T.C.Sağlık Bakanlığı

Kartal Dr.Lütfi Kırdar Eğitim ve Araştırma Hastanesi

İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Kliniği

Şef.Uzm.Dr. Serdar ÖZER

KARBAPENEMLERE DİRENÇLİ GRAM-NEGATİF BASİL İZOLATLARINDA

İMİPENEM-EDTA / MEROPENEM-EDTA DİSK YÖNTEMİ VE MODİFİYE HODGE TESTİ İLE

METALLO-BETA-LAKTAMAZ (MBL) VARLIĞININ ARAŞTIRILMASI

Uzmanlık Tezi

Dr. Hatice SARI

Tez Danışmanı: Uzm.Dr. Serap GENÇER

İstanbul-2005

Uzmanlık eğitim süreci içerisinde bilgi ve deneyimlerinden yararlandığım,

her konuda desteğini gördüğüm, hoşgörü ortamı içerisinde geniş tecrübesiyle

bizlere yön veren, vizyonumuza önderlik eden, ufkumuzu genişleten, kendine

güvenen bireyler olarak yetişmemizde büyük rol oynayan çok saygıdeğer hocam

sayın Dr. Serdar Özer'e en içten saygı ve teşekkürlerimi sunarım.

Rotasyonlarım sırasında bilgi ve deneyimlerinden yararlandığım 2. Dahiliye

şefi Uzm Dr. Rahmi Irmak ve 1.Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Kliniği Şefi Sayın

Doç Dr. Ayça Vitrinel'e çok teşekkür ederim.

Bu tezin başlangıcından en son cümlesine kadar ki her aşamasında çok

büyük emeği, bilgisi, tecrübesi, fedakarlığı, özverisi olan; her işinde olduğu gibi

gerek bu tez gerekse asistanlığım döneminde birlikte çalıştığım zamanlardaki her

türlü işde en ince ayrıntılarla defalarca ilgilenen; uykusundan, çok değerli

zamanından, yemek saatlerinden ödün veren; gerek laboratuvar gerekse yazım

aşamasında her bir detayla tek tek ilgilenen; sevgisini, zerafetini, hoşgörüsünü,

idealistliğini, ufkunun genişliğini, çalışkanlığını, saygınlığını çok takdir ettiğim; bu

süreç zarfında kendisinden çok şey öğrendiğim tez danışmanım çok değerli Dr.

Serap Gençer'e canı gönülden teşekkür ederim.

Eğitimim süresince hoşgörü, tecrübesi ve sevgisiyle Klinik şef muavinimiz

sayın Dr. İsmihan Kuzu'ya, gerek asistanlık gerekse tez aşamasındaki

yardımlarından dolayı idealist, çalışkan ve azimli olan sevgili arkadaşım Dr.Ayşe

Batırel'e, birlikte çalışmaktan mutlu olduğum ve gurur duyduğum Dr. Öznur Ak'a,

bilgisini, enerjisini ve yardımseverliğini hiç esirgemeyen ağabeyim Dr. Fatih

Bektaşoğlu'na, yardımlarından, dostluğundan, samimiyetinden, en zor anlarımda

dahi yanımda olmasından dolayı değerli arkadaşım Dr. Gül Karagöz'e, içten

dostluğu, yardımları için Dr. İlker İnanç Balkan'a, desteklerinden dolayı Dr. Nur

Arditi Benzonana, Dr. Nermin Etiz, Dr. Neşe Yıldırım’a, kalbinin güzelliği yüzüne

yansıyan can dostum Dr.Suzan Şahin’e, açık sözlü Dr. Mustafa Doğan’a, Dr.

Serap Kaya ve diğer asistan arkadaşlarıma, servisimizdeki hemşirelere,

laboratuvardaki teknisyen arkadaşlardan özellikle yardımını, emeğini ve

2

desteğini esirgemeyen Necla Genç'e ve yardımlarından dolayı Orhan Yüksel ve

diğer teknisyen arkadaşlara tüm kalbimle teşekkür ederim.

Hayatımın her döneminde desteklerini, sevgilerini, dualarını esirgemeyen;

benimle ağlayıp benimle gülen; başarı ya da başarısızlığımda hep yanımda olan;

daima karşılıksız sevip ve de çok sevilen, kendileriyle gurur ve onur duyduğum

çok değerli anne ve babam Fatma-Salih Sarı'ya ve hayatıma renk katan

kardeşlerime, özelikle de biricik Yusuf'uma en içten duygularımla teşekkür

ederim .

3

İÇİNDEKİLER

KISALTMALAR……………………………………………………….. 3GİRİŞ……………………………………………………………………. 4GENEL BİLGİLER…………………………………………………….. 6MATERYAL VE METOD……………………………………………... 31BULGULAR…………………………………………………………….. 34TARTIŞMA……………………………………………………………... 37SONUÇ…………………………………………………………………... 43ÖZET…………………………………………………………………….. 44KAYNAKLAR………………………………………………………….. 45

4

KISALTMALAR

CLSI : Clinical Laboratory Standards Institute

EDTA: Etilendiamintetraasetik asit

ESBL: Extented-spectrum beta-lactamase (genişlemiş spektrumlu beta laktamaz)

GN: Gram-negatif

MBL: Metallo-beta-laktamaz

MİK: Minimum İnhibitör Konsantrasyon

MPA: 2-merkaptopropionik asit

NCCLS: National Committee for Clinical Laboratory Standards

NFGN: Non fermentatif gram negatif

OMP: Outer membrane protein (dış membran proteini)

SMA: Sodyum merkaptoasetik asit

5

GİRİŞ

Beta-laktam antibiyotiklere karşı direnç gelişmesinden sorumlu mekanizmalar

içinde en önemlisi bakterilerin ürettiği beta-laktamaz enzimleridir. Son 25 yılda

genişlemiş spektrumlu beta-laktamazlar (ESBL) ve plazmidlerle taşınan AmpC beta-

laktamazlar ortaya çıkmış ve sayıları artmıştır. Karbapenemler, bu beta-laktamazların

hidrolizine karşı stabil olmaları sebebiyle dirençli gram-negatif (GN) bakterilerin yol

açtığı infeksiyonların tedavisinde iyi bir seçenek olmuşdur. Ancak son yıllarda

karbapenemlere karşı da, özellikle nonfermentetif gram-negatif (NFGN) basiller

arasında, artan bir direnç sorunu ortaya çıkmaya başlamıştır. Pseudomonas

aeruginosa’da meropenem duyarlılığını azaltan, imipenem direncine yol açan OprD

porin kaybı karbapenem direncinden sorumlu olabilmektedir. Diğer yandan MexAB-

OprM pompa eflüks sistemi, imipenem hariç meropenem dahil bir çok antibiyotiğin

etkinliğini azaltmaktadır (1). Eflüks sistemini düzenleyen genlerdeki mutasyonlar,

kromozomal AmpC beta-laktamazların üretimi ile birlikte permeabiliteyi de azaltarak

aditif etki gösterir ve böylece birden fazla mekanizmayla dirence sebep olur (2).

GN basillerin karbapenem direncinden esas olarak azalmış dış membran

geçirgenliği veya effluks pompa sistemi sorumlu tutulmakla beraber beta-laktamazlar

da dirençde rol alabilmektedir. Karbapenemazlar; sınıf A penisilinazlar, sınıf D

oksasilinazlar ve sınıf B metallo-beta-laktamazlardan oluşurlar (3).

İlk olarak 1991’de Japonya’da MBL (IMP-1) üreten P.aeruginosa’nın

bildirilmesinden sonra Japonya başta olmak üzere çeşitli Asya ve Avrupa

ülkelerinden GN basillerde, özellikle Pseudomonas aeruginosa ve Acinetobacter

baumannii suşlarında, yeni metallo-beta-laktamaz (MBL)’lar (IMP, VIM, GIM,

SPM) bildirilmiştir ve son 3 yılda bunların sayıları artarak dünya çapında yayılma

göstermektedir (3,4). MBL’lardaki bu hızlı artış hem endişe vermekte hem de bu

enzimlerin varlığını ortaya koyacak testlerin geliştirilmesi konusunda ilgi

uyandırmaktadır. MBL aktivitesinin etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve 2-

merkaptopropionik asit (MPA) gibi metal şelatörler ile inhibe olma özelliklerinden

yararlanılarak bu enzimleri erken tanıyabilecek tarama amaçlı basit fenotipik

6

yöntemler geliştirilmiştir. Bunlar imipenemli veya seftazidimli EDTA veya MPA

disklerini kullanan çift-disk sinerji testi, Hodge testi, saftazidim veya imipenemli

EDTA kombine disk testi, MBL Etest ve imipenemli EDTA kullanan mikrodilüsyon

testidir.

Son zamanlarda giderek arttığını gözlemlediğimiz imipenem ve meropenem

dirençli klinik izolatlarımızda MBL üretiminin prevalansını araştırmak ve bu

enzimlerin varlığını ortaya koyabilecek iki fenotipik tarama yöntemini test etmek ve

karşılaştırmak amacıyla bu çalışma planlanmıştır.

7

GENEL BİLGİLER

BETA-LAKTAM ANTİBİYOTİKLER

Beta-laktam antibiyotikler günümüzde; gerek hastane içinde, gerekse hastane

dışında en sık kullanılan antibiyotik türevlerinin başında gelmektedir. Beta-laktam

antibiyotikler başlıca 5 grupta toplanırlar:

1)Penisilinler,

2)Sefalosporinler,

3)Monobaktamlar,

4)Karbapenemler,

5)Beta-laktamaz inhibitörleri (klavulanat, sulbaktam, tazobaktam).

Beta-laktam antibiyotikler, etkilerini peptidoglikan sentezinde görevli olan

transpeptidaz ve karboksipeptidazları inhibe edip, hücre duvar sentezini durdurarak

gösterirler (5). Her grup beta-laktam antibiyotiğin özelliği bu halkaya bağlanan başka

halkalar ve yan zincirlerle belirlenir. Tüm beta-laktam antibiyotikler bakterilerin

sitoplazmik membranları üzerinde bulunan ve bakteri hücre duvarında peptidoglikan

sentezinden sorumlu olan penisilin bağlayan protein (PBP) adı verilen hedef

proteinlere bağlanarak etkilerini göstermektedirler. Beta-laktam antibiyotik

tarafından PBP’leri inhibe edilen bakteride peptidoglikan sentezlenemeyeceğinden

hücre duvar yapısı bozulmaktadır. Bu durum bakterinin ozmotik direnç kaybına ve

ölümüne neden olmaktadır. Beta-laktam antibiyotiklerin hedeflerine bağlanmaları ve

etkinlik göstermeleri için gram-negatif (GN) bakterilerde porin (Outer Memran

Protein, OMP) adı verilen içi su dolu protein kanalcıklarından geçmeleri, sitoplazmik

membranla dış membran arasındaki periplazmik boşlukta yer alan beta-

laktamazlardan etkilenmemeleri gerekmektedir (6). Gram-pozitif bakterilerde dış

membran bulunmayıp, sitoplazmik membranın üzerinde kalın bir peptidoglikan

tabakası uzanmaktadır. Beta-laktamazlar bu tabakaya yapışık veya bakteri hücresi

etrafında serbest olarak yer almaktadır (7).

8

1-) PENİSİLİNLER: Penisilinlerin temel yapısı, bir tiazolidin halkası, bir beta-

laktam halkası ve bir yan zincirden oluşan çekirdekten ibarettir. İn vitro etki

spektrumlarına göre sınıflandırılırlar, bu sınıfların etkinlikleri kısmen de olsa

çakışma gösterir.

Doğal penisilinler: penisilin G, prokain penisilin G, kristalize penisilin G, benzatin

penisilin G, penisilin V (Fenoksi metil penisilin)

Penisilinaza dayanıklı penisilinler: metisilin, nafsilin, izaksazolil penisilin,

kloksasilin, dikloksasilin, flukloksasilin, oksasilin

Aminopenisilinler: ampisilin, amoksisilin, bakampisilin, siklasilin, episilin,

hetasilin, pivampisilin

Pseudomonaslara etkili penisilinler: karbenisilin, indanil karbenisilin

(korindasilin), tikarsilin

Geniş spektrumlu pseudomonaslara etkili penisilinlere: azlosilin, mezlosilin,

piperasilin

Amdinopenisilinler: amdinosilin, pivamdinosilin

Beta-laktam inhibitörlü kombine penisilinler: ampisilin/sulbaktam,

amoksisilin/klavulonat, tikarsilin/klavulonat, piperasilin/klavulonat

Doğal penisilinler ve penisilinaza dayanıklı penisilinler gram-pozitif bakterilere

etkilidirler. Aminopenisilinlerin etki spektrumu Penisilin G’ye benzer ve kendi

üyeleri arasında da etkinlik açısından farklılık yoktur. Her ne kadar insan florasında

yer alan çoğu E.coli, aminopenisilinlere duyarlı ise de hastane kökenlerinde

plazmidlerle yayılan direnç yaygındır. Shigella sonnei, Salmonella typhi dahil çoğu

Salmonellalar beta-laktamaza bağlı direnç gösterirler. Ayrıca Klebsiella, Serratia,

Acinetobacter, Proteus, Pseudomonas türleri ve Bacteriodes fragilis’lerin çoğu

penisilinlerin bu sınıfına dirençlidir. Çünkü tüm aminopenisilinler GN ve gram-

pozitif bakterilerin beta-laktamaz enzimlerine duyarlıdırlar. Bugün için GN basil

infeksiyonlarında aminopenisilinler ampirik olarak seçilmemelidir.

Pseudomonaslara etkili penisilinler, P.aeruginosa’yı da içine alan pek çok

aerob GN çomağa etkili olan ilaçlardır. Piperasilin ve azlosilin şu anda

Pseudomonaslara en etkili penisilinlerdir. Hepsinin gram-pozitif bakterilere

etkinlikleri, penisilin G ve aminopenisilinlerden daha azdır. Bu grup penisilin

türevleri beta-laktamazlara dirençli değillerdir.

9

Beta-laktamaz inhibitörlü kombine penisilinler, son yıllarda klavulanik asit,

sulbaktam ve tazobaktam gibi beta-laktamaz inhibitörleri ile ampisilin, amoksisilin,

tikarsilin, piperasilin gibi penisilin türevlerinin aynı preparat içinde birleştirilmesi ile

beta-laktamaz salgılayan bakterileri de etki spektrumu içine alan ilaçlar olarak

geliştirilmiştir. Ancak bu kombine preparatlardaki beta-laktamaz inhibitörleri, tüm

beta-laktamazları inhibe edemezler. Bu ilaçlar genellikle Staphylococcus,

Haemophilus, Bacteriodes, Klebsiella türleri ve E.coli’nin basit beta-laktamazlarını

inhibe ederler (8) .

2 -) SEFALOSPORİNLER: Hem yapı hem etkinlik yönünden penisilinlere

büyük yakınlığı olan antibiyotiklerdir. Beta-laktam halkası yanında penisilindeki 5

üyeli tiazolidin halkası yerine sefalosporinlerde 6 üyeli bir dihidrotiazin halkası

bulunur. Dihidrotiazin halkasında fazladan bulunan karbon atomu 3. pozisyonda da

yeni yan dalların ilavesi ile daha değişik ve çok sayıda sefalosporinler elde

edilmesine olanak sağlamıştır. İkinci kuşak sefalosporinler arasında sayılan

sefoksitin, üçüncü kuşak sefalosporinlerden moksolaktam bir sefamisindir ve okso-

beta-laktam antibiyotik olarak da adlandırılır. Farmokolojik özellikleri, bakterilere

karşı etkileri, kimyasal yapıları aynı olduğu için sefalosporinler arasında ele alınırlar

(9). Kronolojik esasa dayanan ve bakterilere karşı etki spektrumundaki gelişmeyi de

yansıtması yönünden pratik değeri olan bir sınıflandırma şu şekildedir:

1. kuşak sefalosporinler: sefalotin, sefazolin, sefaloridin, sefaleksin, sefapirin,

sefradin, sefadroksil, sefasetril, seftezol.

2. kuşak sefalosporinler: sefuroksim, sefoksitin, sefamandol, sefonisid, sefonarid,

sefaklor, sefotiam, sefmetazol, sefotetan.

3. kuşak sefalosporinler: sefotaksim, seftizoksim, sefoperazon, seftriakson,

moksolaktam, seftazidim, sefsulodin, sefmenoksim, sefpiramid

4. kuşak sefalosporinler: sefepim, sefpirom

Parenteral uygulanan 1. kuşak sefalosporinlerin etkinlikleri birbirine benzerdir.

