judul patobiologi hiperglikemia pada jaringan … · 1 laporan akhir penelitian fundamental judul...
TRANSCRIPT
1
LAPORAN AKHIR PENELITIAN FUNDAMENTAL
JUDUL PATOBIOLOGI HIPERGLIKEMIA PADA
JARINGAN PANKREAS TIKUS
Tahun ke 1 dari rencana 1 tahun
KETUA/ANGGOTA TIM Prof. Dr. Drh. Iwan H. Utama, MS
NIDN. 0006046109 Drh. I Made Kardena, MVS
NIDN. 0010037902
Dibiaya dari Dana RM Universitas Udayana dengan surat Perjanjian Penugasan Penelitian No:175.59/UN14.2/ PNL.01.03.00/2013, Tanggal 16 Mei 2013
UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR-BALI
Oktober, 2013
Judul
Peneliti/Pelaksana
Nama Lengkap
NIDN
Jabatan Fungsional
Program Studi
No. HP
Alamat surel
A-nggota ( 1)
Nama Lekap
NIDN
Perguruan Tinggi
Tahrur Pelaksanaan
Biaya TahuB e4'alan
Biaya Keseluruhan
IIALAMAN PENGESAHAN
: Patobiologi Hiperglikemia pada Jaringan pankreas Tilars
: Prof Dr. drh. Iwan H. Utama, MS
: 0006046109
: Guu Besar
: Kedokteran Hewan
: 081337755860
: iwarihu2006@gnail. com
: Drh. I Made Kardena, MVS
: 00i0037902
: Universitas Udayana
:2013
: Rp. 48.020.000
: Rp.48.020.000
Denpasar, 30 Oktober 2013Ketua Peneliti
f Dr. drh. Iwan H. Utama, MS)NIPNTP 19610406198903 1 002
Mengetahui
hfi?.'s,i:
3
RINGKASAN
Pada kondisi hiperglikemia kronis, sebenarnya sel mengalami keracunan glukosa (toksisitas glukosa). Paparan kronis hiperglikemia dapat menyebabkan disfungsi seluler yang menetap atau dapat menjadi ireversibel, proses ini yang disebut toksisitas glukosa. Toksisitas glukosa merupakan awal mekanisme kerusakan sel melalui pembentukan radikal bebas atau spesies oksigen reaktif (ROS=reactive oxygen species) (Robertson, 2004). Produksi radikal bebas yang berlebihan, seperti hidrogen peroksida, superoksida anion, dan hidroksil dapat merusak komponen membran sel diantaranya lipid dan protein membran sel.
Telah dilakukan penelitian mengenai patobiologis hiperglikemia pada jaringan pankreas tikus. Tujuanya adalah untuk mengetahui patobiologis jaringan pankreas tikus akibat hiperglikemia, yang meliputi kadar malonaldehida (MDA) pada pankreas, profil sel beta pankreas, dan gambaran histopatologi jaringan pankreas. Sebanyak 20 ekor tikus jantan putih strain Spraque dawley umur sekitar 2 bulan dengan bobot badan rata-rata 200 g digunakan dalam penelitian ini. Tikus percobaan dibagi menjadi 2 kelompok perlakuan, tiap perlakuan terdiri dari 10 ekor tikus. Tikus perlakuan kontrol dan Tikus perlakuan hiperglikemia (HG) diberikan larutan sukrosa 80% (w/v) secara oral dua kali sehari selama 2 bulan. Pengamatan dilakukan terhadap (1) analisis kadar glukosa darah dengan metode glucose oxidase biosensor menggunakan alat Blood glucose Test Meter GlucoDr™, (2) analisis kadar malonaldehida menggunakan metode spektrofotometri, (3) analisis sel beta pankreas secara imunohistokimia, dan (4) gambaran histopalogi pankreas tikus menggunakan pewarnaan Hematoksilin Eosin.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa tikus percobaan mengalami hiperglikemia selama 1 bulan dengan kadar glukosa akhir sebesar 139,5±5,2 mg/dl sedangkan kadar glukosa kelompok perlakuan kontrol rata-rata sebesar 97,8±4,3 mg/dl. Hiperglikemia menyebabkan terjadinya perubahan kondisi patobiologis pada jaringan pankreas, yaitu meningkatnya kadar malonaldehida (MDA) rata-rata 31,85 ± 5,69 picomol/g dan kelompok kontrol rata-rata 22,94 ± 3,82 picomol/g. Pada jaringan pankreas tikus yang mengalami hiperglikemia juga ditemukan degenerasi ringan, dan secara kualitatif terdapat penurunan massa sel beta.
Kata-kata kunci: pankreas, hiperglikemia, malonaldehida, sel beta
4
PRAKATA
Hiperglikemia adalah suatu keadaan dimana kadar glukosa darah melebihi kadar glukosa darah normal di dalam tubuh. Hiperglikemia dapat mendorong produksi radikal bebas yang berlebihan melalui proses posporilasi oksidatif glukosa. Radikal bebas yang berlebihan dapat menyebabkan kerusakan membran sel, tidak terkecuali sel jaringan pankreas. Selain itu, hiperglikemia kronis juga menyebabkan sel beta mengalami kelelahan karena harus mengsilkan hormone insulin. Kondisi kelelahan ini juga mempercepat kerusakan sel beta.
Penelitian dengan judul: Patobiologi Hiperglikemia pada Jaringan Pankreas tikus, tahun 2013 telah selesai dilakukan. Subyek yang diteliti meliputi kadar malonaldehida (MDA) pada pankreas, profil sel beta pankreas, dan gambaran histopatologi jaringan pankreas.
Bersama dengan telah selesainya penelitian ini, kami tim peneliti mengucapkan banyak terimakasih yang sebesar-besarnya kepada:
1. Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan Nasional dan Rektor
Univesitas Udayana yang telah memberikan biaya penelitian dari Dana RM Universitas Udayana dengan surat Perjanjian Penugasan Penelitian No:175.59/UN14.2/ PNL.01.03.00/2013, Tanggal 16 Mei 2013.
2. Ketua Lembaga Penelitian Universitas Udayana, atas pengajuan dan pegesahan proposal ini.
3. Dekan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana, atas ijin dan kepercayaan untuk melakukan penelitian.
4. Kepada semua tenaga laboran yang telah membantu penelitian ini saya ucapkan banyak terimakasih.
Semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat bagi temen sejawat yang berkecimpung
mendalami hiiperglikemia dan juga bermanfaat dalam mengembangkan ilmu pengetahuan.
Denpasar, 30 Oktober 2013
Tim Peneliti
5
DAFTAR ISI
RINGKASAN ………………………………………………………………………
PRAKATA …………………………………………………………………………
DAFTAR ISI ………………………………………………………………………
DAFTAR TABEL …………………………………………………………………
DAFTAR GAMBAR ………………………………………………………………
DAFTAR LAMPIRAN ……………………………………………………………
BAB 1. PENDAHULUAN ………………………………………………………...
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ………………………………………………….
BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN …………………………….
BAB 4. METODE PENELITIAN …………………………………………………
BAB 5. HASIL DAN PEMBAHASAN ……………………………………………
BAB 6. KESIMPULAN DAN SARAN …………………………………………..
DAFTAR PUSTAKA ………………………………………………………………
LAMPIRAN ………………………………………………………………………...
Halaman
3
4
5
6
6
6
7
9
12
13
16
21
22
24
6
DAFTAR TABEL Nomor Teks Halaman 1. Kadar glukosa darah (mg/dl) tikus selama 8 minggu percobaan …………. 2. Rata-rata kadar malonaldehida (MDA) pada pankreas tikus percobaan …….
17
18
DAFTAR GAMBAR
Nomor Teks Halaman 1. Radikal bebas yang dihasilkan melalui jalur metabolisme glukosa pada
kondisi hiperglikemia ……………………………………………………….
2. Profil kadar glukosa darah tikus selama 8 minggu percobaan …………….
3. Kadar Malonaldehida (MDA) pada pankreas tikus selama percobaan ……
4. Foto mikrograf pewarnaan imunohistokimia terhadap insulin pada sel beta
jaringan pankreas …………………………………………….. …………….
5. Foto mikrograf pulau Langerhans pankreas tikus pewarnaan HE ……….
10
16
18
19
20
DAFTAR LAMPIRAN
Nomor Teks Halaman 1. Biodata Personalia Tenaga peneliti …………………………………..
2. Draft Artikel Ilmiah …………………………………………………..
24
31
7
BAB 1. PENDAHULUAN
Manusia dan juga hewan tidak luput dari keadaan stres oksidatif dengan tingkat
keparahan dan penyebab berbeda dan dapat menghasilkan jumlah radikal bebas dalam tubuh
melebihi jumlah antioksidan endogen. Pada kondisi stres oksidatif dapat terjadi kerusakan sel
akibat radikal bebas bila kemampuan mekanisme pertahanan tubuh seperti enzim antioksidan
seluler menurun. Oleh karena itu perlu dilakukan usaha-usaha dalam mencegah terjadinya stres
oksidatif atau mencegah pencetus terbentuknya radikal bebas di dalam tubuh yang berlebihan,
misalnya mencegah supaya tidak terjadi kondisi hiperglikemia kronis.
Kebanyakan populasi di belahan dunia, termasuk di Indonesia mengkonsumsi
karbohidrat dalam jumlah tinggi. Disadari atau tidak bahwa sedari kecil kita telah terpapar
dengan karbohidrat melalui menu makan yang dihidangkan sehari-hari, bahkan terasa belum
komplit apabila menu kita tidak mengandung glukosa (gula). Kelebihan karbohidrat (glukosa)
di dalam tubuh yang sering disebut dengan hiperglikemia merupakan titik awal terjadinya
pembentukan radikal bebas melalui berbagai mekanisme metabolisme biokimiawi (Robertson,
2004).
Stres oksidatif adalah suatu kondisi yang berhubungan dengan peningkatan kecepatan
kerusakan sel akibat radikal bebas. Hal ini disebabkan oleh ketidak seimbangan antara
pembentukan radial bebas dan aktivitas pertahanan antioksidan. Kondisi yang berhubungan
dengan peningkatan produksi radikal bebas meliputi berbagai proses kimia kompleks dalam
tubuh yang melibatkan aktivitas organel mitokondria terutama dalam menghasilkan ATP
(Newsholme et al., 2007). Pada keadaan glukotoksisiti (Robertson et al., 2004), proses
pagositosis dalam sistim imun, infeksi, dan inflamasi (Freisleben, 2001), serta terpapar dengan
bahan kimia dan zat diabetogenik (Szkuldelski 2001) menyebabkan terbentuknya radikal bebas
yang tinggi di dalam tubuh .
Karbohidrat tidak saja penting dalam makanan manusia sebagai sumber energi, tetapi
karena bahan pangan berkarbohidrat tinggi berlimpah dan murah bila dibandingkan dengan
protein dan lemak. Oleh karena itu, karbohidrat menjadi bagian utama makanan di hampir
semua bagian di dunia. Studi epidemiologi menunjukkan ada kaitan erat antara status
kesehatan dan usia harapan hidup manusia dengan pola konsumsinya. Masyarakat di daerah
yang banyak mengkonsumsi gula, lemak dan garam misalnya, ternyata lebih banyak ditemukan
sebagai penderita penyakit degeneratif.
8
Pemberian jumlah karbohidrat yang berlebih dalam jangka waktu lama dapat
menimbulkan apa yang disebut dengan hiperglikemia. Hiperglikemia kronis cenderung
menimbulkan efek yang tidak baik bagi kesehatan tubuh. Hiperglikemia kronis cenderung
mendorong terbentuknya radikal bebas yang dapat merusak komponen sel (lipid, karbohidrat,
protein, dan DNA) (Robertson, 2004). Kerusakan oksidatif tersebut merupakan cikal bakal
munculnya penyakit degeneratif, misalnya seperti diabetes.
Pada kondisi hiperglikemia, sel beta pankreas akan merespon dengan cara
mengeluarkan insulin. Insulin berfungsi untuk menurunkan kadar glukosa darah melalui
mekanisme memasukan glukosa ke dalam sel untuk selanjutnya mengalami metabolisme
(Dominiczak, 2005). Jika kejadian hiperglikemia berlangsung lama (kronis), maka sel beta
secara terus menerus menghasilkan insulin. Kondisi ini dapat menyebabkan sel beta
mengalami kelelahan bahkan kerusakan sehingga produksi insulin bisa jadi berkurang. Dilain
pihak, pada keadaan hiperglikemia, glukosa akan cenderung mengalami metabolisme kearah
pembentukan radikal bebas (Robertson, 2004). Radikal bebas yang terbentuk akan bereaksi
dengan komponen membran sel. Reaksi berantai radikal bebas tersebut menyebabkan
kerusakan pada membran sel.
