Izolovanje peroksidaze iz rena Armoracia rusticana (HRP)09.01.2012. Priprema ekstrakta HRP 800g opranog (neoljutenog) rena sam iseckala i u porcijama homogenizovala u blendoru sa ukupno 1.2L destilovane vode. Materijal sam procedila kroz gazu tako to sam rukama u rukavicama istisnula tenost. Ostatak (vrstu masu) sam reekstrahovala u 700-900mL destilovane vode i ekstrakt i reekstrakt spojila. Ukupna zapremila bila je 2.1L. Iz tog ekstrakta uzela sam alikvot od 1mL,centrifugirala ga 2 min na 14000 o/min u mikrofugi, odbacila talog i rastvor stavila u friider za odreivanje koncentracije proteina i odreivanje enzimske aktivnosti. U ekstrakt sam dodala 5 kapi toluena i stavila ga u friider da odstoji preko noi. Odreivanje koncentracije proteina Bradford-ovom metodom Potrebni rastvori (pravljeni po protokolu iz praktikuma): Rastvor 1: Koncentrovana boja Coomassie brilliant blue G-250 (CBB G-250) CBB G-250 100mg 95% etanol 50mL H3PO4 100mL Vode do 200mL Boja se rastvori u etanolu pa se dodaju kiselina i voda do finalne zapremine. Rastvor 2: Bradfordov reagens (BR) Rastvor 1 100mL Vode do 500mL Tabela za standardnu krivu u opsegu 20-150g u 100L tj. 0.2-1.5 mg/mL : BSA (1mg/mL) L 5 10 20 30 40 50 Postupak: Voda L 45 40 30 20 10 50 BR-a mL 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 Finalna koncentracija (g/mL) 100 200 400 600 800 1000 -

U 50L rastvora dodala sam 2.5 mL razblaenog rastvora boje. Promeala na vortex-u i nakon 5 min snimila apsorbancu na 595nm. Ovom metodom odreivala sam koncentraciju proteina u sirovom ekstraktu, kad nije bio razblaen i kada je razblaen 10, 100 i 1000 puta. Rezultati:

Equation Weight

y = a + b*x No Weighting 0.00553 0.99266 0.98171 Value Standard Error 0.02892 4.76564E-5 Intercept Slope -0.02647 7.82192E-4

0.8 0.7 0.6 0.5

Residual Sum of Squares Pearson's r Adj. R-Square A A

A

0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0 200 400 600 800 1000

c (g/mL)

c(g/mL) 100 200 400 600 800 1000

A 0.034 0.149 0.271 0.491 0.553 0.768

Jednaina prave: y=7.82192E-4x 0.02647 Uzorak Sirovi ekstrakt 10xR 100xR 1000xR A 0.761 0.069 0.034 c(g/mL) 5.5 0.66 0.422

