izotópok alkalmazása az orvostudományban kísérleti állatok ... · kutya sertés majom 8....
TRANSCRIPT
Kísérleti állatok radioizotópos leképezése
Dr. Márián Teréz
NUKLEÁRIS MEDICINA INTÉZET DEOEC
2010
1
Izotópok alkalmazása az orvostudományban
kutatás diagnosztika terápia
anyagcsere folyamatoksejtosztódásnyomjelzéstérfogatméréskoncentráció mérésbiokémiai folyamatokgyógyszerkutatás
funkcionális vizsgálatokanyagcsere folyamatok
tumor diagnosztikaizotópeloszlás térképkétdimenziós térképháromdimenziós térkép
sugárterápiaradionuklid terápia
2
Új izotóppal jelzett ligandok biológiai tesztelése
Gyógyszerkutatás
Orvostudomány
Állatkísérletek:
In vitro: receptor kötıdési vizsgálatok
Ex vivo: szervi megoszlásos vizsgálatok
autoradiográfia
In vivo:
Funkcionális:PET, Mini-PET, SPECT,
Anatómiai: CT, MRI
3 4
Az állatkísérlet végzésének törvényi feltételei
Hol?a létesítményt a hatóságnak (területi Állategészségügyi Állomás) nyilvántartásba kell vennie(állatok tartása és gondozása, állatházi viszonyok, személyzet, berendezések, stb.)
Miért?a kutatási tevékenységet (projektet) engedélyeztetni kell a hatósággal(célja, indoka, tudományos alapjai, módszertana)
Hogyan?a kísérleti eljárásokat a MÁB-nak jóvá kell hagynia(mint elıbb, csak részletesebben, állatok faja és száma; fájdalom, szenvedés, tartós nélkülözés és károsodás értékelése; ezek megszüntetésére vagy minimalizálására tett intézkedések; a kísérlet idıtartama; stb.)
Ki?a kísérletet vezetı illetve abban résztvevı személyeknek megfelelı, a hatóság által elismert végzettséggel ill. gyakorlattal kell rendelkezniük
5
Feltételek
(2) Állatkísérlet kizárólag nyilvántartásba vett intézményben és engedély alapján végezhetı. (Ávt. 25. §)
(1) Állatkísérlet kizárólag olyan felelıs személy vezetésével végezhetı, aki külön jogszabályban meghatározott végzettséggel és gyakorlattal rendelkezik, és ismeri az állatkísérletek etikai elveit, jogi szabályait.
(2) Állatkísérletet az végezhet, a kísérleti állatot az gondozhatja, felügyelheti, aki erre képesítı oktatásban részesült. (Ávt. 30. §)
Kísérleti célra állatot tenyészteni (szaporítani), tartani, szállítani, valamint forgalomba hozni a tartás helye szerinti állategészségügyi hatóság engedélyével szabad. (Ávt. 31. § (1) bek.)
6
34. § (1) A MÁB feladata az intézménya) állatkísérleti szabályzatának (etikai kódexének) elkészítése;b) állatkísérleti szabályzata végrehajtásának ellenırzése;c) állatkísérleteinek szakmai-etikai felügyelete.
A MÁB feladata továbbá az intézményben az állatkísérlet végzésére jogosult személyek oktatásának, képzésének szervezése.
(2) A MÁB az intézmény belsı állatkísérleti szabályozásának megsértése esetén jogosult - az állat-egészségügyi hatóság egyidejő értesítése mellett - a kísérlet azonnali leállítására. (Ávt. 34. §)
(4) A MÁB nyilvántartást vezet az általa jóváhagyott kísérletekrıl, valamint az intézményben folyó állatvédelmi oktatásról (az oktatás tematikája, a résztvevık névsora). (Korm. rend. 9. §)
Munkahelyi Állatkísérleti Bizottság (MÁB)
7
Állatkísérletek engedélyeztetése
Etikai engedély
Csak erre a célra tenyésztett állatokkal szabad kísérletezi
Egér
Patkány
Nyúl
Macska
Kutya
Sertés
Majom
8
Állatkísérletek izotóppal jelölt biomolekulákkal
In vitro autoradiográfia
Ex vivo autoradiográfia, szervi megoszlásos vizsgálatok
In vivo molekuláris képalkotó technikák
9
Az autoradiográfia nagy múltú
technika
Niepce St. Victor in 1867 – ben mutatta ki, hogy az uránium só
feketedést okoz az ezüst
klorid/bromid sót tartalmazó emulzión.
10
1904
E.H. London készítette az
elsı makro-autoradiográfiát, ahol egy
békát rádium izotóppal
jelölt meg, és rádium sugárzást, ami a békából
jött leképezte egy filmre.
11 12
Autoradiográfia-Fotoemulziós eljárás
A sugárforrás lefényképezése két vagy három dimenzióba egy fotográfiai emulzió segítségével
A sugárzásnak a fotoemulzióra gyakorolt hatása denzitométerrel mérhetı
Denzitométer: speciális fotométer, amely a fotoemulziók feketedését határozza meg, és széles tartományban arányos a sugárzás intenzitásával.
Kvantitálás (mennyiségi kiértékelés): a vizsgálandó emulzió feketedését un. normálsorozat feketedésével hasonlítjuk össze.
13
Autoradiográfia szerepe a biológiai kutatásokban
Az izotóppal jelölt biológiailag aktív molekulákszervezetben, szervekben, sejthalmazon, sıt egyes sejtekenbelüli lokalizációja meghatározható
Gyógyszerkutatás
Élettani folyamatok nyomon követése
Molekuláris biológiai izotópos módszerek (génexpresszió,membrán fehérjék kimutatása, izotópos antitestjelölésekkel stb)
Kémiai analitikai módszerek
14
Autoradiográfia� Izotóp injektálása
� Állatok elıkészítése a metszésre
� A beágyazó anyag elıkészítése
� Beágyazás
� Metszés
� Elımetszés
� Metszés
� A metszetek kezélése (fagyasztva szárítás)
� A szeletek elıkészítése a detektáláshoz
� A szeletekben feldúsult radioaktivitás megjelenítése, film vagy foszfor imager technikával.
� Kiértékékelés
15
A metszetek fagyasztva szárítása
16
Izotópeloszlás detektálása sugárérzékeny
filmen,vagy beta imager technikával
17
LEICA CM 3600 cryomacrotom
18
Patkány modell
18FDG
Tumordiagnosztika,
terápia hatékonyságának
kimutatása állatkísérletekben
Megelızı Orvostani Intézet
TTK Molekuláris Biológiai Intézet
Egésztest autoradiográfia
19
Anatómia kép
20
Anatómiai kép (felsı) és emissziós FDG-PET kép (középsı)
fúziója (alsó kép)
21 22
A radioaktivitás detektálása film A radioaktivitás detektálása film autoradiográfiávalautoradiográfiával
AgBr kristályból Ag kiválás a radioaktív sugárzás hatására
AgBr kristály
Zselatin
Radioactív halmozás
Minta (metszet)
A fényérzékeny anyag (film) egy szilárd hordozóra felvitt zselatinba ágyazott AgBr. Ha fény, vagy radioaktív sugár éri a kristályt, egy elektron kilökıdik, továbbhalad, majd egy hibahelyen befogódik.
23
A radioaktivitás detektálása film autoradiográfiávalA radioaktivitás detektálása film autoradiográfiával
Látens kép kialakítása Ag+ + e- = Ag folyamatban
keletkezı Ag atomok a látens kép prekurzorai
Instabil állapot
Látens kép stabilizálása: az expoziciót -70 oC-on végezzük
24
Elıhívás
Az elıhívó oldat az AgBr szemcsék kémiai redukcióját végzi, amelyet az ezüst atomok katalizálnak.
AgBr----Ag
Látens kép ----- ezüst szemcse
Elıhívás ------ itt jelenik meg gyorsabban a látható kép
A látens kép láthatóvá tétele
25
Fixálás
Autoradiogram
Az elıhívott kép rögzítése: Az elıhívás után a visszamaradó, redukálatlan AgBr-ot a fixirfürdıben eltávolítjuk
Mosás: sók eltávolítása a zselatinból26
Felbontóképesség: az a minimális távolság amikor még két különálló pont helyét meg tudjuk különböztetni a filmen
A felbontóképesség függ:
az izotóp energiájától
a minta rétegvastagságától
a fotoemulzió rétegvastagságától
a minta és a film közötti távolságtól
az expoziciós és elıhívási idıtıl stb.
27
Érzékenység: egységnyi aktivitás által egységnyi felületen (1 cm2) létrehozott Ag szemcsék száma
Optimalizálás
Denzitométerek: a filmen létrejött feketedések értékelése
Probléma: a feketedési értékek nem lineárisan változnak az aktivitással
Preflash– elıvilágítási technika
28
In vitro állatkísérletek: autoradiográfia
A szervekbıl készített szövettani metszetek jelölése a membránhoz kötıdı specifikus izotóppal jelölt ligandokkal:
Receptor-ligand kötıdés
Kompetíciós vizsgálatok
Specifikus – nem specifikus jelölıdések
29
100 nM 18FNECA 100 µM hideg FNECA
Coronális metszetek
18F NECA kötıdéseegéragyban
30
Radioluminescencia detektRadioluminescencia detektálásaálása� George Luckey 1975-ben fejlesztette ki- Gyors, regenerálható
detektálása a radioaktiv felhalmozódásnak az egyes metszetekben, gélekben, szeletekben stb.