Kondisi hiperglikemia tersebut akan menyebabkan perubahan patobiologi pada
pankreas sehingga perlu dilakukan pengamatan terhadap kadar MDA pankreas, sel beta
pankreas, gambaran histopatologi pankreas serta kerusakan DNA melalui analisis 8-hidroksi-
2-deoksiguanosin pada plasma.
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui patobiologis hiperglikemia terhadap
jaringan pankreas tikus, yang meliputi kadar malonaldehida (MDA) pada pankreas, profil sel
beta pankreas, dan gambaran histopatologi jaringan pankreas. Temuan yang ditargetkan/luaran,
yaitu publikasi ilmiah dijurnal ilmiah nasional terakreditasi, dan serangkaian pengetahuan
dasar (basic knowledge) tentang pengaruh hiperglikemia terhadap pankreas akan sangat
bermanfaat dalam penyiapan bahan ajar mata kuliah Biokimia II, khususnya materi
metabolisme karbohidrat.
9
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA
Kemajuan pengetahuan di bidang biokimia, biologi molekuler, imunohistokimia dan
patologi telah mendukung hipotesis bahwa radikal bebas berperan dalam perubahan berbagai
fungsi tubuh sehingga berpengaruh terhadap resiko timbulnya penyakit. Dengan pengetahuan
ini telah banyak dihasilkan temuan-temuan bahan hayati yang sangat berguna dalam usaha
pencegahan maupun pengobatan penyakit non-infeksius, stres oksidatif, dan penyakit
degeneratif seperti diabetes, aterosklerosis.
Penyakit diabetes merupakan sindroma multifaktor yang secara metabolik dikarakterisasi
dengan kondisi hiperglikemia kronis yang timbul akibat ketidakmampuan pankreas
memproduksi insulin yang cukup atau ketidakmampuan tubuh menggunakan insulin secara
efektif (Auroma et al. 2006). Faktor penyebab penyakit diabetes meliputi faktor genetik,
obesitas, radikal bebas, sistem kekebalan (Virtanen dan Knip 2003).
Hiperglikemia bisa dibuat dengan diet tinggi karbohidrat untuk waktu yang lama,
pankreatomi (pengangkatan pankreas) atau pemberian agen diabetogenik seperti aloksan dan
streptozotocin (Szkudelski, 2001). Dalam keadaan normal diet karbohidrat menyebabkan
kenaikan kadar glukosa darah yang selanjutnya akan merangsang sekresi insulin dari sel β
pulau Langerhans pankreas. Diet karbohidrat yang lama akan menyebabkan kelelahan sel β
pankreas yang berakibat rusaknya sel β tersebut sehingga akan terjadi hiperglikemia.
Hiperglikemia kronis dapat mendorong produksi radikal bebas yang berlebihan dari
proses posporilasi oksidatif glukosa. Menurut Robertson (2004), dalam keadaan hipergikemia
akan terjadi pembentukan radikal oksigen spesies (ROS) arau radikal bebas yang berlebihan.
Beberapa jalur metabolisme biokimia yang terlibat dalam mekanisme pembentukan ROS,
diantaranya (1) autooksidasi glukosa, (2) pembentukan dikarbonil dan glikation, (3) aktivasi
protein kinase C (PKC activation), (4) metabolisme sorbitol, (5) metabolisme heksosamin dan
(6) posporilasi oksidatif. Pembentukan radikal bebas yang belebihan pada keadaan
hiperglikemia dapat memicu penurunan kandungan enzim antioksidan dan kerusakan jaringan
pada pankreas. Hal inilah yang dapat menyebabkan terjadinya salah penyakit degeneratif yaitu
diabetes. Kondisi hiperglikemia kronis dan jalur biokimia metabolisme glukosa sampai
menghasilkan ROS diperlihatkan pada Gambar 1.
10
Gambar 1. Radikal bebas yang dihasilkan melalui jalur metabolisme glukosa pada kondisi
hiperglikemia (Robertson, 2004).
Percobaan pada tikus menunjukkan pemberian vitamin E pada tikus dalam kondisi
hiperglikemia dapat mencegah pembentukan malonaldehida (MDA) tetapi tidak berpengaruh
terhadap kadar glukosa darah (Suarsana et al, 2011). Penelitian pada tikus yang diinjeksi
dengan streptozotocin dosis 65mg/kg intraperitoneal (IP) menujukkan kadar glukosa darah
mencapai 400 mg/dl, dan kadar malonaldehida (MDA) darah 171 nmol/100 ml. Kenaikan
kadar MDA juga diiukuti dengan kenaikan kadar enzim superoksida dismutase (SOD) 539
IU/mg Hb dan glutation peroksidase (GPx) 17 IU/mg Hb, dan jumlah sel beta menurun disertai
dengan degenerasi (Rasal et al., 2008).
Hasil penelitian Kim et al (2006) menunjukkan tikus yang diinduksi dengan zat
diabetogenik aloksan menyebabkan kadar glukosa darah meningkat sebesar 507 mg/dl. Selain
itu, terjadi kerusakan pada hati yang ditandai dengan meningkatnya ensim GOT, GPT dan
LDH masing-masing 288; 161; dan 1167 unit/l. Total kolesterol meningkat sebesar 76 mg/dl
dan triasilgliserida sebesar 262 mg/dl. Semua kadar yang disebutkan diatas jauh melebihi kadar
normal.
Tubuh memiliki sistem pertahanan antioksidan enzimatik maupun non-enzimatik untuk
menetralkan pengaruh toksik senyawa radikal bebas. Peran antioksidan ini dapat diartikan
sebagai suatu fungsi homeostasis dari organsime untuk menanggulangi akibat-akibat merusak
dari stres oksidatif terhadap jaringan dan organ yang terpengaruh (Asikin 2001; Soewoto
2001). Antioksidan enzimatik meliputi superoksidae dismutase (SOD), glutation peroksidase
(GPx) dan katalase. Enzim SOD berperan dalam dismutasi radikal anion superoksida menjadi
Hiperglikemia kronis
Disfungsi sel beta
Enzim antioksidan -SOD -Glutation peroksidase -Katalase stres
oksidatif
ROS
11
hidrogen peroksida, sedangkan GPx dan katalase berperan dalam detoksifikasi hidrogen
peroksida menjadi air dan oksigen. Antioksidan non-enzimatik meliputi nutrien seperti vitamin
(α-tokoferol, vitamin C, vitamin A), tranferin, laktoferin, seruloplasmin, dan senyawa bioaktif
yang tergolong senyawa fitokimia seperti derivat fenol, flavonoid.
Sifat reaktif ROS dan berbagai oksidan lainnya dapat berakibat toksik bagi sel dengan
perannya memulai rangkaian reaksi peroksidasi lipid menghasilkan berbagai radikal,
hidroperoksida, dan aldehida khususnya malonaldehida (MDA) (Luczaj dan Skrzydlewska,
2003).
MDA merupakan salah satu produk akhir pada peroksidasi lipid. Kadar MDA akan
meningkat pada kondisi tekanan stres oksidatif meningkat, pada berbagai kondisi patologis,
dan infeksi sebaliknya kadar MDA akan rendah bila sistim pertahanan antioksidannya baik.
Pengukuran kadar peroksidasi lipid digunakan sebagai indikator stres oksidatif pada sel
dan jaringan. Peroksidasi lipid bersifat tidak stabil dan terurai menghasilkan sejumlah senyawa
termasuk senyawa karbonil yang aktif. Peroksidasi asam lemak tidak jenuh ganda terurai
menghasilkan malonaldehid (MDA) dan 4-hidroksialkenal (Tug et al., 2005). Hasil peroksidasi
lipid dapat diperiksa dengan berbagai cara, baik tidak langsung seperti pembentukan konjugat
MDA dengan asam tiobarbiturat (TBARs) atau langsung dengan HPLC. Pengukuran MDA
dianggap mudah dilakukan baik dengan cara spektrofotometri atau fluorometrik (Chonti et al.,
1991).
MDA juga dapat ditemukan pada urine pada kondisi dimana terjadi peningkatan
peroksidasi lipid seperti pada keadaan defisiensi vitamin E, kadar ion Fe yang tinggi dan kadar
kolesterol atau asam lemak poli tidak jenuh (FUPA) yang tinggi dalam jaringan (Draper et al.,
1984).
Radikal bebas dapat menyerang protein dan menghasilkan karbonil dan asam-asam
amino termodifikasi termasuk metionin sulfoksida dan peroksida protein. Modifikasi protein
diprakarsai oleh radikal hidroksil yang utamanya mengoksidasi rantai samping asam-asam
amino untuk menghasilkan ikatan silang antara protein dan menyebabkan protein
terfragmentasi. Protein mempunyai banyak tempat reaktif yang dapat dirusak selama stres
oksidatif, tetapi sangat menarik pada tiga peristiwa yang dapat diukur (Thomas, 1999).
Pertama, radikal bebas reaktif seperti radikal hidroksil dapat memecah protein di dalam
plasma, dan produk pecahannya adalah suatu protein spesifik yang dapat dideteksi. Kedua,
protein mengandung sisi ikatan metal yang secara khusus sangat peka terhadap kejadian
oksidatif melalui interaksi dengan metal. Reaksi ini umumnya menghasilkan modifikasi
produk yang ireversible. Terakhir, banyak protein intraseluler mempunyai gugus sulfidril,
12
reaktif pada residu sistein spesifik yang dapat dimodifikasi (oksidasi) menjadi bentuk
spesifik (disulfides) yang dapat direduksi kembali melalui proses metabolik. Petanda
kerusakan protein akibat serangkain reaksi tersebut diatas adalah karbonil, 8-deoskiguanosin,
thiol, dan protrin oksidai lainnya.
Menurut Asikin (2000), analisis 8-hidroksi-2-deoksiguanosin dapat digunakan untuk
mengukur produk kerusakan sel akibat stres oskidatif. Senyawa 8-hidroksi-2-deoksiguanosin
terbentuk pada proses perbaikan DNA yang mengalami kerusakan akibat proses penuaan, dan
penyakit degeneratif. Kadarnya dapat diukur di dalam plasma, serum atau urin dengan teknik
ELISA
BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN 3.1. Tujuan Pelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui patobiologis hiperglikemia terhadap
jaringan pankreas tikus, yang meliputi kadar malonaldehida (MDA) pada pankreas, profil sel
beta pankreas, dan gambaran histopatologi jaringan pankreas.
3.2. Manfaat Penelitian
Dapat memberi informasi mengenai efek atau gambaran patobiologis jaringan pankreas
pada tikus dalam kondisi hiperglikemia. Dengan demikian dapat dihindari terjadinya kondisi
hiperglikemia dalam kondisi berkepanjangan.
13
BAB 4. METODE PENELITIAN
Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan di laboratorium Biokimia Veteriner FKH, dan Lab. Patologi
BBVet Denpasar.
Bahan dan Alat penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: Tikus strain spraque dawley umur 2
bulan, kandang tikus dan perlengkapannya, pakan tikus, syring 2,5 cc, canul, dan sukrosa.
Bahan pemeriksaan kadar MDA (sigma): TEP (1,1,3,3-tetraethoxypropane) (T-9889), BHT
(butylated hydroxytoluene), TCA (thricloroacetic) (ACS Reagent) (T-9159), TBA (thio
barbituric acid) dan 0.25 N HCl, dan strip test glukosa. Larutan H2O2, Serum normal (BSA)
10%, Antibodi primer monoklonal anti-insulin dan glukagon, Antibodi sekunder DEPS (Dako
Envision Peroxidase System), larutan DAB (diaminobenzidine), larutan Hematoksilin
(counterstain).
Alat yang digunakan adalah: Spectrophotometer UV/VIS, tissue processor, tissue tek
model TEC, Parafin cleaner, inkubator, penangas air, Sentrifugasi mikro, freezer -80 oC,
magnetik stirer, homogenizer, timbangan, vortek, mikro-pipet, mikroskop yang dilengkapi
dengan kamera, GlukoDr®, tip, tabung reaksi dan rak serta seperangkat glasswares.
