journal of biological chemistrytranslate.docx

Journal of Biological Chemistrytranslate.googleusercontent.com

1. Pertama Diterbitkan pada tanggal 3 Juni 2010, doi: 10.1074/jbc.R110.130419 September 3, 2010 The Journal of Biological Chemistry, 285, 27.509-27.515.

Oxytetracycline Biosintesis *

1. Lauren B. Pickens 1 dan 2. Yi Tang 2

+ Author Affiliations

1. Dari Departemen Teknik Kimia dan Biomolekuler, University of California, Los Angeles, California 90095

1. 2 Untuk siapa korespondensi harus ditangani. E-mail: yitang @ ucla.edu.

Bagian berikutnya

Abstrak

Oxytetracycline (OTC) adalah antibiotik spektrum luas yang bertindak dengan menghambat sintesis protein pada bakteri. Ini adalah anggota penting dari bakteri aromatik keluarga poliketida, yang merupakan kelas struktural beragam produk alami. OTC disintesis oleh tipe II poliketida sintase yang menghasilkan tulang punggung poli-β-keton melalui kondensasi decarboxylative berturut-turut unit extender malonyl-CoA, diikuti oleh modifikasi oleh cyclases, oksigenase, transferase, dan enzim menjahit tambahan. Studi genetika dan biokimia telah diterangi sebagian besar langkah-langkah yang terlibat dalam biosintesis OTC, yang rinci di sini sebagai studi kasus perwakilan di tipe II poliketida biosintesis.

Antibiotik Enzim Katalisis Enzim Kinetics Mekanisme enzim Fungsi Ribosom

Bagian Sebelumnya Berikutnya Bagian

Pengantar

Oxytetracycline (OTC) 3 merupakan produk alami poliketida baik dipelajari dan merupakan contoh penting dari tipe II poliketida biosintesis. Tipe II poliketida, juga dikenal sebagai poliketida aromatik bakteri, adalah kelompok senyawa yang diproduksi secara alami dalam bakteri dari poli-β-keton menengah yang dirancang untuk membentuk produk polisiklik yang mengandung setidaknya satu cincin aromatik ( 1 , 2 ). Kelas ini metabolit mencakup banyak senyawa bioaktif penting seperti antikanker agen doxorubicin ( 3 ) dan mithramycin ( 4 ), yang pradimicin antivirus dan antijamur ( 5 ), dan tetrasiklin antibiotik ( 6 ). The biosintesis mesin bertanggung jawab untuk sintesis senyawa ini secara struktural dan biokimia mirip dengan yang untuk jenis synthases asam lemak II, yang mengarah ke klasifikasi tipe II poliketida synthases.

Penemuan chlortetracycline (CTC) pada tahun 1948 oleh Benjamin Duggar ( 7 ) menandai awal dari sejarah keluarga tetrasiklin. Awalnya disebut aureomycin untuk rona kuning, CTC segera diakui untuk sifat antibiotik yang luar biasa dan dipatenkan oleh American Cyanamid ( 7 , 8 ). Pada tahun

1950, AC Finlay dengan Pfizer menerbitkan penemuan antibiotik sejenis yang dihasilkan oleh Streptomyces rimosus bahwa mereka bernama Terramycin (kemudian berganti nama OTC) ( 9 ). Kedua senyawa tersebut adalah antibiotik spektrum luas dan menghambat sintesis protein pada bakteri dengan mengikat subunit ribosom 30 S ( 10 , 11 ). Meskipun nilai senyawa ini adalah mudah terlihat, itu beberapa tahun lagi sampai struktur kimia diselesaikan oleh kelompok Woodward ( 12 , 13 ). Tetrasiklin ditandai dengan fungsi yang unik C2 amida dan linear menyatu tetracyclic backbone, yang sangat dihiasi untuk menghasilkan 2-naphthacene karboksamida aglikon ( Gambar. 1 ). The teroksidasi pinggiran lebih rendah dari molekul termasuk konfigurasi keto-enol di C11, C11a, dan posisi C12, yang bertanggung jawab untuk khelasi ion magnesium. Fitur invarian dan gugus hidroksil di C10 dan C12a, yang terlibat dalam ikatan hidrogen dan konformasi tetrasiklin, yang penting untuk interaksi dengan 30 S ribosom subunit ( 11 ). Modifikasi ke pinggiran yang lebih rendah, seperti yang terjadi di C1 dan C10-C12a, yang merugikan aktivitas antibiotik ( 14 ). Sebaliknya, bagian pinggiran atas tetrasiklin yang toleran terhadap perubahan kimia dan dengan demikian telah menjadi sasaran modifikasi semisintetik ( 15 ).

