BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Jenis penelitian ini adalah eksperimental yaitu dengan mengamati

kemungkinan diantara variabel dengan melakukan pengamatan terhadap

kelompok eksperimental pada berbagai kondisi perlakuan dan

membandingkan dengan kelompok kontrol, dengan menggunakan rancangan

penelitian Randomised Block Design.

B. Variabel Penelitian

a. Variabel bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi ekstrak etanol daun

kumis kucing.

b. Variabel tergantung

Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah:

1. Volume udem kaki tikus.

2. Ketebalan udem telinga tikus.

3. Penurunan serapan plasma.

4. Waktu pendarahan tikus.

c. Variabel terkendali

Variabel terkendali pada penelitian ini adalah:

1. Pemilihan tikus: galur, kondisi, jenis kelamin, umur, berat badan tikus

2. Pemilihan herba: tempat tumbuh, waktu pemanenan, dan bagian

tanaman yang digunakan.

C. Definisi Variabel Operasional

1. Ekstrak etanol daun kumis kucing merupakan ekstrak yang diperoleh dari

penyarian daun kumis kucing menggunakan etanol 70%.

2. Pengukuran uji aktivitas antiinflamasi dan antiagregasi platelet adalah

pengukuran dengan menggunakan perhitungan volume udem kaki tikus,

pengukuran ketebalan udem telinga tikus, penurunan serapan plasma, dan

waktu pendarahan tikus.

3. Dosis ekstrak yang digunakan sebagai perlakuan yaitu 100 mg/kgBB, 500

mg/kgBB dan 2500mg/kgBB.

4. Galur tikus yang digunakan dalam penelitian ini yaitu jenis galur wistar.

5. Umur tikus yang digunakan dalam penelitian ini yaitu antara 2-3 bulan.

6. Bobot tikus yang digunakan dalam penelitian ini yaitu 150-250 gram.

7. Tikus yang digunakan dalam penelitian yaitu tikus jantan.

D. Bahan dan Alat

1. Bahan

Bahan-bahan yang dibutuhkan dalam penelitian adalah daun kumis

kucing, natrium diklofenak (Phapros) dan aspirin (Phapros) sebagai kontrol

positif. Bahan kimia yang digunakan meliputi :etanol 70% (Brataco),NaCl

0,9 % (Brataco), EDTA, CMC-Na , karagenin, asam arakhidonat(Sigma,

Singapore) dan tikus sebagai hewan uji.

2. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian adalah alat-alat gelas

laboratorium, maserator, pengaduk kaca, kain saring, cawan penguap,

sudip, penangas air,pipet ukur, neraca analitik,pleistimograf, kertas saring

whatman,microplate reader (Bio Red, Jepang).

E. Cara Penelitian

1. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan pada bulan Januari sampai dengan Juni 2012 di

Laboratorium Biologi Farmasi dan Laboratorium Farmakologi Universitas

Muhamadiyah Purwokerto.

2. Langkah Kerja Penelitian

a. Penyiapan dan Pengumpulan Bahan Tumbuhan

Penyiapan bahan tumbuhan meliputi pengumpulan dan identifikasi

bahan tumbuhan serta pembuatan simplisia. Pengumpulan bahan simplisia

dilakukan tanpa membandingkan dengan tumbuhan serupa pada daerah

lain. Bahan yang dibutuhkan sebagai sampel adalah daun kumis kucing

yang didapat di daerah Kedung Banteng Purwokerto pada bulan Januari

2012.Determinasi dilakukan di Laboratorium Botani dan Genetika

Universitas Muhammadiyah Purwokerto.

b. Pembuatan Simplisia Daun Kumis Kucing

Daun Kumis Kucing yang diperoleh, dikumpulkan,dibersihkan

dari kotoran dan dicuci dengan air mengalir hingga bersih. Setelah itu

ditiriskan, sebarkan diatas kertas hingga air meresap. Setelah itu dijemur

dibawah sinar matahari, dengan ditutup kain hitam dansetelah kering

serbukan dengan menggunakan blender.Ukuran ayakan untuk serbuk

adalah mesh 20/40.

c. Pemilihan Hewan Uji

1. Pemilihan galur, jenis kelamin, umur dan bobot hewan uji yang akan

digunakan dalam penelitian adalah tikus putih jantan galur wistar

dengan umur 2-3 bulan, dengan berat badan 150-250 gram.

