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JNOMBRE :

TE LEF ON0 :

MATRICUL A :

CLAVE :

CARRERA :

/AREA DE CONCENTRACIQN:

TRIMESTRE L E C T I V O :

HORAS/ SEMANA

LUGAR E N DONDE SE ---- LLEVARA A CABO :

FECHA DE I N I C I O :

/FECHA DE TERMINACION :

JTUTOR INTERNO: P UES TO

Y A D C R I P C I O N :

F I R M A DEL ALUMNO

SR. L U I S F . S C H E T T I N 0

SCHETT INO YAREZ L U I S F E L I P E

6 8 8 - 8 8 - 6 0 .

8 2 3 4 0 3 8 1

2 3 . l a - . 13.86

B I O L O G I A . i; ,¿, c. 1

L B I O L O G I A EXPERIMENTAL -

\ 86 - P

15

LABORATORIO DE B I O L O G I A MOLECULAR

DEL DEPTO. DE C I E N C I A S DE L A SALUD.

1 DE J U L I O DE 1986.

15 DE ENERO DE 1987 2

RODOLFQ VELASCO LEZAMA . PROFESOR

ASOC IADO "B " DE TE IMPO COMPLETO.

P U R I F I C A C I O N Y CARACTERIZAC ION DE

UN FACTOR MEGACARIOCITOPOYETICO A +-

P A R T I R DE L A O R I N A DE P A C I E N T E S CON

PURPURA TROMBOCITOPENICA I D I O P A T I C A " .

F I R M A DEL T U ?

Q . B . P . RQDOLFQ VELASCO LEZAMA

INTRODUCCIQN .

Las p l a q u e t a s t i e n e n un p a p e l impo r t an t e e n l a h e m o s t a s i s ,

man e l c o á g u l o h e m o s t á t i c o i n i c i a l Y aumentan l a f o rmac i ón de t r ombos

de f i h r i n a más oermanentes . Normalmente l a p a r e d v a s c u l a r s i r v e como

b a r r e r a entre e l f l u j o sangu íneo y e l e s p a c i o e x t r a v a s c u l a r ; cuando - e s t a b a r r e r a e s d e s t r u i d a , l a s p l a q u e t a s s e a d h i e r e n a los componen-

t e s d e l s n b e n d o t e l i o , n o s t e r i o r m e n t e o t r a s p l a q u e t a s s e un i rán a l a s

p r i m e r a s pa ra p r o d u c i r un a g r e g a d o y f i n a l m e n t e e s t a s c o n t r i b u i r á n - a l a c o a g u l a c i ó n p l a s m á t i c a med ian te l a l i b e r a c i ó n de s u s t a n c i a s p r o

coamulantns (1 ) . - E l o r i g e n de l a s p l a q u e t a s s e encuen t r a en l a l í n e a megaca r i o -

c í t i c a , cuyas c é l u l a s Dresen tan un p a t r ó n de p r o l i f e r a c i ó n y madura

c iÓn Ún i c o e n l a b i o l o g í a de mamíferos; Los m e a a c a r i o c i t o s maduran

h a s t a o r i g i n a r f r aamentos c i t o p l a s m á t i c o s que son Ins p r e c u r s o r e s - de p l a q u e t a s (2).

E x i s t e n e v i d e n c i a s e x p e r i m e n t a l e s y c l í n i c a s que s eña lán que

t o d a s l a s c é l u l a s sangu íneas se o r i a i n a n a u a r t i r de un p r e c u r s o r - p l u r i p o t e n c i a l , e l c u a l p o s e e c a v a c i d a d de a u t o r r e p l i c a c i ó n ; a l d i v i

ñ i rse , e s t a c é l u l a p r oduce dos c é l u l a s h i j a s ; una p l u r i p o t e n c i a l pa-

r a p e r p e t u a r l a e s p e c i e , y o t r a l l amada en c o m i t é n comis+onada pa-

r a a r t u a r como n r e r u r - o r p r i m i t i v o d- l a - 1:neas e r i t r o c i t o s : granu

l o c i t o s/macrÓ fagos . E s t a Ú l t ima e t a p a , no ha s i d o demost rada ~ l e n a -

mente pa ra l a l í n e a m e g a c a r i o c í t i c a . S in embargo , l a d i f e r e n c i a c i ó n

de e s t a l í n e a c e l u l a r i n i c i a en e l e s t a d o de m e a a c a r i o b l a s t o ( 4n )

( 3 , 4 ) .

pasando a s e r m e a a c a r i o c i t o s b a s ó f i l o s a l t i e m p o nue q u s i s t e m a de

membranas s- deEarTo l 'a en g ran a s c a l a

Los m e g a c a r i o b l a s t o s comienzan a madurar c i t o o l a s m á t i c a m e n t e ,

Poster iormente se s i n t e t i z a n g r á n u l o s de p o l i s a c á r i d o s ae a l t a

d ens i d ad e l e c t r ó n i c a , a lgunos de l o s c u a l e s cont ienen enzimas l i s o s o

ma les . En e l s i g u i e n t e e s t a d o de maduración o de m e g a c a r i o c i t o g r a -

n u l a r , l o s a r ánu l o s continúan aumentando en c a n t i d a d lo nue i n d i c a

"ue l a s p r o t e í n a s e s p e c í f i c a s de l a s p l a q u e t a s se s i guen s i n t e t i z a n

do; l a s c é l u l a s crecen en volumen, e l c i t o p l a sm a se h a l l a d i v i d i d o

p o r invan inac iones membrananles (DMS, Sistema de demarca2iÓn membra

n a i ) .

A l f i n a l de e s t e e s t a d o de maduración, l o s m e q a c a r i o c i t o s d e s a -

r r o l l a n p royecc iones r í g i d a s cargadas con mic ro tÚbu loq . Aún no e s - c l a r o e l mecanismo p o r e l c u a l se l i b e r a n l o s f rasmentos c i toD la smá

t i c o s Drecur so res de p l a q u n t a s , qiie l l e g a n a l o s nulmones dnnde con

t ransfnrmadoc. Aún f a l t a mucha in fo rmac ión a c e r c a d e l p r o c e s o de li-

b e r a c i ó n de e s t o s seudópodos o de m e q a c a r i o c i t o s a l t o r r e n t e c i r c u l a

t o r i o ( 5 . 6 ) .

-

Avances en e l e s t u d i o de f a c t o r e s humorales r e g u l a d o r e s de megaca-

ri OD o i e s i s.

Se han d i señado s i s t emas de c u l t i v o p a r a c é l u l a s de m6dula 6-

s e a , -ue pe rmi te s conocer l o s r r q ne r im i e n t o s e s p e c í f i c o s de l a s d i -

f e r e n t e s l í n e a s c e l u l a r e s hematopoyét icas . Entre e l l o s , e l medio - cond ic ionado de c é l u l a s murinas o humanas. en cuyo sobrenadante se

encuentran f a c t o r e s e s t i m u l a n t e s de l a h e m a t o po i e s i s . Uno de e s t o s ,

e s e l 1 lamado f a c t o r e s t imu l a n t e de c o l o n i a s de m e g a c a r i o c i t o s (CSF-Mea)

que o r i g i n a e l d e s a r r o l l o de unidades formadoras de c o l o n i a s de mega

c a r i o c i t o s a l s e r a d i c i o n a d o a l o s s i s t emas de c u l t i v o . E L número de

e s t a s c o l o n i a s , se encuent ra r e l a c i o n a d o a l a capac idad e s t im u l an t e

d e l f a c t o r (7,s). I

d -.

También se ha e n c o n t r a d o que en e l s i i ern y I n o r i n a de p a c i e n -

t e s con anemia a p l á s t i c a y o t r o s desó rdenes en l a p r o d u c c i ó n de p l a

q u e t a s , e x i s t e una a c t i v i d a d s eme j an t e a CSF-Meg (8,9,10). Es ta pue

de s e r i n d e p e n d i e n t e de la t r o m b o p o i e t i n a . hormona a l a c u a l s e l e ha

a t r i b u i d o l a r e a u l a c i ó n de l a madurac ión n l a n u e t a r i a . A s í , l a l í n e a

c e l u l a r p u d i e r a e s t a r r e g u l a d a p o r v a r i o s f a c t o r e s , entre e l l o s CSF-Mea

y t r o m b o p o i e t i n a , o b i e n un qÓ1o f a c t o r de v a r i a s un idades , e n e l - c u a l , l a t r o m b o p o i e t i n a y e l CSF-Meg f u e s e n a l gunos de los c o n s t i t u -

ven t e s I 11 i . .-

A c t i v i d a d b i o l Ó g ' 7 c a .

La a c t i v i d a d e s t ; m u l a n t e d e l f a c t o r p r o d u c i d o i n v i vo o e v i t r o

puede e s t u d i a r s e en s i s t e m a s :

- In v i t r o , med iante c u l t i v o s de médula ó s e a con tando e l número

de un idades fo rmadoras de m e g a c a r i o c i t o s (UFC-Meg) d e s a r r o l l a d a s co-

mo r e s p u e s t a a su p r e s e n c i a en e l s i s t e m a de c u l t i v o .

I n v i v o , med ian te e l i n c r emen to en e l número de D l a a u e t a s c i r - -- c u l a n t e s en an ima l e s a los c i i a l e s s e l e s i n v e c t a e l m a t e r i a l de prueba .

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....

Antecedentes d e l grupo de t r a b a j o .

Velasco-Lezama, R. y N a k e f f , A. E s t a b l e c i e r o n l a s cond ic iones

r e q u e r i d a s p o r un c u l t i v o de c é l u l a s de bazo de r a t ó n mantenidas

en un medio l i b r e de s u e r o p a r a l a p roducc ión de iin f a c t o r que e s t i

mula l a mesaca r i opo i e s i s i n v i t r o . Como r e s u l t a d o de d i c ho t r a b a j o ,

s e conoce d e l f a c t o r l o s i g u i e n t e : Organo p r o d u c t o r i n v i t r o en me-

d i o s l i b r e s de s u e r o , e s p e c i f i c i d a d e s t im u l a n t e con r e spe c t o a l a s

d i f e r e n t e s l í n e a s ce i u l a r e s hematoDoiét iCaS, p e s o mo lecu l a r ( s u D e r i o r

a 6 0 , 0 0 0 d a l t o n s ) y su m o v i l i d a d e l e c t r o f o r ~ t i c a ( l 3 \ .

E l medio de c u l t i v o en e l c u a l se e nc u e n t r a e l f a c t o r e s t imu l an

t e f u e a n a l i z a d o p o r c romatonra f í a de l í q u i d o s a a l t a p r e s i ó n ( H P L C ) .

Este método fue incapaz de p r e s e r v a r l a a c t i v i d a d b i o l ó s i c a d e l mate-

r i a l sometido a d inho t r a t a m i e n t o , b i e n s e a en su forma i n t e g r a l o en

cada una de l a s f r a c c i o n e s obten idas ; también mediante HPLC se encon-

t r áque un f a c t o r aná l o go p r o ve n i e n t e de l a o r i n a de un i n d i v i d u o con

púrpura t romboc i topén ica i d e o p á t i c a , ~ r e s e n t a una señal g r á f i c a seme-

j a n t e a l a dada p o r e l f a c t o r p r o du c i do i n v i t r o mani festándose en

dos subunidades ( g r á f i c a 1).