GAMBAR 1.

A, diproduksi secara alami tetrasiklin, B, semisintetik tetrasiklin generasi kedua dan ketiga, C, tambahan alami tipe II poliketida direferensikan dalam teks.

Meluasnya produksi dan penggunaan tetrasiklin alami dalam pengobatan manusia dan hewan dalam dekade setelah penemuan mereka menyebabkan munculnya mekanisme resistensi dan penurunan efektivitas sebagai antibiotik lini depan ( 16 , 17 ). Tingkat keparahan resistensi bakteri menciptakan kebutuhan mendesak untuk mengembangkan derivatif tetrasiklin baru yang mampu menghindari mekanisme perlawanan. Yang paling klinis berharga tetrasiklin generasi kedua adalah minocycline dan doksisiklin. Doxycycline dihasilkan dari OTC oleh proses yang pertama-tama bertobat OTC ke methacycline, yang selanjutnya direaksikan untuk membentuk doxycycline ( 18 , 19 ). Ini analog lebih lipofilik daripada produk alami dan terbukti lebih mudah diserap ( 20 ). Para glycylcyclines atau disebut tetrasiklin analog generasi ketiga yang dikembangkan baru-baru ini, dengan tigecycline menerima Food and Drug Administration persetujuan pada tahun 2005. Tigecycline adalah turunan minocycline dan berisi kelompok tert-butylglycylamido di C9 ( 21 , 22 ). Hasil modifikasi penggelapan mekanisme perlindungan baik penghabisan dan ribosom resistensi ( 23 ), menjadikannya pilihan yang layak terhadap infeksi tetrasiklin-tahan.

Sejak penemuan OTC pada tahun 1950, jalur biosintesis telah diperiksa dengan alat yang tersedia untuk menjelaskan mekanisme biosintesis. Studi awal menunjukkan makan asal poliketida OTC ( 24 , 25 ), dan diblokir studi mutan ditentukan jauh dari urutan biosintesis dan menyebabkan isolasi intermediet dan produk shunt ( 26 , - , 31 ). Dengan kemajuan biologi molekuler dan teknik genetik dan urutan cluster gen OTC ( 6 , 32 , 33 ), peran individu dalam enzim jalur telah diperiksa. Menggabungkan studi genetik menggunakan tuan rumah alami S. rimosus dan studi pemulihan sistematis dalam heterolog Streptomyces host telah menyebabkan tugas fungsional hampir semua gen dalam cluster oxy ( 33 , - , 35 ). Rincian tambahan aspek rekayasa genetik dan metabolik tetrasiklin dapat ditemukan dalam tinjauan sebelumnya ( 36 , 37 ). Di sini, kita meninjau pengetahuan saat biosintesis OTC.


Biosintesis poliketida Backbone diamidasi

Biosintesis poliketida tulang punggung dikatalisasi oleh poliketida sintase minimal (PKS), yang meliputi tiga komponen, ketosynthase ini (KS) atau KS α, panjang rantai faktor (CLF) atau KS β, dan protein pembawa asil (ACP). Dalam cluster gen OTC, ini dikodekan oleh oxyA, oxyB, dan oxyC, masing-masing ( 33 ). Rincian tentang enzim komponen PKS minimal telah dibahas dalam beberapa ulasan terakhir ( 1 , 2 , 38 ). Secara singkat, KS dan CLF, yang berbagi kesamaan urutan tinggi,

asosiasi untuk membentuk kompleks heterodimer bertanggung jawab untuk perpanjangan rantai seperti ditunjukkan pada Gambar. 2 A. The extender Unit malonyl-CoA ditransfer ke ACP oleh malonil-CoA: ACP acyltransferase, yang dapat dibagi dengan biosintesis asam lemak ( 39 ), untuk membentuk malonil-ACP. KS-CLF mengkatalisis pembentukan ikatan C-C oleh Claisen-seperti kondensasi decarboxylative dari masuk malonyl-ACP dengan rantai poliketida baru lahir. Hasil bersih dari satu iterasi tersebut adalah penambahan satu unit ketide ke poliketida tumbuh. Panjang rantai diduga dikendalikan oleh subunit CLF, yang menentukan ukuran rongga mengikat poliketida ( 40 , 41

A, poliketida elongasi oleh berulang Claisen seperti kondensasi, B, dua jalur yang diusulkan untuk biosintesis unit pemula malonamate oleh Oxyd MAT, malonil-CoA: ACP acyltransferase..

