karakterisasi molekuler bakteri isolat …digilib.unila.ac.id/60409/3/3. skripsi full tanpa...
TRANSCRIPT
KARAKTERISASI MOLEKULER BAKTERI ISOLAT LOKAL
TERPILIH ASAL LIMBAH SINGKONG DENGAN METODE 16S rRNA
(Skripsi)
Oleh
Widya Kusuma
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS LAMPUNG
BANDAR LAMPUNG
2019
ABSTRACT
MOLECULAR CHARACTERIZATION OF LOCAL ISOLATE BACTERIA
SELECTED FROM CASSAVA WASTE WITH 16S rRNA METHOD
By
Widya Kusuma
Lampung province has a number of cassava production at 7,384,084 tons. The
increasing of cassava production related to the increase in cassava waste
automatically. Indirectly one of the main waste of cassava industry is cassava peel.
Cassava peel consists of components such as cellulose and amylum, so that, this
material could be as a medium for bacterial growth such as cellulolytic and
amylolytic bacteria. This research aims to characterize the molecular of local
isolate bacteria that selected in cassava waste indigenously, conducted by 16S
rRNA method and identify the type or species through phylogenetic analysis. The
results of DNA isolation obtained DNA from cell culture of SCWB1 and SCWB17
were 33.9 ng/µl and 218 ng/µl respectively. The purity of isolated DNA was
examined by comparing absorbance of λ260/280 and λ260/230. Our result show
that the value of comparison for SCWB1 were 2,061 and 2,519, since for SCWB17
were 1,904 and 1,585 respectively. Amplicons appear for both of isolates had DNA
fragment at ± 1500 bp. Based on BLAST analysis on NCBI and phylogenetic tree
construction it was noted that SCWB1 isolates have a percent identity of 97.73%
connected to Bacillus cereus strains IAM 12605 and SCWB17 isolates has a
percent identity of 97.90% connected to Klebsiella variicola strains F2R9.
Keywords: Cassava waste, 16S rRNA, Bacillus cereus, Klebsiella variicola
ABSTRAK
KARAKTERISASI MOLEKULER BAKTERI ISOLAT LOKAL
TERPILIH ASAL LIMBAH SINGKONG DENGAN METODE 16S rRNA
Oleh
Widya Kusuma
Provinsi Lampung memiliki angka produksi singkong sebesar 7.384.084 ton.
Meningkatnya produksi singkong menyebabkan peningkatan pada jumlah limbah
singkong. Limbah utama dari industri singkong adalah kulit singkong. Kulit
singkong mengandung komponen seperti selulose dan amilum, sehingga dapat
dijadikan suatu media bagi pertumbuhan bakteri seperti bakteri selulolitik dan
amilolitik. Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi molekuler isolat lokal
terpilih asal limbah singkong indigenous yang dilakukan dengan metode 16S
rRNA dan ditentukan jenis atau spesiesnya melalui analisis filogenetik. Hasil
isolasi DNA menunjukkan bahwa isolat SCWB1 memiliki konsentrasi sebesar
33,9 ng/µl dan isolat SCWB17 memiliki konsentrasi sebesar 218 ng/µl. Hasil
kemurnian DNA dari isolat SCWB1 adalah 2,061 pada λ260/280 dan 2,519 pada
λ260/230. Sementara pada isolat SCWB17 diperoleh hasil yaitu 1,904 pada
λ260/280 dan 1,585 pada λ260/230. Amplikon menunjukkan bahwa kedua isolat
memiliki fragmen DNA yang berukuran ± 1500 bp. Berdasarkan analisis BLAST
pada situs NCBI dan konstruksi pohon filogenetik dapat disimpulkan bahwa isolat
SCWB1 memiliki nilai percent identity 97,73% terhadap Bacillus cereus strain
IAM 12605 dan isolat SCWB17 memiliki nilai percent identity 97,90% terhadap
Klebsiella variicola strain F2R9.
Kata kunci : Limbah singkong, 16S rRNA, Bacillus cereus, Klebsiella variicola
KARAKTERISASI MOLEKULER BAKTERI ISOLAT LOKAL TERPILIH
ASAL LIMBAH SINGKONG DENGAN METODE 16S rRNA
Oleh
WIDYA KUSUMA
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar
SARJANA SAINS
Pada
Jurusan Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Lampung
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS LAMPUNG
BANDAR LAMPUNG
2019
RIWAYAT HIDUP
Penulis bernama lengkap Widya Kusuma dan dilahirkan di
Tulang Bawang pada tanggal 4 Februari 1997. Penulis
merupakan anak kedua dari tiga bersaudara dari pasangan
Bapak Untung Supriyono (Alm) dan ibu Esti Karyani.
Penulis beralamat di Jl. KS Tubun No. 38 Rawa Laut,
Bandar Lampung.
Penulis memiliki jenjang pendidikan diawali dari Taman Kanak-Kanak (TK)
ABA Aisyiyah Purbolinggo dan lulus pada tahun 2003. Kemudian melanjutkan
pendidikan di Sekolah Dasar (SD) Negeri 3 Taman Fajar dan lulus pada tahun
2009. Lalu melanjutkan pendidikan di Sekolah Menengah Pertama (SMP) Negeri
1 Purbolinggo dan lulus pada tahun 2012. Selanjutnya melanjutkan pendidikan
di Sekolah Menengah Kejuruan (SMK) SMTI (Sekolah Menengah Teknologi
Industri) Bandar Lampung dan lulus pada tahun 2015. Pada tahun 2015, penulis
terdaftar sebagai mahasiswi Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam (FMIPA) Universitas Lampung melalui jalur Seleksi Bersama
Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SBMPTN) dan merupakan salah satu penerima
beasiswa BIDIKMISI angkatan ke enam Universitas Lampung dan berhasil
menyelesaikan S1 pada tahun 2019.
Selama menjadi mahasiswa, penulis pernah menjadi asisten praktikum Kimia
Dasar I dan Kimia Dasar II Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung. Pada
bulan januari 2018, penulis melaksanakan Praktik Kerja Lapangan (PKL) di Balai
Pengujian Mutu dan Sertifikasi Produk Hewan (BPMSPH) Bogor dengan judul
“Identifikasi Spesies Babi (Pork) Pada Kornet Menggunakan Metode Cepat
(Rapid Test), Metode Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), dan
RealTime-PCR (Polymerase Chain Reaction)”. Penulis juga melaksanakan
Kuliah Kerja Nyata (KKN) selama 32 hari di Desa Jaya Murni, Kecamatan
Gunung Agung, Kabupaten Tulang Bawang Barat pada bulan Juli-Agustus tahun
2018. Penulis juga aktif dalam organisasi yang dimulai dengan menjadi anggota
Garuda BEM FMIPA tahun 2015, Kader Muda Himaki (KAMI) tahun 2015,
anggota Bidang Sosial Masyarakat (SOSMAS) Himaki FMIPA Unila tahun 2016,
dan menjadi anggota PSLH BEM FMIPA Unila tahun 2016 serta penulis kembali
menjadi anggota Bidang Sosial Masyarakat (SOSMAS) Himaki FMIPA Unila
periode 2017.
Motto
"Sesungguhnya Allah tidak akan mengubah nasib suatu kaum hingga mereka
mengubah diri mereka sendiri” (QS. Ar-Ra’d:11)
“Life is a choice, but trust in God's will ” (Widya Kusuma)
“Maka sesungguhnya bersama kesulitan ada kemudahan. Maka apabila engkau
telah selesai (dari suatu urusan), tetaplah bekerja keras (untuk urusan yang lain),
dan hanya kepada tuhanmulah engkau berharap”
(QS. Al-Insyirah 6-8)
“Allah tidak membebani seseorang itu melainkan sesuai dengan kesanggupannya”
(QS. Al-Baqarah: 286)
"Dan boleh jadi kamu membenci sesuatu tetapi ia baik bagimu, dan boleh jadi
kamu menyukai sesuatu tetapi ia buruk bagimu, dan Allah mengetahui dan
kamu tidak mengetahui“
(QS. Al-Baqarah:216)
“Bila kau tak tahan lelahnya belajar, maka kau harus tahan menanggung perihnya
kebodohan”
(Imam Syafi’i)
Dengan menyebut nama Allah yang Maha pengasih
lagi Maha penyayang
Puji syukur kepada Allah SWT atas limpahan rahmat dan karunia-Nya, sehingga
terciptalah sebuah karya tulis sederhana ini yang kupersembah kan untuk :
Orang tuaku
Bapak Untung Supriyono (Alm) dan Ibu Esti Karyani serta Bapak Hadi tersayang,
Terimakasih atas segala cinta, kasih sayang, dukungan, kekuatan serta pengorbanan yang
selalu diberikan dalam setiap langkahku untuk meraih kesuksesan dalam hidup ini.
Terimakasih atas kebahagiaan yang telah diberikan selama ini, karena doa yang tiada henti
dari kalianlah aku bisa berdiri sampai titik ini.
Saudara-Saudaraku tersayang,
Kakakku Savela Utari dan adikku M. Aryono Siraj tersayang, yang selalu mendukung dan
mendoakanku, serta memberikan kekuatan padaku, sehingga aku bisa sampai pada titik ini.
Keluarga besarku yang selalu mendoakan kesuksesan dan keberhasilanku.
Ibu Dr. Nurhasanah, M.Si., Bapak Dr. Eng. Heri Satria, M.Si., dan Bapak Andi Setiawan, Ph.D., yang telah membimbing dan memeberikan ilmu kepada penulis selama
mengerjakan penelitian dan skripsi, serta Bapak dan Ibu Dosen Jurusan Kimia
FMIPA Unila yang telah memberikan ilmu pengetahuan dan dukungan kepada
penulis.
Seluruh sahabat dan teman-teman yang telah mengajarkan arti kebersamaan, kekeluargaan, dan kebahagiaan.
Almamater Tercinta Universitas Lampung
SANWACANA
Alhamdulillahhirabbilalamiin, puji syukur penulis ucapkan atas kehadirat Allah
SWT karena berkat rahmat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi
yang berjudul “Karakterisasi Molekuler Bakteri Isolat Lokal Terpilih Asal
Limbah Singkong Dengan Metode 16S rRNA” sebagai salah satu syarat untuk
memperoleh gelar Sarjana Sains pada program studi Kimia FMIPA Universitas
Lampung.
Sholawat serta salam tak lupa penulis ucapkan kepada suri tauladan Nabi
Muhammad SAW beserta para sahabat dan keluarganya, semoga kita termasuk
umatnya yang mendapat syafa’at beliau di yaumilakhir kelak, Aamiin.
Penyusunan skripsi ini telah terselesaikan dengan baik berkat bantuan dan
dukungan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini izinkanlah penulis
menghaturkan ucapan terima kasih. Jazakumullahu Khairan Katsiran Wa
Jazakumullah Ahsanal Jaza kepada:
1. Orang tuaku, Bapak Untung (Alm), Bapak Hadi dan ibu Esti tercinta serta
mbah ibu dan mbah kung (Alm) atas kasih sayang, dukungan, bantuan, doa,
dan segala pengorbanan yang telah diberikan kepada penulis, semoga Allah
senantiasa melimpahkan segala kebaikan kepada kalian, Aamiin yarobbal
alamiin.
2. Kakakku Savela Utari dan adikku Muhammad Aryono Siraj yang telah
memberikan dukungan, kasih sayang, doa, dan canda tawa yang mengisi hari-
hariku saat suka maupun duka.
3. Keluarga keduaku Bulek Yanti, Om Ika, Nadya dan Ganta, serta Bude sri, Pak
Santoso, mba Atid, dan mas Seno yang telah memberikan bantuan, dukungan,
doa, kasih sayang, dan segala pengorbanan untuk penulis.
4. Keluarga besar penulis yang tak pernah berhenti mendukung dan memberikan
doa sehingga menjadi semangat tersendiri bagi penulis.
5. Ibu Dr. Nurhasanah, M.Si., selaku pembimbing 1 yang telah dengan sabar
memberikan ilmu, membimbing, memberikan nasihat, serta kritik dan saran
yang membangun bagi penulis dalam menyelesaikan penulis dalam
menyelesaikan skripsi ini.
6. Bapak Dr. Eng. Heri Satria, M.Si., selaku pembimbing II yang dengan sabar
memberikan ilmu, membimbing, memberikan nasihat, serta kritik dan saran
yang membangun bagi penulis dalam menyelesaikan penulis dalam
menyelesaikan skripsi ini.
7. Bapak Andi Setiawan, Ph.D., selaku pembahas dalam penelitian yang telah
memberikan ilmu, nasehat, kritik dan saran kepada penulis sehingga skripsi ini
dapat terselesaikan dengan baik.
8. Bapak Mulyono, Ph.D., selaku pembimbing akademik yang telah memberikan
bimbingan, bantuan serta nasehat kepada penulis.
9. Bapak Dr. Eng. Suripto Dwi Yuwono, M.T., selaku ketua Jurusan Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.
10. Bapak dan ibu Dosen Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung yang telah
memberikan ilmu pengetahuan dan dukungan kepada penulis.
11. Bapak Drs. Suratman, M.Sc., selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Universitas Lampung.
12. Bapak Wawan A. Setiawan, M.Si., dan mba Maria Bramastri Susilo, S.Si.,
yang telah membantu dan membimbing seta memberikan ilmu selama proses
penelitian berlangsung.
13. Segenap staff dan karyawan Jurusan Kimia dan FMIPA Universitas Lampung,
khususnya Pak Gani dan mba Monic atas segala bantuan yang telah diberikan
kepada penulis.
14. Kepala dan segenap staff serta karyawan Unit Pelayanan Teknis Laboratorium
Terpadu dan Sentra Inovasi Teknologi Universitas Lampung atas segala
bantuan yang telah diberikan kepada penulis.
15. Seluruh guru-guruku dari TK, SD, SMP, dan SMA atas segala ilmu,
pengalaman, nasehat dan motivasi yang diberikan kepada penulis.
16. Somplaak-ku tercinta, Meitri Ayu Ningrum, S.Si., Yesi Oktiara Kasih, S.Si.,
Dira Avista, S.Si., Elsina’Azmi, S.Si., Meynisa Zunaidar, S.Si., Fatry Sinjia,
S.Si., Nur Wulandari, S.Si., Hani Chintia Ramadani, S.Si., dan Zuwita
wulandari, S.Si., Terimakasih karena telah memberikan arti pertemanan yang
sesungguhnya, terimakasih atas segala rasa yang telah diberikan, kita akan
selalu terikat satu sama lain kapanpun dan dimanapun kita berada.
17. CCA-ku tercinta, Meitri Ayu Ningrum, S.Si., Dira Avista, S.Si., Intan
Tsamrotul Fu’adah, S.Si., Sri Budi Asih, S.Si., Alifa Dyah Savira, S.Si., Nadya
Syarifatul Fajriah, S.Si., Aulia Yulanda, S.Si., Nurmala, S.Si., dan Tri Agus
18. Wijayanti, S.Si., Terimakasih karena telah memberikan arti pertemanan yang
sesungguhnya, terimakasih atas segala rasa yang telah diberikan, kita akan
selalu terikat satu sama lain kapanpun dan dimanapun kita berada.
19. Nurhasanah Squad 2015, Meitri Ayu Ningrum, S.Si., Viky Dila Cahyani, S.Si.,
Intan Tsamrotul Fu’adah, S.Si., dan Siwi Meutia Sadewi, S.Si., Terimakasih
atas bantuan, doa, kritik dan saran serta suka dan duka yang telah diberikan
kepada penulis dalam menyelesaikan penelitian dan skripsi ini.
20. Cassava Squad 2015, Melina Putri Ahmad, S.Si., Widya Susanti, S.Si., Rani
Fitria, S.Si., Dwi Nurhayati, S.Si., Desi Damayanti, S.Si., dan Uhti Alaika,
S.Si., Terimakasih atas bantuan, doa, kritik dan saran serta suka dan duka yang
telah diberikan kepada penulis dalam menyelesaikan penelitian dan skripsi ini.
21. Biokim Research 2014, 2015, dan 2016 khusunya Leony Fransiska, S.Si.,
Asrul Fanani, S.Si., dan Angga Hidayatullah Eza, S.Si., terimakasih atas segala
bantuan dan dukungannya untuk penulis selama proses penelitian berlangsung.
22. LTSIT Research khususnya Jevi Muhammad Anwar dan Oklis Syahrin Wijaya
yang telah banyak membantu saat proses penelitian berlangsung.
23. Keluarga Chem15try Unila khususnya Kelas C, terimakasih atas
kebersamaannya selama penulis menempuh pendidikan di jurusan kimia.
24. Keluarga Besar Mahasiswa Kimia angkatan 2011, 2012, 2013, 2014, 2015,
2016, 2017, 2018,dan 2019, atas kebersamaan dan kekeluargaan yang terjalin
selama ini.
25. Teman-teman Kuliah Kerja Nyata (KKN) Jaya Murni, Gunung Agung, Tulang
Bawang Barat, yang telah memberikan doa dan dukungan kepada penulis.
26. Keluarga SMK SMTI Bandar Lampung khusunya Kimia Industri I, terimakasih
atas segala doa dan dukungannyayang telah diberikan selama ini kepada
penulis.
27. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang secara tulus
dan ikhlas memberikan bantuan moril dan materil kepada penulis.
28. Almamaterku tercinta, Universitas Lampung.
Terimakasih atas segala bantuan yang telah diberikan, semoga ALLAH SWT
membalasnya dan menjadi ladang pahala bagi kita semua, Aamiin. Penulis
menyadari bahwa masih banyak terdapat kekurangan dalam skripsi ini, namun
penulis berharap skripsi ini bermanfaat bagi rekan-rekan khususnya mahasiswa
kimia dan pembaca pada umumnya.