I , ~ .... . ,.. . , ,. ,

Justificación ~

En forma paralela a l presente trabajo, se desarrollan en nuestro

laboratorio, l a caracterización de otros factores que influyen en l a

megacariopoyesis -- in vivo e -I_ in vitro. Hasta e l momento, e l mejor dilu-

cidado es e l obtenido en los medios de cultivo de bazo de ratón.

Nuestro interés principal es e l saber si en l a orina de pacien-

tes con enfermedades mieloprolifezativas o desórdenes en l a coagula-

ción, existe un factor análogo a l estudiado; e l cual pudiera ser pu-

rificado y administrado en un futuro lejano, a aquellos pacientes que

no pudiesen producirlo o que l o produjesen con alteraciones en su act i

vidad. Siendo necesario administrar Únicamente las fracciones respon-

sables de l a actividad biológica, para evitar reacciones inmunológi-

cas indeseables.

..<

o b j e t i v o s .

P u r i f i c a r v c a r a c t e r i z a r un f a c t o r m e g a c a r i o o o i é t i c o e x i s t e n t e

I . en l a , , o r i n a de p a c i e n t e s con Púrpura Trombocitopénica I d e o p á t i c a .

~. . I d e o p d t i c a , a p l i c a d o a medios de c u l t i v o de c é l u l a s de médula ó s e a .

M a t e r i a l Y métodos.

Mate r i a 1 b i o l ó g i c o :

Reco l ecc ión de muestras prob lema y c o n t r o l . Las

prob lema provendrán de c i n c o mujeres de 30 a 40 anos de edad con púr

p u r a t romboc i topén ica i d e o p á t i c a , oue no hayan s i d o t r a t a d a s con fár

macos d e l t i p o de los e s t e r o i d e s ; e l g r u po c o n t r o l s e r á n , c i n c o muie- i . r e s sanas e n t r e los 3 0 y l o s 4 0 años de e da d . a l e j a d a s d e l p e r í o d o - menst rua l ambos g rupos ; l o s parámetros de no rma l idad se e s t a b l e c e r á n

p o r un examen g e n e r a l de o r i n a y una cruímica sangu ínea .

P u r i f i c a c i ó n y c a r a c t e r i z a c i ó n d e l f a c t o r e s t im u l a n t e de l a megaca-

r i o p o i e s i s .

1- C u a n t i f i c a c i ó n de p r o t e í n a s t o t a l e s en l a o r i n a p o r e l método d e l

á c i d o s u l f o s a l i c í l i c o (anexo 1).

2 - P u r i f i c a c i ó n de muestras .

- D i á l i s i s v s . agua d e s i o n i z a d a (anexo 11).

-concentrac ión por f i i t r a c i ó n m o l e c u l a r (anexo 111).

- Separac ión pon c romatoqra f í aen Sephadex G-25 (anexo 111).

3- Fracc ionamiento y c a r a c t e r i z a c i ó n .

- Cromatonraf ía en columna DEAE S e f a r o s a (anexo iv).

- Cromatog ra f í a en columna CM S e f a r o s a ( C a r b o x i m e t i l ) ( anexo V).

- Cromatog ra f r a en Sephadex G-100 ( anexo Vi).

4- Determinación de l a a c t i v i d a d b i o l ó g i c a .

- In v i t r o (anexo VII). -- Por c u l t i v o s de médula ósea c u a n t i f i c a ndn e l número de irniaades

formadoras de c o l o n i a s de m e g a c a r i o c i t o s (UFC-MQCI) , d e s a r r o l l a d a s co

,

.. .,,

mo r e s p u e s t a .a l a a c t i v i d a d e s t im u l a n t e de l a s muestras ; a n t e s y

despues d e l f r acc ionamiento . Pos te r i o rmente s e de te rmina rá l a DO-

s i b l e r e l a c i ó n e x i s t e n t e e n t r e e l f a c t o r o f a c t o r e s ob ten idos de

e s t a fuente v e l o b t en i do d e l medio cond ic ionado de b a zo de r a t ón

cuva c a r a c t e r i z a c i ó n se d e s a r r o l l a r á en forma p a r a l e l a a l p r e s e n t e

t n a b a i o.

- In v i v o (anexo V I I I ) . -- Inyecc ión d e l m a t e r i a l crudo a r a t o n e s , a s í como l a s f r a c c i o n e s

p r o t e í n i c a s de1 mismo, c u a n t i f i c a n d o e l número de p l a q u e t a s en sangre

c i r c u l a n t e , an t e s y después de l a a p l i c a c i ó n . A l l o t e c o n t r o l se l e

a n l i c a r á s o l u c i ó n s a l i n a f i s i o l ó g i c a .

5 - Determinación de a lgunas p r o p i e da de s f i s i c o a u í m i c a s .

A launas de l a s DroDiedades f i s i c o q u í m i c a s t a l e s como e l Deso mo-

l e c u l a r y e l nGmero de componentes y l a m o v i l i d a d e l e c t r o f o d t i c a ,

se rán determinadas Dor c r o m a t o g r a f í a y e l e c t r o f o r e s i s , comparándolas

c o n t r a marcadores de p e s o m o l e c u l a r conoc ido (anexo 1x1.

B i b l i o g r a f í a .

1- Ba rnha r t , M . I .

p l a t e l e t r e sponse s i n h e a l t h and d i s e a s e .

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Thrombopoiesis

Haemostasis & Thrombosis

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Fu s i on - f i s i on r e o r g a n i z a t i o n o f membrane : a d e v e l o p i n g membrane

model f o r thrombocytogenes is i n megakaryocytes .

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Thrombopo i es i s and megaka r yo cy t e c o l o n y s t i m u l a t i n g f a c t o r i n t h e

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G r á f i c a 1.

Orina de Pac i en t e s con PGrpura T.rombocitopénica Ideopá-

M E D I O CONDICIONADO DE

BAZO 1X EN d- MOPS .

M R r l T O <-MOPS.

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CUANTIFICACION DE PROTEINAS EN ORINA

METODO DEL ACID0 SULFOSALICPLICO

CURVA TIPO :

Preparar una solución patrón de albGmina sérica bovina

de 1 mg/ml y preparar l a siguiente ser ie de tubos.

mg de proteína/ 1 0 0 ml de orina 1 0 20 30 40 50 60 70 80 9 0 100

~oin.patr6n de proteína( ml 0.1 0.2 0.3 0 . 4 0.5 0.6 0 . 7 0 . 8 0 . 9 1 . 0

agua destilada(m1)

Ac.SulfOSaliCfliC0 ( m i 1 5 .0 a todos los tubos

Dejar rposar los tubos a temperaura ambiente durante 5 minutos para permitir l a reacci6n y leer a Densidad Optica de 420 nm.

Dar e l siguiente tratamiento para los tubos blanco y problema

Cuadro 1 Problema Blanco I Blanco I1

1.0 m l -----. Orfna ( di1 1:20 ) 1 . 0 ml

Soluci6n de NaCl 0 .85% - -3 5 . 0 m l 1 . 0 m l

Soluci6n de Ac. Sulfo-

sa l i c í l i co 3% 5.0 m l --- 5 .0 m l

Todas l as determinaciones se hacen por duplicado. Contrir una

gráf ica con los valores obtenidos e interpolar e l valor de D.O.

del problema para determinar l a concentracidn protéica del --- mismo.

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Reportar l a concentration de proteína por 100 m l de orfna.

Bibl iograf ía :

Lynch, J., Raphael,S,S., Mellor,L,D., Spare,P,D., e Inwood,

M,J,H. Métodos de Laboratorio. Segunda Edicibn. Ed.Interamerkca - na. México,1972.

Anexo I1

P r e p a r a c i ó n de membranas de d i á l i s i s .

1. C o r t a r un t r o z o de membrana d e d i á l i s i s y c o l o c a r l a en

un v a s o de p r e c i p i t a d o s d e 4 It c o n t e n i e n d o s o l u c i ó n de

EDTA 0 .5 M.

2 . Hervir d u r a n t s r e i n t a m inutos .

3. Decan ta r l a s o l u c i ó n y r e p e t i r e s te p r o c e d i m i e n t o ocho

v e c e s más empleando agua d e s t i l a d a en s u t i t u c i ó n d e l EDTA.

4 . Después de e s t e t r a t a m i e n t o e l t u b o d e b e r á mane ja r se con

guan t e sde s e chab l e s o m a t e r i a l l i b r e de n u c l e a s a s y p r o t e -

a sa s y nunca con l a s manos d e s c u b i e r t a s .

5.Con un t r o z o de h i l o , c e r r a r uno d e l o s e x t r emos de l a b o l -

sa d e d i á l i s i s .

6 . A d i c i o n a r agua y p r e s i o n a r h a c i a a b a j o l a b o l s a c o n t r a e l

ex t r emo s e l l a d o u t i l i z a n d o los dedos med ios con e l propó-

- s i t o de d e t e c t a r p i c a d u r a s en l a b o l s a .

7 . De no e x i s t i r f u g a s , l l e n a r 1 a . b o l s a con e l m a t e r i a l pa-

r a ser d i a l i z a d o y cerrar e l o t r o e x t r e m o con h i l o .

8. C o l o c a r l a b o l s a en un v a s o d e p r e c i p i t a d o s de c u a t r o It

con t en i endo e l amor t i guado r s e l e c c i o n a d o pa ra l a d i á l i s i s .

9. C o l o c a r una b a r r a de a g i t a c i ó n m a g n é t i c a y l l e v a r a l cuar

t o f r í o y mantener en a g i t a c i ó n c o n s t a n t e .

10. Hacer v a r i o s camb ios de s o l u c i ó n amor t i guado ra .

11. Al t é r m i n o , e x t r a e r e l c o n t e n i d o d e l a b o l s a med i an t e su

punción con una j e r i n g a y a g u j a d e l número 20.

1 2 . C o l o c a r e l m a t e r i a l a n a l i z a d o en un r e c i p i e n t e y f i l t r a r

en c o n d i c i o n e s de e s t e r i l i d a d , con membrana m i l l i p o r e de

0.22 mic ra s .


Coope r , G.T .

The t o o l s o f B i o c h e m i s t r y , pag . 378.

John W i l e y and Sons. 1 9 7 7 .

Anexo 111

P r o c e d i m i e n t o

t r a c i ó n .

1 . S e l e c c i o n a r

y l a v a r con

2 . C o l o c a r en

pa ra l a c o n c e n t r a c i ó n m o l e c u l a r p o r u l t r a f i l -

l a membrana o e l c a r tucho que s e v a a u t i l i z a r

500 m l d e agua d e s t i l a d a .

e l v a s o d e l c o n c e n t r a d o r e l m a t e r i a l que v a a

ser c oncen t r ado .