Pemilihan satuan Starter merupakan sumber penting keanekaragaman kimia antara poliketida aromatik ( 42 ), dan masuknya unit pemula amida merupakan salah satu keunggulan dari tetrasiklin biosintesis. Yang paling umum Unit starter untuk PKS minimal asetat, namun keluarga tetrasiklin menggunakan unit pemula malonamate, yang merupakan asal dari amida C2. Enzim yang bertanggung jawab untuk biosintesis dari unit pemula yang tidak biasa adalah Oxyd amidotransferase. Saham Oxyd homologi tinggi dengan ATP-dependent kelas II asparagines synthases, yang mengkatalisis konversi aspartat untuk asparagin menggunakan glutamin sebagai donor amina ( 43 ). Oxyd sama mengandung sistein nukleofilik N-terminal yang telah terbukti bertanggung jawab atas hidrolisis amida glutamin dalam Escherichia coli AsnB ( 43 ). Oleh karena itu Oxyd diusulkan untuk mengkatalisis konversi dari malonat setara dengan malonamate sesuai dengan cara ATP-dependent. Yang tepat substrat Oxyd, yang dapat berupa malonyl-S-CoA atau malonyl-S-ACP, belum ditentukan karena ketidakmampuan untuk kegiatan Oxyd menyusun kembali in vitro ( 33 ). Dua jalur yang diusulkan ditunjukkan pada Gambar. 2 B. Peran Oxyd di pemula Unit biosintesis dikonfirmasi oleh ekspresi gabungan dengan minimal PKS OxyABC dalam berbagai heterolog dan isolasi WJ85 (4) ( Gambar. 3 ) ( 33 ). Kehadiran amida dalam 4 menegaskan peran Oxyd di priming PKS minimal. Coexpression dari C9 ketoreductase OxyJ sama menghasilkan biosintesis dari diamidasi berkurang poliketida backbone, yang spontan cyclized untuk membayar isoquinolone WJ35 (6) ( 33 ). Oleh karena itu, PKS minimal oxy dan Oxyd dapat secara kolektif disebut sebagai "oxy diperpanjang PKS minimal."

Biosintesis OTC dan melaporkan produk shunt.

Seperti banyak tipe II PKSS yang menggunakan unit pemula nonacetate, PKS oxy juga dapat dimulai oleh primer asetat dalam ketiadaan Oxyd. Seperti diilustrasikan pertama dengan Khosla dan rekan kerja ( 44 ), PKS minimal oxy saja mensintesis eksklusif asetat-prima decaketides. Dalam jalur lain di mana unit pemula nonacetate bekerja, seperti daunorubisin ( 45 ), frenolicin ( 46 ), R1128 ( 46 , 47 ), dan hedamycin ( 48 , 49 ), modul tambahan inisiasi telah terlibat dalam pemilihan satuan pemula. Dalam kasus frenolicin dan R1128, itu lebih lanjut menunjukkan bahwa ACP khusus diperlukan untuk langkah-langkah inisiasi rantai dan memainkan peran yang berbeda dari ACP dimanfaatkan oleh PKS minimal untuk perpanjangan rantai ( 46 ). The oxy jalur tidak memiliki komponen tambahan, dan diamidasi backbone lengkap dapat diproduksi oleh PKS diperpanjang minimal tanpa enzim tambahan. Sebuah enzim yang menjamin pemula Unit kesetiaan dalam R1128 jalur adalah malonil-CoA: ACP acyltransferase homolog ZhuC. ZhuC terbukti memiliki aktivitas thioesterase ampuh terhadap asetil-ACP. Hal ini menyebabkan usulan bahwa peran ZhuC adalah untuk selektif menghidrolisis bersaing asetil-ACP dalam mendukung rantai panjang unit primer asil-ACP ( 50 ). The oxy klaster berisi homolog ZhuC, OxyP, dan ada indikasi bahwa mungkin melayani peran yang sama dalam menekan priming asetat dan mengurangi tingkat 2-asetil-2-decarboxamido-OTC (ADOTC). 4 Mengurangi ADOTC: OTC rasio yang diinginkan, seperti ADOTC telah sangat mengurangi aktivitas antibiotik dibandingkan dengan OTC dan sulit untuk menghapus dari kaldu fermentasi ( 51 ). Berbeda dengan R1128 jalur, yang hanya menghasilkan asetat-prima poliketida dengan tidak adanya kegiatan proofreading dari ZhuC, PKS oxy tidak memerlukan OxyP untuk menggabungkan unit pemula malonamate. Menariknya, sebuah homolog OxyP tidak ditemukan di cluster gen CTC ( 52 ), yang

selanjutnya menunjukkan bahwa enzim tersebut tidak penting untuk biosintesis tetrasiklin melainkan berfungsi sebagai enzim aksesori.