Metode Penelitian
4.1. Persiapan hewan percobaan
Pada penelitian ini digunakan 20 ekor tikus jantan putih strain Spraque dawley umur
sekitar 2 bulan dengan bobot badan rata-rata 200 g. Tikus percobaan dibagi menjadi 2
kelompok perlakuan, tiap perlakuan terdiri dari 10 ekor tikus. Tahap persiapan tikus
percobaan meliputi masa adaptasi selama 2 minggu dengan pemberian ransum komercial dan
air minum secara ad libitum. Tikus perlakuan hiperglikemia (HG) diberikan larutan sukrosa
80% (w/v) secara oral (air minum) setiap hari selama 2 bulan. Larutan sukrosa diberikan dua
kali sehari hari mulai pukul 08.00dan 18.00 Wita. Kelompok perlakuan yang dicobakan adalah
sebagai berikut:
a. Kelompok I (tikus kontrol), yaitu tikus normal hanya diberi air minum dan ransum.
b. Kelompok II (tikus hiperglikemia=HG), yaitu tikus yang diberi larutan sukrosa 80%
dua kali sehari secara oral dan diberi ransum komersial.
14
Perlakuan pada seluruh kelompok diberikan selama 2 bulan. Pada akhir penelitian, semua
tikus dikorbankan dengan cara dibius dengan ketamin-HCl. Segera setelah mati, tikus dibedah
dan jaringan pankreas diambil untuk analisis kadar malonaldehida (MDA), dan pewarnaan
histopatologi.
2. Analisis kadar glukosa darah
Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan pada hari ke 0 (data base awal) dan setiap 1
minggu selama 2 bulan. Kadar glukosa darah tikus percobaan ditentukan dengan metode
glucose oxidase biosensor, menggunakan alat Blood glucose Test Meter GlucoDr™ model
AGM-2100 (diproduksi oleh allmedicus Co Ltd., Korea). Darah diambil dari ujung ekor tikus
yang sebelumnya telah dibersihkan dengan alkohol 70%, lalu diurut perlahan-lahan kemudian
ujung ekor ditusuk dengan jarum kecil (syring 1 cc) (Kim et al. 2006). Darah yang keluar
kemudian disentuhkan pada strip glukometer. Kadar glukosa darah akan terbaca dilayar
GlucoDr™ setelah 11 detik dan kadar glukosa darah dinyatakan dalam mg/dl.
3. Analisis kadar malonaldehida (MDA)
Preparasi sampel
Preparasi dan pengukuran kadar MDA menggunakan metode menurut Capeyron et al.
(2002). Homogenat pankreas untuk analisis MDA dibuat dengan cara 0,5 g pankreas
dicincang halus dalam kondisi dingin kemudian ditambah dengan 2 ml PBS pH 7,4 dan
dihomogenkan. Homogenat yang dihasilkan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm 4oC
selama 20 menit. Bagian supernatan (lisat) diambil dan segera disimpan pada suhu -4oC untuk
dianalisis kemudian.
Prosedur pengukuran
Sebanyak 0,5 ml sampel (lisat pankreas) atau standar ditambah dengan 2 ml campuran
HCl 0,25 N dingin yang mengandung 15% TCA, 0,38% TBA dan 0,5% BHT. Campuran
larutan ini dipanaskan 80 0C selama 1 jam. Setelah dingin, campuran larutan dan standar
disentrifugasi 3500 rpm selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh diambil dan diukur
absorbansinya pada λ 532 nm. Sebagai larutan standar digunakan TEP (1,1,3,3-
tetraetoksipropana). Caranya adalah membuat larutan kerja 5 µM TEP dengan mengencerkan
larutan induk (stok) standar 2,5 mM TEP sebesar 500 kali dengan pelarut air bebas ion.
Larutan standar MDA dibuat dengan mengencerkan larutan kerja (5 µM TEP) hingga
diperoleh konsentrasi standar sebesar 0; 25; 50, 75; 100; 125; 150; 175; dan 200 pmol/50 µl.
15
Kurva standar dibuat dengan memplotkan nilai absorbansi (sumbu Y) dengan konsentrasi
standar (sumbu X). Kadar MDA sampel yang diperoleh dinyatakan dalam satuan picomol/g.
4. Analisis sel beta pankreas secara imunohistokimia.
Analisis sel beta pankreas secara imunohistokimia dilakukan menggunakan metode
menurut Beesley (1995). Jaringan pankreas difiksasi selama 24 jam dalam larutan formalin
10%, selanjutnya diproses dengan metode standar menggunakan paraffin. Preparat histologis
yang telah dibuat, selanjutnya dilakukan pewarnaan imunohistokimia terhadap sel beta
menggunakan metode tidak langsung dua tahap (metode antibodi berlabel enzim). Setelah
deparafinasi dan rehidrasi, jaringan diinkubasi dengan H2O2 dalam methanol selama 15 menit
untuk menghilangkan aktivitas peroksidase endogen. Selanjutnya jaringan diinkubasi dalam
bovine serum albumin (BSA) 10% selama 45 menit dalam inkubator suhu 37°C. Setelah dicuci
3 kali dengan PBS, jaringan kemudian diinkubasi dalam antibodi primer monoklonal anti-
insulin pada suhu 40C selama 24 jam. Setelah dicuci 3 kali dengan PBS, kemudian jaringan
diinkubasi dalam antibodi sekunder Dako Envision Peroksidase (Dako K 1941) pada suhu
37°C selama 60 menit. Setelah dicuci 3 kali dengan PBS, hasil reaksi antigen-antibodi
divisualisasikan dengan menggunakan diamino benzidine (DAB) pada suhu kamar selama 25
menit. Setelah dicuci 3 kali dengan PBS, kemudian dikounterstain dengan hematoksilin.
Preparat didehidrasi dan clearing kemudian dimounting dengan entelan. Pengamatan secara
kualitatif dan kuantitatif dilakukan pada sel beta pankreas, yang jika positif ditunjukkan
dengan warna coklat dan inti sel beta dapat dihitung.
5. Pengamatan gambaran histopatologi jaringan pankreas.
Pembuatan sediaan histologis dilakukan menurut metode Kiernan (1990). Jaringan
pankreas dicuci dengan larutan PBS (phosphate buffered saline pH 7,4) kemudian difiksasi
dalam larutan formalin 10% selama 24 jam. Sampel jaringan dipindahkan dan disimpan di
dalam alkohol 70% sampai proses selanjutnya. Sampel jaringan dipotong kecil-kecil dan
didehidrasi di dalam seri larutan alkohol dengan konsentrasi bertingkat, kemudian dijernihkan
dalam silol dan diembedding dalam paraffin. Blok paraffin dipotong serial dengan ketebalan 4
μm menggunakan mikrotom dan sayatan dilekatkan di atas gelas obyek. Setelah dilakukan
proses deparafinasi dengan xylol selanjutnya dilakukan rehidratasi dengan alkohol absolut I, II,
dan III, lalu alkohol 95 %, 90 %, 80 % dan 70 %, masing-masing selama 3 menit. Sesudah itu,
sediaan preparat dibilas dengan air selama 5 menit dan aquades selama 5 menit dan pewarnaan
16
HE. Sediaan yang telah diwarnai lalu diamati di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran
200 kali. Pengamatan perubahan histopatologis dilakukan secara deskriptif pada satu
potongan sediaan dari setiap jairngan tikus percobaan. Pada setiap sediaan, pengamatan
dilakukan pada 5 lapang pandang yang dipilih secara acak.
6. Rancangan percobaan dan analisis data
Penelitian ini menggunakan rancangan tidak berpasangan (independent) dengan
perlakuan I adalah tikus normal, dan perlakuan II dalah tikus hiperglikemia. Data yang
diperoleh dianalisis dengan Uji t tidak berpasangan. Sedangkan gambaran histopatologi
pankreas dianalisis secara diskriptif.
BAB 5. HASIL DAN PEMBAHASAN Analisis kadar glukosa darah
Hasil analisis kadar glukosa darah pada tikus percobaan selama 8 minggu diperlihatkan
pada Gambar 2 dan Tabel 1.
Gambar 2. Profil kadar glukosa darah tikus selama 8 minggu percobaan
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Kada
r Gluko
sa darah
(mg/dl)
Minggu ke:Kontrol Hiperglikemia
17
Tabel 1. Kadar glukosa darah (mg/dl) tikus selama 8 minggu percobaan
Perlakuan Kadar glukosa darah (mg/dl) minggu ke: 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Kontrol normal
90,7± 2,9
94,7± 5,4
96,7±3,9
96,2±3,3
95,3±3,2
93,9±3,5
94,9± 4,5
94,7± 3,7
97.,8±4,3
Hiperglikemia 94,7±
5,2 95,0±
46 99,5±
6,3106,2±
4,4119,5±
3,9128,5±
4,9133,4±
4,7 138,8±
3,3 139,5±
5,2
Data pada Tabel 1, terlihat bahwa kadar glukosa darah pada kelompok kontrol relatif
sama, yaitu berkisa antara 90,7 - 97,8 mg/dl dan secara statistik kadar glukosa darah kelompok
kontrol tidak berbeda nyata (P>0,05). Kadar glukosa darah tikus perlakuan hiperglikemia,
menunjukkan kadar awal (minggu ke 0) sebesar 94,7 mg/dl dan setelah minggu ke 8 kadar
glukosa darah sebesar 139,9 mg/dl (Tabel 1). Kadar glukosa darah perlakuan hiperglikemia
mulai mengalami kenaikan pada minggu ke 4 setelah perlakuan. Selanjutnya kadar glukosa
darah tikus percobaan terus mengalami kenaikan sampai pada akhir percobaan.
Kadar glukosa darah tikus normal sangat bervariasi, Ramesh dan Pugalendi (2006)
melaporkan kadar glukosa darah tikus antara 74,35 – 84,85 mg/dl, sementara Gulfraz et al.
(2007) melaporkan kadar glukosa darah normal antara 99-127 mg/dl. Pada penelitian ini
diperoleh kadar normal glukosa darah tikus 90,7 - 97,8 mg/dl. Sedangkan kadar glukosa darah
tikus setelah minggu ke 4 atau pada minggu ke 5 sampai minggu 8 percobaan diperoleh
sebesar 128,5-139,5 mg/dl. Hal ini berarti kadar glukosa darah tikus berada di atas batas nilai
normal yang menandakan bahwa tikus dalam keadaan hiperglikemia.
Data pada Gambar 1, memperlihatkan bahwa tikus mulai mengalami hiperglikemia
setelah minggu ke 4 perlakuan dan selama empat minggu kedepan terus mengalami kenaikan.
Hal ini berarti pemberian larutan sukrosa 80% pada tikus selama dua kali sehari telah mampu
membuat tikus mengalami kenaikan kadar glukosa darah dan tikus percobaan mengalami
hiperglikemia selama 4 minggu.
Analisis kadar malonaldehida (MDA)
Malondialdehida merupakan produk akhir dari peroksidasi lipid. Tingginya kadar
MDA, yang secara tidak langsung juga menunjukkan tingginya jumlah radikal bebas di dalam
jaringan. Hasil analisis kadar malonaldehida pada tikus percobaan di tampilkan pada Tabel 2
dan Gambar 3.
Tabel 2.
PeK
HipeAngka yan(P<0,05).