3 . A p l i c a r una p r e s i ó n d e 0.8 kg/cm2regu lando e l f l u j o , d e l 11

q u i d o con e l manómetro a d j u n t o .

4 .Recoge r e l m a t e r i a 1 , r e t e n i d o en e l r e c i p i e n t e y f i l t r a r

5 .Separa r a l f c u o t a s p a r a c u a n t i f i c a c i e n d e p r o t e í n a s y o t r a s

con membrana m i l l i p o r e de 0.22 m i c r a s .

d e t e r m i n a c i o n e s b i o q u f m i c a s .

6 .Separa r a l l c u o t a s p a r a e l c o n t r o l d e e s t e r i l i d a d e i n cuba r

a 37 g rados c e n t í g r a d o s en amb i en t e húmedo d u r a n t e 36 Hrs.

7.Hacer p ruebas d e a c t i v i d a d b i o l ó g i c a d e l m a t e r i a l c o n c e n t r a

do.

8 . A l f i n a l i z a r l a c o n c e n t r a c i ó n , l a v a r l a membrana o e l c a r -

tucho con 1000 m l d e agua d e s t i l a d a .

9 .Co l o ca r en NaOH 1% y mantener en r e f r i g e r a c i ó n h a s t a nueva

u t i l i z a c i ó n .


Manual de p r o c e d i m i e n t o y man t en im i en t o d e c a r t u c h o s s epara -

d o r e s p o r i n m e r s i ó n , M i l l i p o r e C o r p o r a t i o n . USA . 11175.

Manual de p r o c e d i m i e n t o s p a r a c o n c e n t r a d o r de c a r t u c h o d e

b r a hueca. Amicon C o r p o r a t i o n . USA . 1985.

f i -

.." Anexo VT

P r o t o c a l o pa ra f i l t r a d o m o l e c u l a r med i an t e Sephadex 6-100 I

1. C a l c u l a r e l volumen v a c í o de l a columna según l a f ó rmu la ;

...

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...,. . ..

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V= r2h

2 . C a l c u l a r los gramos d e sephadex q u e s e n e c e s i t a n h i n c h a r

de acuerdo a l a dens idad d e l mismo:

peso- ( d ens i dad ) ( vo lumen de l a columna)

3. H inchar e l sephadex usando como d i s o l v e n t e s o l u c i ó n s a l i

na -bara tos (SSB) con un pH= 8.2 y h a c e r cambios cons tan

te6 de é s t e h a s t a e l i m i n a r l a s p a r t l c u l a s en suspens i ón .

4. Empacar l a columna, t e n i e n d o cu i dado de no i n t r o d u c i r - burbu jas en é s t a y pa sa r e l e q u i v a l e n t e a t res v e c e s e l

volumen de l a columna, d e S S B a f i n d e e q u i l i b r a r la co -

lumna.

5 . De te rminar e l volumen va cxo usando a z u l d e x t r á n .

6. Correr p o r s epa rado los s i g u i e n t e s marcadores :

A l c o h o l Desh id rogenaca : 150 , O00 D

Albúmina S é r i c a Bov ina : 66,000 D

Anh id rasa CarbÓnica : 29 , O00 D

C i t oc romo C : 1 2 , O00 D

6 , O00 D In su1 i n a

7 . A p l i c a r l a muestra prob lema en l a columna y c o l e c t a r l a s

f r a c c i o n e s en volúmenes d e 3 m l ( a j u s t a r l a bomba p e r i c -

t á l t i c a a 20 m l/hr . ) .

8. De t e rminar l a a b s o t b a n c i a de l a s f r a c c i o n e s a 280 nm.


F i s c h e r , L. GEL FILTRATION CHROMATOGRAPHY.

E l s e v i e r e No r th H o l l a n d . B i o m e d i c a l Press.

81, 1980.

Separac ión y C u a n t i f i c a c i ó n de p l a q u e t a s de Ratón.

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1 . C o l o c a r uq r a t ó n macho, de 8 a 12 semanas de edad , b a j o l a

i l um inac i ón de una lámpara , durante aproximadamente 10 m i -

nu to s . E v i t a r l l e v a r a l animal a l a p o s t r a c i ó n po r c a l e n t a

miento i n t e n s o o p ro longado .

2 . Co l o ca r a l r a t ón en un s o po r t e con un extremo a b i e r t o p o r

donde s e l e pueda detener l a c o l a .

3 .Co r t a r l a punta de l a c o l a con un b i s t u r í y e l imina ; l a - pr imera g o t a de s ang r e .

4 . U t i l i z a n d o una p i p e t a p a r a g l ó b u l o s b l a n c o s ( 1 : 2 0 ) y un t u

bo de succ i ón , l l e n e cuidadosamente l a p i p e t a h a s t a l a mar

c a 0 . 5 . Tan r á p i d o como sea p o s i b l e p a r a imped i r l a coagu-

l a c i ó n de l a s ang r e , ordeñe l a c o l a p a r a o b t e ne r mayor can

t i d a d de s ang r e . Si l a s a ng r e p a s a l a marca de 0 . 5 , l i m p i e

l a punta con un papel1 a b so r be n t e y a j u s t e e l n i v e l de l a

s ang r e .

5.Inmediaca-mente después co loque l a p i p e t a en una s o l u c i ó n

amort iguadora de c i t r a t o d e x t r o s a f o s f a t o l amort iguador de

s a l i n a f o s f a t o s , y l l e n e con e l f l u i d o h a s t a l l e g a r a l a

marca de 1 1. ( d i l . 1 : 2 0 ) .

6Desacoplar e l tubo de succ ión y c o l o c a r l a p i p e t a en un a g i

tador de p i p e t a s Cav i t r o n , a g i t a r du r a n t e 3 0 segundos .

7 T r a n s f e r i r e l mezclado ( l a s a ng r e d i l u í d a ) a un r e c i p i e n t e

de p l á s t i c o marcado apropiadamente .

8 .Coloque l a p i p e t a en s o l u c i ó n d e t e r g e n t e p a r a s u l a v a do pos

t e r i o r .

9 . A g i t a r po r i n v e r s i ó n l a muestra d i l u í d a 1 : 2 0 y l l e n a r un

tubo c a p i l a r h a s t a l a marca de 1 0 0 m i c r o l i t r o s .

10 .L impiar e l exceso de s a ng r e en e l t u b o . C o l o c a r e l mismo ex-

tremo d e l c a p i l a r en s o l u c i á n de s i l i c ó n l í q u i d o y tomar una

pequeña p o r c i ó n d e l s i l i c ó n t e n i e ndo cu idado de no pe r de r - s ang r e .

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11. R e t i r a r e l t ubo y l i m p i a r e l excesO de s i l i c ó n , con e l t u

bo en una p o s i c i ó n h o r i z o n t a l , c o l o q u e e l dedo p u l g a r s o b r e e l extremo opuesto a l de l a s a ng r e , asegurándose de - no formar b u r b u j a s .

1 2 . A cop l a r p o r e l extremo, con s i l i c ó n , en una b a r r a de p l a s

t i l i n a p a r a s e l l a r l o .

13. Co l o aa r l o s t ubo s en una c e n t r í f u g a de microhematocr i to

y c e n t r i f u g a r durante 45 segundos en l a v e l o c i d a d ú n i c a

d e l a pa r a t o .

1 5 . R e t i r a r l o s t ubo s c a p i l a r e s de l a c e n t r í f u g a y con una 4

s i e r r a c o r t a r l a zona i n f e r i o r a l p lasma r i c o en p l a q u e t a s .

16.Romper e l tubo y t r a n s f e r i r e l conten ido a un v i a l de p l á s

t i c o que contenga 1 0 m l de PBS ( e l PBS d e b e r á s e r f i l t r a -

do prev iamente p a r a e v i t a r e l paso de b u r b u j a s ) c u b r i r e l

v i a l y a g i t a r durante 1 0 segundos en un a g i t a d o r v o r t e x

p a r a resus -pender e l b o t ó n p l a q u e t a r i o .

17 .Ca r g a r l a cámara cuen t a - g l ó bu l o s y d e j a r en r e po so en atmÓs

f e r a húmeda du r an t e 1 0 minutos .

18 . Contar a l m i c r o s cop i o con o b j e t i v o de 40X, e l número de - p l a q u e t a s p r e s e n t e s en l a zona c e n t r a l d e l a c u a d r í c u l a

(zona de g l ó b u l o s r o j o s ) .


Manual de t é c n i c a s de l a b o r a t o r i o s d e l Dr. A l e xa nde r

N a k e f f .

Cancer B i o l o g y S e c t i o n . School o f Me d i c i ne .

Wáshington U n i v e r x i t y i n S t . L o u i s M i s s o u r i . USA.

Lynch, J . M . , Raphae l , S.S., M e l l o r , D . L . , S p a r e , D.P.? Inwood, J.H.M. 1972 2 a . E d i c i ó n .

Métodos de L a b o r a t o r i o .

Nueva e d i t o r i a l i n t e r a m e r i c a na S.A. deC.V. pp.708-710.

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CULTIVO DE MEDULA OCEA DE FLATON PARA LA OBTENCION DE UNIDADES

FORMADORAS DE COLONIAS DE MEGACARIOCITOS. CFU-M.

Mate r i a l . y Equipo ::

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Soporte de madera de 25x25 cm. Tachuelas. Mechero de Bunsen. 2 pinzas estériles. 2 t i jeras estériles- B i s tu r í . Paño estéril . Agujas 22x32‘‘ . 2 j e r i n gas de 1 m l y 5 m l . 2 tubos de c en t r f f u ga ( 15 mi.). P ipe tas Pasteur s i l i c on i z adas . Hemocit6metro. Cajas de P e t r i ( 50 mm. de diametro Cajas de P e t r i ( 95 mm. de diametro P ipetas de 0 .1 ml. P ipe tas de 0.5 m l . P i pe tas de 1.0 m l . P i pe tas de 5.0 m l . P lacas de cu l t i v o - ~mu l t i pa zo s

Soluciones y Reac t i vos :

Etanol; a l 96% Medio A l f a - 2

Medio de L e i t v o t i z Suero de Caba l l o Medio Condicionado Extracto de Embridn de Bovino Agar Noble Difco a l 3%

I

Procedimiento :

1.- Sacr i f icar por dislocación cervical un ratdn macho de 8 a 12

2.- Bañar l a regidn del fémur con solxi& de etanol a l 96%. 3.- Bajo l a llama del mechero y utilizando pinzas y t i j e r a s ---

semanas de edad.

e s t é r i l e s ; separar l a s extremidades infer iores del animal.

PROCEDIMIENTO EN CAMPANA DE FLUJO LAMINAR

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4. - Eliminar e l músculo que recubre a l fémur. 5.- Limpiar e l fémur con un paño e s t e r i l y hacer un corte trans-

6.- Pasar una aguja e s t é r i l del n(unero 22x32" a través del canal

7.- Inyectar a través del conducto medular 1.0 m l de medio - 2 .

