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1
混ぜるだけで様々な酵素の活性を蛍光で評価できる
検査キットの開発
龍谷大学理工学部物質化学科
宮武 智弘
関西9私大 新技術説明会
2015年 2月27日 科学技術振興機構
2
本技術の概要
• 本法は、様々な種類の酵素および酵素阻害剤の活性
を簡便に蛍光で評価する技術である。
• 蛍光色素を内封したリポソーム(蛍光性リポソーム)と、
その脂質分子膜を透過するポリマーを酵素反応溶液
と混ぜ合わせるだけで、酵素の活性を蛍光で検出で
きる。
3
本技術の特徴・従来技術との比較
• 従来の酵素活性評価キットは汎用性に乏しい問題点
があったが、本技術では一つのキットで様々な酵素の
活性を評価することができる。
• 本技術はラベルフリーな酵素活性評価を可能とし、従
来技術よりも簡便に酵素活性の評価が行える。
• 本技術では酵素反応液に、試薬類を混ぜ合わせるだ
けで、速やかに蛍光発光による検出が可能であり、迅
速な酵素活性の検査が行える。
• 本技術では、市販の安価な試薬類を用いているため、
酵素検査キットのコストを低減できる。
4
F. Perret, et al., J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 1114-1115.
M. Nishihara, et al., Org. Biomol. Chem., 2005, 3, 1659-1669.
両親媒性アニオン
(ドデシルホスフェイト等)
膜透過性ポリマー
・ポリアルギニン(pR: ポリペプチド)
・ポリアリルアミン(pAA: 合成高分子)
など
5(6)-カルボキシフルオレセイン
(CF)
CFが放出
蛍光発光
蛍光性リポソーム
(CH3)3NCH2CH2O P O
O
O-
CH2
CHOCOR
CH2OCOR
ジパルミトイルホスファチジルコリン
(DPPC)
○二分子膜の相転移温度
Tc = 41.4 ˚C
蛍光性リポソームと膜透過性ポリマー
5
DPPC /
メタノール・
クロロホルム
フィルム状のDPPC
溶媒留去
乾燥 Buffer A* 凍結 ⇔ 融解
(4回)
メンブレンフィルター
100 nm
15回
ゲル濾過
クロマトグラフィー
Sephadex G-50
移動相 Buffer B*
*Buffer A
10 mM HEPES
10 mM KCL
50 mM (CF)
pH = 7.4
*Buffer B
10 mM HEPES
107 mM KCL
pH = 7.4
リポソーム
懸濁液
脂質二分子膜 CF
CF
CF 脂質
二分子膜
蛍光性
リポソーム
蛍光性リポソームの調製
6
F. Perret, et al., J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 1114-1115.
M. Nishihara, et al., Org. Biomol. Chem., 2005, 3, 1659-1669.
+ 蛍光性リポソーム
懸濁液
10 mM HEPES
107 mM KCl
Buffer, pH = 7.4
60 ˚C
60 秒
+ 両親媒性アニオン/水
蛍光セル
120 秒
+ 膜透過性ポリマー / 水
蛍光測定開始
蛍光光度計
恒温セルホ
ルダ
300 秒
+ Triton X-100
/ 水
両親媒性
アニオン
膜透過性
ポリマー
Triton X-100
膜透過活性を見積もる
蛍光の時間変化測定
lexc = 492 nm, ldet = 517 nm
蛍光性
リポソーム
膜透過活性の評価法
7
nH CH2 C H
CH2
NH3
+
H
C C
H2C CH2
N
CH3H3C+
n
CH2 CH2H H
H H
ポリリシン(pK)
pKa = 10.5
ポリアリルアミン(pAA)
pKa = 9.67 ポリジアリルジメチルアンモニウム
(pDADM)
ポリアルギニン(pR)
pKa = 12.5
様々な膜透過性ポリマー
NH C C OH
(CH2)3
NH
CNH2H2N
O
+
n
H
H
NH C C OH
(CH2)4
NH3
O
+
n
H
H
ポリペプチド
合成ポリマー
8
O
H
O
H
HO
H
H
OHH
COOH
O
H
HO
H
O
H
H
NHH
CH2OH
O
O
CH3
H
H
n
ヒアルロニダーゼ
ヒアルロニダーゼ
O
H
HO
H
HO
H
H
OHH
COOH
O
H
HO
H
O
H
H
NHH
CH2OH
OH
O
CH3
n
ヒアルロン酸 (HA)
(Glucronic acid – N-acetylglucosamine)
b-1,4結合を切断
二糖
<ヒアルロニダーゼの阻害剤>
Cromolyn
O
O
HO
OH
OH
OH
OH
Quercetin
・ヒアルロン酸: 細胞間物質、保湿成分
・ヒアルロニダーゼ反応: 受精、胚成長、癌増殖、腫瘍転移と関係する
O
H
O
H
HO
H
H
OHH
COOH
O
H
H
O
H
O
NHH
CH2OH
H
HO3S
O
H
O
H
HO
H
H
OCOOH
H
HO
O
H
H
O
H
NHH
CH2OH
H
HO3S
HO
HO3S
Heparin
K. Mio, R. Stern, Matrix Biol. 2002, 21, 31
9
ポリアルギニンの膜透過を利用したヒアルロニダーゼ反応の検出
ヒアルロン酸 ポリアルギニン (pR)
+
二糖
+
ヒアルロニダーゼ LUVCF
膜透過
X
蛍光
アクチベータ
アニオン
汎用性の高い酵素反応モニタリングシステム
ポリアルギニンに対する結合定数が基質および生成物の間で異なれば、様々な酵素
反応に応用できる。
ポリアルギニン (pR) アクチベータ
アニオン
T. Miyatake, M. Nishihara, S. Matile, J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 12420.
10
0
10
20
30
40
50
60
0.001 0.01 0.1 1 10 100
HA Sodium Salt (g / mL)
ヒアルロン酸(HA)存在下でのポリアルギニンの膜透過
IC50 (HA) = 0.56 ±0.06 g / mL
蛍光測定条件
LUVCF c.a. 50 M
pR 250 nM
DP 2.5 ~ 100 M
HEPES 10 mM
KCl 107 mM
pH = 7.4, 60 ˚C
Inte
nsi
ty (%
)
ヒアルロン酸 (g / mL)
11
酵素活性の評価実験
+ 蛍光性
リポソーム
緩衝溶液
+ 膜透過性
ポリマー
+ 両親媒性
アニオン
サンプリング (10~20 L 程度)
酵素反応溶液
酵素反応溶液を少量取り、そこへ蛍光性リポソーム、
と膜透過性物質を加え、蛍光強度を測定する。
12
ヒアルロニダーゼ反応の追跡
0
10
20
30
40
50
60
0 4 8 12 16 20 24 28
Reaction Time (min)
t1/2 = 1.8 ± 0.2 min Inte
nsi
ty (%
)
13
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120
Cromolyn (mM)Reaction Time (min)
Rela
tive
In
ten
sity (
%)