Yalnızca sefazolinin stafilokoklara etkinliği biraz daha az, GN etkinliği diğer 1.

kuşak üyelerine göre biraz daha fazladır. Birinci kuşak sefalosporinlerden herhangi

birisi in vitro antibiyotik duyarlılık testinde diğerlerinin yerine kullanılabilir. Birinci

kuşak sefalosporinlerin esas olarak etkili olduğu bakteriler; metisiline duyarlı

stafilokoklar ve pnömokoklardır. M.catarrhalis, E.coli, P.mirabilis ve

10

K.pneumonia’ya etkinlikleri değişiktir. Bu kuşak sefalosporinlerin H.influenzae,

metisiline dirençli S.aureus ve enterokoklara etkinlikleri zayıftır. Enterobacteriaceae

üyelerine etkinlikleri ise çok azdır.

İkinci kuşak sefalosporinler, 1. kuşağa göre stafilokok ve streptokoklara daha

az, GN çomaklara ve anaeroblara daha fazla etkilidir. GN basillere karşı etkideki

genişleme bazı Enterobacter türlerini, indol (+) Proteus türlerini ve H.influenzae’yı

da kapsamaktadır, anaeroblara etkisi diğer kuşaklara göre daha fazladır. Özellikle

sefuroksim, H.influenzae, M.catarrhalis ve gonokoklara iyi etkilidir.

Sefoksitin, GN basillerin ürettiği bazı beta-laktamazlara dirençlidir ve bazı

Enterobacteriaceae’lar tarafından üretilen beta-laktamazların oldukça etkili

indükleyicisidir. E.coli, Klebsiella ve indol negatif Proteus spp.’ye karşı 1. kuşak

sefalosporinlerden daha etkilidir. Ancak H.influenzae’ya karşı 2. kuşak

sefalosporinlerden daha az etkindir. Sefoksitin anaeroblara özellikle B.fragilis’e

diğerlerinden daha fazla etkilidir. Ayrıca N.gonorrhoeae’ya beta-laktamaz üreten

kökenler de dahil iyi bir etkiye sahiptir. Parenteral verildikten sonra hızlıca idrarla

dışarı atılır.

Üçüncü kuşak sefalosporinler GN basillere karşı yaygın olarak kullanılan

sefalosporinlerdir. E.coli, Klebsiella spp., Proteus mirabilis, indol (+) Proteus,

Providencia ve Serratia’ya karşı etkilidirler. İkinci kuşaktakilerden klinik yönden en

önemli farkları, P.aeruginosa kökenlerine de etkili olmaları ve diğer GN basillere ve

Neisseria türlerine karşı daha güçlü etkinlik göstermeleridir. Gram-pozitif koklara

özellikle S.aureus’a karşı etkileri 1. kuşağa oranla çok zayıftır. Anaeroblara karşı

etkileri değişik derecededir. Beyin omurilik sıvısına geçişleri 1. kuşağa göre iyidir

(10).

3-) MONOBAKTAMLAR: Aztreonam ilk sentetik monobaktam antibiyotiktir.

Beta-laktam halkasına birleşik bir başka halka içermemelerinden dolayı penisilin ve

sefalosporinlerden ayrılırlar. Aztreonam, GN bakterilerde PBP3’e bağlanarak duvar

sentezini bozar. Gram-pozitif bakterilerin PBP’sine bağlanamaz. Anaerob

bakterilerin PBP’sine de düşük affinite gösterir. Bu yüzden etki alanı GN aerob

bakteriler ile sınırlıdır. Aztreonam, parenteral uygulamadan sonra dokulara ve vücut

sıvılarına çok iyi dağılır. K.pneumoniae, H.influenzae, M.catarrhalis gibi sık

rastlanan GN patojenlere etkilidir.

11

4-) KARBAPENEMLER: Sefalosporinlerdeki bir çift bağ içeren 5 üyeli

halka yapısında bir metilenin yerine bir sülfürün geçmesiyle diğer beta-laktam

ajanlardan ayrılır. Karbapenemler Streptomyces cattleya tarafından üretilen bir

bileşik olan tienamisin türevleridir. Beta-laktamların en geniş spektrumlusudur.

Mikobakteriler, hücre duvarından yoksun organizmalar ve nadir nonfermentatifler ve

Aeromonas dışında hemen her bakteriyel patojene etkilidir. Genişlemiş-spektrumlu-

beta-laktamaz (ESBL) ve AmpC enzimini fazla miktarda üreten GN bakterilere karşı

etkinliklerini korurlar (11). Karbapenemler çok geniş spektrumlu antibakteriyel

aktiviteye ve klinikte gözlenen bir çok beta-laktamaza karşı stabiliteye sahiptir.

Ancak sınıf B metallo-beta-laktamazlar dahil, karbapenemazlar bu antibiyotikleri

hidroliz edebilmektedir. Çok geniş etki spektrumu, iyi klinik etkinliği, uygun

güvenlik profili ile karbapenemler, ağır infeksiyonların başlangıç tedavisinde ilk

tercih edilecek olan antibiyotikler içinde oldukça değerlidir (12).

A-) İMİPENEM: Bilinen en geniş spektrumlu antibiyotik olan imipenemin

gram-pozitif, GN, aerob ve anaerob mikroorganizmaları içine alan çok geniş bir

etkinlik kapsamı vardır. Bu mikroorganizmaların çoğu için MİK 4mg/L’nin

altındadır. Enterobacteriaceae ve NFGN bakteriler için sınır MİK değerleri tablo 1’de

görülmektedir. Farklı antibiyotik kombinasyonlarıyla kıyaslandığında, çeşitli ciddi

infeksiyonların tedavisinde son derece etkin bir monoterapötik ajandır ve in vitro

olarak imipenem, klinik olarak önem taşıyan bakterilerin çoğuna etkilidir. Bu nedenle

kritik hastalığı olan kişilerde özellikle dirençli GN etkenler veya polimikrobiyal

infeksiyon düşünüldüğünde, kültür ve antibiyogram sonuçlarını beklemeden ampirik

olarak başlanabilir. Ciddi infeksiyonu olan immunkompromize hastalarda da güvenle

seçilebilmesi avantaj oluşturmaktadır (13).

Tablo 1. İmipenem ve meropenemin Enterobacteriaceae ve

nonfermentetif GN bakteriler için MİK değerleri.

MIK(µg/ml) Sonuç≤4 Duyarlı8 Orta duyarlı

≥16 Dirençli

12

Yapı: Bir beta-laktam halkası içermekle birlikte diğer beta-laktam

antibiyotiklerden farlı olarak sis konfigürasyonundaki acil amino yan zincirinin

yerine trans konfigürasyonunda hidroksietil yan zinciri içerir. Trans konformasyonu

imipenemin beta-laktamaz dayanıklığını sağlar. Penisilin ve sefalosporinlerden farklı

olarak α-halkasında sülfür atomunda metilen (-CH2-) yapısı içerir. Bu yapı

karbapenemlerin bakteri hücresindeki hedef proteinlere bağlanmasını arttırır. Bu da

antibiyotiğin etki spektrumunu genişletir ve antibakteriyel gücünü arttırır. Molekül

ağırlığının düşük olması bakterinin hücre membranından girişini kolaylaştırır. Penem

halkasında bulunan alkil tiyo yan zinciri ise Pseudomonas aeriginosa’ya etkinliği

sağlamaktadır (14).

İmipenem bu olağan üstü geniş etki spektrumuna ve beta-laktamaz direncine

karşın, böbrekte ileri derecede enzimatik yıkıma uğrar. Metaboliti nefrotoksik bir

ajandır. Bu nedenle tek başına kullanılamaz. Bir dehidropeptidaz-1 (DHP-1)

inhibitörü olan silastatin ile 1/1 oranında birleştirilerek pazarlanmaktadır. Silastatin

sodyum, DHP-1’in kompetitif, reversibl ve özgül inhibitörüdür. Silastatinin

antibakteriyel etkinliği ya da beta-laktamazlar üzerine etkisi yoktur. İmipenemin

etkisini antagonize etmez (15,16).

Etki mekanizması: Diğer beta-laktam antibiyotikler gibi bakteri hücre duvar

sentezini inhibe ederek etki eder, bakterisidaldir. İmipenem gram-pozitif ve GN

bakterilerin yüksek molekül ağırlıklı PBP’lerine yüksek bir afinite ile bağlanır.

Bağlanma ilk önce PBP2’ye ve arkasından da PBP1a’ya olur. PBP2’ye bağlanması

GN basillerin sferoblastlara dönüşmesine neden olur. İlave olarak PBP1’e

bağlanması gram-pozitif ve GN bakterilerde hücrelerin daha hızlı lizisine yol açar.

E.Coli’de PBP1a, 1b, 2, 4, 5 ve 6’ya; P.aeruginosa’da PBP1a, 1b, 2, 4, 5’e

bağlanarak hücre duvar sentezini inhibe eder (17,18). GN bakterilerde dış membrana

penetrasyonu da daha fazladır (19). Düşük molekül ağırlığı ve zwitteryonik (nötral

yük) nedeniyle bakterinin hücre duvarına, penisilin ve sefalosporinlerden daha hızlı

penetre olur (20).

Farmakokinetik ve farmakodinamik: İmipenemin plazma yarılanma ömrü

yaklaşık bir saattir. Serum proteinlerine bağlanma oranı %10-20 arasında olup,

imipenem %20, silastatin ise %40 oranında bağlanır. Yaklaşık 10 saat içinde verilen

13

dozun %70’i idrarda saptanır. Total dozun % 48,6’sı idrarla değişmeden atılmaktadır

(21).

Yan etkiler: En sık enjeksiyon yerinde ağrı, flebit ve tromboflebite (%1,7)

rastlanır. Gastrointestinal sistemle ilişkili olarak da bulantı (%1,4), kusma (%0,9),

oral mukozada değişiklikler (%0,3), ishal (%0,9) ve psödomembranöz enterokolit

(%0,1) görülmektedir. Ciddi yan etkiler nadirdir. Diğer beta-laktamlara alerjisi olan

hastalar imipeneme de alerjik olabilir. İmipenem kullanımında çeşitli alerjik

reaksiyonlar (ateş, kaşıntı, deri döküntüsü, solunum sıkıntısı) görülebilmektedir.

Santral sisnir sistemi toksisitesi (konfüzyon, huzursuzluk, konvülziyon, tremor)

görülebilir. İnfüzyon hızına bağlı olarak bulantı, kusma, terleme ve halsizlik olabilir.

Konvülziyon için esas risk faktörleri yüksek dozda kullanım ve hastanın renal

yetmezliğinin olmasıdır. Renal hastalığı olan veya santral sinir sistemi patolojisi

olanlarda konvülziyona neden olması, bulantı ve kusma yan etkileri imipenem

kullanımını kısıtlamaktadır. Yavaş infüzyonla kullanılması gerekmektedir (20).

B-) MEROPENEM: İmipenemin aksine insan böbrek dehidropeptidaz I

(DHP-1) enzimine karşı çok yüksek stabilite gösteren bir karbapenemdir. Klinik

olarak önemli olan hemen tüm aerobik ve anaerobik bakterilere karşı son derece

etkilidir. PBP2, hem imipenemin hem de meropenemin başlıca hedefidir. Ancak

meropenem, P.aeruginosa ve E.coli’nin PBP2 ve 3’üne daha büyük bir afinite

gösterir. Meropenem, stafilokoklara ait enzimler ve GN bakterilerdeki

karbapenemazlar hariç diğer tüm beta-laktamazların hidrolizine karşı dayanıklıdır.

Karbapenemlerden imipenem, gram-pozitif organizmalara karşı daha etkili

gözükürken meropenem, GN’lere özellikle de P.aeruginosa’ya daha etkilidir (22,23).

Meropenem genel olarak 3.kuşak sefalosporinlerden daha güçlü bir indükleyici

olmasına karşın, Enterobacter ve P.aeruginosa izolatlarındaki grup 1 beta-

laktamazlar üzerindeki indükleyici etkisi imipeneme göre daha zayıftır (24,25).

Meropenemin P.aeruginosa’daki PBP2 ve PBP3’e karşı yüksek afinitesi olmasına

rağmen, imipenemin afinitesi sadece PBP2’ye karşıdır. Bu durumun, özellikle

meropenemin P.aeruginosa üzerinde daha güçlü bir etki gösterebilmesinde katkısının

olabileceği ifade edilmektedir (23,26). Meropenem için asıl hedef P.aeruginosa’daki

PBP3’dür (22,23,27).

14

BETA-LAKTAM ANTİBİYOTİKLERE DİRENÇ MEKANİZMALARI

Bakterilerde antibiyotiklere karşı direnç gelişiminde genel olarak 3 genetik

mekanizma vardır.

1-) Kromozomal genlerde mutasyon oluşması: DNA replikasyonu sırasında

her gende 10-9 ile 10-10 sıklıkta mutasyon oluşabilmektedir. Çoğunlukla

antibiyotiklerin bakteri hücresindeki hedefleri, hücrenin üremesi ve devamı için

yaşamsal önemi olan proteinlerdir. Direnç mutasyonları, antibiyotiğin hedefinden

başka, bakterideki düzenleyici genlerde de oluşabilmektedir. Enterobacter spp.’de

kromozomal Amp C beta-laktamaz üretiminin artışı (depresyon), P.aeruginosa’da

OmpD porininin ifadesinin azalması ile imipeneme direnç oluşması ve atım

pompalarının etkisi bu tip dirence örneklerdir. Mutasyon ile oluşan direncin kalıcı

olması, bakterinin buna ne kadar dayanabildiğine bağlıdır. Örneğin, OmpD porininin

ifadesinin azalması çabuk gelişebilmesine karşı yaygın bir direnç mekanizması

değildir. Büyük olasılıkla bu porin, bakteri için yaşamsal olduğundan imipenem

olmadığında bakteri bu porinleri tekrar yapmaktadır. Direnç kazanmanın bakteriye

zararlı olan etkileri “fitness cost”(dayanıklılığın bedeli) olarak tanımlanmaktadır.

Buna karşın, mutasyonların bakterideki zararlı etkileri bazen bakteri tarafından başka

yollar ile telafi edilebilmektedir. Eğer mutasyon ile gelişen direnç bakteriye zarar

vermeden yüksek sıklıkta ortaya çıkıyorsa, o antibiyotik kullanıldığında kısa bir süre

içinde direnç gözlenecektir.

2-) Direnç genlerinin dışarıdan alınması: Direnç genlerinin duyarlı

bakterilere geçişinde en sık gözlenen mekanizma konjugatif plazmidlerin geçişidir.

Bu kromozom dışı replikatif DNA şekilleri, birçok geni kodlamaktadır. Bazı

plazmidlerin konak açısından çok özgül olmasına karşın bazıları birçok farklı tür

bakteriye girip replike olabilmektedir. Plazmidler arasında direnç genleri çoğunlukla

transpozonlar tarafından taşınmaktadır. Bunlar direnç genlerini, bir plazmidden

plazmide veya kromozoma ya da kromozomdan plazmide taşıyabilmektedir. Bazı

transpozonlar bakteriden bakteriye de geçebilmektedir. Ancak bunlar çoğunlukla

gram-pozitif bakterilerde gözlenmektedir. İntegronlar direnç determinantlarının

alınmasını ve ifadesini kolaylaştıran doğal rekombinasyon sistemleridir. GN

15

bakterilerde, çoğunlukla plazmid ve transpozonlarda çok yaygın olarak bulunmakta

ve özellikle sülfonamid ve streptomisine direncin yayılmasında önemli rol

oynamaktadırlar. Çeşitli beta-laktamazlar ve aminoglikozid değiştirici enzimlere ait

genler integronlarda bulunmaktadır. İntegronların direnç genlerinin yayılımı ve

ifadesi için önemli bir kapasiteleri olmasına karşın GN bakterilerde daha yaygın olan

genlerin integronlardan çok transpozonlarda taşındığı gözlenmektedir.

3-) Dışarıdan alınan genlerde mutasyon oluşması: Bu mekanizmaya en iyi

örnek, GN bakterilerde son yıllarda sayıları artmış olan genişlemiş spektrumlu beta-

laktamaz (ESBL) enzimleridir. ESBL’lerin plazmid kontrolünde sentezlenen TEM-1

beta-laktamazından 1-2 nokta mutasyonu sonucu türediği saptanmıştır (28).