Siklisasi Backbone poliketida

Karena reaktivitas dari baru lahir poli-β-keton backbone, cyclases diperlukan untuk menekan cyclizations spontan dan untuk mempromosikan regioselektivitas dari intramolekul aldol kondensasi. Dengan tidak adanya cyclases, KS-CLF dan C9 ketoreductase juga telah disarankan untuk memainkan peran kunci dalam mempengaruhi lipat dari rantai poliketida ( 40 , 53 , 54 ). PKSS paling minimal menghasilkan C7-C12 poliketida cyclized sebagai produk utama dalam ketiadaan enzim menjahit tambahan, menunjukkan bahwa KS-CLF dapat mempromosikan regioselektivitas dari peristiwa siklisasi pertama ( 55 ). Analisis struktur kristal dari actinorhodin (act) KS-CLF menunjukkan bahwa tekuk rantai poliketida harus terjadi dalam terowongan KS-CLF untuk mengakomodasi rantai poliketida full-length. Persyaratan ini mungkin posisi rantai dalam konfigurasi yang menguntungkan bagi C7-C12 siklisasi ( 40 ). Bagi banyak tipe II poliketida, C9 ketoreduction adalah yang pertama menjahit langkah setelah selesainya rantai poliketida oleh PKS minimal. Hampir semua C9 tulang punggung poliketida berkurang menjalani C7-C12 siklisasi membentuk cincin pertama, termasuk dari tetrasiklin. Struktur kristal bertindak ketoreductase (KR) dengan inhibitor terikat menunjukkan preferensi untuk substrat cyclized ( 54 ).

Namun, peran-peran yang diusulkan untuk minimal PKS-dan C9 KR-dikendalikan C7-C12 siklisasi tidak berlaku untuk poliketida backbone diamidasi disintesis oleh oxy diperpanjang PKS minimal. Seperti ditunjukkan dalam Gambar. 3 , 4 disebutkan sebelumnya diproduksi oleh OxyABCD mengadopsi C11-C16 siklisasi dering pertama, sedangkan 6 diproduksi oleh OxyABCDJ yang cyclized melalui C13-C18 kondensasi aldol ( 33 ). Para regioselectivities langkah-langkah siklisasi pertama dalam 4 dan 6 yang terutama mengherankan mengingat bahwa asetat-prima decaketide disintesis oleh PKS minimal oxy memang cyclize istimewa melalui C7-C12. Misalnya, PKS minimal oxy saja menghasilkan SEK15 (2a) ( 33 , 55 ), sedangkan di hadapan tindakan KR, menghasilkan RM20b / c (2b) ( 44 ). Oleh karena itu, kehadiran unit pemula diamidasi secara signifikan dapat mempengaruhi orientasi rantai poliketida dalam situs aktif dari KS-CLF, serta bahwa dari KR C9, untuk menghasilkan regioselectivities siklisasi tak terduga 4 dan 6. Atau , sedangkan tulang punggung mungkin berorientasi dalam konfigurasi yang sama, kehadiran unit pemula amida entah bagaimana ditekan C7-C12 kondensasi aldol, menyebabkan pelepasan produk uncyclized yang cepat mengalami siklisasi spontan untuk menghasilkan 4 dan 6. Oleh karena itu, dalam biosintesis OTC, pertama cincin adenilat / aromatase mutlak diperlukan untuk benar C7-C12 siklisasi dan pembentukan D-ring.