G
R
22,94 pic
Kadar M
pancreas
kondisi h
meningk
pada kon
sehingga
kompone
yang me
hiperglik
berbagai
G
(OH▪) (W
senyawa
Rata-rata ka
erlakuan Kontrol erglikemia ng diikuti oleh
Gambar 3. Ka
Rata-rata kad
comol/g dan
MDA perlaku
perlakuan
hiperglikemi
atnya kadar
ndisi hiperg
a menyebabk
en sel terma
eningkat. M
kemia merup
mekanisme
Glukosa dap
Wolf et al.,
enediol. S
adar malonal
huruf yang be
adar Malona
dar malonald
n kadar MDA
an hiperglik
control dan
ia menyebab
r MDA. Terj
likemia terj
kan kelelaha
asuk kerusak
enurut Robe
pakan titik
metabolism
at mengalam
1989). Pros
Selanjutnya
ldehida (MDK
erbeda pada ba
aldehida (MD
dehida (MD
A pankreas t
kemia terliha
berbeda ny
bkan kerusak
rjadinya keru
adi produks
an sel beta. K
kan jaringan
ertson (2004
awal terjad
me biokimiaw
mi reaksi a
ses reaksiny
enediol, be
DA) pada panKadar MDA
22,94 ± 31,85 ±
aris yang sam
DA) pada pa
DA) pakreas
tikus hipergl
at lebih besar
yata (P>0,05
kan jaringan
usakan jarin
si insulin ol
Kelelahan se
n lemak yan
4), kelebiha
dinya pemb
wi.
autooksidasi
ya melalui en
ereaksi deng
nkreas tikus A picomol/g
± 3,82a ± 5,69b ma menunjukka
ankreas tiku
tikus perlak
likemia sebe
r bila diband
5). Hal ini
n pankreas y
ngan pankea
leh sel beta
el beta diiku
ng ditandai
an glukosa d
bentukan ra
menghasilk
nolisasi glis
gan Fe3+ m
percobaan
an hasil uji ber
us selama per
kuan kontro
esar 31,85 pi
dingkan deng
menunjukka
yang ditanda
as disebabka
yang terus
uti dengan k
dengan kad
di dalam tu
adikal bebas
kan radikal
serida-3P me
menghasilkan
rbeda nyata
rcobaan.
ol sebesar
icomol/g.
gan kadar
an bahwa
ai dengan
an karena
menerus
kerusakan
dar MDA
ubuh atau
s melalui
hidroksil
embentuk
n radikal
18
19
enediol. Ion Fe2+ hasil reduksi Fe3+, akan bereaksi dengan hidrogen peroksida
menghasilkan radikal hidroksil. Sementara, Brownlee (2001) melaporkan keadaan
hiperglikemia dapat mengaktifkan empat jalur metabolisme glukosa yang dapat
menghasilkan radikal anion superoksida (O2▪) berlebih dalam mitokondria. Radikal bebas
yang terbentuk (radikal enediol, radikal hidroksil dan anion superoksida) berpotensi
menyebabkan reaksi glikosilasi protein dengan karbohidrat dan berkontribusi
menyebabkan kerusakan membran sel.
Beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa dalam kondisi diabetes dilaporkan
kadar ensim antioksidan intrasel pankreas menurun dan kadar MDA meningkat. Suarsana
et al (2011), kadar MDA pada pankreas tikus yang mengalami hiperglikemia lebih tinggi
(25,24 pmol/g) dibandingkan dengan tikus perlakuan kontrol (19,57 pmol/g). Analisis sel beta pankreas secara imunohistokimia
Hasil pewarnaan imunohistokimia terhadap sel beta pankreas diperlihatkan pada
Gambar 4. Hasil pewarnaan imunohistokimia menunjukkan bahwa insulin terdapat pada inti
dan sitoplasma dari sel beta. Secara kualitatif terlihat profil kandungan insulin pada sel beta
mengalami penurunan pada kelompok hiperglikemia dibandingkan kelompok kontrol. Warna
coklat menunjukkan reaksi positif terhadap insulin pada pewarnaan imunohistokimia.
Gambaran sel beta pada tikus kontrol dan tikus perlakuan hiperglikemia tidak banyak
mengalami perbedaan. Sel beta terlihat ditengah dengan jumlah yang hampir sama pada kedua
perlakuan.
Gambar 4. Foto mikrograf pewarnaan imunohistokimia terhadap insulin pada sel beta jaringan pankreas. Keterangan: K0=kontrol, HG=hiperglikemia, tanda panah: reaksi positif warna coklat.
K0 50 μmHG 50 μm
20
Pengamatan gambaran histopatologi jaringan pankreas.
Secara umum hasil pengamatan mikroskopis terhadap gambaran jaringan pankreas
menunjukkan bahwa nampak pulau Langerhans yang sangat jelas dengan warna lebih pucat
dubandingkan dengan kelenjar eksokrin disekitarnya (Gambar 5).
Gambar 5. Foto mikrograf pulau Langerhans pankreas tikus pewarnaan HE. Keterangan: A= pulau Langerhans, B=kelenjar eksrokrin. K0=kontrol, dan HG=hiperglikemia. (tanda panah: inti sel piknotis)
Hasil pengamatan secara mikroskopik pada kelompok tikus kontrol (K0) tampak
gambaran pulau Langerhans, baik dari segi bentuk, ukuran, dan massa sel jumlah cukup
banyak. Pada pankreas kelompok tikus hiperglikemia menunjukkan adanya kerusakan yang
mengarah ke degenerasi dengan derajat ringan dengan beberapa inti mengalami piknotis
(Gambar 5). Kondisi hiperglikemia dapat menyebabkan terjadinya degenerasi dengan derajat
ringan dan inti mengalami piknotis pada kelompok HG. Hal ini dikarenakan pada kondisi
hiperglikemia menyebabkan sel-sel pankreas, khususnya sel beta mengalami kelelahan karena
fungsinya yang terus menerus harus menghasilkan dan mengekskresikan insulin. Faktor
kelelahan dapat menyebabkan sel stress dan lebih cepat mengalami kerusakan. Selain itu,
menurut Robertson (2004), kondisi hiperglikemia dapat menyebabkan stress oksidatif. Pada
kelebihan glukosa yang cukup lama dapat menyebabkan terbentuknya radikal bebas yang
berlebihan. Radikal bebas yang terbentuk ini dapat menyerang sel-sel di sekitarnya, termasuk
sel-sel pankreas. Akibat reaksi berantai radikal bebas tersebut menyebabkan sel mengalami
kerusakan.
K0 50 µm
HG 50 µm
A
B A
B
21
BAB 6. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan
Hiperglikemia menyebabkan kondisi patobiologis pada jaringan pankreas berupa
meningkatnya kadar malonaldehid (MDA), masa sel beta berkurang dan sel pankreas
mengalami degenerasi ringan.
Saran
Kondisi hiperglikemia dibuat lebih lama dan tingkat kenaikan kadar glukosa darah
lebih tinggi sehingga efek patobiologisnya pada jaringan pankreas dapat di amati lebih jelas.
Selain itu perlu juga diamati sel alpha apakah dipengaruhi oleh kondisi hiperglikemia.
UCAPAN TERIMAKASIH Pada kesempatan ini, ucapan terimakasih disampaikan kepada Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan Nasional dan Rektor Univesitas Udayana yang telah memberikan biaya penelitian dari Dana RM Universitas Udayana dengan surat Perjanjian Penugasan Penelitian No:175.59/UN14.2/ PNL.01.03.00/2013, Tanggal 16 Mei 2013
22
DAFTAR PUSTAKA
Asikin N. 2001. Antioksidan endogen dan penilaian status antioksidan. Di dalam: Prosiding Kursus Penyegar radikal bebas dan antioksidan dalam kesehatan: dasar aplikasi dan pemanfaatan bahan alam. Jakarta 16 April 2001. Bagian Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia
Auroma OI, Neergheen VS, Bahorun T, Jen LS. 2006. Free radicals, Antioxidants and Diabetes: Embryopathy, Retinopathy, Neuropathy, Nephropathy and Cardiovascular Complications. Neuroembryol Aging 4:117-137.
Beesley, JE. 1995. Immuno-cytochemistry: A Practical Approach. IRL. Press Oxford University Press, New York. P.15-41
Brownlee M. 2001. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature 414:813-820
Capeyron MFM, Julie C, Eric B, Jean P, Jean MR,, Piere B, Claude LL, Benard D. 2002. A diet cholesterol and deficient in vitamin E induces lipid peroxidation but does not enhace antioxidant enzyme expression in rat liver. J Nutr Biochem 13:296-301
Conti, M., P.C. Moramd, P.Levillain, and A.Lemonnier. 1991. Improve Flurometric Determination of Malonaldehyde. J. Clin. Chem. 37(7):1273-1275.
Dominiczak MH. 2005. Glucose homeostasis, fuel metabolism and insulin. Di dalam Baynes JW dan Dominiczak MH Editor. Medical Biochemistry. Second Edition. Elsivier Mosby. Hlm 273-197
Draper HH, Polensek L, Hadley TM, Mcgirr LG. 1984. Urinary Malondialdehyde as an Indicator of Lipid Peroxidation in the Diet and in the Tissues. Lipids 19 (11):836-843.
Freisleben H.J. 2001. Free radical and ROS in biological system. Di dalam: Prosiding Kursus Penyegar radikal bebas dan antioksidan dalam kesehatan: dasar aplikasi dan pemanfaatan bahan alam. Jakarta 16 April 2001. Bagian Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
Gulfraz M, Qadir G, Noshhen F, Parveen Z. 2007. Antihyperglycemic effects of Berberis lyceum royle in alloxan induced diabetic rats. Diabetologia Croatica 36 (3):49-54
Kiernan JA. 1990. Histopatological and Histochemical Methods: theory and Practice. Pergamon Press.
Kim JS, Ju JB, Choi CW, Kim SC. 2006. Hypoglycemic and antihyperlipidemic Effect of Four Korean Medicinal Plants in Alloxan Induced Diabetic Rats. Am J Biochem and Biotech 2: 154-160
Luczaj W, Skrzydlewska E. 2003. DNA damage caused by lipid peroxidation products. Cellular & molecular biology letters 8:391-413
Newsholme P,Haber EP, Hirabara SM, Rebelato ELO, Procopio J, Morgan D, Oliveira-Emilio HC, Carpinelli AR, Curi R. 2007. Diabetes associated cell stress and dysfunction: role of mitochondrial and non-mitochondrial ROS production and activity. J Physiol 583. 9–24.
Ramesh B, Pugalendi KV. 2006. Antihyperglycemic Effect of Umbelliferone in Streptozotocin-Diabetic Rats. Journal of Medicinal Food. J Med Food 9 (4), 562–566
23
Rasal VP, Shetty BBP, Sinnathambi A, Yeshmaina S, Ashok P. 2008. Antihyperglycaemic and Antioxidant Activity of Brassica Oleracea In Streptozotocin Diabetic Rats. The Internet Journal of Pharmacology. ISSN: 1531-2976. 10 halaman. http://www.ispub.com/ostia/ index.php?xmlFilePath= journals/ ijpharm/vol4n2/antioxidant.xml (1 of 10)
Robertson RP, Harmon J, Tran PO, Poitout V. 2004. β-Cell Glucose Toxicity, Lipotoxicity, and Chronic Oxidative Stress in Type 2 Diabetes. Diabetes. 53, :S119-S124
Robertson. 2004. Minireview: Chronic Oxidative Stress as a Central Mechanism for Glucose Toxicity In Pancreatic Islet Beta Cells In Diabetes. J. of Biological Chemistry Vol. 279(41): 42351–42354
Soewoto H. 2001. Antioksidan eksogen sebagai lini pertahanan kedua dalam menanggulangi peran radikal bebas. Di dalam: Prosiding Kursus Penyegar radikal bebas dan antioksidan dalam kesehatan: dasar aplikasi dan pemanfaatan bahan alam. Jakarta 16 April 2001. Bagian Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
Suarsana N, Iwan H Utama, Suartini AA. 2011. Pengaruh hiperglikemia dan vitamin E pada kadar malonaldehida dan enzim antioksidan intrasel jaringan pankreas tikus. Majalah Kedokteran Bandung (MKB). 43 (2):72-76
Szkudelski T. 2001. The mechanism of alloxan and sreptozotocin action in cells of the rat pancreas. Physiol Res 50:536-546.
Thomas, JA. 1999. Oxidative Stress: including glutathione, a peptide for cellular defense against oxidative stress. Departement of Biochemistry and Biophysics Iowa State University Ames, IA. 5001
Tug T, Karatas F, Terzi SM, Ozdemir N. 2005. Comparison of serum malondialdehyde levels determined by two different methods in patients with COPD: HPLC or TBARS Methods. Science 36:41-44.
Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin MTD, Mazur M, Telser J. 2007. Review: Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Inter J Biochem & Cell Biol 39:44-84.
Virtanen SM, Knip M. 2003. Nutritional risk predictors of cell autoimmunity and type 1 diabetes at a young age. Am J Clin Nutr. 78:1053– 1067
Wolff SP, Bascal Z, Hunt JV. 1989. Autoxidative glycosylation: free radicals and glycation theory. In: Kunio Yagi, ed. The Maillard Reaction in Ageing, Diabetes and Nutrition. Alan R. Liss, Inc. 247-275.
24
LAMPIRAN
Lampiran 1. Biodata Personalia Tenaga peneliti.