8.- Recoger l a suspensión medular en un tubo de centrífuga -Nal- gene- de 15 m l esteri l izado previamente.

9 . - Dispersar l a s células mediante pipeteo cuidadoso con una p i -

peta Pasteur siliconizada. 10.- Contar las células nucieadas t o t a l e s e n una cámara cuenta912 -

bulos y a justar l a concnetración celular a 4 . 0 x 1 0 6 células por m i l i l i t r o y colocarlas en un tubo de ensayo conteniendo- los siguentes materiales, los cuales deberán colocarse en e l orden en e l que se enlistan:

versal en l a zona del cuello quirügico.

medular haciendo movimientos hacia adelante y hacia atrás.

Componentes del Medio de Cultivo para CFU-M Volumen

._

Medio teibovitz (L-15) 1.2 m l Suero de Caballo 0 . 6 m l Extracto de anbri6n de Bovino ( d i 1 1 : 4 en L-15) 0 .3 m l

*Medio Condicionado 0 . 3 m l Cuspenci6n celular 2 . Ox106 células/ m l 0 . 3 m l Agar Noble Difco 1% - 3 1 0 C - 0 . 3 m l

11.- Una vez depositado e l agar. Colocar 0 . 5 m l del medio con las células en los pozos de l a s placas de cult ivo dispuestos en e l inter ior de una c a j a de petri e s t é r i l . Homogeneizar e l cult ivo

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moviendo la caja de petri en forma circular.

humedad relativa de 90 a 100% y atm6sfera de C02 de 4 a 10%. 12.- Incubar los cultivos durante siete días a 37OC, con

COSECHA DE CULTIVOS CON UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS DE MEGACARIOCITOS.

13.- Revisar los cultivos ai invertoscopio. Desechar los cultivos que presenten contaminacidn microbiana.

14.- Introducir por los bordes del cultivo-(gel)- una espátula metálica de punta roma para separarlo de la placa de cultivo.

15.- Colocar los coágulos en un portaobjetos y teñir los cultivos mediante la técnica de Jackson et al.

BIBLIOGRAFIA

Metcalf,D., McDonald,H.R.,Odartchenco,N. and Sordat, B.1975. Growth of Mouse Megakaryocyte Colonies in Vitro Proc.Nat.Acad.Sci.USA.Vo1. 72, No.5, pp.1744-1748. Nakeff,N.A. and Daniels-McQueen,S. 1976. In Vitro Colony Assay for a New Class of Megakaryocyte Pre- cursor; Colony Unit Forming (CFU-M). Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 151, pp.587-590.

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PROTOCOLO PARA LA ELECTROFORESIS DE DISCO CON GELES DE ALMIDON - ACRILAMIDA .

I . - SOLUCIONES

Soluci6n A HC1 1N 48 ml Tris 36.6 g

Temed 0 .23 m l

Se disuelve ajusta e l pH a 8 . 9 y se afora a 100 m l con agua( f i l t r a r en

caso de ser necesario ) . e l t r i s en un poso de agua y se agrega"e1 HC1, se

-

.- Solución B

Acrilamida 28 g ( recristalizada )

Bis acrilamida 0 . 7 5 C recristalizada

Soluci6n C

Almidbn soluble 0 . 8 g

Se disuelve e l almiddn en 100 n l de agua; se calienta y se deja - hervir durante un minuto.

Soluci6n D

Persulfato de anonio 0 . 1 4 g

Se disuelve en un poco de agua y después se afora a 100 ml . Este reactivo debe prepararse antes de preparar los geles.

Solvente para l a nuestra

Se disuelvan 4 g de sacarosa en 10 m l de solución de aztil de - bromofeno a l 0 . 0 1 % .

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Amortiguador para Los electrodos

Tris 6 g Glicina 2 8 . 8 g

.

Se disuelven ambos reactivos en 250 m l de agua y se ajusta e l

pH a 8.3; se diluye a 11 con agua. Esta solución se encuentra

10 veces más concentrada por lo que deberá di luirse 1 : 10 -- antes de usarse.

solución para teñir

Az6l de Coomassie 0 .25 g

Metano1 50 m l Acido acético g lac ia l 10 mi

...

Soiucibn para desteñir

piletano1 50 ml Acido acétibo 10 m l Se mezclan y se afora l a colucibn a 100 m l con agua destilada.

11. - PROCEDIMIENTO

Corrida de l a electroforesis

1.- 52 lavan los tubos para los geles con "O3 a l 50% o con ne2 I -

2.- Se enjuagan con agua destilada por 5 veces.

3.- Se Mvan los tubos nuevamente con una soluci6n de SDS a l 2% y se dejan secar a 1 0 0 a C ( No enjuagar )

cla crdmica.

4. - En un matrdz Kitasato de 125 m l mezclas l as siguientes soluclo ne5 para obtener 36 m l de ge l de acrilamida a l 7 % . CülWdi6n A 6 m l

So"&iiCibn B 9 m l Sailfcibn C 6 m l

AgM destilada 3 ml

se tapa e l matraz y se desgasifica l a mezcla para eliminar

e l 02.

5. - Desconectar e i matraz1 del vacio y añadir 12 m l de Solu- cion Di mezclar bien, evitando que se l lene de aire la - soluci6n.

6.- Se tapa un extremo del tubo con para f i lm y se colocan, I d i a

en una gradilla donde puedan quedar en poskcibn vertical. A continuación y con una pipeta Pasteur con punta larga,

proceder a llenarlos lentamente; evitando que se formen, Burbujas, dejando un espacio de aproximadamente un centf - metro antes del f i n a l del tubo. con una jeringa‘añadir -

st, de 4sta manera se obtendrá una superficie plana a i -- polimerizar e l gel.

agua lentamente sobre e l ge l evitando que se mezclen entre d

1

E

7 . - Llenar l a cdmara inferior del equipo de electroforesis para tubo con e l amortiguador para los electrodos dilufdo 1 : 10.

8.- Colocar los tubos en los compartimientos de l a parte superior I 6 .

de l a cdmara. E l im inar e l para f i lm de l a parte inferior de - los tubos. Hay que humedecer l a superficie inferior con e l objeto de evitar que se formen burbujas a l introducirlos en e l amortiguador de l a cdmara. Con un papel absorbente elimi -

3 nar e l agua de l a parte superior de los geles. P

r: I 9.- Llenar l a &rara superior del equipo de electroforesis son

e l amortiguador de corrida; cuidando’ de eliminar cualquier i Y

burbuja que hubiese quedado tanto en l a parte superior como en l a inferior de los tubos.

10.- Preparar l a muestra en un tubo Eppendorf. Se coloca una parte de la muestra por dos partes del solvente para muestra

11.- Con una jeringa añadir lentamente, por las paredes y sin -- tocar e l gel, l a muestra evitando que e l volumen sea mayor - de 150 ul.

12.- Conectar adecuadamente las terminales eléctricas del aparato de electroforesis( generalmente e l cable rojo es positivo y el negro e l negativo ) a l a fuente de poder.

,. 13. - Prender l a fuente de poder, teniendo cuidado de que se encuen-

14. - E l f ina l de l a corrida será cuando e l frente del colorante haya llegado a un centímetro del extremo’inferior del tubo. Apagar -

tre en cero. Para a l corrida se usan 5 mAmp por tubo. c

I .. t l a fuente de poder. i

.̂ 9

BIBLIOGRAFIA

Manual de Prácticas del Primer Curso de Técnicas Básicas , Facultad de Qufrnica , Divisidn de Estudios de Posgrado. Universidad Nacional Autdnoma de México.

. 1984.

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PROCEDIMIENTO PARA LA TINCION DE UNIDADES FOIWADORAS DE COLO- NIAS DE MEGACARIOCITOS -CFU-M- MEDIANTE LA REACCION HISTOQUIMI- CA DE ACETIL-TIOCOLIN-ESTERACA.

Tincidn Colinesterasa

Material y equipo:

Espátula de punta roma portaobjetos tiras de papel filtro pipetas Pasteur vasos de coplin embudo soporte universal con anillo puente de tincion cubreobjetos

Microscopio 6ptico baño con agitacidn reloj de intervalo

Soluciones y Reactivos

Agar-Difco al 3% Amortiguador de fosfatos 0.1 M pH 5.8-6.2 Gluteraldehido 2 .5% amortiguador . de fosfatos 0.1 14 Solucidn para coloración por ance Metanol absoluto Metanol 50% Hematoxilina de Erlich

Procedimiento

1.- Las muestras de médula 6sea cultivadas para el desarrollo de CFU-M son cosechadas con una espátula metálica de punta roma y los codgulos son transferidos a un portaobjetos.

amortiguador de fosfatos de pH 5 . 8 - 6 .2 .

dor de fosfattw 0.1M sobre cada uno de los coágulos. Dejar en reposo durante 10 minutos a temperatura ambiente.

4.- Recirar el pagel Ziltro y pasar la laminilla a un vaso de Cogiin @on amortiguador de fosfatos O.lM, agitar durante 1 minuto.

2.- Colocar sobre los codgulos un papel filtro humedecido con

3.- DepQsitar tres gotas de glutaraldehido al 2 . 5 % en amortigua-

5.- Escurrir l a l a m i n i l l a y pasa r l a a un vaso de Copl in con l a solución de c o l o r a c i 6n , l a cua l deberá e s t a r en un baño de

temperatura constante a 37'C. De ja r l a preparacidn en e s t a solución 60 minutos a 37OC o 3 horas a temperatura ambiente.

de f o s f a t o s 0.1M durante 1 minuto. Escurrir y p e rm i t i r que l a l a m i n i l l a - preparación - seque a temperatura ambiente 2-3 horas-; antes de p rosegu i r con e l siguiente paso d e l procedimiento.

6.- Escurrir l a l a m i n i l l a y enjuagar con solucidn amortiguadora

7.- Sumergir l a l a m i n i l l a en metano1 abso luto durante'10 minutos. 8.- Pasar a una so luc i ón de metano1 a l 50% durante 30 segundos. 9.- Escurrir y colocar l a preparación en so luc ión de Hematoxi-

l i n a de E r l i c h durante 5 minutos. F i l t r a r l a solucidn de Hematoxi l ina antes de r e g r e s a r l a a l f r a s c o de almacenaje.

Fos fa to ag i tando l a solucidn durante 1 minuto.

rante 2 minutos.