OTC pertama cincin cyclase OxyK pertama kali diidentifikasi oleh Petkovic dkk. ( 56 ) sebagai adenilat / aromatase. Gangguan gen ini mengakibatkan penghapusan semua intermediet tetrasiklin dikenali dalam budaya mutan ( 56 ). Zhang et al. ( 35 ) kemudian menunjukkan peran OxyK. Ekspresi heterolog OxyK dengan OxyABCDJ di Streptomyces coelicolor CH999 menyebabkan isolasi WJ78 (8), yang berisi diaromatisasi D-ring dengan benar C7-C12 regioselektivitas. OxyN kemudian diidentifikasi sebagai adenilat cincin kedua berdasarkan kesamaan urutan tinggi untuk DpsY dalam jalur daunorubisin ( 57 ) dan MtmY dalam jalur mithramycin ( 58 ). Penambahan oxyN ke kaset tersebut mengakibatkan produksi linier tetracyclic produk WJ83T1 (12), yang merupakan versi teroksidasi spontan pretetramid (11), sebagai metabolit utama ( 35 ). Cluster gen oxy juga mengkodekan cyclase putatif tambahan, OxyI, yang memiliki homologi urutan ke MtmX, keempat adenilat cincin putatif dalam jalur mithramycin ( 59 ). Karena sepenuhnya cyclized produk 12 diproduksi pada ekspresi gabungan dengan OxyN, peran OxyI dalam jalur oxy tetap tidak jelas. Coexpression dari oxyI di host heterolog memproduksi 12 tidak berpengaruh pada profil produk ( 35 ). Untuk menyelidiki lebih lanjut dasar siklisasi cincin keempat, Zhang et al. ( 35 ) menciptakan konstruk lain di mana Oxyd amidotransferase telah dihapus. CH999 berubah dengan kaset encoding

OxyABCJKN hanya diproduksi asam desmethylaklanonic trisiklik, membenarkan bahwa amida terminal dapat mempengaruhi siklisasi A-cincin perjalanan ke 12.

Cluster gen baru sequencing bertanggung jawab untuk biosintesis dari tetrasiklin seperti senyawa SF2575 memungkinkan pemulihan dari peristiwa siklisasi di jalur ini juga ( 61 ). Kedua adenilat cincin di ssf jalur, SsfY2, memiliki homologi rendah untuk OxyN sementara bantalan homologi yang kuat untuk cyclases cincin kedua dari jalur benzoisochromanequinone seperti Gra-ORF33 ( 60 ). Juga hadir dalam cluster gen ssf adalah homolog OxyI, SsfY4, yang juga bertekad untuk tidak diperlukan untuk siklisasi tetracyclic perancah, mengkonfirmasikan hasil dilihat dengan OxyI. Lebih penting lagi, asil-CoA diduga ligase, SsfL2, diperlukan untuk menghasilkan tetracyclic antara 12 dalam berbagai heterolog ( 61 ). Sebuah kemungkinan peran SsfL2 mungkin untuk mengkatalisis Claisen seperti siklisasi antara C1 dan C18 dari dihidrolisis trisiklik asam karboksilat antrasena dalam mode CoA-dependen. SsfL2 memiliki homolognya di jalur lain yang menghasilkan senyawa tetrasiklin seperti, termasuk OTC ( 33 ), CTC ( 52 ), mithramycin ( 58 ), dan polyketomycin baru sequencing ( 62 ) kelompok gen. The oxy homolog OxyH ditunjukkan, bagaimanapun, harus dibuang dengan knock-out studi. 4 Oleh karena itu, mekanisme yang tepat untuk keempat siklisasi cincin dalam sistem ini belum sepenuhnya dipahami.


Pembentukan anhydrotetracycline

Yang sangat dihiasi cyclohexenone A-cincin tetrasiklin memiliki fitur struktural yang unik tidak diamati antara poliketida aromatik lainnya. Kelompok-kelompok fungsional, yang penting untuk sifat antibiotik tetrasiklin, termasuk amida C2 primer, C4 dimetilamin, dan C12a tersier alkohol. Salah satu intermediet paling penting dalam transformasi pretetramid ke OTC anhydrotetracycline (ATC; 20). ATC adalah menengah pertama di jalur biosintesis mengandung sepenuhnya difungsikan A-ring. Penelitian terbaru oleh Zhang et al. ( 34 ) telah diidentifikasi dan ditandai set minimal enzim yang dibutuhkan untuk pembentukan 20.

Menjahit Langkah pertama berikut siklisasi adalah C6 metilasi. OxyF diidentifikasi dalam cluster gen sebagai salah satu dari dua methyltransferases S-adenosylmethionine-dependent dan terbukti bertanggung jawab untuk C6 metilasi oleh pemulihan dalam berbagai heterolog. Pencantuman gen pengkodean OxyF dalam membangun tersebut memproduksi pretetramid mengakibatkan produksi dikenal antara 6-methylpretetramid (13), yang secara spontan teroksidasi menjadi WJ119 (14) ( 35 ). Metilasi C6, yang terletak di pinggiran bawah OTC, telah dikenal dibuang untuk transformasi berikutnya oleh enzim hilir ( 28 ). Oleh karena itu, penghapusan OxyF dari host heterolog yang menghasilkan 20 menyebabkan biosintesis 6-demethyl-ATC ( 34 ).