CURICULUM VITAE
1 Ketua Peneliti
A IDENTITAS DIRI
1.1 Nama Lengkap (dengan gelar) : Prof. Dr. drh. Iwan Harjono Utama , MS (L)
1.2 Jabatan Fungsional : guru besar 1.3 NIP/NIK/No. identitas lainnya : 196106041989 03 1002 1.4 Tempat dan Tanggal Lahir : Bogor 6 Apil 1961 1.5 Alamat Rumah : Jl. Tibung sari Gg, Badung, Bali. 1.6 Nomor Telepon/Faks : - 1.7 Nomor HP : 081 337755860 1.8 Alamat Kantor : Laboratorium Biokimia Veteriner, FKH
Unud, Kampus Sudirman, Bali 1.9 Nomor Telepon/Faks : 0361-223791 / 0361-223791 1.10 Alamat e-mail : [email protected] 1.11 Lulusan yg telah dihasilkan S-1= 70 orang ; S-2= 1 orang;
S-3= orang 1.12 Mata Kuliah yg diampu
1. Pengantar Kimiabiofisika 2. Biokimia Veteriner I 3. Biokimia Veteriner II 4. pengantar biokimia komparatif (S2 – S3) 5. Biokimia Lanjut (S2 – S3)
B. RIWAYAT PENDIDIKAN
2.1 Program: S-1 S-2 S-3 2.2 Nama PT Institut
Pertanian Bogor
Institut Pertanian Bogor
Institut Pertanian Bogor
2.3 Bidang Ilmu Dokter Hewan Sains Veteriner: Biokimia klinik
Sains Veteriner: Biokimia Vet.
2.4 Tahun Masuk 1980 1986 1993
2.5. Tahun Lulus 1985 1989 1998
2.6 Judul Skripsi/ Tesis/Disertasi
2.7. Nama Pembimbing/ Promotor
Dr. A. Muchlis, MSc (alm) Drh. A. Syahir
Prof. Dr. Aisjah Girindra Prof. Dr. Soenarjo S. Drh. R. ipin. R. manggung MS. Stat
Prof. Dr. Aisjah Girindra Prof. Dr. Fachrijan H. Pasaribu Prof. Dr.
25
Wayan T. Wibawan Prof. Dr. Gatut Ashadi (alm) Dr. Endhie D. Setiawan, MS.
C. PENGALAMAN PENELITIAN (bukan skripsi, tesis, maupun disertasi)
Urutkan judul penelitian yang pernah dilakukan(sebagai ketua) selama 5 tahun terakhir dimulai dari penelitian yang paling diunggulkan menurut Saudara sampai penelitian yang tidak diunggulkan.
No. Tahun Judul Penelitian Pendanaan Sumber* Jml (Juta Rp)
1 2009 Profil DNA Plasmid Serotipe Escherichia coli O157:H7 yang Diisolasi dari Feses Ayam yang Menunjukkan Reaksi Positif Hemolisis dan Bersifat Resistensi Berganda (Multy Drug Resistance) terhadap Berbagai Jenis Antibiotika. Penelitian Hibah Fundamental (Tahap I )
Hibah fundamental
37.200.000
2010 Profil DNA Plasmid Serotipe Escherichia coli O157:H7 yang Diisolasi dari Feses Ayam yang Menunjukkan Reaksi Positif Hemolisis dan Bersifat Resistensi Berganda (Multy Drug Resistance) terhadap Berbagai Jenis Antibiotika. Penelitian Hibah Fundamental (Tahap II)
Hibah fundamental
37.200.000
Tuliskan sumber pendanaan: PDM, SKW, Fundamental Riset, Hibah Bersaing, Hibah Pekerti, Hibah Pascasarjana, RAPID, atau sumber lainnya.
D PENGALAMAN PENGABDIAN KEPADA MASYARAKAT Urutkan judul pengabdian kepada masyarakat yang pernah dilakukan(sebagai ketua) selama 5 tahun terakhir dimulai dari yang paling diunggulkan menurut Saudara sampai pengabdian kepada masyarakat yang tidak diunggulkan.
No. Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan Sumber* Jml (Juta Rp)
2011 Penyuluhan penyakit rabies di desa Buana Giri kecamatan bebandem kabupaten karang Asem, 19/ 8/ 2011
Local universitas
2010 Pelayanan kesehatan dan pemberian obat cacing pada kambing di desa Tangkas kabupaten Klungkung Bali, 29/ 10/ 2010.
Local universitas
26
2007 Pelayanan kesehatan dan vaksinasi SE pada sapi Bali tanggal 4 /10/ 2007.
Local universitas
Tuliskan sumber pendanaan: Penerapan Ipteks, Vucer, Vucer Multitahun, UJI, Sibermas, atau sumber lainnya.
E PENGALAMAN PENULISAN ARTIKEL ILMIAH DALAM JURNAL (tidak termasuk makalah seminar/proceedings, artikel di surat kabar)
Urutkan judul artikel ilmiah yang pernah diterbitkan selama 5 tahun terakhir dimulai dari artikel yang paling diunggulkan menurut Saudara sampai penelitian yang tidak diunggulkan.
No. Tahun Judul Artikel Ilmiah Volume/ Nomor Nama Jurnal
1 2011 Utama, I. H., E. M. Hutagalung, Wy. P. A. Laksmi, I G. M. K. Erawan, S. K. Widyastuti, L. E. Setiasih dan K. Berata. 2011. Urinalisis menggunakan dua jenis dipstick (batang celup) pada sapi bali. J. Vet. 12: 107 - 112
12 : 107 - 112
Jurnal veteriner
2 2010 Utama, I. H., Y. Y. Rumlaklak, D. A. D. Karmi, A. A. S. Kendran, S. K. Widyastuti, Kt. Berata, dan L. E. Setiasih. 2010. Keterkaitan antara turbiditas serum dan laju endap darah dengan jenis kerusakan organ hati pada sapi Bali. J. Vet. 11: 185 -189.
11 ; 185 - 189
Jurnal veteriner
3 2008 Utama, I. H., Sugiyarto, A. A. S. Kendran, I. A. P. Apsari, I Nym. Suarsana, I. G. M. K. Erawan, A. A. A. Mirah Adi, I. B. O. Winaya, dan Y. Hayashi. 2008. Blood smear evaluation of Bali ducks sampled from traditional farming systems in Bali. J. Vet. 9: 188 – 191.
9 : 188 - 191
Jurnal veteriner
4 2007 Utama, I. H., A. Girindra, F. H. Pasaribu, I W. T. Wibawan, E. D. Setiawan, dan A. L. T. Rompis, 2007. Deteksi asam hyaluronat kapsul Streptococcus equi subsp. zooepidemicus sebagai faktor perlekatan pada epitel mukosa buccalis babi. J. Vet. 8 (3) : 132-138
8 : 132 - 138
Jurnal veteriner
F. PENGALAMAN PENULISAN BUKU
Urutkan judul buku yang pernah diterbitkan selama 5 tahun terakhir dimulai dari buku yang paling diunggulkan menurut Saudara sampai buku yang tidak diunggulkan.
27
No. Tahun Judul Buku Jumlah Halaman
Penerbit
1 2001 Pengantar Kimiabiofisika ISBN: 979-8286-26-x (Iwan HU)
287 Universitas Udayana
2 2002 Laboratorium Klinik Veteriner: prinsip dan interpretasi hasil pemeriksaan ISBN: 979-8286-64-2 (Iwan HU)
Universitas Udayana
3 2005 Biokimia Veteriner II ISBN: 979-25-5190-5 (Iwan HU, dan Suarsana N)
223 Pelawa sari
G. PENGALAMAN PEROLEHAN HKI Urutkan judul HKI yang pernah diterbitkan 5-10 tahun terakhir.
No. Tahun Judul/Tema HKI Jenis Nomor P/ID
- - - - - H. PENGALAMAN MERUMUSKAN KEBIJAKAN PUBLIK/REKAYASA SOSIAL
LAINNYA Urutkan judul rumusan kebijakan/rekayasa sosial lainnya yang pernah dbuat/ditemukan selama 5 tahun terakhir.
No. Tahun Judul/Tema/Jenis Rekayasa Sosial Lainnya yang Telah Diterapkan
Tempat Penerapan
Respons Masyarakat
- - - - -
Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata dijumpai ketidak-sesuaian dengan kenyataan, saya sanggup menerima risikonya. Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu persyaratan dalam pengajuan hibah Fundamental
Denpasar, 25 Oktober 2013 Pengusul,
Prof. Dr. Iwan Harjono Utama, MS. NIP. 19610604198903 1002
28
2. Anggota Peneliti 1
A IDENTITAS DIRI
1.1 Nama Lengkap (dengan gelar) : drh. I Made Kardena, MVS (L) 1.2 Jabatan Fungsional : Lektor 1.3 NIP/NIK/No. identitas lainnya : 19790310 200312 1 001 1.4 Tempat dan Tanggal Lahir : Benoa, 10 Maret 1979 1.5 Alamat Rumah : Jl. Pratama No. 35 B Nusa Dua, Kuta
Selatan, Badung, Bali.1.6 Nomor Telepon/Faks : 0361 772330 1.7 Nomor HP : 081 353 353 399 1.8 Alamat Kantor : Laboratorium Patologi Veteriner, FKH
Unud, Kampus UNUD Denpasar, Bali 1.9 Nomor Telepon/Faks : 0361-223791 / 0361-223791 1.10 Alamat e-mail : [email protected] 1.11 Lulusan yg telah dihasilkan S-1= 6 orang ; S-2= - orang;
S-3= - orang 1.12 Mata Kuliah yg diampu
1. Epidemiologi dan Ekonomi Veteriner 2. Patologi Umum Veteriner 3. Patologi Sistemik Veteriner 4. Nekropsi Veteriner
B. RIWAYAT PENDIDIKAN
2.1 Program: S-1 S-2 2.2 Nama PT Universitas Udayana Murdoch
University
2.3 Bidang Ilmu Dokter Hewan
Master of Veterinary Surveillance
2.4 Tahun Masuk 1997 2007
2.5. Tahun Lulus 2002 2009
2.6 Judul Skripsi/ Tesis/Disertasi
Pengaruh Berbagai Konsentrasi Ekstrak Hipofisa Ayam Kampung (Gallus domestikus) Terhadap Kualatas Semen Ayam Kampung.
Syndromic Surveillance: A Potential Method to Improve Animal Health Surveillance System in Bali
2.7. Nama Pembimbing/ Promotor
Drh. I Wayan Bebas, MKes
Prof. Ian Robertson, BVSc, PhD, MACVSc.
29
C. PENGALAMAN PENELITIAN (bukan skripsi, tesis, maupun disertasi) Urutkan judul penelitian yang pernah dilakukan(sebagai ketua) selama 5 tahun terakhir dimulai dari penelitian yang paling diunggulkan menurut Saudara sampai penelitian yang tidak diunggulkan.
No. Tahun Judul Penelitian Pendanaan Sumber* Jml (Juta Rp)
1 2007 Deteksi Antibodi Terhadap Antibodi Japanese Enchephalitis Pada Sapi Bali
DIPA 5
2 2011 Mengukur tingkat validitas uji Seller’s dan FAT dalam mendiagnosa penyakit rabies pada anjing di Bali
DIPA 7.5
Tuliskan sumber pendanaan: PDM, SKW, Fundamental Riset, Hibah Bersaing, Hibah Pekerti, Hibah Pascasarjana, RAPID, atau sumber lainnya.
D PENGALAMAN PENGABDIAN KEPADA MASYARAKAT
Urutkan judul pengabdian kepada masyarakat yang pernah dilakukan(sebagai ketua) selama 5 tahun terakhir dimulai dari yang paling diunggulkan menurut Saudara sampai pengabdian kepada masyarakat yang tidak diunggulkan.
No. Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan Sumber* Jml (Juta Rp)
1 2010 Pemeriksaan Kesehatan dan Pemberian Vitamin Pada Babi Di Desa Taro, Kabupaten Gianyar
DIPA 3
2 2011 Vaksinansi SE Pada Sapi di Desa Demulih, Kabupaten Bangli
DIPA 3
Tuliskan sumber pendanaan: Penerapan Ipteks, Vucer, Vucer Multitahun, UJI, Sibermas, atau sumber lainnya.
E PENGALAMAN PENULISAN ARTIKEL ILMIAH DALAM JURNAL (tidak termasuk makalah seminar/proceedings, artikel di surat kabar)
Urutkan judul artikel ilmiah yang pernah diterbitkan selama 5 tahun terakhir dimulai dari artikel yang paling diunggulkan menurut Saudara sampai penelitian yang tidak diunggulkan.
No. Tahun Judul Artikel Ilmiah Volume/ Nomor Nama Jurnal
1 2010 Syndromic Surveillance: A Potential Method for Alternative Animal Health Surveillance System.