Odreivanje enzimske aktivnosti peroksidaze Za odreivanje enzimske aktivnosti pravila sam sledee rastvore: 100 mM Fosfatni pufer pH 7 200mL Pufer sam napravila tako to sam rastvorila 2.76 g NaH2PO4 u oko 150 mL destilovane vode, dodala NaOH prvo u granulama do pH 5.93 i onda dotitrovala 1M NaOH do pH 7 i dopunila vodom do 200mL,pH se nije promenio. Rastvor pufera se sve vreme meao na magnetnoj mealici. 2.30% rastvor H2O2 sam razblaila jer ja A na 240nm bila 20.01,tako to sam 130L rastvorila u 100mL destilovane vode,nakon ega je A bila 0.765, pa sam to razblaila jo 2 puta odnosno dodala 100 mL vode, nakon ega je A bila 0.392. 3. Rastvor gvajakola-iz 24 mL destilovane vode uzela sam alikvod od 58.8L, a potom dodala istu koliinu gvajakola u kapima uz konstantno meanje na magnetnoj mealici. Ekstrakt(supernatant od alikvota prethodno odvojenog za odreivanje enzimske aktivnosti) sam razblaila 10,100, 1000, 10 000, 100 000 puta destilovanom vodom. U 5 epruvete sipala sam po 2.8 mL pufera, 50L ratvora gvajakola, 50L H2O2 i 100L odgovarajueg razblaenja enzima nakon ega sam merila promenu apsorbance na 436nm na svakih 10s tokom 1 min.Najbolje rezultate sam dobila za 10 puta razblaeni enzim, pa sam te podatke koristila za odreivanje enzimske aktivnosti po formuli: U/mL=((A436/min *4*Vrs )/(25.5*Ve))*R Vrs(zapremina reakcione smee)=3mL Ve(zapremina rastvora enzima)=100L R-razblaenje Rezultat: A436=0.248 R=10 -- U/mL=11.67 Nastavak (10.01.2012) Sirovi ekstrakt centrifugirala sam 20 min 3200 o/min da se izbistri rastvor. Zapremina supernatanta bila je 2050 mL(S1). Talog sam prebacila u plastinu kivetu i stavila u zamrziva. Taloenje amonijum-sulfatom Rastvor S1 zasitila sam vrstim amonijum-sulfatom (koji sam prethodno sprasila u avanu s tukom-koliina 1kg) 40%-og zasienja. Koliinu amonijum-sulfata koju sam dodala, preraunala sam iz tabele taloenja zasienim amonijum-sulfatom koja nije bila iz protokola: koliina AS-a za 40% zasienje na 100 mL rastvora= 22.6g 22.6 g : 100 mL=x : 2050 mL x=463.3g

Na 2.05L polako sam dodavala AS i nakon dodavanja meala 1 h,iako je trebalo 30 min, zbog nedostupnosti centrifuge. Nakon 1h meanja rastvor sam centrifugirala 20 min 3200 o/min. Nakon centrifugiranja, supernatant (S2) sam prebacila u au,zapremina je bila 2030mL jer mi se 1 kiveta malo izvrnula u centrifugi,pa sam tako izgubila oko 100 mL S2. Talog sam prebacila u plastinu kivetu i stavila u zamrziva. Supernatantu sam polako dodala vrst amonijum-sulfat do 80% zasienja (koliinu amonijum-sulfata koju sam dodala prereunala sam iz iste tabele kao u prvom sluaju): koliina AS-a za 80 % zasienje na 100mL rastvora=26.3g 26.3g : 100 mL= x : 2030 mL x= 533.9 g Na 2.03L polako sam dodavala AS i nakon dodavanja, meala 45 min,i zbog nedostupnosti centrifuge ostavila rastvor u friider da odstoji preko noi. Za ujutru sam pripremila crevo za dijalizu tako to sam crevo prvo oprala esmenskom vodom, a zatim ga stavila da se kuva 10 min na 600C u 300 mL 50mM NaHCO3 i 5mM EDTA. Nakon kuvanja (aktiviranja), crevo sam spolja i iznutra isprala prvo esmanskom vodom a zatim destilovanom vodom 12 puta. Crevo sam stavila u etanol da bi ga sutra koristila za dijalizu. 11.01.2012. Rastvor S2 (koji sam ostavila da stoji preko noi u friideru) sam centrifugirala 20 min 3200 o/min. Supernatant sam sauvala da bi kasnije izmerila zapreminu a odatle sam uzela alikvot od 50 mL za analize. Talog (T3) sam resuspendovala u 47 mL destilovane vode i stavila u crevo za dijalizu, koje sam pripremila dan pre. Dijalizovala sam rastvor naspram 5L destilovane vode 6 sati, zatim 4 sata naspram 5L 5mM acetatnog pufera pH 4.6, a onda ponovo naspram 5L istog acetatnog pufera preko noi. Pre svake izmene uzela sam alikvot prethodnog rastvora za analize. Priprema kolone za jonoizmenjivaku hromatografiju 1. Postavila sam kolonu (pric od 50mL) u klemu, koja je privrena za stalak. 2. Zatvorila sam izlaz kolone crevom sa regulatorom protoka. 3. Kao porozno dno koristila sam vatu. U kolonu sa vatom sipala sam oko 40 mL destilovane vode i meala staklenim tapiem da bih isterala vazduh iz vate. 4. Nakon 20 min meanja, ispustila sam oko 20 mL destilovane vode, da se vata ne bi osuila, odnosno da ne bi dola u kontakt s vazduhom. 5. Suspenziju CMC (karboksi-metil celuloza) sipala sam lagano niz stakleni tapi do 50-60 mL i ekala da se slegne. Kada se matriks slegao (oko 10 mL), polako sam ispustila rstvor do 10 mL iznad matriksa, zatim dodala novu koliinu suspenzije, i tako ponavljala oko 2-3 sata dok se nije napakovalo 50 mL matriksa. 6. Vrh kolone zatvorila sam epom sa iglom na koju sam zakaila crevo sa regulatorom protoka i ekvilibrisala je prvo sa 100 ml destilovane vode, a zatim sa 5mM acetatnim puferom pH 4.6. Kada je prolo oko 200 mL pufera izmerila sam pH pufera na izlazu kolone= 3.61. Tih 200 mL sam bacila a u meuvremenu sam kroz kolonu i dalje ekvilibrisala istim puferom. Nakon sledeih 200 mL pH pufera na izlazu kolone bio je 4.1. Napravila sam novu koliinu (1L) istog pufera, dosipala u au, i ostavila da se ekvilibrie preko noi.