� BaFBr:Eu 2+
Energia csapda
Kiolvasás lazer fénnyel
31
Az izotóppal jelölt biológiailag aktív molekulák szervezeten belüli felhalmozódásának, kiürülésének, kötıdésének
vizsgálata szervi megoszlásos ex vivo állatkísérletekben
- Állatok injektálása a radiofarmakonnal
-Expoziciós idı eltelte után az állatok leölése
-Szervek kipreparálása
Szervek tömege és a radioaktivitás mérése
Gamma számláló, folyadék szcintillációs berendezés
ID%= 1 g szervben mért aktivitás normálva a beadott aktivitásra és a teljes tömegre
32
Szerv 10perc 30perc 45perc 60perc
plazma 0,339±0,060 0,268±0,002 0,198±0,069 0,195±0,029
vérsejt 0,266±0,100 0,189±0,050 0,097±0,030 0,104±0,040
lép 0,390±0,050 0,684±0,177 0,250±0,140 0,638±0,192
agy 0,506±0,100 0,350±0,040 0,280±0,060 0,205±0,030
tüdı 0,778±0,131 0,641±0,080 0,518±0,190 0,494±0,075
szív 1,687±0,314 0,914±0,039 0,747±0,092 0,572±0,039
gyomor 1,450±0,087 1,873±0,849 0,223±0,047 0,243±0,070
vastagbél 0,359±0,204 0,386±0,147 0,307±0,132 0,372±0,051
vékonybél 1,593±0,417 6,907±1,877 3,336±0,131 7,390±2,511
vizelet 1,036±0,411 2,846±1,508 1,779±0,922 4,282±1,347
máj 2,611±0,450 2,959±0,520 2,665±0,519 2,105±0,547
2.táblázat: [11C]ISC szervekben, szövetekben történı akkumulációja, egér modellben
n= 3 (átlag±S.D.)
33
Kutatási szintek egy biológiailag aktív molekula (ligand, gyógyszer)
életében
Alap kutatás Betegség
kutatás
Gyógyszer
felfedezés
Preklinikai
vizsgálatok
Klinikai
trial I,
II, III
Gyártás
Nem szabályozott GLP GCP GMP
(Good clinical practice)
(Good manufacturing practice)
34
In vivo állatkísérletek PET kamerával
35
A legfontosabb pozitron-sugárzó radionuklidok
nuklid T1/2 E keV
alkalmazás
11C 20.4 perc
960 Gyors szintézisben a legtöbb szerves vegyületbe beépíthetı. Nincs gyógy-szertani különbség a jelzett és a jelzetlen molekula között. Az izotóp effektus elhanyagolható.
36
A legfontosabb pozitron-sugárzó radionuklidok
nuklid T1/2 E keV
alkalmazás
13N 10 perc
1190 Gyors szintézis szükséges. N-tartalmú vegyületek esetén a jelzett és jelzetlen vegyület biológiai szempontból azonos. Fı alkalmazása ammónium ionként történik, szívizom perfuzió vizsgálatában.
37
A legfontosabb pozitron-sugárzó radionuklidok
nuklid T1/2 E keV
alkalmazás
15O 2.05 perc
1720 Igen gyors szintézisszükséges. Alkalmazás oxigén gázként, vízként,széndioxidként és n-butanolként az agy és a szívizom vérellatásának vizsgálatában.
38
A legfontosabb pozitron-sugárzó radionuklidok
nuklid T1/2 E keV
alkalmazás
18F 110 perc
635 A legkisebb pozitron energiájú PET izotóp. Igen szép a képalkotás. A fiziológiai folyamatok kvantitatív értékelését is lehetıvé teszi. Sokféle molekulába beépíthetı.
39
Funkcionális vizsgálatok PET izotóppal jelölt biomolekulákkal
Metabolikus anyagforgalom nyomjelzıi:
18FDG, 11C-kolin, 11C-metionin,
Targetspecifikus biomolekulák:
jelzett receptor-ligandok
Perfúziós tracerek:
15O-butanol
13N-ammónia
99mTc-MIBI (SPECT)
40
szív
béltraktus
szív
béltraktus
vese
hólyagtüdı
2. ábra: A receptor ligand aktivitás eloszlása dinamikus PET vizsgálat alatt, nyúlban (szaggitális sikok, transzmissziós vizsgálatra helyezett emissziós képek).
41
MiniPET-2 kamera
DEOEC NMIATOMKIMEDISO KFT
közös fejlesztés
42
MiniPET-2 kamera
Tulajdonságai:
hálózat alapú adatgyőjtés
teljes győrős, 5 cm axiális látóterő kamera
szoftveresen mozgatható ágy
felbontás: ~1mm
kristálytípus: LYSO
kristályméret: 1.27 x 1.27 x 12 mm3
kristályszám: 35 x 35
detektorszám: 12
axiális látómezı : ~50mm43 44
45
Patkány agy CT-FDG
46
A radioaktivitás mértékegységei
• Aktivitás (bomlás/másodperc)• [Bq] Becquerel
•SI mértékegység, 1Bq 1bomlás /másodperc• [Ci] Curie
•1gram tiszta 226Ra aktivitása1Curie=3,7x1010Bq10mCi=400MBq1MBq= 27uCi37MBq=1mCi
47