Setelah C6 metilasi, 6-methylpretetramid diubah menjadi 4-keto-ATC (17) melalui hidroksilasi ganda A-ring. Sebanyak lima oxygenases diduga hadir dalam cluster gen oxy, dan studi pemulihan sistematis diidentifikasi OxyL sebagai oxygenase NADPH-dependent yang dibutuhkan untuk menghasilkan 17 melalui hidroksilasi dari C4 dan C12a posisi. Di bawah dalam kondisi in vivo, 17 mudah disusun kembali melalui penataan ulang intramolekul dari cincin-B dan dua tandem perpecahan retro-Claisen untuk menghasilkan produk degradasi diamati WJ135 (18) ( 34 , 63 ). Kegiatan hidroksilasi OxyL dikonfirmasi in vitro, sebagai penambahan dimurnikan OxyL sampai 13 menghasilkan produk singkat diidentifikasi sebagai 17. Sebuah laporan berikutnya oleh Wang et al. ( 64 ) menunjukkan bahwa OxyE, lain oxygenase FAD-dependent, adalah hidroksilase C4 dan memainkan peran pendukung dalam langkah dihydroxylation kunci yang mengkonversi 13 sampai 17. Meskipun OxyL dapat melakukan dihydroxylation dari C12a dan C4 saja, kehadiran OxyE signifikan meningkatkan titer OTC, mungkin dengan meningkatkan laju ini langkah menjahit kunci ( Gambar. 3 ). Coexpression dari OxyE dengan enzim yang diproduksi 13 dalam berbagai heterolog menyebabkan biosintesis JX11 (16), sedangkan inaktivasi oxyE di S. rimosus menyebabkan akumulasi produk shunt yang muncul melalui oksidasi spontan 13. Peran tambahan dari OxyE ke OxyL mirip dengan kegiatan homolognya

diamati dalam jalur polyketomycin. Dalam jalur ini, Daum et al. ( 62 ) mengusulkan hidroksilasi C4 dikatalisis oleh homolog PokO1 OxyE juga dapat dikatalisis oleh homolog PokO2 OxyL, yang juga melakukan C4 dan C12a hydroxylations.

OxyQ memiliki homologi urutan tinggi terhadap piridoksal aminotransferase aspartat 5'-fosfat-dependent ( 65 ). Sebagai anggota keluarga ini, OxyQ diperkirakan mengkatalisis transaminasi kelompok α-amino dari asam amino donor untuk keton C4 dari 17 untuk membentuk 19. Memang, setelah ekspresi kaset encoding OxyABCDJKNLQ di CH999, 19 ditunjukkan menumpuk di kaldu fermentasi ( 34 ). Donor asam amino OxyQ belum ditetapkan karena versi larut OxyQ rekombinan belum diperoleh sejauh ini.

Penambahan gen pengkodean OxyT menyelesaikan kaset ATC-memproduksi, dan ini 10 enzim yang ditampilkan untuk set minimal enzim yang diperlukan untuk biosintesis 20 dalam berbagai heterolog ( 34 ). OxyT selanjutnya ditandai dengan uji in vitro menggunakan 19 sebagai substrat dan S-adenosylmethionine sebagai donor metil. In vitro assay mengungkapkan bahwa antara monomethylated dapat dideteksi setelah waktu reaksi singkat. Konversi penuh 19-20 diamati setelah waktu reaksi yang lama ( 34 ).


Pembentukan OTC

Langkah-langkah yang tersisa dalam biosintesis OTC belum heterologously dilarutkan dalam vivo, namun, uji in vitro dan diblokir studi mutan telah menjelaskan menjahit 20 sampai OTC. Langkah berikutnya setelah pembentukan 20 adalah hidroksilasi C6. Sebuah ATC oxygenase telah dimurnikan dan dipelajari secara in vitro untuk kedua CTC ( 66 ) dan OTC ( 67 , 68 ) jalur. Dalam kedua kasus, ATC oxygenase diidentifikasi sebagai monooxygenase mengkatalisis konversi 20 hingga 21 di hadapan NADPH dan atmosfer oksigen. Titik studi mutasi dengan Peric-Concha et al. ( 68 ) menunjukkan bahwa mutasi glisin residu penting dari NADPH-mengikat situs dieliminasi aktivitas OtcC (juga bernama Oxys) jika dinyatakan heterologously di E. coli. Menariknya, ketika gen mutan ini putatively aktif berubah menjadi Oxys nol strain mutan, aktivitas hidroksilasi C6 dipulihkan, sehingga produksi OTC ( 68 ). Para penulis mengusulkan bahwa hasil ini mengejutkan mungkin disebabkan oleh hidroksilase tambahan yang mungkin juga memiliki beberapa aktivitas terhadap posisi C6, mirip dengan peran pendukung dari OxyE ke OxyL. Namun, dalam kasus ini, Oxys mutan diperlukan untuk hidroksilasi, mungkin melayani sebagai mitra struktural untuk hidroksilase tak dikenal.

Dasar enzimatik C5 hidroksilasi langkah unik untuk jalur OTC belum diselesaikan. Dari lima oxygenases diduga ditemukan di cluster gen OTC, OxyR dan OxyG belum ditugaskan fungsi biosintesis. Homologi urutan tempat OxyR dalam pyridoxine 5'-fosfat oksidase-seperti keluarga protein, yang juga termasuk ActVA-ORF2, sebuah protein ditugaskan dari cluster gen actinorhodin ( 69 ). Di sisi lain, OxyG diperkirakan menjadi kuinon pembentuk monooxygenase kecil dengan homologi enzim yang ditemukan di beberapa cluster poliketida lain seperti mithramycin ( 70 ), aklavinone ( 71 ), dan polyketomycin ( 62 ). AknX ditunjukkan in vitro untuk mengkatalisis reaksi pembentukan kuinon-emodin antron mengkonversi ke emodin, memimpin penulis untuk percaya bahwa itu mengkatalisis reaksi paralel dalam konversi antron asam aklanonic asam aklanonic ( 71 ). Dalam kasus mithramycin, namun inaktivasi OxyG homolog MtmOIII terbukti tidak berpengaruh pada produksi mithramycin ( 72 ). Potensi kuinon-membentuk kegiatan OxyG homolognya menimbulkan spekulasi awal bahwa itu mungkin terlibat dalam pembentukan 17, namun, seperti dijelaskan di atas, OxyL (dengan bantuan OxyE) telah terbukti cukup untuk katalisis dari langkah ini. Ini tidak menghilangkan, bagaimanapun, kemungkinan peran auxiliary OxyG seperti yang ditunjukkan untuk OxyE ( 64 ). Sebuah aspek menarik dari hidroksilasi C5 adalah bahwa karena itu adalah langkah unik untuk biosintesis OTC, orang akan berharap gen yang bertanggung jawab untuk absen dari cluster gen CTC, sebanyak CTC C7 halogenase ( 73 ) tidak hadir dari cluster gen OTC .

Perbandingan antara kelompok gen dua mengungkapkan, bagaimanapun, bahwa masing-masing lima oxygenases di cluster oxy memiliki homolog pada gen klaster CTC ( 33 , 52 ). Ada kemungkinan bahwa enzim yang bertanggung jawab untuk C5 hidroksilasi hadir dalam kedua kelompok gen tetapi tidak aktif menuju menengah diklorinasi dalam jalur CTC. Atau, enzim yang bertanggung jawab untuk langkah ini di cluster gen CTC berisi mutasi menonaktifkan. Sebagai perbandingan tambahan, cluster gen ssf hanya berisi dua oxygenases, sebuah homolog Oxys, SsfO1, dan homolog OxyL, SsfO2 ( 33 , 61 ). Oleh karena itu, peran dari dua oxygenases tambahan dan dasar enzimatik C5 hidroksil tetap menjadi misteri yang belum terpecahkan biosintesis OTC.

Langkah terakhir dalam biosintesis OTC adalah pengurangan C5a-C11a ikatan ganda di 22. Nakano et al. ( 74 ) mengidentifikasi gen dari Streptomyces aureofaciens yang terbukti bertanggung jawab untuk langkah terakhir dalam biosintesis CTC. Gen ini, encoding Tcha, dipetakan luar sequencing sebelumnya gen cluster CTC. Tcha membutuhkan 7,8-dedimethyl-8-hidroksi-5-deazariboflavin sebagai kofaktor ( 74 ), yang menjelaskan mengapa mutan diblokir di 7,8-dedimethyl-8-hidroksi-5-deazariboflavin biosintesis, sebelumnya disebut sebagai faktor cosynthetic saya , juga diblokir dalam langkah reduksi akhir ( 31 , 75 ). Di jalur oxy, tidak ada calon enzim yang jelas yang mungkin terkait dengan langkah ini. Oleh karena itu, reduktase dapat sama dikodekan di tempat lain di genom. Dalam sebuah studi oleh Binnie et al. ( 75 ), wilayah 34-kb yang mengandung gen cluster oxy dan daerah mengapit langsung diubah menjadi Streptomyces lividans dan Streptomyces albus. Kedua strain rekombinan terbukti positif dalam produksi OTC, yang menunjukkan bahwa cluster gen berisi semua enzim yang dibutuhkan untuk biosintesis OTC. Jika ada gen yang terlibat dalam produksi OTC memang terletak di luar cluster gen yang dikenal, mereka mungkin banyak ditemukan dalam strain Streptomyces dan tidak spesifik untuk biosintesis tetrasiklin. Baru-baru ini, Boddy dan rekan kerja ( 76 ) menunjukkan produksi heterolog OTC di Myxococcus xanthus dengan memasukkan konstruk mengandung cluster gen yang ditunjukkan pada Gambar. 4 ke dalam genom inang. Hal ini semakin memperkuat usulan bahwa semua gen yang diperlukan untuk memproduksi OTC dalam berbagai

OTC gen cluster dari S. rimosus.


Gen Pengatur dan Resistance

Terlepas dari gen biosintesis, produsen antibiotik harus membawa gen ketahanan diri untuk melindungi strain inang. Mekanisme yang paling umum memberikan resistensi tetrasiklin adalah melalui protein penghabisan dan perlindungan ribosom ( 17 ). Cluster gen oxy berisi dua protein yang terlibat dalam perlawanan tetrasiklin, Otra dan OtrB, yang 34 kb terpisah dan mengapit cluster gen biosintesis ( 77 , 78 ). Kloning dan karakterisasi TETA (analog dengan Otra) oleh Ohnuki et al. ( 79 ) menunjukkan bahwa itu terlibat dalam mekanisme perlindungan ribosom perlawanan. Ini kemudian diperkuat oleh Doyle dkk. ( 80 ), yang juga menunjukkan urutan kesamaan antara Otra dan TetM. TetM telah ditunjukkan untuk mengikat noncovalently ke ribosom dan mempromosikan penghapusan tetrasiklin ( 81 , 82 ). Di sisi lain, OtrB terbukti menjadi protein terikat membran yang bertanggung jawab untuk mengurangi akumulasi tetrasiklin dalam sel ( 79 , 83 ). Gen yang mengkode OtrB terletak dengan polaritas berlawanan dengan pengkodean gen protein regulator OxyTA1 dengan cara yang sama sebagai tetR / Teta pasangan, di mana TetR negatif mengatur ekspresi protein penghabisan Teta ( 84 ). Urutan perbandingan menempatkan OxyTA1 lebih dekat dengan keluarga Marr dari regulator transkripsi, yang dikenal untuk menekan ekspresi gen resistensi pada tidak adanya induser ( 85 ). Menariknya, cluster oksi tidak menyandikan aktivator transkripsi seperti SARP (S treptomyces yang ntibiotic r egulatory p rotein) protein keluarga ditemukan di banyak kelompok gen antibiotik, termasuk cluster CTC ( 86 ). Baru-baru ini, bagaimanapun, keluarga LuxR aktivator transkripsi, OtcG, telah diidentifikasi oleh Lesnik et al. ( 87 ) yang akan dikodekan hanya di luar Otra. Inaktivasi otcG mengakibatkan penurunan produksi OTC, menunjukkan bahwa itu adalah regulator positif OTC biosintesis ( 87 ).


Kesimpulan

Penjelasan dari jalur biosintesis dari OTC telah memberikan kontribusi terhadap pengetahuan kita tentang tipe II poliketida biosintesis dan aspek diterangi unik untuk jalur ini, seperti biosintesis dari malonamate Unit pemula yang tidak biasa dan efeknya pada langkah-langkah enzimatik hilir. Tetrasiklin perancah telah menjadi inspirasi berharga bagi ahli kimia obat, dan turunan tetrasiklin masih memainkan peran penting dalam mengobati infeksi bakteri. Identifikasi peran enzim individu dalam jalur merupakan langkah maju menuju rekayasa rasional senyawa baru. Karakterisasi tetrasiklin tambahan dan jalur poliketida lanjut akan membantu pemahaman kita tentang pertanyaan yang tersisa tentang jalur ini dan meningkatkan kemampuan kita untuk insinyur senyawa baru.

journal of biological chemistrytranslate.docx

Documents