12.01.2012. Kolona za jonoizmenjivaku hromatografiju se ekvilibrisala preko noi. pH pufera na ulazu kolone bio je 5.1, a na izlazu kolone 4.65. Izmerila sam i rastvor uzorka (koji sam dan pre dijalizovala; V=96 mL, kasnije je razbaen do 102 mL zbog gel filtracije), pH je bio 4.7. Zatim sam izmerila konduktivitet pufera na ulazu kolone, pufera na izlazu kolone i uzorka: konduktivitet uzorka= 880 S/cm konduktivitet pufera na izlazu kolone= 225 S/cm konduktivitet pufera na ulazu kolone= 194.2 S/cm Poto je konduktivitet uzorka bio veliki, poela sam sa pripremom kolone za rasoljavanje uzorka (gel-filtracija). Priprema kolone za rasoljavanje (gel-filtracija): 1.Postavila sam kolonu (dimenzija 3.8cm x 30cm) u klemu koja je privrena za stalak. 2. Zatvorila sam izlaz kolone crevom sa regulatorom protoka. 3. Kao porozno dno koristila sam vatu. U kolonu sa vatom sipala sam oko 30 mL destilovane vode i meala staklenim tapiem da bih isterala vazduh. 4. Nakon 5-10 min meanja ispustila sam vodu do oko 10 cm iznad vate da se ne bi osuila,odnosno da ne bi dola u kontakt s vazduhom. 5. Suspenziju Sephadex-a G-25 dezaerisala sam na vakumu (kada se slegao), i nanela na kolonu niz stakleni tapi. Kada se gel malo slegao, ispustila sam destilovanu vodu (u kojoj je Sephadex G-25 bio suspendovan) do oko 10 cm iznad gela, zatim dodala novu koliinu gela i ponavljala postupak isputanja rastvora i dodavanja gela dok se kolona nije napakovala. Zapreminu kolone izraunala sam na sledei nain: R=3.8cm ; r= 3.8cm/2=1.9cm h=18 cm =3.14 V=r2h= 1.92 x 3.14 x 18= 204 cm3=Vt 6.Na kolonu sam nanela plavi dextran tako to sam prvo ispustila vodu tako da je iznad gela nije bilo i dodala onu koliinu plavog dekstrana jednaku etvrtini zapremine kolone: 100% : 204 cm3= 25% : x x= 51 mL i dodala jo 10% ,odnosno, 56.1 mL(Ve) 7.Merila sam zapreminu rastvora od ulaska plavog dekstana do prve kapi plavog dextrana koja je sila sa kolone, nakon ega sam zaustavila eluciju, da bih znala kada da ponem da skupljam frakciju svog uzorka (V0= 86 mL). 8. Kada je plavi dekstran siao sa kolone, eluirala sam kolonu puferom zapremine Vt=204mL. 9. Nanela sam 56.1 mL uzorka na kolonu, i ponovila postupak kao sa plavim dekstranom. 10. Kada je uzorak siao sa kolone, propustila sam jo 1 zapreminu pufera i ostavila kolonu sa puferom 5 cm iznad gela, zatvorenu folijom, za zaustavljenim protokom i sigurnosnom petljom da stoji preko noi.

