iuniversidade de sÃo paulo - university of são paulo
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IUNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO
FACULDADE DE CIEcircNCIAS FARMACEcircUTICAS
Programa de Poacutes-graduaccedilatildeo em Tecnologia Bioquiacutemico-Farmacecircutica
Aacuterea de Tecnologia de Fermentaccedilotildees
Cultivo descontiacutenuo alimentado de Arthrospira (Spirulina) platensis em
reator tubular utilizando ureacuteia como fonte de nitrogecircnio e CO2 puro ou
proveniente de fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Raquel Pedrosa Bezerra
Tese para obtenccedilatildeo do grau de DOUTOR
Orientadores Prof Dr Joatildeo Carlos Monteiro de Carvalho Prof Dr Attilio Converti
Satildeo Paulo
2010
2
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Raquel Pedrosa Bezerra
Cultivo descontiacutenuo alimentado de Arthrospira (Spirulina) platensis em
reator tubular utilizando ureacuteia como fonte de nitrogecircnio e CO2 puro ou
proveniente de fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Comissatildeo Julgadora da
Tese para obtenccedilatildeo do grau de doutor
Prof Dr Joatildeo Carlos Monteiro de Carvalho
orientadorpresidente
Prof Dr Attilio Converti Co-orientador
____________________________
1o examinador
____________________________ 2o examinador
____________________________ 3o examinador
Satildeo Paulo de de 2011
4
Agrave minha famiacutelia que eacute a alegria da minha
vida e me incentiva a seguir esse caminho
5
AGRADECIMENTOS
Ao Prof Dr Joatildeo Carlos Monteiro de Carvalho pela orientaccedilatildeo dedicaccedilatildeo
confianccedila amizade incentivo e paciecircncia que recebi durante os 6 anos de
convivecircncia no laboratoacuterio
Ao Prof Dr Attilio Converti pela orientaccedilatildeo apoio e confianccedila principalmente
durante minha estadia na Itaacutelia
Ao Prof Dr Sunao Sato chefe do setor de Tecnologia de Fermentaccedilotildees do
Departamento Bioquiacutemico-Farmacecircutica da Universidade de Satildeo Paulo-Brasil
Ao Prof Dr Adalberto Pessoa Juacutenior Profa Dr Ana Luacutecia Figueiredo Porto e
Prof Dr Adilson de Castro Chaves pela indicaccedilatildeo do laboratoacuterio e confianccedila
depositada em meu trabalho
Agrave FAPESP pelo auxiacutelio financeiro que permitiu a execuccedilatildeo desse trabalho
Agrave CAPES pela oportunidade de realizar o doutorado sanduiche na Itaacutelia
contribuindo para meu desenvolvimento pessoal e cientiacutefico
Aos meus pais Irene V P Bezerra e Adesson P Bezerra a minha irmatilde ao
meu cunhado e ao meu namorado Paulo Claudino Veacuteras pelo incentivo apoio
confianccedila e felicidade durante todo esse tempo
Aos meus amigos pernambucanos Fernanda Borba Eduardo Correia Anne
Priscila Croacutecia e Anabel Helena que mesmo distante sempre me incentivaram e a
minha amiga Ceacutelia Bolognesi pelos conselhos e palavras de conforto nos momentos
difiacuteceis
A todos os amigos Liacutevia Seno Ciacutenthia Hoch Ana Morocho Mayla Rodrigues
pelo apoio e carinho que me proporcionou durante a poacutes-graduaccedilatildeo e em especial a
Marcelo Chuei Matsudo
As secretaacuterias da poacutes-graduaccedilatildeo do Deptordm de Tecnologia Bioquiacutemico-
Farmacecircutico (FCF-USP) pela dedicaccedilatildeo apoio e por estarem sempre disponiacutevel
para ajudar e aos secretaacuterios da poacutes-graduaccedilatildeo Elaine Midori Ychico e Jorge Alves
de Lima
Aos funcionaacuterios da Biblioteca do Conjunto das Quiacutemicas pela atenccedilatildeo e
disponibilidade de ajuda sempre que precisei
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RESUMO
A cianobacteacuteria fotossintetizante Arthrospira platensis eacute conhecida por apresentar
em sua biomassa altos teores proteacuteicos (50-70) presenccedila do aacutecido graxo essencial -
linolecircnico e diversas outras substacircncias importantes para a alimentaccedilatildeo humana e
animal Esses micro-organismos satildeo capazes de converter o CO2 em biomassa de
grande potencial na aacuterea de alimentos Durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica a produccedilatildeo de
CO2 eacute da mesma ordem de grandeza da produccedilatildeo de etanol e considerando a crescente
demanda interna e externa por esse combustiacutevel seria importante que houvesse um
processo que fixasse esse CO2 transformando-o em um produto que poderia ser uacutetil para
a nossa populaccedilatildeo Adicionalmente o uso de uma fonte de nitrogecircnio de baixo custo
(ureacuteia) em reatores tubulares contribuiria para a reduccedilatildeo do custo de produccedilatildeo da A
platensis O objetivo desse trabalho foi avaliar os paracircmetros cineacuteticos e bioenergeacuteticos
bem como a composiccedilatildeo centesimal da A platensis cultivadas em biorreator tubular
alimentados com CO2 proveniente de fermentaccedilatildeo alcooacutelica ou com utilizaccedilatildeo de CO2 puro
para o controle do pH sob diferentes intensidades luminosas (I) e fontes de nitrogecircnio (N)
adicionadas por meio de processo descontiacutenuo alimentado Os resultados mostraram que
maiores valores de I proporcionaram maiores valores de concentraccedilatildeo celular maacutexima
(Xm) e produtividade em ceacutelulas (Px) mas natildeo influenciaram nos valores do fator de
conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) As diferentes fontes de CO2 natildeo influenciaram
nos valores de Xm Px YXN O uso da ureacuteia aumentou os valores de YXN em relaccedilatildeo aos
cultivos com NO3- Na composiccedilatildeo centesimal pode-se observar que I influenciou nos
teores de clorofila proteiacutenas e lipiacutedios mas natildeo influenciou nos teores de cinzas e
carboidratos na biomassa final Em relaccedilatildeo aos paracircmetros bioenergeacuteticos dos cultivos
com CO2 puro observou-se que os maiores valores de dissipaccedilatildeo de energia de Gibbs
foram obtidos em tempos mais curtos a 120-240 μmol de foacutetons m-2 s-1
independentemente do N selecionado enquanto que o nuacutemero de moles de foacutetons
absorvidos pelas ceacutelulas para produzir um C-mol de biomassa foi maior nas culturas com
NO3- independentemente do I As fraccedilotildees da energia direcionada para a siacutentese de ATP e
fixada pela ceacutelula foram superiores em culturas com ureacuteia quando comparadas com as
culturas com NO3- que se revelou uma fonte de nitrogecircnio capaz de sustentar o
crescimento energicamente da A platensis
Palavras chaves Arthrospira platensis processo descontiacutenuo alimentado ureacuteia
intensidade luminosa dioacutexido de carbono fermentaccedilatildeo alcooacutelica bioenergeacutetica
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ABSTRACT
Photosynthetic cyanobacterium A platensis contains in its biomass high protein
content (50-70) -linolenic acid and many other substances important for health
human These microorganisms are capable of converting CO2 into biomass of great
potential in the food industry During the alcoholic fermentation the production of
CO2 has the same magnitude of the production of ethanol Considering the
increasingly global demand for this fuel a process to fix this CO2 is of utmost
importance Furthermore the use of low cost nitrogen source (urea) in tubular
reactors would contribute to reducing the production cost of A platensis Therefore
the purpose of this work was to evaluate the kinetic and bioenergetics parameters as
well as the chemical composition of biomass obtained in A platensis cultures in
tubular bioreactor using CO2 from alcoholic fermentation or pure CO2 to control the
pH under different light intensity (I) and nitrogen sources (N) The results showed that
higher I induced higher maximum cell concentration (Xm) and cell productivity (Px)
values but it did not exert any influence on the nitrogen-cell conversion factor (YXN)
Urea increased the YXN values compared to use of NO3- In the centesimal
composition of biomass it can be observed that I influenced the chlorophyll protein
and lipid contents but not influenced the carbohydrate and ash contents For
bioenergetics parameters it was observed that the highest Gibbs energy dissipation
values for cell growth and maintenance were obtained in shorter time at 120-240
micromol photons m-2 s-1 in both nitrogen sources while the moles of photons absorbed
by the system to produce one C-mol biomass was higher in cultures with NO3- The
highest values of the molar production of O2 and consumption of H+ were obtained at
the highest I values using NO3- The estimated percentages of the energy absorbed
by the cell showed that compared with nitrate the use of urea as nitrogen source
allowed the system to address higher fractions to ATP production and light fixation by
the photosynthetic apparatus as well as a lower fraction released as heat Thanks to
this better bioenergetic situation urea appears to be a quite promising low-cost
alternative nitrogen source for A platensis cultures in photobioreactors
Key words Arthrospira platensis fed batch urea light intensity carbon dioxide
alcoholic fermentation bioenergetic
8
RIASSUNTO
Il cianobatterio fotosintetici Arthrospira platensis ha un alto contenuto di proteine (50-
70) presenza di acidi grassi essenziali come l‟acido -linolenico e altre sostanze
importanti per l‟alimentazione umana ed animale Questi microrganismi convertono CO2 in
biomassa di grande potenzialitagrave nellindustria alimentare Durante la fermentazione
alcolica la produzione di CO2 egrave dello stesso ordine di grandezza della produzione di
etanolo e in considerazione alla crescente necessitagrave interna ed europeo per questo
combustibile sarebbe importante lo svilupo di un processo che fissasse questo CO2
transformandolo in un prodotto che potrebbe essere utile per la nostra popolazione
Inoltre luso di una fonte di azoto a basso costo (urea) in reattori tubolari contribuirebbe a
ridurre il costo di produzione di A platensis Lobiettivo di questo studio egrave di valutare i
parametri cinetici bioenergetiche e la composizione della biomassa ottenuta in colture di
A platensis in bioreattori tubolare alimentato con CO2 puro di cilindro o con CO2 della
fermentazione alcolica per il controllo del pH in diverse intensitagrave di luce (I) e fonti di azoto
(N) usando il processo discontinuo alimentato I risultati hanno dimostrato che valori piugrave
alti di I fornire i piugrave alti valori di concentrazione massima delle cellule (Xm) e la produttivitagrave
delle cellule (Px) ma non influenza i valori del fattore di conversione di azoto nelle cellule
(YXN) Luso di urea come fonte di azoto aumentato i valori di YXN rispetto alle culture con
NO3- La composizione chimica di biomassa puograve osservare che I ha influenzato la
percentuale di clorofilla proteine e lipidi ma non ha influenzato la percentuale di
carboidrati e cenere nella biomassa finale In relazioni ai parametri bioenergetici dei cultivi
usando CO2 di cilindri abbiamo osservato che i piugrave alti valori di dissipazione di energia di
Gibbs per la crescita cellulare e la manutenzione sono stati ottenuti in tempo piugrave brevi nel
120-240 μmol di fotoni m-2 s-1 per entrambe le fonti di N mentre il numero di moli di fotoni
assorbiti dalle cellule por produrre una biomassa C-mol era maggiore nelle culture con
NO3- a prescindere dalla I I valori piugrave alti della produzione molare di O2 e il consumo di H+
sono stati ottenuti con valori piugrave alti di I coltivati con NO3- Le frazioni di energia per la
sintese di ATP e fissato per la cellula erano piugrave alti nelle culture con urea che nelle culture
con NO3- che si egrave rivelata una fonte di azoto in grado di sostenere la crescita di A
platensis
Parole chiave Arthrospira platensis processo discontinuo alimentato urea intensitagrave
luminosa anidride carbonica fermentazione alcolica bioenergetica
9
Lista de graacuteficos
Graacutefico 1 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular de A
platensis 73
Graacutefico 2 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia
Graacutefico 3 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo de clorofila a 77
Graacutefico 4 Logariacutetmico da concentraccedilatildeo celular em funccedilatildeo do tempo 88
Graacutefico 5 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 01 h-1 88
Graacutefico 6 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) Etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 005 h-1 89
Graacutefico 7 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) Etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 0025 h-1 89
Graacutefico 8 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 1 93
Graacutefico 9 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 2 (60 mol de foacutetons m-2 s-1) 94
Graacutefico 10 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 2 95
Graacutefico 11 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 3 96
Graacutefico 12 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 4 (120 mol de foacutetons m-2 s-1) 97
Graacutefico 13 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 4 98
Graacutefico 14 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 5 99
Graacutefico 15 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 6 (120 mol de foacutetons m-2 s-1) 100
Graacutefico 16 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 6 101
Graacutefico 17 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 7 102
Graacutefico 18 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 8 (120 mol de foacutetons m-2 s-1) 103
Graacutefico 19 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 8 104
Graacutefico 20 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 9 105
Graacutefico 21 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 10 (240mol de foacutetons m-2 s-1) 106
Graacutefico 22 concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 10 107
10
Graacutefico 23 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 11 108
Graacutefico 24 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 12 (240 mol de foacutetons m-2 s-1) 109
Graacutefico 25 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 12 110
Graacutefico 26 Energia de Gibbs de dissipaccedilatildeo durante o cultivo de A platensis
intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 ( ) 120 () 240
Fonte de nitrogecircnio nitrato (siacutembolo aberto) ureacuteia (siacutembolo fechado) 144
Graacutefico 27 Influecircncia da velocidade especiacutefica de crescimento da A platensis sobre
o nuacutemero de moles de foacutetons absorvido para produzir 1 C-mol de biomassa em
diferentes condiccedilotildees de cultivo () Composiccedilatildeo elementar da biomass descrita por
Cornet et al (1992) PPFD = 60 μmol de foacutetons m-2 s-1 Composiccedilatildeo elementar da
biomass determinada experimentalmente PPFD (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60
() 120 () 240 Fonte de nitrogecircnio nitrato (siacutembolos abertos) ureacuteia
(siacutembolos fechados) 147
Graacutefico 28 Produccedilatildeo molar de O2 (siacutembolo fechado) e consumo de H+ (siacutembolo
aberto) em funccedilatildeo do tempo em diferentes condiccedilotildees de cultivo Intensidades
luminosas (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 () 120 () 240 Fonte de
nitrogecircnio nitrato (linha rachurada) ureacuteia (linha contiacutenua) 149
Graacutefico 29 Energia total de Gibbs absorvida pelo aparato fotossinteacutetico (siacutembolo
fechado) (ΔGa) e energia transformada em ATP (siacutembolo aberto) (ΔGATP) durante o
cultivo da A platensis intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 (
) 120 () 240 Fonte de nitrogecircnio nitrato (linha tracejada) ureacuteia (linha
continua) 150
Graacutefico 30 Energia fixada pelo aparato fotossinteacutetico (siacutembolo fechado) (ΔH) e
energia liberada como calor (siacutembolo aberto) (Q) durante o cultivo de A platensis
intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 ( ) 120 () 240
Fonte de nitrogecircnio nitrato (linha rachurada) ureacuteia (linha contiacutenua) 151
Graacutefico 31 Porcentagem na distribuiccedilatildeo da energia luminosa absorvida durante o
cultivo de A platensis usando nitrato (siacutembolo fechado) e ureacuteia (siacutembolo aberto)
como fonte de nitrogecircnio Energia fixada pelos fotossistemas () energia
transformada em ATP () energia liberada como calor ( ) 152
Graacutefico 32 Concentraccedilatildeo celular nas duas diferentes configuraccedilotildees dos
fotobiorreatores tubulares ( ) horizontal e ( loz ) espiralado 153
11
Lista de Figuras
Figura 1 Spirulina platensis (UTEX 1926) 22
Figura 2 Principais rotas de assimilaccedilatildeo de nitrogecircnio em cianobacteacuterias cultivas em
pH acima de 92 35
Figura 3 Complexos fotossinteacuteticos em membranas tilacoacuteides 42
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do fotossistema 43
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da fase fotoquiacutemica 44
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da moleacutecula da clorofila a 48
Figura 7 Fotobiorreator tubular horizontal utilizado no cultivo de A platensis 67
Figura 8 Fotobiorreator tubular espiralado utilizado no cultivo de A platensis 68
12
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Produtores representativos de Spirulina 23
Tabela 2 - Planejamento experimental 84
Tabela 3 - Valores da concentraccedilatildeo celular meacutedias e desvio padratildeo em massa
seca obtidas a partir do melaccedilo natildeo clarificado e do melaccedilo clarificado 86
Tabela 4 - Variaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de leveduras em funccedilatildeo do tempo 87
Tabela 5 - Valores de XP ART Etanol e Rendimento do processo no regime
permanente para os diferentes valores de D com ART inicial de 170 gL-1 91
Tabela 6 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de carbonato
total referentes ao experimento 1 93
Tabela 7 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 2 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -44554x3 + 54865x2 + 14317x + 400 (60 mol de foacutetons
m-2 s-1) 94
Tabela 8 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 2 95
Tabela 9 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de carbonato
total referentes ao experimento 3 96
Tabela 10 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 4 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -20689x3 + 11591x2 + 33292x + 400 (60 mol de foacutetons
m-2 s-1) 97
Tabela 11 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 4 98
Tabela 12 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 5 99
Tabela 13 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 6 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -13286x3 + 14486x2 + 62226x + 400 (120 mol de
foacutetons m-2 s-1) 100
Tabela 14 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 6 101
Tabela 15 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 7 102
13
Tabela 16 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 8 de
acordo com a y = - 58128x3 + 38625x2 + 38606x + 400 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
103
Tabela 17 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 8 104
Tabela 18 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 9 105
Tabela 19 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 10
de acordo com a equaccedilatildeo y = -12057x3 + 10082x2 + 31899x + 400 (240 mol de
foacutetons m-2 s-1) 106
Tabela 20 - Valores meacutedios de concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 10 107
Tabela 21 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 11 108
Tabela 22 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 12
de acordo com a equaccedilatildeo y = -82763x3 + 62437x2 + 37265x + 400 (240 mol de
foacutetons m-2 s-1) 109
Tabela 23 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amonia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 12 110
Tabela 24 - Valores da concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) produtividade em ceacutelulas
(Px) e fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) com diferentes fontes de
CO2 fontes de nitrogecircnio e intensidades luminosas 119
Tabela 25 - Anaacutelise de variacircncia para a concentraccedilatildeo celular maacutexima 120
Tabela 26 - Meacutedias da concentraccedilatildeo celular maacutexima para a variaacutevel independente
fonte de nitrogecircnio 120
Tabela 27 - Meacutedias da concentraccedilatildeo celular maacutexima para a variaacutevel independente
intensidade luminosa 121
Tabela 28 - Anaacutelise de variacircncia para a produtividade em ceacutelulas 122
Tabela 29 - Meacutedias da produtividade em ceacutelulas para a variaacutevel independente fonte
de nitrogecircnio 123
Tabela 30 - Meacutedias da produtividade em ceacutelulas para a variaacutevel independente
intensidade luminosa 123
Tabela 31 - Anaacutelise de variacircncia para fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas
126
14
Tabela 32 - Meacutedias do fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas para a variaacutevel
independente fonte de nitrogecircnio 127
Tabela 33 - Meacutedias do fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas para a variaacutevel
independente intensidade luminosa 128
Tabela 34 - Concentraccedilatildeo de clorofila na biomassa final obtida nos experimentos
com o pH controlado com CO2 de cilindro 129
Tabela 35 - Anaacutelise de variacircncia para a concentraccedilatildeo de clorofila na biomassa final
130
Tabela 36 - Porcentagem de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos e cinzas na biomassa
seca final 134
Tabela 37 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de proteiacutena na biomassa final 136
Tabela 38 - Meacutedias do teor de proteiacutena na biomassa final para a variaacutevel
independente intensidade luminosa 136
Tabela 39 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de lipiacutedio na biomassa seca final 138
Tabela 40 - Meacutedias do teor de lipiacutedio na biomassa final para a variaacutevel independente
fonte de nitrogecircnio 138
Tabela 41 - Meacutedias do teor de lipiacutedio na biomassa final para a variaacutevel independente
intensidade luminosa 138
Tabela 42 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de carboidratos na biomassa seca final
141
Tabela 43 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de cinzas na biomassa seca final 142
Tabela 44 - Coeficientes estequiomeacutetricos estimados atraveacutes dos balanccedilos de
materiais de carbono nitrogecircnio oxigecircnio enxofre carga e grau de reduccedilatildeo da
biomassa cultivada em fotobiorreator tubular horizontal utilizando nitrato ou ureacuteia
como fontes de nitrogecircnio 145
15
Lista de abreviaturas e siglas
ART Accediluacutecares redutores totais
VOCs Compostos volaacuteteis orgacircnicos
C Carbono
N Nitrogecircnio
S Enxofre
O Oxigecircnio
H Hidrogecircnio
I Intensidade Luminosa
Ef Concentraccedilatildeo de etanol (g L-1)
fc Fraccedilatildeo em massa do carbono na biomassa seca (g g-1)
fi Fraccedilatildeo em massa do aacutetomo i na biomassa seca (g g-1)
Nt quantidade total de nitrogecircnio adicionado (mg)
Petanol Produtividade em etanol (g L h-1)
PX Produtividade em ceacutelulas (mg L-1 d -1)
Tc Tempo de cultivo (dias)
V Volume do meio (L)
Xi Concentraccedilatildeo celular inicial (mg L-1)
Xm Concentraccedilatildeo celular maacutexima obtida (mg L-1)
XP Meacutedias dos valores de concentraccedilotildees celulares ao longo do regime
permanente
YXN Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (mg mg-1)
Cl Clorofila a
GS glutamina sintetase
GOGAT glutamate sintase
FSII Fotossistema II
FSI Fotossistema I
16
Lista de siacutembolos
max
GXY Rendimento maacuteximo teoacuterico de biomassa sobre a energia de Gibbs
Velocidade especiacutefica de crescimento
1YGX Energia de Gibbs para o crescimento e manutenccedilatildeo celular
c Velocidade da luz (299108 m s-1)
D Vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo (h-1)
h Constante de Planck (662610-34 J)
mG Energia de Gibbs dissipada para a manutenccedilatildeo celular
MMc Massa molar do aacutetomo do carbono (g C-mol-1)
MMi Massa molar do aacutetomo i (g C-mol-1)
NA nuacutemero de Avogadro (6022 x 1023 foacutetons de Einstein -1)
nPh nuacutemero de foacutetons
Q Energia de Gibbs liberada como calor
qH+ Consumo molar de H+
qO2 Produccedilatildeo molar de O2
ΔGa Energia total de Gibbs absorvida pela fotossiacutentese
ΔGATP Energia de Gibbs transformada em ATP
ΔgPh Energia de Gibbs contida em 1 Einsten de foacuteton
ΔH Energia fixada pelos fotosistemas
η Rendimento do processo em etanol ()
λ Comprimento de onda
17
Sumaacuterio
1 Introduccedilatildeo 20
2 Revisatildeo bibliograacutefica 22
21 Caracteriacutesticas da A platensis22
22 Fotobiorreatores26
23 Processos de cultivo em fotobiorreatores31
24 Nutrientes para o crescimento da A platensis 33
241 Fontes de Nitrogecircnio33
242 Intensidade luminosa41
2421 Pigmentos 46
243 Fontes de carbono 50
2431 Fonte de carbono orgacircnico (Crescimento hetorotroacutefico) 50
2432 Fonte de carbono inorgacircnico (Crescimento autotroacutefico) 51
2433 Fonte de carbono inorgacircnico e orgacircnico simultaneamente (Crescimento
mixotroacuteficos) 54
3 Objetivos61
4 Materiais e meacutetodos 62
41 Fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua62
411 Testes preliminares para emprego da fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
62
4111 Teste para avaliar a influecircncia do tratamento do melaccedilo na determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo celular62
41111 Melaccedilo natildeo tratado62
41112 Melaccedilo tratado 62
41113 Preparaccedilatildeo do melaccedilo63
4112 Teste para avaliar a homogeneidade do reator 63
4113 Teste para determinar a vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo 63
412 Micro-organismo e condiccedilotildees de manutenccedilatildeo63
413 Preparo do inoacuteculo64
414 Dispositivo para a cultura 64
415 Descriccedilatildeo das condiccedilotildees de fermentaccedilatildeo contiacutenua64
42 Cultivo de A platensis65
421 Micro-organismo e manutenccedilatildeo 65
18
422 Meio de cultivo65
4221 Meio padratildeo para cultivo de A platensis 65
4222 Meio modificado66
423 Preparo do inoacuteculo66
424 Dispositivo da cultura67
4241 Fotobiorreator tubular horizontal67
4242 Fotobiorreator tubular espiralado68
425 Descriccedilatildeo de um experimento tiacutepico de cultivo da A platensis68
43 Teacutecnicas Analiacuteticas69
431 Acompanhamento da fermentaccedilatildeo alcooacutelica70
4311 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular70
4312 Determinaccedilatildeo do pH70
4313 Determinaccedilatildeo de ART70
4314 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol71
4315 Determinaccedilatildeo dos componentes volaacuteteis presentes no gaacutes efluente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua72
432 Acompanhamento do cultivo de A platensis72
4321 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular 72
43211 Densidade oacutetica 72
43212 Construccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo 73
4322 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de carbonato total 73
4323 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia total74
4324 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia75
4325 Determinaccedilatildeo do pH76
4326 Determinaccedilatildeo de nitrato76
4327 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol76
433 Avaliaccedilatildeo da biomassa de A platensis obtida no final do cultivo76
4331 Determinaccedilatildeo de Clorofila a 76
43311 Curva de calibraccedilatildeo para a determinaccedilatildeo de Clorofila a 77
4332 Determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal 77
43321 Proteiacutenas totais78
43322 Lipiacutedios totais78
43323 Cinzas78
43324 Carboidratos totais 79
19
434 Avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo elementar 79
4341 Determinaccedilatildeo de CNHS 79
4342 Determinaccedilatildeo de oxigecircnio 79
44 Caacutelculos 79
441 Produtividade em etanol no regime permanente 79
442 Rendimento do etanol no regime permanente 80
443 Produtividade em ceacutelulas nos cultivos de A platensis 80
444 Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas nos cultivos de A
platensis 80
445 Coeficientes atocircmicos para 1 C-mol de biomassa 81
446 Grau de reduccedilatildeo da biomassa82
45 Teoria dos paracircmetros bioenergeacuteticos 82
5 Planejamento experimental84
6 Resultados e discussotildees85
61 Testes preliminares para a realizaccedilatildeo da fermentaccedilatildeo alcooacutelica 85
611 Avaliaccedilatildeo da influecircncia da clarificaccedilatildeo do melaccedilo na determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo celular 86
612 Teste de homogeneidade do reator87
613 Avaliaccedilatildeo de diferentes vazotildees especiacuteficas de alimentaccedilatildeo (D) 88
614 Avaliaccedilatildeo dos volaacuteteis orgacircnicos no gaacutes de arraste92
62 Avaliaccedilatildeo do crescimento da A platensis 93
63 Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) Produtividade em
ceacutelulas (Px) e Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas
(YXN) 119
631 Concentraccedilatildeo celular maacutexima 119
632 Produtividade volumeacutetrica de ceacutelulas 122
633 Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas 125
64 Avaliaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de clorofila a 129
65 Avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal 134
66 Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros bioenergeacuteticos 143
67 Comparaccedilatildeo entre os fotobiorreatores 153
7 Conclusotildees 154
20
1 Introduccedilatildeo
O interesse na produccedilatildeo comercial da Spirulina sp eacute devido a algumas
propriedades particulares como alta digestibilidade menor concentraccedilatildeo de aacutecidos
nucleacuteicos teores de proteiacutenas elevados (50-70 da massa seca) e importacircncia
quantitativa de aminoaacutecidos essenciais Na sua biomassa encontram-se tambeacutem
pigmentos como a clorofila ficocianina e -caroteno aacutecidos graxos essenciais como
γ-linolecircnico o qual possui efeito terapecircutico em humanos (BELAY OTA 1994)
vitaminas e antioxidantes (PULZ SCHEIBENBOGEN 1998)
Tradicionalmente a Spirulina (Arthrospira) eacute cultivada autotroficamente na
presenccedila de altos niacuteveis de carbonatos e bicarbonatos como fontes de carbono por
serem de baixo custo e proporcionarem pH elevado no meio No entanto Spirulina
ssp tambeacutem podem crescer em condiccedilotildees mixotroacuteficas podendo apresentar uma
produtividade maior quando comparadas a cultivos fotoautotroacuteficos ou heterotroacuteficos
(OGBONNA et al 2000)
Em condiccedilotildees mixotroacuteficas eou fotoautotroacuteficas a intensidade luminosa eacute um
fator importante no crescimento celular da A platensis Baixas intensidades
luminosas podem limitar o crescimento celular Por outro lado altas intensidades
luminosas podem inibir o crescimento celular devido ao fenocircmeno de fotoinibiccedilatildeo
Por isso esse eacute um fator que deve ser controlado em cultivos de micro-organismos
fotossintetizantes
O pH do meio de cultivo eacute um outro fator no cultivo de micro-organismos O pH
determina a solubilidade do dioacutexido de carbono e minerais no meio de cultura e
influencia diretamente ou indiretamente no metabolismo dos micro-organismos
fotossintetizantes Durante o cultivo autotroacutefico da Spirulina sp ocorre um raacutepido
aumento do pH no meio de cultura o que pode atuar como um autoinibidor do
crescimento celular (RICHMOND 2000) e portanto o CO2 pode ser utilizado para a
manutenccedilatildeo do pH oacutetimo
A biofixaccedilatildeo do CO2 pelas microalgas estatildeo entre os meacutetodos bioloacutegicos mais
produtivos no tratamento de emissotildees de resiacuteduos industriais e o rendimento da
biomassa por hectare eacute maior quando comparadas a plantaccedilotildees na agricultura
(LAW BERNING 1991 AKIMOTO et al 1994) O uso direto dos resiacuteduos volaacuteteis
reduz os custos de preacute-tratamento mas a alta concentraccedilatildeo de CO2 pode inibir o
crescimento de cianobacteacuterias e microalgas No entanto alguns autores tecircm
21
recentemente relatado o isolamento de cianobacteacuterias e microalgas tolerantes a
altas concentraccedilotildees de CO2 e capazes de fixar esse gaacutes tais como Chlorella
Spirulina e Scenedesmus (CHANG et al 2003 WATANABE HALL 1995a
HANAGATA et al 1992) Cyanidium cladarium (AKIMOTO et al 1994)
Aleacutem do CO2 a fonte de nitrogecircnio tambeacutem eacute um fator determinante no cultivo
uma vez que este nutriente eacute utilizado principalmente para constituir proteiacutenas e
aacutecidos nucleacuteicos fundamentais para a manutenccedilatildeo e crescimento celular
(WATANABE HALL 1996) O meio de cultura convencional para a obtenccedilatildeo da S
platensis utiliza sais de nitrato como fonte de nitrogecircnio como por exemplo nitrato
de potaacutessio e nitrato de soacutedio Ureacuteia (DANESI et al 2002 SOLETTO et al 2005) e
sais de amocircnio (CARVALHO et al 2004 SOLETTO et al 2005) tecircm sido
pesquisadas como fontes alternativas de nitrogecircnio para o cultivo de S platensis
No caso de fontes de nitrogecircnio amoniacais o emprego dos reatores tubulares
pode ser considerado como uma vantagem por favorecer baixa perda de amocircnia
por volatilizaccedilatildeo reduzindo a necessidade de adiccedilatildeo de fonte de nitrogecircnio como
consequumlente reduccedilatildeo do custo de produccedilatildeo Assim pode-se concluir que os
esforccedilos em melhoria de condiccedilotildees de cultivo de A platensis natildeo sejam apenas
utilizando reatores abertos mas tambeacutem reatores fechados dentre os quais os
tubulares
O dioacutexido de carbono e os compostos volaacuteteis orgacircnicos (CVOs) de
fermentaccedilatildeo alcooacutelica podem ser utilizados como fontes de carbono no cultivo de A
platensis Durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica industrial toneladas de CO2 etanol e em
menor quantidade alguns CVOs satildeo liberados para a atmosfera como resiacuteduos No
entanto esses compostos podem ser reaproveitados como uma fonte de nutriente
juntamente como uma fonte de nitrogecircnio de baixo custo (ureacuteia) para o
desenvolvimento da A platensis que por sua vez permite a produccedilatildeo de
componentes com alto valor agregado e com menor custo de produccedilatildeo industrial
22
2 Revisatildeo bibliograacutefica
21 Caracteriacutesticas da A platensis
Arthrospira platensis eacute uma cianobacteacuteria filamentosa fotossintetizante
pertencente da ordem Oscillatoriales famiacutelia Cyanophyceae gecircnero Arthrospira
espeacutecie platensis Satildeo caracterizadas por tricomas ciliacutendricos multicelulares com
formas espiraladas (Figura 1) Estes possuem comprimentos de aproximadamente
500 μm e diacircmetro variando de 6-12 μm mas dependendo das condiccedilotildees de cultivo
podem adquirir morfologias diferentes Os filamentos natildeo possuem ramificaccedilotildees
nem heterocistos (TOMASELLI 1997)
Figura 1 Spirulina platensis (UTEX 1926) Fonte Universidade do Texas 2006
Arthrospira pode controlar sua flutuabilidade com vesiacuteculas gasosas para
receber a incidecircncia luminosa oacutetima para a fotossiacutentese Essas ceacutelulas podem
tambeacutem excretrar polissacariacutedeos extracelulares para formar agregados flutuantes
um fato que facilita sua recuperaccedilatildeo em lagos naturais e culturas outdoors (MATA
2007) Aleacutem disso devido a sua morfologia taxa de crescimento celular
relativamente alta e a caracteriacutestica das ceacutelulas se agregarem o custo operacional
para a recuperaccedilatildeo da biomassa eacute reduzido tornando-a economicamente viaacutevel
para a produccedilatildeo industrial (MATA 2007)
A Arthrospira sp eacute comercializada de forma inadequada com o nome de
Spirulina (GARRITY et al 2001) Atualmente a Arthrospira sp eacute produzida em
diferentes paiacuteses e sua produccedilatildeo mundial pode exceder 3000 toneladas
(SHIMAMATSU 2004) Na Tabela 1 estatildeo descritos algumas induacutestrias produtoras
de Spirulina (Arthrospira) sp e seu respectivo paiacutes
23
Tabela 1 - Produtores representativos de Spirulina
Induacutestria Paiacutesterritoacuterio
Spirulina Mexicana (Sosa Texcoco) SA
Meacutexico a
Siam Algae Co Ltd Thailand
Earthrise Farms USA
Cyanotech Corporation USA
Nan Pao Resins Chemical Co Ltd Taiwan
Far East Microalgae Co Ltd Taiwan
Parry Agro Industries Ltd (Parry Nutraceuticals)
Iacutendia
Yunnan Spirin Co Ltd Mainland China
Fonte Shimamatsu 2004 a Essa induacutestria faliu por volta do ano de 1990 (LEE 1997)
A biomassa da Spirulina sp eacute comercializada principalmente como alimentos
para seres humanos e animais devido a sua composiccedilatildeo quiacutemica A seguranccedila
como alimento tem sido estabelecida por seacuteculos atraveacutes do consumo pelos seres
humanos e pelos nuacutemerosos estudos toxicoloacutegicos (CHAMORRO et al 2002)
Na China em 1997 existiam cerca de 80 produtores de Spirulina com
produccedilatildeo anual variando de 3 a 500 toneladas A maioria dos produtores se
localizava no sul devido agrave vantagem de possuir verotildees longos e clima temperado
(LEE 1997) O maior produtor mundial de Arthrospira eacute Hainan Simai Enterprising
que estaacute localizado na provincia de Hainan na China Essa companhia tem uma
produccedilatildeo anual de 200 toneladas (SPOLAORE et al 2006) No Japatildeo de acordo
com Healfh Industry News a quantidade total de Spirulina comercializada foi de 400
toneladas em 1996 Em Taiwan 5 induacutestrias produzem um total de 480 toneladas
Na Tailacircndia os dois maiores produtores de Spirulina (Siam Algae Co Ltd e
Neotech Food Co Ltd) produzem 150 toneladas e 20 toneladas por ano
respectivamente Nos Estados Unidos a Cyanotech e a Earthrise Farms satildeo os dois
maiores produtores de Spirulina com produccedilatildeo de 380 toneladas e 500 toneladas
respectivamente Aleacutem dessas induacutestrias citadas acima existem outras produtoras
de Spirulina com uma produccedilatildeo anual menor em diversos paiacuteses como Chile Cuba
Filipinas Iacutendia (LEE 1997)
O potencial dessas cianobacteacuterias como um alimento baacutesico na dieta humana
tem sido investigado haacute muitos anos em diversos paiacuteses No Japatildeo a biomassa
24
algal (por exemplo Chlorella e Spirulina) eacute produzida comercialmente sendo
utilizada primeiramente como alimentos nutracecircuticos ou funcionais (OGBONNA
TANAKA 1997 BOROWITZKA 1986) Na China Spirulina and Chlorella satildeo os
dois maiores gecircneros cultivado na forma de biomassa ou extrato para a induacutestria