2. Hewan uji yang dipilih berdasarkan berbagai kriteria tersebut diberi

perlakuan yang sama. Waktu pengadaptasian hewan uji dilakukan

selama satu minggu sebelum hewan uji mendapat perlakuan.

Kemudian diberi larutan ekstrak etanol daun kumis kucing selama

tujuh hari berturut-turut dengan harapan senyawa yang berfungsi

sebagai agen anti inflamasi telah terakumulasi dalam tubuh.

d. Penentuan Panjang Gelombang

Penentuan panjang gelombang dilakukan dengan tujuan agar

didapatkan absorbansi yang maksimal. Bednar et al (1994), pada

penelitiannya tentang uji agregasi platelet dengan menggunakan

microplate reader, digunakan panjang gelombang 632 nm. Mengacu pada

penelitian tersebut, maka pada penelitian ini dilakukan orientasi langsung

dengan panjang gelombang yang sama yaitu 632 nm.

3. Tahap Persiapan

a. Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Kumis Kucing

Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi. Langkah

pembuatan ekstrak etanol daun kumis kucing adalah sebagai berikut :

Ekstrak dibuat dengan cara maserasi menggunakan etanol 70%.

Satu bagian serbuk kering daun kumis kucing dimasukkan ke dalam

maserator, ditambah 10 bagian etanol 70%, direndam selam 6 jam sambil

sekali-kali diaduk, kemudian didiamkan sampai 24 jam. Maserat

dipisahkan dan proses diulang sekali dengan jenis dan jumlah pelarut

setengah dari pelarut semula. Semua maserat dikumpulkan dan diuapkan

hingga diperoleh ekstrak kental.

b. Penentuan Dosis Ekstrak Daun Kumis Kucing

Daun kumis kucing yang mempunyai efek sebagai antiinflamasi

pada tikus adalah490mg/kgBB (Prayoga, 2008)

1). Dosis ekstrak untuk tikus bobot 200 g (dosis 100mg/kgBB)

��,��

����x0,2 kg=0,02 g

Larutan ekstrak yang diberikan

0,02 g x���

��=0,033 ml ~ 0,03 ml

2). Dosis ekstrak untuk tikus bobot 200 g (dosis 500 mg/kgBB)

=�,�

����x 0,2 kg=0,1 g

Larutan ekstrak yang diberikan

0,1 g x���

��=0,167 ml ~ 0,2 ml

3). Dosis ekstrak untuk tikus bobot 200 g (dosis 2500 mg/kgBB)

=�,�

����x 0,2 kg=0,5 g

Larutan ekstrak yang diberikan

= 0,5 gx���

��=0,833 ml ~ 0,8 ml

c. Penetapan Dosis Karagenin

Karagenin yang diberikan pada tikus harus mempunyai dosis yang pasti

dan tepat. Septiawan (2011) menyatakan dosis karagenin yang di berikan15

mg/ kgBB cukup baik untuk digunakan. Mengacu pada penelitian tersebut

maka penelitian ini dilakukan orientasi langsung pada dosis 15 mg/ kg BB dan

diamati apakah benar pada dosis tersebut memberikan efek peradangan yang

baik dan mudah diamati.

d. Penentuan Dosis Natrium Diklofenak

Dosis Natrium diklofenak untuk tikus perlakuan ditentukan

berdasarkan faktor konversi dosis manusia dan dosis tikus menurut metode

Laurance dan Baoharach. Perhitungan konversi dosis manusia dengan tikus

adalah:

Dosis pemakaian pada manusia (50kg) = 100 mg sehari

Konversi dosis manusia (70kg) pada tikus (200g) = 0,018

Dosis pemakaian pada manusia (70 kg) =����

���x100 mg

� 140mg

Dosis untuk tikus (200 g) = 140 mg x 0,018

= 2,52 mg

Dosis untuk tikus �2,52mg

200gBB

= 0,0126 mg/gram BB

= 12,6 mg/ Kg BB

Larutan suspensi natrium diklofenak 5 % yang diberikan

= �,���

���x 1ml = 0,05 ml

e. Penentuan Dosis Aspirin

Dosis aspirin untuk tikus perlakuan ditentukan berdasarkan faktor

konversi dosis manusia dan dosis tikus menurut metode Laurance dan

Baoharach. Perhitungan konversi dosis manusia dengan tikus adalah:

Dosis aspirin adalah 80-320 mg.

Perhitungan dosis sehari yaitu 80 mg.

Faktor konversi manusia (70 kg) ke tikus (200 g) = 0,018

Rata-rata berat manusia Indonesia adalah 50 kg, sehingga dosis aspirin

yang digunakan ����

���x80 mg=112mg

Dosis aspirin untuk tikus (200 g) = 0,018 x 112 mg

= 2,02 mg

Dosis aspirin untuk tikus = 2,02 mg/ 200 g BB

= 0,01 mg/ g BB

= 10 mg/ kg BB

Volume aspirin yang diberikan :

= �,����

������x100ml=0,202~0,2ml

f. Pembuatan Suspensi CMC-Na 1%

Sebanyak 1 gram CMC Na ditaburkan merata ke dalam mortir yang

berisi aquadest panas sebanyak 35 ml. Didiamkan selama 15 menit hingga

diperoleh massa yang transparan, digerus hingga terbentuk gel kemudian

diencerkan dengan sedikit air, dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, lalu

ditambahkan air suling sampai garis tanda.

g. Pembuatan Larutan Standar Ekstrak Daun kumis kucing 60%

Sebanyak 30 g ekstrak ditimbang seksama dan dimasukkan ke dalam

labu takar 50 mL, ditambahkan dengan CMC-Na 1% sampai tanda dan

dikocok.

h. Pembuatan Larutan Standar Natrium Diklofenak 5%

Sebanyak 5 g natrium diklofenak ditimbang seksama dan dimasukkan

dalam labu takar 100 mL, ditambahkan dengan CMC Na 1% sampai tanda

dan dikocok homogen.

i. Pembuatan Karagenin 1%

Sebanyak 100mg karagenin ditimbang seksama dan dimasukkan

dalam labu takar 10 ml, ditambahkan dengan NaCl 0,9% sampai tanda dan

dikocok.

j. Pembuatan Asam Arakhidonat

Sebanyak 74,6 mg asam arakhidonat ditimbang seksama kemudian

tambahkan 10µl etanol absolut dan ditambahkan NaCl 0,9 % (b/v) sebanyak

0,41 ml.

k. Pembuatan Larutan Standar Aspirin 1%

Ditimbang sebanyak 1g serbuk aspirin kemudian digerus dengan

penambahan suspensi CMC-Na 1% sampai homogen, dimasukkan ke dalam

labu ukur 100 ml, dicukupkan sampai garis tanda dengan suspensi CMC-Na

1%.

4.Tahap Pelaksanaan

Sebelum diberi perlakuan tikus ditimbang dengan bobot rata-rata tikus 200

g. Hewan uji di bagi menjadi 6 kelompok. Pada tiap tikus diberi dengan dosis yang

berbeda. Adapun perlakuan terhadap hewan uji pada masing-masing kelompok,

yaitu:

1. Kelompok I : Kelompok kontrol pelarut yaitu tikus

diberikansuspensi CMC-Na 2% secara per oral selama 7 hari.

2. Kelompok II : Kelompok kontrol positif untuk uji udem yaitu tikus

diberikan suspensi natrium diklofenak 12,6 mg/kgBB secara per oral 2 jam

sebelum perlakuan.

3. Kelompok III : Untuk kontrol positif agregasi platelet

menggunakanaspirin dengan dosis 10 mg/kgBB.

4. Kelompok IV : Kelompok perlakuan dengan pemberian ekstrak dosis

100 mg/kgBB secara per oral selama 7 hari.

5. Kelompok V : Kelompok perlakuan dengan pemberian ekstrak dosis

500 mg/kgBB secara per oral selama 7 hari.

6. Kelompok VI : Kelompok perlakuan dengan pemberian ekstrak dosis

2500mg/kgBB secara per oral selama 7 hari.

Setiap tikus tetap diberi makan selama 7 hari. Kemudian pada hari

ke-7 dilakukan uji sebagai berikut:

1). Uji udema pada telinga tikus

Pengujian udema pada telinga tikus dilakukan pada telinga bagian

kiri.Sebelumnya dilakukan pengukuran ketebalan telinga tikus.