Vol.2 No.1 Buletin Veteriner
2 2011 The Efficacy of Turmeric Juice on Pathological Changes of the Mice Liver Induced by Carbon Tetrachloride.
Vol.12 No.1
Jurnal Veteriner
3 2011 Pathological Changes on Balinese Local Dog’ Lung Infected with Canine Distemper Disease
Vol.3 No.1 Buletin Veteriner
4 2011 The Advantages and Disadvantages of Syndromic Surveillance Methods
Vol.3 No.2 Buletin Veteriner
5 2011 Cloning, Sequencing and Phylogenetic Vol.12 Jurnal Veteriner
30
Analysis of Nucleocapsid Protein Gene of New Castle Disease Virus Bali-1/07
No.3
6 2011 Formaldehyde Exposure Inhibits the Spermatogenesis Process in Mice
Vol.12 No.1
Jurnal Veteriner
7 2012 Case Study of Morbidity, Mortality and Case Fatality Rate of Swine Colibasillosis
Vol.4 No.1 Buletin Veteriner
F. PENGALAMAN PENULISAN BUKU
Urutkan judul buku yang pernah diterbitkan selama 5 tahun terakhir dimulai dari buku yang paling diunggulkan menurut Saudara sampai buku yang tidak diunggulkan.
No. Tahun Judul Buku Jumlah Halaman
Penerbit
- - - - - G. PENGALAMAN PEROLEHAN HKI Urutkan judul HKI yang pernah diterbitkan 5-10 tahun terakhir.
No. Tahun Judul/Tema HKI Jenis Nomor P/ID
- - - - - H. PENGALAMAN MERUMUSKAN KEBIJAKAN PUBLIK/REKAYASA SOSIAL
LAINNYA Urutkan judul rumusan kebijakan/rekayasa sosial lainnya yang pernah dbuat/ditemukan selama 5 tahun terakhir.
No. Tahun Judul/Tema/Jenis Rekayasa Sosial Lainnya yang Telah Diterapkan
Tempat Penerapan
Respons Masyarakat
- - - - - Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata dijumpai ketidak-sesuaian dengan kenyataan, saya sanggup menerima risikonya. Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu persyaratan dalam pengajuan hibah Penelitian Fundamental
Denpasar, 25 Oktober 2013 Anggota Pengusul,
drh. I Made Kardena, MVS
31
32
EFEK HIPERGLIKEMIA KRONIS TERHADAP JARINGAN PANKREAS TIKUS (Effect of Chronic Hyperglycemia on Rat Pancreatic Tissue)
1Iwan H. Utama, 2I Made Kardena, 1I Nyoman Suarsana
1Laboratorium Biokimia, 2Laboratorium Patologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana, Bali. Jl. PB. Sudirman Denpasar
ABSTRAK
Paparan kronis hiperglikemia dapat menyebabkan disfungsi seluler yang menetap atau dapat menjadi ireversibel, proses ini yang disebut toksisitas glukosa. Toksisitas glukosa merupakan awal mekanisme kerusakan sel melalui pembentukan radikal bebas. Radikal bebas yang berlebihan dapat merusak komponen membran sel diantaranya lipid, protein sel, dan DNA. Tujuanya penelitian adalah untuk mengetahui pengaruh jaringan pankreas tikus akibat hiperglikemia. Sebanyak 20 ekor tikus jantan putih strain Spraque dawley umur sekitar 2 bulan dengan bobot badan rata-rata 200 g digunakan dalam penelitian ini. Tikus percobaan dibagi menjadi 2 kelompok perlakuan, tiap perlakuan terdiri dari 10 ekor tikus. Tikus perlakuan kontrol (K0) dan Tikus perlakuan hiperglikemia (HG) diberikan larutan sukrosa 80% (w/v) secara oral dua kali sehari selama 2 bulan. Pengamatan dilakukan terhadap (1) analisis kadar glukosa darah dengan metode glucose oxidase biosensor menggunakan alat Blood glucose Test Meter GlucoDr™, (2) analisis kadar malonaldehida menggunakan metode spektrofotometri, (3) analisis sel beta pankreas secara imunohistokimia, dan (4) gambaran histopalogi pankreas tikus menggunakan pewarnaan Hematoksilin Eosin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tikus percobaan mulai hiperglikemia setelah satu bulan perlakuan selanjutnya mengalami hiperglikemia selama 1 bulan dengan kadar glukosa akhir sebesar 139,5±5,2 mg/dl sedangkan kadar glukosa kelompok perlakuan kontrol rata-rata sebesar 97,8±4,3 mg/dl. Hiperglikemia menyebabkan terjadinya perubahan patobiologis pada jaringan pankreas, yaitu meningkatnya kadar malonaldehida (MDA) rata-rata 31,85 ± 5,69 picomol/g dan kelompok kontrol rata-rata 22,94 ± 3,82 picomol/g. Pada jaringan pankreas tikus yang mengalami hiperglikemia juga ditemukan degenerasi ringan, dan secara kualitatif terdapat penurunan massa sel beta.
Kata-kata kunci: pankreas, hiperglikemia, malonaldehida, sel beta, glukosa darah
ABSTRACT
Chronic exposure to hyperglycemia can cause to cellular dysfunction that persists or may become irreversible, this process is called glucose toxicity. Mechanisms of glucose toxicity initial is cell damage through the formation of free radicals. Free radicals can damage cell membrane components such as lipids, protein, and DNA cells. The aim of research was determined the effect of rat pancreatic tissue caused by hyperglycemia. A total of 20 male white rats Spraque Dawley strain about 2 months of age with an average body weight of 200 g used in this study. Rats were divided into 2 treatment groups, each treatment consisted of 10 rats. Rat control treatments (K0) and rats treatments hyperglycemia (HG) was given 80% sucrose solution (w / v) orally twice a day for 2 months. Parameters were observed among others, (1) the analysis of blood glucose levels with a glucose oxidase method using a biosensor Blood Glucose Test Meter GlucoDr, (2) analysis of malonaldehida levels using spectrophotometric method, (3) analysis of the pancreatic beta cells by immunohistochemistry stainning, and (4) overview hystopalogi of rat pancreatic tissue using Hematoxylin Eosin
33
staining. The results showed that the rats was started to hyperglycemia after one month of treatment subsequently had hyperglycemia for 1 month with a final glucose levels of 139.5 ± 5.2 mg/dl whereas glucose levels control treatment group an average of 97.8 ± 4.3 mg/dl. Hyperglycemia leads to changes phatobiologys in pancreatic tissue, namely increased levels of malonaldehida (MDA) average of 31.85 + 5.69 picomol/g and the control group average of 22.94+3.82 picomol/g. Hyperglycemia condition on rat pancreatic tissue was also found mild degeneration and qualitative decrease of beta cell mass
Key words: pancreatic tissue, Hyperglycemia, malonaldehida, beta cells, blood glucose
PENDAHULUAN
Manusia dan juga hewan tidak luput dari keadaan stres oksidatif dengan tingkat
keparahan dan penyebab berbeda dan dapat menghasilkan jumlah radikal bebas dalam tubuh
melebihi jumlah antioksidan endogen. Pada kondisi stres oksidatif dapat terjadi kerusakan sel
akibat radikal bebas bila kemampuan mekanisme pertahanan tubuh seperti enzim antioksidan
seluler menurun. Oleh karena itu perlu dilakukan usaha-usaha dalam mencegah terjadinya stres
oksidatif atau mencegah pencetus terbentuknya radikal bebas di dalam tubuh yang berlebihan,
misalnya mencegah supaya tidak terjadi kondisi hiperglikemia kronis.
Kebanyakan populasi di belahan dunia, termasuk di Indonesia mengkonsumsi
karbohidrat dalam jumlah tinggi. Disadari atau tidak bahwa sedari kecil kita telah terpapar
dengan karbohidrat melalui menu makan yang dihidangkan sehari-hari, bahkan terasa belum
komplit apabila menu kita tidak mengandung glukosa (gula). Kelebihan karbohidrat (glukosa)
di dalam tubuh yang sering disebut dengan hiperglikemia merupakan titik awal terjadinya
pembentukan radikal bebas melalui berbagai mekanisme metabolisme biokimiawi (Robertson,
2004).
Stres oksidatif adalah suatu kondisi yang berhubungan dengan peningkatan kecepatan
kerusakan sel akibat radikal bebas. Hal ini disebabkan oleh ketidak seimbangan antara
pembentukan radial bebas dan aktivitas pertahanan antioksidan. Kondisi yang berhubungan
dengan peningkatan produksi radikal bebas meliputi berbagai proses kimia kompleks dalam
tubuh yang melibatkan aktivitas organel mitokondria terutama dalam menghasilkan ATP
(Newsholme et al., 2007). Pada keadaan glukotoksisiti (Robertson et al., 2004), proses
pagositosis dalam sistim imun, infeksi, dan inflamasi (Freisleben, 2001), serta terpapar dengan
bahan kimia dan zat diabetogenik (Szkuldelski 2001) menyebabkan terbentuknya radikal bebas
yang tinggi di dalam tubuh .
34
Karbohidrat tidak saja penting dalam makanan manusia sebagai sumber energi, tetapi
karena bahan pangan berkarbohidrat tinggi berlimpah dan murah bila dibandingkan dengan
protein dan lemak. Oleh karena itu, karbohidrat menjadi bagian utama makanan di hampir
semua bagian di dunia. Studi epidemiologi menunjukkan ada kaitan erat antara status
kesehatan dan usia harapan hidup manusia dengan pola konsumsinya. Masyarakat di daerah
yang banyak mengkonsumsi gula, lemak dan garam misalnya, ternyata lebih banyak ditemukan
sebagai penderita penyakit degeneratif.
Pemberian jumlah karbohidrat yang berlebih dalam jangka waktu lama dapat
menimbulkan apa yang disebut dengan hiperglikemia. Hiperglikemia kronis cenderung
menimbulkan efek yang tidak baik bagi kesehatan tubuh. Hiperglikemia kronis cenderung
mendorong terbentuknya radikal bebas yang dapat merusak komponen sel (lipid, karbohidrat,
protein, dan DNA) (Robertson, 2004). Kerusakan oksidatif tersebut merupakan cikal bakal
munculnya penyakit degeneratif, misalnya diabetes.
Penyakit diabetes merupakan sindroma multifaktor yang secara metabolik
dikarakterisasi dengan kondisi hiperglikemia kronis yang timbul akibat ketidakmampuan
pankreas memproduksi insulin yang cukup atau ketidakmampuan tubuh menggunakan insulin
secara efektif (Auroma et al. 2006). Faktor penyebab penyakit diabetes meliputi faktor genetik,
obesitas, radikal bebas, sistem kekebalan (Virtanen dan Knip 2003).
Pada kondisi hiperglikemia, sel beta pankreas akan merespon dengan cara
mengeluarkan insulin. Insulin berfungsi untuk menurunkan kadar glukosa darah melalui
mekanisme memasukan glukosa ke dalam sel untuk selanjutnya mengalami metabolisme
(Dominiczak, 2005). Jika kejadian hiperglikemia berlangsung lama (kronis), maka sel beta
secara terus menerus menghasilkan insulin. Kondisi ini dapat menyebabkan sel beta
mengalami kelelahan bahkan kerusakan sehingga produksi insulin bisa jadi berkurang. Dilain
pihak, pada keadaan hiperglikemia, glukosa akan cenderung mengalami metabolisme kearah
pembentukan radikal bebas (Robertson., 2004). Radikal bebas yang terbentuk akan bereaksi
dengan komponen membran sel. Reaksi berantai radikal bebas tersebut menyebabkan
kerusakan pada membran sel.
Kondisi hiperglikemia tersebut akan menyebabkan perubahan patobiologis pada
pankreas sehingga perlu dilakukan pengamatan terhadap kadar peroksidasi lipid pankreas,
gambaran sel beta pankreas, dan gambaran histopatologi pankreas. Tujuan penelitian ini
adalah untuk mengetahui patobiologis hiperglikemia terhadap jaringan pankreas tikus.
35
MATERI DAN METODE
Bahan dan Alat penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: Tikus strain spraque dawley umur 2
bulan, kandang tikus dan perlengkapannya, pakan tikus, syring 2,5 cc, canul, dan sukrosa.