0 mM
4 mM 6 mM
8 mM
10 mM
O
OO
NaO
O
OH
O
O
O
ONa
O
Cromolyn
ヒアルロニダーゼの阻害剤
K. Mio, R. Stern, Matrix Biol.
2002, 21, 31
T. Miyatake, M. Nishihara, S. Matile, J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 12420.
ヒアルロニダーゼ阻害剤の活性評価
酵素反応時間 (分)
蛍光
強度
(%
)
14
ヘキソキナーゼの活性評価
ヘキソキナーゼ
膜透過性ポリマー
+
+
蛍光性リポソーム
膜透過
X
蛍光
両親媒性アニオン
膜透過性ポリマー
D-グルコース
D-グルコース-6-リン酸
ATP
ADP
両親媒性アニオン
この手法はその他のキナーゼ類(プロテインキナーゼ、酢酸
キナーゼ等)にも適応可能
15
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200
+ LUVCF
10 mM HEPES
107 mM KCl
Buffer pH = 7.4
酵素反応条件
ヘキソキナーゼ 0, 0.2, 0.3 unit / mL
グルコース 2 mM
ATP 2 mM
MgCl2 1 mM
pH = 8.0, 30 ℃
オイルバス 30 ℃
+ pAA
+ DP
酵素反応液
Reaction Time (min)
Rel
ativ
e In
ten
sity
(%
)
pAAの膜透過を利用したヘキソキナーゼ反応の追跡
[ヘキソキナーゼ] = 0, 0.2, 0.3 unit / mL
0 unit
0.2 unit
0.3 unit
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目視によるヘキソキナーゼ反応の評価
0 20 25 30 35 40 45 50
反応時間 / 分
ヘキソキナーゼ
ヘキソキナーゼ +
D-グルコサミン
ヘキソキナーゼ +
N-アセチル- D-グルコサミン
オイルバス 30 ℃
酵素反応液 0 20 25 30 35 40 45 50 分
+ LUVCF + pAA
+ DP
マイクロプレート
10 mM HEPES, 107 mM KCl Buffer pH = 7.4
酵素反応条件
ヘキソキナーゼ 0.1 unit / mL
グルコース 10 mM
ATP 2 mM
MgCl2 1 mM
pH = 8.0, 30 ℃
17
プロテインキナーゼおよびその阻害剤の活性評価
30
40
50
60
70
0 100 200 300 400 500
酵素反応時間 / 分
[H-89] = 0 M
25 M
100 M
200 M
蛍光
強度
(%
)
プロテインキナーゼ反応の追跡と阻害剤(H-89)の活性評価
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酵素を用いた分子センシング(酵素センサー)
酵素 (生成物) 分析対象物質
(基質)
分子認識素子
トランスデューサー 物質変換を信号に変える
【電気化学的信号など】
酵素センサー
例) グルコース酸化酵素を用いたグルコースセンサー
glucose + O2 glucono lactone + H2O2 glucose oxidase
H2O2 2H+ + O2 + 2e- 酵素反応で生成した過酸化水素を電気化学的に検出・定量する
19
OHO
HOOH
CH2OH
O
CH2OH
CH2OH
OH
OH
O
スクロース(ショ糖)
O
OH
CH2OH
OH
HO
HO
HO
CH2OH
CH2OH
HO
OH
O
O
OH
CH2OPO3-
OH
HO
HO
HO
CH2OH
CH2OPO3-
HO
OH
O
グルコース
フルクトース
グルコース-6-リン酸
フルクトース-6-リン酸
+ +ヘキソキナーゼ
ADPATP
ポリアルギニンを添加
ATPはpRと
強く結合する
ADPはpRと
強く結合しない
アクチベータアニオンを添加
アクチベータアニオンはpR
と結合しにくい
アクチベータアニオンはpR
と結合する
pRは膜透過
しにくい
蛍光
pRが膜透過し、
蛍光発光が観測される
CFを封入した
リポソームを添加
インベルターゼ
スクロースのセンシング
ソフトドリンク中のスクロースのセンシング
+ pAA
+ DP
+ LUVCF
インベルターゼ ヘキソキナーゼ
スクロース
グルコース グルコース-6-リン酸
フルクトース-6-リン酸 フルクトース
0
20
40
60
80
100
0 60 120 180 240 300
Time (sec)
Rel
ativ
e In
ten
sity
(
%)
Coca-Cola
Coca-Cola
zero
Coca-
Cola
Coca-
Cola
zero
20
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150