Beta-laktam antibiyotiklerin etki gösterebilmeleri için dış zardan ve

periplazmik aralıktan geçerek PBP’lere etkin konsantrasyonda ulaşması ve

bağlanması gereklidir. Bakteriler, bu basamakların her birinde bir engel oluşturarak

direnç geliştirebilirler. Bakterilerde beta-laktam antibiyotiklere karşı oluşan direnç 3

yolla gelişebilmektedir.

1)İlacın hedef bölgesi olan Penisilin bağlayan proteinler (PBP)’de meydana

gelen değişiklikler

2)Dış membran geçirgenliğinin bozulması

3)Beta-laktamaz enzimleri ile ilacın inaktive edilmesi

1) İlacın hedef bölgesinde gelişen değişiklikler: Beta-laktam antibiyotiklerin

hedef bölgesi olan PBP, membrana bağlı proteinlerdir. PBP’lerdeki değişiklikler;

kromozomal mutasyonlar sonucu PBP’nin beta-laktam antibiyotiğe afinitesinin

azalması, PBP sayısında azalma olması veya beta-laktam antibiyotiklere düşük

afinite gösteren yeni PBP’lerin sentezlenmesi sonucu oluşabilmektedir (29,30).

N.gonorrhoeae, N.meningitidis, H.influenzae ve S.pneumoniae’da gözlenen penisilin

direnci ve metisiline dirençli S.aureus’da gözlenen direnç PBP’lerdeki değişiklikler

ile oluşmaktadır (31). Bu tür direnç, GN bakterilerde nadirdir.

2) Dış membran geçirgenliğinin bozulması: Hücre zarının geçirgenliğinin

azalması GN bakteriler için özellikle önem taşır. Bu bakterilerin membranları gram-

pozitif bakterilerin membranlarına nazaran daha komplike bir yapıya sahiptir. GN

bakterilerde beta-laktam antibiyotikler, dış membrandaki ‘outer mebrane

protein’(OMP) adı verilen porlar yolu ile hücreye girmektedir. Beta-laktam

16

antibiyotikler dış membrandan porin F ve porin C adı verilen başlıca 2 kanal aracılığı

ile geçerler. İmipenem dış membrandan ayrıca D2 proteini adı verilen özel bir porini

kullanarak da geçer. Dolayısıyla bir GN bakteri porin F ve porin C proteinlerini

mutasyona uğratarak tüm beta-laktamlara direnç geliştirebilirken, imipeneme duyarlı

kalır. Öte yandan, özellikle P.aeruginosa ve Enterobacter suşlarında dış

membrandan D2 proteinin kaybolması bakteriyi imipeneme dirençli hale getirebilir.

Ancak bu tipte direnç geliştiren bakteri, diğer beta-laktam antibiyotiklere karşı çapraz

direnç geliştiremez (32). Porinlerin özellikleri ve sayıları ile antibiyotiğin özellikleri

(yük, çözünürlük, büyüklük) hücre içine giriş hızını belirlemektedir (31). Çoğu

sefalosporin ve geniş spektrumlu penisilinler moleküler yapılarındaki uzun yan

zincirler nedeniyle porinlerden nispeten yavaş geçerler. İmipenem, diğer beta-laktam

antibiyotiklere kıyasla daha düşük moleküler ağırlıkta olduğundan porinlerden daha

hızlı bir geçiş göstermektedir. Antibiyotiğin bakteriyel etkinliği açısından

periplazmik boşlukta kısa sürede yüksek konsantrasyonlara ulaşabilme özellikleri

önem taşımaktadır (33). Geçirgenliğin azalmasına bağlı olan direnç özellikle

enzimatik direnç ile birlikte ise yüksek düzeyde dirence yol açmaktadır. Bu direnç

P.aeruginosa ve zor üreyen GN basillerde daha fazla klinik probleme yol açar.

3) Beta-laktamaz enzimleri ile ilacın inaktive edilmesi: Beta-laktam

antibiyotiklere karşı en çok gözlenen direnç, bakterilerin bu antibiyotikleri inaktive

eden beta-laktamaz enzimlerini sentezlemesi ile oluşmaktadır. Beta-laktamaz genleri

bakteri kromozomunda veya plazmid, transpozon, integron gibi hareketli genetik

elemanlarda bulunabilir (34). Gram-pozitif türlerde doğrudan dış ortama salınırken

GN bakterilerde beta-laktamazlar, dış membran ile sitoplazmik memran arasındaki

periplazmik boşlukta bulunmaktadır. Bu nedenle GN bakteri türlerinde beta-

laktamazlara bağlı dirençte sıklıkla ilaç geçirgenliği ile ilgili mekanizmalar da rol

oynamaktadır (35). Beta-laktamazlar, beta-laktam halkasındaki siklik amid bağlarını

parçalayarak beta-laktam ajanların etkinliğini ortadan kaldıran enzimlerdir. Beta-

laktamazlar yapısal olarak PBP’lerden evrimleştiklerini düşündürecek kadar,

PBP’lere benzerler. Beta-laktamazlar; gram-pozitif, GN ve anaerob bakteriler

tarafından sentezlenir. Gram-pozitif bakteriler arasında beta laktamaz üreten en

önemli patojen stafilokoklardır. Anaeroblardan Clostridium ve Fusobacterium’ların

beta-laktamazları esas olarak penisilini parçalarken Bacteriodes’ler tarafından

17

üretilen beta-laktamazlar ise sıklıkla sefalosporinaz etkinliği göstermektedir. GN

bakteriler, daha çok sayıda beta-laktamaz üretirler. Başta Enterobacteriaceae üyeleri

olmak üzere GN bakterilerin beta-laktam direncindeki en önemli mekanizma beta-

laktamaz üretimidir (36).

BETA-LAKTAMAZLAR

1940 yılında Abraham ve Chain’nin penisilinazı ortaya koymalarından bugüne

kadar 400’e yakın beta-laktamaz enzimi tanımlanmıştır. 1980’de Ambler tarafından

moleküler yapılarına göre 4 sınıfa ayrılmışlardır (37).

Sınıf A: Aktif bölgelerinde serin aminoasit taşıyan, öncelikle penisilinleri hidroliz

eden beta-laktamazlardır. GN bakterilerde en sık bulunan TEM-1 enzimi bu gruba iyi

bir örnektir.

Sınıf B: Aktive gösterebilmeleri için çinkoya bağlı tiyol grupları gerektiren

metalloenzimlerdir.

Sınıf C: Aktif bölgelerinde serin aminoasit taşıyan, öncelikle sefalosporinazlardan

oluşan, kromozomal AmpC geni tarafından kodlanması nedeniyle AmpC enzimler

olarak da adlandırılan enzimlerdir.

Sınıf D: Oksasilini hidroliz eden serin beta-laktamazlardır.

Beta-laktamazların en yeni sınıflandırma şeması, 1995 yılında Bush, Jacoby ve

Mederios tarafından biyokimyasal özellikleri ve substrat profillerine göre beta-

laktamazları 4 gruba ayırdıkları sınıflandırmadır. Bu grupların genel özellikleri tablo

2’de görülmektedir. Grup 1’de klavulanik asit ile inhibe olmayan sefalosporinazlar,

Grup 2’de beta-laktamaz inhibitörlerine duyarlı olan moleküler sınıf A ve D içinde

yer alan enzimler, Grup 3’te EDTA dışındaki beta-laktamaz inhibitörlerine duyarlı

olmayan metallo-beta-laktamazlar, Grup 4’te ise klavulanik asit ile inhibe olmayan

penisilinazlar bulunmaktadır (38).

Grup 1: Bunların birçoğu kromozomal enzimlerdir ve indüklenebilme

özelliğine sahiptirler. Moleküler sınıflamada sınıf C’de yeralırlar. Kromozomal

AmpC enzimleri, ayrıca plazmid kontrolündeki FOX-1, LAT-1, MIR-1, BIL-1 beta-

laktamazları da bu grupta yer almaktadır. Sefaloridin ve sefalotini penisilinden daha

hızlı hidroliz ederler. Klavulanik asit ve sulbaktamdan etkilenmezler, buna karşın

18

aztreonam ve kloksasilin tarafından inhibe edilirler. Karbapeneme karşı da

duyarlıdırlar. Grup 1 enzimlerini kodlayan genler plazmidlerde de görülebilmekte ve

Enterobactericeaea arasında transmisyon yoluyla aktarılabilmektedir.

Tablo 2. Beta-laktamaz grupları ve genel özellikleri.

Beta-laktamaz grubu Alt grup

Molekül sınıfı Özellik

1 C Çoğunlukla gram-negatif bakterilerdeki kromozomal enzimler (ancak plazmidde de kodlanabilir)

Klavulanik asitle inhibe olmaz.

2 A, D Birçoğu klavulanik asitle inhibe olur.

2a A Stafilokok ve enterokoklardaki penisilinazlar

2b A Çoğunlukla gram-negatif bakterilerdeki geniş spektrumlu beta-laktamazlar (TEM-1, TEM-2, SHV-1)

2be A Oksiiminosefalosporin ve monobaktamlara direnç oluşturan genişlemiş spektrumlu beta-laktamazlar (ESBL)

2br A İnhibitörlere dirençli TEM (IRT) beta-laktamazlar

bir tane SHV türevi

2c A Karbenisilini hidroliz eden enzimler

2d D Oksasilini hidroliz eden enzimler

Klavulanik asit ile az inhibe olurlar.

2e A Klavulanik asit ile inhibe olan sefalosporinazlar

2f A Karbapenemleri hidroliz eden, aktif bölgede serin içeren ve klavulanik asit ile inhibe olan enzimler

3 3a, 3b, 3c B Metallo-beta-laktamazlar.

Klavulanik asit ile inhibe olmazlar.

4 ? Diğer gruplara girmeyen dizileri belirlenmemiş

19

enzimler

Salmonella dışında hemen tüm GN bakterilerde kromozomal grup 1 beta-

laktamazlar bulunur. Ancak sentez miktarı açısından farklılıklar göstererek yüksek

veya düşük düzeyde üretilebilir. E.coli, P.mirabilis ve Shigella spp.’de ampisilin ve

dar spektrumlu sefalosporinlere karşı direnç oluşturmayacak kadar düşük düzeyde

sentezlenen yapısal enzimler vardır. Buna karşın E.coli izolatlarının %2’sinde AmpC

enzimlerinin aşırı sentezi sonucu yüksek düzeyde direnç oluşabilmektedir (39).

Enterobacter spp., P.aeruginosa. C.freundii, Serratia spp., Morgenella morganii,

Providencia stuartii ve Providencia rettgeri’deki sentezlenen kromozomal beta-

laktamazlar indüklenebilen türdedir (39,40).

Normalde bakteri tarafından bu enzimler bir baskılayıcı mekanizma ile düşük

düzeyde sentezlenirken ortama bir penisilin ya da sefalosporin eklendiğinde enzim

sentezinde birkaç yüz kat artış olabilmektedir (39). Farklı beta-laktam antibiyotikler

değişik oranlarda olmak üzere Grup 1 beta-laktamazları indükleyebilirler. Ancak,

indükleyici beta-laktamın ortadan kalkmasıyla bakteri tekrar eski bazal beta-laktamaz

sentezine geri döner. Bu yüzden bu mekanizma ile klinikte kalıcı bir direnç söz

konusu olmaz. Esas sorun bu enzimleri doğal olarak fazla miktarda sentezleyen

mutant suşlar nedeniyle oluşur. İndüklenebilir kromozomal beta-laktamaz taşıyan bu

GN bakterilerde normalde 10-5-10-7 arasında bir sıklıkla baskılanmış mutantlar

bulunur. Bu baskılanmış mutantlarda beta-laktamaz enzimlerinin sentezi devamlı ve

yüksek düzeyde olmaktadır. Böyle bakterilerle oluşan infeksiyonların bir indükleyici

antibiyotik ile tedavisi sırasında duyarlı bakterilerin ortadan kalkması, antibiyotik

etkisine dirençli doğal mutantların ortamda çoğalması ile tedavi başarısızlıkları

olabilmektedir. Bunun yanı sıra dirençli bakterilerin hastane mikroflorasına

yerleşmesine bağlı olarak da hastane infeksiyonu epidemileri ortaya çıkabilmektedir

(39,40).

Grup 2: En geniş kategoriyi oluşturan bu grup substrat profilindeki farklılık

nedeniyle birkaç alt gruba ayrılmaktadır. Tümü moleküller sınıf olarak A ve D’de yer

almaktadır. Bu beta-laktamazlar penisilinleri, sefalosporinleri, kloksasilini,

karbenisilini, karbapenemleri ve monobaktamları hidroliz etmelerine göre 6 alt gruba

ayrılırlar (41). 2b, 2be ve 2br alt grubunda bulunan TEM ve SHV grubu enzimler, sık

20

soyutlanan türlerde yaygın olmaları ve plazmidlerce taşınmaları nedeniyle klinik

açıdan önem taşımaktadırlar (39,40,42).

2a: Bu alt grupta penisilini hidrolize eden, klavulanik asite duyarlı enzimler

bulunmaktadır. S. aureus’un enzimleri bu gruptadır. Ayrıca B.cereus’un kromozomal

beta-laktamazları, Citrobacter amalonaticus, Eikenella corrodens ve Fusobacterium

nucleatum’da tanımlanan enzimler de bu gruptadır (38).

2b: Hem penisilin hem sefalosporinleri hidrolize eden, klavulanik asit,

sulbaktam ve tazobaktam gibi beta-laktamaz inhibitörlerine duyarlı beta-laktamazları

içerirler (40). Plazmid kontrolündeki “geniş spektrumlu” TEM-1, TEM-2 ve SHV-1

enzimleri bu gruptadır. Bu enzimlere ampisilin, karbenisilin, tikarsilin, sefalotin gibi

beta-laktam antibiyotiklere direnç oluşturmaları nedeniyle geniş spektrumlu

denilmiştir. TEM-1, TEM-2 ve SHV-1 beta-laktamazları Enterobacteriaceae

ailesinde yaygın olarak bulunur. Ayrıca OHİO-1 ve H.influenzae’da saptanan ROB-1

enzimini de içermektedir. TEM-1 beta-laktamazı özellikle E.coli suşlarında ampisilin

ve amoksisilin direncine neden olan mekanizmalar arasında en sık görülenidir.

Ayrıca TEM-1 enzimi, diğer Enterobacteriaceae üyelerinde olduğu gibi

Haemophilus. Vibrio ve Neisseria gibi diğer cinslerde de bulunur. SHV-1 özellikle

K.pneumoniae suşlarında bulunur (42,43).

2be: Oksiimino beta-laktamlar ve monobaktamlar gibi antibiyotiklerin yaygın

kullanımı sonucunda TEM-1, TEM-2 ve SHV-1 gibi ana enzimlerden 1-4 aminoasit

değişikliği ile genişlemiş spektrumlu beta-laktamlara (seftazidim, seftriakson,

sefotaksim veya aztreonam) da etki eden yeni TEM- ve SHV- enzimleri gelişmiştir

(42). Bunlar grup 2be’de yer almakta ve ESBL (extended-spectrum beta-lactamase =

genişlemiş spektrumlu beta-laktamazlar) olarak adlandırılmaktadır. Sefoksitin,

sefotetan ve klavulanik asit gibi beta-laktamaz inhibitörlerine duyarlıdırlar. Özellikle

Klebsiella ve E.coli suşlarında yaygındır. Bu grupta yer alan enzimlerden biri de

PER-1 enzimidir. Bu enzim ilk kez Türk izolatlarında saptanmıştır (44,45).

2br: Klavulanik asitten etkilenmeyen, geniş spektrumlu beta-laktamazlar bu

gruba alınmıştır. TEM-30 dan TEM-36’ya kadar olan TEM enzimleri ve TRC-1

enzimi bu gruptadır.

2c: Bu grup içinde karbenisilini hidroliz eden, klavulanik asite duyarlı enzimler

yer almaktadır. PSE-1, PSE-3, PSE-4 beta-laktamazları, Aeromonas hydrophilia’nın

21

AER-1 enzimi, M.catarrhalis’in BRO-1 ve BRO-2 enzimleri, V.cholerae’nin SAR-1

enzimi de bu gruptadır.

2d: Bu grup, kloksasilini penisilinden daha hızlı hidroliz eden beta-laktamazları

içermektedir. OXA enzimleri bu gruptadır. Bunlardan OXA-11 enzimi, Türkiye’de

izole edilen bir suşda saptanmıştır (46). Klavulanik asit ve sulbaktama dirençlidirler.

Grup 2’nin diğer alt gruplarında bulunan tüm enzimler, moleküler sınıf A’da yer

alırken, sadece bu alt grup moleküler sınıf D’de yer alır.