alimentiacutecia A biomassa eacute usada para produzir uma variedade de produtos
nutracecircuticos ou funcionais como tabletes caacutepsulas poacute ou para extraccedilatildeo de
ingredientes bioativos como β-caroteno e ficocianina A biomassa eacute suplementada
em patildees biscoitos doces sorvetes e o extrato satildeo suplementados em bebidas
como refrigerantes e chaacute principalmente para realccedilar seu valor nutritivo (LIANG et
al 2004)
Uma ampla variedade de pigmentos como clorofila a (Cl a) luteiacutena -caroteno
ficocianina (PC) e aloficocianina (APC) satildeo compostos bioativos na biomassa de S
platensis e tem sido usado como corantes naturais em alimentos em cosmeacuteticos e
como produtos farmacecircuticos no consumo humano e animal (CHEN et al 2006) O
efeito nocivo de corantes sinteacuteticos e a tendecircncia da sociedade utilizar produtos
naturais na alimentaccedilatildeo e cosmeacuteticos tecircm conduzido agrave exploraccedilatildeo das microalgas
como corantes naturais Esses pigmentos tecircm um grande valor comercial como
corantes naturais em induacutestrias nutracecircuticas cosmeacuteticas e farmacecircuticas
(PRASANNA et al 2007)
Recentemente a importacircncia de se estudar esses micro-organismos eacute devido
as suas propriedades terapecircuticas (BELAY et al 1993) e presenccedila de compostos
antioxidantes (ESTRADA et al 2001 MIRANDA et al 1998) Essas propriedades
tecircm sido provadas experimentalmente in vivo e in vitro que satildeo efetivas para o
tratamento de algumas alergias anemia doenccedilas virais e cardiovasculares
hiperglicemia hiperlipidemia processos inflamatoacuterios entre outros (CHAMORRO et
al 2002 BELAY et al 2002)
Essa cianobacteacuteria possui alto teor proteacuteico com importacircncia quantitativa dos
aminoaacutecidos essenciais e outros elementos nutricionais proporcionando seu alto
valor nutricional (MORIST et al 2001) Baixos teores de aacutecidos nucleacuteicos altos
conteuacutedos de vitaminas polissacariacutedeos e aacutecidos graxos essenciais como ocircmega-3
e ocircmega-6 satildeo paracircmetros importantes para avaliar a qualidade da biomassa algal
(OGBONNA TANAKA 1997 BOROWTIZKA 1986) Os polissacariacutedeos que
constituem a parede celular tecircm uma digestibilidade de 86 o que torna a biomassa
facilmente absorvida pelo corpo humano (LI 1997)
25
Haacute relatos tambeacutem do emprego da Arthrospira em cosmeacuteticos um extrato rico
em proteiacutenas feitos a partir da Arthrospira repara sinais de envelhecimento da pele
mais cedo exerce um efeito de firmeza e previne a formaccedilatildeo de estrias (Protulinesreg
Exsymol SAM Monaco) (SPOLAORE et al 2006)
Aleacutem da presenccedila dos compostos citados anteriomente a biomassa de
Spirulina tambeacutem pode ser utilizada no tratamento de aacuteguas residuais renovaccedilatildeo da
aacutegua atraveacutes da desintoxificaccedilatildeo bioloacutegica e remoccedilatildeo de metais pesados Por ser
um micro-organismo fotossintetizante tem a capacidade natildeo apenas de produzir
oxigecircnio mas tambeacutem de remover nutrientes como nitrogecircnio e foacutesforo reduzindo a
eutrofizaccedilatildeo dos efluentes Essa biomassa pode ser recuperada e utilizada para
extrair compostos de interesse industrial como por exemplo pigmentos e o restante
da biomassa pode ainda ser utilizado como combustiacutevel ou para produccedilatildeo de
metano (CIFERRI TIBONI 1985)
O cultivo de microalgas e cianobacteacuterias fornecem excelente perspectivas para
a produccedilatildeo de energia renovaacutevel podendo contribuir substancialmente para uma
reduccedilatildeo de emissotildees do CO2 Essas emissotildees satildeo resultados do processo de
queima dos combustiacuteveis foacutesseis e de praacuteticas agriacutecolas improacuteprias (as queimadas
por exemplo) produzindo elevados rendimentos da biomassa e possibilitando a
produccedilatildeo de compostos com alto valor agregado e biocombustiacutevel (CHISTI 2007
RICHMOND 1990)
As microalgas tecircm sido propostas como mateacuteria-prima para a produccedilatildeo de
biocombustiacuteveis devido ao alto teor de lipiacutedios que algumas espeacutecies podem
alcanccedilar O teor de oacuteleo de 20 a 50 de sua biomassa seca eacute comum entre as
espeacutecies como Nannochloropsis sp Chlorella sp Schizochytrium sp Algumas
microalgas podem exceder a 80 (MIAO 2006 CHISTI 2007 BANERJEE et al
2002) O percentual de lipiacutedios na biomassa de microalgas eacute funccedilatildeo das condiccedilotildees
de cultivo tais como salinidade do meio concentraccedilatildeo de nitrogecircnio natureza da
fonte de carbono assim eacute possiacutevel com certa facilidade e com tempo de resposta
relativamente curto aumentar o teor de oacuteleo nas microalgas de forma a alcanccedilar
valores bastante expressivos (CHISTI 2007)
As principais vantagens para a utilizaccedilatildeo de microalgas como biocombustiacuteveis
satildeo alta eficiecircncia de conversatildeo de foacutetons (como evidenciada pelo aumento do
rendimento da biomasa por hectare) podem ser coletados em lotes durante quase
todo o ano pode utilizar sais e aacutegua residuaacuteria reduzindo extremamente o uso de
26
aacutegua doce produz biocombustiacutevel altamente biodegradaacutevel e natildeo toacutexico podem ser
usado o CO2 liberado pela queima de combustiacuteveis foacutesseis esse CO2 eacute
frequentemente disponiacutevel a baixo custo ou ateacute mesmo sem custo (CHISTI 2007
SAWAYAMA et al 1995 SCHENK et al 2008 YUN et al 1997) As limitaccedilotildees
atuais existentes satildeo principalmente no processo de colheita e na fonte do CO2 para
a maior eficiecircncia de produccedilatildeo (SCHENK et al 2008)
22 Fotobiorreatores
A escolha do biorreator para o cultivo da microalga eacute um importante fator que
influecircncia na produtividade global (WATANABE HALL 1996) Haacute uma grande
variedade de biorreatores utilizados para o cultivo de microalga dentre os quais
alguns satildeo utilizados atualmente para produccedilatildeo industrial (LEE 2001)
Segundo Borowitzka (1999) as microalgas podem ser cultivadas em diversos
sistemas de cultivo com volume variando desde poucos litros ateacute bilhotildees de litros
Em geral os sistemas de produccedilatildeo satildeo pouco sofisticados uma vez que muitas
empresas desenvolvem cultivos a ceacuteu aberto em tanques com fundo de terra e com
baixo ou nenhum controle dos paracircmetros ambientais Nos uacuteltimos 50 anos alguns
cultivos desenvolvidos em fotobiorreatores podem ter os seus paracircmetros
ambientais controlados e isto implica numa elevada produtividade a qual viabiliza a
produccedilatildeo comercial de compostos de elevado valor agregado (KOMMAREDDY
ANDERSON 2005 TREDICI 2004)
Convencionalmente os cultivos de microalgas comerciais satildeo realizados em
reatores abertos por causa de baixa eficiecircncia dos fotobiorreatores fechados em
larga escala (OGBONNA TANAKA 1997) Portanto eacute difiacutecil de obter alta
produtividade em reatores ldquooutdoorsrdquo abertos por causa da dificuldade de controlar
fatores ambientais como temperatura e intensidade luminosa haacute uma grande
evaporaccedilatildeo de aacutegua no meio e aleacutem disso requer uma grande aacuterea superficial
facilitando a contaminaccedilatildeo por outros micro-organismos Esse meacutetodo natildeo deve ser
empregado para produccedilatildeo de componentes quiacutemicos finos e farmacecircuticos uma
vez que o custo de recuperaccedilatildeo desse produto e purificaccedilatildeo podem ser
extremamente altos principalmente devido a baixa concentraccedilatildeo celular e a
contaminaccedilatildeo com impurezas Vaacuterias alternativas tecircm sido propostas para contornar
esse problema como o emprego de fotobiorreatores fechados e processos
heterotroacuteficos (CHEN 1997)
27
Os fotobiorreatores abertos possuem certas desvantagens sobre os
fotobiorreatores fechados dentre elas destacam-se menor eficiecircncia fotossinteacutetica e
menor qualidade do produto da microalga (RICHMOND et al 1990 VONSHAK
RICHOMOND 1988) A menor eficiecircncia fotossinteacutetica eacute principalmente devido ao
efeito de sombreamento quando a densidade celular alcanccedila um determinado valor
a baixa eficiecircncia de utilizaccedilatildeo de CO2 gasoso devido agrave limitaccedilatildeo do suplemento de
CO2 para a microalga uma vez que quando o CO2 natildeo estaacute dissolvido no meio de
cultura este se volatiliza contaminaccedilatildeo do cultivo por bacteacuterias algas protozoaacuterios
e fungos tambeacutem influenciam no crescimento da microalga e na qualidade do
produto Os fotobiorreatores fechados tecircm a vantagem de aumentar a eficiecircncia de
utilizaccedilatildeo de CO2 controlando o pH da cultura e diminuir o niacutevel de contaminantes
(WATANABE HALL 1996) Tambeacutem dependendo da configuraccedilatildeo do reator pode
aumentar a aacuterea iluminada reduzindo o efeito de sombreamento (WATANABE et al
1995)
Fotobiorreatores fechados satildeo usados para cultivos de micro-organismos
fotoautotroacuteficos visando agrave produccedilatildeo de aacutecidos graxos poliinsaturados pigmentos
vitaminas e polissacariacutedeos (MOLINA GRIMA et al 1995 TAKANO et al 1995
MERCHUK et al 1996 MATSUNAGA et al 1996) Para muitas dessas aplicaccedilotildees
eacute essencial o uso desses tipos de fotobiorreatores nos quais as monoculturas
podem ser mantidas por longos periacuteodos preferencialmente se o cultivo for
ldquooutdoorrdquo utilizando luz solar como a uacutenica fonte de energia (JANSSEN et al 2003)
Diversas configuraccedilotildees de fotobiorreatores fechados tecircm sido usadas ou
propostas para o cultivo de Spirulina sp como o tubular horizontal (CONVERTI et
al 2006a) tubular helicoidal (BIOCOIL) (WATANABE et al 1995 NERANTZIS et
al 2002) espiralado vertical (TREDICI ZITTELLI 1998) e laminar inclinado (HU et
al 1996) Quase todas as configuraccedilotildees dos fotobiorreatores usam um recipiente
de degassing para desoxigenar o sistema pois um aumento no niacutevel de oxigecircnio no
meio reduz a produtividade (NERANTZIS et al 2002)
Um fator importante para a configuraccedilatildeo desses fotobiorreatores eacute o
fornecimento de luz eficientemente pela maximizaccedilatildeo da relaccedilatildeo superfiacutecie-volume
iluminada Por isso os tubos satildeo frequentemente estreitos e os ldquopanelsrdquo satildeo finos
No entanto alguns fotobiorreatores bem sucedidos em escala laboratorial podem
natildeo funcionar bem quando se aumenta a escala por causa da reduccedilatildeo da relaccedilatildeo
28
superfiacutecie-volume ocasionando uma pobre distribuiccedilatildeo luminosa dentro do reator
(OGBONNA TANAKA 1997)
Tredici e Zittelli (1998) observaram que cultivos de Arthrospira (Spirulina)
platensis em fotobiorreator tubular obtiveram maiores valores de produtividade
volumeacutetrica eficiecircncia fotossinteacutetica e velocidade especiacutefica de crescimento quando
comparadas com os cultivos em fotobiorreator plano Isso foi devido agrave diferenccedila
entre o fluxo de foacutetons nos cultivos com formas diferentes dos fotobiorreatores Uma
vez que os outros principais paracircmetros que conduzem o crescimento da S
platensis natildeo variaram entre os dois cultivos
Entre os diferentes tipos de fotobiorreatores aqueles do tipo air lift satildeo
particularmente interessantes por apresentarem uma maior transferecircncia de massa
liacutequido-gaacutes com menor gasto de energia podem ter o escoamento do liacutequido
facilmente controlado a circulaccedilatildeo de liacutequidos ocorre sem a remoccedilatildeo de partes do
reator e isto previne a contaminaccedilatildeo no cultivo Estes tipos de reatores satildeo
especialmente recomendados para as culturas de cianobacteacuterias por causa da
sensibilidade destas ao estresse de cisalhamento mecacircnico (CHOI et al 1995
SIEGEL ROBINSON et al 1992 CHISTI 1989 MERCHUK et al 1996
WATANABE et al 1995)
O sistema air lift tambeacutem permite a remoccedilatildeo de oxigecircnio produzido pela
fotossiacutentese (CAMACHO RUBIO et al 1998) A remoccedilatildeo contiacutenua do gaacutes oxigecircnio
em cultivos fotossinteacuteticos eacute essencial por que uma excessiva quantidade de
oxigecircnio dissolvido inibe a fotossiacutentese (MOLINA et al 2001)
O crescimento e a produtividade das ceacutelulas fotossinteacuteticas satildeo afetados por
diversos fatores incluindo composiccedilatildeo do meio de cultura temperatura pH
concentraccedilatildeo de O2 e CO2 no reator e fornecimento de luz sendo este o mais
importante durante o cultivo autotroacutefico de ceacutelulas fotossinteacuteticas (OGBONNA
TANAKA 1997)
Micro-organismos natildeo satildeo expostos a uma densidade de fluxo de foacutetons
constante em fotobiorreatores devido ao sombreamento muacutetuo das ceacutelulas e ao
movimento do liacutequido durante a agitaccedilatildeo Frequumlentemente tem sido sugerido que a
circulaccedilatildeo entre as zonas clara e escura poderia conduzir a uma eficiecircncia
fotossinteacutetica maior que aquela determinada sob iluminaccedilatildeo contiacutenua da densidade
de fluxo de foacutetons (JANSSEN et al 2003)
29
O fornecimento da luz em fotobiorreatores eacute uma variaacutevel importante em
culturas fotoautroacuteficas A alta razatildeo superfiacutecie-volume eacute um preacute-requisito importante
para o suprimento suficiente de luz nos fotobiorreatores Ateacute mesmo sob baixa
intensidade luminosa os organismos fotossintetizantes utilizam a luz exposta na
superfiacutecie dos fotobioreatores A energia de excitaccedilatildeo eacute parcialmente utilizada pelo
aparato fotossinteacutetico e a energia residual eacute perdida na forma teacutermica ou
fluorescecircncia (GRUSZECKI et al 1994) Um excesso da energia de excitaccedilatildeo pode
prejudicar o aparato fotossinteacutetico no processo chamado de fotoinibiccedilatildeo (MELIS
1999)
Dependendo do diacircmetro interno dos tubos (12 a 123 cm) os fotobiorreatores
tubulares fechados podem alcanccedilar valores de concentraccedilatildeo celular maiores que 20
g L-1 e produtividades volumeacutetricas de biomassa de 025 - 364 g L-1d-1 em cultivo
que possuem o ciclo claroescuro A alta turbulecircncia encontrada em reatores
tubulares garante uma oacutetima disponibilidade luminosa para as ceacutelulas e melhor
transferecircncia de massa dos gases (LEE 2001)
Outro fator importante eacute o escoamento turbulento da cultura A velocidade do
escoamento do liacutequido deve ser suficiente para garantir o escoamento turbulento
para evitar que as ceacutelulas fiquem estagnadas no interior escuro dos tubos Portanto
uma turbulecircncia execessiva pode danificar as ceacutelulas e haacute um limite superior para a
velocidade da cultura A turbulecircncia eacute conhecida por aumentar a produtividade da
biomassa quando comparada as condiccedilotildees de escoamento laminar A turbulecircncia
move as ceacutelulas do interior escuro de um tubo para uma zona perifeacuterica iluminada
evitando que as ceacutelulas natildeo recebam luz por longos periacuteodos Adicionalmente o
movimento das ceacutelulas da zona clara para a zona escura pode aumentar a
produtividade desde que a duraccedilatildeo de permanecircncia na zona escura seja curta
Intervalos no escuro na ordem de 1 segundo podem melhorar a conversatildeo da
energia solar em biomassa (LAWS et al 1987 TERRY 1986) Tais intervalos
permitem reaccedilotildees cataliacuteticas da fotossiacutentese no escuro permitindo o
restabelecimento do aparato fotossinteacutetico para sua eficiecircncia no proacuteximo periacuteodo
luminoso (ACIEacuteN FERNAacuteNDEZ et al 2001) Jansen et al (2002) relataram que a
turbulecircncia movimenta as ceacutelulas da zona escura no centro do fotobiorreator para a
zona foacutetica na parte mais externa do cilindro podendo conduzir a maior eficiecircncia do
reator
30
O fluxo laminar pode ser prejudicial agraves altas densidades celulares No entanto
eacute importante por proporcionar uma distribuiccedilatildeo uniforme da luz a todas as ceacutelulas na
cultura reduzir o crescimento da parede do fotobiorreator e diminuir a tensatildeo do
oxigecircnio na cultura (RICHMOND 2000) Carlozzi e Torzillo (1996) obtiveram maior
produtividade da Arthrospira platensis quando a velocidade da cultura densa (10 g L-1)
foi alterada de 018 m s-1 para 075 m s-1 Isto torna evidente a necessidade de se
manter uma velocidade de escoamento que permita um maior nuacutemero de ceacutelulas
captarem luminosidade suficiente e que ao mesmo tempo natildeo aumente a demanda
dos custos de produccedilatildeo
Converti et al (2006) observaram que cultivos de Arthrospira platensis em
fotobiorreator tubular a velocidade da cultura de 016 m s-1 eacute suficiente para garantir
uma boa mistura da cultura evitando danos agraves ceacutelulas Similarmente Tredici (1999)
descreve que cultivos em escala industrial de Arthrospira sp em fotobiorreator com
tubos plaacutesticos alongados sobre a terra com 35 cm de largura e 9 cm de altura a
densidade populacional oacutetima foi de 1 g Lminus1 e a velocidade do fluxo natildeo pode ser
menor que 50 cm sminus1 Baixa velocidade de circulaccedilatildeo 6 a 10 cm sminus1 prejudicou o
cultivo devido a produccedilatildeo O2 que inibiu o crescimento baixas taxas de saiacuteda e a
cultura deteriorou-se rapidamente devido ao seu crescimento na parede do tubo
(biofouling)
Como o crescimento dos micro-organismo fotossintetizantes nos
fotobiorreatores eacute fotossinteacutetico o suplemento de luz e CO2 satildeo provavelmente os
limitantes para o crescimento da microalga Aleacutem desses fatores a concentraccedilatildeo de
nitrogecircnio tambeacutem eacute um fator determinante no cultivo uma vez que este nutriente eacute
utilizado principalmente para constituir proteiacutenas e aacutecidos nucleacuteicos fundamentais
para a manutenccedilatildeo e crescimento celular (WATANABE HALL 1996)
No caso de fontes de nitrogecircnio amocircniacais o emprego dos reatores tubulares
pode ser considerado como uma vantagem por favorecer baixa perda de amocircnia
por volatilizaccedilatildeo reduzindo a necessidade de adiccedilatildeo de fonte de nitrogecircnio como
consequumlente reduccedilatildeo do custo de produccedilatildeo Assim pode-se concluir que os
esforccedilos em melhoria de condiccedilotildees de cultivo de A platensis natildeo sejam apenas
utilizando reatores abertos mas tambeacutem reatores fechados dentre os quais os
tubulares
31
23 Processos de cultivo em fotobiorreatores
S platensis habita naturalmente em lagos africanos e mexicanos (RICHMOND
1990) mas podem crescer artificialmente em meios sinteacuteticos empregando
diferentes tipos de processos de cultivo Estes tecircm sido desenvolvidos com a
finalidade de aumentar a produtividade do material desejado Segundo Sassano
(1999) a forma de adiccedilatildeo do substrato nas dornas pode interferir na qualidade da
biomassa produzida
No processo contiacutenuo eacute realizado por meio de uma alimentaccedilatildeo contiacutenua do
substrato limitante (ou meio de cultura) ao reator a uma determinada vazatildeo
constante e por uma retirada contiacutenua de meio cultivado de forma a se ter o volume
de reaccedilatildeo constante a fim de que o sistema atinja a condiccedilatildeo de estado
estacionaacuterio (steady-state) Esse estado consiste na situaccedilatildeo nas quais todas as
condiccedilotildees no interior do reator permanecem constantes ao longo do tempo
(FACCIOTTI 2001) Esse processo tem sido estudado por diferentes autores
comprovando sua aplicabilidade para no cultivo de Spirulina platensis Hirata et al
(1998) obtiveram concentraccedilotildees de S platensis sob condiccedilotildees fotoautotroacuteficas em
regime permanente nas diferentes intensidades luminosas analisadas 25 a 400 W
m-2 Nerantzis et al (2002) empregou o sistema contiacutenuo no fotobiorreator tubular
helicoidal (HELPBR) no cultivo de S platensis e provou sua flexibilidade ao aumento
de escala bem como sua alta produtividade volumeacutetrica em relaccedilatildeo a outros
fotobiorreatores fechados
Outro tipo de processo que tem sido utilizado no cultivo de S platensis em
fotobiorreatores eacute o semicontiacutenuo Esse processo consiste na alimentaccedilatildeo contiacutenua
do substrato limitante mas a remoccedilatildeo do produto eacute por bateladas (alimentaccedilatildeo
contiacutenua com descarga apoacutes a obtenccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular maacutexima desejada)
(BORZANI 2001) Travieso et al (2001) utilizando fotobiorreator tubular helicoidal
concluiacuteram que eacute possiacutevel empregar satisfatoriamente o sistema semicontiacutenuo no
cultivo de S platensis obtendo uma produtividade da biomassa maior que em
processos descontiacutenuo Isso por que em processo descontiacutenuo a produtividade em
ceacutelulas tende a diminuir quando os nutrientes satildeo totalmente consumidos De acordo
com Reichert et al (2006) a concentraccedilatildeo celular pode atingir valores de duas a
quatro vezes maiores no cultivo semicontiacutenuo de S platensis em relaccedilatildeo ao cultivo
descontiacutenuo utilizando fotobiorreator fechado
32
No processo descontiacutenuo todo o substrato eacute adicionado no iniacutecio do cultivo e
os produtos permanecem ateacute o final do cultivo (CARVALHO SATO 2001) No
processo descontiacutenuo alimentado que eacute uma variaccedilatildeo do processo descontiacutenuo a
alimentaccedilatildeo pode ser de forma intermitente ou contiacutenua O modo de operaccedilatildeo da
alimentaccedilatildeo em bioprocessos permite prevenir o acuacutemulo ou a falta do substrato no
cultivo Em processo microbiano uma apropriada taxa de alimentaccedilatildeo
exponencialmente crescente resulta na manutenccedilatildeo da concentraccedilatildeo do substrato
limitante residual controlando a taxa de formaccedilatildeo do produto (CARVALHO SATO
2001) Esse processo permite que o nutriente seja adicionado em determinados
intervalos de tempo durante todo o processo com isso eacute possiacutevel adicionar
nutrientes potencialmente toacutexicos quando presentes em altas concentraccedilotildees como
por exemplo o iacuteon amocircnio sem prejudicar o crescimento microbiano e prevenindo
seu acuacutemulo (CARVALHO et al 2004) Olguiacuten et al (2001) observaram que no
cultivo descontiacutenuo usando uma concentraccedilatildeo inicial de amocircnia de 1 mM incubada
a 32 ordmC ocorre uma grande perda desse iacuteon para a atmosfera aleacutem de ser
consumida pelo micro-organismo tornando-se deficiente depois de poucos dias
especificamente 12 dias Soletto et al (2005) observaram que o melhor crescimento
cineacutetico da S platensis foi empregando o processo descontiacutenuo alimentado quando
comparada com o processo descontiacutenuo utilizando a ureacuteia com fonte de nitrogecircnio
Comportamento semelhante foi observado por Zhang et al (1998) em cultivos
mixotroacuteficos de S platensis utilizando NaNO3 como fonte de nitrogecircnio
Costa et al (2004) observaram o emprego da aacutegua do lago Mangueira
suplementado com ureacuteia pelo processo descontiacutenuo alimentado no cultivo de S
platensis foi possiacutevel reduzir o custo de produccedilatildeo possibilitando o cultivo em larga
escala
Em casos particulares como por exemplo a necessidade de utilizaccedilatildeo de
nutriente viscoso no cultivo este processo geralmente reduz a viscosidade do meio
e o efeito dos componentes toacutexicos eacute tambeacutem limitado pela diluiccedilatildeo (WARD 1989)
Entre outras vantagens desse processo pode-se encontrar desvio do metabolismo
celular para via de interesse de formaccedilatildeo do produto evita repressatildeo cataboacutelica
evita formaccedilatildeo de produtos toacutexicos no metabolismo microbiano e controla a
velocidade de crescimento microbiano O melhor procedimento operacional para
esse sistema eacute iniciar com pequena quantidade de biomassa e substrato e adicionar
33
mais substrato quando a maior parte do substrato inicial ter sido consumida pelo
micro-organismo (GREGERSEN JORGENSEN 1999)
O processo descontiacutenuo alimentado deve ser usado para melhorar a densidade
celular no crescimento da S platensis desde que a concentraccedilatildeo do substrato
limitante possa ser adicionada ateacute alcanccedilar a produccedilatildeo maacutexima de biomassa sem
resultar na inibiccedilatildeo do crescimento
24 Nutrientes para o crescimento da A platensis
241 Fontes de Nitrogecircnio
O elemento nitrogecircnio constitui aproximadamente de 5 a 10 do peso seco das
cianobacteacuterias (FLORES HERRERO 1994) Diferentes fontes de nitrogecircnio
orgacircnica e inorgacircnica podem ser assimiladas por micro-organismos
fotossintetizantes Dentre as orgacircnicas encontramos aminoaacutecidos purinas ornitina
e as inorgacircnicas encontramos sais de amocircnio e sais de nitrato (BERMAN CHAVA
1999)
As cianobacteacuterias utilizam principalmente fontes de nitrogecircnio inorgacircnico como
nitrato nitrito amocircnia e nitrogecircnio atmosfeacuterico para suprir sua necessidade No
entanto amocircnia eacute a uacutenica fonte inorgacircnica de nitrogecircnio que eacute diretamente
incorporada em compostos orgacircnicos e entatildeo um intermediaacuterio obrigatoacuterio na
utilizaccedilatildeo do outras fontes de nitrogecircnio Essa moleacutecula eacute tambeacutem conhecida como
uma desacopladora na fotossiacutentese causando sob certas circunstacircncias o colapso
do ΔpH requerida pela siacutentese de ATP A amocircnia regula enzimas importantes no
metabolismo de nitrogecircnio tais como nitrato redutase glutamina sintetase e
nitrogenases (BOUSSIBA 1997)
Exceto para o N2 as cianobacteacuterias possuem um sistema de transporte
especiacutefico para as diferentes formas de nitrogecircnio mas a maioria deles pode entrar
na ceacutelula por difusatildeo dependendo de sua concentraccedilatildeo oue do pH do meio de
cultura Nitrato e nitrito satildeo reduzidos pela nitrato redutase e nitrito redutase
respectivamente ambas as enzimas usam ferredoxina como doador de eleacutetrons
(FLORES HERRERO 1994) Ureacuteia eacute convertida a amocircnia pela urease e o
dinitrogecircnio eacute reduzido agrave amocircnia pelo complexo nitrogenase (HERRERO et al
2001) Outras formas de nitrogecircnio como certos aminoaacutecidos requerem sistemas de
34
transporte especiacutefico e posteriormente seratildeo metabolizados para produzir amocircnio
(HERRERO et al 2001 MURO-PASTOR FLORENCO 2003)
Nesses organismos a hierarquia de preferecircncia da assimilaccedilatildeo tem sido
mostrada para esses compostos Quando amocircnio e nitrato estatildeo presentes
simultaneamente no meio externo o sistema para assimilaccedilatildeo de nitrato eacute expresso
somente ao niacutevel basal A inibiccedilatildeo da assimilaccedilatildeo do nitrato exercida pela amocircnia
opera em dois niacuteveis diferentes pelo menos Durante pouco tempo a adiccedilatildeo da
amocircnia interrompe a assimilaccedilatildeo ativa do nitrato pelas ceacutelulas Se as ceacutelulas
continuarem expostas ao amocircnio ateacute mesmo quando o nitrato estaacute
simultaneamente presente a longo prazo o sistema regulatoacuterio atua na repressatildeo
das proteiacutenas envolvendo a assimilaccedilatildeo do nitrato (HERRERO FLORES 1997) A
atividade da nitrato redutase em Spirulina platensis (strain ARM 729) eacute reduzida
mediante a retirada de nitrato do meio e eacute totalmente restaurada apoacutes duas horas
da adiccedilatildeo de nitrato indicando a induccedilatildeo pelo substrato A concentraccedilatildeo oacutetima de
nitrato de soacutedio necessaacuteria para a atividade maacutexima da enzima nitrato redutase eacute de
30 mM Os produtos da assimilaccedilatildeo do nitrato nitrito e amocircnio inibiram
significativamente a atividade da nitrato redutase quando em altas concentraccedilotildees A
acumulaccedilatildeo do nitrito eacute toacutexica para a ceacutelula mas seu niacutevel pode ser controlado tanto
pela inibiccedilatildeo da atividade da nitrato redutase eou transporte do nitrato ou pelo
aumento da atividade da nitrito redutase (JHA et al 2007)
Em cultivos de micro-organismo em larga escala a fonte de nitrogecircnio
preferencial eacute a amocircnia devido ao seu baixo custo e tambeacutem porque ela pode
previnir a contaminaccedilatildeo com zooplancton (BOUSSIBA 1997) A preponderacircncia de
NH3 sobre NH4+ em valores de pH acima de 92 o pKa para amocircnia a 20-30 ordmC
favoreceu a permeabilidade desta pela membrana plasmaacutetica forma natildeo ionizada
que apoacutes difundir pela membrana plasmaacutetica a amocircnia eacute aprisionada dentro da
ceacutelula na forma de iacuteon amocircnio carregado positivamente (BOUSSIBA 1997) O grau
de inibiccedilatildeo parece ser muito reduzido em cepas que crescem restritamente em
condiccedilotildees alcalinas 5 mM de amocircnia inibiu 90 a evoluccedilatildeo de O2 dependente de
luz em micro-organismo neutrofiacutelico Anabaena sp e somente 30 foi observada
em micro-organismo alcalofiacutelico Spirulina platensis no mesmo pH (pH 100) Em
concentraccedilatildeo de 10 mM Spirulina platensis obteve ainda 50 da capacidade
fotossinteacutetica e Anabaena sp natildeo obteve crescimento Essa resistecircncia da Spirulina
agrave amocircnia em pH 10 eacute conferida por um pH intratilacoidal relativamente alto no
35
valor de 65 em relaccedilatildeo ao pH intratilacoidal da Anabaena sp valor de pH de 53
Esta diferenccedila no valor do pH intratilacoidal sugere que menor eacute a ΔpH atraveacutes da
membrana que eacute a razatildeo para a resistecircncia relativa da Spirulina platensis a amocircnia
em pH 100 (BELKIN BOUSSIBA 1991a)
A adiccedilatildeo de 2-3 mM de amocircnia em cultivos de Spirulina mantida geralmente a
pH (95 - 100) causa a deterioraccedilatildeo do contamitante Chlorella no cultivo de
Spirulina A toxidade da amocircnia nas ceacutelulas da Chlorella eacute causada pela grande
entrada dessa moleacutecula devido ao menor pH interno reduzindo a variaccedilatildeo do pH na
membrana tilacoidal requerida para a siacutentese de ATP Logo o uso de amocircnia com
fonte de nitrogecircnio no cultivo de Spirulina pode previnir a proliferaccedilatildeo de outros
micro-organismos (BOUSSIBA 1997)
Ureacuteia e aminoaacutecidos tambeacutem podem ser assimilados pelas cianobacteacuterias A
ureacuteia e fontes de nitrogecircnio orgacircnico satildeo primeiramente metabolizadas para amocircnia
e a partir de entatildeo os aacutetomos de nitrogecircnio seratildeo utilizados como observado na
Figura 2 (FLORES HERRERO 1994)
Figura 2 Principais rotas de assimilaccedilatildeo de nitrogecircnio em cianobacteacuterias cultivas em pH acima de 92
A maioria dos organismos fotossintetizantes a assimilaccedilatildeo da amocircnia ocorre
pela accedilatildeo sequumlencial da glutamina sintetase (GS) e glutamanto sintase (GOGAT)
Ureacuteia
NO3-
aminoaacutecido
NH3
aminoaacutecido
Ureacuteia
NO3-
NH4+
Nucleotiacutedeos
Aminoaacutecidos
Aminoaccediluacutecar
Lipiacutedios
NH4+
Aacutecidos nucleacuteicos
Parede celular
Porfirinas
Proteiacutenas
Intracelular Exracelular
36
Essas reaccedilotildees conhecidas como ciclo GS-GOGAT constituem uma ligaccedilatildeo entre o
metabolismo de nitrogecircnio e de carbono e eacute o metabolismo mais importante para
assimilaccedilatildeo da amocircnia gerada tanto exogenamente como endogenamente
(BOUSSIBA 1997)
As enzimas do ciclo da glutamina sintetase e glutamato sintase satildeo importantes
pela introduccedilatildeo da amocircnia em formas orgacircnicas O glutamato produzido por esta
via aleacutem de ser o principal doador de nitrogecircnio para a siacutentese de outros
metaboacutelitos contendo nitrogecircnio eacute tambeacutem um precursor de alguns aminoaacutecidos e
da 5-aminolevulinato um precursor da biossiacutentese da porfirina ficobilina e clorofila
(FLORES HERRERO 1994)
A parede celular das cianobacteacuterias eacute como as das bacteacuterias gram-negativas
que conteacutem uma camada de peptidoglicano na parte externa da membrana
citoplasmaacutetica Nesta membrana conteacutem tipos de proteiacutenas especiais denominadas
de porinas a qual permite a passagem de pequenas moleacuteculas incluindo
aminoaacutecidos e iacuteons inorgacircnicos Isto eacute essas substacircncias apresentam um sistema
de transporte especializado (FLORES HERRERO 1994) A membrana
citoplasmaacutetica representa a principal barreira de permeabilidade das cianobacteacuterias
Portanto o nitrato provavelmente possui livre acesso ao periplasma das
cianobacteacuterias (HERRERO FLORES 1997)
Algumas cianobacteacuterias como Anabaena Nostoc Fischerella satildeo capazes de
fixar N2 atmosfeacuterico em condiccedilotildees aeroacutebias atraveacutes das nitrogenases (FLORES
HERRERO 1994) No entanto as ceacutelulas de S platensis natildeo podem fixar nitrogecircnio
atmosfeacuterico porque natildeo possuem heterocisto (MATA 2007 VACHHANI VONSHAK
1997) e eacute dentro dos heterocistos onde se encontram as nitrogenases em
cianobacteacuterias (LARA GUERRERO 2007)
O nitrato eacute provavelmente a fonte mais abundante de nitrogecircnio para a nutriccedilatildeo
de cianobacteacuterias A assimilaccedilatildeo do nitrato envolve a incorporaccedilatildeo do nitrato e
reduccedilatildeo do nitrato intracelular para amocircnio na qual eacute a forma de nitrogecircnio
incorporada em compostos orgacircnicos Nitrito na qual pode tambeacutem ser utilizado na
necessidade do nitrogecircnio eacute assimilado pelas ceacutelulas e entatildeo reduzido a amocircnio
(FLORES HERRERO 1994)
A assimilaccedilatildeo do nitrato pelas cianobacteacuterias envolve um sistema de transporte
que eacute carreado por uma proteiacutena e esta possui uma alta afinidade pelo nitrato Esta
alta afinidade permite que as cianobacteacuterias utilizem nitratos mesmo em baixas
37
concentraccedilotildees como eacute encontrado no meio ambiente natural O acuacutemulo intracelular
de nitrato permitiraacute o funcionamento da enzima nitrato redutase (FLORES
HERRERO 1994) Portanto a limitaccedilatildeo do transporte de nitrato pela inativaccedilatildeo de
alguns genes do transporte de nitrato natildeo impede o crescimento dependente de
nitrato quando este eacute suplementado a alta concentraccedilatildeo (20 mM) A entrada do
nitrato nas ceacutelulas nessas condiccedilotildees parece ser por difusatildeo passiva desde que a
concentraccedilatildeo de nitrato seja maior que 1 mM a assimilaccedilatildeo de nitrato aumenta
linearmente com o aumento da sua concentraccedilatildeo (OMATA et al 1989)
O nitrato intracelular eacute reduzido a nitrito em reaccedilatildeo utilizando 2 eleacutetrons
catalizados pela nitrato redutase o nitrito eacute convertido a amocircnio pela nitrito redutase
na reaccedilatildeo utilizando 6 eleacutetrons Ambas as enzimas encontradas nas membranas
tilacoidais utilizam ferrodoxina reduzida como doador de eleacutetrons A presenccedila de
nitrato ou nitrito geralmente tem um efeito positivo nos niacuteveis das enzimas nitrato
redutase e nitrito redutase (FLORES HERRERO 1994) Estas enzimas encontram-
se principalmente no citoplasma das cianobacteacuterias (GUERRERO LARA 1987) A
assimilaccedilatildeo do nitrato envolve a reduccedilatildeo citoplasmaacutetica para nitrito (NO2-)
catalizada pela enzima nitrato redutase (NR) usando NAD(P)H como doador de
eleacutetrons O nitrito eacute rapidamente reduzido a amocircnio (NH4+) pela enzima nitrito
redutase (NiR) que usa a ferrodoxina como doador de eleacutetrons e o amocircnio eacute entatildeo
incorporado a moleacuteculas de nitrogecircnio como aminoaacutecidos purinas pirimidinas e
aminas (LEA LEEGOOD 1993)
Quando somente o CO2 eacute o aceptor de eleacutetrons disponiacutevel e o escoamento de
eleacutetrons pelos fotossistemas natildeo eacute limitado pela luz o que determina a fotossiacutentese
eacute a fixaccedilatildeo de CO2 pelo ciclo das pentoses Quando se adiciona nitrato nessas
mesmas condiccedilotildees este usa os eleacutetrons diretamente da ferrodoxina reduzida
liberando o escoamento dos eleacutetrons natildeo ciacuteclico de sua limitaccedilatildeo e estimulando a
produccedilatildeo de O2 Esse efeito natildeo foi observado quando se adiciona amocircnio Na
intensidade luminosa saturante o nitrato estimula o fluxo de eleacutetrons natildeo ciacuteclico para
gerar um poder redutor utilizado para sua assimilaccedilatildeo No entanto a intensidade de
luz limitante o nitrato reprime a fixaccedilatildeo de CO2 para utilizar o poder redutor gerado
fotossinteticamente na sua reduccedilatildeo a amocircnia (ROMERO LARA 1987)
A nitrato redutase e nitrito redutase presentes na membrana tilacoidal permitem
a fotoreduccedilatildeo do nitrato ou nitrito em uma reaccedilatildeo dependente do fotossistema I na
qual eacute estimulada pela ferrodoxina Nos tilacoacuteides do Synechococcus a fotoreduccedilatildeo
38
do nitrato a amocircnio utiliza aacutegua como fonte de eleacutetrons foi observado na reaccedilatildeo
envolvendo ambos fotossistema I e fotossistema II Em condiccedilotildees heterotroacuteficas a
reduccedilatildeo do nitrato ocorre pela ferrodoxina reduzida produzida a partir do NADPH e
ferrodoxina-NADP oxiredutase NAPDH eacute provavelmente gerado pela glicose-6-
fosfato desidrogenase e 6-fosfogluconato desidrogenase (HERRERO FLORES
1997)
A assimilaccedilatildeo de amocircnio nas cianobacteacuterias pode ser pela difusatildeo de sua
forma gasosa (amocircnia) ou pela accedilatildeo de permeases especiacuteficas e eacute diretamente
incorporado no metabolismo GS-GOGAT (GS glutamina sintetase GOGAT
glutamate sintase) (MURO-PASTOR FLORENCIO 2003)
A ureacuteia eacute uma boa fonte de nitrogecircnio para cianobacteacuterias pertencentes a
diferentes grupos taxonocircmicos Esta parece ser assimilada intacta pelas ceacutelulas
ativas e entatildeo metabolizada intracelularmente (FLORES HERRERO 1994) Embora
o metabolismo assimilatoacuterio do nitrogecircnio tenha sido amplamente investigado
(FLORES HERRERO 1994) informaccedilatildeo sobre a assimilaccedilatildeo da ureacuteia eacute escassa e
a maioria relata sobre o uso da urease (RAI SINGH et al 1987 RAI 1989
PALINSKA et al 2000) A ureacuteia intracelular eacute degradada pela enzima urease
liberando uma moleacutecula de dioacutexido de carbono e duas moleacuteculas de amocircnia
Embora algumas leveduras e algas degradem a ureacuteia pela ureacuteia amidoliase
dependente de ATP e biotina a maioria dos micro-organismos usa a ureacuteia
amidohidrolase dependente de Ni+2 (VALLADARES et al 2002) Essa enzima
possui um Km para ureacuteia geralmente acima de 1 mM (MOBLEY HAUSINGER