Selanjutnya tiap tikus dioleskan asam arakhidonat kemudian ukur

ketebalan telinga tikus tersebut diukur pada 0,5 ; 1 ; 1,5 ; 2 ; 3 dan 4jam

dengan menggunakan jangka sorong.Pengukuran dilakukan replikasi

sebanyak tiga kali.

2). Uji udema pada kaki tikus

Uji udem kaki dilakuan dengan memberi tanda pada kaki tikus, kemudian

kaki tikus dimasukan kedalam alat pleistimograf yang berisi cairan

sampai andda batas. Angka dicatat sebagai Vo. Satu jam kemudian kaki

tikus disuntik secara intraplanar dengan larutan karagenin 1%. Setelah 30

menitpengukuran dilkukan kembali dengan cara mecelupkan kaki tikus ke

dalam alat pleistimograf yang berisi cairan sampai tanda batas. Angka

dicatat sebagai Vt. Pengukuran dilakukan setiap 30 menit, selama 360

hari.Pengukuran dilakukan replikasi sebanyak tiga kali.

3). Uji agregrasi platelet

Tikus kelompok I, III, IV, V dan VI diambil darahnya dari ekor,

ditempatkan dalam mikrotube.Kemudian ditambahkan EDTA sebagai

antikoagulan dan digoyang-goyangka.Setelah itu darah disentrifuge

dengan kecepatan 6000rpm selama 3 menit.Supernatan dipisahkan dari

endapan, dan ditempatkan dalam 96 well microplate. Sebanyak 293,5 µl

supernatan ditambah dengan 6,5 µl asam arakhidonat hingga konsentrasi

akhir 12,38mM. Kemudian dibaca absorbansi menggunakan microplate

reader pada waktu 15 detik, 30 detik serta 1;2;3;4;5;6;7;8;9;10 menit

dengan panjang gelombang 632 nm.

4). Uji waktu pendarahan ekor

Uji waktu pendarahan dilakukan dengan memotong 5 mm ujung ekor

tikus dan ekor ditotolkan pada kertas saring whatman setiap 30 detik

sampai hasil penotolan tidak menunjukan bekas pada kertas.Waktu

pendarahan dihitung antara waktu pemotongan sampai waktu darah

berhenti.

5). Perhitungan Volume Udem, Serapan, dan Waktu pendarahan

a. Perhitungan Volume Udem Telinga

Persen radang dapat dihitung dengan rumus

Persen radang =�����

��x 100%

Dimana : Kt = Ketebalan radang setelah setelah pemberian injeksi asam

arakidonat

Ko = Ketebalan radang sebelum injeksi asam arakidonat

Persen inhibisi radang dihitung dengan rumus :

Persen Inhibisi Radang :���

�x100%

Dimana : a = persen radang rata-rata kelompok kontrol

b = persen radang rata-rata kelompok perlakuan hewan uji

b. Perhitungan Udem kaki tikus

Persen radang dapat dihitung dengan rumus :

Persen radang = �����

��x 100%

Dimana : Vt = volume radang setelah waktu pemberian injeksi karagenin

Vo = volume awal sebelum injeksi karagenin

Persen inhibisi radang dihitung dengan rumus :

Persen Inhibisi Radang :���

�x100%

Dimana : a = persen radang rata-rata kelompok kontrol

b = persen radang rata-rata kelompok perlakuan hewan uji

c. Agregasi platelet

Uji agregasi platelet ditunjukkan dengan perubahan penurunan

serapan plasma.Penurunan serapan plasma dihitung dengan menghitung

selisih serapan plasma.

d. Perhitungan Waktu Pendarahan Ekor Tikus

Perhitungan waktu perdarahan dihitung dari periode waktu amputasi

sampai waktu pemberhentian perdarahan.

F. Analisis Statistik

Data yang diperoleh dianalisa secara statistik menggunakan program

SPSS versi 16.Data persentase inhibisi radang diolah dengan menggunakan

analisis anava dua arah.Sedangkan untuk mengetahui perbedaan persen

inhibisi antara udem kaki dan udem telinga digunakan analisis T-test.Data uji

agregasi platelet dan waktu pendarahan, masing-masing dilakukan analisis

dengan anava satu arah untuk melihat adanya perbedaan antar kelompok

perlakuan.