13.01.2012. Jonoizmenjivaka hromatografija 1. Dijalizovani, rasoljeni uzorak sam nanela na kolonu koju sam pripremila i ekvilibrisala 5mM acetatnim puferom pH 4.6 11.01.2012. , pri protoku 47 mL/h. 2. Kisele peroksidaze eluirala sam 5mM acetatnim puferom pH 4.6 i skupljala frakcije 3x44mL, odnosno 3 zapremine kolone (zapremina kolone se u roku od 36 sati smanjila za 6 mL). 3. Vezane(bazne) proteine eluirala sam prvo 50mM acetatnim puferom pH 4.6, 3 zapremine kolone(132mL), zatim 30mM fosfatnim puferom pH 7.39 2 zapremine kolone(88 mL), i na kraju 30mM fosfatnim puferom, Na2HPO4. Skupljala sam frakcije od po 5mL. 4. Radila sam spot-test za svaku drugu frakciju (1,3,5,7 itd.) da bih detektovala u kojim se frakcijama nalaze enzimi, odnosno bazne peroksidaze. Spot-test U mikrotitar ploice nanela sam 50L svake druge frakcije. U ai od 250 mL pomeala sam 30 mL 100mM natrijum fosfatnog pufera pH 7.2, 30mL 0.02M gvajakola i 30 mL 0.0065M H2O2. Zatim sam automatskom pipetom nanela po 75L navedenog rastvora u svaki bunar u mikrotitar ploici. Narandasto-crvenkasta boja ija pojava pokazuje da uzorak ima enzimsku aktivnost, se javila u svim frakcijama osim u prvih 4 koje sam eluirala prvim puferom (50mM acetatni pufer pH 4.6), odnosno u prvih 7 frakcija nije bilo enzima (jer sam u mikrotitar ploicu nanosila svaku drugu frakciju), pa sam te frakcije bacila, a ostale spakovala u zamrziva kao i nevezane proteine. Nakon zavrene hromatografije kolonu sam regenerisala sa 2 zapremine (88mL) 0.5M NaCl-om, zatvorila je epom i ostavila da stoji preko vikenda. 16.01.2012. Uzorke koje sam ostavila u zamrzivau preko vikenda, odmrzla sam i u svakoj treoj frakciji odreivala enzimsku aktivnost i koncentraciju proteina. Frakcije broj 8,11 i 14 eluirane 50mM acetatnim puferom pH 4.6 razbaila sam 10 puta, kao i frakcije 13 i 16 eluirane 30mM fosfatnim puferom, Na2HPO4. Ostale frakcije razblaila sam 50 puta. Odreivanje enzimske aktivnosti U epruvete sam sipala 2.8mL Na-fosfatnog pufera pH 7, 50L 0.002M gvajakola, i 100L svog uzorka, i nakon dodatka 50L 0.0065M H2O2 pratila promenu apsorbance tokom 90s na 436 nm. Beleila sam A na svakih 60s.Iz sledee jednaine izraunala sam enzimsku aktivost u svakoj treoj frakciji: U/mL=((A436/min *4*Vrs )/(25.5*Ve))*R Vrs(zapremina reakcione smee)=3mL Ve(zapremina rastvora enzima)=100L R-razblaenje (prve 3 i poslednje 2 R=10; ostale-R=50)