1989) Valladares et al (2002) tem demonstrado que algumas cianobacteacuterias como
Synechocystis sp PCC 6803 e Anabaena sp PCC 7120 possuem um transportador
de ureacuteia denominado ABC tipo permease (ABC-type permease) essencial para a
assimilaccedilatildeo da ureacuteia
A atividade da urease em cianobacteacuterias Synechococcus sp eacute geralmente
maior em ceacutelulas rompidas em relaccedilatildeo as ceacutelulas intactas sugerindo que a urease
estaacute localizada intracelularmente no citoplasma (COLLIER et al 1999) A produccedilatildeo
da urease requer Ni+2 no meio de crescimento e tem sido purificada a partir da
Spirulina maxima (CARVAJAL et al 1982)
Em geral haacute dois principais metabolismos para que o amocircnio seja incorporado
em constituintes orgacircnicos nas ceacutelulas O primeiro eacute a incorporaccedilatildeo direta do
amocircnio incorporado do meio para produccedilatildeo do glutamato pela aminaccedilatildeo do 2-
39
oxoglutarato (-cetoglutarato) pela glutamato desidrogenase seguindo pela
aminaccedilatildeo do glutamato pela glutamina sintetase
(1)
No segundo duas moleacuteculas de glutamato satildeo produzidas na reaccedilatildeo de
transaminaccedilatildeo A amocircnia eacute incorporada ao glutamato originando a glutamina na
qual transfere seu grupo amino para 2-oxoglutarato (-cetoglutarato) pela glutamato
sintase ou glutamato-2-oxoglutarato aminotransferase este eacute o ciclo de reaccedilotildees
catalisadas pelo glutamato sintase e glutamina sintetase sendo esta a via mais
comum de assimilaccedilatildeo de amocircnio em cianobacteacuterias independente da fonte de
nitrogecircnio utilizada (FLORES HERRERO 1994)
(2)
Eacute evidente que na assimilaccedilatildeo de algumas formas de nitrogecircnio inorgacircnico
pelas enzimas GSGOGAT um requerimento obrigatoacuterio do esqueleto de carbono
principalmente cetoaacutecidos conduziraacute um desvio do fluxo de carbono da biossiacutentese
de carboidrato para a biossiacutentese de aminoaacutecidos (LARA GUERRERO 1997)
proporcionando um aumento no fluxo de carbono atraveacutes da via glicoliacutetica e dos
aacutecidos tricarboxiacutelicos para a formaccedilatildeo do oxalacetato e do α-cetoglutarato bem
como estimula o turnover de aminoaacutecidos em ceacutelulas de Anacystis nidulans uma
2
+
+
40
vez que um aumento da incorporaccedilatildeo do carbono em aminoaacutecidos induzido pela
assimilaccedilatildeo de nitrogecircnio natildeo foi acompanhado por um aumento no pool de
aminoaacutecidos Esse desvio eacute mais evidente sob altas intensidades luminosas
(CORONIL et al 1993)
Nas ceacutelulas de Phormidium laminosum adaptada ao crescimento com nitrato ou
amocircnia como fonte de nitrogecircnio possuem de 65 a 90 de glutamato em relaccedilatildeo a
quantidade de aminoaacutecidos totais (porccedilatildeo molar) dependendo da fase de
crescimento Essa proporccedilatildeo pode variar se a fonte de nitrogecircnio no cultivo for
alterada Quando o iacuteon amocircnio foi adicionado no cultivo com nitrato o conteuacutedo de
glutamato diminui enquanto que a maioria dos outros aminoaacutecidos aumentou O
niacutevel intracelular da maioria dos aminoaacutecidos (especialmente aspartato e alanina)
aumenta indicando que a siacutentese de aminoaacutecido foi maior que sua incorporaccedilatildeo em
proteiacutenas e outros compostos (OCHOA de ALDA et al 1996)
O meio de cultura convencional para a obtenccedilatildeo da S platensis utiliza sais de
nitrato como fonte de nitrogecircnio como por exemplo nitrato de potaacutessio e nitrato de
soacutedio Fontes alternativas de nitrogecircnio como ureacuteia (DANESI et al 2002 SOLETTO
et al 2005) e sais de amocircnio (CARVALHO et al 2004 SOLETTO et al 2005)
estatildeo sendo pesquisadas com a finalidade de diminuir os custos na produccedilatildeo
industrial Ambos o tipo e a quantidade da fonte de nitrogecircnio no meio de cultura
influenciam no crescimento e composiccedilatildeo da biomassa (STANCA POPOVICI
1996)
Considerando a substituiccedilatildeo de KNO3 por ureacuteia verifica-se que eacute altamente
vantajosa pois o custo desta eacute muito menor que a de KNO3 e aleacutem disso a ureacuteia eacute
facilmente assimilada por S platensis provavelmente devido agrave sua hidroacutelise no meio
de cultivo com formaccedilatildeo de amocircnia seja devido agrave accedilatildeo da urease (CARVAJAL et
al 1982) seja devido agrave alcalinidade do meio de cultivo (DANESI et al 2002
RANGEL-YAGUI et al 2004)
Soletto et al (2005) comparando o crescimento da S platensis no processo
descontiacutenuo observaram que o uso de ureacuteia como fonte de nitrogecircnio proporcionou
uma maior concentraccedilatildeo celular quando comparado com o sulfato de amocircnio Nesse
mesmo trabalho observaram que o melhor crescimento cineacutetico da S platensis foi
utilizando o processo descontiacutenuo alimentado com ureacuteia quando comparada com o
nitrato de soacutedio Portanto o uso de ureacuteia como uma fonte de nitrogecircnio mais
econocircmica pode ser uma alternativa interessante no cultivo de S platensis
41
Bezerra et al (2008) observaram que o emprego do processo descontiacutenuo
alimentado utilizando cloreto de amocircnio como fonte de nitrogecircnio pode ser uma
alternativa viaacutevel para o cultivo de S platensis natildeo influenciam nos teores proteacuteicos
e lipiacutedicos da biomassa final
242 Intensidade luminosa
A intensidade luminosa eacute um importante fator que interfere no crescimento
dos micro-organismos fotossintetizantes A luz absorvida por pigmentos direciona o
transporte de eleacutetrons fotossinteacutetico na qual resulta na reduccedilatildeo do NADP+ e
formaccedilatildeo de ATP (YANG et al 2000)
A soma da luz absorvida pelas ceacutelulas no fotobiorreator depende de muitos
fatores incluindo posiccedilatildeo especiacutefica da ceacutelula num determinado instante densidade
da cultura e pigmentaccedilatildeo das ceacutelulas (RUBIO et al 2003)
Um dos modos de obtenccedilatildeo de energia para o metabolismo da S platensis eacute a
fotossiacutentese e para a sua realizaccedilatildeo eacute necessaacuterio aacutegua dioacutexido de carbono e luz
No processo fotossinteacutetico ocorre o fenocircmeno de captaccedilatildeo de luz e outro conhecido
como oxido-reduccedilatildeo (NELSON YOCUM 2006)
A absorccedilatildeo da luz na faixa de 400-700 nm por pigmentos fotossinteacuteticos
absorve a energia de um foacuteton de dado comprimento de onda e entatildeo utiliza essa
energia para iniciar uma cadeia de eventos da fase fotoquiacutemica da fotossiacutentese
Esses pigmentos tais como clorofila carotenoacuteides e bilinas estatildeo organizados em
complexos fotossinteacuteticos e tecircm a funccedilatildeo de antenas captadoras de luz Centenas
de pigmentos antenas funcionam juntos para direcionar o processo para as etapas
seguintes ou dissipam o excesso de energia para diferentes rotas (ADIR et al
2003)
A faixa do espectro de absorccedilatildeo que eacute utilizada pelos organismos
fotossintetizantes como fonte de energia para as suas atividades metaboacutelicas eacute
comumente chamada de Radiaccedilatildeo Fotossinteticamente Ativa (PAR do inglecircs
Photosynthetically Active Radiation) A Densidade de Fluxo de Foacutetons (PPFD do
inglecircs Photosynthetic Photon Flux Density) cuja unidade eacute micromol de foacutetons m-2 s-1
expressa a irradiacircncia nesta faixa do espectro
A fotossiacutentese oxigecircnica eacute catalizada por quatro complexos proteiacutenas-
membranas formadas pelo fotossistema II (FSII) citocromo bf fotossistema I (FSI) e
42
ATP sintetase Esses complexos estatildeo arranjados nas membranas tilacoacuteidais que
nas cianobacteacuterias distribuem-se de forma concecircntrica ou irregular no citossol
(NELSON YOCUM 2006)
Os fotossistemas satildeo os complexos responsaacuteveis pela conversatildeo da energia
luminosa em energia quiacutemica Nos organismos que realizam fotossiacutentese oxigecircnica
existem dois fotossistemas agindo em seacuterie o fotossistema I (FSI) e o fotossistema II
(FSII) O fotossistema II (FSII) eacute definido como aacutegua-plastoquinona oxidoredutase
pois catalisa a transferecircncia de eleacutetrons entre a aacutegua e a plastoquinona o complexo
citocromo b6f eacute definido como plastoquinonandashplastocianina oxidoredutase
fotossistema I (FSI) como uma plastocianinandashferredoxina oxidoredutase e a ATPase
ou ATP sintetase que funciona como uma forccedila proacuteton motriz que direciona a
siacutentese de ATP (NELSON YOCUM 2006) (Figura 3)
Figura 3 Complexos fotossinteacuteticos em membranas de tilacoacuteides Fonte httpwwwportalsaofranciscocombralfafotossintesehistorico-da-fotossintesephp
Os FSI e FSII contecircm clorofilas e outros pigmentos que absorve a energia
luminosa e as direcionam para o centro de reaccedilatildeo (RC) (Figura 4) O centro de
reaccedilatildeo fotossinteacutetico do FSI possui proteiacutenas com o centro contendo agregados de
Ferro-enxofre (Fe-S) como uacuteltimo aceptor de eleacutetrons e o FSII possui quinona como
uacuteltimo aceptor de eleacutetrons (HEATHCOTE et al 2003) A energia capturada pelo
centro de reaccedilatildeo induz a excitaccedilatildeo de um par especial de clorofila na qual inicia a
translocaccedilatildeo de um eleacutetron atraveacutes da membrana Aacutegua doadora de eleacutetrons para
esse processo eacute oxidada fotoquimicamente a O2 liberando 4 H+ e 4 eleacutetrons pelo
centro fotooxidativo do FSII (P680) Este eacute responsaacutevel pela conversatildeo da energia
luminosa em energia de oxido-reduccedilatildeo (McEVOY et al 2005)
43
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do fotossistema Adaptaccedilatildeo Fontehttpkentsimmonsuwinnipegcacm1504lightreacthtm
Os eleacutetrons extraiacutedos da aacutegua satildeo lanccedilados para quinona (PQ) formando
quinona reduzida (PQH2) (BARBER 2006) A quinona reduzida tambeacutem conhecida
como quinol pode se dissociar do centro de reaccedilatildeo e difundir ateacute o complexo
citocromo b6f O complexo citocromo b6f transfere eleacutetrons da quinona reduzida
(PQH2) ateacute a plastocianina que eacute uma proteiacutena perifeacuterica moacutevel que conteacutem cobre e
que tem como principal funccedilatildeo transferir eleacutetrons do citocromo b6f ateacute o P700 centro
de reaccedilatildeo do Fotossistema I Esse processo permite a transferecircncia de proacutetons da
face externa para a face interna da membrana tilacoidal e a criaccedilatildeo de gradiente
eletroquiacutemico de proacutetons atraveacutes da membrana Energia luminosa absorvida pelo
FSI (P700) induz a transferecircncia de eleacutetrons da plastocianina localizada na face
interna da membrana para a ferredoxina localizada na face externa (NELSON
BEN-SHEM 2002) Outra proteiacutena associada ao Fotossistema I eacute a flavoproteiacutena
ferredoxina-NADP oxidoredutase que reduz o NADP+ a NADPH2 completando a
sequumlecircncia do transporte natildeo-ciacuteclico de eleacutetrons que comeccedila com a oxidaccedilatildeo da
moleacutecula de aacutegua (NELSON YOCUM 2006) A reduccedilatildeo da ferredoxina eacute
subsequentemente usada em numerosas reaccedilotildees de siacutentese e ciclos regulatoacuterios
incluindo assimilaccedilatildeo de nitrato desnaturaccedilatildeo de aacutecido graxo e produccedilatildeo de
NADPH (McCARTY et al 2000 CHITNIS 2001) Essas reaccedilotildees soacute ocorrem na
presenccedila de luz Independentemente da presenccedila de luz a reduccedilatildeo do CO2 a
44
carboidratos ciclo de Calvin ocorre devido a presenccedila de ATP e NADPH (NELSON
YOCUM 2006)
A diferenccedila de carga entre FSI e o FSII juntamente com a transferecircncia de
eleacutetrons atraveacutes do complexo citocromo b6f induz a formaccedilatildeo de um potencial
eletroquiacutemico atraveacutes da membrana na qual potencializa a siacutentese de ATP por um
complexo de quatro proteiacutenas denominadas de ATPase (McCARTY et al 2000)
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da fase fotoquiacutemica Adaptado Fonte httpwwwuiceduclassesbiosbios100lecturesf04amlect10htm
O controle metaboacutelico do consumo de energia isto eacute a soma de energia
capturada pelo aparato fotossinteacutetico e estocada na forma de energia quiacutemica a
taxa de fixaccedilatildeo do carbono e a produccedilatildeo de biomassa eacute um processo mediado por
enzimas Isto implica que a taxa maacutexima do consumo de energia depende da
natureza do micro-organismo (RUBIO et al 2003) A reaccedilatildeo de captura de luz eacute
muito mais raacutepida que as reaccedilotildees subsequumlentes mediada por enzimas a taxa
maacutexima da fotossiacutentese deve ser controlada pela concentraccedilatildeo de uma das enzimas
do ciclo de Calvin (SUKENIK et al 1997 RUBIO et al 2003)
Alguns autores como Hirata et al (1998) e Chojnacka Noworyta (2004a)
identificaram regiotildees que correlacionam o crescimento da Arthrospira ssp e a
intensidade luminosa Essas regiotildees satildeo
Regiatildeo limitada por luz baixa intensidade luminosa onde ocorre um aumento
da concentraccedilatildeo celular com um aumento da intensidade luminosa
Regiatildeo saturada por luz alta intensidade luminosa onde o crescimento celular
independe da intensidade luminosa
Regiatildeo inibida por luz a intensidade luminosa eacute muito alta inibindo o
crescimento celular e ateacute mesmo pode provocar a morte celular
45
A intensidade luminosa eacute fundamental para que ocorra o metabolismo
fotossinteacutetico mas por outro lado altas intensidades luminosas podem danificar o
complexo fotossinteacutetico levando a morte celular Esse processo eacute denominado de
fotoinibiccedilatildeo (RUBIO et al 2003) O excesso de luz pode danificar o centro de
reaccedilatildeo dos fotossitemas II (SAMUELSSON 1985 LU VONSHAK 1999) eou
fotossistema I (SONOIKE 1996)
A fotoinibiccedilatildeo eacute um estado de estresse fisioloacutegico que ocorre em todos os
organismos fotossintetizantes envolvendo o oxigecircnio causado devido a um excesso
de iluminaccedilatildeo A danificaccedilatildeo ocorre primeiramente no centro de reaccedilatildeo do
fotossistemas II reduzindo abruptamente a eficiecircncia do transporte de eleacutetrons
fotossinteacutetico somente quando a taxa da danificaccedilatildeo excede ao do seu reparo na
qual requer o turnover da siacutentese das proteiacutenas do PSII A inibiccedilatildeo pela luz pode
envolver a participaccedilatildeo de todas as atividades realizadas pelo sistema fotossinteacutetico
tais como degradaccedilatildeo e substituiccedilatildeo dos componentes e organizaccedilatildeo da unidade
funcional (ADIR et al 2003)
A fotoinibiccedilatildeo ocorre quando o sistema antena absorve luz em excesso
danificando o sistema fotossinteacutetico O excesso de excitaccedilatildeo pode ser obtido por um
aumento da intensidade luminosa acima do niacutevel de saturaccedilatildeo da taxa fotossinteacutetica
(CHOJNACKA NOWORYTA 2004a) Portanto isso tambeacutem pode ocorrer em
condiccedilotildees moderadas de intensidade luminosa se as ceacutelulas adaptadas a baixa
intensidade luminosa forem transferidas a maiores intensidade luminosas (RUBIO et
al 2003) ou se taxa fotossinteacutetica estiver limitada por fatores de estresse como
baixas temperaturas (GOMBOS et al 1994) eou excesso de sal no meio (LU
ZHANG 2000) o que pode induzir a fotoinibiccedilatildeo em condiccedilotildees de luz moderada
(SAMUELSSON 1985)
A danificaccedilatildeo do fotossistema II consiste na inativaccedilatildeo dos sistemas que
envolvem oxigecircnio carreadores de eleacutetrons e proteiacutenas D1D2 (RUBIO et al 2003)
No FSI a inibiccedilatildeo eacute iniciada pela inativaccedilatildeo do aceptor de eleacutetrons seguindo com a
destruiccedilatildeo do centro de reaccedilatildeo e degradaccedilatildeo do produto do gen psaB que eacute uma
das duas maiores subunidades peptiacutedicas do complexo do centro de reaccedilatildeo do FSI
Baixas temperaturas e estresse oxidativos satildeo caracteriacutesticas requeridas para a
fotoinibiccedilatildeo do FSI in vivo (SONOIKE 1996)
Adir et al (2003) relataram que a fotoinibiccedilatildeo eacute observada tanto sob altas
intensidades luminosas quando o mecanismo de reparo de proteiacutenas atinge sua
46
capacidade maacutexima ou em baixa intensidade luminosa quando fatores externos
adicionais prejudicam seu reparo e a exposiccedilatildeo a alta intensidade luminosa
prolongada induz a um excesso de efeitos secundaacuterios que contribui para uma
reduccedilatildeo na capacidade fotossinteacutetica
Fatores como efeito sombreamento em culturas densas de ceacutelulas a remoccedilatildeo
de O2 e o aumento da concentraccedilatildeo de CO2 podem proteger os micro-organismos
contra o efeito fotooxidativo (ELOFF et al 1976)
Van Eykelenburg (1979) observou que a intensidade luminosa natildeo afeta as
caracteriacutesticas morfoloacutegicas como o tamanho da heacutelice e o diacircmetro da S platensis
e que a concentraccedilatildeo dos gracircnulos de poliglicano diminui com o aumento da
intensidade luminosa
Bezerra et al (2008) observaram que os teores de lipiacutedios e proteiacutenas obtidos
nas biomassas finais foram influenciados pela intensiade luminosa menores
intensidades luminosas conduziram a um aumento no conteuacutedo total de lipiacutedios e de
proteiacutenas
2421 Pigmentos
Para a energia luminosa ser utilizaacutevel pelos organismos fotossinteacuteticos ela
deve inicialmente ser absorvida por pigmentos especiacuteficos tais como clorofila
carotenoacuteides e ficobilinas Esses pigmentos encontram-se associados a proteiacutenas
nas lamelas fotossinteacuteticas formadas por tilacoacuteides Isso permite uma disposiccedilatildeo
espacial que torna muito eficiente a propagaccedilatildeo de energia absorvida (MARZOCCO
TORRES 1999)
Nas cianobacteacuterias tais como A platensis a fotossiacutentese ocorre principalmente
nas membranas tilacoidais onde estatildeo localizados os pigmentos fotossitneacuteticos
clorofila a carotenoacuteides e ficocianina (COGNO et al 2003) As lamelas tilacoidais
satildeo duas linhas paralelas em formato de disco fechado onde estatildeo localizados a
clorofila celular (clorofila a) e os carotenoacuteides (VAN YKELENBURG 1979)
O aparato fotossinteacutetico das cianobacteacuterias consiste principalmente de trecircs
tipos de complexos macromoleculares fotossistema I fotossistema II e os
ficobilissomos O FSI e o FSII satildeo complexos intriacutensecos onde os ficobilissomos
estatildeo sobre a superfiacutecie externa dos tilacoiacutedes na forma de esferas (GANTT 1981
LIU et al 2005) Os ficobilissomos auxiliam na absorccedilatildeo da energia luminosa em
47
um intervalo do espectro maior que as clorofilas absorvem (500-680 nm) permitindo
as espeacutecies que possuem essas antenas a utilizar todo o intervalo da luz visiacutevel
emitido pelo sol (KUMAR MURHTY 2007)
Os ficobilissomos estatildeo unidos nas lamelas tilacoiacutedais e funcionam como
antenas captadoras de luz que transferem a energia excitante para o centro de
reaccedilatildeo dos fotossistemas (VAN EYKELENBURG 1979) A maior parte da energia
luminosa eacute absorvida por complexos pigmentos-proteiacutenas chamados de
ficobilissomos Os componentes dos ficobilissomos as ficobiliproteiacutenas satildeo
responsaacuteveis pela pigmentaccedilatildeo verde-azulada da maioria das cianobacteacuterias Os
ficobilissomos satildeo agregados de alto peso molecular compostos por ficocianina
aloficocianina e ficoeritrina (com pico de absorbacircncia de 615 nm 650 nm e 565 nm
respectivamente) Com o aumento da intensidade luminosa os ficobilissomos satildeo
menos abundantes (VAN EYKELENBURG 1979)
As ficobiliproteiacutenas presentes nos gracircnulos de ficobilissomos podem constituir
mais de 60 de proteiacutena soluacutevel em cianobacteacuterias (HOUMARD 1994) Isso eacute o
que caracteriza a Spirulina spp por ser comercializada como um suplemento
alimentar rico em proteiacutenas (TANDEAU de MARSAC HOUMARD 1993) As
ficobiliproteinas purificadas possuem uma variedade de funccedilotildees como substituinte
de corantes sinteacuteticos em alimentos e produtos cosmeacuteticos sondas para meacutetodos de
imunodiagnoacutesticos citometria de fluxo e microscopia de fluorescecircncia (STANIER e
COHEN-BAZIRE 1977 SPOLAORE et al 2006)
As maiores classes da ficobiliproteinas satildeo ficoeritrina (PE) ficoeritrocianina
(PEC) ficocianina (PC) e aloficocianina (APC) (CIFERRI 1983) A absorccedilatildeo
maacutexima satildeo 540ndash570 570ndash590 610ndash620 e 650ndash655 nm para PE PEC PC e APC
respectivamente (STANIER COHEN-BAZIRE 1977 CIFERRI 1983)
Aleacutem das ficobiliproteiacutenas as cianobacteacuterias contecircm as clorofilas e os
carotonoacuteides para absorccedilatildeo de energia luminosa Entre os carotenoacuteides encontram-
se o β-caroteno o mais importante e as xantofilas que satildeo carotenos oxigenados
(MARZZOCO TORRES 1999)
As clorofilas satildeo os pigmentos naturais presentes nas plantas cianobacteacuterias e
algas O nome clorofila foi proposto por Pelletier e Caventou em 1818 para
designar a substacircncia verde que se podia extrair das folhas com o auxiacutelio do aacutelcool
Atualmente os pigmentos clorofilianos satildeo de grande importacircncia comercial
podendo ser utilizados tanto como pigmentos quanto como antioxidantes Os
48
pigmentos fotossinteacuteticos presentes e a sua abundacircncia variam de acordo com a
espeacutecie A clorofila a (Chl a) estaacute presente em todos os organismos que realizam
fotossiacutentese oxigecircnica As bacteacuterias fotossintetizantes satildeo desprovidas de clorofila a
e possui em seu lugar a bacterioclorofila como pigmento fotossinteacutetico A Chl a eacute o
pigmento utilizado para realizar a fotoquiacutemica (o primeiro estaacutegio do processo
fotossinteacutetico) enquanto que os demais pigmentos auxiliam na absorccedilatildeo de luz e na
transferecircncia da energia radiante para os centros de reaccedilatildeo sendo assim chamados
de pigmentos acessoacuterios (STREIT et al 2005) As cianobacteacuterias possuem clorofila
a e ficobilinas mas natildeo possuem a clorofila b (GRIFFITHS 2006)
As clorofilas satildeo as moleacuteculas fotorreceptoras mais importantes Satildeo moleacuteculas
formadas por complexos derivados da porfirina tendo como aacutetomo central o Mg
(magneacutesio) (Figura 6) Esse composto eacute uma estrutura macrociacuteclica assimeacutetrica
totalmente insaturada constituiacuteda por quatro aneacuteis de pirrol Esses aneacuteis numeram-
se de 1 a 4 ou de ldquoardquo a ldquodrdquo de acordo com o sistema de numeraccedilatildeo de Fisher
(SCHOEFS 2002) A clorofila a o anel de porfirina conteacutem um grupo metil (-CH3) no
Carbono 3 A estrutura quiacutemica da clorofila estaacute representada na Figura 6
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da moleacutecula da clorofila a Fontehttp1381926868bioCoursesbiochem2PhotosynthesisPhotosynthesis1html
Os pigmentos que absorvem luz fazem parte de complexos proteacuteicos que
atravessam a membrana tilacoidal denominados de fotossistemas Esses satildeo
unidades funcionais das reaccedilotildees da fotossiacutentese Cada fotossistema pode conter
vaacuterias moleacuteculas de clorofila carotenoacuteides e ficobilinas todas capazes de absorver
luz por isso denominada de moleacuteculas-antena Os carotenoacuteides e as ficobilinas
apresentam absorccedilatildeo em regiatildeo do espectro luminoso em que as clorofilas
49
absorvem pouco e isso permite a ampliaccedilatildeo do espectro luminoso utilizado na
fotossiacutentese (MARZOCCO TORRES 1999)
A composiccedilatildeo de pigmentos da Spirulina eacute tiacutepica de uma cianobacteacuteria a uacutenica
clorofila presente eacute a clorofila a que tem seu peso variando entre 08 e 15 do
peso seco As proteiacutenas que possuem maior potencial econocircmico satildeo as
biliproteiacutenas Nas Spirulinas existem duas biliproteiacutenas c-ficonianina e a
aloficocianina A fraccedilatildeo proteacuteica pode conter mais de 20 de ficocianina um
pigmento azul soluacutevel em aacutegua (VONSHAK 1997) Entre os carotenoiacutedes 67-79 eacute
constituiacutedo do β-caroteno As maiorias dos carotenoacuteides da Spirulina satildeo β-caroteno
β-cryptoxantina e zeaxantina (LORENZ 1999)
Os carotenoacuteides carotenos e xantofilas aleacutem de sua funccedilatildeo de absorver
energia luminosa satildeo capazes de dissipar a energia de excitaccedilatildeo excedente na
forma de calor evitando danos ao aparato fotossinteacutetico Enquanto que como
transdutores de energia ateacute o centro de reaccedilatildeo natildeo satildeo muito eficiente (30 - 40
de eficiecircncia) como dissipadores de energia absorvida em excesso pela clorofila
satildeo altamente eficientes (MANRIQUE 2003)
A zeaxantina eacute capaz de receber a energia diretamente da clorofila excitada e
dissipa-laacute posteriormente na forma de calor sem emissatildeo de radiaccedilatildeo O processo
se inverte quando a luz desaparece ou vai se tornando menos intensa
progressivamente finalizando o ciclo A dissipaccedilatildeo da energia eacute devido a
zeaxantina (MANRIQUE 2003)
Os pigmentos acessoacuterios satildeo fundamentais para a realizaccedilatildeo da fotossiacutentese
pelos organismos Algas que possuem apenas a clorofila a como Ochromonas
malhamensis e a Nannochloris oculata crescem mais rapidamente em presenccedila de
substrato orgacircnico que em presenccedila apenas da luz como fonte de energia mesmo
sob condiccedilotildees oacutetimas de luz Os pigmentos acessoacuterios atuam somente absorvendo
energia contribuindo para a fotossiacutentese (BRODY BRODY 1962)
No entanto a captaccedilatildeo de energia para a funccedilatildeo fotossinteacutetica natildeo eacute a uacutenica
funccedilatildeo dos pigmentos fotossinteacuteticos estes satildeo sistemas fotoprotetores quando a
intensidade luminosa eacute excessiva Quando nem todos os foacutetons absorvidos pela
clorofila podem ser utilizados no processo fotoquiacutemico eacute desencadeado um
mecanismo para dissipar o excesso de energia e evitar danos as membranas
fotossinteacuteticas e a proacutepria clorofila resultando em um branqueamento das ceacutelulas
com uma consequumlente reduccedilatildeo ou perda da capacidade fotossinteacutetica Na presenccedila
50
de excesso de luz o oxigecircnio reage com a clorofila excitada originando um oxigecircno
singlete que eacute muito mais reativo podendo oxidar as clorofilas (branqueamento) os
aacutecidos graxos polinsaturados que forma peroacutexidos e outros compostos Entatildeo os
carotenoacuteides dissipam o radical peroacutexido e tambeacutem a clorofila excitada adquirindo o
estado triplete que por sua vez se dissipa despreendendo calor para o meio externo
(MANRIQUE 2003)
243 Fontes de carbono
De acordo com Chojnacka e Maacuterquez-Rocha (2004b) a fonte de carbono
empregada e a utilizaccedilatildeo ou natildeo de energia luminosa podem classificar os cultivos
em
Cultivo heterotroacutefico ndash emprego exclusivo de compostos orgacircnicos como fonte
energeacutetica O carbono orgacircnico serve tanto como fonte energeacutetica quanto para a
formaccedilatildeo da biomassa
Cultivo autotroacutefico (ou fotoautotroacutefico) ndash emprego da luz como exclusiva fonte
energeacutetica para a reduccedilatildeo (fixaccedilatildeo) do CO2 (considerado de fonte inorgacircnica)
formando substacircncias orgacircnicas
Cultivo mixotroacutefico ndash utilizaccedilatildeo simultacircnea de uma fonte luminosa e carbono
orgacircnico como fonte de energia
2431 Fonte de carbono orgacircnico (crescimento hetorotroacutefico)
A A platensis cresce principalmente em meios de cultura contendo carbono
inorgacircnico e poucos trabalhos tecircm sido publicados utilizando apenas fonte de
carbono orgacircnico Como fonte orgacircnica de carbono os accediluacutecares satildeo os substratos
mais utilizados para os cultivos heterotroacuteficos e mixotroacuteficos (ZHANG et al 1998
MARQUEZ et al 1993 CHOJNACKA NOWORYTA 2004b MUumlHLING et al 2005
ANDRADE COSTA 2007)
Ogawa and Terui (1970) foram os primeiros a relatar que uma cultura axecircnica
de Spirulina platensis cresce em meio mineral enriquecido com 1 de peptona e
tem uma taxa de crescimento maior que as culturas cultivadas em meio mineral
Marquez et al (1993) relataram que a Spirulina platensis cresce heterotroficamente
sob glicose em condiccedilotildees aeroacutebias no escuro bem como mixotroficamente na
presenccedila de luz Chojnacka e Noworyta (2004a) tambeacutem observaram o crescimento
51
da S platensis em condiccedilotildees heterotroacuteficas utilizando a glicose com fonte de
carbono e energia
S platensis podem utilizar tambeacutem glicerol como a uacutenica fonte de carbono no
entanto as ceacutelulas quando em contato com o glicerol pela primeira vez formam
agregados de ceacutelulas e passam por uma fase lag de adaptaccedilatildeo Apoacutes a sua sub-
cultura as ceacutelulas cresceram utilizando glicerol atingido 1287 mg L-1 e nos cultivos
com apenas bicarbonato como fonte de carbono obteve 1157mg L-1 (NARAYAN et
al 2005)
Por outro lado Soundarapandian e Vasanthi (2008) relataram que diferentes
cepas de S platensis isoladas de solo satildeo incapazes de utilizar apenas fontes de
carbono orgacircnico como D-glucose manitol sacarose e ureacuteia
2432 Fonte de carbono inorgacircnico (Crescimento autotroacutefico)
Microalgas fototroacuteficas requerem CO2 como fonte de carbono e este contribui
para o controle do pH no meio O pH do meio de cultivo eacute um dos fatores mais
importantes no cultivo de algas O pH determina a solubilidade do dioacutexido de
carbono e minerais no meio e influencia direta ou indiretamente o metabolismo das
algas O pH depende de vaacuterios fatores como composiccedilatildeo e capacidade tamponante
do meio quantidade de dioacutexido de carbono dissolvido temperatura (que determina a
solubilidade do CO2) e atividade metaboacutelica das ceacutelulas (BECKER 1995)
A fonte de carbono principal para a A platensis eacute o iacuteon bicarbonato no qual
entra na ceacutelula por transporte ativo O bicarbonato intracelular eacute entatildeo desidratado
via anidrase carbonica para CO2 o qual eacute incorporado no ciclo de Calvin via
ribulose-15-bifosfato carboxilase (RUBISCO) Este carbono eacute usado
simultaneamente para a siacutentese de todas as macromoleacuteculas nas ceacutelulas (proteiacutenas
carboidratos lipiacutedios e aacutecidos nucleacuteicos) a partir do 3-fosfoglicerato como metaboacutelito
intermediaacuterio (COGNE et al 2003)
Durante o cultivo autotroacutefico da Spirulina sp ocorre um raacutepido aumento do pH
no meio de cultura e isso eacute causado pela dissociaccedilatildeo do aacutecido carbocircnico (H2CO3)
em bicarbonato (HCO3-) e OH- (KIM et al 2007) e o bicarbonato eacute dissociado para
produzir CO2 e OH- (RICHMOND GROBBELAAR 1986) O aumento do pH atua
como um autoinibidor do crescimento celular (RICHMOND 2000) e portanto o CO2
pode ser utilizado para a manutenccedilatildeo do pH oacutetimo
52
Em cianobacteacuterias alcalofiacutelicas onde o pH de crescimento tiacutepico eacute 10 a
concentraccedilatildeo de CO2 eacute negligenciada sugerindo que o transporte de CO2 passivo
natildeo poderia contribuir significativamente para carbono inorgacircnico intracelular
Adicionalmente estudos tecircm mostrado que A platensis eacute fortemente dependente do
transporte simporte Na+HCO3- para a assimilaccedilatildeo do carbono inorgacircnico Como eacute
tiacutepico de alcalofiacutelicos a A platensis aparentemente natildeo manteacutem o gradiente de pH
externo positivo na sua membrana plasmaacutetica Consequentemente ocorre uma
extrusatildeo de soacutedio via bomba de soacutedio dependente de ATP em contraste com o
tranporte antiporte Na+H+ na maioria das cianobacteacuterias A Extrusatildeo de soacutedio na
presenccedila de um inibidor do FSII (diuron) indica que uma soma significante de ATP eacute
suplementada pelo transporte de eleacutetrons ciacuteclico em volta do FSI conteuacutedo na qual
em A platensis eacute excepcionalmente alto (BERRY et al 2003)
Anaacutelises quiacutemicas tecircm mostrado que biomassa algal consiste de 40 a 50 de
carbono na qual sugere que 15 a 2 kg de CO2 satildeo necessaacuterios para produzir 1 kg
de biomassa (SOBCZUK et al 2000) Do mesmo modo Chisti (2007) relata que
considerando que a biomassa microalgal possui aproximadamente 50 de carbono
em sua biomassa seca (SAacuteNCHEZ MIROacuteN et al 2003) todo esse carbono eacute
derivado do dioacutexido de carbono A produccedilatildeo de 100 toneladas de biomassa algal fixa
em torno de 183 toneladas de dioacutexido de carbono e este deve ser suplementado
continuamente durante o cultivo iluminado A adiccedilatildeo controlada do CO2 em
respostas aos sinais de sensores de pH minimizam a perda de CO2 e a variaccedilatildeo do
pH (CHISTI 2007)
O sistema de transporte do CO2 inclui a anidrase carbocircnica que converte o CO2
para HCO3- durante a passagem atraveacutes da membrana plasmaacutetica havendo um
acuacutemulo de HCO3- quando o CO2 eacute suplementado A concentraccedilatildeo de CO2
citoplasmaacutetico eacute abaixo do esperado no equiliacutebrio quiacutemico e de acordo com o
modelo proposto pelo mecanismo de concentraccedilatildeo de carbono esse desequiliacutebrio eacute
relatado pelo fato que a anidrase carbocircnica estaacute localizada dentro dos
carboxissomos na membrana plasmaacutetica eou membranas tilacoacuteidais e estaacute ausente
no citoplasma (KAPLAN REINHOLD 1999)
O CO2 entra na ceacutelula pela difusatildeo passiva e a conversatildeo do CO2 para o HCO3-
pela anidrase carbocircnica natildeo permite a sua passagem livremente para fora da ceacutelula
(CARRIERI et al 2007) A concentraccedilatildeo de CO2 nos carboxissomos eacute de 50000
vezes maior que a concentraccedilatildeo extracelular Isso implica em uma resistecircncia a
53
difusatildeo do CO2 pela membrana bioloacutegica extremamente alta apesar do CO2 ser
altamente permeaacutevel agrave membrana bilipiacutedica Geralmente as algas apresentam um
acuacutemulo de carbono inorgacircnico menor que em cianobacteacuterias isso por que a
RubisCO das algas apresentam maior afinidade pelo CO2 (KAPLAN REINHOLD
1999)
O CO2 que entra na ceacutelula por difusatildeo passiva eacute convertido para HCO3- pela
ldquoCA-likerdquo por uma reaccedilatildeo dependente de energia e a assimilaccedilatildeo ativa do HCO3-
que eacute contra seu potencial eletroquiacutemico depende do suplemento da energia
metaboacutelica Essa energia necessaacuteria eacute provavelmente dependente do transporte
ciacuteclico do eleacutetron em torno do FSI e da atividade do FSII (SOBCZUK et al 2000)
Portanto isso ainda natildeo tem sido estabelecido se esta dependecircncia eacute direta ou
indireta (via gradiente de iacuteons) A energia metaboacutelica deveria ser utilizada para
manter o gradiente de iacuteon O antiporte Na+H+ estaacute envolvido na regulaccedilatildeo e
manutenccedilatildeo do pH interno durante a entrada do HCO3- e subsequumlente fixaccedilatildeo do
CO2 (KAPLAN REINHOLD 1999)
As microalgas podem fixar carbono a partir de diferentes fontes tais como CO2
a partir da atmosfera CO2 a partir da exaustatildeo de gases industriais e CO2 na forma
de carbonatos soluacuteveis (eg NaHCO3 e Na2CO3) Tradicionalmente microalgas satildeo
cultivadas em reatores fechados ou abertos na qual satildeo aerados ou expostos ao ar
para permitir que a microalgas capturem o dioacutexido de carbono a partir da atmosfera
para o crescimento celular Como a atmosfera conteacutem somente 003 ndash 006 de
CO2 eacute esperado que a limitaccedilatildeo da transferecircncia de massa possa reduzir a
velocidade do crescimento das microalgas (CHELF et al 1993) Por outro lado
gases da exaustatildeo industrial tais como gases de combustatildeo possuem acima de 15
de CO2 fornecendo uma fonte rica de CO2 para o cultivo de microalgas e um
caminho potencialmente mais eficiente para biofixaccedilatildeo de CO2 Outra alternativa eacute
fixar o CO2 pela reaccedilatildeo quiacutemica para produzir carbonatos (exemplo Na2CO3) e usa-
la mais tarde como fonte de carbono para o cultivo de microalgas (WANG et al
2008)
Estudos sobre a eficiecircncia da utilizaccedilatildeo de CO2 por microalgas tecircm sido feitos
com o objetivo de melhorar a produtividade dos fotobiorreatores Morais e Costa
(2007b) observou que uma concentraccedilatildeo de Spirulina sp foi maior em cultivos
alimentados com 6 e 12 CO2 quando comparado ao cultivo utilizando somente o
ar atmosfeacuterico Watabane e Hall (1996) relataram um aumento na produtividade
54
correspondendo a 159 g de biomassa seca m-2 d-1 no cultivo utilizando o
fotobiorreator com air lift com ar enriquecido de CO2 (4)
Gordillo et al (1999) observaram uma reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo celular
maacutexima de S platensis devido a reduccedilatildeo na quantidade de proteiacutenas soluacuteveis
clorofila a carotenoacuteides totais e ficocianina nos cultivos enriquecido com 1 de CO2
em relaccedilatildeo aos cultivos enriquecidos com CO2 atmosfeacuterico (0035) Portanto altas
concentraccedilatildeo de CO2 podem inibir o crescimento dos micro-organismos
Em cultivo fotoautotroacutefico de Chlorella o conteuacutedo de proteiacutenas e pigmentos
foram maiores quando comparada com o cultivo heterotroacutefico (OGBONNA TANAKA
1997)
2433 Fonte de carbono inorgacircnico e orgacircnico simultaneamente
(crescimento mixotroacuteficos)
A presenccedila do metabolismo fotoautotroacutefico e heterotroacutefico simultacircneo tecircm sido
confirmado para o crescimento de microalgas como por exemplo Chlorella vulgaris
(MAacuteRQUEZ et al 1993) Heamatococcus pluvialis (KOBAYASHI et al 1992
MAacuteRQUEZ et al 1993) Chlorella pyrenoidosa (OGBANNA TANAKA 1996)
Euglena gracilis (OGBONNA et al 1999) Phaeodactylum tricornutum (CEacuteRON
GARCIA et al 2000) e cianobacteacuterias como Spirulina platensis (MARQUEZ et al
1995 CHOJANACKA NOWORYTA 2004 ZHANG et al 1998)
Durante o crescimento mixotroacutefico haacute dois processos metaboacutelicos
independentes dentro das ceacutelulas metabolismo fotossinteacutetico e a respiraccedilatildeo
aeroacutebia Nesse tipo de metabolismo a presenccedila do substrato orgacircnico significa que o
crescimento celular natildeo eacute estritamente dependente da fotossiacutentese e ateacute mesmo a
luz pode deixar de ser um fator indispensaacutevel para o crescimento celular
(CHOJNACKA NOWORYTA 2004a)
Eacute interessante notar que o crescimento especiacutefico de algumas microalgas (ex