10.- Lavar l a preparacidn por inmersidn en solucidn C i t ra to -

11.-Colocar l a preparación b a j o e l f lu jo de agua corriente du-

12.-Escurrir y d e j a r s eca r l a preparación. 13.-Colocar un cubreobje tos y se l lar con esmalte de uñas i n c o l o r o

y transparente.

presentes en l a preparación. 14.-Observar a l microscopio de l u z y con ta r e l número de CFU-M

COMPONENTES DE LA SOLUCION TINTORIAL DE ACTILTIOCOLIN-ESTERASA

Yoduro de a c e t i l t i o c o l i n a 20.0 mg Emortiguador de f o s f a t o s 0.1 M,pH 5.8 - 6.2 30.0 m l C i t ra to de s o d i o O.2M 2.0 m l

Su l f a t o de cobre 0.03 M 4.0 m l F e r r i c i anuro de p o t a s i o 0.0135 M 4.0 m l

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SOLUCION AMORTIGUADORA CITRATO-FOSFATO PARA LAVADO

Citrato de sodio 1 . 0 M

Fosfato de sodio dibásico 0 . 5 M

Agua bidestilada (aforar)

31.2 m l

161.0 m l q.b.p. 3.5 It

B IBLIOGRAFIA:

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1-.

o

Jackgon.C.W.1973.

Cholinesterase as a possible marker f o r ear ly ce l l s of the

megakaryocytic series.

Blood. 42:413-421.

Long.W.M., and Williams.N.1981.

Relationship of Small Acetychoiinesterase Positive Cel ls to

Megakaryocytes and CLonable Meg&karycytic Progenitor Cel ls .

Megakaryocyte Biology and Precursors : In Vitro Cloning and

Cel lular Properties. Eds. Evatt. L.B. , Levine,F.R. and Williams

T.N. Elsevier/ North - Holland. pp. 293 - 298 .

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Nomhre de l Alumno. h i s Felipe Schettino Y a e s

Teléfono. 688-8860

Csrera. Biología. Biologfa Brperimental

Lugar de RealiwciÓn. hboratorio de Biología Molecular de l Depto. de

Ciencias de l a Salud. D.C.B.S. UAM- Ietapalapa.

tar. Q.B.P. Rcdolfo Velasco Lap;aaia. Profesor Asociado "E" de Tiempo Completo. Depsrtamento de Ciancias de l a Salud.

Título de l Proyecto. FurifLcación y Caracterización de un Factor Mega- cariocitopoyético a partir de ia orina de Pacien-

tes con &pura wombocitopénica Idiopática. I f I

I ~i-0:' L i s F. Sctiettino Y, Tutor. Q.B.P. Rcdolfo Velasco

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PURIFICACION Y CARACTERIZACION

DE UN FACTOR MEGACARIDCITOPOYETICQ

A FARTIR DE LA ORINA DE PACIENTES CON

PURPURA TROMBOCITOPENICA IDIOPATICA

. .

INDICE

CAPITULO 1

1ntr.oduccidn

CAPITULO 2

CAPITULO 3

CAPITULO 4

CAPITULO 5

CAPITULO 6

CAPITULO 7

CAPITULO 8

CAPITULO 9

CAPIT~LO 10

CAPITULO 1 1

CAPITULO 12

Antecedentes

Justif icacian

Hipotesis de Trabajo

Objetivo

Material y Metodos

Diseho Experimental

Resultados

Discus1 on de Resultados

Conclusiones

Resumen

Eibliografia

6

7

8

9

10

1 1

23

30

34

35

36

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d ) I n c r a m e n t o en el vr i?umen p l a y u e t a r i o . I .

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PURIFICACION Y CAHACTERIZñCION

DE UN FACTOR MEGACAHIOCITOPOYETICO

A PFIRTIR DE LFI ORINA DE PACIENTES CON

PURPURA TROMBOCIYOPENICA IDIOPATICA

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ODJET I VU

PURIFICAR Y CARACTERIZAR PARCIALMENTE UN FACTOR

M~GACARIOFOYETICO EXISTENTE EN LA ORINA DE

PACIENTES CON TROMBOCITOPENIA AUTOINMUNE.

I'IATEK'IFIIL Y METODOS

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O ISEN0 EXPER I MENTAL

-- I N vim. ---_ A c t i vi dad trombcipoi et i c a medi i d a c:c:ino u n i nirremrri'cu en

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CURNTIFICACION DE PROTEINAS EN OHII'JFi POR EL. METOCil DEL &lCISiC CULF0CFiLI:::LICO.

Cui,-va T i pa:

D e j a r r.iposar- los .tubos a t empa ra tu ra a m b i &:vire .durante 5 i n i n u ~ t : . c i i í p a r a p e r m i t i r l a re' ~ C ~ - ~ . J ~ I y ;---,*- a Dens idad Opt.ica de 4Li3 rm.,

Dar el s i g i i i i n t e , . -atamiento p a r a los t u S o s h l a a c a y p r c b l e - rl! a :

PROBLEMA EJLFtl\lCO 1 BLRNCO 2

_. - _. Orina í1:20) 'i ,, !I:# rn:. 'i . C! 31 I.

- icdae lac, d s t e r m i n a c i c n e s se hacen por d u p l i c a d a . C o n s t r u i r una g r a f i c a can l35 v a l o r n s a h t e n i d a s e i n t e r p o l a r e l va l . o r d e E.O.. d e l prob lema para d e t e r m i n a r la c a n c e n t r a c i b n p r a t h i t a . d e l misma.

Repoj-tar l a c a n c e n t r a c i b n de pro.tei:ia p o r l.t::~!:i r n l de crina.

Hi h l i a g r a f 1 a:

Lynch, J., Raphae i , S.C. , M e l l a r , L.D. I Spa r e , F.G. Iriwoad, M.,?..H: Metadas de L a b a r a t a r i a . Segunda E d i c i d n . Ed. Iri .tw-arnerica-, na. Mexico 1972.

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CEFARACION Y CUANTIFICACION DE FLAWETAS DE HATON.

1 . Colocar a l ra tdn ba jo l a i luminac ibn d i r e c t a de una lampara de l u z blanca durante 1 0 minutos.

2. Trasladar al animal a un soporte para ratones, tomar l a c o l a y c o r t a r con un b i s t u r i e s t e r i l aproximadamente 2 min de l a punta.

3. Expr imi r l a c o l a y l lenar- con la sangre una p i p e t a para g lbbu los b1anc:os hasta l a marca de O.5,recubierta con s i l i c o n a .

4. D i l u i r con c i t r a t a de sodio 127 mM hasta l a marca de 11, d i l u c i d n 1:2.0.

5. Colocar l a p ipe ta en un agi tador para p i p e t a s de Thomas durante 3 minutos, y v a c i a r l a en un tubo de pol icarbonata.

6. Tomar 0.1 m l con una p ipe ta vo lumetr ica r e c u b i e r t a con s i l i c o - na y obtener una d i l u c i d n 1: iO con so luc idn de Rees-Eck!+er, homo- genei zar medi ante p ipeteo cu i dadoso.

Formula de l a Colucibn de Rees-Ecker

Azul de Cresil. b r i l l a n t e C i t r a t o de sodio Formaldehido 40% Agua Dest i 1 add q.b.p.

0.1 g

0.2 m l 100.0 ml

3.8 g

7. L lenar la camara cuenta g ldbuios y mantenerla 10 minutos en una atmdsfera htimeda.

8. Contar l a s piaquetas en l a cuadr icu la de g lbbu los r o j o s c inco cuadros de l a cuadr icu la ce i i t r a l . E l resu l tado de l conteo 5e m u l t i p l i c a por 1Cl,OO0 y se obt iene a s i e l nlimero de plaquetas por m i 1 i metro ctibico.

B i b i i o g r a f i a :

Simmons A. 1980 Technical Hematology. J.B. L i p p i n c o t t Co. Th i rd Ed i t i on . pp. 50-575, 241.

Manual de t r a b a j o d s l Labora tor io de B i o l o g i a Molecular.

1 4,

CROMATOGRAFIA EN CIJLUMNA MEDIANTF: GEL SEF'HADEX G,--li:)(2

1. C a l c u l a r - e1 volumen d e l a co lumna c,ecLin l a .fl;rmula:

B i b l i n g r a f i a :

Fi'zcher L. G e l F i 1 t r z t i o n Chrnmatuyraphy. E l sevi ere N o r t h H o l l a n d Press. pp. 81 1980.

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Materia: y

Culuciuneeí

Proced i m i en to:

1. Preparar en e l orden

zl reac t :i. .vo R adi c: i onando I a? s i gu-. ~ ~ t e s .sol LIC :I anea en que se en l i s tan :

REACT IL'C Ti

T a r t r a t o de sodio dihidra-kado al 2% 0.5 mi Cuifato de cobre pentahidratado al 1% 0.5 m l Carbonato (le Findio a1. 2:- en NaoH O.LN 50.0 m1-

2. /Jgitar estarro el

51.0 m?

l a m e z c l a durante unus minutos. Cubr i r con papel de m,xtra:z que la cori.ticlne para e v i t a r la al ter-acibn del

r e a c t i v o p a r la l u z .

3. P r e p a r a r una c u r v a t i po con l a s u l u c i o n p a t r o n d e a l b h n i n a 0.5 mg/ml h a c i e n d o d i l u c i o n e s s u c e s i v a s con una sulr-tcibn de IVaCl 0.85% como =.e muestra en l a t a b l a sigui.ent:e:

Tü2O COFlC. PRíJT. CflL.PATRON I'laCI 0.85% REACT. A REACT. E ( u g i m l ) i m l ) !ml j !ml) !!nl j

P AGREGAR O. 4 ml DE PIUECTF:A PF:.üHLEI*IA 2 . !j <:. 7

4. Despues d e a y r a y a r e? reac t i vo A d e j a r en r e p o s o duran te^ 10 minutos .

-t. Despcies de a g r e g a r E'? react ivo 8 , de ja r - en repcár: d u r a n t e :3(3 minc.it.os.

6. Leel- :!as muest.r.dE. a '750 i ~ m en el e= .pec t ro fn tbme%ro .

7. Ti-azar l a c u r v a t i p o eri pape l milimetrico h a c i e n d o l a gr.$fica d e c o n c e n t r a c i b n !ug/ml) cnn.tra a t i s o rbanc i a ínm) . 9. Dete rminar l a c o n c e n t r a c i b n d e pr i - i t i i ina d e l a muest ra pr-cblnrna i n t e r p o l a n d o su v a l o r de a b a o r b a n c i a en l a c u r v a t i p o .

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H i 13 1 i o g r a f i a:

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Frr;cedi. m i en to :

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2. UaTcar l a r e g i o n del f3mur ccm a a l u c i h d s e t a n a l a l 5'6%.

3. Bajo :la l l a m a ~ d e i mechero ; u t i l t z a n d o p i n z a s y tijeras er;t$- r i les , separar las e x t r e m i d a d e s i.nfericr@:s d e l an ima l .

PROCEDIMIENTO EN CAMPANA DE FLUJO LAMINAR

4. E l i m i n a r el mt isculo q u e c u b r e a l f e m u r , l i m p i a r l o con un p a h a es ter i l y h a c e r un corte t r a n s v e r s a l e n l a z o n a d e l c u e l l o q u i r - iIir y i ca . 5. P a s a r u n a a g u j a e s t h r i l . d e número 22x32'' a t r a v h s d e l c a n a l m e d u l a r h a c i e n d o m o v i m i e n t o s h a c i a a d e l a n t e y hac ia a t r a s p a r a a s e g u r a r l a s a l i d a d e l l i q u i d o m e d u l a r .