Bahan pemeriksaan kadar MDA (sigma): TEP (1,1,3,3-tetraethoxypropane) (T-9889), BHT
(butylated hydroxytoluene), TCA (thricloroacetic) (ACS Reagent) (T-9159), TBA (thio
barbituric acid) dan 0.25 N HCl, dan strip test glukosa. Larutan H2O2, Serum normal (BSA)
10%, Antibodi primer monoklonal anti-insulin dan glukagon, Antibodi sekunder DEPS (Dako
Envision Peroxidase System), larutan DAB (diaminobenzidine), larutan Hematoksilin
(counterstain).
Alat yang digunakan adalah: Spectrophotometer UV/VIS, tissue processor, tissue tek
model TEC, Parafin cleaner, inkubator, penangas air, Sentrifugasi mikro, freezer -80 oC,
magnetik stirer, homogenizer, timbangan, vortek, mikro-pipet, mikroskop yang dilengkapi
dengan kamera, GlukoDr®, tip, tabung reaksi dan rak serta seperangkat glasswares.
Metode Penelitian
Persiapan hewan percobaan
Pada penelitian ini digunakan 20 ekor tikus jantan putih strain Spraque dawley umur
sekitar 2 bulan dengan bobot badan rata-rata 200 g. Tikus percobaan dibagi menjadi 2
kelompok perlakuan, tiap perlakuan terdiri dari 10 ekor tikus. Tahap persiapan tikus
percobaan meliputi masa adaptasi selama 2 minggu dengan pemberian ransum komercial dan
air minum secara ad libitum. Tikus perlakuan hiperglikemia (HG) diberikan larutan sukrosa
80% (w/v) secara oral (air minum) setiap hari selama 2 bulan. Larutan sukrosa diberikan dua
kali sehari hari mulai pukul 08.00dan 18.00 Wita. Kelompok perlakuan yang dicobakan adalah
sebagai berikut:
c. Kelompok I (tikus kontrol), yaitu tikus normal hanya diberi air minum dan ransum.
d. Kelompok II (tikus hiperglikemia=HG), yaitu tikus yang diberi larutan sukrosa 80%
dua kali sehari secara oral dan diberi ransum komersial.
Perlakuan pada seluruh kelompok diberikan selama 2 bulan. Pada akhir penelitian, semua
tikus dikorbankan dengan cara dibius dengan ketamin-HCl. Segera setelah mati, tikus dibedah
dan jaringan pankreas diambil untuk analisis kadar malonaldehida (MDA), dan pewarnaan
histopatologi.
36
Analisis kadar glukosa darah
Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan pada hari ke 0 (data base awal) dan setiap 1
minggu selama 2 bulan. Kadar glukosa darah tikus percobaan ditentukan dengan metode
glucose oxidase biosensor, menggunakan alat Blood glucose Test Meter GlucoDr™ model
AGM-2100 (diproduksi oleh allmedicus Co Ltd., Korea). Darah diambil dari ujung ekor tikus
yang sebelumnya telah dibersihkan dengan alkohol 70%, lalu diurut perlahan-lahan kemudian
ujung ekor ditusuk dengan jarum kecil (syring 1 cc) (Kim et al. 2006). Darah yang keluar
kemudian disentuhkan pada strip glukometer. Kadar glukosa darah akan terbaca dilayar
GlucoDr™ setelah 11 detik dan kadar glukosa darah dinyatakan dalam mg/dl.
Analisis kadar malonaldehida (MDA)
Analisis kadar MDA menggunakan metode menurut Capeyron et al. (2002). Sebanyak
0,5 ml sampel (lisat pankreas) atau standar ditambah dengan 2 ml campuran HCl 0,25 N
dingin yang mengandung 15% TCA, 0,38% TBA dan 0,5% BHT. Campuran larutan ini
dipanaskan 80 0C selama 1 jam. Setelah dingin, campuran larutan dan standar disentrifugasi
3500 rpm selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh diambil dan diukur absorbansinya pada
λ 532 nm. Sebagai larutan standar digunakan TEP (1,1,3,3-tetraetoksipropana). Caranya
adalah membuat larutan kerja 5 µM TEP dengan mengencerkan larutan induk (stok) standar
2,5 mM TEP sebesar 500 kali dengan pelarut air bebas ion. Larutan standar MDA dibuat
dengan mengencerkan larutan kerja (5 µM TEP) hingga diperoleh konsentrasi standar sebesar
0; 25; 50, 75; 100; 125; 150; 175; dan 200 pmol/50 µl. Kurva standar dibuat dengan
memplotkan nilai absorbansi (sumbu Y) dengan konsentrasi standar (sumbu X). Kadar MDA
sampel yang diperoleh dinyatakan dalam satuan picomol/g.
Analisis sel beta pankreas secara imunohistokimia.
Analisis sel beta pankreas secara imunohistokimia dilakukan menggunakan metode
menurut Beesley (1995). Jaringan pankreas difiksasi selama 24 jam dalam larutan formalin
10%, selanjutnya diproses dengan metode standar menggunakan paraffin. Preparat histologis
yang telah dibuat, selanjutnya dilakukan pewarnaan imunohistokimia terhadap sel beta
menggunakan metode tidak langsung dua tahap (metode antibodi berlabel enzim). Setelah
deparafinasi dan rehidrasi, jaringan diinkubasi dengan H2O2 dalam methanol selama 15 menit
untuk menghilangkan aktivitas peroksidase endogen. Selanjutnya jaringan diinkubasi dalam
bovine serum albumin (BSA) 10% selama 45 menit dalam inkubator suhu 37°C. Setelah dicuci
3 kali dengan PBS, jaringan kemudian diinkubasi dalam antibodi primer monoklonal anti-
37
insulin pada suhu 40C selama 24 jam. Setelah dicuci 3 kali dengan PBS, kemudian jaringan
diinkubasi dalam antibodi sekunder Dako Envision Peroksidase (Dako K 1941) pada suhu
37°C selama 60 menit. Setelah dicuci 3 kali dengan PBS, hasil reaksi antigen-antibodi
divisualisasikan dengan menggunakan diamino benzidine (DAB) pada suhu kamar selama 25
menit. Setelah dicuci 3 kali dengan PBS, kemudian dikounterstain dengan hematoksilin.
Preparat didehidrasi dan clearing kemudian dimounting dengan entelan. Pengamatan secara
kualitatif dan kuantitatif dilakukan pada sel beta pankreas, yang jika positif ditunjukkan
dengan warna coklat dan inti sel beta dapat dihitung.
Pengamatan gambaran histopatologi jaringan pankreas.
Pembuatan sediaan histologis dilakukan menurut metode Kiernan (1990). Jaringan
pankreas dicuci dengan larutan PBS (phosphate buffered saline pH 7,4) kemudian difiksasi
dalam larutan formalin 10% selama 24 jam. Sampel jaringan dipindahkan dan disimpan di
dalam alkohol 70% sampai proses selanjutnya. Sampel jaringan dipotong kecil-kecil dan
didehidrasi di dalam seri larutan alkohol dengan konsentrasi bertingkat, kemudian dijernihkan
dalam silol dan diembedding dalam paraffin. Blok paraffin dipotong serial dengan ketebalan 4
μm menggunakan mikrotom dan sayatan dilekatkan di atas gelas obyek. Setelah dilakukan
proses deparafinasi dengan xylol selanjutnya dilakukan rehidratasi dengan alkohol absolut I, II,
dan III, lalu alkohol 95 %, 90 %, 80 % dan 70 %, masing-masing selama 3 menit. Sesudah itu,
sediaan preparat dibilas dengan air selama 5 menit dan aquades selama 5 menit dan pewarnaan
HE. Sediaan yang telah diwarnai lalu diamati di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran
200 kali. Pengamatan perubahan histopatologis dilakukan secara deskriptif pada satu
potongan sediaan dari setiap jairngan tikus percobaan. Pada setiap sediaan, pengamatan
dilakukan pada 5 lapang pandang yang dipilih secara acak.
Rancangan percobaan dan analisis data
Penelitian ini menggunakan rancangan tidak berpasangan (independent) dengan
perlakuan I adalah tikus normal, dan perlakuan II adalah tikus hiperglikemia. Data yang
diperoleh dianalisis dengan Uji t tidak berpasangan. Sedangkan gambaran histopatologi
pankreas dianalisis secara diskriptif.
38
HASIL DAN PEMBAHASAN Analisis kadar glukosa darah
Hasil analisis kadar glukosa darah pada tikus percobaan selama 8 minggu diperlihatkan
pada Gambar 2 dan Tabel 1.
Gambar 2. Profil kadar glukosa darah tikus selama 8 minggu percobaan Tabel 1. Kadar glukosa darah (mg/dl) tikus selama 8 minggu percobaan
Perlakuan Kadar glukosa darah (mg/dl) minggu ke: 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Kontrol normal
90,7± 2,9
94,7± 5,4
96,7±3,9
96,2±3,3
95,3±3,2
93,9±3,5
94,9± 4,5
94,7± 3,7
97.,8±4,3
Hiperglikemia 94,7±
5,2 95,0±
46 99,5±
6,3106,2±
4,4119,5±
3,9128,5±
4,9133,4±
4,7 138,8±
3,3 139,5±
5,2
Data pada Tabel 1, terlihat bahwa kadar glukosa darah pada kelompok kontrol relatif
sama, yaitu berkisa antara 90,7 - 97,8 mg/dl dan secara statistik kadar glukosa darah kelompok
kontrol tidak berbeda nyata (P>0,05). Kadar glukosa darah tikus perlakuan hiperglikemia,
menunjukkan kadar awal (minggu ke 0) sebesar 94,7 mg/dl dan setelah minggu ke 8 kadar
glukosa darah sebesar 139,9 mg/dl (Tabel 1). Kadar glukosa darah perlakuan hiperglikemia
mulai mengalami kenaikan pada minggu ke 4 setelah perlakuan. Selanjutnya kadar glukosa
darah tikus percobaan terus mengalami kenaikan sampai pada akhir percobaan.
Kadar glukosa darah tikus normal sangat bervariasi, Ramesh dan Pugalendi (2006)
melaporkan kadar glukosa darah tikus antara 74,35 – 84,85 mg/dl, sementara Gulfraz et al.
(2007) melaporkan kadar glukosa darah normal antara 99-127 mg/dl. Pada penelitian ini
diperoleh kadar normal glukosa darah tikus 90,7 - 97,8 mg/dl. Sedangkan kadar glukosa darah
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Kada
r Glukosa darah
(mg/dl)
Minggu ke:Kontrol Hiperglikemia
39
tikus setelah minggu ke 4 atau pada minggu ke 5 sampai minggu 8 percobaan diperoleh
sebesar 128,5-139,5 mg/dl. Hal ini berarti kadar glukosa darah tikus berada di atas batas nilai
normal yang menandakan bahwa tikus dalam keadaan hiperglikemia.
Data pada Gambar 1, memperlihatkan bahwa tikus mulai mengalami hiperglikemia
setelah minggu ke 4 perlakuan dan selama empat minggu kedepan terus mengalami kenaikan.
Hal ini berarti pemberian larutan sukrosa 80% pada tikus selama dua kali sehari telah mampu
membuat tikus mengalami kenaikan kadar glukosa darah dan tikus percobaan mengalami
hiperglikemia selama 4 minggu.
Analisis kadar malonaldehida (MDA)
Malondialdehida merupakan produk akhir dari peroksidasi lipid. Tingginya kadar
MDA, yang secara tidak langsung juga menunjukkan tingginya jumlah radikal bebas di dalam
jaringan. Hasil analisis kadar malonaldehida pada tikus percobaan di tampilkan pada Tabel 2
dan Gambar 3.
Tabel 2. Rata-rata kadar malonaldehida (MDA) pada pankreas tikus percobaan
Perlakuan
Kadar MDA picomol/g
Kontrol 22,94 ± 3,82a Hiperglikemia 31,85 ± 5,69b
Angka yang diikuti oleh huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan hasil uji berbeda nyata (P<0,05).
Rata-rata kadar malonaldehida (MDA) pakreas tikus perlakuan kontrol sebesar
22,94 picomol/g dan kadar MDA pankreas tikus hiperglikemia sebesar 31,85 picomol/g.
Kadar MDA perlakuan hiperglikemia terlihat lebih besar bila dibandingkan dengan kadar
pancreas perlakuan control dan berbeda nyata (P>0,05). Hal ini menunjukkan bahwa
kondisi hiperglikemia menyebabkan kerusakan jaringan pankreas yang ditandai dengan
meningkatnya kadar MDA. Terjadinya kerusakan jaringan pankeas disebabkan karena
pada kondisi hiperglikemia terjadi produksi insulin oleh sel beta yang terus menerus
sehingga menyebabkan kelelahan sel beta. Kelelahan sel beta diikuti dengan kerusakan
komponen sel termasuk kerusakan jaringan lemak yang ditandai dengan kadar MDA
yang meningkat. Menurut Robertson (2004), kelebihan glukosa di dalam tubuh atau
hiperglikemia merupakan titik awal terjadinya pembentukan radikal bebas melalui
berbagai mekanisme metabolisme biokimiawi.