Chlorella vulgares Haematococus pluvialis) crescendo mixotroficamente eacute a soma
de suas velocidades especiacuteficas de crescimento em culturas fotossinteacuteticas e
heterotroacuteficas (LEE 2001 OGBONNA et al 2000)
Um possiacutevel modo para obter uma alta concentraccedilatildeo de micro-organismos
fotossinteacuteticos eou produtos desses micro-organismos eacute o uso de cultura
mixotroacutefica onde fontes de carbono orgacircnicas e inorgacircnicas satildeo concomitantemente
fornecidas ao biorreator Sob determinadas condiccedilotildees de cultivo ambas a atividade
55
fotoautotroacutefica e a heterotroacutefica podem ocorrer simultaneamente e
independentemente resultando no aumento da velocidade especiacutefica de
crescimento como jaacute referido anteriormente
Maacuterquez et al (1993) relatam que a Spirulina platensis eacute capaz de crescer em
cultivo heterotroacutefico na presenccedila de glicose bem como mixotroficamente na
presenccedila de luz sugerindo que os crescimentos autotroacutefico e heterotroacutefico
funcionam independentemente no crescimento mixotroacutefico Nieva e Valiente (1996)
portanto observaram uma reduccedilatildeo na taxa de fixaccedilatildeo de CO2 em condiccedilotildees de
crescimento mixotroacutefico da Anabaena variabilis sugerindo que alguns aspectos do
metabolismo do CO2 podem ser modulados pela presenccedila de carbono orgacircnico Do
mesmo modo Kang et al (2004) observou que pode existir alguma interaccedilatildeo entre o
metabolismo de carbono orgacircnico e inorgacircnico uma vez que a presenccedila do carbono
inorgacircnico acelerou a assimilaccedilatildeo do carbono orgacircnico durante o cultivo do
Synechococcus spPCC7002 A intensidade luminosa favoreceu o crescimento
mixotroacutefico do Synechocystis sp PCC 6803 utilizando glicose como fonte de
carbono Este fenocircmeno pode ser explicado pelo efeito positivo da luz sobre o
fotossistema I (WANG et al 2002) A via glicoliacutetica o ciclo dos aacutecidos tricarboxiacutelicos
(TCA) e a fosforilaccedilatildeo oxidativa mitocondrial mantiveram alta atividade nos cultivos
de Chlorella pyrenoidosa durante a iluminaccedilatildeo indicando pouco efeito da luz nessas
vias metaboacutelicas Portanto o fluxo atraveacutes da via das pentoses fosfato durante a
iluminaccedilatildeo foi muito pequena devido a regulaccedilatildeo mediada pela luz (YANG et al
2000)
Adicionalmente Maacuterquez et al (1993) concluiacuteram que a Spirulina platensis tem
a habilidade de realizar a fermentaccedilatildeo embora soacute utilize essa estrateacutegia como um
modo de sobrevivecircncia sob condiccedilotildees anaeroacutebicas e no escuro
Nos cultivos de S platensis suplementados com glicose alcanccedilaram o
crescimento maior que nos cultivos sob condiccedilotildees de crescimento fotoautotroacuteficos
(MARQUEZ et al 1995 1993) Chen et al (2006) observaram que a suplementaccedilatildeo
de acetato como fonte de carbono proporcionou um aumento significante da
concentraccedilatildeo celular e da produccedilatildeo de clorofila a luteiacutena -caroteno ficocianina e
aloficocianina quando comparada ao cultivo fotoautotroacutefico
O melaccedilo subproduto da induacutestria de accediluacutecar que conteacutem mais do que 50 de
accediluacutecar tambeacutem pode ser um substrato suplementado de baixo custo na produccedilatildeo
56
industrial para o crescimento mixotroacutefico de Spirulina platensis (ANDRADE COSTA
2007)
O emprego de cultivos mixotroacuteficos pode levar as ceacutelulas agrave siacutentese de
compostos caracteriacutesticos tanto de cultivos fotoautotroacuteficos quanto heterotroacuteficos
como pode implicar em altas taxas de produccedilatildeo de biomassa (CERON GARCIA et
al 2000) Uma vez que num cultivo mixotroacutefico o CO2 e o carbono orgacircnico satildeo
simultaneamente assimilados este tipo de cultivo pode ser o processo mais eficiente
para a produccedilatildeo de biomassa microalgal visto que implica em uma economia na
energia gasta para a siacutentese de todo o aparato fotossinteacutetico e para a fixaccedilatildeo de
carbono (LEE 2004)
25 Produccedilatildeo de CO2 e VOCs proveniente da fermentaccedilatildeo alcoacuteolica
A revoluccedilatildeo industrial e a intesa utilizaccedilatildeo dos combustiacuteveis foacutesseis (carvatildeo
petroacuteleo e gaacutes natural) estatildeo associadas ao elevado niacutevel de vida das sociedades
ocidentais Contudo as reservas de combustiacuteveis foacutesseis satildeo limitadas e a sua
utilizaccedilatildeo tem impactos ambientais consideraacuteveis como por exemplo o aumento do
efeito estufa e as consequumlentes alteraccedilotildees do clima Neste contexto o etanol surge
como uma alternativa vaacutelida em termos de fonte de energia renovaacutevel e menos
poluente
Nas uacuteltimas deacutecadas o etanol tem ocupado um lugar de destaque e de grande
importacircncia tecnoloacutegica firmando-se como um produto estrateacutegico economicamente
por ser amigaacutevel com o meio ambiente pois eacute um aditivo ao combustiacutevel que reduz
a emissatildeo de monoacutexido de carbono oacutexido de nitrogecircnio e hidrocarbonos (WHEALS
et al 1999) e por ser produzido a partir de biomassa renovaacutevel como accediluacutecar e
amido atualmente e materiais de lignocelulose no futuro (GOLDEMBERG 2009)
Inicialmente o objetivo de utilizar o aacutelcool combustiacutevel era se tornar
independente do mercado do petroacuteleo e reduzir os custos de sua importaccedilatildeo Hoje
em dia a ecircnfase do uso do etanol combustiacutevel estaacute sobre a reduccedilatildeo da poluiccedilatildeo
devido ao protocolo de Quioto para limitar o aquecimento global (WHEALS et al
1999) Na produccedilatildeo e combustatildeo do etanol de milho pode reduzir em ateacute 12 a
emissatildeo de gases causadoras do efeito estufa quando comparado com o uso de
combustiacuteveis foacutesseis (HILL et al 2006) e quando utilizado etanol de cana-de-accediluacutecar
essa reduccedilatildeo pode ser de 66 (ANDREOLI SOUZA 2006)
57
O aacutelcool estaacute em expansatildeo por ser um combustiacutevel de baixo custo renovaacutevel e
cujo emprego como alternativa para a matriz energeacutetica mundial estaacute em fase de
crescimento A tendecircncia de aumento da produccedilatildeo de aacutelcool no Brasil ocorre por
vaacuterios fatores como aumento da frota de carros bi-combustiacutevel (demanda interna)
Protocolo de Quioto (demanda externa) e aumento do preccedilo do petroacuteleo Poliacuteticas
similares tecircm sido adotadas pela Uniatildeo Europeacuteia Japatildeo e Estados Unidos
(GOLDEMBERG et al 2007) Por essas razotildees a demanda por etanol no mercado
internacional tem sido crescente nos uacuteltimos anos O Brasil aleacutem de ser um dos
maiores produtores e consumidores de etanol eacute tambeacutem o maior exportador no
cenaacuterio global Segundo dados da Uniatildeo da Induacutestria de Cana de Accediluacutecar (Unica) ateacute
2016 o Brasil produziraacute 129 bilhotildees de litros de etanol para o mercado externo Na
safra 20082009 o total de etanol produzido foi de 275 bilhotildees de litros (UacuteNICA)
O Brasil e os Estados Unidos satildeo liacutederes mundiais na produccedilatildeo de etanol
utilizando como mateacuteria prima a cana de accediluacutecar e milho respectivamente Os dois
paiacuteses acumulam cerca de 70 da produccedilatildeo mundial (ROMERO 2007) Aleacutem disso
o Brasil lidera a produccedilatildeo mundial de cana-de-accediluacutecar (principal mateacuteria-prima do
etanol) sendo essa uma induacutestria que movimenta vaacuterios bilhotildees de doacutelares por ano
O fato de o etanol ser produzido dentro do Brasil representa uma menor
dependecircncia de petroacuteleo externo diminuindo substancialmente os gastos com
importaccedilotildees
O agronegoacutecio da cana-de-accediluacutecar movimenta R$ 40 bilhotildees por ano no paiacutes A
safra 20072008 ficou entre 547 milhotildees de toneladas de cana-de accediluacutecar 152 a
mais do que a safra anterior Metade dela eacute destinada agrave fabricaccedilatildeo de etanol o que
faz do Brasil o segundo maior produtor de combustiacutevel no mundo O primeiro lugar
cabe aos Estados Unidos que extraem etanol de milho a poder de pesados
subsiacutedios Dois terccedilos da produccedilatildeo nacional estatildeo no estado de Satildeo Paulo Avalia-
se que o Brasil precisaraacute dobrar sua produccedilatildeo num horizonte de 5 a 7 anos se
quiser suprir as demandas locais e internacionais do combustiacutevel Isso exigiraacute a
construccedilatildeo de novas usinas o crescimento das aacutereas plantadas melhorias no
manejo e principalmente ganhos de produtividade (MARQUES 2008)
O cenaacuterio futuro mostra que paiacuteses como Estados Unidos Japatildeo e Europa vatildeo
precisar importar mais de 10 bilhotildees de litros de etanol ateacute 201112 Se uma
tonelada de cana produz 88 litros de etanol precisaria adicionar mais de 110
milhotildees de toneladas de cana para atender o mercado futuro o que acrescentaria
58
mais 12 milhotildees de hectares A UNICA (Uniatildeo da induacutestria de cana-de-accediluacutecar)
prevecirc um crescimento da produccedilatildeo de 6 a 7 anualmente chegando a uma
produccedilatildeo de 560 milhotildees de toneladas de cana em 201011 (ANDREOLI SOUZA
2006)
A quantidade de CO2 liberada diretamente para a atmosfera devido ao aumento
da sua produccedilatildeo mundial pode causar prejuiacutezos ao meio ambiente No Brasil a
produccedilatildeo de etanol por processos fermentativos principalmente pelo processo
descontiacutenuo alimentado ou contiacutenuo utilizando mosto de melaccedilo de cana-de-accediluacutecar
eou caldo de cana-de-acuacutecar tem no cultivo da Saccharomyces cerevisiae um
grande impacto no acircmbito socioeconocircmico Existem cerca de 300 induacutestrias que
utilizam fermentaccedilatildeo alcooacutelica no Brasil que movimentam bilhotildees de doacutelares e
geram 6 dos empregos totais do Paiacutes (Uniatildeo da Agroinduacutestria Canavieira de Satildeo
Paulo 2006)
No Brasil 70 das destilarias de cana-de-accediluacutecar usam o processo
descontiacutenuo com uma capacidade fermentativa acima de 15 milhotildees de litros de
etanol por dia e aproximadamente 350 destilarias usam a fermentaccedilatildeo contiacutenua
(WHEALS et al 1999) Estudos comparativos e avaliaccedilotildees econocircmicas de diversos
processos utilizados na produccedilatildeo de etanol concluiacuteram que fermentaccedilatildeo contiacutenua
apresentava uma reduccedilatildeo de 57 no investimento de capital fixo em destilarias
quando comparado ao daquelas que utilizam processo em batelada Uma reduccedilatildeo
ainda maior de 68 e 71 eacute obtida para os processos que utilizam reciclo de ceacutelulas
e operaccedilatildeo a vaacutecuo respectivamente (CYSEWSKI WILKE 1978)
A fermentaccedilatildeo contiacutenua apresenta menor custo de investimento maior
facilidade para a instalaccedilatildeo de sistemas de automaccedilatildeo e ausecircncia de ldquotempos
mortosrdquo que eacute o tempo em dado momento do ciclo fermentativo natildeo estaacute produzindo
tiacutepico de processos descontiacutenuo Aleacutem disso a fermentaccedilatildeo contiacutenua tende a
consumir menos anti-espumante decorrecircncia da alimentaccedilatildeo mais estaacutevel de
accediluacutecar para o processo e tambeacutem da geometria dos fermentadores Por outro lado
a fermentaccedilatildeo contiacutenua apresenta maiores dificuldades quando temos que lidar com
contaminantes indesejaacuteveis no processo Natildeo eacute possiacutevel promover a assepsia de
fermentadores de bombas e de trocadores com frequumlecircncia como ocorre no sistema
em bateladas Desta maneira a fermentaccedilatildeo contiacutenua tende a consumir mais aacutecido
sulfuacuterico e mais antibioacutetico
59
Segundo Romano et al (2003) as transformaccedilotildees quiacutemicas que ocorrem
durante a fermentaccedilatildeo por leveduras satildeo a conversatildeo dos accediluacutecares em etanol e
CO2 e em menores quantidades a formaccedilatildeo de CVOs Basso et al (1996) relata
que durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica por levedura os produtos da fermentaccedilatildeo satildeo
constituiacutedos de 43 ndash 47 de etanol 41 - 45 de gaacutes carbocircnico e o restante satildeo
formados por outros compostos orgacircnicos tais como glicerol aacutecido succiacutenico aacutecido
aceacutetico entre outros Dentre os volaacuteteis orgacircnicos majoritaacuterios produzidos durante a
fermentaccedilatildeo de mosto de cana-de-accediluacutecar por Saccharomyces cerevisiae
encontram-se o etanol acetaldeiacutedo propanol isobutanol aacutelcool isoamiacutelico acetato
de etila (CACHOT et al 1991) Durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica do mosto de cana-
de-accediluacutecar os principais componentes gasosos satildeo o CO2 e o etanol mas outros
aacutelcoois e aacutecidos tambeacutem satildeo liberados em menores quantidades na forma gasosa
(VENTURINI FILHO e MENDES 2003)
A reaccedilatildeo quiacutemica simplificada da produccedilatildeo de etanol a partir da sacarose da
cana-de-accediluacutecar eacute
C12H22O11 +H2O rarr 4C2H5OH + 4CO2 (3)
Onde 342 g de sacarose produz 184 g de etanol e 176 g de CO2 Com isso
pode-se estimar que cada grama de sacarose produz 0514g de CO2 assumindo
uma recuperaccedilatildeo de CO2 em 100 no caso de induacutestrias dedicadas a produccedilatildeo de
etanol No entanto as induacutestrias de produccedilatildeo de etanol tambeacutem utilizam como
mateacuteria-prima o melaccedilo um sub-produto da produccedilatildeo de accediluacutecar industrial a partir
da cana-de-accediluacutecar que conteacutem cerca de 15 da sacarose inicial (MOLLERSTEN et
al 2003) e represeta mais de 75 do custo total de produccedilatildeo de etanol
(CYSEWSKI WILKE 1978)
Cada litro de etanol produzido pela fermentaccedilatildeo alcooacutelica resulta em
aproximadamente 076 kg de CO2 portanto a capacidade de produccedilatildeo de CO2
durante a fermentaccedilatildeo de etanol combustiacutevel nos EUA e o Brasil eacute de
aproximadamente 84 e 106 toneladas de CO2 por ano respectivamente
(KHESHGI PRICE 2005) No Brasil a produccedilatildeo meacutedia de etanol a partir da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica eacute de 180 milhotildees de litros por ano gerando
consequentemente 014 milhotildees de CO2 por ano (MOLLERTEN et al 2003)
O uso do biocombustiacutevel traz uma seacuterie de benefiacutecios associados agrave reduccedilatildeo
dos gases de efeito estufa e de outros poluentes atmosfeacutericos tais como o enxofre
aleacutem da reduccedilatildeo do consumo de combustiacuteveis foacutesseis Poreacutem no processo de
60
fabricaccedilatildeo uma seacuterie de resiacuteduos e subprodutos industriais eacute gerada os quais
podem quando adequadamente geridos contribuir para a viabilidade econocircmica da
produccedilatildeo de biocombustiacuteveis Esses resiacuteduos possuem potencial para uso na
induacutestria de alimentos e para a nutriccedilatildeo animal bem como na induacutestria quiacutemico-
farmacecircutica mas haacute uma grande carecircncia de estudos de anaacutelises de viabilidade
teacutecnica e financeira que possam apontar as melhores alternativas de custo-
benefiacutecio para o processamento e tratamento desses resiacuteduos os quais podem
agregar valor e reduzir os custos de produccedilatildeo de biocombustiacuteveis com o
aproveitamento e venda destes produtos e seus derivados
Um nuacutemero de subprodutos da induacutestria do etanol combustiacutevel pode ter o
potencial para a aplicaccedilatildeo de nutracecircuticos ou de alimentos funcionais que eacute uma
das aacutereas de grande interesse atualmente e representa um mercado potencial
enorme ainda em seu desenvolvimento inicial Por isso o interesse em utilizar
micro-organismos fotossintetizantes devido a sua capacidade de reduzir a emissatildeo
de CO2 e de CVOs na atmosfera subproduto da induacutestria de etanol produzindo
compostos de alto valor industrial
61
3 Objetivos
Geral
Este trabalho tem como objetivo verificar a influecircncia do efeito da adiccedilatildeo de
CO2 proveniente de cilindro ou da fermentaccedilatildeo alcooacutelica mantendo o pH no valor
oacutetimo igual a 95 no cultivo de A platensis em reatores tubulares utilizando nitrato ou
ureacuteia como fonte de nitrogecircnio em diferentes intensidades luminosas
Especiacuteficos
Avaliar os testes preliminares da fermentaccedilatildeo alcoacuteolica contiacutenua utilizada para
posterior acoplamento dos gases liberados durante a fermentaccedilatildeo com os
cultivos de A platensis
Avaliar os paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima produtividade em ceacutelulas
e fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas usando anaacutelise de variacircncia
multivariaacutevel nos cultivos de A platensis
Determinar a composiccedilatildeo centesimal da A platensis no final dos cultivos teor
de proteiacutenas lipiacutedios cinzas e carboidratos usando a anaacutelise de variacircncia
multivariaacutevel
Estudar os paracircmetros bioenergeacuteticos da A platensis durante os cultivos
utilizando CO2 de cilindro avaliando os andamentos em funccedilatildeo do tempo dos
paracircmetros valor teoacuterico da energia de Gibbs dissipada para o crescimento
(1YGX) das produccedilotildees molares de O2 consumo de H+ e absorccedilatildeo de foacutetons
para produzir 1 C-mol de biomassa
Calcular o rendimento teoacuterico da energia fixada pelo aparato fotossinteacutetico
energia transformada em ATP e a energia liberada como calor calculando-se a
partir da energia molar de Gibbs absorvida da luz pelo aparato fotossinteacutetico
Comparar o comportamento celular em duas diferentes configuraccedilotildees de
fotobiorreatores tubulares um horizontal e outro helicoidal
62
4 Materiais e meacutetodos
41 Fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
O CO2 proveniente da fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua foi utilizado como fonte
de carbono para o cultivo de A platensis O desprendimento desse gaacutes do reator foi
arrastar volaacuteteis orgacircnicos formados na fermentaccedilatildeo cujas interferecircncias nos
cultivos de A platensis foram avaliadas Para os cultivos contiacutenuos de fermentaccedilatildeo
alcooacutelica foi utilizado o mosto de melaccedilo de cana-de-accediluacutecar
411 Testes preliminares para emprego da fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
4111 Teste para avaliar a influecircncia do tratamento do melaccedilo na
determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular
Para a realizaccedilatildeo desse teste foi preparada uma suspensatildeo celular de 300g L-1
de levedura uacutemida em aacutegua destilada a partir dessa suspensatildeo foram retirados sob
agitaccedilatildeo 10 mL e adicionados em dois diferentes frascos um contendo 290 mL de
melaccedilo natildeo clarificado (item 41111) e outro contendo 290 mL de melaccedilo
previamente clarificado (item 41112) de modo que a concentraccedilatildeo celular final de
cada frasco tenha 10g L-1 em 300 mL de mosto A partir dessa suspensatildeo foram
retirados 5 mL para a anaacutelise da concentraccedilatildeo celular como descrito no item 4311
41111 Melaccedilo natildeo tratado
O melaccedilo natildeo tratado consiste apenas na sua diluiccedilatildeo com aacutegua potaacutevel e
preparado como descrito no item 41113
41112 Melaccedilo tratado
O tratamento do melaccedilo consistiu de sua preacutevia clarificaccedilatildeo diluiccedilatildeo e
suplementaccedilatildeo adequadas A clarificaccedilatildeo foi realizada com diluiccedilatildeo do melaccedilo pela
adiccedilatildeo de aacutegua potaacutevel em partes iguais e adiccedilatildeo de 15 g de fosfato de soacutedio
monobaacutesico como agente floculante em cada litro da soluccedilatildeo de melaccedilo diluiacutedo
Posteriormente esse melaccedilo diluiacutedo foi autoclavado a 121 ordmC por 10 minutos Apoacutes
o aquecimento foi mantido em repouso no miacutenimo por 48 horas para a
sedimentaccedilatildeo do material em suspensatildeo O melaccedilo clarificado foi entatildeo sifonado
63
pronto para ser diluiacutedo com aacutegua e preparado como descrito no item 41113 sem
a adiccedilatildeo do antibioacutetico O mosto foi esterilizado em autoclave a 121 ordmC durante 30
minutos (PEREGO JUacuteNIOR 1979)
41113 Preparaccedilatildeo do melaccedilo
O melaccedilo foi diluiacutedo ateacute concentraccedilatildeo 170 g L-1 em accediluacutecares redutores totais
(ART) (GUERREIRO et al 1997) e suplementado com ureacuteia na concentraccedilatildeo de 05
g L-1 suficiente para que a fonte de nitrogecircnio natildeo se torne fator limitante da
atividade da levedura (MAGALHAtildeES 1978 CARVALHO 1994 PEREGO-JUNIOR
1979) O pH do mosto foi ajustado em 45 (JONES et al 1981) pela adiccedilatildeo de aacutecido
sulfuacuterico concentrado ou pela adiccedilatildeo de soluccedilatildeo de hidroacutexido de soacutedio 4N Por fim
adicionou-se penicilina V aacutecida (500 UIL) como antibioacutetico (AQUARONE 1960
CARVALHO et al 2003)
4112 Teste para avaliar a homogeneidade do reator
Para a realizaccedilatildeo do teste de homogeneidade foi preparado 10 litros de uma
suspensatildeo celular de 9 g L-1 de levedura em aacutegua destilada e adicionada ao
fermentador Apoacutes 30 minutos de homogeneizaccedilatildeo mecacircnica do material iniciou
uma contiacutenua adiccedilatildeo de aacutegua destilada e retirada da amostra a uma vazatildeo
especiacutefica de alimentaccedilatildeo calculada (Dc) igual a 0124 h-1 No intervalo de 30
minutos em diferentes regiotildees do reator as amostras foram recolhidas para
determinar a concentraccedilatildeo celular A homogeneidade do reator eacute verificada se a
queda da concentraccedilatildeo celular for uma funccedilatildeo exponencial
4113 Teste para determinar a vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo
Foram realizados 3 experimentos com a fermentaccedilatildeo contiacutenua nas condiccedilotildees
descritas no item 415 Os valores de vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo (D) foram 01
h-1 005 h-1 e 0025 h-1
412 Micro-organismo e condiccedilotildees de manutenccedilatildeo
Saccharomyces cerevisiae CCT7150 uma cepa isolada de planta industrial de
fermentaccedilatildeo alcooacutelica nacional (Usina Nova Ameacuterica) e produtora de altas
concentraccedilotildees de etanol a partir de melaccedilo adquirida da Fundaccedilatildeo Andreacute Tosello
foi utilizada nos cultivos contiacutenuos Sua manutenccedilatildeo em tubo de ensaio foi no meio
Sabourand (Merckreg) A cultura foi armazenada sob refrigeraccedilatildeo a 4 ordmC
64
413 Preparo do inoacuteculo
As ceacutelulas de levedura estocada foram multiplicadas em tubos contendo meio
soacutelido Sabourand e incubadas em estufa a 30 ordmC por 24 h Posteriormente as
culturas foram inoculadas com alccedila de platina sob condiccedilotildees asseacutepticas em tubos
contendo 10 mL do meio Sabourand e incubadas em estufa a 30 ordmC por 24 h Cada
tubo por sua vez inoculou um frasco de Erlenmeyer de 500 mL contendo 90 mL de
mosto de melaccedilo de cana-de-accediluacutecar contendo 5 de ART que foi entatildeo incubado
a 30 ordmC por 12 h em agitador rotativo a 400 rpm Decorrido este tempo o conteuacutedo
de 10 frascos de Erlenmeyer preparados com o preacute-inoacuteculo (1 L) foi adicionado agrave
dorna juntamente com o mosto (9 L) nas condiccedilotildees em que se trabalhou no
processo contiacutenuo resultando em um volume uacutetil do fermentador de 10 litros que
deu iniacutecio a uma fermentaccedilatildeo descontiacutenua (PEREGO JUacuteNIOR 1979)
414 Dispositivo para a cultura
Foi utilizado um fermentador fabricado pela INFORs HT com dornas de vidro
de 10 litros de capacidade nominal com controles de temperatura pH niacutevel de
espuma e frequumlecircncia de agitaccedilatildeo com saiacutedas que foram conectadas a uma bomba
peristaacuteltica para alimentaccedilatildeo do mosto e retirada do material durante a fermentaccedilatildeo
contiacutenua
415 Descriccedilatildeo das condiccedilotildees de fermentaccedilatildeo contiacutenua
O cultivo contiacutenuo teve como iniacutecio o cultivo descontiacutenuo como descrito acima
(item 413) A alimentaccedilatildeo contiacutenua do mosto ocorreu apoacutes um periacuteodo de 6 a 8 h
da inoculaccedilatildeo do S cerevisiae na dorna para garantir que o micro-organismo se
encontre na fase exponencial de crescimento A concentraccedilatildeo de accediluacutecares no mosto
de alimentaccedilatildeo foi de 170 g L-1 (GUERREIRO et al 1997) expressa em ART O
mosto foi suplementado com sulfato de amocircnio na concentraccedilatildeo de 1 g L-1 A
temperatura de fermentaccedilatildeo foi mantida a 30 plusmn 1 ordmC (KOCK et al 2000) com
frequumlecircncia do agitador de 500 rpm A vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo foi
determinada em ensaios preliminares (item 61)
65
42 Cultivo de A platensis
421 Micro-organismo e manutenccedilatildeo
Spirulina (Arthrospira) platensis UTEX (1926) foi mantida em meio liacutequido de
cultivo padratildeo para Arthrospira (item 4221) em tubos hermeticamente fechados
422 Meio de cultivo
Foram utilizados dois tipos de meio Um meio padratildeo para o cultivo de
Arthrospira (SCHLOumlSSER 1982) ndash item 4221 com NaNO3 como fonte de
nitrogecircnio que foi utilizado para duas finalidades manutenccedilatildeo do micro-organismo e
preparo do inoacuteculo um meio modificado (item 4122) onde se utilizou ureacuteia como
fonte de nitrogecircnio
4221 Meio padratildeo para cultivo de A platensis
O meio mineral padratildeo foi o de Schloumlsser (1982) cuja composiccedilatildeo por litro de
aacutegua destilada eacute a seguinte
NaHCO3 1361g
Na2CO3 403g
K2HPO4 050g
NaNO3 250g
K2SO4 100g
NaCl 100g
MgSO47H2O 020g
CaCl22H2O 004g
Soluccedilatildeo de metal PIV 6mL
Soluccedilatildeo de micronutrientes Chu 1mL
Vitamina B12 (15g100mL H2O) 1mL
Soluccedilatildeo de metal PIV (em 1 litro de aacutegua destilada)
Na2EDTA 750 mg
FeCl36H2O 97 mg
MnCl24H2O 41 mg
ZnCl2 5 mg
CoCl26H2O 2 mg
Na2MoO42H2O 4 mg
66
Soluccedilatildeo de micronutrientes Chu (em 1 litro de aacutegua destilada)
Na2EDTA 50 mg
H3BO3 618 mg
CuSO45H2O 196 mg
ZnSO47H2O 44 mg
CoCl26H2O 20 mg
MnCl2middot4H2O 12 mg
Na2MoO4middot2H2O 12 mg
4222 Meio modificado
O meio de Schloumlsser (1982) foi utilizado com substituiccedilatildeo do nitrato de soacutedio
por ureacuteia
A massa diaacuteria de ureacuteia adicionada por unidade de volume foi determinada de
acordo com o experimento padratildeo utilizando nitrato de soacutedio como fonte de
nitrogecircnio (descrito no item 5)
423 Preparo do inoacuteculo
A A platensis foi inoculada em 10 mL de meio liacutequido (em tubo de ensaio) em
condiccedilotildees asseacutepticas Depois de 7 dias esse material foi utilizado para inocular
frascos de Erlenmeyer de 500 mL com 200mL de meio de cultivo padratildeo (item
4121) previamente esterilizado por autoclavaccedilatildeo
Os erlenmeyers apoacutes o repique foram imediatamente levados a agitador
rotativo a 100 min-1 (FERRAZ 1986) temperatura de 30 OC e iluminacircncia de 72
mol de foacutetons m-2 s-1 (CARVALHO et al 2004)
O crescimento celular foi acompanhado sendo utilizada para inoacuteculo uma
suspensatildeo de A platensis apoacutes de 6 a 8 dias de cultivo (PELIZER et al 2003) em
crescimento exponencial isenta de contaminaccedilatildeo Nos cultivos utilizando meio
mineral padratildeo a suspensatildeo foi filtrada lavada e ressuspensa em meio de cultivo
padratildeo Nos cultivos utilizando ureacuteia como fonte alternativa de nitrogecircnio a
suspensatildeo foi filtrada lavada com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada do NaNO3 e
ressuspensa em meio de cultivo padratildeo isento de NaNO3 Estas suspensotildees foram o
inoacuteculo para o cultivo no reator tubular onde foram realizados os estudos
empregando NaNO3 como fonte de nitrogecircnio padratildeo e a ureacuteia como fonte
67
alternativa de nitrogecircnio com o pH do cultivo controlado pela adiccedilatildeo de CO2
proveniente de cilindro ou da fermentaccedilatildeo alcooacutelica
424 Dispositivo para cultura
4241 Fotobiorreator tubular horizontal
O fotobiorreator tubular utilizado eacute apresentado na Figura 7 Este eacute constituiacutedo
por 20 tubos de vidro transparentes (diacircmetro interno de 10 cm) (CARLOZZI
PINZANI 2005) com inclinaccedilatildeo de 2 (115ordm) (TREDICI ZITTELLI 1998) para
facilitar o escoamento do liacutequido interligados com mangueiras de PVC de mesmo
diacircmetro interno de forma que o volume iluminado corresponde a 212 litros
(606) O volume total do sistema foi de 35 litros A recirculaccedilatildeo de liacutequido foi de
26 L h-1 para evitar a sedimentaccedilatildeo da biomassa e melhorar a transferecircncia de
massa
Na parte mais baixa dos tubos do reator tubular haacute um tubo na forma de Y que
recebe ar proveniente de uma bomba deslocando a suspensatildeo celular para um
frasco na parte superior provido de agitaccedilatildeo com um agitador magneacutetico Tambeacutem
na parte inferior do reator haacute uma conexatildeo no qual ocorre entrada de CO2 para
manutenccedilatildeo de pH quando da abertura da vaacutelvula solenoacuteide controlada por um
controlador de pH
Figura 7 Fotobiorreator tubular horizontal utilizado no cultivo de A platensis
68
4242 Fotobiorreator tubular espiralado
O fotobiorreator tubular espiralado utilizado eacute apresentado na Figura 8 Este eacute
constituiacutedo por 5 conjuntos de tubos espiralados de vidro transparentes (diacircmetro
interno de 10 cm) (CARLOZZI PINZANI 2005) interligados com mangueiras de
PVC de mesmo diacircmetro interno Cada conjunto eacute constituiacutedo por 3 tubos
espiralados logo o reator conteacutem no total 15 tubos de vidros espiralados de forma
que o volume iluminado corresponde a 665 ml (606 ) O volume total do sistema
foi de 11 litros A recirculaccedilatildeo de liacutequido foi de 26 L h-1 para evitar a sedimentaccedilatildeo
da biomassa e melhorar a transferecircncia de massa
Na parte mais baixa dos tubos do reator tubular haacute um tubo na forma de Y que
recebe ar proveniente de uma bomba deslocando a suspensatildeo celular para um
frasco na parte superior Tambeacutem na parte inferior do reator haacute uma conexatildeo no
qual ocorre entrada de CO2 para manutenccedilatildeo de pH
Figura 8 Fotobiorreator tubular espiralado utilizado no cultivo de A platensis
425 Descriccedilatildeo de um experimento tiacutepico de cultivo da A platensis
A suspensatildeo de Arthrospira (item 43) foi adicionada ao biorreator tubular na
concentraccedilatildeo inicial de 400 mg L-1 (SOLETTO et al 2008) e o volume de trabalho
foi de 35 L no fotobiorreator tubular horizontal e de 11 L no fotobiorreator tubular
espiralado Devido a evaporaccedilatildeo e a retirada de amostras o meio de cultura isento
da fonte de nitrogecircnio foi adicionado para manter o volume constante
69
Nos experimetos utilizando NaNO3 como fonte de nitrogecircnio a concentraccedilatildeo
inicial deste foi de 25 g L-1 e ocorreram adiccedilotildees do nitrato de soacutedio de modo que sua
concentraccedilatildeo natildeo fosse inferior a 1 g L-1 (FAINTUCH 1989) desta forma evitaria a
limitaccedilatildeo do crescimento celular pela fonte de nitrogecircnio No cultivo utilizando a
fonte de nitrogecircnio alternativa (ureacuteia) a adiccedilatildeo diaacuteria foi efetuada por pulsos (adiccedilatildeo
intermitente) (SAacuteNCHEZ-LUNA et al 2004) As intensidades luminosas foram
medidas com um sensor quantum (model LI-190 SB Li-Cor Lincoln Neb USA) As
diferentes fontes de nitrogecircnio e intensidades luminosas foram preacute-estabelecida de
acordo com o plano de trabalho (Item 5)
O valor de pH nos cultivos foi mantido em 95 plusmn 02 (SANCHEZ-LUNA et al
2007 TREDICI ZITTELLI 1998) com auxiacutelio de um aparelho controlador de pH
METTLER TOLEDO acoplado a uma vaacutelvula solenoacuteide Nos ensaios com CO2 puro
(999) a valvula solenoiacutede estava ligada a um cilindro de CO2 e nos ensaios com
CO2 proveniente de fermentaccedilatildeo alcooacutelica a vaacutelvula solenoacuteide foi ligada agrave tubulaccedilatildeo
proveniente de um reator operando com processo contiacutenuo de fermentaccedilatildeo alcooacutelica
em regime permanente
A temperatura de 29 plusmn 1ordmC (SAacuteNCHEZ-LUNA et al 2007) foi mantida por ar
condicionado que climatizou a temperatura da sala onde estaacute localizada o reator
No final do experimento o reator foi lavado com soluccedilatildeo de hipoclorito de soacutedio
5 por 16 h e com uma soluccedilatildeo de tiosulfato de soacutedio (Na2S2O3) 50 mM para
neutralizar o clorito residual de acordo com De Beer et al (1994)
43 Teacutecnicas Analiacuteticas
Na fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua ateacute o estabelecimento de regime
permanente as determinaccedilotildees de concentraccedilatildeo celular pH ART etanol no caldo
fermentado foram determinados a cada 12 horas Estabelecido o regime
permanente as determinaccedilotildees de concentraccedilatildeo celular pH ART etanol foram
feitas diariamente O efluente gasoso foi analisado qualitativamente para
identificaccedilatildeo dos principais compostos volaacuteteis orgacircnicos
No cultivo de Arthrospira a concentraccedilatildeo celular foi feita diariamente ateacute atingir
concentraccedilatildeo celular maacutexima As medidas de concentraccedilatildeo de nitrato ureacuteia residual
amocircnia e de carbonato total em funccedilatildeo dos relativos grandes volumes necessaacuterios
para a execuccedilatildeo das teacutecnicas foram realizadas a cada dois dias Nos cultivos
utilizando o CO2 proveniente da fermentaccedilatildeo alcooacutelica foram analisados os
70
compostos volaacuteteis orgacircnicos presentes no meio isento de ceacutelulas A concentraccedilatildeo
de clorofila a foi determinada no final de cada experimento bem como a
determinaccedilatildeo de proteiacutenas lipiacutedios totais carboidratos e cinzas
431 Acompanhamento da fermentaccedilatildeo alcooacutelica
4311 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular
A concentraccedilatildeo celular expressa em massa seca foi determinada por filtraccedilatildeo
de acordo com metodologia descrita por Carvalho et al (2003) Um volume de 5 mL
da amostra foi filtrada em membrana millipore 12 microm de porosidade previamente
seca em estufa a 105 ordmC por 4 horas e em dessecador por 1 h e pesada A biomassa
filtrada e lavada com 50 mL de aacutegua destilada foi seca em estufa a 105 ordmC por 4
horas e em dessecador por 1 h e posteriormente pesada A concentraccedilatildeo celular foi
determinada por diferenccedila de massa antes e apoacutes a filtraccedilatildeo
4312 Determinaccedilatildeo do pH
O pH seraacute acompanhado por potenciometria com um aparelho da marca
METTLER TOLEDO
4313 Determinaccedilatildeo de ART
A determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ART foi realizada por espectrofotometria a
540 nm pelo meacutetodo de SOMOGYI-NELSON (1952) precedido da hidroacutelise da
sacarose contida na fase liacutequida do meio de fermentaccedilatildeo realizada pela teacutecnica de
Falcone e Marques (1965)
A hidroacutelise da sacarose foi feita por hidroacutelise aacutecida utilizando 5 mL da amostra
e 25 mL da soluccedilatildeo de aacutecido cloriacutedrico 13 N e deixou-se em banho de aacutegua a 70 ordmC
por 15 minutos Deixou-se esfriar essa soluccedilatildeo ateacute a temperatura ambiente e foi
adicionado NaOH 6N ateacute verificar uma mudanccedila no pH utilizando fenolfitaleiacutena
como indicador Posteriormente completou-se o volume final para 100 mL com aacutegua
destilada diluindo-se assim a amostra 20 vezes A partir dessa soluccedilatildeo jaacute diluiacuteda
fizeram-se novas diluiccedilotildees necessaacuterias para a determinaccedilatildeo do ART pelo meacutetodo de
Somogyi-Nelson (1952)
71
A anaacutelise compreende na adiccedilatildeo de 1 mL da amostra convenientemente diluiacuteda
e 1 mL do reativo de Somogy em tubo de Folin-Wu onde foi fervido durante 10
minutos resfriado em aacutegua com gelo Apoacutes o resfriamento adicionou-se 2 mL do
reativo de Nelson e agitou-se os tubos em agitador ateacute expulsar os gases formados
Completou-se o volume para 25 mL com aacutegua destilada e a soluccedilatildeo foi lida em
espectrofotometro a 520 nm Foi feito um branco substituindo a amostra por aacutegua
destilada
O accediluacutecar aquecido com uma soluccedilatildeo alcalina de tartarato de cobre leva agrave
obtenccedilatildeo de oacutexido cuproso que reagindo com molibdato de arsecircnio possibilita a
produccedilatildeo de um composto de coloraccedilatildeo azul passiacutevel de ser quantificada por
colorimetria a adiccedilatildeo de sulfato de soacutedio a mistura minimiza a entrada de oxigecircnio
na soluccedilatildeo responsaacutevel pela reoxidaccedilatildeo do oacutexido cuproso
4314 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol
A determinaccedilatildeo do etanol foi realizada atraveacutes do meacutetodo de oxidaccedilatildeo por
dicromato de potaacutessio proposto por Joslyn (1907)
O etanol foi determinado mediante a destilaccedilatildeo atraveacutes de um microdestilador
de KJELDHAL e recolhido em 20 mL de uma soluccedilatildeo de dicromato de potaacutessio
fortemente acidulada com aacutecido sulfuacuterico A determinaccedilatildeo consiste na destilaccedilatildeo de
1 mL do meio fermentado isento de ceacutelulas recolhido na soluccedilatildeo de dicromato
contida em erlenmeyer onde o etanol reagiu com os iacuteons dicromato como mostrado
na eq 1 produzindo acetaldeiacutedo e iacuteons Cr(III) Conforme o etanol reage haacute uma
mudanccedila da coloraccedilatildeo laranja caracteriacutestica desta soluccedilatildeo para um tom esverdeado
A reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo do etanol com iacuteons dicromato envolve pelo menos duas
etapas Na primeira etapa o etanol introduzido na soluccedilatildeo reage com os iacuteons
dicromato produzindo um aldeiacutedo que neste caso eacute o acetaldeiacutedo (reaccedilatildeo 4)
Na segunda etapa como o aldeiacutedo produzido tambeacutem eacute susceptiacutevel agrave oxidaccedilatildeo o
acetaldeiacutedo eacute consumido produzindo aacutecido aceacutetico (um aacutecido carboxiacutelico) com a
correspondente reduccedilatildeo dos iacuteons Cr(VI) para iacuteons Cr(III) (reaccedilatildeo 5) A reaccedilatildeo
entre o etanol e os iacuteons dicromato pode ser descrita de forma global como mostrado
na (reaccedilatildeo 6)
3 CH3CH2OH + CrO7-2 rarr 3 CH3COH 2 Cr+3 + 7 H20 (reaccedilatildeo 4)