6. Inyectar a t r a v e s d e l c o n d u c t a m e d u l a r 1 . 0 m l d e m e d i o alfa-2.

MEDIO ALFA-2

S u e r o d e C a b a l l o Medio a l fa -NEM pH 7 . 2

1.0 m l 49.0 m l

50.0 m l

7. Colectar l a s u s p e n s i b n me'dular e n un t u b o d e c e n t r i f u g a este- r i l .

8. D i s p e r s a r l a s c h l u l a s m e d i a n t e p i p e t e a c u i d a d o s a can una p i p e t a F a s t e u r r e c u b i e r t a con s i l i c o n a .

9. C a n t a r l as c e l u l a s n u c l e a d a s t o t a l e s con un h e m o c i t d m e t r o ; a j u s t a r l a c o n c e n t r a c i a n c e l u l a r a 4.0 x l0*6 c & l u l a s / m l y colaca- r las e n un t u b a d e ensayo c o n t e n i e n d o l o s s i g u i e n t e s materiales, l as c u a l e s d e b e n a d i c i a n a r s e en el a r d e n q u e se e n l i s t a n :

COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO PARA CFU-M

Medio L e i b a v i t z (L--151 S u e r a d e C a b a l l o E x t r a c t o d e e m b r i b n d e b o v i n a í d i l . 1:4 e n L - 1 5 ) E x t r a c t o U r i n a r i a

0.9 m l 0.6 m l 0.3 m i

0.3 m l

S u s p e n s i o n c e l u l a r 4 .0 x 10b cel/ml S o l u c i b n d e c o l a g e n a 80 % (L-15 l C i X / N a O H C i . 3 4 N )

0.3 m l 0.6 m l

3.0 m l

1 0 . Colocar 0.5 m l d e medio con las c e l u l a s e n l o s p o z a s d e l a s p l a c a s d e c u l t i v o (66 X 66 mm) d i s p u e s t a s e n el i n t e r i o r de una c a j a F e t r i e s t h r i l . Homogeneizar e l c u l t i v a movienda l a ca ja P e t r i en forma c i r c u l a r .

1 1 . I n c u b a r l o s c u l t i v o s d u r a n t e s iete dias a 37 C , can humedad r e l a t i v a de 90 a 100 X y atmasfera d e CO 2 d e 4 a 10%.

I. 9

COSECHA DE CULTIVO CON IJNIDADEC. FORMAOORAC DE CCLONIAC DE MEGACAHIOCITGC.

12. Reviriirr luri cultivos al invertoscopio.

1;. Inti-ciducir por Los-tiurde d e l g e l formado en los ~ C J Z C J ! ~ de c : ! . 11 t i vu una espAkula de pui?t.: roma par.3 SI.\ cosecha.

1 4 - Colocar- 105 g e l e s mi ctri portaobjetos y teriir:orí median.te la t&c:nica de co l i r i es te rasa -he~a to , : i l i na .

~

lPI!:?tiia?f D. ; iMiüoriald l4.R. ~ ndartchcnco N. ~ Corda t i3" G r o w t h of Mouse Megakaryocyte Colori ies Ir: { J i t ro" Froc. Nat . &cad. / Sci. Us&. 7 2 <5>: 1744-1748. 1975. 1

. I iVal%:eff !N.Am and Dan:ie:l-McC!ueen C. In Vitr-o Colony /-iissay fix a 9.w Clñsjii. o.; Megakaryocyte i'rec:irsrir: Colony Fo!-miny Uni t (CiW- PI). Pruc . Soc. Exp. Biol. Ned. 151: 587-590. 19'7U.

TINCION DE UNIDCiDEC FORMGUORQS DE COLONIAS DE MEGACAHIUCITílC (CFU-M) MEDIANTE L A RERCCION CITO!ZUIMICR DE nCETIL-.COLIIVES'í'LRA9A.

M a t e r i a l y Equ.ipa:

EspEi.ti.ila d e punYa ¡ -om%. Partarrb jetos T i r a s d e papz1 Ci l t ; . a 5-' i p e t a s P a a t caw- Vasc;~ ; d e [:on 1 i ii Emu udo Copar-t-ri i..ictvsr!saI i:nn ani 1 i r F u e r t e para -ti nc: i bn I

Mi cr-occop i (3 hi7 t t c n Baf'fo con a g i tacibn

I., Rel.aj d e i n t c r v a l g .

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Amor t i guado r d e fosfa.t.oc, 0.1% pll 5.8 -6 .2 Giu ta ra1 ,d eh ido a l 2.5% e n a m o r t i g u a d o r de fosfati:is !3 . 1 M C o l u c i On t i n t o r i a l

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_- Metano1 Pibsalwko

, . Ne-kana a l 50% Hemataxi l i n a .

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P r o c e d i m i e n t o : .. ..

L - 1. L a s mi.iei,traa dz medula CFlJ-M son coaechadas can

... l os g e l e s son t r a n s f e r i d o s

L. C o l o c a r sabre l os seles I_/ I-

%sea cu1.t i v a d s pal-a el des iar ro l In d e una Fispktrrla m e t l r l i c a d c punta roma y a un p a r t a o b jetos.

up. papel ";l.t:-o humedecidci c o n amor.ti- . .. .. guador de fo!i.f.1.:oz; ;>H 5. El-6. 2 .

I .. ..,. Depoz i ta r - !sabre z l p a p e l .tres gotas de g l c t a r a l i e h i d o a i 2.5 % e n a m o r t i g u a d o r d e fos.Fatos !J. 111. D e j a r en r e p o s o d u r a n t e 10 minu to s a t e m p e r a t u r a a inbiente .

7

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4. R e t i r G r e l pape l filtro y pasar la laminilla a un vas!D d e . . C o p l i n con l a ao l c i c i bn . t in. i :or ia l : dejai- l a prepar -ac ibn e n esta

! m i u c i a n por- MI ininutoc, a 3 7 ' ~ o 3 tioras a t e m p e r a t u r a amtiieri.te. * . ,

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COMPONENTES DE L A SOLUCION TINTORIAL D E ACETIL-TIOCOLINA

Yoduro de ace t i l - t ioco l ina 20.0 mg Amortiguador de fosfatos 0. 1M pH 5.8-6.2 30.0 m l Ci t ra to de Sodio Ci.2M 3.0 m l Su l fa to de cobre 0.03M 4.0 m l Ferr ic ianuro de potasio Ci.005M 4.0 m l

6. Escurrir l a l am in i l l a y enjuagarla con solucibn amortiguadora de fosfatos 0.1 M durante 1 minuto. P e r m i t i r que l a l a m i n i l l a seque a temperatura ambiente ( 2 a 3 horas) antes de seguir con el procedi m i en-t o.

7. Sumergir l a l am in i l l a en metano1 absoluto durante 10 minutos.

E. Pasar a una soluciC!n de metano1 al 50 % durante 30 segundos.

9. Escurrir y colocar l a preparacibn en solucibn de hematoxilina de E r l i c h durante 5 minutos. F i l t r a r l a snlucibn de hematoxilina antes de regresarla a l f rasco de almacenamiento.

10. Lavar l a preparacibn por inmersibn en solucibn de c i t r a to- fosfato agitando l a preparacibn durante 1 minuto.

SOLUCION AMORTIGUADORA DE CITRATO-FOSFATO PARA LAVADO

C i t r a to de Sodio 1.0 M 31.2 m l Fosfato de sodio dibasic0 0.5M 161.0 m l Agua bidesti lada g.b.p.- 3.5 It

11. Colocar l a preparacifin bajo el . f lu jo de agua corr iente durante 1 minuto.

12. Escurrir y dejar secar l a preparacibn.

13. Colocar un cubreobjetos y f i j a r con barniz transparente.

14. Observar a l microscopio de l u z y contar e l nhnero de CFU-M presentes en l a preparacidn.

B ib1 iograf 1 a:

Jackson C.W. Cholinesterase a5 a Poss ib le Marker f o r E a r l y C e l l s of the Megakaryocytic Series. Blood. 42: 413-431. 1973.

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M a t er i a 1 H i o 1 09 i c a :

T a b l a 1.

! DETI~RMINACIONEC ORINA I

, '<' 1 i (7 $ :i I 1 z a- 2 F c r r s o l u b i l i C O , ~ soiiiciaSn

-?;:?.?ins ~ bor-atos pH a.4 en un volumen l r i veces menor par-a as1 o b t e n e r una so?uci¿!n de c o n c e n t r a c i h n 113 X; e l 1io.Fi l i z a d o d e la OHINk 1 se d i s o l v i h en l a misma s ü i . u r i b n hasta alcanzar una

. i vL>.,.>~r;;:~i :,-1;>3: :>:

I c o n c e n t r a c i h n d o 1ZO mq/mI. d e l i o f i l i z a d o en amori:ig;iaclor-. li

Se c u a n t i f i c a r a n i a s pro . t e i r ias de 10s e::.kractoi, y d e :ci o r i n a n o r - m a l p a r el metodo d e L E I W ~ Y .

Tab l a 2.

DETEHMINRCION DE ?SUTET.NAS TOTALES POR EL METODO DE LOWRY

MUESTFLí'i . COl'iC. u q / m l .

..

Una v e r c u a n t i f i c a d a s . l a s p r o t e i n a s y con el objeto d e cono- I ,. , c e r si e11 los e:.:t.racttr>s estaban presen - t e5 a c t i v i d a a e s irtegacar.ia--

=e ~i r o b aran c! i c: h a 5 act i v I dad c. 5 en . ,. CUI ti\vol; d e m*du:la hsea, E ii:ac:tlai-ido i-a.cones 1-ecept0re.s nurn! .s : ies

p oy C- t i c: a 5

y cuant i . f icando la c:oncentracibi? p l a q u e . t a r i a , r e s p e c t i v a m e n t e .

y .t r m i I i op o.{&,t !. c as I

~~. .. . Se c u ñ n t i f i c a r o n c:oinpñrativariienti' l a s plaquetas de: iiz gri.+:r>

d e cuatro i-a.kones no rma l e s u t i 1 i z a n d o d o s d i f e rmtes a n t i r o a g u i a - . .. . ntes. F:tnsL.iltadus en la g r a f i c a 1.

En base a estos resultados se e l i g i ? ~ e l ci . tra.to de soc!io corno anticoagulante. Se inyectaran ci.5 i n l d e l e x t r a c t o u r i na r i o 1C!X a dos lotes d e 4 ratciner,; probandose en f o r m a comparat.iva '!as V ia s Intravenoea 'y Cubr_l.it&r?e.a cowtra l a V3.a 1rrtraperi.triririal . i::uant:.i.f:ic:andoc,e l a s plaquetar a;i.kes de 1,- i n y ~ r c i h r i del mate!-:i i : L

í d i a (11) y 3 di.as cle:;pu&s ( d i u 4 ) . Lo:s restrl.t.ados ~ i e mues.k.ran mi l a s gr&f:ic:as 2 y 3.