Broj frakcije/br.odgovarajueg pufera 8/4 11/4 14/4 17/4 20/4 23/4 26/4 1/5 4/5 7/5 10/5 13/5 16/5 1/6 4/6 7/6 10/6 13/6 16/6

A436/min

A595

0 0.002 0.002 0.075 0.311 0.243 0.136 0.099 0.063 0.060 0.018 0.018 0.006 0.009 0.005 0.003 0 0.007 0.001

0.040 0.037 0.042 0.039 0.037 0.026 0.031 0.033 0.034 0.031 0.031 0.036 0.044 0.085 0.062 0.055 0.029 0.053 0.037

Konc. proteina (mg/mL) 0.616 0.590 0.632 3.037 2.953 2.491 2.701 2.785 2.810 2.701 2.701 2.911 3.247 4.970 4.003 3.709 2.617 0.725 0.590

Enzimska Specifina aktivnost aktivnost (U/mL) (U/mg) 0 0 0.094 0.1593 0.094 0.1487 17.6 5.795 73.17 24.77 57.17 22.95 32 11.84 23.29 8.36 14.82 5.274 14.11 5.224 4.23 1.566 4.23 1.453 1.41 1.434 2.11 0.424 1.17 0.292 0.705 0.190 0 0 1.647 2.27 0.235 0.428

4- 50mM acetatni pufer pH 4.6 5- 30mM fosfatni pufer pH 7.39 6- 30mM natrijum fosfatni pufer,Na2HPO4 Odreivanje koncentracije proteina U 2.5 mL Bradfordovog reagensa sipala sam 50L uzorka, ostavila da stoji 30min i nakon toga merila apsorbancu na 595nm. Koncentraciju proteina izraunala sam po sledeoj jednaini prave: y=0,00119x 0.03329 y-A595 x- koncentracija proteina (g/mL)

Iz dobijenih rezultata izraunala sam specifinu aktivnost, da bih videla koje frakcije da spajam a koju da preiavam gel-filtracijom. Frakcije iji su rezultati podebljani su one koje u sutra da spojim tako to u iz svake druge uzeti po alikvot od 0.5mL, a frakciju 20/4 u preistiti gel-filtracijom. Uzorke sam ostavila u friideru da stoje preko noi, usled nedostatka vremena za dalji rad. Slika hromatograma dobijenog nakon IEC na CMC-u:

25

Specificna aktivnost (U/mg)

20

15

10

5

0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Broj frakcije

17.01.2012. Iz svake druge frakcije, ije su vrednosti za specifinu aktivnost bile najvee, uzela sam alikvote od po 0.5mL i ostavila za npr. izoelektrino fokusiranje. Ostale frakcije sam spojila. Gel-hromatografija na Sephadex-u G-100 1. Uzorak za gel filtraciju (frakcija 20/4) sam spojila sa uzorcima koleginica (ukupno 15mL). 2. Prethodno pripremljenu i kalibrisanu kolonu, dimenzija 2.8cm x 60 cm napunjenu Sephadex-om G-100, ekvilibrisala sam 5mM acetatnim puferom, 50mM NaCl, pH 5.71. V0=96mL Vt=369mL 3. Kada je prolo 96 mL od nanoenja uzorka, skupljala sam frakcije od po 5 mL. Kada sam skupila 32 frakcije, uradila sam spot-test. Spot-test