Bandar Lampung, Desember 2019
Penulis
Widya Kusuma
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL .................................................................................................iii
DAFTAR GAMBAR .............................................................................................iv
I. PENDAHULUAN..........................................................................................1
A. Latar Belakang ...........................................................................................1
B. Tujuan Penelitian .......................................................................................4
C. Manfaat Penelitian .....................................................................................4
II. TINJAUAN PUSTAKA................................................................................6
A. Singkong ....................................................................................................6
B. Bakteri Selulolitik ......................................................................................6
C. Bakteri Amilolitik ......................................................................................7
D. Isolasi DNA ...............................................................................................8
E. Identifikasi Molekuler................................................................................9
F. Polymerase Chain Reaction (PCR) .......................................................... 12
G. Sekuensing ................................................................................................16
H. Analisis Filogenetik .................................................................................18
I. Program MEGA7 .....................................................................................20
ii
III. METODE PENELITIAN............................................................................22
A. Waktu dan Tempat Penelitian ..................................................................22
B. Alat dan Bahan.........................................................................................22
C. Prosedur Kerja..........................................................................................23
a. Pembuatan Media Kultur Cair. . ...........................................................23
b. Isolasi DNA..........................................................................................23
c. Analisis Kemurnian Hasil Isolasi DNA...............................................25
d. Amplifikasi Gen 16S rRNA ................................................................25
e. Penentuan Urutan DNA (Sekuensing)..................................................26
f. Analisis Filogenetik..............................................................................26
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN..................................................................29
A. Ekstrak DNA..........................................................................................29
B. Kemurnian Ekstrak DNA .......................................................................30
C. Amplikon Fragmen Gen 16S rRNA.......................................................32
D. Urutan Nukleotida Fragmen Gen 16S rRNA......................................34
E. Pohon Filogenetik..................................................................................39
V. SIMPULAN DAN SARAN.........................................................................45
A. Simpulan...................................................................................................45
B. Saran ........................................................................................................46
DAFTAR PUSTAKA..........................................................................................47
LAMPIRAN ........................................................................................................52
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. RNA Ribosomal pada prokariot.….................................................................10
2. Primer Universal 16S rRNA...........................................................................13
3. Hasil Nanophotometer....................................................................................31
4. PCR Mix Solution...........................................................................................32
5. Tahapan PCR…..............................................................................................33
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Struktur 16S rRNA .........................................................................................11
2. Siklus Amplifikasi ..........................................................................................16
3. Tampilan Pohon Filogenetik ..........................................................................20
4. Tampilan Menu MEGA7................................................................................21
5. Bagan Alir Penelitian.......................................................................................28
6. Elektroforegram Hasil Amplifikasi Fragmen gen 16S rRNA.........................34
7. Urutan Basa Nukleotida Gen 16S rRNA SCWB1..........................................36
8. Urutan Basa Nukleotida Gen 16S rRNA SCWB17........................................36
9. Hasil BLASTn SCWB1...................................................................................37
10. Hasil BLASTn SCWB17.................................................................................38
11. Alignment menggunakan Program ClustalW..................................................40
12. Pohon Filogenetik SCWB1 dengan Metode Neighbor Joining......................41
13. Pohon Filogenetik SCWB17 dengan Metode Neighbor Joining....................42
I. PENDAHULUAN
A. Latar belakang
Singkong adalah salah satu tanaman yang banyak terdapat di Indonesia.
Berdasarkan data dari Badan Pusat Statistik Tahun 2016, Provinsi Lampung
memiliki angka produksi singkong sebanyak 7.384.084 ton pada tahun 2015
(Badan Pusat Statistik, 2016). Peningkatan produksi singkong di dunia
industri secara tidak langsung akan berhubungan dengan peningkatan limbah
singkong. Limbah singkong yang dihasilkan dapat berupa padatan maupun
cairan, misalnya kulit singkong, onggok, dan limbah tapioka.
Limbah utama dari industri singkong adalah kulit singkong. Kulit singkong
mengandung beberapa komponen yaitu selulosa 43,626%, pati/amilum
36,58%, hemiselulosa 10,384%, lignin 7,646%, dan komponen lainnya 1,762%
(Artiyani, 2011). Adanya kandungan tesebut menyebabkan kulit singkong
dapat dijadikan suatu media bagi pertumbuhan bakteri seperti bakteri
selulolitik dan amilolitik.
Beberapa penelitian terkait keberadaan mikroba pada limbah kulit singkong
sudah dilakukan oleh Makkadafi dkk. (2017), yang menunjukkan bahwa
terdapat satu spesies bakteri selulolitik yaitu Bacillus subtilis yang berhasil
2
diidentifikasi menggunakan metode uji hidrolisis dengan menentukan indeks
hidrolisisnya. Begitu juga pada penelitian yang dilakukan oleh Hanzen dkk.
(2017), terdapat 4 spesies bakteri amilolitik dari limbah kulit singkong yaitu
Bacilus circulans, Bacilus subtilis, Bacilus coagulans, dan Pseudomonas
aeruginosa yang diidentifikasi menggunakan pengukuran indeks hidrolisis.
Identifikasi bakteri dapat dilakukan dengan 2 pendekatan, yaitu secara
konvensional dan molekuler. Menurut Petti et al. (2005), proses identifikasi
bakteri secara konvensional berdasarkan karakter fenotip bakteri seperti
pewarnaan gram, morfologi koloni, dan aktivitas enzim seringkali tidak
bersifat statis dan dapat berubah seiring dengan adanya evolusi. Kesalahan
identifikasi sering terjadi karena hadirnya karakteristik fenotip bakteri yang
tidak biasa ataupun kurangnya pengalaman dalam menginterpretasikan data
karakter fenotip.
Untuk mengatasi permasalahan tersebut, digunakan metode identifikasi
secara molekuler menggunakan gen 16S rRNA atau biasa disebut juga
sebagai uji genotip. Selain itu, uji genotip memiliki banyak keuntungan
diantaranya lebih mudah, lebih valid dan lebih cepat. Identifikasi secara
molekuler ini dapat dilakukan juga untuk mempelajari adanya keragaman
genetik dari suatu lingkungan lebih detil karena mikroba yang tidak dapat
dikulturkan pun dapat diperoleh gen 16S-rRNA-nya. Urutan yang lebih
conserved (lestari) dapat digunakan untuk menghasilkan pohon filogenetik
yang lebih diskriminatif sehingga dapat membagi organisme ke dalam tiga
domain, yaitu Archaea, Bacteria, dan Eucarya (Amann et al., 1994).
3
Sehingga identifikasi urutan nukleotida yang didasarkan pada gen 16S rRNA
dapat digunakan untuk menentukan hubungan kekerabatan bakteri
berdasarkan konstruksi pohon filogenetiknya dan untuk mengidentifikasi
bakteri yang belum diketahui jenisnya. Selain itu, database tentang bakteri
berdasarkan identifikasi 16S rRNA sudah banyak sehingga memudahkan
dalam pembandingan (Koonin, 2003).
Beberapa penelitian yang telah dilakukan dalam mengidentifikasi bakteri
menggunakan teknik 16S rRNA yaitu dilakukan oleh Sabbathini dkk. (2017),
yang berhasil mengetahui spesies tiap isolat bakteri endofit dari daun tanaman
padi menggunakan metode PCR pada gen 16s rRNA. Pada penelitian ini
diperoleh 15 isolat dari daun padi dan setelah dilakukan identifikasi
molekuler 16S rRNA bakteri, terdapat empat isolat yang menunjukkan
kemiripan dengan genus Sphingomonas. Begitu juga dengan penelitian yang
dilakukan oleh (Harun, 2018) diperoleh isolat IROD5 yang dapat tumbuh
dalam media Skim Milk Agar dan memiliki potensi menghasilkan protease
yang diidentifikasi secara molekuler menggunakan fragmen gen 16S rRNA.
Berdasarkan hasil analisis, bakteri strain IROD5 penghasil protease memiliki
kemiripan 99% dengan fragmen gen 16S rRNA bakteri Staphylococcus
hominis. Penelitian selanjutnya oleh Rambitan dkk. (2018), mengidentifikasi
Bakteri asam laktat yang diisolasi dari fermentasi kol merah yang
diamplifikasi dengan gen 16S rRNA yang diketahui memiliki kemiripan 100%
dengan Weissella cibaria dan Weissella confusa.
4
Pada penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Satria dkk. (2018),
didapatkan tujuh isolat bakteri dari limbah kulit singkong. Tujuh isolat yang
didapatkan telah dianalisis secara kualitatif untuk mengetahui aktifitas
hidrolitiknya dan terpilih 2 isolat, dimana isolat SCWB1 dan SCWB17
memiliki potensi amilolitik dan selulolitik yang cukup besar. Namun kedua
isolat ini belum diidentifikasi genetiknya. Berdasarkan latar belakang diatas,
maka pada penelitian ini akan dilakukan karakterisasi molekuler isolat lokal
terpilih asal limbah singkong yang dilakukan dengan metode 16S rRNA dan
ditentukan jenis atau spesiesnya melalui analisis filogenetik.
B. Tujuan Penelitian
Adapun tujuan dari penelitian ini adalah sebagai berikut :
1. Mengidentifikasi bakteri isolat lokal terpilih asal limbah singkong
dengan menggunakan 16S rRNA.
2. Mengetahui jenis bakteri isolat lokal terpilih asal limbah singkong.
3. Mengetahui kekerabatan bakteri isolat lokal terpilih asal limbah singkong.
C. Manfaat Penelitian
Adapun manfaat dari penelitian ini adalah sebagai berikut :
1. Memberikan informasi terbaru tentang bakteri isolat lokal terpilih asal
limbah singkong.
5
2. Metode 16S rRNA yang digunakan dalam penelitian ini dapat dijadikan
acuan untuk mengidentifikasi mikroba lainnya yang berasal dari limbah
singkong.
3. Isolat terpilih yang berhasil diidentifikasi dapat dimanfaatkan untuk
perkembangan ilmu pengetahuan dan bioteknologi.
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. Singkong
Singkong merupakan salah satu sumber karbohidrat yang paling penting
setelah beras, namun dengan kemajuan teknologi pengolahan singkong tidak
hanya terbatas pada produksi pangan, tetapi juga merambah sebagai bahan
baku industri (Rukmana, 1997). Pengolahan singkong secara terpadu
merupakan upaya yang dilakukan untuk memanfaatkan seluruh bagian dari
singkong tanpa ada yang terbuang termasuk kulitnya. Menurut penelitian
Turyoni (2005), kulit singkong segar mengandung karbohidrat sebesar 4,55%,
sehingga memungkinkan digunakan sebagai sumber energi bagi
mikroorganisme dalam proses fermentasi. Berdasarkan penelitian yang
dilakukan oleh Artiyani (2011), diketahui bahwa kulit singkong mengandung
beberapa komponen yaitu selulosa 43,626%, pati/amilum 36,58%,
hemiselulosa 10,384%, lignin 7,646%, dan komponen lainnya 1,762%.
B. Bakteri Selulolitik
Bakteri selulolitik adalah bakteri yang mampu mensekresikan enzim selulase
Madigan et al. (2003). Enzim selulase merupakan enzim ekstraseluler yang
7
dihasilkan di dalam sel kemudian dikeluarkan ke medium pertumbuhannya
untuk mendegradasi nutrien. Enzim selulase diproduksi untuk mengkatalisis
pemecahan selulosa menjadi glukosa dengan pemutusan ikatan β-1,4-
glukosidik (Acharya et al., 2008). Enzim selulase termasuk salah satu jenis
enzim yang sangat penting peranannya dalam proses biokonversi limbah-
limbah organik berselulosa menjadi glukosa, makanan ternak, etanol dan lain-
lainnya. Kebutuhan enzim selulase dari hari ke hari semakin meningkat
sesuai dengan kemajuan industri (Soeka, 1992).
Bakteri selulolitik dan enzim selulasenya banyak dimanfaatkan untuk
berbagai macam keperluan industri karena biaya produksinya murah, waktu
produksi singkat, menghasilkan kompleks multienzim dan cenderung stabil
pada kondisi ekstrim. Selain itu, selulase banyak digunakan dalam industri
pulp dan kertas untuk modifikasi serat, penghilangan warna dan peningkatan
drainase (Ladeira et al., 2015) industri tekstil sebagai bio- polishing kain dan
deterjen yang digunakan untuk meningkatkan kelembutan dan kecerahan kain
(Sadhu, 2013) serta produksi biofuel (Bogati, 2011). Aplikasi enzim selulase
di bidang peternakan telah dilakukan untuk peningkatan kualitas bahan pakan
ternak, digunakan untuk meningkatkan kecernaan bagas tebu (Rayhan dkk.,
2013), eceng gondok (Riswandi, 2014), dan bahan baku lainnya.
C. Bakteri Amilolitik
Bakteri amilolitik adalah bakteri yang mampu memecah pati menjadi
senyawa sederhana seperti glukosa. Bakteri yang diisolasi dari sumber kaya
8
pati umumnya berpotensi menghasilkan enzim amilase yang lebih baik
(Vaseekaran et al., 2011). Enzim amilase berperan dalam menghidrolisis pati
pada ikatan 1,4-glikosidik menjadi monosakarida dan disakarida (Sudiana
dan Rahmansyah, 2002).
Bakteri potensial yang telah banyak digunakan untuk memproduksi enzim
amilase pada skala industri yaitu Bacillus licheniformis dan B.
stearothermophillus. Penggunaan B. stearothermophillus pada skala industri
lebih disukai karena mampu menghasilkan enzim yang bersifat termostabil
sehingga menekan biaya produksi. Hingga saat ini kebutuhan akan enzim
amilase di Indonesia belum dapat dipenuhi, sehingga masih harus diimpor
(Naiola, 2008).
D. Isolasi DNA
Isolasi DNA merupakan metode yang digunakan untuk memisahkan DNA
dari sel nya (Surzycki, 2000). Metode isolasi DNA terdiri dari 3 tahapan
yaitu :
1. Penghancuran (Lisis) sel
Lisis merupakan proses perusakan dinding dan membran sel sehingga
seluruh isi sel keluar. Pemecahan dapat dilakukan secara fisik, misalnya
dengan freeze- thawing, ultrasonikasi, atau penggerusan dalam nitrogen
cair. Sel juga dapat dilisiskan secara kimiawi maupun enzimatik. Lisis
secara kimiawi biasanya menggunakan detergen SDS (Sodium Dodecyl
9
Sulfate) atau CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide), dan lisis
secara enzimatik biasanya menggunakan proteinase K atau lisozim.
2. Ekstraksi DNA
Ekstraksi merupakan proses yang bertujuan untuk memisahkan DNA dari
kontaminan lain. Pada tahap ini, berbagai modifikasi biasa dilakukan,
meliputi inkubasi pada temperatur tinggi, penggunaan agen pengkhelat
seperti EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid) yang berfungsi untuk
menghambat enzim nuklease, juga phenol atau chloroform yang
menggunakan senyawa Phenol-choloroform-isoamyl alcohol dan
merupakan metode standar untuk ekstraksi DNA yang akhir-akhir ini
mulai ditinggalkan, karena sifat toksik dari phenol.
3. Presipitasi DNA
Presipitasi merupakan proses pengendapan DNA yang bertujuan
mengisolasi DNA dari larutan yang digunakan selama ekstraksi.
Pengendapan DNA dapat dilakukan dengan menambahkan etanol dingin
beserta NaCl ke dalam ekstrak. Hasil pengendapan DNA yaitu akan
diperoleh benang-benang DNA berwarna putih.
(Widyastuti, 2011).
E. Identifikasi Molekuler
Metode identifikasi molekuler adalah identifikasi berdasarkan urutan 16S-
rRNA (16S ribosomal Ribonucleic acid/Asam ribonukleat pengkode ribosom
16S, S menyatakan Svedberg, yaitu satuan ukuran ribosom). Sebagian besar
10
prokariot memiliki 3 jenis rRNA, yaitu 5S, 16S dan 23S seperti terlihat pada
Tabel 1.
Tabel 1. RNA Ribosomal pada prokariot
Jenis rRNA Ukuran (Nukleotida)
5S rRNA 120
16S rRNA 1500
23S 2900
Sumber : Clarridge, 2004.
Gen 5S rRNA memiliki ukuran 120 basa sehingga gen ini terlalu kecil untuk
digunakan dalam penentuan filogenetik. Gen 23S rRNA memiliki ukuran
2900 basa, molekul ini menyulitkan analisis karena memiliki struktur
sekunder dan tersier yang cukup panjang. Prosedur baku yang sudah
digunakan untuk menentukan hubungan filogenetik dan mendefinisikan
spesies adalah melalui amplifikasi gen 16S rRNA (Jusuf, 2001). Gen 16S
rRNA ini digunakan untuk mempelajari spesies bakteri, dengan alasan
bahwa:
1. Gen 16S rRNA terdapat di dalam semua sel bakteri.
2. Fungsi gen 16Sr RNA dalam waktu yang lama tidak berubah tergantung
jarak evolusinya.
3. Gen 16Sr RNA cukup panjang yaitu 1500 bp.
(Janda and Abbott, 2007).
Identifikasi berdasarkan urutan 16S rRNA dilakukan karena mengandung
urutan yang sangat conserved (lestari) secara evolusi. Daerah yang sangat
conserved dapat digunakan sebagai situs pelekatan primer sehingga dapat
11
diamplifikasi secara in vitro dengan PCR. Urutan yang lebih beragam dari
16S rRNA sangat cocok untuk membedakan suatu organisme ke dalam taksa
yang lebih rendah seperti genus dan spesies. Urutan 16S rRNA ini juga
menyediakan data yang secara statistik cukup valid (Amann et al., 1994).
Struktur 16S rRNA dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Struktur 16S rRNA (Fuchs et al., 1998)
Beberapa penelitian menggunakan metode identifikasi molekuler telah
dilakukan oleh Roslan et al. (2018), yang telah mengidentifikasi isolat dari
ragi, yaitu dua isolat bakteri pendegradasi pati yang diidentifikasi
menggunakan sekuensing gen 16S rRNA sebagai Bacillus licheniformis
dengan kesamaan 97% dan 98%, dan satu isolat diidentifikasi sebagai bakteri
12
asam laktat, Enterococcus faecium (98%). Begitu juga dengan penelitian
yang dilakukan oleh Awan et al. (2018), telah mengisolasi empat bakteri
termofilik sumber air panas Chakwal di Pakistan yang diidentifikasi
menggunakan sekuensing gen 16S rRNA yang diketahui bahwa semua isolat
berasal dari Bacillus licheniformis dengan kemiripan 98-99%.
F. Polymerase Chain Reaction (PCR)
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan metode enzimatis untuk
amplifikasi DNA dengan cara in vitro. PCR pertama kali dikembangkan pada
tahun 1985 oleh Kary B. Mullis (Yuwono, 2006). Menurut Erlich (1989),
PCR merupakan teknik yang sangat tepat dan paling sering digunakan untuk
biologi molekuler karena mudah, cepat dan murah. Teknik amplifikasi DNA
dari sumber DNA yang dihasilkan merupakan DNA yang spesifik dari
sejumlah kecil gen-gen yang berbeda. Pada proses amplifikasi DNA oleh
PCR, digunakan enzim yang dinamakan dengan “Taq polymerase”.
Beberapa komponen PCR antara lain:
1. Enzim DNA Polimerase
Enzim Taq DNA polimerase berfungsi untuk menggabungkan nukleotida
pada proses ekstensi/elongasi, dimana enzim ini memiliki keaktifan pada
suhu tinggi. Oleh karena itu, penambahan enzim tidak perlu dilakukan di
setiap siklusnya.
13
2. Primer
Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal atau potongan dari
DNA utuh yang berperan sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan
diamplifikasi. Primer juga menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’
yang diperlukan untuk proses elongasi DNA komplemen dengan DNA
template yang akan diperbanyak. Panjang dari primer berkisar antara 20-30
basa. Beberapa primer yang digunakan untuk identifikasi 16S rRNA
disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2. Primer Universal 16S rRNA
Primer
Name Sequence (5'-3') Ref.
27F AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG (Brosius et al., 1978)
1492R CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT (Brosius et al., 1978)
928F TAA AAC TYA AAK GAA TTG ACG GG (Lane et al., 1985)
336R ACT GCT GCS YCC CGT AGG AGT CT (Lane, 1991)
63F CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC (Marchesi et al., 1998)
1387R GGG CGG WGT GTA CAA GGC (Marchesi et al., 1998)
3. Reagen lainnya
Selain enzim dan primer, terdapat juga reagen lain yang ikut menentukan
keberhasilan reaksi PCR, yaitu antara lain dNTPs (deoxynucleotide
triphosphates) yang merupakan suatu campuran yang terdiri dari dATP
(deoxyadenosine triphosphates), dTTP (deoxythimydine triphosphates) ,
dCTP (deoxycytidine triphosphates) dan dGTP (deoxyguanosine
triphosphates). dNTPs berfungsi sebagai building block DNA yang
diperlukan dalam proses ekstensi/elongasi DNA. dNTP ini akan menempel
pada gugus -OH pada ujung 3’ dari primer membentuk untai baru yang
14
komplementer dengan untai DNA templat. Selain dNTP, terdapat buffer
yang mengandung MgCl2 (magnesium klorida). Konsentrasi ion Mg2+
ini
sangat mempengaruhi proses primer annealing, denaturasi, dan aktivitas
enzim (Yuwono, 2006).
Proses PCR terdiri dari tiga tahapan, yaitu denaturasi DNA template,
penempelan (annealing) primer, dan polimerisasi (elongasi) rantai DNA.
Denaturasi merupakan suatu proses pemutusan untai ganda DNA menjadi dua
untai tunggal DNA, dimana DNA tersebut akan menjadi template (cetakan)
yang berfungsi sebagai tempat penempelan primer dan tempat kerja DNA
polimerase dengan pemanasan singkat yaitu pada suhu 90-95°C selama
beberapa menit. Penjelasan ringkas tentang proses siklus reaksi PCR adalah
sebagai berikut:
1. Pradenaturasi
Predenaturasi dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk
memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA polimerase.
Predenaturasi biasanya dilakukan pada suhu 95°C.
2. Proses Siklus PCR
a. Denaturasi
Denaturasi terjadi dengan adanya proses terbukanya DNA untai ganda
menjadi dua untai tunggal. Hal ini terjadi karena suhu denaturasi yang
tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang
komplemen. Pada denaturasi, seluruh reaksi enzim tidak berjalan,
misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya. Denaturasi
biasanya dilakukan antara suhu 90 – 95°C.
15
b. Penempelan Primer (Annealing)
Proses yang terjadi pada tahap penempelan primer (annealing) yaitu
primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan
primer. Pada proses annealing, ikatan hidrogen akan terbentuk antara
primer dengan urutan komplemen pada template. Proses ini biasanya
dilakukan pada suhu 50 – 60°C.
c. Reaksi Polimerisasi (Elongasi)
Reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai umumnya terjadi pada suhu
72°C. Primer yang telah menempel pada DNA template akan mengalami
perpanjangan pada sisi 3’ nya dengan penambahan dNTP yang
komplemen dengan templat oleh DNA polimerase. Apabila siklus
amplifikasi dilakukan secara berulang, maka daerah yang dibatasi oleh dua
primer akan di amplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang
berupa untai ganda). Jika enzim Taq DNA polimerase yang digunakan
pada akhir dari setiap siklus, maka akan menyebabkan terjadinya
penambahan satu nukleotida A pada ujung 3’ dari potongan DNA yang
dihasilkan. Proses PCR dilakukan menggunakan alat yang disebut
thermocycler.
3. Final Elongasi
Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72C) selama 5-15
menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah
diperpanjang secara sempurna (Handoyo dan Rudiretna, 2000).
16
Gambar 2. Siklus Amplifikasi (Ferdiansyah, 2014)
G. Sekuensing
Sekuensing DNA adalah proses atau teknik penentuan urutan basa nukleotida
pada suatu segmen molekul DNA. Urutan basa nukleotida tersebut dikenal
sebagai sekuens DNA, yang merupakan informasi paling mendasar suatu gen
atau genom karena mengandung instruksi yang dibutuhkan untuk
pembentukan tubuh mahluk hidup. Pengurutan (sequencing) asam nukleat
dapat digunakan untuk mengetahui kode genetik dari molekul DNA,
identitas maupun fungsi gen ataupun fragmen DNA dengan cara
membandingkan sekuensnya dengan sekuens DNA yang sudah diketahui
(Glick, 2010).
17
Macam-macam metode sekuensing :
1. Metode Maxam-Gilbert
Metode sekuensing DNA yang pertama kali dikenal adalah metode kimia
yang dikembangkan oleh A.M. Maxam dan W. Gilbert pada tahun 1977.
Chemical degradation method (metode degradasi kimia), merupakan metode
yang digunakan untuk pengurutan molekul DNA untai ganda yang
ditentukan dengan menggunakan bahan kimia yang dapat memotong molekul
DNA pada posisi nukleotida tertentu. Biasanya digunakan fosfat radioaktif
atau suatu nukleotida pada ujung 3’ untuk melabeli fragmen-fragmen DNA
yang akan disekuensing. Metode Maxam-Gilbert dapat diterapkan untuk
DNA untai ganda maupun DNA untai tunggal dan melibatkan pemotongan
basa spesifik (Maxam and Gilbert, 1992).
2. Metode Sanger
A. Sanger dan kawan-kawan telah mengembangkan metode lain yang jauh
lebih praktis dibandingkan dengan metode sekuensing Maxam-Gilbert, yaitu
metode dideoksi yang dikembangkan pada tahun 1977. Chain termination
method (metode terminasi rantai) merupakan pengurutan molekul DNA untai
tunggal yang ditentukan dengan sintesis rantai polinukleotida komplementer
secara enzimatis. Metode terminasi rantai yang telah dikembangkan oleh
Frederick Sanger dan rekan-rekannya telah digunakan pada hampir semua
usaha sekuensing DNA. Metode Sanger menggunakan teknik penghentian
(terminasi) reaksi sintesis DNA in vitro yang spesifik untuk sekuens tertentu
menggunakan substrat nukleotida yang telah dimodifikasi. Keunggulan
metode ini adalah bahwa seluruh proses sekuensing dapat dilakukan dalam
18
satu reaksi. Pada metode ini digunakan dideoksinukleotida, dimana masing-
masing dideoksinukleotida yang merupakan pemutus rantai ditandai dengan
pewarna fluoresens, yang berpendar pada panjang gelombang yang berbeda-
beda. Metode ini telah banyak digunakan karena keunggulannya, yaitu lebih
sederhana dan murah, serta primer-primer yang digunakan tidak perlu dilabel
secara terpisah (Sanger et al., 1977).
H. Analisis Filogenetik
Kata filogeni berasal dari bahasa Yunani yaitu phylon yang berarti suku, dan
genesis yang berarti asal mula. Secara terminologi, filogeni telah diartikan
sebagai sejarah evolusi spesies atau kelompok spesies yang berkerabat dekat
(Campbell et al., 2003). Pohon filogenetik merupakan diagram dengan
bentuk percabangan yang menggambarkan hubungan evolusi antara berbagai
sekuens organiseme berdasarkan kemiripan dan perbedaan karakter fisik serta
genetik yang telah diturunkan dari induknya (Smith et al., 1986).
Beberapa metode analisis filogenetik adalah sebagai berikut :
1. Metode Maximum Parsimony/Minimum Evolution
Metode parsimony atau minimum evolution pertama kali digunakan dalam
bidang filogenetik oleh Camin and Sokal pada tahun 1965 (Felsenstein, 1978).
Metode ini dapat memperkirakan pohon evolusi/evolutionary tree yang
meminimalkan jumlah langkah yang dibutuhkan untuk menghasilkan variasi
yang diamati dalam sekuen. Metode ini dapat digunakan untuk sekuen yang
mirip dan dalam jumlah yang sedikit. Tahapan yang digunakan dalam
19
metode ini tidak rumit, tetapi dijamin untuk dapat menemukan pohon yang
terbaik, sebab semua kemungkinan pohon yang dibentuk berhubungan
dengan kelompok sekuen yang diperiksa. Dengan adanya alasan tersebut,
metode ini cukup membutuhkan banyak waktu dan tidak berguna untuk data
sekuen dalam jumlah besar dan asumsi lain harus dibuat untuk root pohon
yang diprediksikan.
2. Metode Jarak/Distance Method
Metode Jarak merupakan metode yang digunakan karena adanya jumlah
perubahan diantara masing-masing pasangan dalam kelompok untuk
mengkonstruksi pohon filogenetika dalam kelompok. Pasangan sekuen yang
memiliki jumlah perubahan terkecil diantara mereka disebut neighbors.
Tujuan dari metode ini adalah untuk mengidentifikasi pohon pada posisi
neighbors dengan benar, dan juga mempunyai cabang yang menghasilkan
data orisinil sedekat mungkin.
3. Metode Fitch dan Margoliash
Metode Fitch dan Margoliash 1987 mengombinasi sekuen-sekuen untuk
mendefinisikan cabang-cabang pohon yang diprediksikan dan untuk
menghitung panjang-panjang cabang dari pohon, hal ini disebut metode
averanging distance. Metode ini merupakan metode yang paling akurat
untuk pohon dengan cabang yang pendek. Adanya cabang yang panjang
cenderung menurunkan tingkat kepercayaan dari prediksi.
4. Metode Neighbor - Joining (NJ)
Metode neighbor-joining memiliki prinsip yang hampir sama dengan metode
Fitch dan Margoliash, perbedaannya yaitu tentang pemilihan sekuen untuk
20
berpasangan ditentukan oleh perbedaan alogaritma (Saitou and Nei, 1987) .
Metode ini memilih sekuen yang jika digabungkan akan memberikan estimasi
terbaik dari panjang cabang yang paling dekat, sehingga menunjukkan jarak
yang nyata diantara sekuen. Metode yang paling sering digunakan yaitu
metode Neighbor-Joining (NJ). Metode NJ adalah metode yang
disederhanakan dari metode Minimum Evolution (ME) (Swofford et al.,
1996).
Gambar 3. Tampilan Pohon Filogenetik (Anonim, 2019)
I. Program MEGA 7
Program MEGA 7 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) digunakan
untuk mengetahui tingkat kemiripan antara sekuen satu dengan sekuen
21
pembanding (standart). Ge et al. (2018) menyatakan bahwa program MEGA
7 dapat digunakan untuk pengambilan kesimpulan hubungan evolusi dari
sekuen-sekuen yang homolog. Selain itu, MEGA 7 ini juga dilengkapi
dengan hasil berupa diagram pohon filogenetik. Contoh tampilan Program
MEGA7 dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4. Tampilan Menu MEGA7
III. METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April hingga September 2019 di UPT
Laboratorium Terpadu dan Sentra Inovasi Teknologi (LTSIT) Unila dan
analisis urutan nukleotida dilakukan melalui jasa Bioneer, Korea.
B. Alat dan Bahan
Adapun alat-alat yang akan digunakan pada penelitian ini adalah erlenmeyer
50 mL, kasa, kapas, jarum ose, gelas ukur 10 mL, neraca analitik digital,
shaker inkubator, LAF (Laminar Air Flow), bunsen, dan autoclave,
centrifuge, microcentrifuge tube 2 mL, thermomixer, vortex, mini spin,
micropet, tips, GeneJET Genomic DNA Purification Column, collection tube
2 mL, Instrumen PCR SensoQuest Labcycler, Nanophotometer Pearl, dan
Instrumen elektroforesis QIAxcel Advanced dengan DNA High Resolution
Kit, serta program MEGA 7, ClustalW, dan QIAxcel ScreenGel Software.
Adapun bahan-bahan yang digunakan yaitu isolat SCWB1, isolat SCWB17,
NB (Nutrient Broth), aquades, GeneJET Genomic DNA Purification Kit,
23
NEXpro™ Pfu PCR 2X Master Mix, primer 63F 5’-CAG GCC TAA CAC
ATG CAA GTC-3’, 1387R 5’-GGG CGG WTG GTA CAA GGC-3’.
C. Prosedur Kerja
a. Pembuatan Media Kultur Cair
Pembuatan media kultur cair ini bertujuan untuk memperbanyak sel yang
akan di isolasi. Tahap ini dilakukan dengan cara menimbang media NB
sebanyak 0,13 g, kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer 50 mL dan
ditambahkan aquades sebanyak 10 mL, lalu disterilkan dengan autoclave
selama 15 menit pada suhu 121C dan tekanan 2 atm. Setelah 15 menit,
media cair didinginkan pada suhu ruang di dalam LAF (Laminar Air Flow).
Setelah media dingin, masukkan 1 ose isolat bakteri ke dalam media cair, dan
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37C dengan kecepatan 125 rpm.
b. Isolasi DNA
Isolasi DNA digunakan untuk memperoleh materi genetik yang diinginkan
dari masing-masing isolat. Tahap ini dilakukan dengan cara memindahkan
1,5 mL medium cair yang telah ditumbuhi bakteri ke dalam microcentrifuge
tube yang steril. Microcentrifuge tube disentrifugasi selama 10 menit pada
5.000 x g dan supernatan hasil sentrifugasi dibuang. Pelet yang dihasilkan
siap diisolasi DNA nya dengan cara disuspensikan dalam 180 µL digestion
solution. Kemudian ditambahkan 20 µl larutan proteinase K dan
dihomogenkan menggunakan vortex atau menggunakan pipet agar larutan
tercampur rata dan diinkubasi pada suhu 56C dalam thermomixer selama 15
24
menit. Kemudian ditambahkan 5 µl Rnase A solution dan dihomogenkan
dengan menggunakan vortex dan dilanjutkan dengan inkubasi selama 10
menit dalam suhu ruang. Tahap berikutnya ditambahkan etanol 99%
sebanyak 400 µl dan dihomogenkan kembali menggunakan pipet.
Lysate yang diperoleh dipindahkan ke dalam GeneJET Genomic DNA
Purification Column yang sebelumnya telah dimasukan dalam collection tube,
kemudian disentrifugasi selama 1 menit pada 6.000 x g, lalu collection tube
yang mengandung larutan flow-trough dibuang dan GeneJET Genomic DNA
Purification Column dimasukkan kembali ke dalam collection tube baru
ukuran 2 mL. Selanjutnya ditambahkan 500 µl wash buffer I (yang telah
ditambahkan ethanol), dan disentrifugasi selama 1 menit pada 8.000 x g, lalu
buang flow-through dan letakan kembali GeneJET Genomic DNA
Purification Column dalam collection tube. Tambahkan 500 µl wash buffer II
(yang telah ditambahkan ethanol) ke dalam GeneJET Genomic DNA
Purification Column dan sentrifugasi selama 3 menit pada kecepatan
maksimum (12.000 x g). Tahap berikutnya tambahkan 200 µl elution buffer
pada bagian tengah membran GeneJET Genomic DNA Purification Column
dan diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang, setelah itu disentrifugasi
selama 1 menit pada 8.000 x g, kemudian GeneJET Genomic DNA
Purification Column dibuang dan filtrat yang berisi DNA berhasil diperoleh.
DNA yang diperoleh diuji tingkat kemurniannya dengan menggunakan alat
NanoPhotometer yang kemudian hasilnya digunakan sebagai
template/cetakan untuk proses amplifikasi.
25
c. Analisis Kemurnian Hasil Isolasi DNA
Analisis ini dilakukan untuk mengetahui tingkat kemurnian DNA yang
diisolasi agar siap digunakan untuk proses amplifikasi. Analisis dilakukan
dengan memasukkan sampel DNA pada alat NanoPhotometer Pearl. Adapun
langkahnya yaitu dengan memipet buffer TE 1 µL dan dimasukkan ke dalam
kuvet, lalu tekan tombol blank, maka nilainya 0 . Kemudian memipet filtrat
hasil isolasi DNA sebanyak 1 µL dan dimasukkan ke dalam kuvet, lalu tekan
tombol sampel, maka akan keluar nilai konsentrasi dan kemurniannya.
d. Amplifikasi Gen 16S rRNA
Tahap amplifikasi ini dilakukan untuk memperbanyak DNA. DNA yang
sudah diisolasi sebelumnya, diamplifikasi dengan ditambahkan komposisi
reaksi yang memiliki total volume 20 µL NEXpro™ Pfu PCR 2X Master Mix,
dengan primer 63F 5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’, 1387R 5’-
GGG CGG WTG GTA CAA GGC-3’yang dimasukkan ke dalam micro tube.
Kemudian setting alat PCR SensoQuest Labcycler dengan tahap
Predenaturasi selama 5 menit pada 95 °C, denaturasi selama 30 detik pada
94 °C, annealing selama 30 detik pada 50 °C, elongasi selama 2 menit pada
72 °C, final elongasi selama 5 menit pada 72 °C yang dilakukan selama 35
siklus. Isolat DNA siap diamplifikasi.
Setelah proses amplifikasi selesai, tahap berikutnya analisis menggunakan
alat elektroforesis. Elektroforesis digunakan untuk mengetahui tingkat
kemurnian DNA. Elektroforesis dilakukan dengan menganalisis sampel
DNA dalam tube PCR dengan menggunakan alat QIAxcel Advanced dengan
26
DNA High Resolution Kit. Tahapannya yaitu sampel hasil amplifikasi dalam
tabung mikro PCR 0.2 mL atau plate 96 well diletakkan dalam isolat tray alat.
Tampilan “Instrument Control” memerlukan beberapa informasi yang perlu
diisi. Proses elektroforesis akan dimulai dengan memberi perintah dengan
mengklik “Run”. Hasil elektroforesis menggunakan QIAxcel adalah
elektroforegram dan hasil amplifikasi DNA ditampilkan dalam komputer
berupa gambar gel.
e. Penentuan urutan DNA (Sekuensing)
Tahap sekuensing produk PCR dilakukan untuk mengetahui urutan basa
nukleotida isolat SCWB1 dan SCWB17. Penentuan urutan DNA (sekuensing)
dilakukan melalui jasa Bioneer, Korea. Proses penentuannya adalah
menggunakan metode Sanger yang meliputi beberapa tahap yaitu: penyiapan
template, pemurnian produk PCR, elektroforesis dengan scanning
fluorescence, dan reaksi sekuensing.
f. Analisis Filogenetik
Pohon filogenetik dibuat untuk mengetahui kekerabatan antara isolat SCWB1
dan SCWB17 dengan spesies yang diduga memiliki tingkat kemiripan
berdasarkan urutan basa nukleotidanya. Sekuen DNA yang diperoleh
dianalisis menggunakan program MEGA 7 untuk melihat hubungan
kekerabatannya dengan menjajarkan urutan nukleotida 16S rRNA yang
didapatkan dengan data yang terdapat di GenBank menggunakan BLASTn
(Basic Local Alignment Search Tool – Nucleotide) dari situs NCBI (National
Center for Biotechnology Information) (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov).
27
Seluruh sekuen DNA yang diperoleh kemudian dilakukan menggunakan
ClustalW pada program MEGA 7 dan kemudian kontruksi pohon filogenetik
menggunakan menu pembuatan pohon filogenetik dengan metode Neighbor-
Joining pada program MEGA 7.
28
Bagan alir penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5. Bagan Alir Penelitian
Inokulasi
DNA
Isolat SCWB1
dan SCWB17
Inokulum SCWB1 dan SCWB17
Isolasi DNA
Analisis Kemurnian DNA Hasil Isolasi
Amplifikasi Gen 16S rRNA
Elektroforesis
Amplikon
Sekuensing Urutan Basa Nukleotida gen 16S
rRNA dan electropherogram
Analisis Hasil Sekuensing
Konstruksi Pohon Filogenetik
Hasil
DNA murni
(Template)
DNA Sekuens
V. SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Adapun kesimpulan yang diperoleh dari penelitian ini adalah sebagai
berikut :
1. Isolat SCWB1 memiliki nilai query coverage 100%, percent identity
97,73% dan e-value 0.0 dengan Bacillus pacificus, Bacillus
paranthracis, dan Bacillus cereus.
2. Isolat SCWB17 memiliki nilai query coverage 100%, percent identity
97,90% dan e-value 0.0 dengan Klebsiella pneumoniae dan
Klebsiella variicola.
3. Isolat SCWB1 memiliki keidentikan tertinggi dengan 8 spesies bakteri
yaitu Bacillus pacificus strain MCCC 1A06182, Bacillus
paranthracis strain MCCC 1A00395, dan Bacillus cereus strain
ATCC 14579, JCM 2152, CCM 2010, NBRC 15305, IAM 12605.
4. Isolat SCWB17 memiliki keidentikan tertinggi dengan 2 spesies
bakteri yaitu Klebsiella pneumoniae strain DSM 30104 dan Klebsiella
variicola strain F2R9.
5. Analisis kekerabatan memperkirakan bahwa isolat SCWB1 memiliki
kekerabatan terdekat terhadap Bacillus cereus strain IAM 12605 dan
46
isolat SCWB17 memiliki kekerabatan terdekat terhadap Klebsiella
variicola strain F2R9.
B. Saran
Berdasarkan hasil penelitian ini, terdapat beberapa saran yaitu :
1. Isolat SCWB1dan SCWB17 yang berhasil diidentifikasi dapat
digunakan pada tahap selanjutnya untuk mengkonversi limbah
singkong menjadi bioetanol.
2. Gen selulolitik dan amilolitik yang ada pada isolat SCWB1 dan
SCWB17 perlu dieksplorasi untuk dikembangkan lebih lanjut pada
bidang-bidang penelitian.
DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2019. Figure 1: Phylogenetic tree: Relationship amongst test strains by
neighbor joining method. https://www.omicsonline.org/articles-images/2157-
7463-4-158-g001.html. Diakses pada 4 November 2019.
Acharya, P. B., Acharya, D. K., and Modi, H. A. 2008. Optimization for cellulase
production by Aspergillus niger using saw dust as substrate. African Journal
of Biotechnology. 7(22): 4147-4152.
Amann, R., Ludwig, W., and Schleifer, K. H. 1994. Identification of uncultured
bacteria: A challenging task for molecular taxonomists. ASM NEWS. 60(7)
360-365.
Artiyani, A. 2011. Bioetanol dari Limbah Kulit Singkong Melalui Proses
Hidrolisis dan Fermentasi dengan Saccharomyces cerevisiae. (Tesis). ITS.
Surabaya.
Badan Pusat Statistik. 2016. Tanaman Ubi Kayu Per-Provinsi. Badan Pusat
Statistik. Jakarta.
Bogati, D. R. 2011. Cellulose Based Biochemicals and Their. (Thesis). Saimaa
University of Applied Sciences. Finlandia.
Brosius, J., Palmer, M. L., Kennedy, P. J., and Noller, H. F. 1978. Complete
nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA gene from Escherichia coli.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America. 75(10): 4801–4805.
Campbell, Reece dan Mitchel. 2003. Biologi Terjemahan edisi kelima jilid 1.
Erlangga. Jakarta.
Clarridge, J. 2004. Impact of 16S rRNA Gene Sequence Analysis for
Identification of Bacteria on Clinical Microbiology and Infectious Diseases.
Clinical Microbiology Reviews. 17(4): 840–862.
48
Erlich, H. A. 1989. Polymerase chain reaction. Journal of Clinical Immunology.
9(6): 437–447.
Fatchiyah, Estri, L.A., Sri, W., dan Sri, R. 2011. Biologi Molekular-Prinsip Dasar
Analisis. Erlangga. Jakarta.
Felsenstein. 1978. Cases in which Parsimony or Compatibility Methods will be
positively misleading. Systematic Zoology. 27(4): 401 – 410.
Ferdiansyah, N. 2014. Polymerase Chain Reaction.
http://nedfer.blogspot.com/2014/09/polimerase-chain-reaction-pcr.html.
Diakses pada 4 November 2019.
Fuchs, B., G. Wallner, W. Beisker, I. Schwippl, W. Ludwig, and R. Amann.