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Se probo la actividad trombopoietica de este material, comparandola con la posible act.ividad trombopoietica de un factor de probada actividad megacariocitopoyetica yL&ro, proveniente del medio condicionado de bazo de ratdn concentrado SOX. Los resultados se dan en l a grafica 5.

I O X

Dí.

w x

T 1 C O

O W e * r o L d n t O a DETEHMINACION DE LFI ACTIVIDAD MEGACAHIOPOYETICA IN VITRO

Los extractos urinarins fueron utilizados como agentes esti- mulantes de megacariopoiesis en cultivos de medula bsea. La actividad estimulante fue medida por el namero de UFC-Pi desarrol- ladas en cultivo, comparandola con un control de actividad’positiva que es el medio condicionado de bazo de ratbn con suero de caballo al 1OX; considerandose esta actividad como 100X.y l as de los extractos como actividad relativa.Los resultados se dan en la Graf ica 6.

Unidad Formadora d e Cnlonias de Meaacar ioc i tos (UFC-Pi)

2cB 1 175

15 0

1 125. x

- CAPBCIDAD ESTIHilULRNiE DEL FRCTOR MEGllCllRI OPOYETICO WRIFICRDO

I I(c1 ORIWA 23 FP 1 FP 2 .FP 3 .ORIN4 N , . FP 1 : FBCTOX PfJRIFICkDO/NaCl 0,85x

FP 2 z PIiCTOI! PURiFICIiPO/flSB FP 3 : FfiCTOX PURIFICIDOiMEM

, .,* Con el f i n d e saber si l a a c t i v i dad est imulante d e l e x t r a c t o e r a debida a una rnolecula presente e n los e x t r a c t o s , y queriendo conocer el rango d e peso molecular d e l a misma; se proced i o a

v" f r acc i onar l a rnuestra en una columna d e Sephadex 6-100. Las f r a c c i one s fueron l e i d a s con l u z UV a 280 nm. Se obtuvo a p a r t i r

. . d e l a muestra un io10 p i c o entre l a al.bZimina s e r i c a bovina y l a ovalb&mlna, como se muestra en l a g r a f i c a 7.

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Ills. 1

1 E

I Las fracciones que co'ntenian proteinas fueron reunidas y liofilizadas. Posteriormente se prabb la actividad megacariapoy- Ltica en cultivos de medula &sea. Grafica 8.

x C F U

1 -

n I

I

EFECTO DE XI&. CONCENTRRCI ON 2c0, DEL EXTRRCTO URINi3RlO

175 156

12 5

100

75

58

25

E ORINA 1 ORINPI 2 DRINíi 2* ORINA N n c 2

I NC 1 : M E M O CONi'HOI. ~ W L DE ACTIVIDAD ORltM 2* : ORINM CONCENRfiiM 1EX ORIM N = QRINM tMRiíRL CONTROL NEGIIIIVC!

ni z = HERIO iomciomo LIBRE DE SUERO

DISCUSION DE RESULTADOS

Corno puede o b s e r v a r s e e n el examen g e n e r a l d e o r i n a , las mues t r a s no p r e s e n t a n ano rma l i dades , í a e x c e p c i h d e l a c a n t i d a d d e e r i t r o c i t o s e n l a muest ra No. 1 1 pues ambas c o n t i e n e n c a n t i - d a d e s n o r m a l e s d e p r o t e i n % , mien-tras q u e se e s p e r a b a l o c o n t r a r i o de a c u e r d o con l o r e p o r t a d d en l a l i . t e r a t u r a p a r a p a c i e n t e s con Pi'irpura 'Trombocitop6!nica I d i n p A t i r a .

S i t i embargo es n e c e r j a r i o mencionsr que (el t r a b a j a se ciesaF- rol l o con l a o r i n a d e , p a c i # e n t e s !:ron T r n m b o c i t o p e n i a Autninmutne, s i h i d o n o s , d e este maciQ3 deac :anoc idc l a c a r t i d a d y t.ipc? d e Lx-ote?.nai. arr-ojadai, a i~ iii-ina de eskos pacien.te:s.

E l habe r t i -aba jado con estos p a c i e n t e s o b o d e c i b fundainen.tal- mente a l d e s e o d e c o r r e l a c i o n a r l a p r e s e n c i a d e un f a c t o r megac.3- r i o p o y e t i c o en l a or ina, .con el c u r s o de un d e s o r d e n p l a q u e t a r i o e s p e c i f i c o , So c u a l n o seria p o s i b l e lograr C I ~ l a s p a c i e n t e s d e P T I . E s t o a SU vez , p o s i b l e m e n t e p e r m i t i r i a d i f e r e n c i a r l o s t i p o s d e t r o m b o c i t o p e n i a con hase e n el t i p o o t i p u s d e . Fa c t o r e s p r e s e - n.tii'. eii 1-1 orin.?.. Ea impar tan- te se'Pia1.w tambier! , qu:? ti..-abajan\:io c.un e.?,%* t i p o d e p a c i e n t e s , se tiens uca p c b l a c i d n rnAs hclmGg&nea r e s p e c t o a l a e t i o l o g i a d e l padec im i en t o . .

Estos p a c i e n t e s c u r ~ a r u n durari.te a l g h t i e m p o c o n .trumb«ci- t0peni .a d e b i d a a un a u t o a n t i c u e r p o Ic;G c o n t r a p l a q u e t a s . H e c i b i e - ron t r a t a m i e n t o con c o r t i c o s t e r o i d e s y p a s t s r i o r m e n t e , agotada es ta t e r a p i a , se p r a c t i c h l a s s p l e n e c t o m i a . IVo p o d r i a m o s espe- c i f i c a r - si este an. t icue i -po estd d i r i g i d o con . t ra p l a q u e t a s , p l a - quctas y p r e c u r s o r e s o s d l c contra los p r e c u r s o r e s , y a q u e d e a c u e r d o con R a b e l l i r i o y c o l a b o r a d o r e s í2C! ) , se ha v i s t o que e x i w - .tren anti::uerpns d i r i g i d o - í c o n t r a p r o t e i nas compar . t idas por preci-iq rsorei, y ~ l . ~ q c e t . a i , 9 Ibien, cnmc sea.aian Hnffnlan y cnlabtsradore.; i2L ) t-m a i i t i c s e r p o d i r i g i d o contra p r e c u r s o r e s m e g a c a r i o c i t icos l l e g a n d o a p r o d u c i r e s t a d o s d e A p l a s i a M s g a c a r i o c i t i c a . E s t o s a u t o r e s d emos t r a r on en e n s a y o s yitAgI l a capacidad d e p r o l i f e - tracid#n m e g a c a t - i o c i t o p o y e t i c a d e l a m M u l a osea eri p r e s e n c i a d e l %mro inac:.t ivado d e p a c i e n t e s ; mnstrando con esto que l a i n h i b i - ctbn i!iyg depende d e l a p r e s e n c i a rle l a IgG y d e l complnmentu en <jus f o r m a s a e t i v a s í 2 t i .

C o m a puede verse,el metodo d e c u a n t i f i r a c i b n d e p r o t e i n a s d e l A c i d o s u l f o s a l i c i l i c o , r e s u l t b poco s e n s i b l e y f u e n e c e s a r i o s u s t i t u i r l a p o r el metado d e Lowry.Camo ! r e s u l t a d o d e este a n a l i - sic, ( T a b l a 2 ) , l a Orina No. 1 , t i e n e e:! mayor c on t . en i do p r o t & i c o . En este caso, l a g r a n can.t.idad d e p r o t e i n a s p u d i e r a d e b e r ser a t r i b u i d o a que l a p a c i e n t e curáaha con !una infecciun a l momento d e l muestres; esto esta c o r r e l a c i o n a d o a l a p r e s e n c i a de n i t r i t o s ( T a b l a 11, que se l o c a l i z a n e n l a s i n f e c c i o n e s de via5 r e n a l e s y u r i n a r i a s , p o r l o cual , e s t a muest ra sa l o fue u t i l . i z a d a e n l a s p r u e b a s d e a c t i v i d a d m e g a c a r i o p o y + t i c a .

..

Despues de que un i n d i v i d u o ha cursado con trambocitopeni.a, e x i s t e un mecanismo de compensacibn, que l e permi te tnan1:ener la concentracibn de plaque.ta-3 constante. En t re el per ioda clii tr-ctribo- c i t open ia y e l de compensacibn, algunas autores h a n encon.trado il!? l o s f l lu idos corpora1e.s de .pacientes con Anemia Aplast ica, FGrptra Ti-ointioci topenica Id iop3t ic .s y algunos tipos de Leucemicts, u-; g i " u i j c : de m c i l &cul a5 de ;i.:.tu:-il ~ z a p r o t e i ca, rapaces de *s.ti riici: .*P.

-I In Viv!: - -_ €2 .~JJ yc&r-r megacar-iapoyeiia y .t.rornbopoyesis; con base en es te cmocimiento, en e l presente t raba ja , ie pre tend ib a i s l a r una Ipro.ke?na a pi:.rt ir de la o r i n a de pacien.tes con Tronbocitope- n i a F:u-tiii;r:miine. El que el conlreniclo de pr-o~teina el-: :[s cjr nue5trG% pacientes sea r-e.l,at.ivanie;ite b a j o cion re%pe*ctr, a ].a5 ,:e la!: enfermedades awtes mencionadas, pu i l i s r s a. t . r ibuirse a d.3.r; c.au~;.a~ pr inc ipa les :

a > Que se es te l iberando poca p rn te ina por el caractei- misma ;:e l a enfermedad, b! E l t.iempo de l a reca lecc ian de l a muestra no haya s ido e l

adecuada, ya que estos paci'entes ten ian una cctncentr-acibn plaqiie- tar-i.a mayor 3.1 :.imi.t.e %up-.rior ncrmal. r n m o puede ver-.@ a ron~. inuac ion :

3 .

Las resul tados an te r io res hacen pensar que se cursaba por un per iodo de compensacihn 11,smado de "Rebote .Tromboci t b t i c o " men- cionado por alyunns autores (23,33,24j y es to e x p l i c a r i a l a l i b e r a c i & n disminuida. de este .Factor a l o s f l u i d o s corpw-ales..

En v i r t u d de ,que ino se sabe s i YL-g s ~ i presenta tuno o mas factores, o si l a s ac t iv idades trombopoyetica.s y Meyacariopoye- ~ 1 c : a s san separadas a se diben a uno %crl.ci o va r ios .Factorei;, ccins i deramos p e r t i nen-bo Iprobar ambas a c t i vi. dadss.

... .

. . C o m o puede observarse en l a s grAi: i ia- i TL zt 5, esta p ra te ina

no presenta act i ,v idai j trombopay&t.ica baje ¡nuestra% candi.ciones de eñperimentacidn, independientemente de 1 a vi a de ap l i cacien.

Puede verse en l a s gra f i cas mencinnadas, que l a s var iac iones en- l a concentracibn de plaquetas en l a s animales receptanres Ino~ san s: i .ynif ica.t ivas, p o r 1ci que consider-a.inas que la mi-iest.ra rio presenta ac t i v idad trombopoy+tica, a pei- i r cíe haber uti. I . i r3do el tiempo bptimo p a r i este -tipci de determinaciones, sugericlox; en la l i t e r a t u r a í25).

En l a s g r a f i c a 6 se muestran los r e s u l t a d o s d e l a s pr-u.ebcts d e a c t i v f i d a d m e g a c a r i u p o y o t i c a . D e e l lns se deduce que iio obs.tcin- t e el b a j o coi i . tenidn d e p r o t e i n a s de :las mues t r a s , l a ac t i v id .?c f e s t imu l a i i t ; = es a l t a . S i n embarga ctlando l a mues t r a es concen~tt -Ada y p o s t e r i nrmente d i 1 u i da, I. a ac.t i v i dad d i smi nuye not a.b I. erneiit e. Es-to pi,Jria d e b e r s e a que' en el medio a c u o s o i ex istan csnb io i i ;~oi-!.Formacion;lle.c, de l a p r o t e ? i i a que á,z - i raducen como p@rdic ! i i d i a r t i v i d a d . Ein e.;ta g r $ f i c a , Iíe o b s e r v a .tamhien que la C!R:IlW No1 no c o n c e n t r a d a p r e s e n t a una a c . t i v i da c l d e l 62% con r e s p e r k n a1 r i o n t r o l , 'y mayor crln r e s p e c t o a :.a ORTUA 2 no conceii-t.r.ad:i. Z ic ! ia

p 1- at,?? r-,.iis ~2s -ip' i (J en m i cia:, i i . i - : ~ . 1 ~s' :~mulante pudier-.3 sei- d ~ : I (3 :L n er,T) ec L ." i c I cl Pil :I. d 2 .a L ' - .

Fuessla dz marii.CiesCrl l.a 3c.t.i dad estimu:ank,e d e la. proteinñ en la o r i n a , se f r a c c i o n o el E:.:tra.ctc, U: - i r iar is p a r a de.trirmina.r- z i e s t a a c . t i v i d a d o b s e r v a d a p a c i a a . k r i S u i r s e a una p ro t e ? .na p r e s e n t e e n l a o r i n a , y c o n o c e r as? sus c a r a c t e r i s t i c a s .

En l a g r A f i . c a . 7 se muest ra el p e r f i l d e corrimiento d e este ei.r.tr=?<;.L~ y e; d e Sum3. ! s e r t e d e rnarcadsres dri ;.'ti:x~ mn:ecu.lar. S.i !sb-ieria u;: <mica p i c i , cr!ti-.e la ~ X b C h i i - , ~ C h r i c a n o v i n a y la Oval.- blrm.ina, cons fderamns en - t onc z s que el Pesa m o l e c u i a r se e n c u e n t r a e n t r e los 44,cXKi y los C.6,c:>c:!O Da1,tons. E s t o es i m p o r t a n t e pues c u i n c i Y e con una d e 13s tre!q: s e h a l e s o b t e n i d a s p o r l~:s.waki.ta (14) a l + racc i i onar un e:.:ki-ac:t-j ur.ina!,-in d e p a c i e n t e s con P.nemi.3 AplA- s t i ca .

De a c u e r d o con los r e s u l t a d o s d e l a g r a f i c a R, l a s f rac - c i o n e s p r n t e i r i a s o b t e n i d a s p a r c r o m a t o g r a f ia, mues%ran a r t i v i d a d c e r c a n a a.l contr-o1 p o s i t i v o , y mues t r a 1.8 veces mas a c t i v i d a d q u e l a muestra d e e:itrac.t:a urii:ai-io 1 0 X a p a r t i r d e l cua.1 se o k t u v i eroi-i I

E -> iinpor-tan.te sefialar que l a a7c t i v i dad i i i egacar lopoyet . i . ca yi.gr-, p a r e c e e s t a r dada un icamente por es.:a p r o t e i n a c u y a ac t i - vtdad m e j o r a a l a g r e g a r c:omo v e h i c u l o 4lbÜn:ina S'rica B o v i n a d i a l i z a d a . Esta, p o r ser una pro te l i - : a erla.zant.e, p o s i b l e m e n t e p e r m i te m a i i . t e n er- 1'3, es.t r UT t t u r c' c o ri f o!- n n . ~ ~ i at': a l d e 1 f a c t or I c OD sz r - vando l a a c t i v i d a d biol.5g1:cu, ya qiit. ciiiando e s t a p i - o t e i n a +e ei- icuentra en media acuosa i como !o e!í e l nio.c::Is iYEM, . p i e r d e gran parte d e su a c t i v i d a d ; l a c u a l pare.r ier1a indicar que l a p r o t e f r i a es a l t a m e n t e l a b i l a d i c h o medio , y q u e l a a.lbilimina l e p r o t e g e d e ese ambiente . La albhni i i is puede c u m p l i r tambien el p a p e l d e e v i t a r l a t o x i c i d a d d e l a c o n c e n t r a c i d n l h n i c a d e l amor t i guado r d e corrimiento l i o f i l i z a d o caz 1 1 muestrau

Es impor.tai i . te que en 'kraba-jos p o s t e r i o r e s con este t i p o de p a c i e n t e s , se d e t e r m i n e i i se l i b e r a en forma c o n s t a n t e e s t a prcr i e i i i a , d e .tal manera que pueda es.Cab:er:er-se una co r r e l a c c i bn eimkre el c u r s o d e la en fe rmedad y l a pt-eseccia d e l a mistma en l a or ina d e p a c i e n t e s . .~

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. . nas'otk,as y sus caracte-

risticas; para formular modelos de actividad bioldgica !&yg . Mediante l a caracterizacion de esta proteina y su a i s l a

miento constante de l a Ori-na de pacientes, sa podria separar a l a Trombocitopenia' Autoinmune como un padecimiento especifico, de l gran grupo de trombocitopeni,as Idiopaticas, en base a l a presen- c i a constante de esta proteina.

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CONCLUC I ONES' :. ~,

i d . 'proteins obtenida ' a p a r t i r d e l e x t r a c t o u r i n a r i o de .. pacientes con Trombocitopenia Autoinmune, mosjtra un peso molecu- l a r en t re l o s 44,000 y 66,000 Daltons. A pesar de tener un peso tan cercana a la Trombopoyetina, (48,000 D) , no demostra ac t i v idad trombapoyetica, por lo que descartamos l a p o s i b i l i d a d de que este sea un f a c t o r trombopoyhtico. E l f ac to r ' encontrado en el medio condicionado de bazo de ratan, estudiado .paralelamente a es te t raba jo , .tampoco mastra a c t i v i d a d alguna 'en es te sentido. E l peso : molecular de es te f a c t o r es de L50,000.D.. Ambos factores poseen .

a c t i v i d a d megacariopoyetica a pesar de l a d i f e r e n c i a en ,sus pesos moleculares.

Tal como se mostra en la g r a f ~ i c a 1 del p ro toco lo i n i c i a l de 'este proyecto, en l a . o r i n a de pac ientes can Pürpura Trombocitop- en ica Idiapatica,parecen e x i s t i r dos moleculas;. una de e l l a s .. -.

emejante'.': a-.. la. sena1 ~praducida por e l fac to r obtenj+.,:del.: media .~ . ondicionado de bazo de- ra tbn , l a o t r a puede ser l a encontrada en

nuestro estudio, l levandonas a pensar que,' dependiendo del t i p o L de ant icuerpas y e l n i v e l a l que actSian, se l i b e r a n una u o t r a

c lase de f a c t o r hac ia l o s f l u i d o s corporales. .. . . . .

, . .

Es necesario un es tud io mas prpfundo para deberminar si e l f ac to r megacariopoy&tico proveniente de l o s pac,ientes con trombo- c i t o p e n i a autoinmune, es constante en' . l a or iqa. Si. e x i s t e LQ ~ L X Q en l a s mi+mas_condi.ciones en l a s qqe. lo-encontr,amos 0,5i proviene ..,, .. . ,

de un precursor .tie mayor peso molecúlar. .'

- . . . -.

Estudios pos te r io res real-izacfbs con mayor cant idad de mues- t r a podr ian dar una v i s i o n comparativa de t i ' po c u a l i t a t i v o y c u a n t i t a t i v o , . en t re l a FTI y ? a Trornbocitopenia Autoinmune; es.to ayudai-ia a formar un c r i t e r i o para 'd i fe renc ia r l o s . d i s t i n t o s . ? ' '

ti pos^ de Trombocitopenia Autoinmune por medio ~ d e i desa r ru l l a de

tir l a deteccibn rap ida y e s p e c i f i c a de d icha prote lna, siendo pos ib le , en un f u t u r o le jano, u t i l i z a r l o s como herramienta que permi-ta re lac iona r e l cursa de l a enfermedad ~ o n ~ l o s . n i v e l e s de ~.

- metodos e l e c t r o f a r e t i c o s l o suf ic ientemente sensib-les'~'park permi- ~

p ro te ina en l a o r i n a de l o s pacientes. ~.

,.

.~ .. : . , - . . . . . . . . . - .. . . . .

. . .

..

Se colecto l a orina de dos pacientes con Trontbocitopenia . v ' , , Autoinmune y de un control sano. Las muestrasz furon dializadas, . .

la5 de 105 pacientes, I ioYil izadas. y concentradas. Se probb l a actividad trombopoyetica inoculando ratqnes receptores normales y 5e midib e l efecto como un incremento en l a concentracibn de

. plaquetas a l o s 4 dias. de l a inoculacibn. Se probb la actividad megacariopoyetica~ en cultivos tidemedula &sea de ratbn- antes y .

despues de un fraccionamiento del extracto urinario por cromatog- - r a f i a con Cephadex 6-100, entendiendo l a actividad como porceri- t a j e re lat ivo a l a presentada por un control positiva, que es e l medio condicionada de bazo de raton.

, .

- . ~. , .

Se encontrb una proteina de rango de peso molecular entre 'los 44,OO y los 66,000 D, con una actividad.meg&a a l rededor de "200%.. d antes del , f racci onami enka.. ' Desp'W namiento se l l e v i a caba una l io f i l i zac ion de . l a s fracciones; l a .. '.:I' actividad del l i o f i l i z ado fue de 108% al d i l u i r l a en Fllbttmina

._ Serica Bovina 1.:10 y de 26.2% a l d i l u i r con el'medio MEM. En l.as pruebas d e actividad trombopoyetica con animales receptores,. no ::- se encontro actividad trombopoyetica en ninguna da l as müestras. . . ~

oyetica de -.: &i+accio- 1. --

.. . . . ... L. .~~. . ~ .

... , .~., ~. . . Los ~' resultados muestran que :el factor obtenido posee ..

solamente act~ividad megacariopoy&tic,a y no trombopoy&tic.a 1 nuestras .condfciones . de experimentacion. ~~ .

~. , . : ,~ . . . . - . -, - - , ..

. . . . 5.

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