U bunare mikrotitar ploice nanela sam po 50L svake frakcije i 25L 100mM Na-fosfatnog pufera pH 7.09. Pomeala sam 12mL 0.002M gvajakola i 12mL 0.0065M H2O2 i dodavala u svaki bunar po 50L tog rastvora da bih videla u kojim se frakcijama nalazi peroksidaza. Narandasta boja ija pojava pokazuje da uzorak ima enzimsku aktivnost javila se u frakcijama 9-12 i 14-21,u ostalim se ili javila kasnije ili je nije bilo. Sve frakcije sam stavila u friider da stoje preko noi. 18.01.2012. U frakcijama koje sam sacuvala u friideru odreivala sam enzimsku aktivnost i koncentraciju proteina da bih izraunala specifinu aktivnost i tako odredila koje frakcije da nanosim na gel za izoelektrino fokusiranje.Enzimsku aktivnost odreivala sam isto kao do sad kao i koncentraciju proteina, u svakoj drugoj frakciji. Odreivanje enzimske aktivnosti 100L uzorka 2.8mL 100mM Na-fosfatnog pufera pH 7 50L 0.002M gvajakola 50L H2O2 Merila sam promenu A na 436 nm tokom 1min. U/mL=((A436/min *4*Vrs )/(25.5*Ve))*R Vrs(zapremina reakcione smee)=3mL Ve(zapremina rastvora enzima)=100L R-razblaenje Rezultati: Broj epruvete (frakcije) 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 Enzimska aktivnost (U/mL) 0 0 0 0 2.49 15.01 29.83 27.95 20.42 4.70 0.941 3.2 1.97 0.65 0.37 Koncentracija proteina (mg/mL) 0 0 0 0 0 0 0.196 0.350 0.281 0.119 0.073 0.004 / / / Specifina aktivnost (U/mg) 0 0 0 0 0 0 152.2 79.85 72.66 39.49 12.89 800(?) / / /

31 33 Odreivanje c proteina 2.5mL BR 50L uzorka Merila sam A na 595 nm Jednaina prave: y= 0.0013x 0.0747

0.42 0.18

/ /

/ /

Od frakcija 13-25 uzela sam alikvot od po 0.5mL i ostavila za izoelektrino fokusiranje. Navedene frakcije koristila sam kao uzorke za izoelektrofokusiranje, pre nego da koleginica napravi standardnu pravu i stoga nisam mogla da odmah preraunam Sp, pa sam na osnovu enzimske aktivnosti odredila koje u frakcije kasnije koristiti kao uzorke za IEF. Izoelektrofokusiranje Priprema gela: 3.75 mL akrilamida 0.75 mL amfolita pH opsega 3-10 4 mL glicerola (50%) 6.5 mL vode 12 L temed-a (katalizator reakcije polimerizacije) 75 L APS APS je inicijator polimerizacije, pa sam ga dodala pre nego da sipam gel izmeu ploa, koje su spojene spejserima tako da dno bude ravno da rastvor (gel) ne bi cureo. Rastvor za polimerizaciju sam nadslojila n-butanolom da bi se spreio ulazak kiseonika kao radikala. Nakon 1h, koliko je potrebno da rastvor polimerizuje, ploe koje dre gel se otvaraju u jednom cugu tako da ne nastane mehur na gelu i postavljaju se elektrodni papiri 1mm od ivice gela. Elektrodni papiri se umoe u elektrodne rastvore: Anodni- 75mM H2SO4 Katodni- 150mM NaOH Zatim se blotuju na papirnom ubrusu do suva i tek onda stave na gel. Preko elektrodnih papira se postavljaju elektrode i ukljuuje se struja. Pre toga se na sredinu gela nanose uzorci (po 10 L). IEF traje oko sat i po, nakon ega se iskljuuje struja, vade se papirne elektrode, polako, da ne bi povukle gel sa sobom, i onda se noiem sastrue gel sa ploa i ispire destilovanom vodom. Uzorke sam sa ostalim koleginicama koje izoluju peroksidaze nanosila na gel sledeim redosledom: 1. Dijalizat 1-kisele peroksidaze 2. Uzorak posle IEC na Q-Sepharozi-kisele peroksidaze 3. Dijalizat 2 kisele peroksidaze 4. Dijalizat 3 kisele peroksidaze 5. Dijalizat 4-uzorak posle rasoljavanja,pre IEC 6. 13. Frakcija posle GF-bazne peroksidaze

7. 15.frakcija posle GF-bazne peroksidaze 8. 17.frakcija posle GF-bazne peroksidaze 9. 19.frakcija posle GF-bazne peroksidaze 10. 21.frakcija posle GF-bazne peroksidaze 11. 23.frakcija posle GF-bazne peroksidaze 12. 25.frakcija posle GF-bazne peroksidaze