2e: Bu grupta yer alan beta-laktamazlar sefalosporinaz olmalarına karşın, grup

1’dekilerden farklı olarak klavulanik asitle inhibe olmaktadırlar. B.fragilis’in CepA

enzimi, B.uniformis ve B.vulgatus’un kromozomal CblA ve CfxA, E.coli’den izole

edilen FEC-1 ile S.maltophilia’nın L2 ve Y.enterocolitica’dan izole edilen Blal

enzimleri bu grubta yeralmaktadır (38).

2f: Bu grupta, E.cloacae’nın indüklenebilen IMI-1 enzimi, E.cloacae’nın

kromozomal NMC-A enzimi ve S.marcescens’in Sme-1 enzimi yer almaktadır.

Karbapenemleri hidroliz etmekte, klavulanik asit ile inhibe olmaktadırlar (38).

Grup 3: Bu grup, moleküler sınıf B’de yer alan metallo-beta-laktamaz (MBL)

enzimlerinden oluşur. Monobaktamlar dışında karbapenemler dahil tüm beta-

laktamları hidroliz edebilirler. Klavulanik asit veya tazobaktam gibi beta-laktamaz

inhibitörleri ile inhibe olmaz, EDTA ile inhibe olurlar. Aktiviteleri için Zn (çinko)

iyonlarına gereksinmeleri vardır. Bu beta-laktamazlar a,b,c olmak üzere 3 alt gruba

ayrılırlar.

3a: B.cereus II, B.fragilis (CcrA) ve S.maltophilia (L1 enzimi) kromozomal

beta-laktamazlarından oluşur. Bu enzimler penisilinleri, karbapenem ve

sefalosporinlerden daha etkili olarak hidrolize edebilirler.

3b: Büyük ölçüde Aeromonas cinsindan türeyip A.hydrophilia’da bulunur ve

bazen gerçek karbapenemaz olarak adlandırılır, çünkü grup 3a enzimlerinin aksine

penisilin ve sefalosporin üzerinde hiç hidrolitik etkileri yoktur. Bu da onların zor

belirlenmesine neden olur.

3c: Sadece bir enzim vardır ki o da Legionella gormannii’deki beta-

laktamazdır. Bu, genişletilmiş spektrumlu MBL enzimi olup 3a ve 3b’deki

gruplardan daha geniş etki spektrumuna sahiptir ve çoğu sefalosporinleri hidroliz

edebilir (47).

22

Grup 4: Bu grup, klavulanik asit ile pek de iyi inhibe olmayan küçük bir

penisilinazlar grubundan oluşur. Biri dışında hepsi kromozomaldir. Yapıları henüz

tam olarak saptanamamıştır ve molekül sınıfı henüz belirlenmemiştir. A.faecalis,

B.fragilis, C.jejuni’den izole edilen enzimler, Clostridium butyricum’un

indüklenebilen enzimi, E.coli’nin plazmid kontrolündeki SAR-2 beta-laktamazı bu

gruba sokulmuştur. Pseudomonas cepacia’daki beta-laktamazlar da bu gruba

dahildir.

Tüm bu 4 grup beta-laktamaz, fonksiyonlarındaki çeşitliliği sergiler. Tek bir

bakteride birden çok beta-laktamaz tipi aynı anda görülebilir ve bu çok sık olan bir

durumdur. Böylece kromozomal ve plazmid kökenli beta-laktamazlar bazen iç içe

geçerler. Hastane infeksiyonlarında en sık sorun olarak karşılaşılan enzimler, Grup

1’deki kromozomal beta-laktamazlar, Grup 2’deki ESBL enzimler ve Grup 3’deki

beta-laktamazlardır.

KARBAPENEMLERE DİRENÇ MEKANİZMALARI

Karbapenemler; antibakteriyel spektrumlarının genişliği, amfilik özellikleri

nedeniyle bakteriyel membranlardan hızla geçebilmeleri, AmpC ve ESBL

enzimlerine dayanıklı olmaları gibi özellikleri nedeniyle özellikle çoklu dirençli GN

bakteri infeksiyonlarında ilk sırada kullanılan antibiyotik grubudur. Ancak,

karbapenemlerin özellikle empirik tedavide yaygın olarak kullanılması, bunlara karşı

direnç oranlarının artmasıyla sonlanmıştır.

Karbapenemlere karşı bilinen 3 etki mekanizması ile direnç gelişebilmektedir:

1. İlacın hücre içinde etkin konsantrasyona ulaşamaması:

a.Porin değişimleri: Bu, özellikle P.aeruginosa suşlarındaki temel direnç

mekanizmasıdır. P.aeuriginosa suşlarında karbapenemler için özel bir porin olan

OprD’nin kaybı bu grup antibiyotiklere direnç gelişmesine neden olmaktadır. OprD

kaybı özellikle imipenem tedavisi sırasında gelişmektedir. Bir haftalık imipenem

tedavisi sonunda P.aeuriginosa suşlarının %50’sinde oprD geninde mutasyonlar

oluştuğu saptanmıştır (48). OprD’nin kaybı tipik olarak imipenem direncine ve

azalmış meropenem duyarlılığına sebep olur. Fakat OprD kanallarını kullanamayan

diğer beta-laktamlar üzerine etkisi yoktur. P.aeruginosa’daki duyarsızlık, ayrıca

23

çoklu ilaç efluks pompası (MexA-MexB-OprM)’nın mutasyonel sayı artışına bağlı

olarak ortaya çıkarılabilir. Bu mekanizma meropenem, penisilin, sefalosporin,

kinolon, tetrasiklin ve kloramfenikol için geçerli fakat imipenem için geçersizdir (1).

P.aeruginosa’da Opr kaybı ile oluşan imipenem direnci sadece kromozomal AmpC

beta-laktamazı korunduğunda ve tanımlandığında fonksiyon görür. Porin kaybıyla ve

kromozomal AmpC beta-laktamazlarının aşırı üretimi ile oluşan imipenem direnci

Enterobacter spp.’de tanımlanmıştır (49). K.pneumonia’da ise porin kaybına bağlı ve

plazmid aracılıklı AmpC beta-laktamazın (ACT-1) varlığıyla direnç oluşur (50).

Klebsiella spp.’de porin kaybıyla birlikte SHV ESBL’leri ile ilişkili karbapenem

direncine ait birkaç rapor da bildirilmiştir (51).

b.Aktif pompa sistemlerinin indüklenmesi

2. Karbapenemleri hidroliz eden enzimlerin varlığı:

a.İntrinsik (kromozomal) karbapenemazlar: Bu grupta, B.cereus II,

B.fragilis’in CcrA, B.cepacia’nın PCM-1, S.maltophilia’nın L1, C.indologenes’in

IND-1-4, C.meningosepticum’un BlaB enzimleri sayılabilir. Bunların tümü Bush

sınıflandırmasında grup 3’te yer alan MBL’lardır. Karbapenem hidrolize eden beta-

laktamaz genlerinin çoğu kromozomal olarak kodlanır. Bu durum bu enzimlerin

yavaş yayılımını ve böylece karbapenemlere karşı beta-laktamaz aracılıklı direncin

artmasının yavaş olmasını sağlamıştır. Yine de direnç paternleri değişebilir. Birçok

yıldır nadir olarak bilinen enzimler beta-laktam kemoterapinin kullanımına gerçek ve

artan oranda tehdit oluşturabilir. Düşük düzey direncin ne kadar beta-laktamaz

aracılıklı olduğu bilinmemektedir. Fakat yüksek düzey direnç beta-laktamaz ile

ilgilidir.

b.Ekstrinsik (kazanılmış) karbapenemazlar:

Sınıf A (Bush grup 2f)’da yer alan karbapenem hidroliz eden enzimler:

E.cloacae’nin IMI-1, ve NMC-A enzimleri, S.marcescens’in Sme-1 ve 2 enzimleri ve

Kpneumonia’nın KPC-1 enzimi bu grupta yer almaktadır. Bunlar, imipenem,

meropenem, penisilinler, geniş spektrumlu sefalosporinler ve aztreonama direnç

gelişmesine neden olan ve tazobaktam başta olmak üzere beta-laktamaz

inhibitörlerine duyarlı olan enzimlerdir.

Sınıf B metalloenzimler: IMP-1-18, VIM-1-13, SPM-1, GIM-1. MBL geni

transpoze edilebilir (aktarılabilir) bir eleman olan plazmid üzerinde yer alır.

24

K.pneumonia, çoğu geniş spektrumlu serin beta-laktamazın orijinal suşu olmasına

rağmen MBL’ların Enterobacteriaceae ailesinin diğer üyeleri arasında yayılımına

katkısı olduğu görülmektedir (51).

Sınıf C beta-laktamazlar: Kromozomal AmpC enzimlerinin aşırı üretiminin

özellikle dış membran porin değişimleri ile birleştiğinde karbapenem direncine yol

açması büyük olasılıkla en yaygın karbapenem direnç mekanizmasıdır. Bu durum

E.cloacae, E.aerogenes, K.pneumonia, P.rettgeri, C.freundii, E.coli, P.aeruginosa

gibi birçok türde gösterilmiştir. İmipeneme yüksek düzey direnç gösteren dereprese

bir E.aerogenes mutantında hücre genomuna ampD geni sokulduğunda imipenem

MIK değerlerinin normale dönmesi AmpC tipi enzimlerinin karbapenemlere

dirençteki önemini vurgulamaktadır.

Sınıf D oksasilinazlar: OXA-23-27

3. Hedef PBP değişimleri:

Tek başına nadir görülür ancak diğer mekanizmalar ile birliktedir.

KARBAPENEMAZLAR

Karbapenemazlar, en geniş spektrumlu antibakteriyel etkinliğe sahip beta-

laktam sınıfı olan karbapenemlerden birini, en azından imipenem veya

meropenemden birini, belirgin olarak hidrolize eden beta-laktamazlar olarak

tanımlanabilir. Bu enzimlerin çoğu yalnız karbapenemlere değil diğer beta-laktam

ajanlara da etkilidirler. Bu nedenle sadece karbapenem grubu beta-laktam ajanlara

afinitesi diğer beta-laktamlara kıyasla daha fazla olan metalloenzimler

“karbapenemaz” olarak adlandırılmaktadır. Diğer beta-laktamazların sayısı ile

karşılaştırıldığında sayıları düşük kalmaktadır (51).

1990 öncesinde tanımlanan karbapenem hidroliz eden enzimlerin tümü

kromozomal olarak bilinmesine rağmen yakın geçmişte Japonya’dan plazmid

aracılıklı MBL’lar bildirilmiştir (3,47). Bu enzimler B.fragilis, P.aeruginosa ve en az

bir kromozomal enzim üreten S.marcescens ve K.pneumoniae gibi enterobactericeaea

ailesi üyelerinde gözlenmektedir (51). Bugüne kadar bu karbapenem dirençli

organizmalar ve bunlarla alakalı plazmidlerin yayılımı bir şekilde sınırlı kalmıştır.

25

Yüksek düzey direnç, dış membran proteini D2’nin eş zamanlı kaybıyla alakalıdır

(52).

A-) KROMOZOMAL KARBAPENEMAZLAR

Birçok nadir nonfermantatif GN (NFGN) basiller ve Aeromonas spp.,

kromozomal kodlanan ve moleküler sınıf B’ye ait olan karbapenemazlara sahiptir ve

bu enzimler aktif bölgelerinde çinko iyonları bulundurduklarından beta-laktamazlar

içinde kendine ait özgün özelliğe sahiptir. Katalitik aktivite çinko iyonuna bağlıdır ve

EDTA ile birleştiğinde kaybolur. Diğer moleküler sınıflara (A,C ve D) ait beta-

laktamazlar çinko içermezler, serin bazlı mekanizmaları vardır ve birkaç istisna

dışında önemli kromozomal karbapenemaz etkinlikleri yoktur (38).

Sınıf B beta-laktamazlar S.maltophila, Myroides (Flavobacterium) odoratum,

Chryseobacterium (Flavobacterium) meningosepticum, C.indologenes,

A.hydrophilia, A.sobria, A.salmonicida, Legionella gormanii ve B.cereus’da

yaygındır.

B-) KAZANILMIŞ KARBAPENEMAZLAR

Kazanılmış direnç kapsamına giren karbapenemazlar, Ambler moleküler

sınıflamasına göre A, B veya D moleküler sınıflarına ait olabilir (3). Bu bakteriyel

suşlar oldukça nadirdir. Fakat son 2-3 yılda daha sık bildirilmeye başlanmıştır ve

enzim tiplerinin listesi hızla artmaktadır. Kazanılmış karbapenemazlar,

Acinetobacter spp., P.aeruginosa ve Enterobacteriaceae’da bulunur. Sınıf D tipleri

sadece Acinetobacter spp.’de, sınıf A tipleri ise birkaç Enterobacteriaceae izolatında

bulunur.

Sınıf B kazanılmış karbapenemazlar: Ambler sınıf B veya Bush grup 3’de yer alan

karbapenemazlar MBL olarak bilinirler, klinik açıdan en önemli karbapenemazlardır.

Aztreonam dışındaki tüm beta-laktamları hidrolize eden IMP ve VIM serisi

metalloenzimleri içerirler. Dünya çapında yaygın olarak bildirilmiş olsalar da en sık

Güneydoğu Asya ve Avrupa’dan bildirilmişlerdir (3). Metalloenzimlerin genleri

plazmid ve integronda yerleşiktir. Rasmussen ve Bush, grup 3 MBL’ları 3 alt grupta

toplamıştır: 3a, 3b, 3c. Bu alt gruplardan 3a’da imipenem ve penisilinleri büyük bir

hızla ve yüksek oranda hidrolizleyen, sefalosporin hidrolizi pozitif fakat daha düşük

oranlarda olan; meropenem hidrolizi de pozitif fakat tamamen değişik oranlarda olan

enzimler yer alır. Grup 3b enzimleri “gerçek karbapenemazlar” olarak tanımlanır.

26

Bunlar spesifik olarak karbapenemleri hidroliz ederler ve nitrosefin testiyle tespit

edilemezler. Grup 3c’de yalnızca Legionella gormanii’nin MBL’ı bulunur. 3a, 3b ve

3c’deki enzimler klavulanik asitle inhibe olmazlar (51).

İlk plazmidik MBL, 1991 yılında Japonya’dan bildirilen bir P.aeruginosa’dan

izole edilmiştir (53). IMP serisi enzimler ile VIM serisi enzimler daha çok İtalya,

Fransa gibi Avrupa ülkelerinde saptanmıştır. MBL’ların etkilediği beta-laktam

antibiyotik spektrumu geniş olmakla birlikte hidroliz düzeyleri düşüktür fakat MBL

üreten bakteriler genellikle farklı grup beta-laktamazları da üretirler ve grup 1 beta-

laktamaz üreten bakterilerde olduğu gibi burada da total fenotip olarak hem geniş

hem de etkili bir direnç profili ortaya çıkar. Bu nedenle de MBL üreten bakteriler

genellikle sefalosporinlere, penisilinlere, karbapenemlere, beta-laktamaz

inhibitörlerine dirençli olarak saptanırlar (54). Tek başına kodladıkları direnç önemli

düzeyde olmamakla birlikte, bugün gram-negatif bakterilerde kombine direnç

mekanizmalarının ve birden çok beta-laktamazın varlığı nedeniyle karbapenem

direnç düzeylerinin klinik olarak önemli düzeylere çıkabileceği ve karbapenem

kullanımının MBL üretimini doğrudan etkilediği gerçeği dikkate alınmalıdır (55).

IMP tipi beta-laktamazlar: 1991’de Watanabe ve arkadaşları, Japonya’da 1988’de

saklanan bir P.aeruginosa suşunda transfer edilebilir sınıf B enzimi bildirmişlerdir

(53). Bu, büyük olasılıkla Japonya’da 1991’de bir S.marcescens izolatında

sekanslanan ve isimlendirilen IMP-1’dir (56). Daha sonra farklı coğrafik bölgelerden

bugün IMP-18’lere kadar varan yeni IMP tipi enzimler tanımlanmıştır. Bu IMP tipi

enzimlerin tümü monobaktamlar dışındaki beta-laktamlara karşı geniş etkinliğe

sahiptir. IMP-1, ampisiline göre karbenisiline daha etkilidir. IMP-2 ve IMP-3 ise her

iki ilaca da benzer etkinliğe sahiptir (51,57). Bu enzimler meropenem ve imipeneme

eşit düzeyde yüksek direnç oluşturmaktadırlar. EDTA ile inhibe olup klavulonatla

olmamaktadırlar. Monobaktamları hidroliz edememektedirler (3,58).

