lssN 0854-5154

Jurnal ternatika & SainsVolume 11 No. 4 Desember 2006

Pengaruh Triptofan pada Pertumbuhan dan Kandungan Katarantindari Kalus Catharanthus roseus

Dings e P andian ganl ), D e nni e H eroike Rompas2), H enry F ondct Aritonctn.s3 )

RizkitaRachmi Esyantia), clai nrty Manyani'l) - '-- ""-o

'

.',)Jttrttsan Biologi, Fakultas Matemrfiika clan llmu Pengetahttctn Alcmt, (Jniyersitas Sam Ratulartgi, Munaclo')Jurusan Biologi, Fakultas Matematika tlan llmu Pengetalutan Akun, (Jniversitas l,,legeri Manado, Tonclano

')Ju.rrlrnn Khniu, Fakultas Matematika clan llruu Pengetahtrcut Alum, (Jniversitas Sartt Ratulcutgi, Marrucloo)Progra,n Studi Biotogi, Sekolah llmtt clcut'leknoiogi Hayati, Institut Teknologi Banclung, Bandtutg

e -moil : ding s e p an@ yoho o. com

Diterima Juni 2006, diserujui untuk dipublikasikan Desember 2006

Abstrak

Pengaruh triptofon terlmdap pefiumbulnn dan kandungatT kcLtaratltitt pada kttLtur kalus Catharanthus roselis telahditeliti- Pertuntbuhan kalus C. roseus-],arlg, tliberitriptofan 100, 125 dan225 mg/Lrendahpada hari ke-21, trLmurtyrutgdiberi penantbahan 150, 175 datt 200 ng/L pertunbuhannya lebih baikctari kontrol. Kcutclulgan katarantirt kontrolataLt tatTpa triptofan adalah 123,22 pg/g bk. Kandungan katarantitt pada keencun kalus yang diberi perlakuan triptofan100' 125, 150, 175,200,225 mg/L adalah 485,00, 588,32,875,10, 905,26,781,10 dan 950,i4 pg/g bk. pertakuail,angoptimal untuk pefiumbuhan dan produksi katarantin dengan pencntbahan prekursor triptofan aiatah 175 mg/L a"",rgolpeningkatan kandungan katarantin sebesar I 13,90 7o .

Kata Kunci: Catharanthus roseus, KoltLs, Katarantin, Triptofan

Abstract

Research on the growtlt and catharctnthine content of Catharanthus roseus callus w,lticlt were treatel with tryptophanhad been done. Wet and dry weight o/Catharanthus roseus collus clecreased wlten treated with 100, 125 and 2-25 nry/Ltr1|ptopltan' but callus treated with 150, 175 cutd 200 ntg/L tryptophan grew better. Catharanthine contents ofihekontrol callus was 423,22 1tg/g dw. The treatrnettt ccLlli containi +'ss,oo,-5gg,32, g75,10, g05,26, 7g4,10 artd 950,541tg/g dw of catlmrantltine respectively. The optinml tryptophan treattilett for callus growth ancl cathara,tltirrcproduction was 175 mg/L tryptopltcut with a I 13,90 To. increase of catharanthine content.

Keywords : Catharanthus roseus, Cctllus, Catlmranthine, Tryptophan

1. Pendahuluan

Catharantlms roseus (L) G. Don yang seringdisebut tapak dara adalah set.rak tahunan yang banyakdibudidayakan sebagai tanaman hias dan obat.Tanaman tapak dara ini berguna untuk men-gobatihipertensi, diabetes, pendarahan akibat penurunanjumlah trornbosit, chorionic epithelionm, acutelyntplrccfiic leukenda, aalte nrcnocytic leukenia.limfosarkoma den sarkoma r.t retikulum(Wijayakusuma et al., 1992). Sekitar 100 macamalkaloid telah diidentifikasi pada tanaman ini,diantaranya adalah alkaloid anti kanker sepenivinblastin, vinkristin, katarantin clan leurosin (de paduaet al., 1999). Vinkistin dan vinblastin yang relahdikomersialkan kebanyakan berasal clari tapak dara (dePadua et al., 1999). Senyawa antikanker ini menekanatau menghambat pembelahan sel dengan n'rembekukar.rprotein nrikrotubular, terutama pada metafase(Alexaridrova et al., 2000; de paclua et at., 1999).