Rezultat:

Na donjoj polovini gela su kisele peroksidaze, na gornjoj polovini bazne peroksidaze. Vidi se da su u uzorcima 1 i 5 dijalizati, jer ima i baznih i kiselih peroksidaza. 19.01.2012. SDS elektroforeza u homogenom i gradijentnom gelu Rastvori i priprema: 1. Monomerni rastvor: Akrilamid 58.4g Bisakrilamid 1.6g Voda do 200mL 2. Pufer za razdvajajui gel (1.5M Tris HCl pH 8.8 ) Tris 36.3g Voda do 200mL 4M HCl do pH 8.8

3. Pufer za koncentrujui gel (0.5M Tris HCl pH 6.8) Tris 6g Voda do 100Ml 4M HCl do pH 6.8 4. Rastvor detergenta (10% SDS) SDS 10g Voda do 100mL 5. APS (inicijator) APS 0.2g Voda do 2mL 6. Rastvor za nadslojavanje (n-butanol) n-butanol 100 mL voda do formiranja 2 sloja 7. Pufer za obradu uzoraka (PUZ): 0.5M Tris HCl pH 6.8 85% glicerol 10% SDS 0.1% brom fenol plavo Voda do -ME

9.38mL 9 mL 1.5g 1.5 mL 21.25 mL 3.75 mL

8. Pufer za elektroforezu (0.025M tris, 0.192M Gly, 0.1%SDS pH 8.3) Tris 3g Glicin 14.4g 10% SDS 10mL Voda do 1L 9. Rastvor za fiksiranje, bojenje i obezbojavanje Metanol 0.5L Siretna kiselina 0.1L Voda do 1L 10.Rastvor boje CBB G 0.5g Rastvor 9 do 500 mL 11.Rastvor za obezbojavanje Metanol 50mL Siretna kiselina 70 mL Voda do 1L Gradijentni gelovi :

Gel za razdvajanje: AA 10mL Tris pH 8.8 (rastvor 2) 7.5mL Voda 12.05mL TEMED 10L Dezaeracija 5-10min SDS 0.3mL APS 0.15mL Gel za koncentrovanje: AA 0.4mL Tris pH 6.8 (rastvor 3) Voda 1.8 mL TEMED 8L Dezaeracija 5-10min SDS 30L APS 15L

0.75mL

Priprema uzoraka U ependorfe sam sipala 40L odgovarajueg uzorka i 20L pufera za uzorke, i kuvala 3 min u kljualoj vodi. Prvo sam sipala rastvor gela za razdvajanje izmeu ploa, nakon ega sam gel nadslojila rastvorom 6, da bi se spreio ulazak kiseonikovih radikala pri reakciji polimerizacije(inicijatorAPS se dodaje pre nanoenja gela izmeu ploa tako da gel polimerizuje izmeu ploa). Kada je polimerizacija gela za razdvajanje bila zavrena, rastvor n-butanola sam prosula i isprala destilovanom vodom. Zatim sam sipala koncentrujui gel, stavila ealj u rastvor i ostavila da polimerizuje. Nakon polimerizacije, ealj, koji je formirao bunare, sam izvadila i u svaki bunar nanela po 20L odgovarajueg uzorka sledeim redosledom: 1.Sirovi ekstrakt 2.Ekstrakt posle 40% zasienja amonijum-sulfatom 1 (20xR) 3.Ekstrakt posle 40% zasienja amonijum-sulfatom 2 (moj uzorak/ 100xR) 4.Rasoljeni uzorak posle dijalize 5.Najaktivnija frakcija posle IEC 1 6.Najaktivnija frakcija posle IEC 2 (moj uzorak-21/4) 7.Frakcija br 13 posle GF 8.Frakcija br 15 posle GF 9.Frakcija br 17 posle GF 10.Markeri Kada sam nanela uzorke plou sam stavila u kadu sa puferom za elektroforezu (rastvor 8), povezala elektrode i ukljuila struju (80V). Kada se elektroforeza zavrila (uzorci su stigli do kraja gela, to se vidi zbog sastava rastvora 7-brom fenol plavo), struja se iskljuuje, ploe se vade i razdvajaju u jednom cugu , gel se sastrue sa ploa noiem i stavlja u staklenu olju.