3 CH3COH + CrO7-2 + 8H+ rarr 3 CH3COOH + 2 Cr+3 + 4 H20 (reaccedilatildeo 5)
72
3 CH3CH2OH + 2 CrO7-2 + 16H+ rarr 4Cr+3 + 3 CH3COOH 11 H2O (reaccedilatildeo 6)
Apoacutes a destilaccedilatildeo o erlenmeyer foi levado a um banho de aacutegua a 70 ordmC
durante 20 minutos para que se complete a oxidaccedilatildeo do etanol Apoacutes esse tempo
deixou-se esfriar ateacute temperatura ambiente e essa soluccedilatildeo foi titulada com soluccedilatildeo
de sulfato ferroso amoniacal Foi feita concomitantemente uma soluccedilatildeo utilizando
aacutegua em vez do destilado para determinar o poder redutor do sulfato ferroso
amoniacal
4315 Determinaccedilatildeo dos componentes volaacuteteis presentes no gaacutes efluente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
Os voltaacuteteis majoritaacuterios liberados durante o regime permanente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica foram determinados pelo Laboratoacuterio de Anaacutelises Quiacutemicas do
Instituto de Pesquisa Tecnoloacutegis (IPT) usando um cromatoacutegrafo a gaacutes (marca
Shimadzu modelo CG-2010) acoplado ao espectrocircmetro de massas (Shimadzu
Modelo GCMS ndash QP5050A)
432 Acompanhamento do cultivo de A platensis
O volume das amostras diaacuterias retiradas para o acompanhamento celular foram
de 50 mL Apoacutes a remoccedilatildeo da amostra igual volume de meio de cultura isento da
fonte de nitrogecircnio foi adicionado para manter o volume constante Similarmente a
evaporaccedilatildeo de aacutegua diaacuteria foi compensada pela adiccedilatildeo do meio de cultura
4321 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular
43211 Densidade oacutetica
O acompanhamento do crescimento celular foi realizado diariamente em
duplicata por turbidimetria a 560 nm (LEDUY THERIEN 1977) Os valores de
transmitacircncia obtidos no espectrofotocircmetro foram convertidas em concentraccedilatildeo
celular atraveacutes de uma curva de calibraccedilatildeo (Item 43212)
43212 Construccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo
A curva de calibraccedilatildeo foi obtida tomando-se um volume de 25 mL de uma
suspensatildeo concentrada de ceacutelulas em fase de crescimento exponencial que foi
73
filtrada e lavada com aacutegua destilada em uma membrana de acetato de celulose de
12 μm previamente seca a 70 ordmC por 12 horas e previamente pesada A amostra
foi levada agrave estufa a 100ndash105 ordmC por um periacuteodo de 5 horas suficiente para que
mantivesse uma massa constante A massa das ceacutelulas foi calculada por diferenccedila
dos valores das massas das membranas antes e depois da filtraccedilatildeo e dividido pelo
volume filtrado para obter-se a concentraccedilatildeo celular na suspensatildeo A partir desta
mesma suspensatildeo foram preparadas diferentes diluiccedilotildees e aliacutequotas dessas
diluiccedilotildees foram levadas ao espectrofotocircmetro para leitura da transmitacircncia a 560 nm
de comprimento de onda e caminho oacuteptico de 1 cm com aacutegua destilada como
branco Dessa forma foi obtida uma curva que relaciona concentraccedilatildeo celular com o
logaritmo da transmitacircncia (Graacutefico 1)
Graacutefico 1 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular de A platensis
4322 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de carbonato total
Embora a concentraccedilatildeo de carbonato total deva se manter constante em
decorrecircncia do fornecimento de CO2 para a manutenccedilatildeo do pH foi acompanhado na
fase liacutequida do meio em cultivo
No meio isento de ceacutelulas o acompanhamento da concentraccedilatildeo de fonte de
carbono na forma de carbonato total foi atraveacutes de titulometria Inicialmente
adiciona-se hidroacutexido de soacutedio na amostra (Reaccedilatildeo 7) e titula-se com HCl
(Reaccedilatildeo 8) na presenccedila do indicador fenolftaleiacutena para a conversatildeo de carbonato
em bicarbonato Posteriormente foi titulada novamente com HCl (Reaccedilatildeo 9) na
74
presenccedila do indicador alaranjado de metila para que todo o bicarbonato transforme-
se em aacutecido carbocircnico por deslocamento de equiliacutebrio O carbonato total foi
quantificado pelos dois intervalos de viragem (PIERCE HAENISCH 1948)
NaOH + NaHCO3 = Na2CO3 + H2O (Reaccedilatildeo 7)
Na2CO3 + HCl = NaHCO3 + NaCl (Reaccedilatildeo 8)
NaHCO3 + 1 HCl = H2CO3 + 1 NaCl (Reaccedilatildeo 9)
4323 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia total
A amocircnia total foi quantificada no meio isento de ceacutelulas de 2 em 2 dias em
potenciocircmetro marca ORION modelo 710-A por meio de um eletrodo seletivo para
amocircnia modelo 95-12 ORION Tendo em vista que o eletrodo soacute eacute sensiacutevel ao iacuteon
amocircnia e que no pH de cultivo existe equiliacutebrio entre os iacuteons amocircnia e amocircnio para
se fazer a leitura foi necessaacuterio corrigir o pH da amostra para 13 pela adiccedilatildeo de
NaOH 15 M antes da leitura no eletrodo de forma que todo iacuteon amocircnio fosse
convertido em amocircnia (LEDUY SAMSON 1982) O volume utilizado foi de 15 mL e
nesse procedimento foi necessaacuteria agrave calibraccedilatildeo do aparelho em todos os dias em
que foram realizadas as determinaccedilotildees Isso foi feito atraveacutes da construccedilatildeo de uma
curva que correlaciona a milivoltagem lida no potenciocircmetro com soluccedilotildees de NH4Cl
em diferentes diluiccedilotildees com concentraccedilotildees conhecidas A partir da equaccedilatildeo dessa
curva com a milivoltagem lida na amostra do cultivo foi calculada a concentraccedilatildeo
de amocircnia total Esta metodologia tambeacutem serviu para auxiliar na determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de ureacuteia conforme se observa no item a seguir
43231 Construccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da amocircnia
A metodologia empregada para a determinaccedilatildeo de amocircnia requer a construccedilatildeo
de uma curva de calibraccedilatildeo para cada dia em que foi analisada a amocircnia Desta
forma no Graacutefico 2 tecircm-se uma das curvas de calibraccedilatildeo utilizada
75
Graacutefico 2 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia
Nesse caso a curva de calibraccedilatildeo corresponde agrave Log [NH3] -00213 x mV ndash
10583 A maior diluiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia foi de 5x10-6 (cujo o valor de
Log eacute -53) que corresponde a um valor de milivoltagem de 182 detectado no
eletrodo de amocircnia
4324 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia
Para a determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia inicialmente foi hidrolisada em
meio aacutecido como segue 10 mL do meio de cultivo isento de ceacutelulas foi submetido a
um tratamento com H2SO4 (1 mL de H2SO4 5 N) a 200 ordmC por 6 horas em bloco
digestor Tecnal modelo TE-106 (CEZARE 1998) Apoacutes esse tempo o conteuacutedo
presente no tubo onde ocorreu a hidroacutelise aacutecida foi quantitativamente transferido
para um balatildeo volumeacutetrico de 50 mL com neutralizaccedilatildeo do pH com NaOH 15 M
utilizando fenolftaleiacutena como indicador e finalmente o volume completado com aacutegua
destilada Desse balatildeo foi retirado um volume de 15 mL para a determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de amocircnia conforme meacutetodo descrito no item anterior Considerando
ainda a diluiccedilatildeo da amostra calcula-se a concentraccedilatildeo de amocircnia global que
representa a amocircnia que jaacute estava presente no meio de cultivo mais a amocircnia
proveniente da hidroacutelise da ureacuteia Assim por diferenccedila eacute possiacutevel calcular a
concentraccedilatildeo de ureacuteia no meio de cultivo
76
4325 Determinaccedilatildeo do pH
O pH foi acompanhado por potenciometria com um aparelho da marca
METTLER TOLEDO
4326 Determinaccedilatildeo de nitrato
A anaacutelise de nitrato foi realizada atraveacutes da adaptaccedilatildeo do meacutetodo descrito por
Vogel (2002) Foram pipetados 10 mL do meio isento de ceacutelulas 10 ml de NaOH
(05 N) e 700 mg de liga de devarda ( 50 de cobre 45 de alumiacutenio 5 zinco) em
balatildeo volumeacutetrico onde foi aquecido em bico de busen durante 1 hora para que todo
o nitrato presente na amostra seja reduzido a amocircnio como descrito na reaccedilatildeo a
seguir
NO3- + 8 Al + 5 OH- + 2 H2O rarr 8 Al2
- + 3 NH3 (Reaccedilatildeo 10)
Durante o aquecimento os iacuteons amocircnio satildeo desprendidos e recolhidos em uma
soluccedilatildeo padronizada de 10 mL de aacutecido cloriacutedrico (01 N) formando o cloreto de
amocircnio Essa soluccedilatildeo foi titulada com NaOH (005 N) padronizada usando vermelho
de metila como indicador e a quantificaccedilatildeo do amocircnio formado foi feita por diferenccedila
entre a quantidade de HCl inicial e final depois da destilaccedilatildeo A conversatildeo de
volume do aacutecido tilulado (mililitros) em massa de iacuteons nitrato (gramas) foi baseada
na informaccedilatildeo de que 1 mL de aacutecido cloriacutedrico 1 N corresponde a 006201g de iacuteons
nitrato (VOGEL 2002)
4327 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol
A determinaccedilatildeo do etanol foi realizada atraveacutes do meacutetodo de oxidaccedilatildeo por
dicromato de potaacutessio proposto por Joslyn (1907) como descrito no item 4314
433 Avaliaccedilatildeo da biomassa de A platensis obtida no final do cultivo
4331 Determinaccedilatildeo de Clorofila a
A anaacutelise de clorofila a foi realizada utilizando uma suspensatildeo celular de 5 mL
correspondente agrave concentraccedilatildeo celular maacutexima obtida Essa suspensatildeo foi filtrada e
a biomassa foi ressuspendida em 5 mL de metanol e incubada em banho maria a
70ordmC por 2 minutos Apoacutes esse tempo a amostra foi filtrada em filtro de
77
politetrafluoretileno 10 microm de diacircmetro (Milliporereg) e o sobrenadante contendo a
clorofila foi determinado espectofotometricamente a 665 nm adotando-se o
procedimento descrito por Vonshak (1997a) A curva de calibraccedilatildeo foi feita
previamente utilizando clorofila areg padratildeo
43311 Curva de calibraccedilatildeo para a determinaccedilatildeo de Clorofila a
A curva de calibraccedilatildeo foi construiacuteda utilizando uma soluccedilatildeo de clorofila a
padratildeo (Sigmareg) obtida comercialmente em metanol A partir dessa soluccedilatildeo foram
realizadas diferentes diluiccedilotildees que resultaram em leituras espectrofotomeacutetricas em
comprimento de onda de 665nm obtendo valores de absorbacircncia entre 0200 e
0800 A relaccedilatildeo entre as diferentes concentraccedilotildees de clorofila em miligrama por
litro com os valores de aborbacircncia obtem-se a equaccedilatildeo como mostrada no graacutefico
3 que foi utilizada para a determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de clorofila nos ensaios
Graacutefico 3 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo de clorofila a
4332 Determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal
Ao final do cultivo o meio contendo a A platensis foi centrifugado com 3
lavagens sucessivas com aacutegua destilada para retirada do sal adsorvido agraves ceacutelulas e
apoacutes secagem com ventilaccedilatildeo a 55 ordmC por 12 horas (PELIZER et al 1999) foi
avaliada a composiccedilatildeo centesimal da biomassa seca
78
43321 Proteiacutenas totais
O teor proteacuteico total na biomassa seca foi determinado pelo claacutessico meacutetodo de
KJELDHAL adotando-se o fator de 625 para a conversatildeo a partir dos teores de
nitrogecircnio total (ASSOCIATION OF OFFICIAL METHODS OF FOOD ANALYSIS
1984) Esse meacutetodo caracteriza-se pela destruiccedilatildeo da mateacuteria orgacircnica com aacutecido
sulfuacuterico concentrado em presenccedila de um catalizador e aquecimento com
formaccedilatildeo de nitrogecircnio inorgacircnico na forma de sulfato de amocircnio A seguir em
aparelho destilador de nitrogecircnio adiciona-se hidroacutexido de soacutedio no tubo
proveniente da digestatildeo para alcalinizaccedilatildeo do meio e desta forma o sal de
amocircnio eacute convertido agrave amocircnia que eacute destilada para uma soluccedilatildeo saturada de aacutecido
boacuterico Posteriormente titula-se essa soluccedilatildeo com HCl 002N fatorada para se
quantificar a concentraccedilatildeo de nitrogecircnio (FERRAZ 1986)
43322 Lipiacutedios totais
A fraccedilatildeo lipiacutedica total foi obtida por extraccedilatildeo com solvente orgacircnico (FERRAZ
1986) A amostra foi triturada em gral e entatildeo transferida para um extrator contiacutenuo
de Soxhlet com refluxo da mistura de solventes clorofoacutermio-metanol (21 vv) ateacute o
liacutequido ficar liacutempido (PIORRECK 1984 OLGUIacuteN et al 2001) A fraccedilatildeo lipiacutedica total
juntamente com os solventes foram tratados em sistema evaporador rotativo a
vaacutecuo O material obtido reuacutene aacutecidos graxos trigliceriacutedeos fosfolipiacutedios
carotenoacuteides pigmentos fotossintetizantes esteroacuteides e hidrocarbonetos sendo
chamados de fraccedilatildeo lipiacutedica total (GIOIELLI 1997)
43323 Cinzas
O teor de cinzas das ceacutelulas secas foi determinado por aquecimento de acordo
com meacutetodo descrito pelo Instituto Adolfo Lutz (1985) 1g da amostra foi pesada em
caacutepsula de porcelana previamente aquecida em mufla a 550 ordmC resfriada em
dessecador ateacute a temperatura ambiente e pesada A amostra foi seca em estufa a
105 ordmC carbonizada e incinerada em mufla a 550 ordmC durante 4 horas tempo
necessaacuterio para obter peso constante Posteriomente resfriou-se a amostra em
dessecador durante 1 hora ateacute atingir a temperatura ambiente e pesada As cinzas
devem ficar brancas ou ligeiramente acinzentadas
79
43324 Carboidratos totais
A porcentagem de carboidratos foi calculada pela diferenccedila entre e as
porcentagens dos demais componentes analisados na biomassa seca
434 Avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo elementar
As determinaccedilotildees de CNHSO foram realizadas pela CE instruments flash
EA1112 series acoplada com um detector de condutividade teacutermica (TCD) Para as
anaacutelises de Carbono Nitrogecircnio Hidrogecircnio e Enxofre foi utilizada a meteonina (C =
4025 N = 939 H = 743 S = 2149) como padratildeo e para a anaacutelise de
oxigecircnio foi utilizado o aacutecido aspaacutertico (C = 3609 N = 1052 H =53 S =
000 O = 4908)
4341 Determinaccedilatildeo de CNHS
Foram determinados pesando aproximadamente 1 a 4 mg da amostra em
recipiente de estanho e adicionar V2O5 (oacutexido de vanaacutedio) para que toda a biomassa
seja carbonizada Utiliza-se gaacutes oxigecircnio (99995) para carregar as amostras e
fazer a combustatildeo a 900degC formando os compostos reduzidos N2 CO2 H20 e SO2
Esses gases vatildeo para a coluna cromatograacutefica onde seratildeo separados e
posteriormente detectados por sinais eleacutetricos no detector de condutividade teacutermica
usando o software EAGER 300 na qual fornece a porcentagem de N C H S
contida na amostra
4342 Determinaccedilatildeo de oxigecircnio
Pesar aproximadamente 1 a 4 mg da amostra em recipiente de prata eleva-se
a temperatura a 1060degC onde ocorre a piroacutelise Durante a piroacutelise satildeo formados N2
CO e H2 estes satildeo filtrados onde os compostos halogenados satildeo retidos
Posteriormente esses gases vatildeo para a coluna cromatograacutefica onde o CO eacute
separado dos outros gases utilizando gaacutes heacutelio como carreador detectados por
sinais eleacutetricos no detector de condutividade teacutermica
44 Caacutelculos
441 Produtividade em etanol no regime permanente
Petanol = DEf (Equaccedilatildeo 1)
80
Onde Petanol = Produtividade em etanol (g L-1 h-1)
D = vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo (h-1)
Ef = concentraccedilatildeo de etanol (g L-1)
442 Rendimento do etanol no regime permanente
η = 1005110
1
ARTi
Ef (Equaccedilatildeo 2)
Onde η = rendimento em etanol ()
Ef = concentraccedilatildeo de etanol (g L-1)
ARTi = Accediluacutecares redutores totais no mosto de entrada no reator (g L-1)
0511 = rendimento teoacuterico (estequiomeacutetrico) da conversatildeo de glicose em
etanol
443 Produtividade em ceacutelulas nos cultivos de A platensis
Tc
XiXmPx
(Equaccedilatildeo 3)
Onde PX = produtividade em ceacutelulas (mg L-1 d -1)
Xm = concentraccedilatildeo celular maacutexima obtida (mg L-1)
Xi = concentraccedilatildeo celular inicial (mg L-1)
Tc = tempo de cultivo (dias)
444 Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas nos cultivos de A
platensis
Nt
VXiXmY NX
(Equaccedilatildeo 4)
81
OndeYXN = Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (mg mg-1)
Xm = concentraccedilatildeo celular maacutexima obtida (mg L-1)
Xi = concentraccedilatildeo celular inicial (mg L-1)
V = volume do meio (L)
Nt = quantidade total de nitrogecircnio adicionado (mg)
445 Coeficientes atocircmicos para 1 C-mol de biomassa
Foram escolhidos os principais aacutetomos (C H 0 N e S) que formam as
macromoleacuteculas proteiacutenas carboidratos lipiacutedios RNA e DNA Um C-mol de
biomassa eacute definida como CX1HX2NX3OX4SX5 e os coeficientes atocircmicos Xi satildeo
calculados a partir da Equaccedilatildeo 5
MMc
fc
MMi
fiXi (Equaccedilatildeo 5)
fi = fraccedilatildeo em massa do aacutetomo i na biomassa seca (g g-1)
MMi = Massa molar do aacutetomo i (g C-mol-1)
fc = fraccedilatildeo em massa do carbono na biomassa seca (g g-1)
MMc = Massa molar do aacutetomo do carbono (g C-mol-1)
Exemplo
Para se calcular o coeficiente atocircmico do hidrogecircnio em 1 C-mol de biomassa
no experimento 1 (Fonte de Carbono cilindro fonte de nitrogecircnio nitrato
intensidade luminosa 60 μmol de foacutetons m-2 s-1)
Teor de hidrogecircnio na biomassa foi de 662 e o teor de carbono foi de 543
o que corresponde a 662 mg de hidrogecircnio e 543 mg de carbono em 1 g da
biomassa Logo substituindo esses valores na Equaccedilatildeo 5 se encontra o coeficiente
atocircmico do hidrogecircnio de 146
12
543
1
66HX
XH = 146
82
446 Grau de reduccedilatildeo da biomassa
O grau de reduccedilatildeo (γ) de um composto orgacircnico eacute definido como o nuacutemero de
eleacutetrons envolvido na sua oxidaccedilatildeo Esse valor eacute a somatoacuteria da multiplicaccedilatildeo entre
os coeficientes atocircmicos e seu respectivo grau de reduccedilatildeo (HEI JNEN 2001)
45 Teoria dos paracircmetros bioenergeacuteticos
A energia de Gibbs dissipada para o crescimento e manutenccedilatildeo celular por
unidade de biomassa (1YGX kJC-mol) foi estimada de acordo com Heijnen (2001)
pela Equaccedilatildeo 6
G
GXGX
m
YY
max
11 (Equaccedilatildeo 6)
max
GXY eacute o rendimento maacuteximo teoacuterico de biomassa sobre a energia de Gibbs que
corresponde a um valor de 986 C-molX kJ-1 em cultivos fotoautotroacutefico com CO2
como fonte de carbono (HEIJNEN 2001)
Nesta equaccedilatildeo a velocidade especiacutefica de crescimento μ foi definida de
acordo com Leduy e Zajic (1973) como
1
ln1
i
i
X
X
t (Equaccedilatildeo 7)
Onde Xi e Xi-1 satildeo as concentraccedilotildees de biomassa no final e iniacutecio do intervalo de
tempo decorrido entre as duas determinaccedilotildees consecutivas (Δt = 1 dia) enquanto
que mG eacute a energia de Gibbs utilizada para a manutenccedilatildeo celular correspondendo a
712 kJ C-molX -1 h-1 a 30degC (HEIJNEN 2001)
A estimativa o nuacutemero de foacutetons (Einsteins) para sustentar o crescimento
autotroacutefico nPh foi necessaacuterio recorrer ao balanccedilo de energia de Gibbs tendo em
conta as contribuiccedilotildees de energia para o crescimento e manutenccedilatildeo 1YGX e a
absorccedilatildeo de 1 Einstein de foacutetons ΔgPh em adiccedilatildeo aqueles de formaccedilatildeo de
substratos e produtos Δgfi como descitos pela equaccedilatildeo
ΔgfHCO3- + ΔgfN + ΔgfH2O + ΔgfH
+ + ΔgfX + 1YGX + nPh ΔgPh = 0 (Equaccedilatildeo 8)
83
O valor de ΔgPh = 2062 kJ mol-1 foi estimado atraveacutes da equaccedilatildeo
A
Ph
hcNg (Equaccedilatildeo 9)
Sendo h = 662610-34 J a constante de Planck c = 299108 m s-1 a velocidade da
luz NA = 6022 x 1023 foacutetons de Einstein -1 o numero de Avogadro e λ = 580 nm o
comprimento de onda do foton absorvido (Li et al 2001)
Calculando os valores de ΔgPh e nPh eacute possiacutevel estimar a energia molar de
Gibbs absorvida pela equaccedilatildeo 10
ΔGa = nPh ΔgPh (Equaccedilatildeo 10)
A energia total de Gibbs absorvida pela fotossiacutentese (ΔGa) foi assumida como a
soma da energia fixada pelo sistema para aumentar o seu proacuteprio conteuacutedo
entaacutelpicos (ΔH) a energia transformada em ATP usada para o crescimento e
manutenccedilao celular (ΔGATP) e a liberada como calor (Q)
ΔGa + ΔGATP + ΔH + Q = 0 (Equaccedilatildeo 11)
Onde ΔGATP e ΔH foram calculados a partir do nPh a energia de Gibbs associada a 1
ATP mol e a media da variaccedilatildeo de potencial entre FSI e FSII (TORRE et al 2003)
A produccedilatildeo molar de O2 (qO2) e o consumo de H+ (qH+) foram calculados de
acordo com Torre et al (2003) multiplicando-se os seus coeficientes
estequiomeacutetricos pela concentraccedilatildeo celular expressa em C-mol L-1 e usando a
composiccedilatildeo elementar da biomassa experimental
84
5 Planejamento experimental
Os experimentos realizados estatildeo descritos na Tabela 2 Os valores de
intensidade luminosa foram escolhidos em funccedilatildeo do trabalho de Watanabe e Hall
(1995) O valor de pH foi fixado em 95 plusmn 02 de acordo com trabalho de Sanchez-
Luna et al (2007) e Tredici e Zittelli (1998) As adiccedilotildees diaacuterias de ureacuteia foram fixadas
com base na necessidade de nitrogecircnio da ceacutelula calculadas a partir dos resultados
das produtividades celulares obtidos nos experimentos padrotildees realizados utilizando
a fonte convencional de nitrogecircnio (NaNO3)
Para a realizaccedilatildeo dos ensaios padrotildees a concentraccedilatildeo de NaNO3
(SCHLOumlSSER 1982) foi mantida acima de 1 g L-1 para evitar a limitaccedilatildeo do
crescimento pela fonte de nitrogecircnio A partir da curva de crescimento experimental
utilizando o nitrato como fonte de nitrogecircnio para cada intensidade luminosa
estudada obteacutem-se uma equaccedilatildeo que representa a curva de crescimento teoacuterica e a
partir desta calcula-se a produtividade celular diaacuteria Considerando que as ceacutelulas
possuem 7 de nitrogecircnio (BEZERRA 2006) calcula-se a quantidade diaacuteria de
nitrogecircnio necessaacuteria para o crescimento celular obtendo-se assim a equaccedilatildeo de
adiccedilatildeo de nitrogecircnio amoniacal Por isso eacute necessaacuterio realizar uma curva de
crescimento padratildeo com NaNO3 para cada condiccedilatildeo analisada (diferentes
intensidades luminosas) A exemplificaccedilatildeo do escrito acima esta representado no
Item 62
Tabela 2 - Planejamento experimental
Experimento
Intensidade luminosa
( mol de foacutetons m-
2 s-1)
Fonte de nitrogecircnio
Controle de pH por CO2 de cilindro
Controle de pH por CO2 de
fermentaccedilatildeo alcooacutelica
1 60 NaNO3 Sim Natildeo
2 60 Ureacuteia Sim Natildeo
3 60 NaNO3 Natildeo Sim
4 60 Ureacuteia Natildeo Sim
5 120 NaNO3 Sim Natildeo
6 120 Ureacuteia Sim Natildeo
7 120 NaNO3 Natildeo Sim
8 120 Ureacuteia Natildeo Sim
9 240 NaNO3 Sim Natildeo
10 24 0 Ureacuteia Sim Natildeo
11 240 NaNO3 Natildeo Sim
12 240 Ureacuteia Natildeo Sim
valor fixado em 95 com uso de CO2
85
6 Resultados e discussatildeo
No item 61 estatildeo descritos os resultados dos testes preliminares da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica e no item 62 estatildeo apresentados os resultados dos
experimentos 1 ao 12 referentes aos acompanhamentos dos cultivos ao longo do
tempo A concentraccedilatildeo celular concentraccedilatildeo de carbonato de nitrato de amocircnia e
ureacuteia foram apresentadas neste item
As determinaccedilotildees da concentraccedilatildeo celular foram feitas diariamente enquanto
que as medidas de concentraccedilatildeo de nitrato amocircnia ureacuteia e de carbonato total no
meio de cultura em funccedilatildeo dos relativos grandes volumes de amostra necessaacuterios
para a execuccedilatildeo das teacutecnicas foram realizadas de dois em dois dias
Os paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima produtividade em ceacutelulas e fator
de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas estatildeo descritos no item 63 As
determinaccedilotildees da concentraccedilatildeo de clorofila foram realizadas no final de cada
experimento e estatildeo descritas no item 64 e a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal
teor de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos e cinzas estatildeo descritos no item 65
As anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas atraveacutes de anaacutelise de multivariacircncia e
diferenccedila entre as meacutedias em niacutevel de 5 de significacircncia visando-se examinar a
influecircncia de cada variaacutevel independente para os paracircmetros cineacuteticos Xm Px e
YXN bem como para o conteuacutedo de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos cinzas e teores
de clorofila a
As anaacutelises dos paracircmetros bioenergeacuteticos dos cultivos de A platensis
utilizando CO2 de cilindro estatildeo descritas no item 66 e a comparaccedilatildeo entre o perfil
de crescimento da A platensis em duas diferentes configuraccedilotildees de fotobioreator
tubular estaacute descrito no item 67
61 Testes preliminares para a realizaccedilatildeo da fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Antes de iniciar os experimentos acoplando a fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
com a produccedilatildeo de A platensis foram realizados testes para avaliar a influecircncia da
clarificaccedilatildeo do melaccedilo na determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular a homogeneidade
do reator as vazotildees especiacuteficas de alimentaccedilatildeo no processo contiacutenuo de modo a
obter regime permanente e produccedilatildeo gases suficiente para a correccedilatildeo do pH
durante o cultivo de A platensis
86
611 Avaliaccedilatildeo da influecircncia da clarificaccedilatildeo do melaccedilo na determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo celular
Inicialmente foi proposto utilizar o melaccedilo de cana-de-accediluacutecar clarificado e
esterilizado no entanto devido as dificuldade operacionais como por exemplo
grandes volumes de melaccedilo que seria utilizado para a manutenccedilatildeo do processo
contiacutenuo optou-se por utilizar o melaccedilo natildeo clarificado e natildeo esterilizado uma vez
que nas usinas brasileiras natildeo eacute empregado atualmente esse preacute-tratamento do
melaccedilo (LIMA et al 2001) Dhamija et al (1982) relata que os custos adicionais
para o preacute-tratamento de melaccedilo e da levedura reciclada pode limitar o uso do
processo Portanto a teacutecnica de reciclo de leveduras por centrifugaccedilatildeo e uso de
melaccedilo natildeo clarificado torna o processo mais econocircmico
O melaccedilo de cana-de-accediluacutecar possui aproximadamente 50 de accediluacutecares
(sacarose 25 a 40 glicose e frutose 12 a 35) aacutegua carboidratos cinzas
metais pesados compostos nitrogenados e em menor quantidade aacutecidos natildeo
nitrogenados (aacutecido ciacutetrico acido maacutelico oxaacutelico glicoacutelico) ceras esteroacuteides e
vitaminas (ROUKAS 1998) Vaacuterios fatores influenciam na composiccedilatildeo do melaccedilo ou
mel final os meacutetodos de fabricaccedilatildeo do accediluacutecar o tempo de armazenamento e as
regiotildees do plantio Este elevado teor de accediluacutecar eacute a razatildeo porque o melaccedilo eacute
largamente utilizado na induacutestria de fermentaccedilatildeo em particular produccedilatildeo de etanol
O emprego do melaccedilo natildeo tratado poderia influenciar a determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo celular por massa seca uma vez que no melaccedilo conteacutem aleacutem da
sacarose diversos outros resiacuteduos que poderiam ficar retidos na membrana de
filtraccedilatildeo dificultando esse processo eou resultando no falso aumento da
concentraccedilatildeo celular Por isso realizou-se um teste para avaliar se o natildeo tratamento
do melaccedilo influenciaria na determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular Os resultados e a
anaacutelise estatiacutestica da diferenccedila entre as meacutedias estatildeo descritos na Tabela 3
Tabela 3 - Valores da concentraccedilatildeo celular meacutedias e desvio padratildeo em massa seca obtidas a partir do melaccedilo natildeo clarificado e do melaccedilo clarificado
Melaccedilo natildeo clarificado (gL-1) Melaccedilo clarificado (gL-1)
1110 1010
1094 1074
1082 1004
Meacutedia = 109 plusmn 014ordf Meacutedia = 103 plusmn 040a
Diferenccedila percentual = 640
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
87
Como se pode observar na Tabela 3 as meacutedias da concentraccedilatildeo celular
determinada por massa seca foram estatisticamente iguais nas duas condiccedilotildees de
melaccedilo avaliadas melaccedilo clarificado e melaccedilo natildeo clarificado Com esses
resultados optou-se utilizar o melaccedilo natildeo clarificado uma vez que no acircmbito
industrial o processo de clarificaccedilatildeo aumenta os custos operacionais resultando em
um aumento dos custos do produto final Por isso estudos sobre os preacute-tratamentos
do melaccedilo de cana-de-accediluacutecar tecircm sido desenvolvidos para que viabilizem natildeo soacute a
obtenccedilatildeo dos produtos mas tambeacutem as etapas de recuperaccedilatildeo e purificaccedilatildeo sem
aumento excessivo no custo do processo (VALDUGA et al 2007)
612 Teste de homogeneidade do reator
O teste de homogeneidade no reator foi realizado com o objetivo de se avaliar
se as amostras retiradas em qualquer lugar do reator podem ser consideradas
equivalentes com um risco de erro estatisticamente determinado neste trabalho em
10 Para isso o teste de homogeneidade foi realizado de acordo com Koshimizu et
al (1983)
Na Tabela 4 estatildeo descritos os valores da concentraccedilatildeo celular e o logaritmo
da concentraccedilatildeo celular em funccedilatildeo do tempo com uma vazatildeo de alimentaccedilatildeo de
0124 h-1 A homogeneidade do reator eacute verificada se a queda da concentraccedilatildeo
celular for uma funccedilatildeo exponencial
Tabela 4 - Variaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de leveduras em funccedilatildeo do tempo
Tempo (horas) [X] (g L-1) Ln X
05 89 094939 10 72 085733 15 62 079379
20 57 075587
25 50 070070 30 46 066651 35 39 059988 40 33 051851 45 30 048287 50 25 039445
Aplicando-se o logaritmo neperiano aos valores do [X] (Tabela 4) e
construindo um graacutefico ln X em funccedilatildeo do tempo obtecircm-se a equaccedilatildeo da reta onde
o coeficiente angular da reta obtida eacute igual agrave vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo do
sistema teoacuterico (Dt)
88
Graacutefico 4 Logariacutetmico da concentraccedilatildeo celular em funccedilatildeo do tempo
O valor de Dt obtido pela reta eacute igual a 0115 h-1 que se comparado ao valor
calculado 0124 h-1 apresenta uma diferenccedila de 78 indicando que o sistema
pode ser considerado homogecircneo (KOSHIMIZU et al 1983)
613 Avaliaccedilatildeo de diferentes vazotildees especiacuteficas de alimentaccedilatildeo (D)
O efeito da vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo (D 01 h-1 005 h-1 e 0025 h-1) na
fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua foi avaliada para a produccedilatildeo de etanol Os
resultados satildeo mostrados nos Graacuteficos de 5 a 7
Graacutefico 5 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) etanol () e
accediluacutecar redutor total (ART) para D = 01 h-1
y = -01151x + 09884 Rsup2 = 09912
0010203040506070809
1
0 1 2 3 4 5 6
Ln
X
Tempo (h)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 20 40 60 80 100 120 140
Co
nc
en
tra
ccedilatilde
o (
g L
-1)
Tempo (horas)
Iniacutecio do regime permanente
89
Graacutefico 6 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) Etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 005 h-1
Graacutefico 7 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) Etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 0025 h-1
Como se pode observar nos Graacuteficos de 5 a 7 foi possiacutevel a obtenccedilatildeo do
regime permanente nos 3 valores de D empregados indicando a adequaccedilatildeo desses
valores e da concentraccedilatildeo de ART agrave velocidade de crescimento do micro-organismo
Nos ensaios de fermentaccedilatildeo contiacutenua a condiccedilatildeo de estado estacionaacuterio foi
obtida apoacutes trecircs tempos de residecircncia sem qualquer tipo de problema operacional
como obstruccedilatildeo do tubo de retirada de caldo crescimento na parede e mistura
imperfeita O Graacutefico 5 mostra um resultado tiacutepico em termos de perfis de
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Co
nc
en
tra
ccedilatilde
o (
g L
-1)
Tempo (horas)
Iniacutecio do regime permanente
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 20 40 60 80 100 120 140
Co
nc
en
tra
ccedilatilde
o (
g L
-1)
Tempo (horas)
Iniacutecio do regime permanente
90
concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de glicose (S) e concentraccedilatildeo de etanol (E)
No estado estacionaacuterio (D = 01 h-1) a concentraccedilatildeo de ART residual na saiacuteda do
reator foi de 9421plusmn449 g L-1 a concentraccedilatildeo celular foi de 547plusmn047 g L-1 e a
concentraccedilatildeo de etanol de 4169plusmn163 g L-1 Com a reduccedilatildeo da vazatildeo especiacutefica de
alimentaccedilatildeo para D = 005 h-1 (Graacutefico 5) a concentraccedilatildeo de glicose residual reduziu
para cerca de 4780plusmn870 g L-1 e as concentraccedilotildees de etanol e celular aumentaram
para 4542plusmn31 g L-1 e 618plusmn077 g L-1 respectivamente devido ao maior tempo de
residecircncia nessa segunda condiccedilatildeo Reduzindo a vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo
para 0025 h-1 (Graacutefico 6) a concentraccedilatildeo de etanol aumentou para 553plusmn757 g L-1
Isso porque menor a vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo maior o tempo de contato
entre as ceacutelulas e o accediluacutecar convertendo-o mais eficientemente no etanol Esse
resultado mostra que a reduccedilatildeo da vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo aumenta a
produtividade em etanol
Similarmente Perego Jr (1979) observaram que a diminuiccedilatildeo da vazatildeo
especiacutefica de 0117 para 0049 h-1 durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
menores foram os valores de ART residual 58 g L-1 e 28 g L-1 respectivamente Por
outro lado a concentraccedilatildeo de etanol aumentou de 496 g L-1 para 68 g L-1 e a
concentraccedilatildeo celular reduziu de 67 g L-1 para 53 g L-1 Esses valores diferiram do
presente trabalho devido agraves diferentes cepas de Saccharomyces cerevisieae bem
como o melaccedilo utilizado O melaccedilo por ser um produto natural varia de composiccedilatildeo
de acordo com o clima solo tempo de colheira
Na Tabela 5 mostra que a reduccedilatildeo da vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo levou a
um aumento no rendimento do processo obtendo maior valor de 636 no emprego
de D igual a 0025 h-1 O aumento na vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo proporciona
um aumento do fluxo de entrada de accediluacutecar provavelmente superior ao aumento da
velocidade de consumo levando a uma diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol
aumento da concentraccedilatildeo de ART residual e consequentemente diminuiccedilatildeo da
eficiecircncia de transformaccedilatildeo O rendimento representa a eficiecircncia da fermentaccedilatildeo
alcooacutelica tomando como base a equaccedilatildeo estequiomeacutetrica de Gay-Lussac onde a
relaccedilatildeo teoacuterica para 100 de eficiecircncia de conversatildeo de hexose em etanol eacute de
0511g de etanol produzido para cada grama de hexose consumida
91
Tabela 5 - Valores de XP ART Etanol e Rendimento do processo no regime
permanente para os diferentes valores de D com ART inicial de 170 gL-1
D (h-1)
XP (gL-1)
ARTf
(gL-1) Ef
(gL-1) η
() Px
(g L-1 h-1) Pe
(g L-1 h-1)
0100 547plusmn047 942plusmn449 417plusmn163 4799 055 417
0050 618plusmn077 478plusmn870 454plusmn310 5229 031 227
0025 609plusmn054 532plusmn567 553plusmn757 6364 015 138
D vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo Xp meacutedia dos valores de concentraccedilatildeo celular ao longo do regime permanente e seus desvios padrotildees ARTf accediluacutecares redutores totais no caldo fermentado Ef oncentraccedilatildeo de etanol no caldo fermentado η Rendimento do processo Px Produtividade em ceacutelulas Pe Produtividade em etanol
Na fermentaccedilatildeo alcooacutelica vaacuterios fatores podem influenciar no rendimento do
processo ou seja a conversatildeo de accediluacutecar em etanol entre eles a concentraccedilatildeo de
accediluacutecar e o fluxo pelo qual ele eacute adicionado e removido do reator (em processos
contiacutenuos) pH concentraccedilatildeo celular presenccedila de bacteacuterias contaminantes e o tipo
de processo adotado Na induacutestria o rendimento do processo eacute calculado baseado
na concentraccedilatildeo de accediluacutecar total que entra no sistema fermentativo sem considerar o
accediluacutecar residual podendo ser maior que 90 a 93 do valor teoacuterico da conversatildeo de
glicose em etanol (INGLEDEW 1999)
O processo de fermentaccedilatildeo mais comumente utilizado nas destilarias do
Brasil eacute utilizando a recuperaccedilatildeo de leveduras atraveacutes da centrifugaccedilatildeo do vinho
Aproximadamente 90 da levedura satildeo reutilizadas de uma fermentaccedilatildeo para a
proacutexima Esta suspensatildeo de fermento diluiacutedo e acidificado conhecido na praacutetica
com o nome de peacute-de-cuba permanece em agitaccedilatildeo de uma a trecircs horas antes de
retornar agrave dorna de fermentaccedilatildeo resultando em altas densidades celulares dentro
do reator (10-17 pv) e contribuindo para um tempo de fermentaccedilatildeo curto Isso
favorece a valores de conversotildees teoacutericos de accediluacutecares em etanol de 90 a 92
(BASSO et al 2008) valores maiores do que os obtidos no presente trabalho
(Tabela 5)
Em termos de produtividades a Tabela 5 mostra que as maacuteximas
produtividades em ceacutelulas (Px) e em etanol (Pe) foram obtidas para um alto valor de