Kultur suspensi sel, kaius, tunas, akar danagregat sel C. roseus dapat menghasilkan alkaloid yanglebih banyak (Vazquez-FloIa et al., 1994; Kim et aL.,1994; Verpoorte et al., 1993; Smith er a1., lggi,;McCaskill et al., 1988). Keunrungan lain daripenggunaan kultur jaringan untuk produksi alkaloid iniadalah produksinya dapat diatur, kualitas dan hasilproduksinya lebih konsisten, biaya prociuksi lebih kecildan mengurangi penggunaan lahan (Sugiarso, 1999;Bajaj et a/., 1988; Hirata et o1.,1990a dan 1990b).

Menurut Matrel and Smirh (1983), agar produksimetabolit sekunder tinggi maka perlu optimasi faktor-faktor internal dan ekster"nal. Optimasi dapat clilakukandalam dua tahap, yaitu tahap perlumbuhan dan padatahap produksi. Pada tahap pertumbuhan, pengaturankondisi kultur diarahkan untuk memproduksi biomassadalam waktu dekat, sedangkan tahap pro<iuksi,pengaturan kondisi kultur untuk produksi metabolitsekunder. Selain optimasi pada ke<iua tahap cli atas,

111

L 12 J t] RNAL MATEM ATIKA DAN SAI,ryS, DESEM B ER 2006,

pendekatair lain yang dapat dilakukafl secara efektifuntuk meningkatkan produksi biomassa sel dan

metallolit sekunder adalah penambahan prekursor(prazat), eiisitasi dan amobilisasi.

Triptofan merupakan prekursor alkaloid indolkompleks, sepefti katarantin. Penambahan zat tersebut

dapat mengaktifkan sintesis alkaloid indoi komplekspada C. roseus (Zhao et aI.,2001).

Penelitian ini bertujuan untuk mempelajariresporls pertumbuhan kalus C. roseus terhadap

pemberian perlakuan variasi triptofan; sefta

pengaruhnya terhadap produksi katarantin pada kalus.

2. Metode

2.l Eksplan

Bahan-bahan yang digunakan adalah daun ke-3atau ke-4 dari tunas apical C. roseus yafig berbungaputih. Eksplan tersebut di peroleh dari LaboratoriumBotani Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam Universitas Sam Ratulangi.

2.2Medium

Medium untuk induksi kalus yang digunakandalam penelitian ini adalah medium induksi kalus yang

terdiri dari medium dasar Murashige dan Skoog (MS),2 mgll- napthalene acetic acid dan 0,2 mg/L Kinetin.Medium perlakuan adalah medium induksi kalus yang

ditambahkan dengan berbagai konsentrasi triptofan,yaitu: 100, 125, 150,115,200 dat225 mgll-.

2.3 Sterilisasi

Mediurn dan alat-alat yang digunakan terlebihdahulu disterilkan di dalam autoklaf pada suhu lzL'C,tekanan 15 psi selama 15 menit. Sterilisasi triptofandilakukan dengan membran filter selulosa asetat

(PTFE) 0,45 pm.Sumber eksplan yang akan ditanam pada

rnedium terlebih dahulu dicuci di bawah air trengalirselama 15 menit, kemudian direndam dalam etanol707o selama enam menit dan dibiias dengan H2O steril.Eksplan selanjutnya disterilisasi dengan natriumhipoklorit (NaClO) 27o selama sepuluh menit, laludibilas dengan H2O steril sebanyak tiga kali. Peralatan

kultur disterilkan secara aseptik dengan perendaman

pada etanol 907o dan pembakaran pada setiap kalipemakaian.