Coca-Cola (L)
0
20
40
60
80
100
0 50 100
カルピス (L)
コカコーラの量と蛍光強度の関係 カルピスの量と蛍光強度の関係
V50 =53±2 L V50=50±1 L
ソフトドリンク中のスクロースの定量
コカコーラ中のスクロース
270±9 M
カルピス中のスクロース
250±9 M
Rel
ativ
e In
ten
sity
(
%)
Rel
ativ
e In
ten
sity
(
%)
21
酢酸キナーゼを用いた酢酸の検出
酢酸キナーゼ反応
酢酸ナトリウム 300 mM
酢酸キナーゼ 7.5 units / mL
ATP 10 mM
MgCl2 10 mM
ヒドロキシルアミン 100 mM
TEA 56.3 mM (pH=7.6, 29 ℃)
酢酸キナーゼ
ATP
CH3COOH
ADP
CH3COO P
OH
O
OH
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50 60 700
20
40
60
80
100
10 100 1000
0
20
40
60
80
100
1 10 100
酢酸の濃度と蛍光強度の関係
食用酢の量と蛍光強度の関係 酢酸キナーゼ反応曲線
Rel
ativ
e In
ten
sity
(
%)
Rel
ativ
e In
ten
sity
(
%)
Rel
ativ
e In
ten
sity
(
%)
time (min) 食用酢 (L) 酢酸 (mM)
V50=17±0.6
L
EC50=130±5
mM
食用酢中の酢酸の濃度 2200±200 (mM)
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ラクトースの検出(甘味成分)
ガラクトシダーゼ
OHOHO
OHOH
OH
ラクトース
グルコース
ガラクトース
O
HOOH
OH
OHO
HO
HOOH
O
OH
OHO
HOOH
OH
OH
OHOHO
OHOH
OPO32-
グルコース-6-リン酸
OHO
HOOH
OH
OPO32-
ガラクトース-6-リン酸
ヘキソキナーゼ
ATP ADP
20
30
40
50
60
70
0.1 1 10
I %
[ラクトース]/mM
ラクトースの濃度に対する蛍光強度変化
EC50=1.2±0.08 mM
牛乳中のラクトース濃度
100±20 mM
122 mM (文献値)
20
30
40
50
60
70
1 10 100
I %
牛乳/L
牛乳の量に対する蛍光強度変化
V50=22±2 L W. J. Mullin, Food Res. Int. 1997, 304,
147
23
CH2OCOR
CHOCOR
CH2OCOR グリセロキナーゼ
グリセロール-3-リン酸 ATP ADP 脂肪
脂肪酸
グリセロール
リパーゼ
Liposome
pAA
Dp
Flu.
脂肪のセンシング
CH2OH
CHOH
CH2OH
CH2O
CHOH
CH2OH
P
O
O
O
牛乳 低脂肪牛乳
24
乳酸の検出
NHO
NO
O
O
O
OH
O
O
O
NHO
H2N
乳酸
乳酸
オキシダーゼ
ピルビン酸
ピレン酪酸
ヒドラジド (PBH) pR
蛍光
PBH-ピルビン酸
ヨーグルト中の乳酸濃度
45±5 mM
54 mM (文献値)
乳酸オキシダーゼ反応の追跡
0
20
40
60
80
100
0 30 60 90
I %
酵素反応時間/min
乳酸の濃度に対する
蛍光強度変化
0
20
40
60
80
100
0.1 1 10
I %
[乳酸]/mM
C50=3.4±0.2 mM
ヨーグルトの量に対する
蛍光強度変化
0
20
40
60
80
100
1 10
I %
ヨーグルト/L
V50=7.4±0.4 L F. Mizutani, et al., Anal Chem. Acta
1995, 314, 233
25
多品種の検体を迅速に検査でき、酵素あるいは酵素
阻害剤のスクリーニングに有効。医薬品開発などで、
薬理活性をもつ物質の探索などに利用できる。
使用する試薬類は溶液の状態で長期保存が可能であ
ることから、それらを組み合わせた酵素活性評価キット
としての利用が可能。
本技術は酵素活性を簡便に蛍光で検出できることから、
特定の物質を酵素で認識し、蛍光発光する蛍光酵素
センサーとしての応用も可能。
想定される用途
26
• 発明の名称 :酵素反応の阻害剤活性分析
方法、および、分析キット
• 公開番号 :特開2013-212103
• 出願人 :学校法人龍谷大学
• 発明者 :宮武智弘、礒谷侑司
本技術に関する知的財産権
27
龍谷大学
知的財産センター
知的財産アドバイザー 櫻井 雄三
TEL: 077-543 - 7832
FAX: 077-544 - 7263
e-mail: chizai@ad.ryukoku.ac.jp
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