1998. Flow cytometric analysis of the in situ accessibility of Escherichia
coli 16S rRNA for fluorescently labeled oligonucleotide probes. Appl.
Environ.Microbiol. 64:4973–4982.
Ge, S., Li, J., Fan, X., Liu, F., Li, L., Wang, Q., and Wang, Z. 2018. Molecular
characterization of African swine fever virus, China, 2018. Emerging
Infectious Diseases. 24(11): 2131–2133.
Glick B.R., Pasternak J.J., and Patten C.L. 2010. Molecular Biotechnology:
Principles and Applications of Recombinant DNA, 4th ed. ASM Press.
Washington DC.
Handoyo, D., dan Rudiretna, A. 2000. Prinsip Umum Dan Pelaksanaan
Polymerase Chain Reaction (PCR). Unitas. 9(1): 17-29.
Hanzen, W. F. E., Hastuti, U. S., Makkadafi, S. P., Asna, P. M. Al, Sarwendah, F.,
dan Nugraheni, A. 2017. Isolasi Dan Identifikasi Bakteri Amilolitik Dari
Tanah Yang Tercampur Limbah Kulit Ubi Kayu Di Bondowoso , Jawa
Timur. Prosiding Seminar Nasional III Tahun 2017. Malang.
Hartl, D. L. 1988. A Primer of Population Genetics (Second Edition). Sinauer
Associates Inc. Sunderland.
Harun, A. 2018. Isolasi Bakteri Penghasil Enzim Protease Staphylococcus hominis
Pada Oncom Merah Pasca Fermentasi. Seminar Nasional Edusainstek.
Semarang.
Janda, J. M., and Abbott, S. L. 2007. 16S rRNA gene sequencing for bacterial
identification in the diagnostic laboratory: Pluses, perils, and pitfalls. Journal
of Clinical Microbiology. 45(9): 2761–2764.
Jusuf, M. 2001. Genetika I : Struktur dan Ekspresi Gen. CV. Sagung Seto. Jakarta.
49
Koonin, E. V. 2003. Comparative genomics, minimal gene-sets and the last
universal common ancestor. Nature Reviews Microbiology. 1(2): 127–136.
Ladeira, S. A., Cruz, E., Delatorre, A. B., Barbosa, J. B., and Martins, M. L. L.
2015. Cellulase production by thermophilic Bacillus sp. SMIA-2 and its
detergent compatibility. Electronic Journal of Biotechnology. 18(2): 110–
115.
Lane, D. J. 1991. Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics In
Development and Application of Nucleic Acid Probes. International Journal
of Food Microbiology. 120(3): 225-236.
Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahl, D. A., Sogin, M. L., and Pace, N. R.
1985. Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for
phylogenetic analyses. Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America. 82(20): 6955-6959.
Madigan, M. T., Martinko, J. M., and Parker, J. 2003. Brock Biology of
Microorganisms, 10th ed. Prentice Hall. London.
Makkadafi, S. P., Hastuti, U. S., Hanzen, W. F. E., Asna, P. M. Al, and Nugraheni,
A. S. F. 2017. Isolasi Dan Identifikasi Bakteri Selulolitik Dan Pektinolitik
Dalam Limbah Kulit Singkong Pabrik Tape Di Bondowoso , Jawa Timur.
Prosiding Seminar Nasional III Tahun 2017. Malang.
Marchesi, J. R., Sato, T., Weightman, A. J., Martin, T. A., Fry, J. C., Hiom, S. J.,
and Wade, W. G. 1998. Design and evaluation of useful bacterium-specific
PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA. Applied and
Environmental Microbiology. 64(2): 795–799.
Maxam, A. M., and Gilbert, W. 1992. A new method for sequencing DNA. 1977.
Biotechnology (Reading, Mass.). 24(2): 99–103.
Naiola, E. 2008. Amylolitic microbes of nira and laru from Timor Island, East
Nusa Tenggara. Biodiversitas, Journal of Biological Diversity. 9(3): 165–168.
[NCBI] National Center for Biotechnology Information. 2019.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Diakses pada 24 September 2019.
Petti, C. A., Polage, C. R., and Schreckenberger, P. 2005. The Role of 16S rRNA
Gene Sequencing in Identification. Journal of Clinical Microbiology. 43(12):
6123–6125.
Rambitan, G., Pelealu, J. J., and Tallei, T. E. 2018. Isolasi dan identifikasi bakteri
asam laktat hasil fermentasi kol merah (Brassica oleracea L.) sebagai
probiotik potensial. Jurnal Bioslogos. 8(2): 33.
50
Rayhan, M., Suryapratama, W., dan Sutardi, T. R. 2013. Fermentasi Ampas Tebu
(Bagasse) Menggunakan Phanerochaete chrysosporium Sebagai Upaya
Meningkatkan Kecernaan Bahan Kering Dan Kecernaan Bahan Organik
Secara in vitro. Jurnal Ilmiah Peternakan. 1(2).
Riswandi. 2014. Kualitas Silase Eceng Gondok (Eichhornia crassipes) dengan
Penambahan Dedak Halus dan Ubi Kayu. Jurnal Peternakan Sriwijaya. 3(1):
1–6.
Roslan, R., Rehan, M. M., Kamarudin, K. R., Noor, H. M., Huda-Faujan, N., and
Radzi, S. M. 2018. Isolation and identification of amylolytic bacteria from
ragi. Malaysian Applied Biology. 47(2): 83–88.
Rukmana, R. 1997. Ubi Kayu, Budidaya dan Pascapanen. Kanisius.Yogyakarta
Sabbathini, G. C., Wijanarka, Pujiyanto, S., dan Lisdiyanti, P. 2017. Isolasi dan
Identifikasi Bakteri Genus Sphingomonas Dari Daun Padi ( Oryza Sativa ) di
Area Persawahan Cibinong. Jurnal Biologi. 6(1): 59–64.
Sadhu, S. 2013. Cellulase Production by Bacteria: A Review. British
Microbiology Research Journal. 3(3): 235–258.
Saitou, N. and M. Mei. 1987. The neighbor-joining method: a new method for
reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution. 4: 406-
425.
Sambrook, J., and Russel, J.W. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
Cold-Spring Harbor Laboratory Pr. New York (US).
Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A. R. 1992. DNA sequencing with chain-
terminating inhibitors. 1977. Biotechnology (Reading, Mass.). 24: 104-108.
Santella, R. M. 2006. Approaches to DNA/RNA extraction and whole genome
amplification. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 15(9):
1585–1587.
Satria, H., Nurhasanah, Aspita, L., dan Dian, H. 2018. Pretreatment Limbah Padat
Singkong (LPS) Menggunakan Ionic Liquid [Emim]Oac dan Isolat-Isolat
Bakteri Indigenous Untuk Peningkatan Hasil Intermediate Produk. Seminar
Nasional Hasil Hasil Penelitian 2018. Universitas Lampung.
Smith, L. M., Sanders, J. Z., Kaiser, R. J., Hughes, P., Dodd, C., Connell, C. R.,
and Hood, L. E. 1986. Fluorescence detection in automated DNA sequence
analysis. Nature. 321(6071): 674–679.
Soeka Y.S. dan Sastraatmadja D.D. 1992. Pengaruh Penambahan Sumber-Sumber
Nitrogen Terhadap Produksi Enzim Selulase Oleh Aspergillus niger
Terseleksi Pada Media Dedak. Jurnal Penelitian. Bogor.
51
Sudiana, I.M. dan Rahmansyah, M. 2002. Aktivitas amilase dan selulase jamur
tiram putih yang ditumbuhkan pada medium ampas aren dan serbuk gergaji
kayu. Jurnal Mikrobilogi Indonesia. 7:7-10.
Surzycki, S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer. German.
Swofford, D.L., Olsen, G.J., Waddell, P.J. and Hillis, D.M. 1996. Phylogenetic
Inference. In: Hillis, D.M., Moritz, C. and Mable, B.K., Eds., Molecular
Systematics, 2nd ed. Sinauer Associates. Sunderland.
Turyoni, D. 2005. Pembuatan Dodol Tape Kulit Singkong (Cassava) Teknologi
Jasa dan Produksi. (Skripsi). Universitas Negeri Semarang. Semarang.
Vaseekaran, S., Balakumar, S., and Arasaratnam, V. 2011. Isolation and
Identification of a Bacterial Strain Producing Thermostable α- Amylase.
Tropical Agricultural Research. 22(1): 1.
Widyastuti, D. A. 2011. Isolasi DNA Kromosom Salmonella sp . dan
Visualisasinya pada Elektroforesis Gel Agarosa. Prosiding SNPBS (Seminar
Nasional Pendidikan Biologi dan Saintek) Ke-2. Semarang.
Yeates, C., Gillings, M. R., Davison, A. D., Altavilla, N., and Veal, D. A. 1998.
Methods for microbial DNA extraction from soil for PCR amplification.
Biological Procedure Online. 1(1):40-47.
Yuwono, T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Erlangga.
Jakarta.