2.4 Induksi kalus

Penanaman dan induksi kalus dilakukan didalam kotak pemindah beraliran udara. Daun yang

telah disterilisasi dipotong-potoltg dengan ukuran 0,5 x0,5 cm2 dan selanjutnya ditanarn pada medium. Setelah

penanalnan, semua botol kultur clisimpan dalam ruangkultur pada suhu kamar.

voL. I I NO.4

2.5 Kultur kalus peilakuan triptofan

Kalus yang terbentuk setelah sekitar 28 haridisubkuitur sebesar 0,2 g ke media MS yang

mengandung triptofan. Setiap botol dikultur 2-3 kaius.Setelah 2l hari dalam medium perlakuan (subkultur 1),

kemudian dilakukan subkultur kembali ke mediaperlakuan yang sama. dengan besar kalus yang sama

dengan subkultur 1 untuk semua perlakuan. Kalusdipanen pada hari ke-10 seteiah subkultur ke-2.

Kemudian kaius dikeringkan dalam freeze dryer.Selanjutnya dilakukan ekstraksi dan analisis katarantindari kalus yang sudah kering.

2.6 Ekstraksi dan Isolasi alkaloid katarantin

Prosedur ekstraksi yang digunakan adalah

menurut metode Tikhomirof and Jolicoeur (2002),

Sumarsi et al. (1990), Pandiangan dan Nainggolan(2006) yang telah dimodifikasi. Sel dikeringkan dengan

freeze dryer selama satu malam atau sekitar L2 jam.

Bahan yang telah kering (0,1 g) dihaluskan dalammortar dan diekstraksi daiam 5 ml larutan metanolselama 2 jam sambil dikocok. Campuran kemudiandisentrifugasi pada 15.000g selama 5 menit dan

supernatan (ekstrak metanol) diambil kemudiandiuapkan dengan evaporator pada suhu 40 oC selama 1

malam. Ekstrak metanol kental diekstraksi lagi dengan

diklorometana dan selanjutnya dikeringkan sehingga

diperoleh ekstrak kering. Ekstrak tersebut dilarutkandalam I ml metanol HPLC, dan disaring dengan filterseluiosa asetat (PTFE) 0,45 pm.

2.7 Analisis Kandungan Katarantin secara Kualitatifdan Kuantitatif dengan Kromatografi Cair KinerjaTinggi IKCKT)

Analisis kualitatif dan kuantitatif untukkatarantin dilakukan dengan KCKT yang <lihubungkan

dengan kromatopak Shimadzu CR-7A Plus. Fase gerak

yang digunakan berupa larutan yang terdiri darimetanol : asetonitril : 5 mM diamonium hidrogen fosfat

=3'.4:3 secara isokratik. Kecepatan aliran lml/menit.Jenis kolom yang. digunakan adalah Shim-pack VP-ODS C18 0,15 m dengan diameter 4,6 mm. Panjang

gelombang IIV yang digunakan untuk mendeteksikatarantin adalah 22A nm. Sebelum analisis dilakukan,terlebih dahulu dilakukan filtrasi terhadap fase gerak

dan larutan sampel dengan membran PTFE 0,45 pm.

Sebagai senyawa pembanding digunakan standar

katarantin.

3. Hasil dan Diskusi

3.1 Induksi Kaius

Eksplan daun C. roseus yang ditanam pada

medium induksi kalus mengandung NAA 2 mgll- dan

kinetin 0,2 rngll-. Respons awal terjadi dengan'mengerutnya eksplan pada hari ke-6 setelah penanaman

l!

l

(kuitur). Proliferasi sel secara umum mulai terjadi padahari ke-S setelah kultur.

