à 4°C pendant 4 heures. Après

centrifugation à 12.000 tours pendant 45mn à 4°C, le culot est repris en suspension dans

le tampon phosphate de potassium 0.1M pH6.9, il est dialysé contre l’eau distillée puis

testé pour l’activité aminopeptidasique. Le surnageant récupéré après la première

centrifugation est additionné de sulfate d’ammonium solide jusqu’à une saturation de

80% dans les mêmes conditions que précédentes. Après centrifugation, le culot ainsi

obtenu est repris en suspension dans le tampon phosphate de potassium 0.1M pH 6.9 puis

dialysé contre l’eau distillée et testé pour l’activité enzymatique.

7.2) Purification par Chromatographie sur colonne :

7..2.1) sur gel de fi1tration sephadex G100 :

Il s’agit d’une séparation des protéines selon leur taille en utilisant un tamis moléculaire.

Une colonne de chromatographie pour filtration sur gel est remplie d’une matrice

consistant en billes creuses et poreuses, la taille des pores de ces billes est telle que

certaines protéines (petites) pénètrent dans la matrice par les pores et se déplacent à

travers la colonne très lentement. Leur migration sera retardée et apparaissent en sortie

de colonne parmi les derniers composés élués. En revanche, les molécules dont la taille

dépasse celle des pores migreront entre les billes et seront collectées rapidement dans les

premières fractions. Les protéines de taille intermédiaire prendront moins de temps à

sortir de la colonne que les petites molécules.

L’extrait enzymatique obtenu après précipitation au sulfate d’ammonium et concentré

par dialyse contre le sucrose et quantifié par dosage à la méthode de Bradford est déposé

à la surface d’une colonne ( 20cmxd) remplie au Sephadex G100 (pharmacia) dont le

domaine de fractionnement est de 0 à 100 kDa.

La colonne est équilibrée par le tampon tris HCl 0.05M pH : 7.0.Les protéines sont

éluées par le même tampon à un débit de 4.2ml /mn. Des fractions de 1.5 ml sont

collectées à l’aide d’un collecteur automatique (model advantec SF3120) et sont testées

pour l’activité aminopeptidasique.

7.2.2) sur résine échangeuse d’ions :

Dans une colonne échangeuse d’ions, les protéines interagissent par affinité

électrostatique avec les groupements chargés de la résine.

Une résine peut être échangeuse d’anions parce qu’elle interagit avec les ions négatifs

ou groupements acides d’une protéine ou échangeuse de cations car ce sont les

groupements basiques d’une protéine qui interagissent avec elle.

Les deux substituants les plus utilisés sont le diethylaminoethyl (DEAE) pour une

résine échangeuse d’anions et le carboxymethyl (CM) pour une résine échangeuse de

cations, le choix de l’un ou de l’autre dépend de la charge de la protéine à étudier.

Nous avons utilisé la résine DEAE cellulose (D52 Watman) préparée suivant les

étapes décrites par Deneuville,(1991) :

1g de résine est dissout dans 20ml de tampon K2HPO40.025M / MgCl2 0.01M pH7.4, le

mélange obtenu est incubé dans un bain-marie à 50°C pendant 30mn pour permettre le

dégazage total de la résine.

La résine est équilibrée en utilisant le composant acide ou basique du tampon.

Une colonne de 11ml est remplie par la résine, après 30mn de repos la colonne est

lavée deux fois par le même tampon et 1ml de la fraction active obtenue par filtration

sur gel G100 est déposé.

Les protéines sont éluées par 20ml du même tampon contenant 1% puis 3% de NaCl.

Des fractions de 2ml sont collectées et soumises à la recherche de l’activité

aminopeptidasique. .

8 ) Caractérisation de l’activité enzymatique de l’aminopeptidase purifiée :

8.1. Influence du pH

L’influence du pH était étudiée en pré-incubant l’enzyme purifiée pendant 15mn dans du

tampon phosphate potassium 0.1M à pH 5.1, 5.6, 6.6, 7.5 ou 8.0 avant d’ajouter le substrat.

L’incubation était prolongée pendant 24h à 40°C.

8.2 . Détermination de la température optimale :

L’influence de la température était recherchée en pré-incubant l’enzyme purifiée dans du

tampon phosphate de potassium 0.1M pH6.9 à différentes températures (30°C,40°Cet

50°C), le substrat étant ajouté après 15mn de préincubation. Le mélange réactionnel était

incubé pendant 24heures aux températures étudiées. Les DO sont lues à 410nm

8.3. Effet des inhibiteurs

L’activité de l’enzyme purifiée est étudiée en présence du phenylmethyl sulfonyl

fluoride ou PMSF (Inhibiteur des protéines à serine), B mercaptoéthanol (réducteur des

fonctions thiols) ou l’ethylène diaminetetra acétate ou l’EDTA (chélateur des cations

divalents).

L’extrait enzymatique est préincubé dans le tampon phosphate de potassium 0.1M

pH6.9 contenant à chaque fois l’inhibiteur étudié à raison de 5 et 10mM. Le substrat est

ensuite ajouté et le mélange est incubé à 40°C pendant 24heures.

8.4 .Effet des ions :

L’effet des ions est déterminé en préincubant dans le tampon phosphate potassium

0.1M pH6.9 l’extrait enzymatique purifié en présence des solutions de CoCl2, CaCl2,

KCl , ZnCl2, NaCl, MnCl2, MgCl2 et CuCl2 à 5 et 10mM pendant 15mn à 40°C. Le

substrat est alors ajouté et le mélange est laissé à incuber pendant 24heures.

9) La sélection des mutants déficients protéase négatifs (Prt-) par mutagenèse :

9.1) La mutagenèse :

La mutagenèse a été réalisée par irradiation aux UV, ces derniers provoquent de

nombreuses modifications de l’ADN par formation des dimères de pyrimidine entre des

résidus adjacents ou plusieurs autres types de mutations ponctuelles ou des réarrangements

des chromosomes.

L’irradiation est réalisée à l’obscurité étant donné que certaines lésions ont réparées en

présence de lumière visible (photoréversion).

Chaque souche a une sensibilité propre aux U.V et chaque lampe délivre une énergie

différente, il est recommandé d’établir la courbe de survie de la souche utilisée avec la

lampe à disposition.

Une culture de 18heures d’incubation est récupérée diluée jusqu’à 10-6 dans du MRS

stérile,la dilution est ensuite déposée dans une boite de Pétri stérile et exposée aux rayons

d’une lampe (biobloc scientif 312nm power 180W) pendant

2mn,4mn,6mn,8mn,10mn,12mn et 15mn.l’échantillon témoin n’est pas irradié.

9.2)La détection des variants protéolytiques (Prt-) :

Pour isoler des mutants d’un organisme donné, il est nécessaire de connaître le caractère de

la souche sauvage, ( protéolyse dans ce cas), afin de connaître le phénomène altéré.

La détection des variants doit se faire aisément même s’ils sont rares, il faut aussi les

séparer efficacement des cellules parentales et des autres mutants.

La présélection des colonies Prt- est effectuée sur le milieu solide MRS/lait 2%par

étalement de 100µl de la dilution irradiée. Les boites protégées de la lumière sont incubées

à 37°C pendant 48heures.

Une perte de l’activité protéolytique se traduit par l’absence de halo clair autour des

colonies.

10) Dosage des protéines par la méthode de Bradford :

Dans cette méthode les protéines forment avec le bleu de Coomassie G250 un

complexe coloré présentant un maximum d’absorption à 595nm. L’analyse des

protéines est basée sur le changement de couleur du colorant en réponse à diverses

concentrations en protéines.

Une courbe d’étalonnage est réalisée par une solution d’albumine sérique bovine

(BSA) préparée à 1mg/ml dans de l’eau distillée. Le tableau 4 présente la préparation

de gamme étalon.

Tableau4 : Préparation de la gamme étalon :

BSA solution mère

1mg /ml µl

0 10 20 30 40 50

Eau distillée µl 50 40 30 20 10 0

Réactif de Bradford ml 2 2 2 2 2 2

Les tubes sont incubés 5 à 10mn à température ambiante, puis les DO sont lues à

595nm

Courbe étalon

11 ) Electrophorèse SDS- PAGE :

L'électrophorèse, effectuée sur un support en gel de polyacrylamide, permet de séparer

un mélange protéique par la migration de ses constituants sous l'effet d'un champ

électrique.

En conditions dénaturantes c’est à dire en présence de SDS (détergent anionique), les

protéines sont séparées selon leur poids moléculaire car le détergent anionique dissocie

le complexe protéique en monomères en leur attribuant une charge négative globale,

ainsi les protéines migrent du pole négatif vers le pole positif selon leur taille.

Les gels utilisés sont biphasiques, constitués d’un gel supérieur ou gel de concentration

(5%) et un gel inférieur ou gel de séparation (13%) pour l’analyse des fractions

purifiées.

Les échantillons sont préparés selon la méthode de Laemmli ,(1970).

4V d’échantillon (fraction purifiée) sont dissous dans 1V de tampon d’échantillon

(annex)deux fois concentré,le mélange est chauffé à100°C pendant 3mn puis

centrifugés à 5000tours pendant 5mn .

Les fractions traitées sont déposées à l’aide d’une seringue Hamilton dans les puits

creusés dans le gel supérieur. La séparation est réalisée à 50mA pendant une nuit.

Après migration, le gel est démoulé puis placé dans une solution fixatrice d’acide

trichloroacétique (10%) pendant 30mn.

Les bandes sont révélées au bleu de Coomassie R250 pendant 2 heures, les gels sont

décolorés dans deux bains de 30mn puis pendant une nuit dans une solution de

décoloration(annexe).

Les gels décolorés sont conservés dans une solution d’acide acétique (10%).

12) L’activité autolytique

L’autolyse bactérienne est un phénomène spontané ou induit qui se traduit par l’hydrolyse

de la paroi cellulaire sous l’action d’enzymes endogènes appelées autolysines.(Lortal et

Chartier, 2005 , Benatier, 2000).

Plusieurs facteurs induisent l’autolyse bactérienne, il a été démontré qu’il y a augmentation

du taux d’autolyse dans des conditions osmotiques anormales telle que les cellules en

milieu hypo ou hypertonique. (Lazure- Demers, 2000).

Détermination de l’activité autolytique :

L’aptitude à l’autolyse des cellules des souches BH14 et CHTD27 est détectée sur le

milieu MRS et le tampon phosphate potassium dissodique en suivant la diminution de la

densité optique cellulaire à 640nm pour pouvoir calculer le taux d’autolyse.

12.1)l’activité autolytique spontanée :

L’activité autolytique spontanée est mesurée sur le milieu de culture dans les conditions

normales de croissance. Dans ce cas, le milieu MRS est inoculé à 1% par une culture jeune

et l’autolyse des cellules est suivie à 30°C pendant deux semaines avec un prélèvement au

bout de chaque semaine. Les DO sont lues à 640 nm (Benatier, 2000)

12.2) l’activité autolytique induite :

L’activité autolytique induite est étudiée dans le tampon phosphate potassium dissodique

0.01M pH5.8 additionné de 0.4% de NaCl, et le tampon citrate acide citrique 0.01M pH7.0

L’utilisation du Na Cl induit d’une part la libération des autolysines et d’autre part permet

de réaliser les conditions de production fromagère qui sont en générale salines (El Soda et

al, 2003).

Le tampon phosphate est ensemencé (1%) par une culture jeune. La suspension bactérienne

est incubée à 30°C pendant 48heures, des prélèvements sont réalisés chaque 24 heures et

les DO sont lues à 640nm.

12.3) calcul du taux d’autolyse :

Le pourcentage d’autolyse est calculé selon la méthode décrite par Boutrou et al., (1998) :

% d’autolyse = A0 – At × 100 A0 : DO640nm à t0

A0 At : DO640nm à t prélèvement.

Ce pourcentage permet de classer les souches selon leur pouvoir autolytique en se

référant à la classification établie par Boutrou et al., (1998).

3

RESULTATS ET DISCUSSION

3.1 Détection de la protéolyse des caséines du lait :

L’activité protéolytique des cellules est confirmée par l’apparition d’une auréole claire,

correspondant à la dégradation des protéines du lait, autour des colonies ensemencées par

touches sur milieu solide MRS additionné de 2% de lait (figure 11).

La présence des enzymes protéolytiques est également vérifiée dans des surnageants

obtenus après culture sur bouillon MRS / lait 2%. L’activité protéolytique est révélée de la

même manière que précédemment, par l’apparition de halos clairs autour des puits creusés

dans la gélose au lait 2%. Les diamètres des halos obtenus sont de 400mm2 pour la souche

CHTD27 et de 484mm2 pour la souche BH14. Ces valeurs rejoignent celles rapportées au

laboratoire pour les deux souches. Quelques propriétés biochimiques ont été déterminées

pour ces protéases extracellulaires, il s’agit de métalloenzymes Ca+2 indépendantes, ayant

un maximum d’activité à température 40°C à pH7.0 pour les protéases de la souche

CHTD27 et à pH8 et pH 4 pour les protéases de la souche BH14 (Belkheir,2004,Azri,

2005, Makhlouf, 2006, Zemmache, 2006 et Sekrane et Kebli, 2007)..

Ces résultats indiquent que les souches bactériennes ont gardé le même potentiel de

protéolyse plusieurs années après leur isolement. Ce caractère est donc stable durant la

conservation des bactéries.

3.2 L’aptitude caséinolytique des cellules et de la fraction extracellulaire :

L’hydrolyse d’une solution de 2% de caséines en fonction du temps par les cellules ou par

la fraction extracellulaire est révélée par électrophorèse SDS-PAGE (figure 12).

La caséinolyse n’est observée qu’après 24h d’incubation pour les cellules alors que le

maximum d’activité est obtenu après 18h d’incubation pour les surnageants

extracellulaires : ceci peut être expliqué par la meilleure accessibilité de l’enzyme au

substrat lorsqu’elle n’est plus attachée à la paroi cellulaire.

Les profils obtenus montrent aussi que les 2ème et 3ème entités des caséines sont

préférentiellement hydrolysées par les cellules des deux souches. On remarque par ailleurs

que les protéases extracellulaires produites par la souche BH14 sont actives sur la 1ère

entité, contrairement à celles produites par la souche CHTD27 (figure 12).

La spécificité d’hydrolyse des caséines par les bactéries lactiques a été largement décrite.

En effet, la spécificité de substrat diffère d’une espèce à une autre dans le genre

Lactobacillus : en général, les enzymes membranaires appartiennent aux protéinases de

type III ou de type I observées chez les lactocoques (Khalid et Marth, 1990). Des résultats

similaires ont été rapportés pour les protéases extracellulaires des streptocoques (Espla et

al., 2000).

Chez Lactobacillus la situation est sensiblement différente. Alors que Lb. delbrueckii

bulgaricus ATCC12278 et Lb. helveticus ATCC10797 hydrolysent les caséines αS1 et β

sans aucune préférence, Lb. helveticus CNRZ32 hydrolyse préférentiellement la caséine β.

Une préférence pour la caséine αS1 et la caséine κ a été observée chez Lb. plantarum et Lb

casei (Khalid et Marth, 1990). Lb. helveticus CRL1062 montre un maximum d’activité sur

les caséines αS1 et β ; le profil électrophorétique obtenu après 3h d’activité révèle que la

caséine αS1 est dégradée en 4 peptides et la caséine β en trois peptides (Hebert et al., 2000).

La dégradation de la caséine β par Lb helveticus BGRA43 donne deux produits

d’hydrolyse révélés par électrophorèse (Pastar et al., 2006).

3.3 Recherche de l’activité aminopeptidasique (AAP) :

• Dans les cellules :

Les deux souches montrent une activité aminopeptidasique sur le substrat chromogène

L-leucyl paranitroanilide, qui devient jaune après libération du nitroanilide. Cette

activité est plus importante pour la souche CHTD27 (DO410nm = 2.85) par rapport à la

souche BH14 (DO410nm =1.96) (figure 13).

Des variations d’expression de cette activité aminopeptidasique ont été aussi observées

par Thivierge (1999) chez des souches lactocoques mésophiles.

• Dans les surnageants de culture :

Une activité aminopeptidasique négligeable est notée dans les surnageants de culture

extracellulaires (DO410nm=0.0815 pour la souche CHTD27 et DO410nm =0.0915 pour la

souche BH14) (figure13). Ceci nous permet de conclure qu’il s’agit d’une enzyme qui

n’est pas ou très peu sécrétée dans le milieu extracellulaire. Des localisations

membranaire et cytoplasmique ont été rapportées pour des aminopeptidases de type N

ou pepN (Eggimann et Bachmann, 1980 ; Atlan et al., 1989 ; Cholette et Mc Kellar,

1990 ; Atlan et al., 1990 ; Tsakalidou et al., 1993 ; Macedo et al., 2003 ; Pan et

Tanokura , 2004).

Chez le genre Lactobacillus aucun travail n’a concerné les aminopeptidases

extracellulaires jusqu’à récemment (Choi et al., 1995). Ces enzymes jouent un rôle

important dans la nutrition cellulaire et ceci en enrichissant la cellule par les acides

aminés nécessaires pour sa croissance. Cependant leur éventuelle sécrétion dans le

milieu extracellulaire conduirait la cellule à ne pas utiliser les caséines du lait, ce qui

n’est pas le cas des bactéries lactiques et notamment des lactobacilles dont la nutrition

azotée dépend de l’utilisation des caséines du lait (Monnet et al., 1993).

Les résultats précédents indiquent que l’activité aminopeptidasique de nos souches est

principalement localisée dans le cytoplasme. Ceci nous oriente vers l’étude des

aminopeptidases, notamment celles de type N (pepN) car ce type d’enzyme représente le

groupe majeur (environ 2/3) des aminopeptidases (Thivierge, 1999). De plus l’activité

pepN a la propriété intéressante de contribuer fortement à la diminution de l’amertume

dans les fromages : cela explique pourquoi les souches exprimant une forte activité

aminopeptidasique sont recherchées en industrie fromagère.

3.4 Expression de l’AAP durant la croissance :

La synthèse maximale des aminopeptidases chez les deux souches est observée pendant la

phase exponentielle de croissance, c'est-à-dire entre 6h et 12h de culture (figure 14, a et b).

Cette activité reste stable pour la souche CHTD27 durant la phase stationnaire de

croissance qui dure jusqu’à 28h de culture. La phase de déclin n’est pas observée pour

cette souche qui exprime peu d’autolyse bactérienne.

Pour la souche BH14 une baisse de la production des aminopeptidases est notée, avec

diminution de la densité cellulaire après 20h de culture seulement. Cette autolyse

bactérienne ne s’accompagne pas d’une augmentation de l’activité aminopeptidasique, ce

qui n’est pas le cas des souches de lactobacilles thermophiles utilisées en fromagerie (Prost

et Chamba, 1992). En effet, pour ces auteurs un maximum d’activité aminopeptidasique est

retrouvé après 24h de culture, lorsque la densité cellulaire est élevée. Une faible

diminution de l’activité aminopeptidasique est ensuite notée durant la phase allant de 1 à 7

jours d’incubation : cette diminution peut être expliquée par l’instabilité de l’enzyme se

trouvant dans un milieu fortement acide. De 7 jours à 90 jours de culture (durée

correspondant à celle de la phase de maturation fromagère) une augmentation de l’activité

aminopeptidasique est relevée, certainement suite à la libération des aminopeptidases

intracellulaires.

Choi et al. (1995) ont remarqué que l’activité aminopeptidasique suit la courbe de

croissance, ce qui renseigne sur l’importance que joue cette enzyme pour la croissance des

cellules.

Ceci est le cas des aminopeptidases produites par nos deux souches,.

Dans notre cas nous pouvons suggérer que les aminopeptidases produites par la souche

BH14 sont plutôt fortement liées à la paroi cellulaire et ne sont pas intracellulaires.

3.5 Conditions optimales de température et de pH pour l’expression de l’AAP:

Les conditions de température et de pH ont été examinées pour obtenir un maximum

d’activité chez les cellules. Selon les résultats présentés dans les figures 15 et 16, le

maximum d’activité est observé à 40°C pour la souche CHTD27 et à 30°C pour la souche

BH14. Les deux souches expriment un maximum d’activité à pH 6.9.

3.6 Mise en évidence de la localisation subcellulaire des aminopeptidases :

Différentes procédures ont été utilisées pour l’extraction des aminopeptidases des cellules

(utilisation du toluène, utilisation du tampon phosphate sodium0.1M pH7.2, utilisation du

NaCl à 0.9%). Ces méthodes se sont révélées inefficaces et introduisaient de plus des

interférences avec le substrat chromogène lors du dosage.

Cependant la méthode alliant une culture en présence de glycine, puis un traitement des

cellules par le lysozyme, a permis d’extraire ces enzymes. Cet extrait brut nous a permis de

mesurer des activités catalytiques intéressantes, soit 193.52 nanokats pour la souche

CHTD27 et 134.5 nanokats pour la souche BH14 (Tableau4)

De nombreux auteurs ont utilisé différentes techniques pour l’extraire les aminopeptidases

à partir des cellules : tels que le choc osmotique ou le traitement par le lysozyme suivi de

quelques cycles de sonication (Sanz et Toldra, 2002 ; Tsakalidou et al., 1993 ; Montel et

al., 1995 ; Tobiassen et al., 1997 ; Magboul et Mc Sweeney, 1999) ou par compression des

cellules (Cholette et Mc Kellar, 1989).

Certaines aminopeptidases membranaires ont été extraites par traitement au lysozyme à

partir de Lb. lactis (Eggimann et Bachmann, 1980) et à partir de Lb. helveticus LHE51

(Miyakwa et al., 1990).

Dans notre cas, l’enzyme est extraite après un traitement glycine/lysozyme, c’est à dire

deux agents conduisant à une fragilisation du peptidoglycane. Ceci renforce la suggestion

quant à la localisation membranaire des aminopeptidases des souches étudiées.

3.7 Purification de la fraction enzymatique AAP:

Nous avons entamé la purification des aminopeptidases à partir de l’extrait brut obtenu

comme décrit précédemment. Les différentes étapes de cette purification sont les

suivantes :

• Précipitation à l’aide du sulfate d’ammonium • Chromatographie d’exclusion • Chromatographie d’échange

3.7.1 Précipitation au sulfate d’ammonium :

Les essais ont été faits en ajoutant à l’extrait brut différentes concentrations en sulfate

d’ammonium. La fraction obtenue pour les deux souches avec 80% de saturation en sulfate

d’ammonium (SA80) montre l’activité aminopeptidasique la plus importante: 159.21

nanokats pour la souche CHTD27 et 131.76 nanokats pour la souche BH14 (Tableau 4). Ce

résultat est en accord avec les données de la littérature car la majorité des aminopeptidases

extraites des lactobacilles sont précipitées avec des concentrations allant de 70% jusqu’à

85% de sulfate d’ammonium (Eggimann et Bachmann, 1980 ; Miyakawa et al., 1990 ;

Goldstein et al., 2002 ; Sanz et Toldra, 2002) .

3.7.2 Filtration de la fraction SA80sur gel Sephadex G100 :

Les fractions actives SA80 précédemment obtenues sont concentrées par dialyse à 4°C puis

appliquées sur un gel de Sephadex G100. L’activité aminopeptidasique est recherchée dans

les fractions (fractions Gn, où n désigne le numéro de la fraction). Les résultats obtenus

montrent que l’activité est retrouvée dans les fractions G10 à G21 pour CHTD27 comme

pour BH14 (figure 17) avec respectivement un maximum dans les fractions G17 et G12.

Le volume mort de la colonne étant de 15ml, les poids moléculaires des aminopeptidases

extraites à partir des deux souches sont légèrement inférieurs à 100 kDa. Ce résultat rejoint

ceux observés pour les aminopeptidases de type N extraites à partir de différentes souche

du genre Lactobacillus : Lb. lactis (Eggimann et Bachmann, 1980), Lb. helveticus

(Chollete et Mc Kellar, 1990), Lb. plantarum ESB5004 (Macedo et al., 2003), Lb. curvatus

DPC2024 (Magboul et Mc Sweeney, 1999a), Lb. delbrueckii ssp bulgarius ACADC233

(Tsakalidou et al., 1993), Lb. helveticus LHE511(Miyakawa et al., 1992) et Lb.

sanfrancsco CB1 (Gobbetti et al., 1996) et pour lesquelles les poids moléculaires ont été

estimés généralement autour de 100 kDa. Celles de la souche Lb helveticus JCM1004

présentent des poids moléculaires voisins de 129kDa (Pan et Tanokura, 2004).

Après passage sur gel G100 nous avons obtenu des activités catalytiques de 70.69nanokats

et de 56.27nanokats respectivement pour la souche CHTD27 et la soucheBH14. (Tableau

4). Ce résultat nous renseigne sur une perte en quantité et en activité enzymatique.

3.7.3 Purification par chromatographie échangeuse d’ions (DEAE) :

Les fractions G montrant une activité aminopeptidasique sont rassemblées en une fraction

G qui est alors appliquée sur une colonne de résine échangeuse d’anions DEAE cellulose.

Après lavage, l’élution est réalisée à l’aide de tampon d’élution additionné de 1% et de

3%de NaCl Les résultats obtenus sont montrés dans la figure 18. L’activité

aminopeptidasique est retrouvée dans les fractions 10 à 16 pour les deux souches, ce sont

les fractions éluées avec 1% de NaCl. Nos résultats montrent aussi une perte notable

d’activité, notamment pour la souche BH14 dont l’activité catalytique a diminué pour

passer de la valeur de 56.27 nanokats (fractions G) à la valeur de 8.92 nanokats après

passage sur résine échangeuse d’ions

(Tableau 4). Ceci est en accord avec les observations de Atlan et al. (1989) qui ont noté

l’instabilité de la L-leucyl aminopeptidase lors de l’extraction des aminopeptidases de Lb.

bulgaricus.

Les résultats consignés dans le tableau 4 montrent, comme précédemment évoqué, qu’il y a

une perte importante de quantité de protéines après les deux chromatographies, ce qui

pourrait indiquer une mauvaise efficacité des deux résines utilisées pour la purification des

aminopeptidases. ET PAR RAPPORT AUX ACTIV. SPECIF. ??? .

L’instabilité des enzymes étudiées a été souvent rapportée (Atlan et al., 1989 ; Monnet et

al.,1993 ; Bolumar et al., 2003), surtout dans le cas d’enzyme intracellulaire. Il est donc

important d’utiliser d’autres techniques et de revoir les conditions expérimentales pour

améliorer le rendement de purification de ces aminopeptidases.

Le gel de filtration G100 n’est pas fréquemment utilisé pour la purification de ces enzymes

bactériennes (Pan et Tanokura, 2004 ; Goldstein et al., 2002). Une aminopeptidase de Lb.

plantarum ESB5004 a été 11 fois purifiée ??? avec un rendement de 1% seulement en

utilisant la combinaison précipitation au sulfate d’ammonium (30 et 50%) : :

chromatographie hydrophobe : chromatographie échangeuse d’ions (Macedo et al., 2003),

ceci confirme les remarques élaborées concernant l’effet de technique .

3.7.4 Détermination du poids moléculaire de l’enzyme extraite par électrophorèse

SDS PAGE :

Dans le but de préciser le poids moléculaire de l’aminopeptidase, nous avons analysé les

différentes fractions précédemment décrites ainsi que l’extrait brut par électrophorèse sur

gel de polyacrylamide en conditions dissociantes. Les profils électrophorétiques obtenus

(Figure 19) révèlent la présence de deux protéines majeures dont l’une, de PM voisin de

43kDa, représente probablement l’enzyme étudiée. L’autre, de PM inférieur à 25kDa, a la

même migration que le lysozyme.

Précédemment, par chromatographie sur gel de filtration G100, nous avions avancé un

poids moléculaire légèrement inférieur à 100kDa pour cette enzyme. Les résultats obtenus

par l’électrophorèse en conditions dissociantes indiquant environ la moitié de cette valeur,

nous pouvons émettre l’hypothèse que l’enzyme native aurait une structure dimérique.

Ceci n’est pas en accord avec les travaux décrivant une structure monomérique des

aminopeptidases de type N chez Lactobacillus (Eggimann et Bachmann, 1980 ; Chollete et

Mc Kellar, 1990 ; Miyakawa et al., 1992 ; Tsakalidou et al., 1993 ; Gobbetti et al., 1996)

ou encore trimérique comme chez Lb. helveticus JCM1004 (Pan et Tanokura, 2004) mais

nos résultats sont en accord avec les données montrant que ces enzymes sont dimériques

chez Lb. curvatus DPC2024 et Lb. plantarumESB5004 (Magboul et Mc Sweeney, 1999a ;

Macedo et al., 2003).

Nos résultats obtenus chez Lb. plantarum et Lb. brevis et ceux des auteurs ci-dessus chez

d’autres espèces de lactobacilles montrent bien qu’il y a une diversité importante des

aminopeptidases au sein du genre Lactobacillus.

3.7.5 Propriétés physico-chimiques de l’enzyme:

Nous avons voulu caractériser les enzymes produites par nos deux souches en étudiant les

effets de divers paramètres physico-chimiques sur leurs activités. Les résultats obtenus sont

résumés dans le tableau 5.

Les aminopeptidases produites par la souche CHTD27 présentent des caractéristiques

généralement observées pour les aminopeptidases de type N isolées chez les lactobacilles :

ce sont des métalloenzymes présentant un maximum d’activité à pH6.9 et à température

40°C, inhibées par les ions Cu+2 (70% d’inhibition) et activées par les ions Co+2 (130%) et

les ions Na+(141%) (Eggimann et Bachmann, 1980 ; Gobbetti et al., 1996 ; Tsakalidou et

al., 2002 ; Sanz et Toldra, 2002) .

Celles extraites à partir de la souche BH14 montrent des caractéristiques différentes : ce

sont des métalloenzymes présentant un site catalytique avec une sérine, ayant un maximum

d’activité à pH7.5 et à température 40°C ; elles sont inhibées par les ions Cu+2 (70%

d’inhibition). Certaines aminopeptidases de Lactobacillus contiennent d’autres

groupements tels que les fonctions thiols ou une cystéine dans leurs sites catalytiques

(Miyakawa et al., 1990 ; Magboul et Mc Sweeney, 1999b).

Une stimulation de 166.6% par le β mercaptoéthanol à 5mM est notée pour les enzymes

extraites à partir de la souche BH14, ceci a été également rapporté par plusieurs auteurs

(Miyakawa et al., 1990 ; Gobbetti et al., 1996 ; Sanz et al., 2002) qui l’attribue à un effet

de pH. Une stimulation de l’activité aminopeptidasique est observée à pH6.0 tandis qu’à

pH 8.0 on note une inhibition à 90% de cette activité (Chollette et al., 1990).

3.8 Recherche des mutants déficients en protéases:

Nous avons tenté d’obtenir des variants déficients en protéases afin d’avoir un témoin

négatif, nécessaire à la poursuite de l’étude des protéases de lactobacilles. Pour cela nous

avons réalisé une mutagenèse sur les deux bactéries, à l’aide des rayons UV.

Les courbes de survie établies indiquent que la souche BH14 se montre plus sensible aux

UV que la souche CHTD27 (Figure 20). Sa croissance est totalement abolie après 4 mn

d’exposition au rayonnement.

Les clones bactériens obtenus individuellement après mutagenèse aux UV sont ensuite

cultivés sur milieu MRS en vue de détecter des variants de protéolyse. Les résultats

obtenus montrent que certains clones donnent le halo clair habituellement observé pour une

activité protéolytique (Figure 21) alors que d’autres ne donnent pas de halos clairs mais des

halos opaques.

Ces dernières bactéries sont repiquées sur milieu solide MRS/lait 2% sur lequel elles

montrent une clarification du milieu après 48h d’incubation.

Dans une deuxième tentative pour obtenir des variants déficients en protéases, nous avons

soumis les bactéries à la température de 38°C, qui est sub-létale pour les deux souches. Des

repiquages étaient faits toutes les 24 h pendant 8 jours, en vérifiant systématiquement

l’aspect des halos de protéolyse. Après le 8ème repiquage nous avons noté une diminution

de densité cellulaire dans les bouillons par comparaison avec une culture témoin réalisée à

30°C. La culture réalisée à partir de ce repiquage sur milieu MRS/2%lait se montre

identique à celle de la culture sauvage. Ces essais n’ont donc pas permis d’obtenir de

variants de protéolyse.

Le caractère protéolytique de deux souches étudiées est conservé après mutagénèse, ce qui

indique vraisemblablement que le(s) gène(s) concerné(s) est (sont) important(s) pour la

survie de la bactérie et certainement localisé(s) sur le chromosome bactérien. La

localisation chromosomique des gènes de protéolyse a été effectivement rapportée pour les

lactobacilles alors que chez les lactocoques ces gènes sont plasmidiques (Kok, 1990 ;

Kunji et al., 1996 ; Espla et al., 2000 ; Kojic et al., 1991 ; De Palencia et al., 1997). Il n’y a

quasiment aucune information dans la littérature sur l’obtention, par traitement aux UV, de

mutants déficients en protéases chez les lactobacilles. En effet tous les variants

protéolytiques déficients sélectionnés chez ce Lactobacillus ont été obtenus par action de

mutagènes chimiques tels que la nitrosoguanidine (Atlan et al., 1989 ; Prost et Chamba,

1992), l’EMS (De Palencia et al., 1997) et l’acriflavine (Matar et al., 1997).

3.8 Activité autolytique chez Lactobacillus:

Nous avons voulu estimer l’autolyse chez nos souches, qu’elle soit spontanée ou induite.

3.8.1 Autolyse spontanée :

L’autolyse bactérienne spontanée a été suivie par mesure de la DO640nm des cultures de

15jours en milieu MRS liquide, pH 6.5 incubé à 30°C (conditions optimales de

croissance). Le pouvoir autolytique des deux souches est différent car on relève qu’après 7

jours d’incubation la souche BH14 est plus autolytique que la souche CHTD27. Les

valeurs d’autolyse sont de 67.3% pour la souche BH14 contre 31.3% pour la souche

CHTD27 (Figure 22). Cependant après 15 jours d’incubation, quasiment les mêmes

pourcentages d’autolyse sont observés pour les deux souches, soit 69.1% et 67.3%

respectivement pour la souche BH14 et la souche CHTD27 (Figure 23). Ces résultats

indiquent qu’il y a des différences d’aptitudes à l’autolyse entre les souches, et d’autre part

montrent l’influence de la composition du milieu (suite au métabolisme bactérien) sur le

pouvoir autolytique des souches.

Ceci s’applique en particulier pour la souche BH14 chez qui un maximum d’autolyse est

rapidement atteint (après 7 jours d’incubation). La souche CHTD27 s’est montrée moins

influencée par la composition du milieu et notamment moins sensible à la présence du

glucose comme seule source de carbone. Le maximum de son activité autolytique est

observé qu’au bout de 15 jours de culture, c’est une activité induite par l’épuisement des

réserves énergétiques et accumulation des déchets dans le milieu de culture.

L’influence de la source de carbone du milieu de culture sur la capacité des cellules à se

lyser en fin de croissance a été largement étudiée. Des expériences ont montré que

l’autolyse est plus rapide et atteint une proportion de cellules très importante pour des

cultures réalisées sur milieu ne contenant que du glucose comme source de carbone. Des

résultats similaires ont été observés sur des souches de lactocoque qui se sont montrées

osmotiquement plus fragiles et s’autolysent immédiatement une fois cultivées sur la

glucose, cette fragilité a été expliquée par l’incapacité des cellules à utiliser le glucose

comme précurseur de la galactosamine qui entre dans la composition des acides

teichoiques, en conséquence les cellules présentent une paroi moins solide et s’autolysent

rapidement (Chapot Chartier, 1996).

3.8.2 Autolyse induite :

L’induction de l’autolyse est obtenue en transférant les cellules en culture dans une

solution tamponnée puis elles sont incubées à 30°C. Les cellules vont se trouver alors en

situation de privation nutritionnelle et s’autolysent. Cette technique est utilisée pour

l’induction de l’activité autolytique chez plusieurs espèces bactériennes à Gram+ ou à

Gram- (Lortal et al., 1997).

Après 24h d’incubation dans le tampon phosphate de potassium 0.1M pH5.8 additionné de

4% de NaCl, les deux souches donnent des pourcentages d’autolyse sensiblement

identiques, soit 66.7 % et 68.8% respectivement pour la souche CHTD27 et la souche

BH14 (Figure 23).

Dans des essais utilisant le tampon citrate/acide citrique 0.01M pH 7.0, les deux souches se

montrent encore plus autolytiques, l’autolyse atteignant 91.5% chez la souche BH14 contre

63.6% chez la souche CHTD27 (Figure 23).

L’autolyse induite chez les deux souches étudiées est très élevée et concerne donc une

proportion cellulaire importante après 24h d’incubation seulement. De manière générale,

l’autolyse en solution tamponnée observée dans le cas des lactobacilles est supérieure à

celle observée pour les lactocoques (Chapot Chartier, 1996).

La souche Lactobacillus plantarum BH14 se montre rapidement très autolytique. Des

résultats similaires ont été rapportés par Weinrichter et al. (2001) qui, en comparant

l’activité autolytique chez trois espèces de Lactobacillus (Lb. casei, Lb. rhamnosus et Lb.

plantarum) ont observé que Lactobacillus plantarum regroupe des souches hautement

autolytiques par rapport à Lactobacillus rhamnosus dont les souches se sont révélées

faiblement autolytiques et Lactobacillus casei dont les souches sont distribuées d’une

façon identique entre les trois aptitudes à l’autolyse : hautement, faiblement ou de classe

intermédiaire.

Ce type d’expérience permet d’étudier l’influence de différents paramètres sur la capacité

des cellules à se lyser. Dans notre cas, nous avons étudié l’influence des ions contenus

dans les solutions tamponnées, ainsi que leurs pH, sur le pouvoir autolytique des deux

souches. En effet l’autolyse observée chez Lactobacillus gasseri à pH 5.0 est nettement

supérieure à celle observée pour la même souche à pH7.0 (Masuda et al., 2005).

Différentes études ont mis en évidence l’effet de la température et la concentration de

différents cations afin de rechercher les conditions optimales de lyse pour mieux contrôler

le processus en production fromagère.

Dans le but d’étudier la relation entre l’autolyse des deux souches et l’activité Leucyl-

aminopeptidase, nous avons dosé cette même activité dans les surnageants obtenus après

autolyse des cellules dans le tampon phosphate de potassium 0.1 M pH5.8 additionné de

4% de NaCl. Les résultats obtenus montent une activité autolytique négligeable pour la

souche BH14 (DO410mn = 0.1501) et pratiquement absente pour la souche CHTD27

(DO410nm=0.008), ce qui mène à suggérer que les souches étudiées ne possèdent pas de

leucyl aminopeptidases intracellulaires, sans écarter l’hypothèse de la dénaturation de ces

enzymes une fois mises dans le milieu extracellulaire riche en NaCl.

Tous les résultats obtenus concernant l’activité autolytique permettent de classer les deux

souches selon la classificationproposée par Boutrou et al. (1996) comme étant hautement

autolytiques.

Conclusion et perspectives :

La maturation fromagère inclue des changements physiques et chimiques du produit,

accompagnés par le développement des caractéristiques de flaveur. Ces changements sont

attribués à la protéolyse, la lipolyse et la fermentation du lactose en acide lactique, sous

l’action des bactéries lactiques, de la présure et des protéases et lipases du lait. Grâce à leur

équipement enzymatique complexe (protéases, peptidases....), les lactobacilles jouent un

rôle très important lors de la maturation fromagère. Certaines de ces enzymes sont

extracellulaires mais la majorité d’entre elles ne sont libérées qu’après autolyse

bactérienne. Notre choix s’est orienté vers l’étude de l’activité aminopeptidasique (PepN)

car ce type d’enzyme représente le groupe majeur des aminopeptidases et de plus PepN est

une activité qui conduit à la diminution de l’amertume dans les fromages. Les souches la

possédant sont très recherchées en technologie fromagère.

L’originalité du présent travail consiste dans l’étude de deux phénomènes technologiques :

la protéolyse et l’autolyse chez de nouvelles souches du genre Lactobacillus indigènes

uniques à l’échelle industrielle isolées de lait de chamelle du Sud algérien.

Les deux souches étudiées montrent une activité protéolytique cellulaire et production des

protéases extracellulaires avec une spécificité de dégradation des caséines du lait. La

caséinolyse est un caractère demandé dans les premières étapes de la fabrication fromagère

c'est-à-dire lors de la coagulation du lait, cependant l’aptitude aminopeptidasique est aussi

sollicitée pour l’étape de la maturation du fromage soit au sein de la même souche d’où

l’intérêt de notre étude ou en utilisant des cultures bactériennes mixtes.

Les deux souches possèdent une activité leucyl-aminopeptidase avec un potentiel plus

élevé chez la souche CHTD27 que la souche BH14.Les enzymes extraites à la glycine(4%)

et lysozyme(10mM) , purifiées par précipitation au sulfate d’ammonium (80%) et par la

résine échangeuse d’ions DEAE, sont des métalloenzymes ayant un maximum d’activité à

40°C. Les aminopeptidases produites par la souche CHTD27 présentent des

caractéristiques généralement observées pour les aminopeptidases de type (N) isolées chez

les Lactobacilles, tandisque celles extraites à partir de la souche BH14 montrent des

caractéristiques bien particulières observées que chez certaines souches de Lactobacillus.

L’électrophorèse SDS page a permis de déterminer une structure dimérique des enzymes

extraites.

L’activité autolytique spontanée sur le milieu MRS a permis de mettre en évidence la

sensibilité de la souche BH14 aux différents composés du milieu de culture par rapport à la

souche CHTD27 qui ne montre aucune influence.

Les deux souches révèlent une activité autolytique induite importante sur les deux

solutions tamponnées utilisées, cependant le tampon citrate /acide citrique 00.01M pH7.0

est défini comme un milieu favorable pour le maximum d’activité autolytique pour les

deux souches 91.7% pour la souche BH14 et 63.6% pour la souche CHTD27. Vue

l’activité autolytique élevée exprimée par les deux souches on suggère leur utilisation

comme des additifs ceci leur permet de jouer leur rôle au complet dans l’affinage du

fromage après lyse des cellules et libération du contenu enzymatique intracellulaire tout en

évitant une éventuelle acidification tardive.

L’étude entamée dans ce travail a permis d’accumuler beaucoup de connaissances

biochimiques sur l’activité protéolytique, aminopeptidasique et le pouvoir autolytique des

deux souches cependant, il serait intéressant de il serait intéressant de séquencer les

peptides produits après caséinolyse d’autant que certaines espèces du genre Lactobacillus

sont à l’origine des flaveurs positives ( Lb plantarum, Lb casei ) tandisque d’autres sont

responsables du développement de l’amertume( Lb brevis).(Khalid et

Marth,1990,Tobiassen et al.,1997).

Pour mieux comprendre le caractère protéolytique, il faut mettre au point une méthode

permettant l’obtention des mutants protéolytiques déficients à partir des deux souches

étudiées.

Certaines activités peptidasiques conduisent à l’accumulation de peptides de petite taille,

ayant une hydrophobicité élevée dont la partie C terminale est constituée soit de leucine, de

phénylalanine ou de tyrosine, dans le but de caractériser celles des deux souches, il est

impératif de chercher d’autres activités aminopeptidasiques en utilisant d’autres substrats

chromogènes (aa-PNA) tout en étudiant ces activités sur les produits d’hydrolyse des

caséines par les mêmes ou d’autres souches.

D’étudier les différentes enzymes libérées après autolyse des deux souches étudiées.

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