G
G
(OH▪) (W
senyawa
enediol.
menghas
hiperglik
menghas
yang terb
menyeba
menyeba
B
kadar ens
et al (201
(25,24 pm Analisis
H
Gambar
dan sitop
mengalam
coklat m
Gambara
Gambar 3. Ka
Glukosa dap
Wolf et al.,
enediol. S
Ion Fe2+ h
ilkan radik
kemia dapat
ilkan radika
bentuk (rad
abkan reaks
abkan kerusa
Beberapa has
sim antioksi
11), kadar M
mol/g) diban
sel beta pa
Hasil pewarn
4. Hasil pew
plasma dari
mi penuruna
menunjukkan
an sel beta
adar Malona
at mengalam
1989). Pros
Selanjutnya
hasil reduk
al hidroksil
t mengaktif
al anion supe
dikal enediol
si glikosila
akan membra
sil penelitian
dan intrasel
MDA pada pa
ndingkan den
ankreas seca
naan imuno
warnaan imu
sel beta. Se
an pada kelo
n reaksi po
pada tikus
aldehida (MD
mi reaksi a
ses reaksiny
enediol, be
si Fe3+, ak
l. Sementar
fkan empat
eroksida (O2▪
l, radikal h
asi protein
an sel.
n menunjukk
pankreas me
ankreas tiku
ngan tikus pe
ara imunoh
ohistokimia
unohistokim
ecara kualita
ompok hiper
ositif terha
s kontrol d
DA) pada pa
autooksidasi
ya melalui en
ereaksi deng
kan bereaks
ra, Brownle
t jalur met▪) berlebih d
hidroksil dan
dengan k
kan bahwa d
enurun dan k
us yang meng
erlakuan kon
histokimia
terhadap s
mia menunju
atif terlihat p
rglikemia di
dap insulin
dan tikus pe
ankreas tiku
menghasilk
nolisasi glis
gan Fe3+ m
i dengan
ee (2001) m
tabolisme g
dalam mitoko
n anion sup
karbohidrat
dalam kondis
kadar MDA
galami hiper
ntrol (19,57
el beta pan
ukkan bahwa
profil kandu
ibandingkan
n pada pew
erlakuan hip
us selama per
kan radikal
serida-3P me
menghasilkan
hidrogen p
melaporkan
glukosa yan
ondria. Radi
peroksida) b
dan berk
si diabetes d
meningkat.
rglikemia leb
pmol/g).
nkreas dipe
a insulin terd
ungan insulin
kelompok k
warnaan im
perglikemia
rcobaan.
hidroksil
embentuk
n radikal
peroksida
keadaan
ng dapat
kal bebas
berpotensi
kontribusi
ilaporkan
Suarsana
bih tinggi
rlihatkan pa
dapat pada
n pada sel b
kontrol. Wa
munohistokim
tidak bany
40
ada
inti
beta
arna
mia.
yak
41
mengalami perbedaan. Sel beta terlihat ditengah dengan jumlah yang hampir sama pada kedua
perlakuan.
Gambar 4. Foto mikrograf pewarnaan imunohistokimia terhadap insulin pada sel beta jaringan pankreas. Keterangan: K0=kontrol, HG=hiperglikemia, tanda panah: reaksi positif warna coklat.
Pengamatan gambaran histopatologi jaringan pankreas.
Secara umum hasil pengamatan mikroskopis terhadap gambaran jaringan pankreas
menunjukkan bahwa nampak pulau Langerhans yang sangat jelas dengan warna lebih pucat
dubandingkan dengan kelenjar eksokrin disekitarnya (Gambar 5).
Gambar 5. Foto mikrograf pulau Langerhans pankreas tikus pewarnaan HE. Keterangan: A= pulau Langerhans, B=kelenjar eksrokrin. K0=kontrol, dan HG=hiperglikemia. (tana panah: inti sel piknotis)
Hasil pengamatan secara mikroskopik pada kelompok tikus kontrol (K0) tampak
gambaran pulau Langerhans, baik dari segi bentuk, ukuran, dan massa sel jumlah cukup
banyak. Pada pankreas kelompok tikus hiperglikemia menunjukkan adanya kerusakan yang
mengarah ke degenerasi dengan derajat ringan dengan beberapa inti mengalami piknotis
K0 50 μmHG 50 μm
K0 50 µm
HG 50 µm
A
B A
B
42
(Gambar 5). Kondisi hiperglikemia dapat menyebabkan terjadinya degenerasi dengan derajat
ringan dan inti mengalami piknotis pada kelompok HG. Hal ini dikarenakan pada kondisi
hiperglikemia menyebabkan sel-sel pankreas, khususnya sel beta mengalami kelelahan karena
fungsinya yang terus menerus harus menghasilkan dan mengekskresikan insulin. Faktor
kelelahan dapat menyebabkan sel stress dan lebih cepat mengalami kerusakan. Selain itu,
menurut Robertson (2004), kondisi hiperglikemia dapat menyebabkan stress oksidatif. Pada
kelebihan glukosa yang cukup lama dapat menyebabkan terbentuknya radikal bebas yang
berlebihan. Radikal bebas yang terbentuk ini dapat menyerang sel-sel di sekitarnya, termasuk
sel-sel pankreas. Akibat reaksi berantai radikal bebas tersebut menyebabkan sel mengalami
kerusakan.
KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan
Hiperglikemia menyebabkan kondisi patobiologis pada jaringan pankreas berupa
meningkatnya kadar malonaldehid (MDA), masa sel beta berkurang dan sel pankreas
mengakami degenerasi ringan.
Saran
Kondisi hiperglikemia dibuat lebih lama dan tingkat kenaikan kadar glukosa darah
lebih tinggi sehingga efek patobiologisnya pada jaringan pankreas dapat di amati lebih jelas.
Selain itu perlu juga diamati sel alpha apakah dipengaruhi oleh kondisi hiperglikemia.
UCAPAN TERIMAKASIH Pada kesempatan ini, ucapan terimakasih disampaikan kepada Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan Nasional dan Rektor Univesitas Udayana yang telah memberikan biaya penelitian dari Dana RM Universitas Udayana dengan surat Perjanjian Penugasan Penelitian No:175.59/UN14.2/ PNL.01.03.00/2013, Tanggal 16 Mei 2013
43
DAFTAR PUSTAKA
Asikin N. 2001. Antioksidan endogen dan penilaian status antioksidan. Di dalam: Prosiding Kursus Penyegar radikal bebas dan antioksidan dalam kesehatan: dasar aplikasi dan pemanfaatan bahan alam. Jakarta 16 April 2001. Bagian Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia
Auroma OI, Neergheen VS, Bahorun T, Jen LS. 2006. Free radicals, Antioxidants and Diabetes: Embryopathy, Retinopathy, Neuropathy, Nephropathy and Cardiovascular Complications. Neuroembryol Aging 4:117-137.
Beesley, JE. 1995. Immuno-cytochemistry: A Practical Approach. IRL. Press Oxford University Press, New York. P.15-41
Brownlee M. 2001. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature 414:813-820
Capeyron MFM, Julie C, Eric B, Jean P, Jean MR,, Piere B, Claude LL, Benard D. 2002. A diet cholesterol and deficient in vitamin E induces lipid peroxidation but does not enhace antioxidant enzyme expression in rat liver. J Nutr Biochem 13:296-301
Conti, M., P.C. Moramd, P.Levillain, and A.Lemonnier. 1991. Improve Flurometric Determination of Malonaldehyde. J. Clin. Chem. 37(7):1273-1275.
Dominiczak MH. 2005. Glucose homeostasis, fuel metabolism and insulin. Di dalam Baynes JW dan Dominiczak MH Editor. Medical Biochemistry. Second Edition. Elsivier Mosby. Hlm 273-197
Draper HH, Polensek L, Hadley TM, Mcgirr LG. 1984. Urinary Malondialdehyde as an Indicator of Lipid Peroxidation in the Diet and in the Tissues. Lipids 19 (11):836-843.
Freisleben H.J. 2001. Free radical and ROS in biological system. Di dalam: Prosiding Kursus Penyegar radikal bebas dan antioksidan dalam kesehatan: dasar aplikasi dan pemanfaatan bahan alam. Jakarta 16 April 2001. Bagian Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
Gulfraz M, Qadir G, Noshhen F, Parveen Z. 2007. Antihyperglycemic effects of Berberis lyceum royle in alloxan induced diabetic rats. Diabetologia Croatica 36 (3):49-54
Kiernan JA. 1990. Histopatological and Histochemical Methods: theory and Practice. Pergamon Press.
Kim JS, Ju JB, Choi CW, Kim SC. 2006. Hypoglycemic and antihyperlipidemic Effect of Four Korean Medicinal Plants in Alloxan Induced Diabetic Rats. Am J Biochem and Biotech 2: 154-160
Luczaj W, Skrzydlewska E. 2003. DNA damage caused by lipid peroxidation products. Cellular & molecular biology letters 8:391-413
Newsholme P,Haber EP, Hirabara SM, Rebelato ELO, Procopio J, Morgan D, Oliveira-Emilio HC, Carpinelli AR, Curi R. 2007. Diabetes associated cell stress and dysfunction: role of mitochondrial and non-mitochondrial ROS production and activity. J Physiol 583. 9–24.
Ramesh B, Pugalendi KV. 2006. Antihyperglycemic Effect of Umbelliferone in Streptozotocin-Diabetic Rats. Journal of Medicinal Food. J Med Food 9 (4), 562–566.
44
Rasal VP, Shetty BBP, Sinnathambi A, Yeshmaina S, Ashok P. 2008. Antihyperglycaemic and Antioxidant Activity of Brassica Oleracea In Streptozotocin Diabetic Rats. The Internet Journal of Pharmacology. ISSN: 1531-2976. 10 halaman. http://www.ispub.com/ostia/ index.php?xmlFilePath= journals/ ijpharm/vol4n2/antioxidant.xml (1 of 10)
Robertson RP, Harmon J, Tran PO, Poitout V. 2004. β-Cell Glucose Toxicity, Lipotoxicity, and Chronic Oxidative Stress in Type 2 Diabetes. Diabetes. 53, :S119-S124
Robertson. 2004. Minireview: Chronic Oxidative Stress as a Central Mechanism for Glucose Toxicity In Pancreatic Islet Beta Cells In Diabetes. J. of Biological Chemistry Vol. 279(41): 42351–42354
Soewoto H. 2001. Antioksidan eksogen sebagai lini pertahanan kedua dalam menanggulangi peran radikal bebas. Di dalam: Prosiding Kursus Penyegar radikal bebas dan antioksidan dalam kesehatan: dasar aplikasi dan pemanfaatan bahan alam. Jakarta 16 April 2001. Bagian Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
Suarsana N., Utama IH, Suartini, IGA. Pengaruh hiperglikemia dan Vitamin E pada kadar manolaldehida dan enzim antioksidan intrasel jaringan pankreas tikus. Majalah Kedokteran Bandung (MKB). 43 (2):72-76.
Szkudelski T. 2001. The mechanism of alloxan and sreptozotocin action in cells of the rat pancreas. Physiol Res 50:536-546.
Thomas, JA. 1999. Oxidative Stress: including glutathione, a peptide for cellular defense against oxidative stress. Departement of Biochemistry and Biophysics Iowa State University Ames, IA. 5001
Tug T, Karatas F, Terzi SM, Ozdemir N. 2005. Comparison of serum malondialdehyde levels determined by two different methods in patients with COPD: HPLC or TBARS Methods. Science 36:41-44.
Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin MTD, Mazur M, Telser J. 2007. Review: Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Inter J Biochem & Cell Biol 39:44-84.
Virtanen SM, Knip M. 2003. Nutritional risk predictors of cell autoimmunity and type 1 diabetes at a young age. Am J Clin Nutr. 78:1053– 1067
Wolff SP, Bascal Z, Hunt JV. 1989. Autoxidative glycosylation: free radicals and glycation theory. In: Kunio Yagi, ed. The Maillard Reaction in Ageing, Diabetes and Nutrition. Alan R. Liss, Inc. 247-275.