Pembentukan kalus pada hari ke-8 setelahpenanaman umumnya diikuti oleh pertumbuhan kalusyang makin membesar. Pada medium induksi kalusdengan menggunakan NAA 2 rng/L dan kinetin 0,2mg/L tidak terjadi pembentukan akar sampai pada harike-14 setelah kultur. Setelah hari ke-1E terlihat adanyabulu-bulu akar yang muncul di permukaan kalus. Halini menunjukkan adanya pengaruh keseimbanganauksin dan sitokirrin terhadap respons jaringan.Krikorian (1995) melaporkan bahwa akar terbentukdari kalus pada medium yang ditambahkan auksindengan konsentrasi lebih tinggi daripada sitokinin.Hasil penelitian Fitriani (i998) juga menunjukkan akarterbentuk pada medium dengan konsentrasi NAAantara 1 - l0 pM atau setara dengan 0,2 - 2,0 mgll-.Eksplan pada awal penanaman masih inengandung zatpengatur tumbuh (zpt) endogen yaag dibentuk padatanaman sebelum eksplan dikultur. Setelah zpt endogenpada eksplan habis terpakai, maka zpt medium yangditambahkan yang paling banyak berperan untukinduksi kalus. NAA berperan penting untuk induksiakar.

Tipe kalus yang dihasilkan berupa kalus kompak(data tidak ditampilkan). Kalus tipe ini menjadi kulturagregat sel pada kultur cair. Kalus yang terbentuk padaawal pertumbuhan berwarna putih. Pada tahapselanjutnya kalus mulai berwarna kuning kehijauan danakhirnya warna kalus menjadi kecoklatan pada bagiandasar pinggiran kalus. Setelah disubkultur, kalus yangsebelumnya kecoklatan perlahan-lahan kembaliberwarna krem sampai kehijauan diiringi pefiumbuhanyang semakin membesar. Perlumbuhan kalus rnenjadilebih cepat dan pencoklatan mulai berkurangdibandingkan dengan kuitur sebeluinnya.

3.2Peturnbuhan Kalus pada Media dengan PerlakuanTriptofan

Penampakan kalus pada media yang diberiperlakuan triptofan pada awalnya tidak ada perbedaanantara kontrol dengan perlakuan triptofan. Kalustampak tumbuh bersama-sama dan mengalamiperbesaran secara besama-sama, nalrun keadaan yangdemikian hanya berlangsung sampai hari ke 20. Setelahhari ke-21, kalus kontrol tantpak sebagian mengalamikematian sel atau nekrotis dengan warna cokiatkemerahan. Kalus yang dikultur pada perlakuantriptofan. masih tumbuh baik setelah 21 hari kulturpada media pellakuan (k:rlus tidak rnengalami neklotis)dan warnanya putih keabu-abuan. Hal ini menunjukkanbahwa kalus kontrol lebih cepat mengalami penuaandari pada kaius perlakuan triptofan. Hal ini didugakarena pertumbuhan kalus yang lebih cepat padakontroi yang diakibatkan auksin dalam sel kontrol lebihtinggi (Dahab and AbdLrl-aziz, 2006). Cepatnya

Pandiarryan dkk, Penganrh Triptofan Pada Peftumbuhan 113

pertumbuhan kalus menyebabkan media cepat habi dankalus kekurangan nutrisi. Penambahan triptofan didugamendorong perubahan sintesis auksin menjadi sintesisterpenoid indol alkaioid sehingga pertumbuhan menjadilambat (El Sayed and Verpoorte,2002).

Pertumbuhan kalus yang diamati daripenimbangan berat basah kalus (Gambar 1)

menunjukkan bahwa berat dan ukuran kalus kontrol(tanpa triptofan) pada umumnya lebih besar daripadakalus perlakuan triptofan. Berat dan ukuran kalus tidakselalu menurun dengan peningkatan konsentrasitriptofan. Ada penurunan pada T1 dan T2, tetapi padaT3 dan T4 hampir sama dengan kontrol, T5 lebih tinggidari kontrol, selanjutnya menurun lagi pada T6. Hal inimenunjukkan bahwa pengaruh triptofan sangat spesifikterhadap pertumbuhan sel. Ketika subkulturdiperpanjang sampai 72 hai, pada kalus T5 muncultunas daun, sedangkan perlakuan lainnya tidak adatunas daun. Hal ini menguatkan pemikiran bahwaekspresi gen dan aktivitas enzim untuk pertumbuhanmeningkat dan produksi metabolit sekundernya tentumenurun.