D (01 h-1) de cerca de 055 g L-1 h-1 e 417 g L-1 h-1 respectivamente Por outro
92
lado nessas condiccedilotildees o rendimento em etanol obteve menor valor (48) Quando
a taxa de diluiccedilatildeo eacute alta os accediluacutecares satildeo adicionados a uma velocidade mais raacutepida
do que satildeo consumidos logo a perda de accediluacutecar aumenta e a concentraccedilatildeo de
etanol reduz diminuindo consequentemente a eficiecircncia do processo Como se pode
observar no trabalho de Melzoch et al (1991) a produtividade de etanol maacutexima foi
de 15 g L-1 h-1 no regime permanente com uma concentraccedilatildeo de S cereviseae de 46
g L-1 e concentraccedilatildeo de etanol de 81 g L-1 em bioreator agitado continuamente com
reciclo total de ceacutelulas utilizando a ultrafiltraccedilatildeo
Nas condiccedilotildees adotadas nessa fermentaccedilatildeo com ART de 170gL-1 optou-se
por aplicar D igual a 0025 h-1 por obter um maior valor de rendimento alcooacutelico e
gerar CO2 suficiente a ser incorporado nos cultivos de A platensis em fotobiorreator
tubular
614 Avaliaccedilatildeo dos volaacuteteis orgacircnicos no gaacutes de arraste
De acordo com os resultados obtidos pelo Instituto de Pesquisas Tecnoloacutegicas
foram encontrados nos gaacutes de arraste da fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
predominacircncia de (CO2) pequenas proporccedilotildees de etanol (C2H6O) e elementos
traccedilos de acetaldeiacutedo (C2H4O) Isso estaacute de acordo com Romano et al (2003) que
relataram as transformaccedilotildees quiacutemicas durante a fermentaccedilatildeo por leveduras
produzem principalmente CO2 e etanol e em menores quantidades a formaccedilatildeo de
CVOs Basso et al (1996) relata que durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica por levedura
os produtos da fermentaccedilatildeo satildeo constituiacutedos de 43 ndash 47 de etanol 41 - 45 de
gaacutes carbocircnico e o restante satildeo formados por outros compostos orgacircnicos tais como
glicerol aacutecido succiacutenico aacutecido aceacutetico entre outros Dentre os volaacuteteis orgacircnicos
majoritaacuterios produzidos durante a fermentaccedilatildeo de mosto de cana-de-accediluacutecar por
Saccharomyces cerevisiae encontram-se o etanol acetaldeiacutedo propanol isobutanol
aacutelcool isoamiacutelico acetato de etila (CAEHOT et al 1991)
93
62 Avaliaccedilatildeo do crescimento da A platensis
Experimento 1
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 60 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Cilindro
Tabela 6 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de carbonato
total referentes ao experimento 1
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 405 plusmn 27 1155 plusmn 000
1 590 plusmn 32 -
2 884 plusmn 24 1193 plusmn 027
3 1248 plusmn 202 -
4 1368 plusmn 99 1186 plusmn 026
5 1914 plusmn 19 -
6 2292 plusmn 103 1131 plusmn 021
7 2379 plusmn 46 -
8 2899 plusmn 17 1124 plusmn 021
9 2831 plusmn 22 -
10 2952 plusmn 76 1106 plusmn 064
Graacutefico 8 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 1
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
94
Experimento 2
Fonte de nitrogecircnio = ureacuteia Intensidade luminosa= 60 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = Cilindro
Tabela 7 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 2 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -44554x3 + 54865x2 + 14317x + 400 (60 mol de foacutetons
m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de
nitrogecircnio (mM dia -1)
0 0484
1 0691
2 0832
3 0906
4 0913
5 0853
6 0726
7 0533
8 0277
Graacutefico 9 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 2 (60 mol de foacutetons m-2 s-1)
0
02
04
06
08
1
0 2 4 6 8 10
mM
Ureacute
ia
Tempo (dias)
95
Tabela 8 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 2
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
Amocircnia total (mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 406 plusmn 000 1155 plusmn 000 - -
1 534 plusmn 49 - - -
2 906 plusmn 18 1155 plusmn 027- 132E-05 240E-04
3 1059 plusmn 37 - - -
4 1538 plusmn 137 1290 plusmn 004 136E-05 197E-04
5 2003 plusmn 94 - - -
6 2330 plusmn 28 1154 plusmn 125 135E-05 212E-04
7 2602 plusmn 25 - - -
8 2847 plusmn 0 1002 plusmn 089 338E-06 827E-04
9 2869 plusmn 14 - - -
10 2847 plusmn 56 1078 plusmn 018 681E-04
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 10 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 2
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
96
Experimento 3
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 60 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 9 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de carbonato
total referentes ao experimento 3
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 490plusmn0 1155 plusmn 000
1 591plusmn92 -
2 1193plusmn87 1224 plusmn 05
3 1430plusmn10 -
4 1959plusmn197 1234 plusmn 023
5 2161plusmn171 -
6 2445plusmn48 129 plusmn 005
7 2621plusmn102 -
8 2789plusmn82 1138 plusmn 104
9 2782plusmn125 -
10 2832plusmn89 111 plusmn 104
Graacutefico 11 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 3
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 5 10 15
X (
mg
L
-1)
Tempo (dias)
97
Experimento 4
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa = 60 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 10 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 4 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -20689x3 + 11591x2 + 33292x + 400 (60 mol de foacutetons
m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 086
1 088
2 088
3 084
4 078
5 068
6 055
7 039
8 020
Graacutefico 12 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 4 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
000
020
040
060
080
100
0 2 4 6 8 10
mM
ureacute
ia
Tempo (dias)
98
Tabela 11 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 4
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
Amocircnia total (mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 494plusmn0 1155plusmn000 - 284E-04
1 618plusmn74 - - -
2 1213plusmn59 1139 plusmn 069 218E-04
3 1498plusmn33 - - -
4 1874plusmn76 1095 plusmn 05 324E-05 221E-04
5 2250plusmn44 - - -
6 2516plusmn147 1083 plusmn 139 42E-04 829E-04
7 2694plusmn105 - - -
8 2867plusmn28 1086 plusmn 091 13E-03 308E-05
9 2871plusmn34 - -
10 2860plusmn61 118 plusmn 071 35E-04 202E-03
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 13 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 4
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg
L
-1)
Tempo (dias)
99
Experimento 5
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 120 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Cilindro
Tabela 12 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 5
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 406 plusmn 0 1155 plusmn 000
1 529 plusmn 22 -
2 894 plusmn 4 1155 plusmn 080
3 1401 plusmn 76 -
4 2118 plusmn 82 1191 plusmn 136
5 2584 plusmn 50 -
6 3209 plusmn 110 1134 plusmn 003
7 3262 plusmn 115 -
8 3302 plusmn 100 1212 plusmn 000
Graacutefico 14 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 5
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
100
Experimento 6
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa= 120 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = Cilindro
Tabela 13 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 6 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -13286x3 + 14486x2 + 62226x + 400 (120 mol de
foacutetons m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 0485
1 1010
2 1335
3 1462
4 1389
5 1117
6 0645
Graacutefico 15 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 6 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
0
02
04
06
08
1
12
14
16
0 2 4 6 8
mM
ureacute
ia
Tempo (dias)
101
Tabela 14 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 6
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total
(g L-1)
Amocircnia total
(mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 309 plusmn 00 1155 plusmn 000 - -
1 548 plusmn 10 - - -
2 797 plusmn 7 1117 plusmn 134 214E-05 197E-05
3 1267 plusmn 163 - - -
4 2062 plusmn 92 1101 plusmn 004 291E-06 182E-06
5 2558 plusmn 170 - - -
6 2980 plusmn 103 1253 plusmn 058 119E-06 252E-06
7 3093 plusmn 234 - - -
8 3266 plusmn 50 1033 plusmn 004 275E-06
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 16 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 6
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
102
Experimento 7
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 120 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 15 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 7
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 477 plusmn000 1155 plusmn 000
1 954 plusmn135 -
2 1151 plusmn140 1224 plusmn 080
3 1667 plusmn70 -
4 2165 plusmn256 1233 plusmn 136
5 2516 plusmn147 -
6 2969 plusmn23 1134 plusmn 035
7 2827 plusmn28 -
8 2969 plusmn59 1112 plusmn 114
Graacutefico 17 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 7
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
103
Experimento 8
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa= 120 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 16 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 8 de
acordo com a y = - 58128x3 + 38625x2 + 38606x + 400 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 105
1 115
2 117
3 110
4 095
5 070
6 037
Graacutefico 18 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 8 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
000
020
040
060
080
100
120
140
0 1 2 3 4 5 6 7
mM
ureacute
ia
Tempo (dias)
104
Tabela 17 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 8
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total
(g L-1) Amocircnia total
(mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 445 plusmn0 1155 plusmn 000 - -
1 767 plusmn46 - - -
2 1053 plusmn50 1117 plusmn 134 430E-04 307E-05
3 1554 plusmn31 - - -
4 2158 plusmn143 1101 plusmn 004 477E-04 273E-06
5 2552 plusmn87 - - -
6 2952 plusmn35 1253 plusmn 058 166E-04 54E-06
7 3048 plusmn96 - - -
8 3079 plusmn86 1033 plusmn 004 367E-05 194E-06
Graacutefico 19 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 8
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
105
Experimento 9
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 240 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Cilindro
Tabela 18 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 9
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 410 plusmn 0 1155plusmn000
1 815 plusmn 94 -
2 1297 plusmn 206 1117plusmn027
3 2174 plusmn 90 -
4 2625 plusmn 297 1264plusmn033
5 2994 plusmn 213 -
6 3291 plusmn 207 1246plusmn112
7 3422 plusmn 172 -
8 3299 plusmn 117 1045plusmn064
Graacutefico 20 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 9
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
106
Experimento 10
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa= 240 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = Cilindro
Tabela 19 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 10
de acordo com a equaccedilatildeo y = -12057x3 + 10082x2 + 31899x + 400 (240 mol de
foacutetons m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 101
1 134
2 148
3 145
4 123
5 083
6 025
Graacutefico 21 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 10 (240 mol de foacutetons m-2 s-1)
0
02
04
06
08
1
12
14
16
0 1 2 3 4 5 6 7
mM
Ureacute
ia
Tempo (dias)
107
Tabela 20 - Valores meacutedios de concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 10
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total
(g L-1)
Amocircnia total (mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 402 plusmn 000 1155plusmn000 - -
1 461 plusmn 62 - - -
2 839 plusmn 139 1003 plusmn 080 27994E-05
3 1705 plusmn 89 - - -
4 2663 plusmn 95 1120 plusmn 130 153E-05 65768E-06
5 3015 plusmn 78 - - -
6 3236 plusmn 72 1101 plusmn 058 178E-05 95016E-05
7 3307 plusmn 30 - - -
8 3293 plusmn 113 1200 plusmn 017 232E-06 75662E-05
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 22 concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 10
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10
Xm
(m
gL
-1)
Tempo (dias)
108
Experimento 11
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 240 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 21 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 11
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 358plusmn0 1155plusmn000
1 976plusmn53 -
2 1298plusmn61 1003plusmn27
3 1928plusmn78 -
4 2428plusmn207 1141plusmn014
5 2834plusmn199 -
6 3102plusmn130 1053plusmn161
7 2969plusmn59 -
8 3109plusmn19 965plusmn079
Graacutefico 23 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 11
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
109
Experimento 12
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa= 240 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 22 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 12
de acordo com a equaccedilatildeo y = -82763x3 + 62437x2 + 37265x + 400 (240 mol de
foacutetons m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 107
1 126
2 132
3 126
4 107
5 077
6 033
Graacutefico 24 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 12 (240 mol de foacutetons m-2 s-1)
000
020
040
060
080
100
120
140
0 2 4 6 8
mM
ureacute
ia
Tempo (dias)
110
Tabela 23 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amonia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 12
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total
(g L-1) Amocircnia total
(mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 400plusmn0 1155plusmn000 - -
1 625plusmn228 - - -
2 1095plusmn802 1003 plusmn 080 477E-05
3 1562plusmn357 - -
4 1912plusmn47 1120 plusmn 130 95E-05 110E-04
5 2609plusmn231 - -
6 3071plusmn111 1101 plusmn 058 220E-05 126E-04
7 3180plusmn820 - -
8 3200plusmn734 1200 plusmn 017 25E-06
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 25 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 12
Resultados do processo descontiacutenuo alimentado no cultivo de Arthrospira
(Spirulina) platensis utilizando CO2 proveniente de cilindro ou de fermentaccedilatildeo
alcooacutelica com diferentes fontes de nitrogecircnio (nitrato de soacutedio ou ureacuteia) e intensidade
luminosas (60 120 ou 240 mol de foacutetons m-2 s-1) podem ser observados nos
Graacuteficos 8 10 11 13 14 17 18 20 22 23 e 26
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
X (
mg
L
-1)
Tempo (dias)
111
Os perfis das curvas de crescimento foram semelhantes com ausecircncia da fase
lag no cultivo de A platensis no iniacutecio do cultivo crescendo exponencialmente e
estabilizando na fase estacionaacuteria As diferentes fontes de nitrogecircnio (nitrato e ureacuteia)
utilizadas nas diferentes intensidades luminosas (60 120 e 240 mol de foacutetons m-2 s-1
avaliadas) natildeo influenciaram nos perfis das curvas de crescimento Essa
caracteriacutestica foi observada em trabalhos anteriores de Pelizer et al (2003) e Danesi
et al (2002) Isso se deve a semelhanccedila nas condiccedilotildees de crescimento tais como
composiccedilatildeo quiacutemica do meio de cultura e temperatura de crescimento entre a
preparaccedilatildeo do inoacuteculo e o cultivo Outro fator eacute que as ceacutelulas para a preparaccedilatildeo do
inoacuteculo estavam na fase exponencial de crescimento isto eacute o inoacuteculo era um cultivo
jovem constituiacutedo de ceacutelulas ativas De fato Pelizer et al (2003) que trabalharam
com KNO3 como fonte de nitrogecircnio relataram a influecircncia da idade do inoacuteculo no
crescimento da S platensis comprovando que a utilizaccedilatildeo de inoacuteculo no 6ordm dia de
cultivo proporcionou maiores valores no crescimento celular em cultivos realizados
em minitanques Nessas condiccedilotildees tambeacutem natildeo detectaram fase lag de
crescimento
Autores como Danesi et al (2002) trabalhando com ureacuteia como fonte de
nitrogecircnio tambeacutem natildeo observaram a presenccedila de fase lag no cultivo de S
platensis De fato mesmo em cultivos onde o inoacuteculo foi cultivado em meio com
nitrato como eacute o caso do presente trabalho seria esperado que o uso de fontes de
nitrogecircnio que levem agrave presenccedila de amocircnia no meio de cultivo natildeo apresentasse
fase lag de crescimento celular pois a amocircnia eacute a fonte de nitrogecircnio
preferencialmente utilizada pela S platensis (BOUSSIBA 1989 BELKIN
BOUSSIBA 1991b)
A fonte de nitrogecircnio no meio de cultura eacute nutriente fundamental para o
crescimento de micro-organismos fotossintetizantes (WEN CHEN 2001) Diferentes
fontes de nitrogecircnio inorgacircnico para o cultivo de S platensis tem sido estudados tais
como cloreto de amocircnio (CARVALHO et al 2004) sulfato de amocircnio (SOLETTO et
al 2005) nitrato de amocircnio fosfato de amocircnio (COSTA et al 2001) nitrato de soacutedio
(SCHLOumlSSER 1982) nitrato de potaacutessio (PAOLLETI 1975) e ureacuteia (SAacuteNCHEZ-
LUNA et al 2004)
Comparando-se os cultivos com nitrato (Graacuteficos 8 11 14 17 20 e 23) e os
cultivos com ureacuteia (Graacuteficos 10 13 16 19 22 e 25) para cada intensidade luminosa
e fonte de CO2 estudada observam-se que as curvas de crescimento dos cultivos e
112
as concentraccedilotildees celulares diaacuterias com ureacuteia foram semelhantes as curvas de
crescimentos e as concentraccedilotildees celulares diaacuterias utilizando nitrato Isso mostra que
a equaccedilatildeo de alimentaccedilatildeo com ureacuteia (Graacuteficos 9 12 15 18 21 e 24) obtida em
cada intensidade luminosa e fonte de CO2 reproduziu seu respectivo cultivo
utilizando o nitrato
Como pode ser observado nas Tabelas 8 1114 17 20 e 23 as concentraccedilotildees
de amocircnia e ureacuteia residual durante os cultivos sempre apresentaram concentraccedilotildees
inferiores ou proacuteximas 10-4 molar mostrando que natildeo houve acuacutemulo de amocircnia e
ureacuteia residual nos cultivos e essa concentraccedilatildeo tambeacutem satildeo consideradas natildeo
toacutexicas pois esta concentraccedilatildeo torna-se toacutexica numa concentraccedilatildeo acima de 10 mM
e inibitoacuteria na concentraccedilatildeo de 17 mM a 2 mM (ABELIOVICH AZOV 1976
CARVALHO et al 2004 CONVERTI et al 2006b)
O nitrato eacute fonte de nitrogecircnio convencional nos cultivos de micro-oganismo e eacute
encontrado em abundacircncia em ambientes naturais No entanto o emprego de
nitrato em meio sinteacutetico utilizado na produccedilatildeo comercial de micro-organismos
pode aumentar custo do produto final Por isso fontes de nitrogecircnio alternativas tecircm
sido estudadas visando agrave reduccedilatildeo nos custo de produccedilatildeo
Ureacuteia tem sido considerada uma fonte alternativa de nitrogecircnio no cultivo de S
platensis por proporcionar um aumento da concentraccedilatildeo celular (SASSANO et al
2004 SOLETTO et al 2005 DANESI et al 2004) e por ter alta competitividade
econocircmica Isso decorre do seu baixo custo e alto conteuacutedo de nitrogecircnio tendo
como consequumlecircncia o baixo custo por unidade de nitrogecircnio quando comparada a
outras fontes de nitrogecircnio
A ureacuteia quando hidrolisada origina duas moleacuteculas de amocircnia e uma de
dioacutexido de carbono Essa conversatildeo ocorre primeiramente quando a ureacuteia
(CO(NH2)2) combina com a aacutegua (hidroacutelise) e forma o carbonato de amocircnio
((NH4)2CO3) Esse composto eacute instaacutevel e decompotildee para formar o gaacutes amocircnia (NH3)
e o dioacutexido de carbono (CO2) (DORN 2007) A amocircnia por sua vez eacute uma moleacutecula
pequena e natildeo carregada que se move relativamente livre atraveacutes da bicamada
lipiacutedica Um possiacutevel mecanismo para a assimilaccedilatildeo da amocircnia pode envolver a
simples difusatildeo da amocircnia seguindo pelo seu aprisionamento atraveacutes da
protonaccedilatildeo uma vez que dependendo do pH (pH 8) em que se encontra a amocircnia
reage com a aacutegua formando o iacuteon amocircnio (NH4+) Portanto a membrana eacute
permeaacutevel agrave amocircnia mas impermeaacutevel ao iacuteon amocircnio (BOUSSIBA et al 1984)
113
Costa et al (2001) em estudos comparativos usando diferentes fontes de
nitrogecircnio em processo descontiacutenuo no cultivo de S platensis observaram que
001 M de ureacuteia ou nitrato de amocircnio proporcionaram maiores concentraccedilotildees
celulares de aproximadamente 1g L-1 natildeo diferindo estatisticamente do cultivo com
o nitrato de soacutedio No entanto nos cultivos com maiores concentraccedilotildees dessas
fontes de nitrogecircnio (003 M e 005 M) natildeo houve crescimento celular
Costa et al (2004) avaliaram o crescimento da S platensis na lagoa Mangueira
suplementando ureacuteia por processo descontiacutenuo alimentado e observaram um
aumento de 267 vezes na concentraccedilatildeo da biomassa no cultivo suplementado com
1125 mg L-1 de ureacuteia quando comparada nos cultivos natildeo suplementado com ureacuteia
No entanto nos cultivos com 2250 mg L-1 de ureacuteia houve uma reduccedilatildeo na
concentraccedilatildeo celular Isso sugere que a adiccedilatildeo de ureacuteia na lagoa Mangueira eacute
beneacutefica ao crescimento da S platensis mas se adicionada em altas concentraccedilotildees
podem inibir o crescimento Por outro lado Soletto et al (2005) compararam cultivos
de S platensis utilizando processo descontiacutenuo com a mesma concentraccedilatildeo de
sulfato de amocircnio ou ureacuteia como fonte de nitrogecircnio e observaram que na
concentraccedilatildeo de 17 mM houve um raacutepido crescimento da biomassa quando
utilizado ureacuteia e houve uma inibiccedilatildeo no crescimento quando utilizado o sulfato de
amocircnio Como sugerido em trabalhos preacutevios a accedilatildeo simultacircnea das condiccedilotildees
alcalina (DANESI et al 2002) e a accedilatildeo da urease (CARVAJAL et al 1982
SHIMAMATSU 2004) poderia ter promovido a hidroacutelise da ureacuteia em amocircnia
acoplado com a assimilaccedilatildeo da amocircnia pelas ceacutelulas minimizando portanto a
inibiccedilatildeo pela amocircnia
Sassano et al (2004) observaram que utilizando 500 mg L-1 de massa total de
ureacuteia alimentada durante 12 dias proporcionou aumento na concentraccedilatildeo de S
platensis em minitanques quando comparadas ao emprego do nitrato
Su et al (2007) observaram que o maior desempenho em termos de
rendimento de biomassa e conteuacutedo de lipiacutedios durante o crescimento da Isochrysis
galbana foi no meio contendo ureacuteia como fonte de nitrogecircnio indicando que a ureacuteia
eacute a fonte preferencial de nitrogecircnio em relaccedilatildeo ao (NH4)2SO4 e NH4Cl
O emprego da ureacuteia pode levar a inibiccedilatildeo do crescimento celular Em condiccedilatildeo
alcalina ou a presenccedila de urease no meio de cultivo hidrolisa uma moleacutecula de ureacuteia
em duas moleacuteculas de amocircnia e esta em altas concentraccedilotildees eacute considerada toacutexica
para as ceacutelulas (SASSANO et al 2004) Por outro lado quando em baixas
114
concentraccedilotildees podem limitar o crescimento uma vez que a presenccedila nitrogecircnio eacute
fundamental para o crescimento e manutenccedilatildeo celular Por isso o modo de adiccedilatildeo
de ureacuteia eacute importante para melhorar a produtividade do cultivo
O modo de alimentaccedilatildeo empregado no cultivo de ureacuteia pode prevenir o
acuacutemulo ou a falta desse nutriente no cultivo Sanchez-Luna et al (2004) relataram
que a adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia a uma taxa constante pode ser usada no cultivo de S
platensis implicando em baixo custo na produccedilatildeo da biomassa por natildeo precisar de
bombas para alimentaccedilatildeo
A baixa concentraccedilatildeo de nitrogecircnio no cultivo limita o crescimento celular Por
outro lado a alta concentraccedilatildeo de nitrogecircnio inibe o mesmo Deste modo foram
feitos cultivos de A platensis utilizando a fonte de nitrogecircnio convencional (NaNO3)
para se observar a necessidade diaacuteria de nitrogecircnio consumida pelas ceacutelulas nas
diferentes intensidades luminosas e com base nessas curvas de crescimento
obtidas foram calculadas as quantidades de ureacuteia diaacuteria necessaacuterias visando evitar
a limitaccedilatildeo ou inibiccedilatildeo de crescimento celular pela fonte de nitrogecircnio como pode-se
observar nas Tabelas 7 9 10 13 16 19 e 22 Aleacutem disso foi empregado o
processo descontiacutenuo alimentado que deve ser usado para melhorar a densidade
celular no crescimento da A platensis desde que a concentraccedilatildeo de nitrogecircnio
soluacutevel possa ser adicionada ateacute alcanccedilar a produccedilatildeo maacutexima de biomassa sem
resultar na inibiccedilatildeo do crescimento
Outro fator importante no crescimento celular de micro-organismos
fotossintetizantes eacute a intensidade luminosa Nas culturas fotossinteacuteticas a
quantidade de energia luminosa captadas pelas ceacutelulas tem uma relaccedilatildeo direta com
a capacidade de fixaccedilatildeo do CO2 consequentemente a luz determina a
produtividade e a taxa de crescimento celular As diferentes intensidades luminosas
estudadas influenciaram nas concentraccedilotildees celulares maacuteximas Um aumento da
intensidade luminosa de 60 mol de foacutetons m-2 s-1 para 120 mol de foacutetons m-2 s-1
houve um aumento no valor da concentraccedilatildeo celular maacutexima No entanto um
aumento da intensidade luminosa de 120 mol de foacutetons m-2 s-1 para 240 mol de
foacutetons m-2 s-1 as concentraccedilotildees celulares maacuteximas obtiveram valores proacuteximos
Geralmente a taxa de crescimento das ceacutelulas microalgas aumenta com a
intensidade luminosa e a taxa atinge um valor de saturaccedilatildeo quanto maior for a
intensidade luminosa porque o excesso da energia luminosa natildeo pode ser utilizada
para a fotossiacutentese nas ceacutelulas e quando submetidas a um valor de intensidade
115
luminosa ainda maior o crescimento celular eacute reprimido como relatado por Hirata et
al (1998) e Chojnacka e Noworyta (2004a)
Segundo Hirata et al (1998) e Chojnacka e Noworyta (2004a) existe uma
correlaccedilatildeo entre o crescimento da Arthrospira ssp e a intensidade luminosa que satildeo
definidas por regiotildees denominadas regiatildeo limitada por luz saturada por luz e inibida
por luz A regiatildeo saturada por luz eacute definida como alta intensidade luminosa onde o
crescimento celular independe da intensidade luminosa Essa regiatildeo saturada por
luz pode ser observada no presente trabalho uma vez que o aumento da
intensidade luminosa natildeo interferiu na concentraccedilatildeo celular maacutexima O intervalo da
intensidade luminosa dessas regiotildees depende de vaacuterios fatores como configuraccedilatildeo
do reator micro-organismo condiccedilotildees de cultivo
S platensis cultivada em reator retangular alcanccedilou um aumento no valor da
velocidade especiacutefica de crescimento com o aumentou da intensidade luminosa de 8
a 34 W m-2 mas foi reduzido quando a intensidade luminosa aumentou de 34 W m-2
(156 mol de foacutetons m-2 s-1) para 158 W m-2 (724 mol de foacutetons m-2 s-1) e foi
completamente reprimida a 158 W m-2 (HIRATA et al 1998) Chojnacka e Noworyta
(2004a) avaliando o cultivo fotoautotroacutefico da S platensis em reator retangular
tambeacutem concluiacuteram que a velocidade de crescimento especiacutefica aumenta com o
aumento da intensidade luminosa ateacute um valor de 30 W m-2 Entre os valores de
intensidade luminosa de 30 W m-2 (138 mol de foacutetons m-2 s-1) a 50 W m-2 (229 mol
de foacutetons m-2 s-1) observa-se a regiatildeo de saturaccedilatildeo luminosa e acima desse valor
(50 W m-2) ocorre o fenocircmeno da fotoinibiccedilatildeo
Nos cultivos sob maiores intensidades luminosas (120 e 240 mol de foacutetons m-2
s-1) desenvolveram uma coloraccedilatildeo amarelada no decorrer do cultivo por outro lado
no cultivo a 60 mol de foacutetons m-2 s-1 as ceacutelulas apresentaram uma coloraccedilatildeo mais
verde-azulada claacutessica Como eacute bem conhecido sob condiccedilotildees limitantes de
nitrogecircnio o conteuacutedo de clorofila da S platensis diminui apresentando uma
coloraccedilatildeo verde-amarelada ao contraacuterio da coloraccedilatildeo verde-azulada claacutessica
(CARVALHO et al 2004) No entanto no presente estudo como natildeo houve
limitaccedilatildeo de nitrogecircnio durante os cultivos essa coloraccedilatildeo amarelada pode ser
devido agrave alta intensidade luminosa uma vez que as intensidades luminosas
estudadas atingiram a regiatildeo saturado por luz como definido por Hirata et al (1998)
e Chojnacka e Noworyta (2004a) Do mesmo modo Vonshak et al (1996) relataram
que o crescimento da S platensis torna-se saturado a um intervalo de 150 a 200
116
mol de foacutetons m-2 s-1 e esta faixa da intensidade luminosa corresponde a
aproximadamente de 10-15 da radiaccedilatildeo solar total a 400-700 nm
Geralmente o pH do meio aumenta durante o crescimento celular devido agrave
assimilaccedilatildeo da fonte de carbono o bicarbonato durante a fotossiacutentese (WATANABE
et al 1995 BINAGHI et al 2003) Os iacuteons bicarbonato satildeo transportados
ativamente para o interior celular convertidos a carbonato e gaacutes carbocircnico que eacute
utilizado na fotossiacutentese Para cada moleacutecula de CO2 utilizada pela ceacutelula ocorre a
liberaccedilatildeo de um iacuteon carbonato O pH da cultura foi mantido a 95 02 (SANCHEZ-
LUNA et al 2007 TREDICI ZITTELLI 1998) logo o CO2 consumido pelo micro-
organismo foi reposto por CO2 natildeo havendo modificaccedilotildees severas do pH o que
acarretaria uma reduccedilatildeo no crescimento da S platensis Valores de pH altos por
exemplo acima de 11 pode ser um fator no qual restringe a produtividade no
sistema air-lift usando ar natildeo suplementado com CO2 (WATANABE et al 1995)
Normalmente culturas de microorganismos fotossinteacuteticos usam como fonte
de carbono o bicarbonato eou carbonato Estes nutrientes satildeo adicionados em
grande quantidade no meio Schloumlsser para o cultivo de A platensis (1208 g L-1)
Adicionalmente estes micro-organismos tecircm a capacidade de fixar CO2 como fonte
de carbono na qual eacute liberado pelos efluentes industriais Logo este CO2 pode ser
adicionado ou substituiacutedo no meio de cultura reduzindo os custos da produccedilatildeo de
microorganismos fotossinteacuteticos bem como reduzindo os problemas ambientais
causados por esse gaacutes
O sequestramento de CO2 mostrou ser efetivo nas ceacutelulas de Chlorella
vulgaris e a presenccedila da mistura de CVOs (benzeno tolueno acetona metanol e
naftaleno) presente no efluente natildeo interferiu no uso desse CO2 e adicionalmente
11 dos CVOs foram removidos (KEFFER KLEINHEINZ 2002)
Diferentes autores relataram sobre o crescimento mixotroacutefico da A platensis
na presenccedila de glicose (ZHANG et al 1998 CHOJNACKA NOWORYTA 2004) ou
acetato (CHEN et al 2006) Maacuterquez et al (1993) mostraram que a S platensis eacute
capaz de crescer heterotroficamente ou mixotroficamente na presenccedila de glicose
sugerindo que o crescimento autotroacutefico e heterotroacutefico satildeo independentes Em
cultivos mixotroacuteficos o CO2 e composto orgacircnico satildeo assimilados conjuntamente
podendo ser um processo mais eficiente para a produccedilatildeo de biomassa microalgal
desde que isto implica em uma economia em energia usada para a siacutentese do
aparato fotossinteacutetico e para a fixaccedilatildeo do carbono (LEE 2004) Chen et al (2006)
117
mostraram que o acetato pode ser usado como fonte de carbono em cultivos
mixotroacuteficos de S platensis para a produccedilatildeo de vaacuterios pigmentos fotossinteacuteticos e
obtenccedilatildeo da concentraccedilatildeo de biomassa maacutexima (165 g Lminus1) na qual obtiveram
valores maiores que usando apenas bicarbonato (108 g L-1)
Menzyanova et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de pequenas quantidades
de etanol (01 - 03) aumentou a concentraccedilatildeo de Dunaliella viridis enquanto que
em quantidades maiores que 05 natildeo houve efeito no crescimento A adiccedilatildeo
muacuteltipla e sucessiva de etanol no cultivo favoreceu a um acuacutemulo de etanol no meio
de cultivo o que provocou uma inibiccedilatildeo o crescimento da D viridis quando a
concentraccedilatildeo de etanol foi de 03 e causou a morte celular na concentraccedilatildeo de
etanol de 05
Apesar do etanol ser o CVO predominante no material gasoso sua proporccedilatildeo
em relaccedilatildeo ao CO2 eacute pequena (resultados obtidos pelo instituto de Pesquisa
Tecnoloacutegica) Assim no presente trabalho natildeo se observou um efeito dos volaacuteteis
orgacircnicos (CVOs) liberados da fermentaccedilatildeo alcooacutelica no cultivo de A platensis
Esses CVOs satildeo constituiacutedos a maior parte por 43 ndash 47 de etanol (Basso et al
1996) e em menor quantidade acetaldeiacutedo propanol isobutanol aacutelcool isoamiacutelico e
acetato de etila (CAEHOT et al 1991) Logo A platensis pode ser usada para o
tratamento de efluentes gasosos nas induacutestrias de fermentaccedilatildeo alcooacutelica Logo
observou-se que o efluente gasoso liberado das induacutestrias de fermentaccedilatildeo alcooacutelica
pode ser usado no cultivo de A platensis sem prejudicar o crescimento celular
Similarmente Ferraz et al (1985) observaram que eacute possiacutevel cultivar S
maxima em reatores abertos (open ponds) borbulhando o CO2 proveniente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica de modo descontiacutenuo e usando nitrato com fonte de
nitrogecircnio
A adiccedilatildeo de CO2 no reator aleacutem de controlar o pH fornece a fonte de
carbono para o crescimento celular Como pode ser observado nas Tabelas 6 8 9
11 12 14 15 17 18 20 21 e 23 mesmo ocorrendo o crescimento celular as
concentraccedilotildees de carbonato total sempre apresentaram valores altos de um modo
geral proacuteximos aos 1208 g L-1 iniciais (concentraccedilatildeo indicada em Schloumlsser et al
1982) indicando que os cultivos tambeacutem natildeo foram limitados pela fonte de carbono
Durante a fotossiacutentese oxigecircnica realizada pela S platensis ocorre a
liberaccedilatildeo de O2 no meio de cultura Elevadas concentraccedilotildees de O2 no meio de
cultura pode prejudicar o crescimento celular uma vez que este pode danificar o
118
aparato fotossinteacutetico dificultando a realizaccedilatildeo da fotossiacutentese Por isso a
concentraccedilatildeo de O2 deve ser controlada durante o crescimento celular As
concentraccedilotildees de oxigecircnio foram analisadas diariamente e os valores natildeo atnigiram
niacuteveis inibitoacuterios pois foram sempre menores que 10 mg L-1 (Vonshak 1997)
119
63 Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm)
Produtividade em ceacutelulas (Px) e Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN)
Na Tabela 24 estatildeo descritos os valores da concentraccedilatildeo celular maacutexima
produtividade em ceacutelulas e fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas Nas Tabelas
25 28 e 31 estatildeo descritos a anaacutelise de variacircncia dos paracircmetros cineacuteticos Xm Px
e YXN respectivamente Os valores meacutedios de Xm Px e YXN para cada variaacutevel
independente estatildeo descritos nas Tabelas 26 27 29 30 32 e 33
Tabela 24 - Valores da concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) produtividade em ceacutelulas
(Px) e fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) com diferentes fontes de
CO2 fontes de nitrogecircnio e intensidades luminosas
Experimento Fonte de CO2 Intensidade luminosa (I)
Fonte de nitrogecircnio
Xm
(mg L-1)
Px
(mg L-1 d-1)
YXN
(g g-1)
1 Cilindro 60 NaNO3 2899 plusmn 17 250 plusmn 2 42 plusmn 003
2 Cilindro 60 Ureacuteia 2847plusmn 1 245 plusmn 1 14 plusmn 000
3 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 60 NaNO3 3120plusmn156 299 plusmn10 40 plusmn 014
4 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 60 Ureacuteia 2957 plusmn 99 308 plusmn 4 14 plusmn 017
5 Cilindro 120 NaNO3 3209plusmn109 454 plusmn18 45 plusmn 018
6 Cilindro 120 Ureacuteia 2980plusmn103 408 plusmn17 11 plusmn 050
7 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 120 NaNO3 2728 plusmn 27 428 plusmn 4 43 plusmn 004
8 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 120 Ureacuteia 2855 plusmn 11 425 plusmn 6 15 plusmn 02
9 Cilindro 240 NaNO3 3291plusmn206 482 plusmn 34 54 plusmn 038
10 Cilindro 240 Ureacuteia 3236 plusmn 72 473 plusmn 12 133plusmn034
11 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 240 NaNO3 3102plusmn130 450 plusmn 22 50 plusmn 024
12 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 240 Ureacuteia 3070plusmn112 445 plusmn19 14 plusmn 056
I = mol de foacutetons m-2
s-1
631 Concentraccedilatildeo celular maacutexima
Na Tabela 25 estatildeo apresentados os resultados da anaacutelise de variacircncia da
concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) e nas Tabelas 26 e 27 estatildeo apresentadas as
120
meacutedias do Xm nas variaacuteveis independentes fontes de nitrogecircnio e intensidades
luminosas respectivamente
Tabela 25 - Anaacutelise de variacircncia para a concentraccedilatildeo celular maacutexima
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
13585 1 13585 157 0225
Fonte de Nitrogecircnio
84 1 84 001 0922
Intensidade luminosa
443083 2 221542 2566 0000
Resiacuteduos 164033 19
total 620786 23
Como se observa na Tabela 25 a variaacutevel independente intensidade luminosa
foi estatisticamente significante na determinaccedilatildeo do Xm (p = 0000) enquanto que
as variaacuteveis independentes fontea de CO2 (p = 0225) e fonte de nitrogecircnio (p =
0922) natildeo influenciaram estatisticamente no valor de Xm De fato a similaridade das
fontes de nitrogecircnio jaacute era esperada uma vez que a adiccedilatildeo de ureacuteia nos cultivos para
cada intensidade luminosa foram baseadas em seus respectivos cultivos com nitrato
visando um crescimento celular natildeo limitado e nem inibido pela fonte de nitrogecircnio e
obtendo portanto valores de Xm meacutedios semelhantes Ambas as fontes de nitrogecircnio
utilizadas satildeo facilmente assimiladas pela A platensis os valores de Xm foram
estatisticamente iguais para cada intensidade luminosa avaliada (Tabela 26)
Em relaccedilatildeo agrave fonte de CO2 Isto mostra que o CO2 e os volaacuteteis orgacircnicos
liberados na atmosfera como resiacuteduo podem ser utilizados como fonte de carbono
no cultivo de A platensis sem prejudicar o crescimento celular
Tabela 26 - Meacutedias das concentraccedilotildees celular maacutexima para a variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio
Fonte de nitrogecircnio Xm meacutedia (mgL-1)
Nitrato 3027 plusmn 162ordf
Ureacuteia 3031 plusmn 174ordf
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
121
Comparando-se as meacutedias de Xm entre as diferentes intensidades luminosas
observa-se que o valor meacutedio de Xm na intensidade luminosa de 60 mol de foacutetons
m-2 s-1 foi estatisticamente diferente ao valor meacutedio de Xm quando a intensidade
luminosa foi de 120 mol de foacutetons m-2 s-1 e este foi estatisticamente semelhante ao
valor meacutedio de Xm quando a intensidade luminosa foi de 240 mol de foacutetons m-2 s-1
(Tabela 27) Essas comparaccedilotildees das meacutedias de Xm explicam o valor do niacutevel
descritivo obtido pela anaacutelise de variacircncia para a variaacutevel intensidade luminosa (p
=0000 Tabela 25) mostrando que a esta influencia no valor de Xm Esses
resultados estatildeo de acordo com Chojnacka e Noworyta (2004a) que avaliaram o
cultivo fotoautotroacutefico da S platensis em reator retangular tambeacutem concluiacuteram que a
velocidade de crescimento especiacutefica aumenta com o aumento da intensidade
luminosa ateacute um valor de 30 W m-2 (138 mol de foacutetons m-2 s-1) Entre os valores de
intensidade luminosa de 30 W m-2 (138 mol de foacutetons m-2 s-1) a 50 W m-2 (229 mol
de foacutetons m-2 s-1) observa-se a regiatildeo de saturaccedilatildeo luminosa Acima desse valor (50
W m-2) ocorre o fenocircmeno da fotoinibiccedilatildeo Do mesmo modo no presente trabalho
os valores de Xm foram estatisticamente iguais nas intensidades luminosas de 120
mol de foacutetons m-2 s-1 e 240 mol de foacutetons m-2 s-1 cujas intensidades luminosas satildeo
proacuteximas agraves intensidades luminosas que correspondem agrave regiatildeo de saturaccedilatildeo
luminosa observada por Chojnacka e Noworyta (2004a)
Tabela 27 - Meacutedias das concentraccedilotildees celular maacutexima para a variaacutevel independente
intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(mol de foacutetons m-2 s-1)
Xm meacutedia (mgL-1)
60 2851plusmn54ordf
120 3056plusmn115b
240 3180plusmn96b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
A maior concentraccedilatildeo celular maacutexima encontrada nesse trabalho foi maior do
que a obtida por Binaghi et al (2003) utilizando minitanques no cultivo de S
platensis (15 g L-1) e tambeacutem maior que a obtida por Watanabe e Hall (1996)
utilizando fotobiorreator tubular cocircnico no cultivo de S platensis (13 g L-1)
122
Morais e Costa (2007a) relataram que em cultivo de S platensis em
fotobiorreator tubular vertical obtiveram maiores valores de Xm de 413 g L-1
suplementado com 6 CO2 quando comparadas em cultivos em Erlenmeyer Esses
autores relatam que a S platensis podem crescer com 18 CO2 demonstrando que
estes suportam altas concentraccedilotildees de CO2 podendo ser usado para mitigar o efeito
do CO2 emitido pelos gases efluentes
Olguiacuten et al (2001) avaliando o crescimento da S platensis em meio contendo
aacutegua do mar suplementado com efluentes anaeroacutebicos a partir da digestatildeo de
resiacuteduo da suinocultura e em meio Zarrouk tambeacutem observaram um aumento no
valor de Xm com o aumento da intensidade luminosa de 66 mol de foacutetons m-2 s-1
para 144 mol de foacutetons m-2 s-1
632 Produtividade volumeacutetrica de ceacutelulas
Na Tabela 28 estatildeo apresentados os resultados da anaacutelise de variacircncia da
produtividade em ceacutelulas (Px) e nas Tabelas 29 e 30 estatildeo apresentadas as meacutedias
do Px nas variaacuteveis independentes fontes de nitrogecircnio e intensidades luminosas
respectivamente
Tabela 28 - Anaacutelise de variacircncia para a produtividade em ceacutelulas
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
315 1 315 137 0256
Fonte de Nitrogecircnio
1 1 1 000 0947
Intensidade luminosa
116579 2 58289 25372 0000
Resiacuteduos 4365 19 230
total 121260 23
Avaliando-se os paracircmetros produtividades em ceacutelulas pela anaacutelise de
variacircncia (Tabela 28) pode-se notar que a fonte de CO2 (p=0256) e a de nitrogecircnio
(p=0947) natildeo interferiram nas produtividades em celulares Portanto a intensidade
luminosa mostrou ser estatisticamente significante no valor de Px (p=0000)
123
Tabela 29 - Meacutedias das produtividades em ceacutelulas para a variaacutevel independente
fonte de nitrogecircnio
Fonte de nitrogecircnio Px meacutedio (mgL-1 d-1)
Nitrato 404 plusmn 74ordf
Ureacuteia 405 plusmn 75ordf
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
Como se pode observar na Tabela 29 os valores meacutedios de Px para as
diferentes fontes de nitrogecircnio estudadas natildeo diferiram estatisticamente Do mesmo
modo como ocorreu com o paracircmetro Xm os valores de Px nos cultivos com ureacuteia e
nitrato foram semelhantes para cada intensidade luminosa Isso jaacute era esperado
uma vez que a adiccedilatildeo de ureacuteia nos cultivos para cada intensidade luminosa foram
baseadas em seus respectivos cultivos com nitrato Spirulina platensis cultivadas em
minitanques com 257 mg L-1 de KNO3 ou 500 mg L-1 de ureacuteia obtiveram valores de
Px semelhantes para as intensidades luminosas estudadas 14 klux (168 mol de
foacutetons m-2 s-1) ou 56 klux (672 mol de foacutetons m-2 s-1) (RANGEL-YAGUI et al 2004)
Tabela 30 - Meacutedias das produtividades em ceacutelulas para a variaacutevel independente intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(mol de foacutetons m-2 s-1)
Px meacutedio (mgL-1)
60 306plusmn7a
120 443plusmn19b
240 463plusmn16b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
Os maiores valores de produtividade em ceacutelulas foram encontrados nas
maiores intensidades luminosas obtendo valores meacutedios de 443 plusmn 19 mg L-1 d-1 a
120 μmol de foacutetons m-2 s-1 e 463 plusmn 16 mg L-1 d-1 a 240 μmol de foacutetons m-2 s-1
independente da fonte de nitrogecircnio utilizada (Tabela 30) Durante a fotossiacutentese as
ceacutelulas podem utilizar somente uma soma limitada de energia luminosa por vez
Este fenocircmeno de saturaccedilatildeo luminosa eacute provavelmente resultado de um mecanismo
interno onde as ceacutelulas podem realizar a fotossiacutentese usando somente uma
124
determinada quantidade de luz (CARLOZZI 2003) Isso significa que durante a
saturaccedilatildeo luminosa um aumento da intensidade luminosa natildeo permitiraacute um
aumento da concentraccedilatildeo celular e nem reduziraacute o tempo de cultivo mantendo
proacuteximos os valores de produtividades de ceacutelulas nesse intervalo de saturaccedilatildeo
luminosa
Na menor intensidade luminosa (60 mol de foacutetons m-2 s-1) o valor de Px foi
menor em relaccedilatildeo agraves outras intensidades luminosas obtendo valor meacutedio de 306 plusmn 7
mg L-1 d-1 Do mesmo modo como observado nas outras intensidades luminosas as
fontes de nitrogecircnio estudadas natildeo influenciaram na produtividade celular Essa
diferenccedila nos valores de Px entre as intensidades luminosas foi devido a um maior
tempo de cultivo nos experimentos submetidos agrave intensidade luminosa de 60 mol
de foacutetons m-2 s-1 A produtividade eacute uma razatildeo inversa do tempo de cultivo logo
quanto maior a intensidade luminosa mais raacutepida as ceacutelulas atingem a concentraccedilatildeo
celular maacutexima e consequentemente maior seraacute a produtividade celular diaacuteria
Quanto maior a intensidade luminosa maior eacute a quantidade de foacutetons emitidos e
estes podem ser absorvidos pelas ceacutelulas isto eacute maior eacute a quantidade de energia
luminosa que seraacute convertido em energia quiacutemica que por sua vez as ceacutelulas
utilizam essa energia quiacutemica para a manutenccedilatildeo e o crescimento celular Esse
efeito tambeacutem foi observado por Danesi et al (2004) Rangel-Yagui et al (2004) em
cultivos de S platensis em minitanques utilizando KNO3 ou ureacuteia como fontes de
nitrogecircnio
O maior valor da produtividade encontrada nesse trabalho foi proacuteximo a 510 mg
L-1 d-1 obtido por Watanabe e Hall (1996) investigando o crescimento da S platensis
em fotobiorreator helicoidal cocircnico sob ciclos 12h12h (claroescuro) e uma meacutedia
de fluxo de foacutetons de 546 mol de foacutetons m-2 s-1 Watanabe et al (1995) em
processo descontiacutenuo utilizando a S platensis cultivada em fotobiorreator tubular
helicoidal cocircnico utilizando luz artificial (118 mol de foacutetons m-2 s-1) tambeacutem
obtiveram uma produtividade volumeacutetrica diaacuteria de 051 g L-1d-1 Foram usados dois
sistemas (airlift e bomba) para reciclar a cultura Com o sistema airlift os autores
encontraram a maior concentraccedilatildeo da biomassa de 16 g L-1 apoacutes 5 dias de
crescimento da S platensis e uma menor concentraccedilatildeo da biomassa quando
utilizado o sistema de bomba No fotobiorreator tubular helicoidal cocircnico quando
cultivado em ambiente externo a produtividade foi de 900 mg L-1 d-1 (TREDICI
125
ZITTELLI 1998) Travieso et al (2001) encontrou uma produtividade maacutexima de
040 g Lminus1 dminus1 em fotobiorreator tubular helicoidal operado de modo semicontiacutenuo
No presente trabalho os maiores valores da produtividade em ceacutelulas
encontradas foram maiores do que a relatada por Richmond (1990) em reatores
tubulares em ambiente externo que foi de 370 mg L-1 d-1 e Morais e Costa (2007b)
que obteve Xmax de 022 g Lminus1 dminus1 no cultivo de Spirulina sp na presenccedila de 6 de
dioacutexido de carbono em fotobiorreator tubular com trecircs estaacutegios em seacuterie Por outro
lado autores como Carlozzi e Pinzani (2005) conseguiram uma produtividade em
ceacutelulas maacutexima de 182 g L-1 dminus1 utilizando o processo descontiacutenuo em ambiente
externo Lee (2001) relata que dependendo da configuraccedilatildeo de fotobiorreator tubular
fechado e de placas retangulares a produtividade volumeacutetrica foi de 025 a 364 g L-1
d-1 utilizando o processo descontiacutenuo alimentado
Travieso et al (2001) relataram uma produtividade maacutexima de 04 g L-1 d-1 em
processo semicontiacutenuo de Spirulina utilizando uma diluiccedilatildeo de 15 e taxa de diluiccedilatildeo
de 00078 hminus1 Esses autores utilizaram o fotobiorreator patenteado bdquobdquoBiocoil‟‟ da
Biotechna Grasser UK (European patent EPO239272 March 6 1987)
Vernerey et al (2001) utilizando uma nova configuraccedilatildeo de fotobioretator para o
aumento da escala (72 litros) na produccedilatildeo de S platensis conseguiram uma
produtividade de 138 g L-1 d-1 com intensidade luminosa de 300 W m-2 e pH
controlado a 95 pela adiccedilatildeo de CO2
Cultivos de Arthrospira platensis em fotobiorreator tubular outdoor no periacuteodo
de marccedilo a setembro de 2002 na Repuacuteblica Checa com a maioria dos dias
ensolarados a irradiacircncia do ambiente maacutexima foi entre 15 and 18 mmol de foacutetons
mminus2 sminus1 Nessas condiccedilotildees a produtividade maacutexima atingida foi de 05 g Lminus1 dminus1
correspondendo a um rendimento de aacuterea (baseada na aacuterea superficial) de
aproximadamente 325 g mminus2 dminus1 na qual eacute um valor relativamente alto se considerar
que foi obtida no mecircs de setembro A concentraccedilatildeo celular oacutetima da cultura foi
obtida em um intervalo de 1 a 2 g L-1 demostrando que a faixa da concentraccedilatildeo
celular oacutetima no cultivo de Spirulina natildeo eacute muito restrita (MASOJIDEK et al 2003)
633 Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas
Na Tabela 31 estatildeo os resultados da anaacutelise de variacircncia para o fator de
conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) e nas Tabelas 32 e 33 estatildeo os valores
126
meacutedios do YXN nas variaacuteveis independentes fontes de nitrogecircnio e intensidades
luminosas respectivamente
Tabela 31 - Anaacutelise de variacircncia para fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
054 1 054 091 0351
Fonte de Nitrogecircnio
5078 1 5078 8453 0000
Intensidade luminosa
043 2 022 036 0700
Resiacuteduos 1123 19 059
total 520 23
Como observado na Tabela 24 os maiores valores do fator de conversatildeo (YXN)
foram obtidos nos cultivos utilizando ureacuteia como fonte de nitrogecircnio independente
da fonte de CO2 e da intensidade luminosa utilizada Isso pode ser avaliado pela
anaacutelise de variacircncia (Tabela 31) onde apresenta o niacutevel descritivo para a fonte de
CO2 fonte de nitrogecircnio de p = 0000 e para a intensidade luminosa o p = 0700 A
maior meacutedia dos valores de YXN foi 1380 plusmn 090 g g-1 obtida nos cultivos utilizando
ureacuteia como fonte de nitrogecircnio (Tabela 32) diferindo estatisticamente dos valores
obtidos nos cultivos com nitrato (460 plusmn 055 g g-1) De fato nos cultivo utilizando
ureacuteia a concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente foi calculada com base
na necessidade das ceacutelulas para o crescimento e a manutenccedilatildeo celular natildeo
ocorrendo uma limitaccedilatildeo ou um excesso de nitrogecircnio adicionado durante o cultivo
(item 5) Como mencionado por Rangel-Yagui et al (2004) o excesso de ureacuteia
diminui a eficiecircncia de utilizaccedilatildeo desse nutriente e portanto menor o valor de YXN
Da mesma forma a menor massa total adicionada no cultivo proporcionou maiores
valores de YXN (739 g g-1) no cultivo de S platensis em minitanques utilizando o
cloreto de amocircnio como fonte de nitrogecircnio (Carvalho et al 2004) Por outro lado
nos cultivos com nitrato a concentraccedilatildeo deste foram mantidas acima de 1 g L-1 de
modo a evitar a limitaccedilatildeo do crescimento pela fonte de nitrogecircnio Por isso os
maiores valores de YXN foram obtidos nos cultivos utilizando ureacuteia Resultados
similares foram obtidos por Danesi et al (2003) empregando 25 g de ureacuteia em
127
diferentes protocolos de alimentaccedilatildeo e temperatura em relaccedilatildeo a KNO3 e por Danesi
et al (2004) que tambeacutem observaram um maior fator de conversatildeo utilizando ureacuteia
em relaccedilatildeo a KNO3 independente da intensidade luminosa utilizada (2 e 5 klux)
Rangel-Yagui et al (2004) tambeacutem observaram maiores valores de YXN nos cultivos
utilizando ureacuteia
Tabela 32 - Meacutedias dos fatores de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas para a
variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio
Fonte de nitrogecircnio YXN (mgmg-1)
Nitrato 460 plusmn 055ordf
Ureacuteia 1380 plusmn 090b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
Em relaccedilatildeo agrave variaacutevel independente intensidade luminosa pode-se observar na
Tabela 33 que natildeo diferiram estatisticamente nos valores de YXN Isto eacute
independente da intensidade luminosa utilizada os valores de conversatildeo de
nitrogecircnio em ceacutelulas foram estatisticamente iguais De fato a quantidade de
nitrogecircnio adicionada nos cultivos estaacute relacionada com o crescimento celular
portanto quanto maior o valor de Xm maior foi a quantidade de nitrogecircnio
adicionada nos cultivos independente da fonte nitrogecircnio utilizada (nitrato ou ureacuteia)
Com isso razatildeo entre biomassa formada e nitrogecircnio adicionado foi estatisticamente
igual nas diferentes intensidades luminosas estudas
A Intensidade luminosa influencionou no crescimento celular (Item 62) e a
fonte de nitrogecircnio (nitrato ou ureacuteia) foi adicionada de acordo com a necessidade da
ceacutelula para o crescimento celular (Item 5) Por isso o YXN foi estatisticamente igual
(p = 0245) nas diferentes intensidades luminosas estudadas (Tabela 31)
O fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas eacute definido como a quantidade de
nitrogecircnio utilizada para a formaccedilatildeo de biomassa como no presente trabalho o
nitrogecircnio adicionado foi de acordo com a necessidade diaacuteria das ceacutelulas os valores
meacutedios de YXN para cada intensidade luminosa natildeo poderiam variar como pode ser
observado na Tabela 33
Nos trabalhos apresentados por Bezerra et al (2008) Danesi et al (2004) e
Rangel-Yagui et al (2004) observaram que os valores de Xm e YXN aumentam com
128
o aumento da intensidade luminosa fornecida ao cultivo Maiores energias
fornecidas pelas mais altas luminosidades empregadas nos cultivos permitem as
ceacutelulas de consumirem o nitrogecircnio disponiacutevel levando a maiores valores de Xm e
YXN Isso ocorreu porque a mesma quantidade de nitrogecircnio foi adicionada nos
ensaios com diferentes intensidades luminosas logo o YXN foi uma funccedilatildeo de Xm
Por outro lado no presente trabalho os valores meacutedios YXN natildeo diferiram
estatisticamente com o aumento da intensidade luminosa porque a quantidade total
de nitrogecircnio adicionada variou nos cultivos com as diferentes intensidades
luminosas isto eacute quanto maior a intensidade luminosa maior foi a quantidade de
nitrogecircnio adicionada e consequentemente maior concentraccedilatildeo celular Por isso o
YXN natildeo diferiram nas diferentes intensidades luminosas estudadas (Tabela 26)
Tabela 33 - Meacutedias dos fatores de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas para a
variaacutevel independente intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(mol de foacutetons m-2 s-1)
YXN (mgmg-1)
60 922 plusmn 034ordf
120 902 plusmn 034a
240 935 plusmn 034a
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
Os maiores valores do fator de conversatildeo encontrado nesse trabalho (1327 plusmn
028 mg mg-1) foi maior do que 739 g g-1 (CARVALHO et al 2004) 85 g g-1
(RANGEL-YAGUI et al 2004a) utilizando ureacuteia e 57 plusmn 017 g g-1 utilizando cloreto de
amocircnio como fonte de nitrogecircnio nos cultivos de S platensis em minitaques
(BEZERRA et al 2008) Isso porque no presente trabalho a S platensis foi
cultivada em fotobiorreator tubular fechado o que proporciona menor volatilizaccedilatildeo
da amocircnia e melhor eacute o seu aproveitamento pelas ceacutelulas ocasionando maiores
valores de YXN
129
64 Avaliaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de clorofila a
No final de cada experimento foi realizada a determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de
clorofila a na concentraccedilatildeo celular final e os resultados estatildeo descritos na Tabela
34
Tabela 34 ndash Concentraccedilotildees de clorofila na biomassa final
Experimento Fonte de CO2 Intensidade luminosaa
Fonte de nitrogecircnio
Concentraccedilatildeo de clorofila (mg cl g cel -1)
1 Cilindro 60 NaNO3 521plusmn028
2 Cilindro 60 Ureacuteia 415plusmn020
3 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 60 NaNO3 392plusmn008
4 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 60 Ureacuteia 326plusmn030
5 Cilindro 120 NaNO3 344plusmn010
6 Cilindro 120 Ureacuteia 296plusmn009
7 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 120 NaNO3 294plusmn040
8 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 120 Ureacuteia 210plusmn023
9 Cilindro 240 NaNO3 175plusmn037
10 Cilindro 240 Ureacuteia 181plusmn 015
11 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 240 NaNO3 294plusmn035
12 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 240 Ureacuteia 210plusmn023
a mol de foacutetons m-2 s-1
Dentre os metaboacutelitos microalgais a clorofila foi muito pouco investigada Satildeo
os uacutenicos pigmentos naturais de coloraccedilatildeo verde em abundacircncia mas sua
instabilidade ao isolamento tem restringindo a sua utilizaccedilatildeo como corante natural na
induacutestria de alimentos As clorofilas utilizadas como corantes alimentares provecircm
principalmente de plantas terrestres (HENDRY 1996)
Microalgas fotossinteacuteticas satildeo organismos que capturam energia luminosa
eficiententemente O pigmento fotossinteacutetico clorofila a eacute o principal componente
130
fotoquiacutemico ativo na qual funciona como um receptor de luz para direcionar a
fotossiacutentese O conteuacutedo deste pigmento em microalga eacute portanto relatado para
atividade fotossinteacutetica (MACINTYRE et al 2002) A intensidade de luz captada
pelos pigmentos influencia na produccedilatildeo da biomassa e no acuacutemulo de produtos
alvos na microalga cultivada sob diferentes condiccedilotildees
As clorofilas satildeo pigmentos verdes de alto valor comercial encontradas em
plantas microalgas e cianobacteacuterias como A platensis A concentraccedilatildeo desse
pigmento nas ceacutelulas depende das condiccedilotildees ambientais Devido a sua cor e as
propriedades fiacutesico-quiacutemicas satildeo utilizadas como corantes naturais em produtos
alimentiacutecios
Na Tabela 35 observa-se que ambas as variaacuteveis independentes avaliadas
nesse estudo fonte de nitrogecircnio e intensidade luminosa interferiram na
concentraccedilatildeo de clorofila a na biomassa final Isso foi confirmada pela anaacutelise
estatiacutestica ANOVA onde apresentou um valor de niacutevel descritivo de 0011 para a
variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio e de 0000 para a intensidade luminosa
Tabela 35 - Anaacutelise de variacircncia para a concentraccedilatildeo de clorofila na biomassa final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Meacutedia dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
03725 1 03725 101 0328
Fonte de Nitrogecircnio
29751 1 29751 804 0011
Intensidade luminosa
158306 2 79153 2139 0000
Resiacuteduos 70318 19 01272
Total 26210 23
Avaliando-se as meacutedias da concentraccedilatildeo de clorofila a nas diferentes fontes de
nitrogecircnio (Tabela 34) observa-se que nos cultivos utilizando nitrato obtiveram
maiores concentraccedilotildees de clorofila em relaccedilatildeo aos cultivos com ureacuteia nas
intensidades luminosas de 60 mol de foacutetons m-2 s-1 e 120 mol de foacutetons m-2 s-1
Essa diferenccedila na concentraccedilatildeo de clorofila pode ser explicada pelo fato dos cultivos
com nitrato a concentraccedilatildeo de nitrato no meio de cultura foi mantida sempre
superior a 1 g L-1 enquanto que nos cultivos com ureacuteia a concentraccedilatildeo de ureacuteia no
131
meio cultura foi abaixo de 10-4 M (item 62) Essa concentraccedilatildeo de ureacuteia apesar de
natildeo interferir na concentraccedilatildeo celular pode ter influenciado na concentraccedilatildeo de
clorofila nas ceacutelulas Resultados similares foram observados por Danesi et al (2004)
e Rangel-Yagui et al (2004) em cultivos de S platensis em minitanques
substituindo a fonte de nitrogecircnio KNO3 por ureacuteia
O efeito da limitaccedilatildeo de nitrogecircnio e ferro comprometeu a capacidade
fotossinteacutetica reduziu o conteuacutedo de clorofila celular e diminuiu o rendimento
quacircntico do fotossintema II (YOUNG BEARDALL 2005) Muggli e Harrison (1996)
observaram que a concentraccedilatildeo de clorofila nas ceacutelulas de Emiliania huxleyi
cultivadas com nitrato foi estatisticamente maior que nas celulas cultivadas com
amocircnia sob condiccedilotildees limitadas de ferro e intensidade luminosa abaixo da
saturaccedilatildeo Por outro lado nos cultivos natildeo limitados com ferro as concentraccedilotildees de
clorofilas foram estatisticamente iguais Sob duas diferentes intensidades luminosas
abaixo da regiatildeo de saturaccedilatildeo (45 e 70 mol de foacutetons m-2 s-1) as ceacutelulas cultivadas
em nitrato mantiveram uma maior taxa de clorofila por volume de ceacutelulas que nas
ceacutelulas cultivadas com amocircnio similar ao que aconteceu nas condiccedilotildees limitadas
por ferro
A intensidade luminosa eacute uma importante variaacutevel que interfere na
concentraccedilatildeo de clorofila Como podemos observar na Tabela 34 maiores
concentraccedilotildees de clorofilas meacutedias independente da fonte de nitrogecircnio e de CO2
satildeo encontradas nas menores intensidades luminosas De um modo geral o
aumento da concentraccedilatildeo de clorofila com a reduccedilatildeo da luminosidade aumenta a
capacidade de absorccedilatildeo de luz pois a clorofila eacute quem efetivamente atua nas
reaccedilotildees fotoquiacutemicas da fotossiacutentese e representa um mecanismo de adaptaccedilatildeo agrave
condiccedilatildeo de menor intensidade luminosa A reduccedilatildeo do conteuacutedo de pigmentos a
altas irradiacircncias permite as algas reduzirem a taxa de fornecimento de energia pela
absorccedilatildeo da luz nas ceacutelulas com a finalidade de balancear a energia absorvida e a
energia necessaacuteria para a fixaccedilatildeo do carbono e crescimento celular (GEIDER et al
1997) Geralmente a clorofila e as ficobiliproteiacutenas tendem a aumentar sua
concentraccedilatildeo com a reduccedilatildeo da intensidade luminosa (TOMASELLI et al 1997)
Nas menores intensidades luminosas onde a competiccedilatildeo pelo poder redutor eacute
maior observa-se que as ceacutelulas cultivadas em nitrato mantem maior niacuteveis de
clorofila que nas ceacutelulas cultivadas em amocircnia Portanto as ceacutelulas cultivadas em
nitrato precisam mais do poder redutor para transportar e utilizar sua fonte de
132
nitrogecircnio eles podem requerer mais clorofila que as ceacutelulas cultivadas em amocircnio
para suprir tais necessidades Por outro lado altas intensidades luminosas alteram o
complexo proteacuteico contendo pigmentos captadores de luz como observado por
Smith et al (1990) em ceacutelulas de Dunaliella salina Telfar et al (1990) mostrou que
iluminaccedilatildeo prolongada causa destruiccedilatildeo dos pigmentos da clorofila e conduz a
inibiccedilatildeo fotoquiacutemica do FSII
Cultivos de Spirulina subsalsa exposto agrave alta intensidade luminosa (100 mol
de foacutetons m-2 s-1) mostrou uma reduccedilatildeo no conteuacutedo de pigmentos nas ceacutelulas O
conteuacutedo de carotenoacuteide e clorofila a reduziu com o aumento da intensidade
luminosa de 25 mol de foacutetons m-2 s-1 para 100 mol de foacutetons m-2 s-1 O conteuacutedo
de ficobilissomos obteve uma maior reduccedilatildeo quando comparados com o conteuacutedo
de clorofila a (aproximadamente 70 e 57 respectivamente) Devido a uma
reduccedilatildeo nos carotenoacuteides zeaxantina foi o carotenoacuteide predominante a maior
intensidade luminosa (TOMASELLI et al 1995) Um aumento da intensidade
luminosa de 2 klux (24 mol de foacutetons m-2 s-1 ) para 5 klux (60 mol de foacutetons m-2 s-
1) houve uma reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de clorofila de 14 plusmn 18 mg cl g cel -1 para
80 plusmn 18 mg cl g cel -1 nos cultivos com KNO3 e 142 plusmn 08 mg cl g cel -1 para 72 plusmn
14 mg cl g cel -1 para os cultivos com ureacuteia respectivamente (DANESI et al 2004)
Pode-se observar que a concentraccedilatildeo de clorofila nos cultivos a 5 klux (60 mol de
foacutetons m-2 s-1) foram proacuteximas as concentraccedilotildees obtidas no presente trabalho nos
cultivos a 60 mol de foacutetons m-2 s-1 (NaNO3 = 521 plusmn 03 mg cl g cel -1 Ureacuteia = 415
plusmn 02 mg cl g cel -1 Tabela 34) Essa diferenccedila pode ser devido ao aumento do
efeito sombreamento ser maior em minitanques quando comparada aos
fotobiorreatores tubulares o que favorece a um aumento da concentraccedilatildeo de
clorofila nos cultivos em minitanques Soundarapandian e Vasanthi (2008)
observaram um maior teor de clorofila em diferentes cepas de S platensis cultivadas
a 3 klux (36 mol de foacutetons m-2 s-1) intensidade luminosa com ciclos alternados de 16
horas no claro e 8 horas no escuro
Dados na literatura mostram que na biomassa de A platensis possuem 1 de
clorofila (VONSHAK 1997 COGNO et al 2003) No entanto no presente trabalho a
maior concentraccedilatildeo de clorofila foi de 05 correspondendo ao experimento 1 (60
mol de foacutetons m-2 s-1 NaNO3 Tabela 13) Esse baixo valor de concentraccedilatildeo de
clorofila em relaccedilatildeo aos valores citados na literatura eacute devido agraves altas intensidades
luminosas utilizadas no neste trabalho Soundarapandian e Vasanthi (2008)
133
relataram que a concentraccedilatildeo de clorofila nas S platensis cultivadas a 3 klux pode
variar de 085 (8526 μg mg cel-1) a 097 (9723 μg mg cel-1) dependendo da
cepa utilizada Jimenez et al (2003) em cultivos de S platensis em minitanques
utilizando a energia solar no sul da Espanha obtiveram uma concentraccedilatildeo de
clorofila de 79 g kgminus1 (079)
Carlozzi e Pinzani (2005) observaram uma concentraccedilatildeo maacutexima de clorofila
de 2 em cultivos outdoor de S platensis em fotobiorreator espiralado fechado
Esta concentraccedilatildeo permaneceu constante do 6deg ao 10deg dia de cultivo Tomaselli et
al (1997) tambeacutem observaram um aumento na concentraccedilatildeo de clorofila de 151 μg
mg cel-1 para 263 μg mg cel-1 nos cultivos de A maacutexima em reator de vidro
retangular a intensidade luminosa de 144 mol de foacutetons m-2 s-1 e 25 mol de foacutetons
m-2 s-1 respectivamente Tredici e Zittelli (1998) em cultivos continuos ldquooutdoorsrdquo de
A platensis em fotobiorreator tubular e plano obtiveram a concentraccedilatildeo de clorofila
de 155plusmn002 e 163 plusmn002 na massa seca no iniacutecio do periacuteodo luminoso
De fato a concentraccedilatildeo de clorofila depende das condiccedilotildees ambientais
principalmente da intensidade luminosa No presente estudo nos cultivos
submetidos agrave alta intensidade luminosa favoreceram a uma reduccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de clorofila principalmente nos cultivos a 240 mol de foacutetons m-2 s-1
Do mesmo modo Nakajima e Ueda (1997) observaram um aumento no crescimento
celular de Chlorella pyrenoidosa e uma reduccedilatildeo no conteuacutedo de pigmentos
captadores de luz nas ceacutelulas cultivadas a altas intensidades luminosas (50 μmol de
foacutetons m-2 s-1) Na presenccedila de excesso de luz o oxigecircnio produzido durante a
fotossiacutentese reage com a clorofila excitada originando um oxigecircnio singlete que eacute
muito mais reativo podendo oxidar as clorofilas e ocasionando consequentemente o
fenocircmeno denominado de branqueamento (MARIQUE 2003) As clorofilas tendem a
ser foto-oxidadas a alta irradiaccedilatildeo e devido aos carotenoacuteides poderem prevenir a
foto-oxidaccedilatildeo das clorofilas a relaccedilatildeo entre as clorofilas e carotenoacuteides pode ser
usada como um indicador potencial de perdas foto-oxidativas causadas por fortes
irradiaccedilotildees (HENDRY amp PRICE 1993)
134
65 Avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal
Micro-organismos fotossintetizantes usam fonte de carbono inorgacircnico energia
luminosa e nitrogecircnio para sintetizar compostos orgacircnicos como proteiacutenas
carboidratos vitaminas lipiacutedios pigmentos entre outros Com isso a composiccedilatildeo
centesimal da biomassa pode variar com as condiccedilotildees ambientais (RAFIQUL et al
2005 MOHANTY et al 1997)
Na Tabela 36 estatildeo apresentados os teores de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos
e cinzas das biomassas secas obtidas no final dos experimentos
Tabela 36 - Porcentagem de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos e cinzas na biomassa
seca final
Experimento Intensidade
luminosa (I)
Fonte de CO2
Fonte de nitrogecircnio
Proteiacutenas totais ()
Lipiacutedios totais ()
Cinzas ()
Carboidratos totais ()
1 60 Cilindro NaNO3 319plusmn01 863plusmn03 442plusmn001 5226plusmn358
2 60 Cilindro Ureacuteia 233plusmn07 660plusmn09 442plusmn004 6471plusmn064
3 60 Alcooacutelica NaNO3 324plusmn07 101plusmn08 583plusmn002 5222plusmn341
4 60 Alcooacutelica Ureacuteia 427plusmn23 112plusmn14 508plusmn091 6492plusmn336
5 120 Cilindro NaNO3 281plusmn04 121plusmn06 476plusmn002 5500plusmn-016
6 120 Cilindro Ureacuteia 299plusmn06 730plusmn07 482plusmn018 5794plusmn005
7 120 Alcooacutelica NaNO3 315plusmn18 862plusmn06 497plusmn018 5576plusmn341
8 120 Alcooacutelica Ureacuteia 404plusmn07 953plusmn07 394plusmn063 4642plusmn091
9 240 Cilindro NaNO3 213plusmn01 142plusmn23 428plusmn004 6004plusmn243
10 240 Cilindro Ureacuteia 319plusmn09 129plusmn05 540plusmn050 5079plusmn147
11 240 Alcooacutelica NaNO3 278plusmn04 144plusmn29 579plusmn048 5222plusmn341
12 240 Alcooacutelica Ureacuteia 210plusmn03 117plusmn28 449plusmn004 6492plusmn336
I = Intensidade luminosa (mol de foacutetons m-2 s-1)
A Fotossiacutentese eacute o processo pelo qual a energia luminosa eacute convertida em
energia quiacutemica pelas plantas bacteacuterias fotossinteacuteticas e cianobacteacuterias A energia
luminosa eacute capturada pelos pigmentos fotossinteacuteticos como clorofila carotenoacuteides e
ficocianina na qual satildeo complexados com proteiacutenas que satildeo partes do fotossistema I
e II em cianobacteacuterias O sistema fotossinteacutetico eacute fortemente conectado com outras
135
vias metaboacutelicas como biossiacutentese de proteiacutenas e lipiacutedios nas quais satildeo
necessaacuterias para o crescimento celular (MOHANTY et al 1997)
Os teores de proteiacutena variaram de 21 a 42 Esses valores estatildeo proacuteximos
aos valores encontrados por Cantildeizares-Villanueva et al (1994) cultivando S maxima
em meio de cultura constituiacutedo por resiacuteduo da criaccedilatildeo de porcos (diluiacutedo a 50 em
aacutegua) Embora o teor de proteiacutena seja baixo (36) a biomassa ainda eacute apropriada
para o uso como suplemento aliementar para animais Jimeacutenez et al (2003) tambeacutem
encontraram um baixo teor de proteiacutena de 47 do peso seco em meacutedia na
produccedilatildeo industiral da Spirulina em Malaga no sul da Espanha
A biossiacutentese de proteiacutena depende principalmente da disponibilidade de
nitrogecircnio de carbono para formaccedilatildeo do esqueleto carbocircnico e da intensidade
luminosa na qual fornece energia para fixaccedilatildeo do CO2 Nos cultivos utilizando
nitrato bem como nos cultivos utilizando ureacuteia natildeo houve limitaccedilatildeo do crescimento
pela fonte de nitrogecircnio (Item 611) A fonte de carbono tambeacutem natildeo foi limitada
uma vez que o pH foi mantido durante todo o tempo de cultivo com a adiccedilatildeo de CO2
As intensidades luminosas foram altas pertencendo agrave regiatildeo de saturaccedilatildeo luminosa
(Item 611) Logo mesmo dispondo de nitrogecircnio carbono e energia as ceacutelulas natildeo
converteram o nitrogecircnio disponiacutevel em proteiacutenas SAKAMOTO e BRYAN (1999)
observaram que um aumento da intensidade luminosa de 250 mol de foacutetons m-2 s-1
para 1 mmol foacutetons m-2 s-1 no cultivo de Synechococcus sp PCC 6301 natildeo foi
observado um aumento na absorccedilatildeo de nitrato mostranto que a taxa do consumo
de nitrato foi saturado a intensidade luminosa de 250 mol de foacutetons m-2 s-1
Soundarapandian e Vasanthi (2008) observaram que o conteuacutedo de proteiacutena
nas S platensis cultivadas a 3 klux (36 mol de foacutetons m-2 s-1) com ciclos alternados
de 16 horas no claro e 8 horas no escuro pode variar de 5937 (5937μg mg-1 cel)
a 6421 (6421 μg mg-1 cel) dependendo da cepa utilizada Torzillo et al (1991)
observaram um aumento na siacutentese de carboidrato nas ceacutelulas de S platensis
cultivadas ldquooutdoorsrdquo a altas intensidades luminosas e temperatura de 25ordmC O
execesso do carboidrato sintetizado foi parcialmente utilizado a noite para a siacutentese
de proteiacutena Isso pode ter contribuiacutedo a um baixo teor de proteiacutena no presente
trabalho uma vez que os cultivos foram submetidos sempre a altas intensidades
luminosas natildeo obtendo ciclos claroescuro durante o cultivo
A anaacutelise de variacircncia (Tabela 37) indicou que a fonte de nitrogecircnio e de CO2
natildeo influenciaram na variaacutevel dependente teor de proteiacutena enquanto que a
136
intensidade luminosa influenciou como pode-se obversar na anaacutelise de diferenccedila
entre as meacutedias para essa variaacutevel (Tabela 38)
Tabela 37 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de proteiacutena na biomassa final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
5304 1 5304 235 0142
Fonte de Nitrogecircnio
1134 1 1134 050 0487
Intensidade luminosa
4341 2 2170 963 0001
Resiacuteduos 42833 19 2254
total 9268 23
Tabela 38 - Meacutedias do teor de proteiacutena na biomassa final para a variaacutevel
independente intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(mol foacutetons m-2 s-1)
Proteiacutena ()
60 358plusmn43ordf
120 326plusmn50ordf
240 256plusmn51b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
O modelo da biossiacutentese e metabolismo de lipiacutedios em cianobacteacuterias eou
algas satildeo afetados pelos fatores ambientais dentre esses as condiccedilotildees de
iluminaccedilatildeo (BABADZHANOV et al 2004 KHOTIMCHENKO e YAKOVLEVA 2005)
As ceacutelulas de Tichocarpus crinitus satildeo capazes de mudar o conteuacutedo de
armazenamento e estrutural de lipiacutedios e a composiccedilatildeo de aacutecidos graxos Altas
intensidades luminosas estimulam o acuacutemulo de lipiacutedios de armazenamento
(triacilgliceroacuteis) enquanto a baixas intensidades luminosas induzem a um aumento
nos lipiacutedios estruturais (glicolipiacutedios) Isto indica um alto grau de controle de
estrutura nas membranas das algas porque o grau de insaturaccedilatildeo dos aacutecidos
graxos tem sido considerado um dos fatores mais importantes no controle da fluidez
e funcionalidade da membrana celular Adicionalmente as diferenccedilas na
137
composiccedilatildeo dos lipiacutedios nas T crinitus cultivadas a altas e baixas irradiaccedilotildees solar
podem ser consideradas como uma resposta adaptativa das ceacutelulas algais para as
vaacuterias condiccedilotildees de crescimento Portanto a sobrevivecircncia das ceacutelulas nas
mudanccedilas ambientais pode ser atribuiacuteda agrave funcionalidade das membranas onde o
aparato fotossinteacutetico eacute formado (KHOTIMCHENKO e YAKOVLEVA 2005)
Nos cultivos com disponibilidade de nitrogecircnio carbono e altas intensidades
luminosas as ceacutelulas utilizam a energia e o carbono disponiacutevel para crescimento
manutenccedilatildeo celular e formaccedilatildeo de componentes orgacircnicos tais como proteiacutenas
lipiacutedios e carboidratos Como apresentados na Tabela 41 o teor de lipiacutedio aumenta
com a intensidade luminosa Esse efeito foi observado por Solovchenko et al
(2008) nos cultivos da microalga Parietochloris incisa Isto pode ser consequecircncia da
produccedilatildeo excessiva de aacutecidos graxos entre eles triacilgliceroacuteis provavelmente como