VIM tipi beta-laktamazlar: Kazanılmış sınıf B beta-laktamazların ikinci ailesi olan

VIM tipleri ilk kez 1997’de İtalya’dan bir P.aeruginosa izolatında VIM-1 olarak

tanımlanmış ve 1999’da bildirilmiştir (59). Bugün sayıları artarak bildirilen enzimler

VIM-13’e kadar gelmiştir.

Sınıf D kazanılmış karbapenemazlar: Moleküler sınıf D beta-laktamazlar,

oksasilinaz aktiviteleri dikkate alındığından OXA tipleri olarak sınıflandırılır. En sık

27

karşılaşılan temsilcileri OXA-1, -2, -10 (PSE-2)’dur. Tümünün karbapenemaz

etkinliği yoktur. OXA-23, OXA-24, OXA-25, OXA-26, OXA-27 enzimleri

karbapenemaz etkinliğine sahiptir. Bunlar karbapenemleri çok güçlü olmayan bir

şekilde hidrolize ederler, 3. kuşak sefalosporinlere ve aztreonama etkileri yoktur.

OXA-23 dışında klavulanik asitle inhibe olurlar. Karbapenemaz niteliği içeren bu

enzimlerin tümü A.boumannii’de bulunmuş, İskoçya, Singapur, İspanya ve

Belçika’dan bildirilmiştir (3).

Sınıf A kazanılmış karbapenemazlar: Bunlar Sme-1, Sme-2, NMC-A ve IMI-

1’dir. Sme tipleri İngiltere ve ABD’deki S.marcescens izolatlarının bazı kümelerinde

bulunmuştur ve sadece bir aminoasit farklılığı vardır. IMI-1 ve NMC-A %96

homolojiye sahiptir, Kaliforniya ve Fransa’dan toplanan E.cloacae suşlarından izole

edilmiştir. Sme ve IMI/NMC kümeleri arasındaki homoloji %70’dir. Orijinal IMI-1

üreticileri 1985’de saptanmıştır ve orijinal Sme-1 üretenler 1982’de bulunmuştur.

Her ikisi de imipenemin kullanıma girmesinden öncedir. Nadir görüldüklerinden bu

enzimlerin tehdidi hafif görülmektedir. Bu gruptaki enzimlerin tümü meropeneme

göre imipeneme etkinliği daha fazla olan penisilinazlardır ve penisilin, aztreonam ve

karbapenem direncine neden olurlar. Oksiminosefalosporinler zayıf substratlardır ve

sınıf A enzimleri dirence neden olmaz. A sınıfındaki karbapenemazlar serin-beta-

laktamazlardır, klavulanik asit ile inhibe olurlar ve enderdirler. E.cloacae ve

S.marcescens’teki enzimler (NMC-A, Sme-1, Sme-3, IMI-1) kromozomal,

K.pneumoniae’daki KPC-1 ve P.aeuriginosa’daki GES-2 plazmidiktir. KPC-1,

karbapenemlere, 3. kuşak sefalosporinlere ve aztreonama direnç oluşturan,

klavulanik asit ve tazobaktam ile inhibe olan bir enzimdir. Plazmidik oluşu ve

Enterobacteriaceae içinde bulunmuş olması bu enzime ayrı bir önem kazandırmıştır.

GES-2 (P.aeuriginosa’daki) klavulanik asit ile inhibe olan, genişlemiş spektrumlu

beta-laktamaz olan GES-1’in nokta mutantıdır (3).

Karbapenemlere karşı karbapenemaz aracılıklı direnç oldukça nadirdir.

Özellikle P.aeruginosa ve A.boumannii’de görülmeye başlanmıştır. Avrasya

ülkelerinin birbirinden uzak 5’inde, P.aeruginosa’da VIM enzimlerinin bulunmasi

üzücüdür. IMP üreten suşlar artık Japonya ile sınırlı değildir. A.baumannii’de çoklu

oksikarbapenemazlar saptanmıştır. Bu enzimlerin kaynakları meçhuldür. IMP ve

VIM tipleri kendi başlarına aynı genetik kaçışları gösterdiğinden birbirinden

28

farklıdır. Kaçışdan sonra genlerde farklılaşma olmamaktadır. Karbapenemazların

gelecekte artması bir riskdir. Özellikle diğer beta-laktamlara artan direnç,

karbapenemlerin artan oranda kullanımına neden olmaktadır. Oral analoglarının

piyasaya çıkması ve yarı ömrü uzun olan karbapenemler bu seleksiyonu

hızlandırabilir. Dirençle başa çıkmak özellikle sınıf B enzimleriyle oluştuğunda

kolay değildir. Bu sınıf B enzimlerinin aktif bölgesi oldukça geniştir, stabilitesi,

monobaktamlar haricinde oldukça zordur. İnhibitörler için umut daha fazladır.

Antibiyogram okuyarak ve fenotip değerlendirerek karbapenemazların varlığı

konusunda tahmin yürütmek mümkün değildir denebilir. B sınıfı MBL’ların EDTA

ile inhibisyon esasına dayalı Etest MBL stripleriyle pozitif bulunan suşlarda MBL

PCR’ları paralel sonuç vermemektedir Bu durumda bu grup enzimlerin moleküler

yöntem dışındaki tespit yöntemleri ile tanımlanması güç olabilmektedir (3).

İleriki çalışmaların en enteresan yönlerinden biri de klinikte izole edilen gram-

negatif suşlarda karbapenemazların gerçek prevalansını saptamak ve beta-laktam ve

beta-laktam dışı antibiyotiklerin seçici baskısını analiz etmektir. Çünkü

karbapenemaz genleri sıklıkla en azından aminoglikozid direnç genlerine integron

yapıları içinde fiziksel olarak bağlı bulunmaktadır. Bu karbapenemaz genlerinin

orijini bilinmemektedir. Kuvvetle muhtemel, Enterobactericeaea, bu enzimlerin

doğal rezervuarı değildir, muhtemelen çevresel olan rezervuarları saptandıkça

karbapenemaz genlerinin disseminasyonu önlenecek ve belki de integron ve gen

kaset oluşumunun moleküler mekanizmasına dair fikirlere ulaşılacaktır (3).

METALLO-BETA-LAKTAMAZLAR

Metallo-beta-laktamazlar, Bush sınıflamasında fonksiyonel grup 3 veya

Ambler sınıflamasında sınıf B’de yer alan ve diğer beta-laktamazlardan farklı olarak

aktif bölgelerinde Zn+2 iyonu bulunan enzimlerdir. Dolayısıyla bu enzimler

klavulanat, tazobaktam, sulbaktam gibi klasik beta-laktamaz inhibitörlerinden

etkilenmezken EDTA gibi bir metal şelatörü ile inaktive olurlar. Bu enzimlerin en

önemli özelliği monobaktamlar hariç tüm beta-laktamları ve bu arada karbapenemleri

de hidroliz edebilmeleridir (3).

29

1960’ların ortalarında ciddiye alınmayan klinik patojenlerden biri olan

B.cereus’ta çinko bağımlı ilk MBL tanımlanmış, ikinci çinko bağımlı penisilinaz ise

1980’lerin başında S.maltophilia’da gösterilmiştir. Kısa süre sonra imipenem

hidrolizi yapan MBL’lar A.hydrophilia ve B.fragilis’ten identifiye edilmiştir.

Önceleri bu grupta sadece kromozomal enzimlerin varlığı bilinirken, 1991’de

Japonya’da S.marcescens ve P.aeuriginosa suşlarında plazmid kökenli bir MBL’ın

(IMP-1) saptanması, karbapenemlerin geleceği konusunda endişe doğurmuştur.

Nitekim geçen süre içinde integron kökenli IMP (IMP-1-18) ve VIM (VIM-1-13)

ailesi üyeleri Avrupa ülkelerinde de giderek artan oranlarda bildirilmeye

başlanmıştır.

Aralarında küçük yapısal benzerlikler bulunan 2 majör enzim grubu

tanımlanmıştır: Birinci grupta; geniş substrat özgüllüğü gösteren, monobaktamlar

dışındaki tüm beta-laktamları hidroliz eden enzimler bulunur. İkinci grup; “gerçek

karbapenemaz”lardan oluşur. Primer olarak Aeromonas türlerinde bulunan bu grup

enzimler penisilin ve sefalosporinlere zayıf hidrolitik etki gösterir. Şimdiye dek,

karbapenem dirençli suşların yalnızca küçük bir kısmında MBL varlığı saptanmıştır.

Muhtemelen bu durumun sebebi, karbapenem direncinin, permeabilite değişiklikleri

ve kromozomal sefalosporinazların üretiminde artış gibi daha kolay yollarla

kazanılabilmesidir. Ancak Japonya’da MBL’ların plazmidler üzerinde gösterilmesi

önemli bir sorunu ortaya çıkarmıştır. Plazmid aracılı karbapenem direncinin artışını

sürdüreceği ve belki de bu ajanların kullanımını sınırlayabileceği tahmin

edilmektedir (60).

MBL’lar sıklıkla etki spektrumlarını genişletecek bir diğer enzimle birlikte

üretilirler. Örneğin, alt grup 3b genellikle grup 2b’deki penisilinazlarla birliktedir.

S.maltophilia’da ise L1 ile birlikte ESBL niteliği taşıyan L2 üretilmektedir.

Böylelikle S.maltophilia suşları normalde MBL’ların etki etmediği aztreonama da

direnç göstermektedir.

MBL’lar aktif bölgelerinde bir Zn+2 iyonu taşıdıklarından tanımlanmalarında

bu çinko iyonuna bağlanarak enzimi inaktive eden EDTA, 2-merkaptopropionik asit

gibi bileşikler kullanılmaktadır (61). Hastane salgınları açısından önemli bakteri

türlerinde bulundukları için tanımlanmaları infeksiyon kontrolü açısından önemlidir.

30

MBL’ların en önemli özelliği karbapenemleri hidroliz edebilme yetenekleri

olmasına karşın bazıları aynı zamanda çoğu beta-laktam grubunu da hidroliz

edebilecek kapasitededir. Dolayısıyla, MBL üreten organizmalar söz konusu

olduğunda beta-laktam antibiyotiklerin kullanılabilirliği ciddi olarak sınırlanmış

durumdadır (60).

MBL’ların sınıflandırılması: 1995’te MBL’lar hep birlikte Bush ve arkadaşları

tarafından “fonksiyonel grup 3”içinde sınıflandırılmıştır. Bu enzimlerin majör ayırt

edici özellikleri metal iyon şelatörleri tarafından inhibe edilmesi ve klavulanik asit,

sulbaktam, tazobaktam gibi ticari olarak elde edilebilen inhibitörlerden

etkilenmemeleridir. İlk sınıflandırmanın yapıldığı sıralarda (1995’te) substrat

profillerine göre bu enzimlerin subgruplara ayrılması söz konusu olmamıştır. Ancak

ilerleyen yıllarda literatürde tanımlanan MBL sayısı arttıkça enzimlerin substrat

özelliklerine göre alt gruplara ayrılması gerektiği ortaya çıkmıştır. Rasmussen ve

Bush tarafından 3 fonksiyonel grup MBL tanımlanmıştır (60).

Grup 3a: Bu enzimler, genellikle penisilinleri imipenemden daha hızlı (en az

%60) olarak hidrolize edebilirler. Sefalosporinler de, imipenem kadar olmasa da bu

enzimler tarafından güçlü bir şekilde hidrolize edilir. Bu enzimler maksimum aktivite

için çinko eklenmesini gerektirirler veya bu +2 değerlikli katyon tarafından aktive

olurlar. Bu da çinko için düşük bağlanma affinitesi anlamına gelir (51). Bu grup

içerisinde B.cereus II, B.fragilis’in CcrA, B.cepacia’nın PCM-1, S. maltophilia’nın

L1, Chryseobacterium indologenes’in IND-1-4, C. meningosepticum’un BlaB

enzimleri yanı sıra S.marcescens, P.aeruginosa, A.baumannii, S.flexneri,

K.pneumoniae gibi değişik türlerde saptanan IMP-1-18 ve VIM-1-13 enzimleri yer

almaktadır (60).

Subgrup 3a enzimleri çok geniş aralıkda çok çeşitli substratları tanıyabilir. Bu

da onların çok çeşitli beta-laktam içeren ajanlara karşı tehdit oluşturmasına neden

olur. Bu enzimlerim tümü penisilinleri hidroliz eder. Sefalosporinler genellikle

imipenemden daha yavaş hidrolize olurlar (51). Katalitik çinko ilavesine ek olarak

grup 3a enzimleri, maximum katalitik aktivite için suplemental iki değerlikli çinkoya

ihtiyaç duyar.

Grup 3b: Aeromonas türlerinin metallo enzimlerini kapsar ve bunlara “gerçek

karbapenemazlar” da denir. Bu enzimlerin karbapenemlere yüksek özgüllüğü

31

bulunmaktadır. Karbapenemler dışındaki beta-laktamlara etkileri çok az olduğundan

varlıkları nitrosefin hidrolizine dayanan testlerle gösterilemez. Bu enzimleri grup 3a

MBL’larından ayıran bir diğer özellik, çinko ilavesinin aktif enzim üzerindeki

etkisidir. Tüm MBL’ların aktif bölgelerinde çinko bulunduğu ve enzimin katalitik

aktivitesi için bu katyonun mutlaka ortamda bulunması gerektiği kabul edilmektedir.

Bununla birlikte, grup 3b enzimlerinden en az 3 tanesi düşük çinko konsantrasyonları

ile inhibe olur (60). Aeromonas spp. enzimlerinin nitrosefini çok zayıf hidrolize

etmesi nedeniyle bu karbapenemazlar yakın geçmişe kadar tanınamamıştır, varlıkları

izoelektrik odaklama jellerinde tespit edilememiştir. Bu subgrubu tespit edebilmek

için jel içinde karbapenem substrat olarak kullanılmalıdır. Grup 3b’deki bütün

enzimler EDTA ile inhibe olur. Bu da aktif bölge metal iyonunun şelasyonunu

gösterir. EDTA eklenmesinden sonra çinko eklemenin enzimlerin çoğunun

aktivitesini geri kazandırdığı gösterilmiştir. Grup 3b enzimleri için imipenem

açısından yüksek katalitik etkinlik bildirilmiş, fakat benzil penisilin veya sefaloridin

için düşük veya zayıf hidroliz gözlenmiştir (51).

Grup 3c: Bu grupta sadece Legionella gormanii’nin MBL’ı yer almaktadır. Bu

enzim literatürde bir kez tanımlanmıştır. Yüksek sefalosporinaz aktivitesi ile diğer alt

gruplardan ayrılmaktadır. Diğer grup 3 enzimlerinden farklı biyokimyasal özellikler

taşımaktadır (60). Bu enzim, geniş spektrumlu sefalosporinler ve sefamisinler de

dahil sefalosporinleri çok yüksek oranda hidroliz etmesiyle ayrılır. İleri

değerlendirmeler sonucunda bu enzimin grup 3a enzimiyle yakın ilişkili olabileceği

gösterilebilir (51).

Subgrup 3a enzim üreten organizmaların çoğu beta-laktam antibiyotiklerle olan

saldırıya karşı koyabilmesine rağmen grup 3b enzimleri sadece karbapenemler değil

daha geniş substrat profiline sahip beta-laktamazlarla birlikte üretilmeye gerek

duyarlar (51).

MBL’ların epidemiyolojisi: İmipenem dirençli suşların epidemiyolojisi son yıllarda

başta Japonya olmak üzere daha yakından izlenmektedir. Çünkü Japonya plazmid

aracılı MBL bildiriminin yapıldığı esas ülke konumundadır. 4 yıllık bir izlem

periyodu içerisinde Bacteriodes spp’de imipenem direçli suşların oranında küçük

değişimler görülmüştür. Transfer edilebilir MBL, B.fragilis’te, bu izlem periyodunun

ortasında saptanmış ve bildirilmiştir. S.marcescens suşlarına yönelik yapılan bir

32

çalışmada suşların %4’ünden azında MBL üretimine bağlı karbapenem direnci

saptanmıştır. İki Japon çalışmasında P.aeruginosa’da imipenem dirençli suşların çok

az bir kısmında plazmid aracılı MBL spesifik probu ile reaksiyon veren bir genin

üretildiği saptanmıştır. Asıl not edilmesi gereken şudur ki; P.aeruginosa suşlarının

%18’inde MBL üretimi dışında imipenem direnci saptanmıştır (60).