Berat basah kalus (g)

T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6

Kalus perlakuar triptofan

Gambar 1. Berat basah kalus yang diberi perlakuantriptofan (mg/L). 0 (T0) atau kontrol, 100 (Ti), 125(T2), 150 (T3), 175 (T4), 200 (T5) dan 225 (T6) padahari ke-10 setelah subkultur.

3.3 Analisis Kualitatif dan kuantitatif katarantin sel C.

toseus

Sampel kaius C. roseus dranalisis kandungankatarantinnya pada umur sei yang sama, yaitu padaumur 10 hari setelah subkultur pada media MS.Analisis kualitatif dengan menggunakan KCKTmenunjukkan bahwa waktu retensi untuk katarantinstandar adalah sekitar 8.16 menit. Hasil analisiskualitatif dan kuantitatif menunjukkan bahwa se1 C.

roseil.r menghasilkan katarantin pada semua sampei,baik yang diberi perlakuan ttiptofan tnaupun kontrol.Kandungan katarantin kontrol (T0) adalah sebesiir423,22 lLSlg bk. Katarantin pada T0 tersebut

3.5

3

){

2

1.5

l

I

I

)

II4 JURNAL I,IATEMATIKA l)AA/ SA/A/I!-, DESEfr,IBER 2006,

merupakan kandungan yang paling rendah. Kandungankatarantin mengalami peningkatan secara berurutan,dari Ti = 485,00 ltglgbk, T2 = 588,32 pglg bk, T3 =875,10 1tg/gbk,T4 = 905,26,rrglg bk dan T6 = 950,54pglg bk. Namun, T5 mengandung katarantin sebesar784,10 pglg bk atau lebih rendah dari T4 danmenunjukkan adanya pengecualian. T5 merupakan selyang paling tinggi pertumbuhannya. Hal ini mungkindisebabkan nutrisi untuk sintesis alka1oid, sepertikatarantin, digunakan untuk pertumbuhan. PenelitianFitriani (1998) menunjukkan bahwa kalus dengan berarkering rendah mempuyai kandungan alkaioid ajmalisintinggi. Kondisi cekaman dapat menginduksi sintesisalkaloid. Sebaliknya pada perlakuan T6 kandungankatarantinnya tinggi dibandingkan dengan sel yang lainyang diberi triptofan. Hal ini terjadi karena nutrisidimanfaatkan untuk sintesis dan metabolismekatarantin, bukan untuk pertumbuhan sel. Secarakeseluruhan kandungan katarantin pada T3 dan T4tinggi deinikian juga peftumbuhan selnya, bahkan lebihtinggi dari kontrol. Hal ini nienunjukkan bahwa pada.T4 (115 mg/L triptofan) merupakan media yang baikuntuk peningkatan kandungan katarantin.

Katarmtin (ug./g bk)

voL. li No.1

Tatrel 1. Peningkatan kandunganperlakuan triptofan

katarantin pada kalus

Kaius Katarantin Peningkatanrlakuan (pglg bk) (7o)

To 423,22 0T1 485,00 t4,60T2 588,32 39,0tT3 87*s,10 106,77T4 905,26 1 13,90T5 784,10 85,27T6 950,54 124,60

Triptofan (mg,rl-): 0 (T0) atau konrrol, 100 (Ti), 125(T2), 150 (T3), 175 (T4),200 (T5) dan 225 (T6).

Zhao et al. QA}l) melaporkan juga bahwakandungan katarantin meningkat dengan penambahantriptofan 300 mg/L dan 500 mg/L yang dikombinasikandengan asam suksinat pada kultur kalus kompak dari C.roseus. Pengaruh triptofan terhadap kultur itu bisameningkatkan atau menurunkan kandungan alkaloidtergantung tipe kultur yang digunakan.

5. Kesimpulan

1. Perlakuan triptofan terhadap kultur kalus menekanpertumbuhan pada umumnya.

2. Kandungan katarantin meningkat pada sernua kalusperlakuan triptofan, dengan peningkatan tertinggi124,60 Vo pada kalus T5 (200 mg/L).

3. Perlakuan triptofan oprimal adalah kandungankatarantin tinggi dengan pertumbuhan sama dengankontrol adalah kalus T4 (.I15 mgtL).

Ucapan Terima kasih

Penelitian ini didanai oleh program PenelitianHibah PEKERTI 2005 dengan nomor kontrak051/SPPPIPP|DP3WIY12005, ranggat 11 April 2005.Peneliti juga mengucapkan terimakasih kepada Dr.Magdi El-Sayed yang telah memberikan katarautinmurni.

Daftar Pustaka

Alexandrova, R., I. Alexandrova, M. Velcheva and T.Varadinova, 2000, Phytoproduct and Cancer,Exp. Patlrcl. Parttsitol.,4, 15-26

Bajaj, Y.P.S., M. Furmanowa and O. Olszowska,Biotechnology of the Micropropagation ofMedicinal and A.romatic Plants, in Bajaj,Y.P.S. (Ed.), i988, Bioteclmotogy irtAgricullture and Forestry, 4. Medicinal andAromotic Plants, Springer-Verlag. Berlin,60*1i3.

Dahab, T.A.M.A. and N.G. Abdul-azis, 2006,Physiological EfTect of Diphenylamin and

1200

*",uJ'p"r"*I o,o,'Jl 15 16

Gambar 2. Kandungan katarantin pada kalus C. roseusyang diberi triptofan (mg/L). 0 (T0) atau kontrol, 100(TI), t2s (T2), 150 (T3), 175 (T4), 200 (T5) dan 225(r6).

Peningkatan kandungan katarantin terjadi jugapada semua kalus perlakuan triptofan. Peningkatantertinggi terjadi pada T6 sebesar 124,607o (Tabel l),namun peftumbuhan kalusnya sangat rendah (tebihrendah dari kontrol (Gambar 1). Pertumbuhan yangsarna dengan kontrol dengan peningkatan kandungankatarantin 113,907o terjadi pada kalus T4 (1754 mgfi-triptofan). Ivlaka dari hasil tersebut perlakuan yangterbaik untuk produksi katarautin dengan prazattriptofan adalah 175 mg/L (sel T4). Produksi katarantinakan maksimal apabila pertumbuhan se1 (biomassa) dankandungan katarantin berada pada kondisi optimal.

Tryptophan on the Growth and ChemicalCoristituents of Philodendron erubescensPlants, World J. Agr. Sci.,2:1,15-El

de Padua, L.S., N. Bunyapraphatsara, and R.H.M.J.Lemmens, (Eds.), 1999, PLati Resout-ces ofSoutlt East Asia no. l2(l). Medicinal andPoisonous plants 1. PROSEA Foundation,Bogor, Indor.resia, 185-190

El-Sayed, M. and R. \rerpoorle, 2002, Effect ofPhytohormones on Growth and AlkaloidAccumulation by a C. roseus Cel| SuspensionCultures Fed with Alkaloid PrekursorsTriptamnine and Loganin. Plant Cell TissueOrg Cult, 6823,265-210

Fitriani, A., 1998, Pengaruh Pemberian HomogenatJamur Pythium opfumidermatnn (Edson)Fitzp. Terhadap Kandungan Ajmalisin dalamKultur Kalw Catltaranthus roseus (L.) G.Don,[Tesis], Pascasarjana ITB, Bandung.