Detekcija proteinskih traka Ispiranje- destilovana voda 1 min Fiksiranje-rastvor 9; 20 min Bojenje-rastvor 10; 20 min Obezbojavanje-rastvor 9; 20 min Poto su se nakon obezbojavanja trake na gelu jedva videle, primenjuje se tehnika bojenja srebrom. Detekcija proteinskih traka bojenjem srebrom Rastvori Ispiranje destilovanom vodom 50% metanol, 20% TCA, 2% CuCL2 10% etanol, 5% siretna kiselina 0.01% KMnO4 Ispiranje 2 puta destilovanom vodom 10% etanol, 5% siretna kiselina 10% etanol Ispiranje 2 puta destilovanom vodom Destilovana voda 0.1% AgNO3 Ispiranje destilovanom vodom 10% K2CO3 2% K2CO3, 0.01% formaldehid (50L) 10% etanol, 5% siretna kiselina Ispiranje destilovanom vodom Rezultat: Vreme (min) 1 15 10 10 1 10 10 1 10 10 20s 1 Do pojave traka(oko 6 min) 20s 20s

Gel je pri prebacivanju u staklenu olju obrnut, tako da se sa ove slike redosled nanoenja uzoraka ita s desna na levo, odnosno poslednji uzorak-markeri su ovde prva traka, frakcija br 17 posle GF druga traka..itd.

20.01.2012.Izolovanje plazmidne DNA (E. coli pBluescript KS)

U ependorficu, u kojoj je ve bio pripremljen talog bakterija E. coli (pripremljen po protokolu koji je dat u praktikumu-Zoran Vuji, Eksperimentalna Biohemija, Praktikum. Rantek, 2002., strane 154-156) sam dodala 0.1 mL rastvora 2 (50 mM glukoza, 35 mM tris, 10 mM EDTA, pH 8.0) i vorteksovala. Ependorficu sam stavila u led i nakon 1 min dodala 0.2 mL rastvora 3 (0.2 m NaOH, 2% SDS) i promeala. Zatim sam dodala 0.15 mL rastvora 4 (5 M kalijum acetat 60 mL, glacijalna siretna kiselina 11.5 mL, voda 28.5 mL) i promeala. Rastvor sam inkubirala 5 minuta na ledu a zatim centrifugirala 10 minuta na 10000 obrtaja. Supernatant sam mikropipipetom prebacila u novi ependorf, dodala 2 L rastvora 5 (0.1 mg RNA-za i voda do 0.1 mL) i inkubirala tokom 2 asa na 37oC. Nakon inkubiranja sam u ependorf dodala jednaku zapreminu rastvora 6 ( 50 mL fenola, 50 mL hloroforma) i vorteksovala, a potom centrfugirala 10 minuta na 10000 obrtaja. Gornji vodeni rastvor sam mikropipetom prenela u novi ependorf i dodala istu zapreminu izopropanola, promeala i drala 10 minuta na sobnoj temperaturi (da se DNA istaloi). Ponovo sam centrifugirala 5 minuta na 10000 obrtaja i mikropipetom ukonila supernatant. Dodala sam 70% etanol, blago promeala i centrifugirala 5 minuta na 10000 obrtaja. Ependorf sam izvrnula da se rastvor ocedi i talog prosui. U talog dodala 20 L destilovane vode, stavila u friider, i kasnije uzorak nanela 10 L rastvora uyorka na gel i dodala 2 L boje.

Na prethodno napravljeni gel (po protokolu iz praktikuma-Zoran Vuji, Eksperimentalna Biohemija, Praktikum. Rantek, 2002., strane 157) nanela sam mikropipetom 10 L uzorka. Rezultati dobijeni nakon bojenja gela etidijum bromidom: