jornada d'aplicacions cromatogràfiques en · alimentsmitjançantla tècnicaspme/gc/ms. josé...
TRANSCRIPT
1 24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari
“JORNADA D’APLICACIONS CROMATOGRÀFIQUES EN EL SECTOR
AGROALIMENTARI”
Disseny experimental en l’anàlisi de volàtils en aliments mitjançant la tècnica SPME/GC/MS.
José A. Garcia-Regueiro
Assessor laboratoris d’anàlisi de l’IRTA
SPME
Supelco va desenvolupar la micro-extracció en fase sòlida amb fibres de diferents polímers que permeten l’adsorció de compostos en fase gas i en fase líquida
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari3
TÈCNIQUES PER A DETERMINAR COMPOSTOS VOÀTILS EN ALIMENTS
Head space:
Estàtic
Dinàmic
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari4
SPME
Steam distillation
Destil·lació amb captació a temperatures decreixents
Concepte SPME
El polímer de la fibra (adsorció o absorció) compostos d’un mode similar al que es pot produir en una fase estacionària en les separacions per cromatografia de gasos.
Per tant de manera similar les interaccions es poden plantejar en
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari5
Per tant de manera similar les interaccions es poden plantejar en funció de la polaritat del solut i del polímer. La quantitat d’adsorció dependre de la quantitat de polímer dipositada a la fibra (7 -100 µm)
Quantificació
m = (Kfs Vf C0 VS / (Kfs Vf + VS)
m = quantitat de solut extretKfs = coeficient de partició entre la fibra i la mostra per a un compostC0 = concentració inicial a la mostraV = volum de la fibra
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari6
0
Vf = volum de la fibraVS = volum de la mostra
Si VS >> Kfs Vf ⇒ m = Kfs Vf C0
És una relació lineal, que hem de mantenir en el procés operatiu; tanmateix quan tenim 100 compostos diferents aquesta aproximació potser no aplicable a tots.
Fibra Mecanisme Polaritat
PDMS Absorbent Apolar
Polyacrilate (PA) Absorbent Apolar
PDMS-DVB Adsorció Bipolar
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari7
CW-DVB Adsorció Polar
Carboxen-PDMS Adsorció Bipolar
DVB-Carboxen-PDMS Adsorció Bipolar
COMPOSTOS VOLÀTILS I SEMIVOLÀTILS EN ALIMENTS
Podem considerar dos situacions:
Líquids (Begudes, llet, sucs)
Sòlids (fruita, carn, peix, fruits secs, verdures, cereals...)
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari8
Sòlids (fruita, carn, peix, fruits secs, verdures, cereals...)
Contingut d’aigua
Proteïnes
Lípids
Processament
Origen dels compostos volàtils
Propis de l’aliment
Genètica
Sistema de producció
Condicions de collita/sacrific
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari9
Generats en el procés tecnològic
Temperatura
Enzims
Oxidació
Reaccions químiques entre components i additius
Microorganismes
Contaminants
Aproximació 1
Cada perfil de volàtils es depenent de:
Tipus de fibraCondicions operativesPes de la mostra
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari10
Pes de la mostraVolum de la fase gas (vapor)Fibra (absorció o adsorció)Temps i temperatura de captació dels volàtilsTemperatura de desorcióFase estacionària columna cromatogràficaSensibilitat i altres paràmetres del sistema GC/MS
Conseqüències
No es pot obtenir un anomenat perfil de volàtils “únic”
Es pot obtenir un perfil de volàtils en les condicions x,y...
Aquest perfil es pot comparar en aliments obtinguts de
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari11
Aquest perfil es pot comparar en aliments obtinguts de mode similar i en procediments tecnològics reproducibles
La robustesa es pot determinar amb dades de diferents laboratoris i en funció de compostos escollits per la seva rellevància
Procediment quantitatiu
Un cop obtingut un perfil és necessari quantificar per tal de poder efectuar comparacions estadístiques
Dos situacions:
Determinació de compostos coneguts (target)
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari12
Determinació de compostos coneguts (target)Determinació del perfil complert
Estratègies:Si el compost és conegut podem fer servir patrons interns (deuterats,...) En el cas de varis compostos del perfil no es viable fer servir un patró per a cadascú.
Mètode de obtenir dades quantitatives en perfils
a) Àrees absolutes (dada directa de l’àrea obtinguda del pic)
b) Patró intern (2 o 3 amb tR en zones de diferents P. eb. Estimats)
Dificultats:
En a) la variabilitat entre mostres pot no ser detectada per errors
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari13
En a) la variabilitat entre mostres pot no ser detectada per errors aleatoris no detectats.
En b) els errors aleatoris poden ser detectats, però com en a) la concentració és una valor estimat sense un coneixment del factor de resposta individual.
La fibra i la fase estacionària (GC) donen perfils diferents i per tant quantificacions no equivalents
TIC o SIM (m/z específics)
TIC permet una resposta que és por aproximar a la d’un detector FID, però en la que compostos amb àrees petites i propers al “soroll” del sistema (background spectra) pot induir molts errors
En aquest casos la selecció d’ions representatius pot ajudar a la
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari14
En aquest casos la selecció d’ions representatius pot ajudar a la identificació i quantificació (més crítica)
Sempre en les dades quantitatives s’ha d’indicar el procediment i la seva validesa per tal de que en altres estudis es pugui comparar
Análisis de conglomerados (método Ward y distancia euclídea) sobre todaslas variables disponibles. Posteriormente análisis de la varianza de un factorcon el fin de comprobar la existencia de diferencias estadísticas entre losdistintos grupos homogéneos obtenidos (conglomerados). En este caso para
Aproximació estadística per a classificar mostres en grups mitjançant compostos
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari15
distintos grupos homogéneos obtenidos (conglomerados). En este caso parala comparación de medias se aplica mediante el test de Tukey. Finalmenteanálisis discriminante para valorar la capacidad de las variables medidas dediscriminar y clasificar correctamente las distintas muestras en cada uno delos grupos obtenidos previamente (conglomerados). Todos los análisis serealizaron mediante el programa estadístico XLSTAT (Addinsoft, Paris).
Automatització = Repetibilitat
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari16
Automatització = Repetibilitat
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari17
450000
500000
550000
600000
650000
700000
750000
800000
850000
Abundance
Ion 57.00 (56.70 to 57.70): L_392.D\data.ms
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari18
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.000
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
Time-->
26000
28000
30000
32000
34000
36000
38000
40000
42000
44000
46000
48000
Abundance
Ion 56.00 (55.70 to 56.70): 34097AVECO10.D\data.ms
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari19
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.000
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
22000
24000
26000
Time-->
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.000
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
Time-->
Abundance
Ion 85.00 (84.70 to 85.70): 34097AVECO10.D\data.ms
Abundance
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari20
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.000
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
Time-->
Ion 71.00 (70.70 to 71.70): 34097AVECO10.D\data.ms
26000
28000
30000
32000
34000
36000
38000
40000
42000
44000
46000
48000
50000
52000
Abundance
Scan 1946 (10.240 min): 34097AVECO10.D\data.ms44.1
57.1
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari21
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 2100
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
22000
24000
26000
m/z-->
72.0
85.1
98.1114.0 207.0
180000
200000
220000
240000
260000
280000
300000
320000
340000
360000
Abundance
TIC: 34097AVECO10.D\data.ms
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari22
10.05 10.10 10.15 10.20 10.25 10.30 10.35 10.40
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
Time-->
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari23
6000000
6500000
7000000
7500000
8000000
8500000
9000000
9500000
1e+07
1.05e+07
1.1e+07
1.15e+07
Abundance
TIC: L_392.D\data.ms
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari24
17.00 17.20 17.40 17.60 17.80 18.00 18.20 18.40 18.60 18.80
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
4500000
5000000
5500000
Time-->
Pentilfurà
300000
350000
400000
450000
500000
550000
600000
Abundance
Scan 4167 (17.263 min): L_392.D\data.ms81.0
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari25
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 2800
50000
100000
150000
200000
250000
300000
m/z-->
138.053.1
109.1207.1 281.0
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
2000000
2200000
2400000
2600000
2800000
3000000
Abundance
TIC: HAM1162.D\data.ms
5.675
6.665
6.968
8.104
11.910
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
2000000
2200000
2400000
2600000
2800000
3000000
Abundance
TIC: HAM1247.D\data.ms
5.674
6.664
6.968
11.916
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari26
6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00
200000
400000
600000
800000
Time-->
4.828
4.9275.675
7.4987.608
9.373
9.5289.899
10.767
14.44815.302
6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00
200000
400000
600000
800000
Time-->
4.829
4.927
7.4987.606
8.046
10.765 15.815
TIC volatile profiles obtained by SPME-GC/MS. Profile from 1g of semimebranosus
and a biceps femoris.
-0,5
0,0
0,5
1,0C
ompo
nent
2
heptanal
2-Heptanone
Hexanal
2-hexanone
pentanal
2 octanone
octanal1-pentanol
2-pentanone
2-methylbutanalnonanal
2-butanone
3-methylbutanal
3-methyl-1-butanol
Ethylacetate
-5
0
5
10
Com
pone
nt 2
BFSM
Muscle
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari27
-1,0
pentanal
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0
Component 1
-10-10 -5 0 5 10
Component 1
Loading plot and Score Plot obtained from volatile components in drycured ham. Component 1 and Component 2 explaining a 33 % and 17 %of total variability.
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
2000000
2200000
2400000
2600000
Time-->
AbundanceTIC: HAM1001.D\data.ms
1 g mostra
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari28
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
2000000
2200000
2400000
2600000
Time-->
AbundanceTIC: HAM1003.D\data.ms
2
3
4
51 6
1 g mostra + metanol
Gràcies per la seva atenció
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari29
24/11/2015Jornada d'Aplicacions Cromatogràfiques en
el Sector Agroalimentari30