Hirata, K., M. Horiuchi, T. Ando, K. Miyamoto and y.Miura, 1990a, Vindoline and CatharanthineProduction in Muitiple Shoot Cultures ofCatharanthus roseus, J. Fernrcnt. Bioeng.,7023,193-195.

Hirata, K., A. Yamanaka, N. Kurano, K. Miyamoto andY. Miura, 1990b. Production of indoleaikaloids in multiple shoor culture ofCatharantltus roseus, Agric. Biol. Chem. 5125,1311 - 1317.

Kim, S.W., K.H. Jung, S.S. Kwak and J. R. Lia,1994,Relationship between ceil morphoiogy andindole alkaloid production in suspensioncultures of Catlrrruihus roseus, plant CellRep. 14,23-26.

Krikorian, A.D., 1995, Hormones in tissue culture andmicropropagation. In: Davies PI, ed. plcuttho rmone s. Dordrecht: Kluwer, 1 1 4-1 96.

Mattel, S.H. and H. Srnith, 1983, Cultural Facror thatInfluence Secondarv MetabolitesAccumulation in Plant Cell and TissueCultures, irz Matel, S.H. and H. Smith (Eds.),Plati Biotechnology, Cambridge University,London. l5-102,

McCaskill, D.G., D.L. Marrin, and A.I. Scou, 1988,Characterization of alkaloid uptake by

Pandiangan dkk, Petryarulr Triptofan Pada Pefiuttbufum I i5

Catharanthus roseus protoplast, pLant

Physiol", 87 , 402-408.Pandiangan, D. dan N. Nairggolan,2006, peningkatan

Kandungan Katarantin pada Kultur Kalus C.roseus yang Diberi NAA, Hayati, 13:3, 90-94.

Smith, J.I., N.J. Smart, M. Misawa, W.G.W. Kurt, S.G.Tallevi and F. DiCosmo, 1987, IncreaseAccumuiation of Indole Alkaloids by SomeCell Lines of Cilharantlurs roseus inResponse to Addition of Vanadyl Sulfate,Plant Cell Rep., 6,142-145.

Sumarsi. S. Darjianto, dan Suprapto, 1990, IsolasiKomponen Aktif Daun Tapak Dara, BalaiBesar Penelitian dan Pengembangan IndustriHasil Perranirn.

Sugiarso, D., 1999, Kadar Alkaloid Total KalusCatlnranthus roseus (L).G. Don pada MediaMS den-9an Penambahan Triptofan, HasilPenelitian Institut Teknologi SepuluhNopember Surabaya, XIL

Tikhomiroff, C. and M. Jolicoeur, 2002, Screening ofCatlnranthus roserzs Secondary Metabolitesby High-performance Liquid Chromatography,J. Chromatogr A, 955,87 -93.

Vazquez-Flota, F., O. Moreno-Valeujuela, M.L.Miranda-Ham, J. Coello-Coello, and V.M.Loyola-Vargas, 1994, Catharanthine andAjmalisine Synthesis in Catharantltus roseusHairy Root Cultures, Plant Cell Tissne OrgCult, 38,213-219.

Verpoofte, R., R. van der Heijden, J. Schripsema, 1993,Plant Cell Biotechnology for the production ofAlkaloids: Present Status and prospects, ,/.

Nat. Prod., 56:2, 186-207.Wijayakusuma, H.M.H., S. Dalihmarta, A.S. Winar,

1992, Tanantctn Berklmsiat Obat di Indonesict,Jilid I, Pustaka Karrini, Ikapi Jaya.

Zhao,J., Q.Hu, Y.Q. Guo, W.H. Zhu,200t, Effects ofStress Factors, Bioregulators. and SyntheticPrekursors on Indole Alkaloid production inCompact Callus Clusters Cultures ofCatharanthtrs roseus, AppL. Microbiol.Biotec hnol., 55:6, 693-8.

J