33

MATERYAL ve METOD

Bakteriyel suşlar: 2004 Ağustos - 2005 Ağustos tarihleri arasındaki bir yıllık

süre içerisinde Kartal Dr. Lütfi Kırdar Eğitim ve Araştırma Hastanesi Klinik

Mikrobiyoloji labaratuvarına gönderilen çeşitli klinik örneklerden izole edilen GN

basillerden Bauer-Kirby disk difüzyon yöntemi ile CLSI (NCCLS) kriterlerine (62)

göre imipenem ve/veya meropeneme dirençli veya azalmış duyarlılığı olan suşların

ilk izolatları bu çalışmaya alındı. Bu süre içersinde çalışmaya aldığımız 82 izolatın

36’sı trakeal aspirat, 20’si idrar, 11’i yara, 10’u kan ve 5’i diğer (BOS, katater ucu,

kulak,...) materyallerden izole edildi. Bu materyallerin çoğunluğu Yoğun Bakım

Ünitesinden olmak üzere çeşitli servislerden gönderilmişdi. Suşlar klasik yöntemlerle

identifiye edildi. Çalışma gününe kadar izolatlar sütlü besiyerinde –200C’de saklandı.

Antimikrobiyal duyarlılık testleri: NCCLS (CLSI) önerilerine göre disk

difüzyon yöntemi ile imipenem (IPM) (10 µg) veya meropenem (MEM) (10 µg)

diskleri (Oxoid) etrafındaki inhibisyon zon çapları <16 mm olan GN suşlar (≤13

mm. dirençli, 14-15 mm.orta derecede duyarlı) çalışmaya alındı. Bu suşlardaki

direnç, Etest yöntemi (AB Biodisk, Sweden) ile imipenem ve meropenem için MİK

tespit edilerek (MİK değeri ≤ 4 µg/ml duyarlı, 8 µg/ml orta derecede duyarlı, ≥ 16 µ

g/ml dirençli) doğrulandı. Tüm suşların karbapenem duyarlılıkları her iki yöntemle

de uyumlu sonuçlar verdi (tüm suşların MİK değerleri >4 µg/ml).

Kontrol suşu olarak Escherichia coli ATCC 25922 ve Pseudomonas

aeruginosa ATCC 27853 kullanıldı.

Metallo-beta-laktamaz (MBL) aktivitesinin belirlenmesi: Karbapenemlere

dirençli veya azalmış duyarlılığı olan suşların karbapenemaz ve MBL üretimi

modifiye Hodge testi ve IPM-EDTA / MEM-EDTA disk yöntemi ile tarandı (61,63).

IPM-EDTA / MEM-EDTA disk yöntemi: Öncelikle EDTA stok solüsyonu

hazırlandı. Bunun için, 1000 mL distile suda 186,1 g disodyum EDTA.2H2O (Sigma

34

chemicals, Germany) çözdürülerek 0,5 M EDTA solüsyonu elde edildi ve NaOH ile

pH 8,0’e ayarlandı. Otoklavlanarak sterilize edildi.

Test suşları CLSI’ın önerdiği disk difüzyon yönteminde olduğu gibi Mueller-

Hinton agar plağının yüzeyine ekildi. Plağa 2’şer adet IPM (10 µg) ve MEM (10 µg)

diskleri yerleştirildi. Disklerin birer tanesine 5 µL (930 µg) 0,5 M EDTA solüsyonu

eklenerek kombine diskler (10 µg / 930 µg) oluşturulmuş oldu. 350C’de 16-18 saatlik

inkübasyondan sonra zon çapları ölçüldü (Şekil 1). Her iki karbapenem diskleri için

ayrı ayrı etraflarındaki zon çapları ile bu disklerin EDTA ile kombine edildiği

disklerin etrafındaki zon çapları arasındaki fark her bir suş için kaydedildi.

Modifiye hodge testi: E.coli ATCC 25922 suşunun McFarland 0,5'in 1/10

bulanıklığındaki süspansiyonu hazırlanarak Mueller-Hinton agar plağının yüzeyine

disk difüzyon yönteminde olduğu gibi ekildi. Plağın merkezine IPM diski (10 µg)

yerleştirildi. Test suşları, bu diskin dört bir kenarından perifere doğru çizgi ekimi

şeklinde öze ile ekildi. 350C’de 16-18 saatlik inkübasyondan sonra diskin etrafındaki

inhibisyon zonunda çarpıklık veya yonca görünümü pozitif olarak kabul edildi (Şekil

2 ve 3).

35

Şekil 1. İmipenem-EDTA ve meropenem-EDTA disk yöntemi.

Şekil 2. Modifiye Hodge testi pozitif olan iki izolat.

Şekil 3. Modifiye Hodge testi ile pozitiflik.

36

BULGULAR

Çalışmaya alınan 82 izolatın 25’i Pseudomonas spp., 45’i Pseudomonas dışı

diğer nonfermentetif gram-negatif (NFGN) basiller, 4’ü Citrobacter spp., 4’ü

Enterobacter spp., 3’ü Klebsiella spp., biri Serratia spp. idi.

İzolatların 52 (% 63)’si modifiye Hodge testi ile pozitifdi. Modifiye Hodge

testi pozitif ve negatif olan izolatların imipenem diski ile imipenem-EDTA diski

arasındaki inhibisyon zon farkları şekil 4’de, meropenem diski ile meropenem-EDTA

diski arasındaki inhibisyon zon farkları şekil 5’de görülmektedir. Bunlar

incelendiğinde, modifiye Hodge testi pozitif olan izolatların tamamının her iki

karbapenem için de EDTA diskleri ile 6 mm ve üzerinde inhibisyon farkı

oluşturduğu görüldü. Ne var ki, modifiye Hodge testi negatif olduğu halde 21 izolat

imipenem-EDTA disk testi ile, 18 izolat ise meropenem-EDTA ile 6 mm ve üzerinde

inhibisyon farkı oluşturdu (Tablo 3).

Tablo 3. Modifiye Hodge testi pozitif ve negatif olan izolatlar arasında IPM-

EDTA ve MEM-EDTA diskleri ile ≥6 mm. ve <6 mm. inhibisyon farkı

oluşturanların dağılımı.

IPM-EDTA disk testi MEM-EDTA disk testiModifiye Hodge t. ≥ 6 mm. < 6 mm. ≥ 6 mm. < 6 mm.

Pozitif

(n=52)52 0 52 0

Negatif

(n=30)21 9 18 12

37

İmipenem için inhibisyon zon farkı

1614131211109876540

Cou

nt

16

14

12

10

8

6

4

2

0

Mod.Hodge

Negatif

Pozitif

Şekil 4. Modifiye Hodge testi pozitif ve negatif olan izolatların imipenem diski ile

imipenem-EDTA diskleri arasındaki inhibisyon zon farklarının dağılımı.

Meropenem için inhibisyon zon farkı

1816141312111098765430

Cou

nt

20

10

0

Mod.Hodge

Negatif

Pozitif

Şekil 5. Modifiye Hodge testi pozitif ve negatif olan izolatların meropenem diski ile

meropenem-EDTA diskleri arasındaki inhibisyon zon farklarının dağılımı.

38

Daha önce Yong ve arkadaşları ile Pitout ve arkadaşlarının yapmış oldukları

çalışmalarda PCR ile MBL ürettiği tespit edilen Pseudomonas aeruginosa ve

Acinetobacter baumannii suşları, EDTA ilavesi ile ≥7 mm. inhisyon zon farkı

yaratmışlar ve imipenem-EDTA disk testi için “≥7 mm inhibisyon zonunda

genişleme” pozitiflik kabul edilmiştir (64, 65). Bu sonuçlar referans alınarak,

Pseudomonas spp. ve NFGN basillerde çalışmamızda kullanılan her 2 testin

pozitifliği karşılaştırıldı (Tablo 4). Pseudomonas suşlarının 4 (% 12)’ü modifiye

Hodge testi ile, 14 (% 52)’ü imipenem-EDTA disk testi ile, 15 (% 60)’i meropenem-

EDTA disk testi ile pozitiflik verdi. NFGN basillerin 40 (% 89)’ı modifiye Hodge

testi ile, 43 (% 96)’ü imipenem-EDTA ve meropenem-EDTA disk testleri ile

pozitiflik verdi.

NFGN basil izolatlarında Pseudomonas suşlarına göre, EDTA kombine disk

testi ile modifiye Hodge testine göre, meropenem-EDTA diski ile imipenem-EDTA

diskine göre daha fazla sayıda fenotipik olarak MBL-pozitifliği saptandı.

Tablo 4. Pseudomonas spp. ve NFGN basil izolatlarında modifiye Hodge testi ile

IPM-EDTA ve MEM-EDTA disk testlerinin sonuçlarının karşılaştırılması.

Modifiye

Hodge t.

IPM-EDTA

disk testi

pozitifliği*

MEM-EDTA

disk testi

pozitifliği*Pseudomonas spp.

(n=25)

Pozitif

(n=4)4 2

Negatif

(n=21)10 13

NFGN

(n=45)

Pozitif

(n=40)38 39

Negatif

(n=5)5 4

*inhibisyon zon farkı ≥7 mm.

Çalışmaya aldığımız bu karbapenem dirençli 82 izolatımızın 67 (% 82)’si aynı

zamanda siprofloksasine, 75 (% 91)’i gentamisine, 67 (% 82)’si amikasine dirençli

veya orta duyarlı saptandı.

39

TARTIŞMA

Yaşamı tehdit eden ciddi infeksiyonlarda ve çoklu ilaç direnci gösteren gram

negatif bakterilerin yol açtığı infeksiyonlarda karbapenem grubu antibiyotikler son

seçenek durumunda olduğu için karbapenem direncinin ayrı bir önemi vardır. Direnç

oranları ve dirençten sorumlu olabilecek olası enzimler her ülke ve merkeze göre

değişiklikler göstermekle birlikte her merkez için değişmeyen bir gerçek, oranların

yıllar içinde artmakta olduğudur. Japonya’da karbapenem dienci 1998’de % 19.3’den

2002’de % 38’e çıkmıştır (4).

Çeşitli çalışmalarda P.aeruginosa kökenlerinde imipeneme ve meropeneme %

0’dan % 37’ye kadar değişen oranlarda direnç gözlenmiştir. Enterobacteriaceae’ların

klinik kökenleri arasında ise imipenem direnci nadirdir ve bu son yapılan

çalışmalarda tüm enterik çomakların % 95’inin imipeneme duyarlı olduğu

bulunmuştur (66-70). Karbapenem antibiyotiklere karşı farklı mekanizmalarla direnç

gelişebilmektedir: bakteri dış membran proteinlerinde değişiklik sonucu

geçirgenliğin azalması, karbapenemin dışarı pompalanması, AmpC tipi beta-

laktamazların aşırı üretimi, karbapenemaz üretimi. P.aeruginosa tedavi sırasında

imipeneme direnç geliştirebilir. Bu direnç seleksiyonu, diğer beta-laktam

antibiyotiklerin seleksiyonundan farklı olarak, P.aeruginosa’nın imipeneme seçici

membran geçirgenliğinde değişiklik meydana gelmesiyle oluşur. Enterobacteriaceae

kökenlerinde imipenem direnci kromozomal beta-laktamazların yüksek düzeyde

üretilmesi ve geçirgenliğinde azalmaya bağlı olarak ortaya çıkar (71). Ancak Serratia

spp.’lerde tek başına MBL enzimi imipenem direncine yol açabilir (72).

Genel olarak imipenem ve meropenem duyarlılığının birbirine parallel olduğu

kabul edilmekte ve CLSI tarafından da her iki karbapenemin antibiyogram

değerlendirilmesinde birbirini temsil edebileceği önerilmektedir. Bal ve arkadaşları,

yaptıkları çalışmada GN bakterilerde meropenem ve imipenem duyarlılıklarını eşit

oranlarda bulmuşlardır (73). Ancak, farklı porin veya pompa-efluks sistemleri

nedeniyle imipenem ve meropenem birbirinden bağımsız duyarlılıklara sahip

olabilirler.

40

Plazmidik MBL’lar son birkaç yılda dünya genelinde hızlanan yayılmaları ile

gündemde yer tutmaktadır (3). Özellikle, NFGN basillerde IMP veya VIM tipi

MBL’ların yayılması 2 nedenle epidemiyolojik risk oluşturur. Birincisi, MBL’lar

sadece karbapenemlere değil tüm beta-laktamlara direnç oluşturabilir ve beraberinde

taşınabilen diğer direnç genleriyle aminoglikozidlere ve florokinolonlara karşı da

çoklu direnç gösterebilirler. İkincisi, IMP veya VIM tipi enzimleri kodlayan genler

sıklıkla haraketli elemanlar üzerinde taşındıklarından farklı suşlar arasında horizontal

olarak yayılabilirler (74).

Tedavilerinde karbapenem antibiyotiklerin tercih edildiği infeksiyonlarda

etkeni izole etmek kadar etkenin karbapenemaz ve MBL üretimini basit ve güvenilir

bir labaratuvar metoduyla tespit etmek de önem kazanmaktadır. Ne var ki,

ESBL’lerde olduğu gibi CLSI kriterlerine göre izolatlarda MBL üretimini tespit

etmede geçerli bir metod henüz oluşturulmamıştır. Ancak, çift disk sinerji testi,

imipenem-EDTA kombine disk testi, MBL Etest, modifiye Hodge testi gibi çeşitli

yöntemleri kullanan çalışmalar yapılmakta ve sonuçlar PCR sonuçları ile

karşılaştırılmaktadır. Bu çalışmaların bazıları olumlu sonuçlar verirken bazılarında

yalancı pozitifliğin yüksek olduğu görülmektedir. Tabii ki, farklı ülkelerde farklı

MBL prevalanslarının bu sonuçlar üzerindeki etkisi büyüktür.

Arakawa ve arkadaşları, 1999 yılında Japonya’da yaptıkları bir çalışmada IMP-

1 tipi MBL üreten GN bakterilere biri seftazidim (CAZ) diğeri ise bir MBL

inhibitörü içeren iki disk kullanarak çift disk sinerji testi uygulamışlardır. 2-

merkaptopropionik asit (MPA) ve EDTA gibi thiol bileşikleri içeren diskler

kullanılmış ve CAZ diski ile aralarında merkezden merkeze 1 - 2,5 cm mesafe

bırakılarak antibiyogram plağına yerleştirilmiştir. IMP-1 üreten suşlarda CAZ diski

ile thiol bileşiği içeren diskin arasındaki inhibisyon zonu daha genişlemişken serin

beta-laktamaz üreten suşlarda ise inhibisyon zonlarının şeklinde belirgin bir değişme

görülmemiştir. Bu testin özgüllük ve duyarlılığı PCR analizleri ile kıyaslanabilir

nitelikte bulunmuştur (75). Lee ve arkadaşlarının Kore’de yaptıkları bir çalışmada,

IMP-1 ve VIM-2 ürettiği bilinen Pseudomonas ve Acinetobacter suşlarında çift-disk

sinerji testleri için imipenem-EDTA, CAZ-MPA, CAZ-sodyum merkaptoasetik asit

(SMA) kullanılmıştır. MBL saptanmasında Pseudomonas suşları için EDTA diskleri

daha iyi, Acinetobacter suşları için MPA ve SMA diskleri daha iyi bulunmuştur.

41

EDTA+SMA diskleri, hem Pseudomonas hem de Acinetobacter suşları için EDTA,

MPA ve SMA disklerine göre daha iyi etkinlik göstermiştir (63). Oh ve arkadaşları,

iki çeşit substrat-inhibitör kombinasyonlarını (CAZ-MPA ve imipenem-EDTA)

karşılaştırmış ve imipenem-EDTA kullanan disk difüzyon testinin, VIM-2

üreticilerini saptamada yüksek düzeyde duyarlı ve özgül olduğunu bulmuştur (76).

Jesudason ve arkadaşları, karbapenemaz ve MBL üretimini tespit etmede

EDTA çift disk sinerji testini, modifiye Hodge testine göre daha duyarlı bulmuştur

(77). Lee ve arkadaşları da, MBL üreten Pseudomonas ve Acinetobacter suşlarında

modifiye Hodge testinin duyarlılığını % 100, özgüllüğünü % 88, EDTA-disk sinerji

testinin duyarlılığı ve özgüllüğünü % 100 olarak saptamışlardır (61). Modifiye Hodge

testi basit bir yöntem olmasına rağmen nadir yalancı pozitiflikleri rapor edilmiştir.

İmipenem diskine veya Mueller-Hinton agara çinko sülfat ilavesi ile bu durum

engellenebilmektedir (77).

Kore’de MBL üreten P.aeruginosa izolatlarının mikrodilüsyon testi ile

imipenem MİK’leri, EDTA ve 1,10-phenanthroline karışımının varlığında 4 kat veya

daha fazla azalırken MBL üretmeyen suşlarda hiç bir etki gözlenmemiştir (78). 2002

yılında İngiltere’de yapılan bir çalışmada, EDTA veya MPA varlığında imipenem

veya seftazidim MİK’inin azaltılması temeline dayanan Etest yöntemi farklı substrat

ve inhibitörlerle çalışılmış; EDTA’nın daha iyi bir MBL inhibitörü olduğu,

imipenem-EDTA’nın CAZ-EDTA stripinden daha iyi sonuç verdiği ve duyarlılığının

% 94 ve özgüllüğünün % 95 olduğu saptanmıştır (79).

Yan ve arkadaşları, Tayvan’da 3 fenotipik yöntemi karşılaştırdıklarında MPA

çift disk sinerji metodunun kombine disk ve Eteste göre en duyarlı yöntem olduğunu

saptamışlardır. Kombine disk yöntemi ise EDTA içeren ve içermeyen beta-laktam

disklerinin verdiği zonların karşılaştırılmasına dayanmaktadır. En iyi sonuçlar,

Pseudomonas spp. ve Acinetobacter baumanni için imipenem ile elde edilmiştir.

Kombine disk metodu % 86,7 duyarlı bulunmuştur. Etest metodu imipenem-EDTA

stripleri kullanılarak uygulanmış ve bu test yalnızca imipenem dirençli MBL-pozitif

suşları % 36,7 duyarlılık ile saptamıştır (80).

Tüm bu çalışma verilerinden görüldüğü gibi yöntemler arasındaki ufak detaylar

sonuçları oldukça etkileyebilmektedir. Genel olarak; seftazidime göre imipenemin

daha iyi bir substrat olduğu, MBL inhibitörleri içinde EDTA’nın daha başarılı

42

sonuçlar verdiği söylenebilir. MPA’in uçucu ve toksik olması da kullanımından

kaçınmayı gerektirebilir. Bu fenotipik yöntemler arasında da çift-disk sinerji testi

daha iyi görünmekle birlikte diskler arasındaki mesafenin doğru ayarlanması

gerekmektedir. Bu yüzden çalışmamızda, çift-disk sinerji testi yerine kombine disk

yöntemi ve basit olduğu için modifiye Hodge testi kullanılmıştır. İnhibitör olarak da

hazırlanması kolay olan EDTA tercih edilmiştir. Diskteki EDTA miktarının

belirlenmesi için Yong ve Pitout’un çalışmaları referans alınarak 930 µg EDTA

kullanılmıştır (64,65).

Yong ve arkadaşları, çoğunluğu VIM-2 üreten MBL-pozitif Pseudomonas ve

Acinetobacter izolatlarında imipenem-EDTA disk metodunu test etmişler, 750 ve

1000 µg EDTA içeren farklı iki kombine disk hazırlamışlardır. 750 µg EDTA içeren

diskin kullanıldığı yöntem tüm MBL üreten Pseudomonasları ayırt edebilmiş ve

Acinetobacter spp. için duyarlılığı ve özgüllüğü, sırasıyla, % 95.7 ve % 91 olarak

bulunmuştur. Pseudomonas spp.’de tüm MBL-pozitif izolatlar, EDTA eklendiğinde

≥7 mm. inhibisyon zonunda artış göstererek MBL-negatif izolatlardan iyi bir şekilde

ayrılmıştır. Tek başına kombine diskin inhibisyon zonlarının büyüklüğünün de yararlı

olduğu gösterilmiş, MBL-pozitif izolatlarda imipenem-EDTA disklerinin inhibisyon

zonları ≥17 mm iken MBL-negatif izolatlarda ≤14 mm tespit edilmiştir. Bu

çalışmada imipenem-EDTA disk metodunun basit ve oldukça duyarlı olduğu,

özgüllüğünün Pseudomonas spp. için mükemmel, Acinetobacter spp. için iyi olduğu

görülmektedir (65).

Pitout ve arkadaşları, MBL üreten P.aeruginosa izolatlarını tespit etmek için

bir EDTA disk tarama testi geliştirmişlerdir. İmipenem ve meropenem disklerinin tek

başına ve 930 µg EDTA ile kombinasyonunda, inhibisyon zon çapları belirlenmiş ve

bu testin MBL Etest ile kıyaslanabilir olduğu görülmüştür. PCR ile blaVIM ve blaIMP

genlerine sahip izolatlarda meropenem-EDTA disk tarama testi % 100 duyarlılık, %

97 özgüllük gösterirken imipenem-EDTA disk testi % 96 duyarlılık, % 91 özgüllük

göstermiştir. 930 µg EDTA varlığında ≥7 mm zon çapında artış MBL varlığı için

pozitif test olarak kabul edilmiştir. Bu çalışma, meropenemi substrat olarak kullanan

yayınlanmış ilk fenotipik tanı yöntemini kullanmıştır. Meropenemin EDTA ile

kombine edilmesinde imipenemden daha iyi bir substrat olduğunu göstermektedir

(64).

43

Bizim çalışmamız da meropenem-EDTA kombine diskini kullanan ikinci

çalışma gibi görünmektedir. Pseudomonas spp.’de meropenem-EDTA daha duyarlı

gibi görünmekle birlikte birbirlerine alternatif olabilecekleri söylenebilir.

Bu fenotipik yöntemlerin sonuçlarını değerlendirirken, o merkezlerdeki MBL

tiplerini ve prevalanslarını da dikkate almak gerekir. IMP tipi MBL’lar 1997’ye kadar

Japonya ile sınırlı kaldıktan sonra Avrupa ülkelerinde de saptanmaya başlamıştır.

VIM tipi MBL’lar Avrupa orijinli olmakla birlikte bugüne kadar 20 ülkeden

bildirilmiştir. SPM enzimi Brezilya’da, GIM ise Almanya’da sınırlı kalmıştır.

Japonya’da 1998-2002 yılları arasında bütün bölgelerde artan karbapenem direnci ve

her merkezde en az 1 MBL olgusu gözlenmiştir (81). Oh ve arkadaşları, Kore’de

imipenem ve/veya seftazidime azalmış duyarlılık gösteren 130 P.aeruginosa ve

A.baumannii suşunun 33 (% 25.4)’ünde VIM-2, ikisinde IMP-1 yapımı tespit

etmişlerdir. VIM-2’nin Kore hastanelerinde yüksek prevalansa sahip bir MBL olduğu

saptanmıştır (76). Lee ve arkadaşları, P.aeruginosa izolatlarının % 11’inin imipenem

dirençli olduğunu ve dirençli izolatlar arasında % 8.7’sinin MBL ürettiğini

göstermişlerdir (82) Kore’de 28 hastaneyi kapsayan çok merkezli bir çalışmasında ise

imipeneme duyarlı olmayan 387 Pseudomonas spp.’nin % 11.4’ünde ve 267

Acinetobacter spp.’nin % 14.2’sinde MBL üretimi ortaya konmuştur. Bu suşların

esas olarak YBÜ izolatı olmaları ve blaIMP-1 ve blaVIM-2 genlerine sahip olmaları

dikkati çekmektedir. Çalışmaya katılan hastanelerin % 61’inde MBL-üreten suşlar

tanımlanmıştır (83) Singapur’da izole edilen 4 karbapenem dirençli Pseudomonas

spp.’nin biri Japonya’da tanımlanan ile idantik blaIMP-1, ikisi yeni bir VIM geni

varyantı olarak saptanan blaVIM-6 içermiştir (84).

Polonya’da 151 imipenem direçli P.aeruginosa suşunun 11’inde VIM-4 tipi

MBL saptanmış, 4 farklı patern ve 3 subtipinin bulunduğu gösterilerek sık

görülmeyen VIM-4 MBL'ın P.aeruginosa suşlarında endemik hale geldiği ortaya

konmuştur (85). Luzzaro F ve arkadaşları İtalya’da karbapenem ve/veya seftazidim

dirençli 82 P.aeruginosa izolatında Etest MBL stripleri ile % 9.8, buyyon dilüsyon

testi ile % 13.4 olarak MBL üretimini rapor etmişlerdir (74).

Türkiye’de yapılan çalışmalar ise sınırlı sayıdadır. Genotipik çalışma ile bir

K.pneumoniae ve bir P.aeruginosa suşunda VIM-5 bulunmuştur (86,87). Türkiye’de

MBL prevalansını yansıtan uluslararası yayınlanmış iki çalışma bulunmaktadır. Ne

44

yazık ki, bunlar sadece fenotipik yöntemleri kullanmışlardır. Altoparlak ve

arkadaşları, Erzurum’da karbapenemlere dirençli 40 P.aeruginosa ve A.baumannii

suşunun imipenem-EDTA kombine disk yöntemi ile 22 (%55)’sinde pozitiflik

bulmuşlardır. İmipenem-EDTA disk testini değerlendirirken Yong ve arkadaşlarının

çalışmasını referans alarak kombine diskin etrafındaki zon çapının ≥17 mm. olmasını

pozitif, ≤14 mm. olmasını negatif kabul etmişlerdir (88). Toraman ve arkadaşları,

Elazığ’da karbapenemlere dirençli 52 P.aeruginosa izolatının 15 (%29)’inde, 24

A.baumannii suşunun 5 (%21)’inde MBL Etest ile MBL üretimini tespit etmişlerdir

(89).

Bizim çalışmamızda, karbapenem dirençli 82 izolatın 52 (% 63)’si modifiye

Hodge testi ile pozitiflik vermiştir. Pseudomonas suşlarına gore Pseudomonas dışı

NFGN basillerde pozitiflik daha fazla saptanmıştır. Yirmibeş Pseudomonas suşunun

% 12’si modifiye Hodge testi ile, % 52’si imipenem-EDTA disk testi ile, % 60’ı

meropenem-EDTA disk testi ile; 45 NFGN basil izolatının % 89’u modifiye Hodge

testi ile, % 96’sı imipenem-EDTA ve meropenem-EDTA disk testleri ile pozitiflik

vermiştir.

45

SONUÇ

İmipenem-EDTA ve meropenem-EDTA kombine diskleri ile tespit edilen

pozitiflik oranının, modifiye Hodge testi pozitifliğinden daha yüksek bulunması

EDTA kombine disk yönteminin MBL’ların taranmasında daha duyarlı olabileceğini

göstermektedir. Ancak, EDTA disk yönteminin daha iyi standardize edilmeye ve

değerlendirme kriterlerinin belirlenmesine gereksinim vardır.

GN izolatlarımızın önemli bir bölümünde, yalancı pozitiflikler olsa da,

azımsanmayacak oranda karbapenem direncinden MBL üretiminin sorumlu

olabileceği düşünülmektedir. Bu vardığımız sonuçların doğrulanması için genotipik

yöntemlerle MBL varlığının ortaya konması gerekmekte ve bu çalışma

planlanmaktadır. Böylece, genotipik çalışma verilerine göre EDTA disk yönteminin

de daha iyi yorumlanması mümkün olacaktır.

Bu basit ve ucuz fenotipik yöntemlerin tarama amaçlı kullanılması ile MBL

üreten GN basillerin yayılımın önlenmesi ve daha hızlı infeksiyon kontrolü

sağlanabilecektir.

46

ÖZET

Gram-negatif (GN) basillerin son yıllarda giderek artan karbapenem

direncinden sorumlu olabilecek yeni metallo-beta-laktamaz (MBL) enzimleri

tanımlanmakta ve sayıları artarak dünya genelinde yayılma göstermektedir. Bu

çalışmada, imipenem ve meropenem dirençli klinik izolatlarda MBL üretiminin

yerini araştırmak ve bu enzimlerin varlığını ortaya koyabilecek iki fenotipik yöntemi

test etmek ve karşılaştırmak amaçlandı. 2004-2005 yıllarında Klinik Mikrobiyoloji

laboratuarına gönderilen çeşitli klinik örneklerden izole edilen imipenem ve/veya

meropenem dirençli 82 GN basilin ilk izolatları çalışmaya alındı. Her iki

karbapeneme karşı dirençleri Etest yöntemi ile MİK bakılarak doğrulandı. Bu

suşlarda imipenem-EDTA / meropenem-EDTA disk yöntemi ve modifiye Hodge

testi ile fenotipik olarak MBL varlığı araştırıldı. EDTA disk yöntemi için Mueller-

Hinton agar besiyerinde imipenem (10 µg) ve meropenem (10 µg) diskleri ile

bunların 930 µg EDTA eklenen disklerinin inhibisyon zon çapları karşılaştırıldı.

Pseudomonas spp. ve NFGN basiller için EDTA disk testinde ≥7 mm. inhisyon zon

farkı pozitiflik kabul edildi. Otuzaltısı trakeal aspirat, 20’si idrar, 11’i yara, 9’u kan

ve diğerleri değişik materyallerden izole edilen 82 suşun 25’i Pseudomonas spp., 45’i

diğer nonfermentetif GN basiller ve 12’si enterik GN basillerdi. Suşların 52 (% 63)’si

modifiye Hodge testi ile pozitiflik verdi. Pseudomonas suşlarının 4 (% 12)’ü

modifiye Hodge testi ile, 14 (% 52)’ü imipenem-EDTA disk testi ile, 15 (% 60)’i

meropenem-EDTA disk testi ile pozitiflik verdi. NFGN basillerin 40 (% 89)’ı

modifiye Hodge testi ile, 43 (% 96)’ü imipenem-EDTA ve meropenem-EDTA disk

testleri ile pozitiflik verdi. NFGN basil izolatlarında Pseudomonas suşlarına göre,

EDTA kombine disk testi ile modifiye Hodge testine göre daha fazla sayıda fenotipik

olarak MBL-pozitifliği saptandı. GN izolatlarımızın önemli bir bölümünde

karbapenem direncinden MBL üretiminin sorumlu olabileceği düşünülerek bu

47

suşlarda genotipik yöntemlerle MBL varlığının doğrulanması planlandı. Böylece,

EDTA disk yönteminin de daha iyi yorumlanması mümkün olacak ve bu fenotipik

yöntemlerin tarama amaçlı kullanılmasıyla MBL üreten GN basillerin yayılımı

önlenerek daha hızlı infeksiyon kontrolü sağlanabilecektir.

48

KAYNAKLAR

1. Kohler T, Michea-Hamzehpour M, Epp SF, Pechere JC. Carbapenem activities

against Pseudomonas aeruginosa: respective contributions of OprD and efflux

systems. Antimicrob Agents Chemother 1999;43:424-7.

2. Pai H, Kim JW, Kim J, et al. Carbapenem resistance mechanisms in Pseudomonas

aeruginosa clinical isolates. Antimicrob Agents Chemother 2001;45:480-4.

3. Nordmann P, Poirel L. Emerging carbapenemases in Gram-negative aerobes. Clin

Microbiol Infect 2002;8:321-33.

4. Fritshe TR, Sader HS, Toleman MA, Walsh TR, Jones RN. Emerging metallo-beta-

lactamase-mediated resistances: A summary report from the worldwide SENTRY

antimicrobial surveillance program. Clin Infect Dis 2005;41:S276-8.

5. Essack SY. The development of beta-lactam antibiotics in response to the evolution

of beta-lactamases. Pharmaceutical Research 2001;18:1391-9.

6. Gür D. Hastane infeksiyonlarında önem kazanan gram-negatif bakterilerde

antibiyotiklere direnç mekanizmaları. Hastane İnfeksiyonları Dergisi 1997;1:38-45.

7. Opal SM, Medeiros AA. Molecular mechanisms of antibiotic resistance in bacteria.

In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (eds). Principles and Practice of Infectious

Diseases. Sixth edition, Pennsylvania: Elsevier Churchill Livingstone Inc,

2005:253-70.

8. Chambers HF. Penicillins. In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (eds). Principles

and Practice of Infectious Diseases. Sixth edition, Pennsylvania: Elsevier Churchill

Livingstone Inc, 2005:281-93.

9. Andes DR, Craig WA. Cephalosporins. In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (eds).

Principles and Practice of Infectious Diseases. Sixth edition, Pennsylvania: Elsevier

Churchill Livingstone Inc, 2005:294-311.

10. Harold C, Neu M D. Relation of structural properties of beta-lactam antibiotics to

antibacterial activity. Am J Med 1985;(Suppl 2A):2-13.

11. Livermore DM, Woodford N. Carbapenemases: a problem in waiting?. Curr Opin

Microbiol 2000;3:489-95.

49

12. Bonfiglio G, Russo G, Nicoletti G. Recent developments in carbapenems. Expert

Opin Investig Drugs. 2002;11(4):529-44.

13. Basoli A, Az M, Mazzocchi P, Speranza V, and study group. Iimipenem/silastatin

(1,5 g daily) versus Meropenem (3,0 g daily) in patients with intraabdominal

infections: Results of prospective, randomized, multicentre trial. Scand J Infect Dis

1997;29:503-8.

14. Bimbaum J, Kahan FM, Kroop H. Carpapenems, a new class of beta-lactam

antibiotics: Discovery and development of imipenem-cilastatin. Am J Med

1985:78(Suppl 6A):3-21.

15. Nikaido H. Role of permeability barriers in resistance to beta-lactam antibiotics.

Pharmacol Ther 1985;27:197-231.

16. Endtz HP, Dijk WC, Verbrugh HA and Mustin Study Group. Comparative in vitro

activitiy of meropenem against selected pathogens from hospitalized patients in the

Netherlans. J Antimicrob Chemother 1997;39:149-56.

17. Yang Y, Bhached N, Bush K. Biochemical comparison of imipenem, meropenem

and biapenem: Permeability, binding to penicillin-binding proteins, and stability to

hydrolysis by beta-lactamases. J Antimicrob Chemother 1995;35:75-84.

18. Jackson JJ, Kroop H. Beta-lactam antibiotics induced release of free endotoxin: In-

vitro comparison of penicillin-binding protein (PBP)2-specific imipenem and PBP3-

specific ceftazidim. J Infect Dis 1992;165:1033-41.

19. Gudmundsson S, Erlendsdttir H, Gattfrendsson M, Gudmundsson A: The

postantibiotics effect induced by antimicrobial combinations. Scand J Infect Dis

1990;74:80-93.

20. Yoshimura F, Nikaido H. Diffusion of beta-lactam antibiotics. Pharmacol Ther

1985;27:197-231.

21. Dreetz M, Hamacher J, Eller J, et al. Serum bactericidal activities and comperative

pharmakokinetics of meropenem and imipenem-cilastatin. Antimicrob Agents

Chemother 1996;40:105-9.

22. Edwards JR. Meropenem: a microbiological overview. J Antimicrob Chemother

1995;36(Suppl A):1-17.

50

23. White Friedrich L, Burgess D, Warkentın D, Bosso J. Comperative in vitro

pharmacodynamics of imipenem and meropenem against Pseudomonas aeruginosa.

Antimicrob Agents Chemother 1996;40(4).904-8.

24. Gür D. Beta-laktamazlar. Flora 1997;283:3-16.

25. Yang, Livermore DM. Interactions of meropenem with class C chromozomal beta-

lactamases. J Antimicrob Chemother 1989;24(Suppl A):187-96.

26. Kitzis MD, Acar JF, Gutmann L. Antibacterial activity of meropenem against gram-

negative bacteria with a permeability defect and against staphylococci. J Antimicrob

Chemother 1989;24 (suppl A):125-32.

27. Sumita Y, Fukasawa M, Okuda T. Comparison of two carpapenems, SM-7338 and

imipenem: affinities for penicillin-binding proteins and its release from these

proteins in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents and Chemother

1990;34(3):484-6.

28. Gür D. Gram-Negatif Bakterilerde Antibakteriyel Direnç Mekanizmaları. In: Ulusoy

S, Leblebicioğlu H, Arman D (editörler). Önemli ve sorunlu gram-negatif bakteri

infeksiyonları. Ankara, 2004:69-83.

29. Malouin F, Bryan LE. Modification of penicillin-binding proteins as mechanisms of

beta-lactam resistance. Antimicrob Agents Chemother 1986;30:1-5.

30. Spratt BG. Resistance to beta-lactam antibiotics mediated by alterations of

penicillin-binding proteins. In: Bryan LE (Ed.). Handbook of Experimental

Pharmacology. Berlin: Springer-Verlag, 1989:77-100.

31. Livermore DM. Mechanisms of resistance to beta-lactam antibiotics. Scand J Infect

Dis 1991;(Suppl 78):7-16.

32. Sanders CC. Beta-lactamases of gram-negative bacteria: New challenges for new

drugs. Clin İnfect Dis 1992;14:1089-99.

33. Sanders CC, Sanders WE. Beta-lactam resistance in gram-negative bacteria: Global

trends and clinical impact. Clin Infect Dis 1992;15:824-39.

34. Bradford PA. Extended-spectrum beta-lactamases in the 21 st century:

Charactarization, epidemiology and detection of this important resistance threat.

Clin Microbial Rev 2001;14:933-51.

51

35. Cornaglia G, Mazzariol A, Fontana R. The astonishing complexity of antibiotics

resistance. Clin Microbial Infect 2000;6(Suppl 3):93-4.

36. Pool K. Resistance to beta-lactam antibiotics. Cell Mol Life Sci 2004;61:2200-23.

37. Gür D. Beta-laktamazların sınıflandırılması. Flora Dergisi 1996,1:80-6.

38. Bush K, Jacoby GA, Medeiros AA. A functional classification scheme for beta-

lactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob Agents

Chemother 1995;39:1211-33.

39. Livermore DM. Beta-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin

Microbial Rev 1995;8:557-84.

40. Gür D. Hastane infeksiyonlarında önem kazanan gram-negatif bakterilerde

antibiyotiklere direnç mekanizmaları. Hastane İnfeksiyonları Dergisi 1997;1:38-45.

41. Medeiros AA. Evolution and dissemination of beta-lactamases accelerated by

generations of beta-lactam antibiotics. Clin Infect Dis 1997;24,19-45.

42. Yuluğ N. Beta-laktamazlar ve klinik açıdan önemi. ANKEM Derg 1997;11:205-7.

43. Livermore DM. Beta-lactamase mediated resistance and opportunities for its

control. J Antimicrob Chemother 1998;41(Suppl D):24-41.

44. Danel F, Hall LMC, Gür D, Akalın HE, Livermore DM. Transferable production of

PER-1 beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa. J Antimicrob Chemother

1995;35:281-94.

45. Vahapoğlu H, Hall LM, Mülazımoğlu L, et al. Resistance to extended spectrum

cephalosporins, caused by PER-1 beta-lactamase in Salmonella typhimurium from

Istanbul, Turkey. J Med Microbiol 1995;43:294-9.

46. Hall LMC, Livermore DM, Gür D, Akova M, Akalın HE. OXA-11, an extended

spectrum variant of OXA-10(PSE-)beta-lactamase from Pseudomonas aeruginosa.

Antimicrob Agents Chemother 1993;37:1637-44.

47. Amyes SGB. Carbapenemases. ANKEM Dergisi 1997;11(2):221-5.

48. Hancock REW. Resistance mechanisms in Pseudomonas aeruginosa and other

nonfermentative gram-negative bacteria. Clin Infect Disease 1989;27(Suppl 1):93-9.

49. Lee EH, Nicolas MH, Kitzis MD, et al. Association of two resistance mechanisms

in a clinical isolate of Enterobacter cloacae with high-level resistance to imipenem.

Antimicrob Agents Chemother 1991;35:1093-8.

52

50. Bradford PA, Urban C, Mariano N, et al. İmipenem resistance in Klebsiella

pneumonia is associated with the combination of ACT-1, a plasmid-mediated AmpC

beta-lactamase, and loss of an outer membrane protein. Antimicrob Agents

Chemother 1997;41:563-9.

51. Rasmussen BA, Bush K. Carbapenem-hydrolizing beta-lactamases. Antimicrob

Agents Chemother 1997;41:223-32.

52. Minami S, Akama M, Araki H, et al. Imipenem and cephem resistant Pseudomonas

aeruginosa carrying plasmids coding for class B beta-lactamase. J Antimicrob

Chemother. 1996;37:433-4.

53. Watanabe M, Iyobe S, Inone M, Mitsuhashi S. Trasferable imipenem resistance in

Pseudomonas aeruginosa Antimicrob Agents Chemother 1991;35:147-51.

54. Bush K. New beta-lactamases in gram-negative bacteria: Diversity and impact on

the selection of antimicrobial therapy. Clin Infect Dis 2001;32:1085-9.

55. Bal Ç. Beta-laktamazlar: güncel durum. Flora 2003;8(2):111-23.

56. Osano E, Arakawa Y, Wacharotayankun R, et al. Molecular characterization of an

enterobacterial metallo-beta-lactamase found in a clinical isolate of Serratia

marcescens that shows imipenem resistance. Antimicrob Agents Chemother

1994;38:71-8.

57. Riccio ML, Franceschini N, Boschi L, et al. Characterization of the metallo-beta-

lactamase determinant of Acinetobacter baumannii AC-54/97 reveals the existence

of blaIMP allelic variants carried by gene cassettes of different phylogeny.

Antimicrob Agents Chemother 2000;44:1229-35.

58. Özsoy MF, Öncül O, Yıldırım A, Pahsa A. Genişletilmiş-spektrumlu beta-

laktamazlar: klinik önemi ve getirdiği sorunlar. Flora 2001;6(Ek1):3-23.

59. Lauretti L, Riccio ML, Mazzariol A, et al. Cloning and characterization of blaVIM,

a new integron-borne metallo-beta-lactamase gene from a Pseudomonas aeruginosa

clinical isolate. Antimicrob Agents Chemother 1999;43:1584-90.

60. Bush K. Metallo-beta-lactamases: A Class Apart. Clin Infect Dis 1998;(Suppl

1):S48-53.

53

61. Lee K, Chong Y, Shin HB, et al. Modified Hodge test and EDTA-disk synergy tests

to screen metallo-B-lactamase-producing strains of Pseudomonas and Acinetobacter

species. Clin Microbiol Infect 2001;7:88-91.

62. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for

Antimicrobial Susceptibility Testing; Fifteenth Informational Supplement. CLSI

document M100-S15. Clinical and Laboratory Standard Institute, Pennsylvania

USA, 2005.

63. Lee K, Lim YS, Yong D, Yum JH, Chong Y. Evaluation of the Hodge test and the

imipenem-EDTA double-disk-synergy test for differentiating metallo-beta-

lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp. J Clin

Microbiol 2003;41:4623-9.

64. Pitout JD, Gregson DB, Poirel L, et al. Detecting of Pseudomonas aeruginosa

producing metallo-beta-lactamases in a large centralized laboratory. J Clin

Microbiol 2005; 43(7):3129-35.

65. Yong D, Lee K, Yum JH, et al. Imipenem-EDTA disk method for differentiation of

metallo-beta-lactamase-producing clinical isolates of Pseudomonas spp. And

Acinetobacter spp. J Clin Microbiol 2002;40(10):3798-801.

66. Şanlıdağ T, Çakır N, Özçelik S, Çeliksöz A, Saygı G. Hastane kaynaklı

infeksiyonlardan soyutlanan Pseudomonas aeruginosa suşlarına antipseudomonal

antibiyotiklerin in vitro etkinliği. 11. Antibiyotik ve Kemoterapi (ANKEM)

Kongresi, Ankem Derg 1996;10(2):101.

67. Koşan E, Kocabeyoğlu Ö, Özcan Ş, ve ark. Meropenem ile imipenemin in vitro

olarak gram-negatif bakteriler üzerine etkinliğinin karşılaştırma olarak araştırılması.

11. Antibiotik ve Kemoterapi (ANKEM) Kongresi, ANKEM Derg 1996,10(2):102.

68. Öztürk R, Köksal F, Eroğlu C, et al. The resistance pattern of Acinetobacter species.

10th Mediterranean Congress of Chemotherapy, Antalya,1996

69. Nas Y, Sünbül M, Saniç A, Günaydın M, Leblebicioğlu H. Enterobacteriaceae ve

Pseudomonas aeruginosa suşlarında antibiyotik direncinin E test ile belirlenmesi.

11. Antibiyotik ve Kemoterapi (ANKEM) Kongresi, ANKEM Derg 1996;10(2):100

70. Gençer S, Ak Ö, Benzonana N, Batırel A, Özer S. Susceptibility patterns and cross

resistances of antibiotics against Pseudomonas aeruginosa in a teaching hospital of

Turkey. Ann Clin Microbiol Antimicrob 2002;I:2.

54

71. Champs C, Henguell C, Guelon D, et al. Clinical and bacterilogical study of

nosocomial infections due to Enterobacter aerogenes resistant to imipenem. J Clin

Microbiol 1993;31(1):123-7.

72. Erdeniz H, Derbentli Ş. Klinik örneklerden izole edilen gram-negatif çomak

şeklindeki bakterilerde antibiyotik direnci. ANKEM Derg 1995;90-94.

73. Bal Ç, Bauernfeind A, Aydın AE, Anğ Ö. Çoğul dirençli Klebsiella pneumonia

suşlarında plazmidik sefamisinaz CMY 2. İnfeks Derg 1995;9(1-2):67-9.

74. Luzzaro F, Endimiani A, Docquier JD, et al. Prevalance and characterization of

metallo-beta-lactamases in clinical isolates of pseudomonas aeruginosa. Diag

Microbiol Infect Dis 2004;48(2):131-5.

75. Arakawa Y, Shibata N, Shibayama K, et al. Convenient test for screening metallo-

beta-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds. J Clin

Microbiol 2000;38(1):40-3.

76. Oh EJ, Lee S, Park YJ, et al. Prevalence of metallo-beta-lactamase among

Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii in a Korean university

hospital and comparison of screening methods for detecting metallo-beta-lactamase.

J Microbiol Methods. 2003;54(3):411-8.

77. Jesudason MV, Kandathil AJ, Balaji V. Comparison of two methods to detect

carbapenemase and metallo-beta-lactamase-production in clinical isolates. Indian J

Med Res 2005;121:780-3.

78. Migliavacca R, Docquier JD, Mugnaioli C, et al. Simple microdilution test for

detection of metallo-beta-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa. J Clin

Microbiol 2002;40:4388-90.

79. Patzer J, Toleman MA, Deshpande LM, et al. Pseudomonas aeruginosa strains

harbouring an unusual blaVIM-4 gene cassette isolated from hospitalized children

in Poland (1998-2001). J Antimicrob Chemother 2004;53(3):451-6.

80. Yan JJ, Wu JJ, Tsai SH, Chuang CL. Comparison of the double-disk, combined

disk, and Etest methods for detecting metallo-beta-lactamases in gram-negative

bacilli. Diagn Microbiol Infect Dis 2004;49(1):5-11.

81. Jones RN, Deshpande LM, Bell JM, et al. Evaluation of the contemporary

occurrencerates of metallo-b-lactamase in multidrug-resistant Gram-negative bacilli

55

in Japan: report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (1998-

2002). Diag Microbiol Infect 2004;49:289-94.

82. Lee K, Lim JB, Yum JH, et al. blaVIM-2 cassette-containing novel integrons in

metallo-beta-lactamase-producing Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas

putida isolates disseminated in a Korean Hospital. Antimicrob Agents Chemother

2002;46:1053-8.

83. Lee K, Lee WG, Uh Y, et al. VIM- ve IMP- tipi matallo-beta-lactamase producing

Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp. in Korean Hospitals. Emerg Infect Dis

2003;9:868-71.

84. Koh TH, Wang GC, Sng LH. IMP-1 and novel metallo-beta-lactamase, VIM-6, in

fluorescent pseudomonas isolated in Singapore. Antimicrob Agents Chemother.

2004;48(6):2334-6.

85. Walsh TR, Balmström A, Owarnström A, Gales A. Evaluation of a new Etest for

detecting metallo-beta-lactamases in routine clinical testing. J Clin Microbiol

2002;40:2755-9.

86. Midilli K, Aygün G, Kuşkucu M, ve ark. Bir K.pneumoniae kökeninde saptanan

yeni bir metallo-beta-laktamaz varyantı: VIM-5. XI.KLİMİK Kongresi,

İstanbul,2003. Bildiri no:S-21.

87. Bahar G, Mazzariol A, Koncan R, et al. Detection of VIM-5 metallo-beta-lactamase

in a Pseudomonas aeruginosa clinical isolate from Turkey. J Antimicrob Chemother

2004;54:282-3.

88. Altoparlak U, Aktas F, Celebi D, Ozkurt Z, Akcay MN. Prevalence of metallo-beta-

lactamase among Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii isolated

from burn wounds and in vitro activities of antibiotic combinations against these

isolates. Burns 2005;31:707-10.

89. Toraman ZA, Yakupogulları Y, Kizirgil A. Detection of metallo-beta-lactamase

production and antibiotic resistance with Etest method in Pseudomonas,

Acinetobacter and Klebsiella strains in Turkey. J Infect Chemother 2004;10:257-61.

56