um modo de converter o excesso de luz em energia quiacutemica para evitar o dano
fotooxidativo (ASADA 1994 RABBANI et al 1998 MENDOZA et al 1999 NIYOGI
1999) Kaixian et al (1993) observaram um aumento no teor de lipiacutedios com o
aumento da intensidade luminosa nas ceacutelulas de Phaeodactylum tricornutum
Solovchenko et al (2008) relataram que os triacilgliceroacuteis acumuladas em algas
(Parietochloris incisa) sob condiccedilotildees de stress satildeo frequentemente depositadas em
gloacutebulos de lipiacutedios citoplasmaacutetico referidos como corpos oleosos na qual aumentam
em tamanho e nuacutemero sob deficiecircncia na nutriccedilatildeo mineral especialmente na falta de
nitrogecircnio e altas irradiacircncias
Como observado na Tabela 41 os cultivos a 240 mol de foacutetons m-2 s-1
obtiveram maiores teores de lipiacutedios Steiner et al (1970) observaram que as ceacutelulas
de Chromatium cultivadas a baixas intensidades luminosas (100 ftc = 01 klux = 12
mol de foacutetons m-2 s-1) obteve menor teor de fosfolipiacutedios em relaccedilatildeo aos cultivos a
altas intensidades luminosas (7500 ftc = 8 kux = 96mol de foacutetons m-2 s-1) 1 lux =
0929 foot-candles
Na Tabela 39 estatildeo apresentados os valores da anaacutelise de variacircncia dos teores
de lipiacutedios Como se pode observar apenas a intensidade luminosa influenciou nos
valores de lipiacutedios apresentando um valor de niacutevel descritivo menor que 5
Embora o niacutevel de significacircncia da variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio seja
menor que 5 a anaacutelise estatiacutestica diferenccedila entre as meacutedias mostraram essa
variaacutevel natildeo interfere no teor de lipiacutedio apresenta um valor de niacutevel descritivo maior
que 5 (Tabela 40)
138
Tabela 39 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de lipiacutedios na biomassa seca final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
143 1 143 059 0453
Fonte de Nitrogecircnio
1853 1 1853 762 0012
Intensidade luminosa
141 2 71 29 0000
Resiacuteduos 46 19 244
total 207 23
Tabela 40 - Meacutedias do teor de lipiacutedio na biomassa final para a variaacutevel independente
fonte de nitrogecircnio
Fonte de nitrogecircnio Lipiacutedios ()
Nitrato 109 plusmn 310ordf
Ureacuteia 918 plusmn 275a
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um
intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
Tabela 41 - Meacutedias do teor de lipiacutedio na biomassa final para a variaacutevel independente
intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(μmoles m-2 s-1)
Lipiacutedios ()
60 763 plusmn 11a
120 972 plusmn 19a
240 136 plusmn 21b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
A similaridade entre as fontes de nitrogecircnio (Tabela 40) podem ser explicadas
pelo fato de que nos cultivos com ureacuteia a quantidade de ureacuteia adicionada foi
calculada com base nos seus respectivos cultivos com nitrato nas quais foram
139
cultivos natildeo limitados por nitrogecircnio (concentraccedilatildeo de nitrogecircnio superior a 1 g L-1)
Logo isso favoreceu a semelhanccedila entre os teores de lipiacutedios nos cultivos a
diferentes fontes de nitrogecircnio
Os valores de lipiacutedios encontrados variaram de 66 plusmn 09 a 144 plusmn 29
dependendo das condiccedilotildees de cultivo Esses valores estatildeo de acordo com Cogno et
al (2003) e Vonshak (1997) na qual relataram que o conteuacutedo de lipiacutedios da A
platensis em condiccedilotildees fotoautotroacuteficas podem variar de 8 ndash 12 quando cultivadas
em meio sinteacutetico Tokusoglu e Uumlnal (2003) encontraram um teor de lipiacutedio meacutedio
entre trecircs diferentes cepas de Splatensis de 753 natildeo diferindo estatisticamente
entre si
O teor de lipiacutedio foi de 863 plusmn 03 com NaNO3 e 66 plusmn 09 com ureacuteia na
intensidade luminosa de 60 μmoles de foacutetons m-2 s-1 utilizando CO2 de cilindro
Esses valores foram proacuteximos aos teores de lipiacutedios encontrados por Rafiqul et al
(2005) cultivando S platensis (74) e para S fusiformis (82) a 25 klux (30 μmol
de foacutetons m-2 s-1) Oliveira et al (1999) observaram um teor de lipiacutedios de 696 plusmn
086 nas ceacutelulas de S platensis cultivadas em 4 l Virtis fermenter a 180 μmol de
foacutetons mndash2 sndash1
Olguiacuten et al (2001) observaram uma menor concentraccedilatildeo de lipiacutedios nos
cultivos a maior intensidade luminosa em cultivos de S platensis cultivada tanto em
meio sinteacutetico (meio Zarrouk) como em meio complexo (aacutegua do mar do Golf do
Meacutexico suplementado com 2 de efluente anaeroacutebico da criaccedilatildeo de porcos) A
concentraccedilatildeo de nitrogecircnio no meio complexo possui 10 vezes a menos que o meio
sinteacutetico (25 g L-1 NaNO3) O teor de lipiacutedio de 8 encontrado no meio de cultivo
com 25 g L-1 NaNO3 a 66 μmols de foacutetons m-2 s-1 foi proacuteximo ao encontrado no
presente trabalho 66 plusmn 09 no cultivo natildeo limitado por NaNO3 e 60 μmols de foacutetons
m-2 s-1
Nos cultivos a 60 mol de foacutetons m-2 s-1 mostrou maiores valores de lipiacutedios
quando cultivadas com CO2 proveniente de fermentaccedilatildeo alcooacutelica em relaccedilatildeo aos
cultivos utilizando CO2 de cilindro Sob condiccedilotildees autotroacuteficas a produtividade de
lipiacutedios foram menores quando comparadas com o crescimento heterotroacutefico em
culturas de Chlorella vulgareis (LIANG et al 2009) e crescimento heterotroacutefico e
mixotroacutefico nas ceacutelulas de Chlamydomonas reinhardtii (BOYLE MORGAN 2009)
O teor de carboidrato nas ceacutelulas A platensis natildeo diferiram estatisticamente
pela anaacutelise de variacircncia nas diferentes condiccedilotildees estudadas (Tabela 44) obtendo
140
um niacutevel de significacircncia de 0118 0974 e 0562 para as variaacuteveis independentes
fontes de CO2 fonte de nitrogecircnio e intensidades luminosas respectivamente O
teor de carboidrato encontrado variou de 38 a 51 valores considerados altos No
entanto esses valores foram proacuteximos aos valores obtidos por Cantildeizares-Villanueva
et al (1994) que observaram um teor de carboidrato de 42 e 44 em ceacutelulas de S
maxima cultivadas em meio sinteacutetico (Zarrouk) e meio constituiacutedo por resiacuteduo da
criaccedilatildeo de porcos (diluiacutedo a 50) respectivamente sob intensidade luminosa de 3
klux (36 μmol de foacutetons m-2 s-1) O teor de carboidrato neste trabalho foi um pouco
maior que o observado por Cantildeizares-Villanueva et al (1994) provavelmente devido
a diferenccedila de intensidade luminosa pois maiores teores de carboidratos satildeo
obtidos nos cultivos sob maior intensidade luminosa
Olguiacuten et al (2001) obtiveram um alto teor de polissacariacutedeos de 2841 nas
ceacutelulas de S platensis cultivadas em meio complexo quando exposta a intensidade
luminosa de 144 μmol de foacutetons mminus2 sminus1 Esse alto valor poderia ter sido devido a
dois fatores simultacircneos deficiecircncia de nitrogecircnio e alta intensidade luminosa
Desse modo no presente trabalho natildeo houve deficiecircncia de nitrogecircnio nos cultivos
no entanto a aacuterea iluminada no fotobioreator tubular usado no presente trabalho eacute
maior quando comparada com os cultivos em bench raceway utilizados por Olguiacuten et
al (2001) e esse aumento pode ter favorecido a obtenccedilatildeo dos altos teores de
carboidratos
Tomaselli et al (1997) observaram uma reduccedilatildeo no teor de carboidrato nas
ceacutelulas de A maacutexima de 282 mgg-1 (28) para 180 mgg-1 (18) quando a
intensidade luminosa reduziu de 144 μmol de foacutetons mminus2 sminus1 para 25 μmol de foacutetons
mminus2 sminus1 A capacidade dos microganismos fototroacuteficos em estocar na forma de
carboidratos o excesso do carbono fixado durante a aclimataccedilatildeo a altas intensidades
luminosas e mobilizar esse esqueleto carbocircnico para a siacutentese de proteiacutena
representa um requisito importante para a sobrevivecircncia
141
Tabela 42 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de carboidratos na biomassa seca final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
107 1 107 268 0118
Fonte de Nitrogecircnio
004 1 004 000 0974
Intensiade luminosa
48 2 24 059 0562
Resiacuteduos 763 19 40
total 918 23
A partir dos estudos relatados previamente na literatura mostram que o teor de
carboidrato eacute 12 a 16 nas ceacutelulas de Arthrospira platensis cultivadas em meio
sinteacutetico e em condiccedilotildees fotoautotroacuteficas sem condiccedilotildees de stress como alta
salinidade alta intensidade luminosa deficiecircncia em nitrogecircnio (COGNO et al
2003 VONSHAK 1997) Carlozzi e Pinzani (2005) relataram que as ceacutelulas de
Artrospira platensis foram estimuladas para sintetizar carboidratos durante o dia e
estes foram consumidos para permitir a siacutentese de proteiacutenas durante a noite De
acordo com Ma et al (1997) uma menor taxa na siacutentese de proteiacutena eacute observado a
altas irradiaccedilotildees comparando com a siacutentese de carboidrato Isto pode conduzir a
um acuacutemulo de carboidrato nas ceacutelulas sem um concomitante aumento na siacutentese
de proteiacutena Tem sido sugerido que o carbono a partir dos poliacutemeros de carboidratos
estocados pode ser transferido para formaccedilatildeo de proteiacutenas durante a noite (Ma et
al 1997) No entanto como no presente trabalho natildeo houve fotoperiacuteodo de fase
claroescuro propiciou a um acuacutemulo de carboidrato nas ceacutelulas e a reduziu a
concentraccedilatildeo de proteiacutenas Adicionalmente Torzillo et al (1991) relataram que as
ceacutelulas de Spirulina expostas a altas irradiacircncais direcionam a biomassa a sintetizar
carboidratos na qual pode ser usado como um reservatoacuterio do poder redutor e a
uma reduccedilatildeo na siacutentese de proteiacutenas
Como podemos observar na anaacutelise de variacircncia (Tabela 43) o teor de cinzas
natildeo foi influenciado pelas variaacuteveis estudadas atingindo valores que variaram de
428 plusmn 004 a 583 plusmn 002 Esses valores estatildeo de acordo com os valores obtidos
por Miao (2005) que obtiveram um teor de cinzas de 636 plusmn 005 em cultivos
autotroacuteficos e 593 plusmn 004 em cultivos heterotroacuteficos de Chlorella protothecoides
Similarmente Tokusoglu e Uumlnal (2003) observaram um conteuacutedo de cinzas em trecircs
142
diferentes cepas de Spirulina denominada de 1 2 e 3 foram de 743 751 and
1038 respectivamente A microalga marinha Isochrisis obteve o maior conteuacutedo
de cinzas (1608)
Tabela 43 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de cinzas na biomassa seca final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
068 1 069 18 0192
Fonte de Nitrogecircnio
058 1 058 152 0232
Intensiade luminosa
112 2 056 147 0255
Resiacuteduos 723 19 038
total 962 23
Jimeacutenez et al (2003) encontraram um alto teor de cinzas no cultivo de S
platensis aproximadamente 20 (valores tiacutepicos satildeo de 5ndash7) esse alto valor pode
ser explicado pelo fato de que a alga obtida a partir do filtro foi introduzida
diretamente spray drier sem passar pelo processo de lavagem Como o meio de
crescimento eacute altamente enriquecido com bicarbonato a lavagem eacute necessaacuteria para
eliminaacute-los Esse processo normalmente reduz o conteuacutedo de cinzas
No presente trabalho a composiccedilatildeo do meio de cultura foi mantido em todas as
condiccedilotildees experimentais com modificaccedilatildeo apenas da fonte de nitrogecircnio de nitrato
de soacutedio para ureacuteia em alguns experimentos Adicionalmente a biomassa passou
por um processo de lavagem antes da etapa de secagem que removeu os sais
adsorvidos nas ceacutelulas Portanto isso favoreceu a manutenccedilatildeo no teor de cinzas na
biomassa seca Canizares et al (2004) obtiveram elevados teores de cinzas (14)
na biomassa de Spirulina maacutexima utilizando 50 de efluente suiacuteno no meio de
cultura Isso foi atribuiacutedo ao elevado quantidade de partiacuteculas minerais presente no
meio
143
66 Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros bioenergeacuteticos
Foram avaliados os paracircmetros bioenergeacuteticos da A platensis durante os
cultivos avaliando os andamentos em funccedilatildeo do tempo dos paracircmetros energia de
Gibbs dissipada para o crescimento e manutenccedilatildeo celular (1YGX) das produccedilotildees
molares de O2 consumo de H+ e nuacutemero de foacutetons para sustentar o crescimento
fotoautotroacutefico Foi avaliada a eficiecircncia da fotossiacutentese em A platensis calculando-
se a energia molar de Gibbs absorvida da luz para produzir um C-mol de biomassa
a partir do correspondente nuacutemero de Einsteins absorvidos e da energia meacutedia
molar dos foacutetons
A energia de Gibbs dissipada por unidade da biomassa (1YGX kJ por C-mol X)
foi calculada pela Equaccedilatildeo 6 como descrita no item 45 A equaccedilatildeo mostra que na
dissipaccedilatildeo da energia de Gibbs estatildeo inclusos tanto a manutenccedilatildeo como o
crescimento celular A energia de Gibbs eacute utilizada tambeacutem para a manutenccedilatildeo das
funccedilotildees celulares como reposiccedilatildeo dos gradientes que faltam degradaccedilatildeo proteiacutenas
Esta energia de Gibbs eacute produzida pelo catabolismo de certas quantidades de
doadores de eleacutetrons (substratos)
No Graacutefico 26 ilustra o comportamento da dissipaccedilatildeo da energia de Gibbs para
o crescimento e manutenccedilatildeo celular 1YGX em relaccedilatildeo ao tempo Como regra geral
esse paracircmetro bioenergeacutetico aumentou com o tempo em todas as condiccedilotildees
testadas como resultado do crescente niacutevel de biomassa que foi responsaacutevel por
diminuir a velocidade especiacutefica de crescimento Um aumento na intensidade
luminosa ateacute 120 mol de foacutetons m-2 s-1 favoreceu o crescimento de ceacutelulas por
causa de fotolimitaccedilatildeo com isso as exigecircncias de energia aumentaram
notavelmente no periacuteodo de tempo mais curto Por outro lado nenhum (ureacuteia) ou
muito pouco (nitrato) aumento de 1YGX foram observados na faixa da intensidade
luminosa de 120-240 mol de foacutetons m-2 s-1 por causa da obtenccedilatildeo das condiccedilotildees
de saturaccedilatildeo de luz Esse comportamento tambeacutem eacute consistente com os menores
valores de 1YGX previamente observados em tanques abertos (TORRE et al 2003)
o que permitiu um menor crescimento devido ao efeito de sombreamento (DANESI
et al 2004)
144
Graacutefico 26 Energia de Gibbs de dissipaccedilatildeo durante o cultivo de A platensis
intensidade luminosa (μmol m-2 s-1) () 60 ( ) 120 () 240 Fonte de
nitrogecircnio nitrato (siacutembolo aberto) ureacuteia (siacutembolo fechado)
Com os dados da composiccedilatildeo elementar da biomassa seca obtida no final de
cada experimento foram calculados os coeficientes atocircmicos para os elementos C
N H O S principais elementos que constituem a composiccedilatildeo elementar da
biomassa Determinado o coeficiente atocircmico dos elementos C H O N S (descrito
no item 4653) e conhecendo-se os graus de reduccedilatildeo desses elementos (C = 4 H
=1 O = -2 S = 6 N-NH4+ = -3 ou N-NO3
- = 5) de acordo com os iacuteons nas quais satildeo
inseridos na biomassa (HCO3- H2O H+ O2 NH4
+ e SO4-2) foi possiacutevel calcular o
grau de reduccedilatildeo da biomassa (descrito no item 4654 Tabela 44) bem como os
coeficientes estequiomeacutetricos para balanccedilos de carbono nitrogecircnio oxigecircnio
enxofre carga iocircnica e poder de reduccedilatildeo para a produccedilatildeo fotoautotroacutefica de 1 mol
de carbono (C-mol) de biomassa seca usando NaNO3 e ureacuteia como fonte de
nitrogecircnio de acordo com Heijnen (2001) em cada condiccedilatildeo estudada de acordo
com a aplicaccedilatildeo do princiacutepio de conservaccedilatildeo
O crescimento autotroacutefico pode ser representado por uma equaccedilatildeo de
balanccedilo de massa global onde as fontes de nitrogecircnio (NO3- ou NH4
+) e carbono
(HCO3-) H2O e H+ estatildeo envolvidas para a formaccedilatildeo de 1 C-mol de biomassa
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
0 2 4 6 8 10 12
1Y
GX (
kJ
C-m
ol
DM
-1)
Tempo (dias)
145
a HCO3- + b NO3
- (or NH4+) + c H2O + d O2 + e H+ + f SO4
-2 +
CH1650O0531N0170S00007 = 0 (11)
Para esse propoacutesito foi usada a composiccedilatildeo elementar descrita por Cornet et
al (1992) (Equaccedilatildeo 11) ou a composiccedilatildeo elementar determinada
experimentalmente como descrita no item Materiais e meacutetodos
Os coeficientes estequiomeacutetricos foram estimados atraveacutes dos balanccedilos de
materiais de carbono nitrogecircnio oxigecircnio enxofre carga e grau de reduccedilatildeo da
biomassa usados para a formaccedilatildeo da biomassa Os principais iacuteons envolvidos na
formaccedilatildeo da biomassa e seus respectivos coeficientes estequiomeacutetricos estatildeo
descritos na Tabela 44
Como pode ser observado o grau de reduccedilatildeo da biomassa (γX) calculado no
modelo da composiccedilatildeo da biomassa determinado experimentalmente neste trabalho foi
sempre um pouco maior com o nitrato (489 ndash 519) do que com ureacuteia (399 ndash 432)
como esperado pelo maior nuacutemero de oxidaccedilatildeo do nitrato (HEIJNEN 2001)
Tabela 44 - Coeficientes estequiomeacutetricos estimados atraveacutes dos balanccedilos de materiais de
carbono nitrogecircnio oxigecircnio enxofre carga e grau de reduccedilatildeo da biomassa cultivada em
fotobiorreator tubular horizontal utilizando nitrato ou ureacuteia como fontes de nitrogecircnio
HCO3- NO3
- NH4+ H2O O2 H+ SO4
-2 Biomassa
Δgf‟i
(kJ mol-1) -5872 -1114 -794 -2373 0 -399 -7446 -670
Coeficiente estequiomeacutetrico (mol C-molDM-1)
testes Ia a b b C d e f γX b
1 c 60 -1 -020 - 020 145 -120 - 58
1 d 60 -1 -011 - 032 130 -111 000 519
2 d 60 -1 - -007 024 100 -093 000 399
3 d 120 -1 -011 - 023 122 -111 000 489
4 d 120 -1 - -008 042 103 -092 000 411
5 d 240 -1 -010 - 023 127 -110 000 509
6 d 240 -1 - -008 034 108 -092 000 432 a Intensidade luminosa (μmol m
-2 s
-1)
b Grau de reduccedilao da biomassa
c Composiccedilatildeo elementar da biomassa descrita por Cornet et al (1992)
d Composiccedilatildeo elementar da biomassa determinada experimentalmente
146
Estimando os coeficientes estequiomeacutetricos da reaccedilatildeo 11 e conhecendo a
energia de Gibbs de formaccedilatildeo de produtos e reagentes (Tabela 44) (HEIJNEN
2001) eacute possiacutevel calcular o numero de moles de foacutetons (Einsteins) para sustentar o
crescimento autotroacutefico de 1 C-mol de biomassa (nPh) pela Equaccedilatildeo 8 (item 45)
Embora os valores reais de Δgfi deveriam ter sido utilizados para este caacutelculo
foram utilizados os valores das condiccedilotildees bioloacutegicas padratildeo Torre et al (2003)
demostraram que as diferenccedilas entre a energia de Gibbs de formaccedilatildeo nas
condiccedilotildees reais de cultivo natildeo diferem entre si ou diferem natildeo mais que 3 apartir
de seus respectivos valores estimados com base nas condiccedilotildees bioloacutegicas padratildeo
(T = 2984K C = 10M pH = 70) Por isso foram utilizados os valores de energia de
Gibbs nas condiccedilotildees bioloacutegicas padratildeo
No entanto para o iacuteon H+ a energia de Gibbs de formaccedilatildeo (ΔgfH+) eacute por
definiccedilatildeo uma funccedilatildeo da cultura do pH Assim esse paracircmetro foi recalculado para
as condiccedilotildees reais da equaccedilatildeo de Gibbs
7
pH
ff10
10ln
HH
RTgg (Equaccedilatildeo 12)
Durante as reaccedilotildees luminosas da fotossiacutentese a energia livre carregada
pelos foacutetons eacute capturada por pigmentos (por exemplo a clorofila) organizadas em
grandes complexos de proteiacutenas chamado de centros de reaccedilatildeo A energia de um
foacuteton provoca excitaccedilatildeo eletrocircnica elevando um eleacutetron para um niacutevel maior de
energia exatamente igual agrave energia do foacuteton (hν) Satildeo exigidos um miacutenio de 8 foacutetons
para transferir 4 eleacutetrons de 2 moleacuteculas de H2O para reduzir a 2 moleacuteculas de
NADPH2 de acordo com a equaccedilatildeo
2 H2O + 8 hν +2 NADP+ rarr 2 NADPH + O2 + 2H+ (Reaccedilatildeo 12)
Subsequentemente os eleacutetrons satildeo transferidos do NADPH para o CO2
atraveacutes do ciclo de Calvin para produzir os constituintes da biomassa (RAVEN et al
2000)
Como mostrado na Graacutefico 27 a diminuiccedilatildeo progressiva da velocidade
especiacutefica de crescimento () ao longo do cultivo provocou um aumento (em valor
absoluto) no nuacutemero de Einsteins absorvido para produzir 1 C-mol de biomassa
147
(nPh) Nos maiores valores de quase atingiu o valor teoacuterico de nPh relatado por
Richmond (1983) para sustentar o crescimento sob condiccedilotildees ideais que eacute de 8
Einsteins por C-mol de biomassa
Como jaacute foi observado em trabalho anterior (TORRE et al 2003) a exigecircncia
de energia adicional em relaccedilatildeo agrave situaccedilatildeo ideal de 8 Einsteins C-mol DM-1 foi
insignificante no iniacutecio dos cultivos (alta velocidade especiacutefica de crescimento) e em
seguida aumentou consideravelmente durante a fase estacionaacuteria de cada
experimento sugerindo que em condiccedilotildees provavelmente limitada pelo
sombreamento a biomassa usa a energia preferencialmente para a manutenccedilatildeo
do que para o crescimento Em condiccedilotildees de limitaccedilatildeo de luz (no iniacutecio) ou de
sombreamento (na fase estacionaacuteria) um aumento progressivo da intensidade de
luz natildeo excedeu qualquer influecircncia significativa sobre este paracircmetro
Graacutefico 27 Influecircncia da velocidade especiacutefica de crescimento da A platensis sobre
o nuacutemero de moles de foacutetons absorvido para produzir 1 C-mol de biomassa em
diferentes condiccedilotildees de cultivo () Composiccedilatildeo elementar da biomass descrita por
Cornet et al (1992) PPFD = 60 μmol de foacutetons m-2 s-1 Composiccedilatildeo elementar da
biomass determinada experimentalmente PPFD (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60
() 120 () 240 Fonte de nitrogecircnio nitrato (siacutembolos abertos) ureacuteia
(siacutembolos fechados)
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
000 010 020 030 040 050 060 070 080
nP
h (
Ein
stei
n C
-mol
DM
-1)
(dias -1)
148
Como mostrado no Graacutefico 27 as culturas com nitrato necessitam de maiores
valores de nPh para sustentar o crescimento autotroacutefico em relaccedilatildeo agraves culturas
utilizando ureacuteia Como as concentraccedilotildees celulares dos cultivos utilizando nitrato ou
ureacuteia foram semelhante em todas as intensidades luminosas (Item 61) a exigecircncia
adicional foacuteton nos cultivos com nitrato foi provavelmente utilizado para reduzir o
nitrato a amocircnio (HATORI MYERS 1966) que eacute a forma preferencial de nitrogecircnio
assimilado pela A platensis (BOUSSIBA et al 1984) Este efeito tambeacutem foi
observada por Torre et al (2003) em tanques abertos
Finalmente pode ser observado na mesma figura que o uso do modelo
bioenergeacutetico acima com os coeficientes relatados por Cornet et al (1992) para a
composiccedilatildeo da biomassa de A platensis (CHNOS) levou a resultados praticamente
coincidentes com aqueles obtidos utilizando as experimentais determinadas neste
trabalho Essa constataccedilatildeo demonstra que a composiccedilatildeo da biomassa tem um
impacto pouco significativo sobre os resultados de tal modelo bioenergeacutetico logo
poderia simplesmente ser usado como um instrumento geral assumindo os dados da
literatura sem a necessidade de qualquer determinaccedilatildeo da biomassa
No Graacutefico 28 mostra os comportamentos da produccedilatildeo molar de O2 e do
consumo de H+ durante os cultivos nas diferentes intensidades luminosas Essas
tendecircncias demonstram que as diferentes atividades de consumo e produccedilatildeo
seguem fielmente o crescimento celular O aumento progressivo desses paracircmetros
com a intensidade luminosa confirma que esta foi o fator limitante ao crescimento
nunca atingindo as condiccedilotildees de inibiccedilatildeo da luz Como esperado este
comportamento foi qualitativamente semelhante nas culturas utilizando nitrato como
fonte de nitrogecircnio
149
Graacutefico 28 Produccedilatildeo molar de O2 (siacutembolo fechado) e consumo de H+ (siacutembolo
aberto) em funccedilatildeo do tempo em diferentes condiccedilotildees de cultivo Intensidades
luminosas (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 () 120 () 240 Fonte de
nitrogecircnio nitrato (linha rachurada) ureacuteia (linha contiacutenua)
Como eacute conhecido a energia do fluxo de eleacutetrons entre o FSII e NADPH
direciona proacutetons atraveacutes da membrana plasmaacutetica criando uma forccedila motriz de
proacutetons que fornece energia para a siacutentese de ATP pela ATP sintase (LEHNINGER
2004) Portanto assumiu-se que uma parte da energia molar de Gibbs absorvida
pelos dois fotossistemas foi usada para converter ADP em ATP Como mostrado no
Graacutefico 29 os maiores valores de ΔGa e ΔGATP foram obtidos no final do cultivo
devido a condiccedilotildees ambientais desfavoraacuteveis como a falta de nutrientes ou
liberaccedilatildeo de metaboacutelitos celulares No que se refere agrave intensidade luminosa os
maiores valores de ΔGa e ΔGATP foram observados nas culturas a intensidades
luminosas iguais e maiores que 120 μmol de foacutetons m-2 s-1 que garantiu a maior
concentraccedilatildeo de ceacutelulas (Item 61) Os valores de ΔGa e ΔGATP natildeo aumentaram no
caso dos cultivos utilizando ureacuteia ou aumentou muito pouco no caso dos cultivos
utilizando nitrato na faixa de intensidade luminosa de 120 - 240 μmol de foacutetons m-2
s-1 devido agraves condiccedilotildees de saturaccedilatildeo de luz como mencionado anteriormente
-015
-010
-005
000
005
010
015
020
0 2 4 6 8 10 12
q (
mo
lL
)
Tempo (dias)
150
Graacutefico 29 Energia total de Gibbs absorvida pelo aparato fotossinteacutetico (siacutembolo
fechado) (ΔGa) e energia transformada em ATP (siacutembolo aberto) (ΔGATP) durante o
cultivo da A platensis intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 (
) 120 () 240 Fonte de nitrogecircnio nitrato (linha tracejada) ureacuteia (linha
continua)
No Graacutefico 30 mostra os resultados da energia fixada pela fotossiacutentese (ΔH)
e a liberada como calor (Q) a diferentes condiccedilotildees de intensidades luminosas e
fontes de nitrogecircnio Pode ser visto que no final de cultivos tanto ΔH como Q
aumentaram com a intensidade luminosa Como eacute bem conhecido sob condiccedilotildees de
excesso de luz parte da energia absorvida eacute dissipada termicamente atraveacutes de um
mecanismo natildeo fotoquiacutemico (Non-Photochemical Quenching) (MOZZO et al 2008)
e uma quantidade significativa de energia livre eacute perdida como calor durante as
reaccedilotildees bioquiacutemicas entre a absorccedilatildeo luz e a formaccedilatildeo carboidratos (HAUSKA
ARNALD 2000) Esse resultado foi atribuiacutedo a um mecanismo fisioloacutegico para
proteger o aparelho fotossinteacutetico contra fotodestruiccedilatildeo (KARAPETYAN 2008
HEBER et al 2006) cuja funccedilatildeo eacute desempenhada pelos complexos antena do
aparato fotossinteacutetico que muda forma de captaccedilatildeo de luz para uma forma de
dissipaccedilatildeo teacutermica eficiente (MOZZO et al 2008)
-10000
-8000
-6000
-4000
-2000
0
2000
0 2 4 6 8 10 12
G
AT
P (
kJ
C-m
ol
DM
-1)
Tempo (dias)
151
Graacutefico 30 Energia fixada pelo aparato fotossinteacutetico (siacutembolo fechado) (ΔH) e
energia liberada como calor (siacutembolo aberto) (Q) durante o cultivo de A platensis
intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 ( ) 120 () 240
Fonte de nitrogecircnio nitrato (linha rachurada) ureacuteia (linha contiacutenua)
Como era esperado pelo fato de que tanto a siacutentese de ATP como a formaccedilatildeo
de NADPH satildeo resultantes do mesmo complexo fotossinteacutetico o comportamento do
ΔH foi bastante semelhante ao observado para o ΔGATP
No Graacutefico 31 mostra a distribuiccedilatildeo percentual da energia luminosa absorvida
em funccedilatildeo do tempo nos cultivos a 60 μmol de foacutetons mndash2 sndash1 escolhidos como
exemplo Resultados qualitativamente semelhantes foram observados nos cultivos a
maiores intensidades luminosos (dados natildeo mostrados) Os cultivos com ureacuteia
apresentaram maiores valores de ηATP e ηF e menores valores de ηQ quando
comparado aos cultivos usando nitrato Isso pode ser explicado pelo fato de um
maior requerimento energeacutetico para a reduccedilatildeo de nitrato de amocircnia Aleacutem disso em
todos os experimentos a fraccedilatildeo de energia armazenada como ATP (ηATP) e a fixada
pelos sistemas (ηF) diminuiram ao longo do tempo enquanto que o liberado em
forma de calor (ηQ) aumentou
-2000
0
2000
4000
6000
8000
0 2 4 6 8 10
-H
Q
(k
J C
-mo
l D
M -1
)
Tempo (dias)
152
Graacutefico 31 Porcentagem na distribuiccedilatildeo da energia luminosa absorvida durante o
cultivo de A platensis usando nitrato (siacutembolo fechado) e ureacuteia (siacutembolo aberto)
como fonte de nitrogecircnio Energia fixada pelos fotossistemas () energia
transformada em ATP () energia liberada como calor ( )
Os maiores valores ηATP e ηF foram por volta de 12 e 23-27 nas culturas
com nitrato e 15 e 31-34 em culturas com ureacuteia respectivamente Nos cultivos a
maiores intensidades luminosas (120 e 240 μmol de foacutetons mndash2 sndash1) os valores de ηF
diminuem mais acentuadamente que os cultivos a 60 μmol de foacutetons mndash2 sndash1 devido
agrave maior concentraccedilatildeo de ceacutelulas (item 61) que reduziu a disponibilidade de luz para
a ceacutelula (efeito de sombreamento) A disponibilidade de nutrientes eacute outro importante
fator ambiental influenciando a composiccedilatildeo do aparato fotossinteacutetico de
cianobacteacuterias Murakami et al (1997) tecircm mostrado que as respostas ao CO2 Na+
e estresse pela luz em Synechocystis sp provocam alteraccedilotildees no estado redox de
componentes entre os sistemas de transporte de eleacutetrons Da mesma forma a
diminuiccedilatildeo na disponibilidade de alguns nutrientes no final do cultivo de A platensis
pode ter contribuiacutedo para diminuir os valores de ηF Como esperado ηQ mostraram
um comportamento oposto aumentando progressivamente a partir dos valores
miacutenimos (60-66 com nitrato e 49-54 com ureacuteia) no iniacutecio do cultivo e cerca de
90 no final Isto significa que no final do cultivo da maior parte da energia
absorvida foi liberada como calor
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2 4 6 8 10 12
h (
)
Tempo (dias)
153
67 Comparaccedilatildeo entre os fotobiorreatores de diferentes configuraccedilotildees
Apoacutes a escolha da melhor condiccedilatildeo do cultivo de A platensis em
fotobiorreator tubular horizontal utilizando CO2 de cilindro foram realizados
experimentos nas mesmas condiccedilotildees em fotobiorreator tubular espiralado para
avaliar o comportamento celular em duas diferentes configuraccedilotildees de
fotobiorreatores tubulares Luo et al (2003) tem mostrado que a configuraccedilatildeo de
cada reator eacute um dos principais fatores que controlam a produtividade do cultivo
fotossinteacutetico Por isso foram comparadas as curvas de crescimento A platensis
duas diferentes configuraccedilotildees dos fotobiorreatores tubulares uma horizonal (Figura
7) e outra espiralada (Figura 8)
Como observado no Graacutefico 32 os crescimentos celulares da A platensis nos
diferentes fotobiorreatores foram semelhantes obtendo valores de concentraccedilotildees
celulares diaacuterias proacuteximas Isso pode ser explicado pela semelhanccedila nas condiccedilotildees
fiacutesicas entre os fotobiorreatores tais como diacircmetro interno do tubo velocidade de
escoamento do liacutequido bem como as condiccedilotildees de cultivos como a intensidade
luminosa temperatura meio de cultivo que foram mantidas as mais semelhantes
possiacuteveis
Graacutefico 32 Concentraccedilatildeo celular nas duas diferentes configuraccedilotildees dos
fotobiorreatores tubulares ( ) horizontal e ( loz ) espiralado
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
Tempo (dias)
X (
mg
L-1)
154
7 Conclusotildees
Os paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) e produtividade em ceacutelulas
(Px) foram influenciados pela variaacutevel independente intensidade luminosa (I)
obtendo maiores valores quando submetidos a maiores intensidades luminosas Por
outro lado a variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio (N) natildeo influenciou nesses
paracircmetros mostrando a viabilidade na substituiccedilatildeo do nitrato pela ureacuteia nos cultivos
de Artrhospira platensis
A variaacutevel independente intensidade luminosa natildeo influenciou no paracircmetro
fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) No entanto para variaacutevel
independente fonte de nitrogecircnio os cultivos utilizando ureacuteia apresentaram maiores
valores de YXN quando comparados aos cultivos com nitrato As diferentes fontes de
CO2 natildeo influenciaram nos paracircmetros analisados Xm Px e YXN Logo o CO2
juntamente com os volaacuteteis orgacircnicos liberados durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica
pode ser utilizado para o cultivo da A plantesis sem interferir no crescimento celular
Na composiccedilatildeo centesimal da biomassa pode-se observar que intensidade
luminosa influenciou nos teores de clorofila proteiacutenas e lipiacutedios obtendo maiores
valores de clorofila e proteiacutena nos cultivos a baixa intensidade luminosa enquanto
que nessas condiccedilotildees foram obtidos menores teores de lipiacutedios A fonte de
nitrogecircnio influenciou apenas no teor de clorofila obtendo maiores valores utilizando
nitrato como fonte de nitrogecircnio A fonte de CO2 natildeo influenciou na composiccedilatildeo da
biomassa Nenhuma das variaacuteveis independentes estudadas influenciou nos teores
de cinzas e carboidratos na biomassa final
Os resultados tambeacutem indicaram que todas as variaacuteveis independentes tiveram
uma certa influecircncia nos paracircmetros de bioenergeacutetica A dissipaccedilatildeo de energia de
Gibbs aumento com o tempo em todas as condiccedilotildees analisadas obtendo os maiores
valores em tempos mais curtos nos cultivos a 120-240 μmol de foacutetons m-2 s-1
independentemente da fonte de nitrogecircnio selecionado O nuacutemero de moles de
foacutetons absorvidos pelas ceacutelulas para produzir um C-mol de biomassa foi maior nas
culturas com nitrato independentemente da intensidade luminosa Os maiores
valores de produccedilatildeo molar de O2 e do consumo de H+ foram obtidos com os valores
mais elevados de intensidade luminosa utilizando nitrato As fraccedilotildees da energia
direcionada para a siacutentese de ATP fixada pela ceacutelula foram superiores em culturas
com ureacuteia quando comparadas com as culturas com nitrato que se revelou uma
fonte de nitrogecircnio capaz de sustentar o crescimento energicamente da A platensis
155
As diferentes configuraccedilotildees dos fotobiorreatores tubulares natildeo influenciaram
nas concentraccedilotildees celulares indicando que o formato do tubo que forma o
fotobiorreator seja horizontal ou espiralado natildeo interferem no crescimento da A
platensis
Com isso pode-se concluir que a intensidade luminosa eacute uma importante
variaacutevel que influencia nos paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima produtividade
celular fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas bioenergeacuteticos e na
composiccedilatildeo quiacutemica da A platensis e que o emprego do CO2 proveniente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica juntamente com a ureacuteia como fonte de nitrogecircnio pode ser
uma alternativa viaacutevel para o cultivo de A platensis em escala industrial
proporcionando uma reduccedilatildeo no custo de produccedilatildeo
156
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178
ANEXOS
Artigos publicados submetidos e em fase de redaccedilatildeo para perioacutedicos internacionais
ANEXO 1 - BEZERRA RP MONTOYA EYO SATO S PEREGO P
CARVALHO JCM CONVERTI A Effects of light intensity and dilution rate on the
semicontinuous cultivation of Arthrospira (Spirulina) platensis A kinetic Monod-type
approach Bioresource Technology 102 p3215 - 3219 2011
ANEXO 2 - BEZERRA RP MATSUDO MC SATO S CONVERTI A
CARVALHO JCM Effects of photobioreactor configuration nitrogen source and
light intensity on the fed-batch cultivation of Arthrospira (Spirulina) platensis
Bioenergetic aspects Biomass and Bioenergy
ANEXO 3 - BEZERRA RP MATSUDO MC SATO S CONVERTI A
CARVALHO JCM Carbon dioxide from alcoholic fermentation as a carbon source
for the fed-batch cultivation of Arthrospira platensis Biomass and Bioenergy
BEZERRA RP MATSUDO MC SATO S CONVERTI A CARVALHO JCM
Chemical composition of the A platensis biomass cultivated on CO2 from alcoholic
fermentation Em fase de Redaccedilatildeo
179
ANEXOS
180
Anexo 1
181
182
183
184
185
Anexo 2
Effects of photobioreactor configuration nitrogen source and light intensity
on the fed-batch cultivation of Arthrospira (Spirulina) platensis
Bioenergetic aspects
Raquel Pedrosa Bezerraab
Marcelo Chuei Matsudoa Sunao Sato
a Patrizia Perego
b Attilio
Convertibc
Joatildeo Carlos Monteiro de Carvalhoa
a Department of Biochemical and Pharmaceutical Technology Faculty of Pharmaceutical
Sciences University of Satildeo Paulo Av Prof Lineu Prestes 580 Bl 16 05508-900 Satildeo Paulo-
SP Brazil
b Department of Chemical and Process Engineering ldquoGB Boninordquo University of Genoa via
Opera Pia 15 16145 Genoa Italy
c CAPES Fellowship holder Brazil
_________
Author for correspondence phone +55-11-30913695 fax +55-11-38156386
E-mail jcmdcarvuspbr
186
ABSTRACT
The bioenergetics of the photoautotrophic growth of the cyanobacterium Arthrospira
(Spirulina) platensis was investigated in different bioreactor configurations (tubular
photobioreactor and open ponds) using different nitrogen sources (nitrate and urea) and under
different light intensity conditions Although an increase in the light intensity increased the
Gibbs energy dissipated for cell growth and maintenance in both nitrogen sources it did not
exert any appreciable influence on the moles of photons absorbed by the system to produce
one C-mol biomass On the other hand both bioenergetic parameters were higher in cultures
with nitrate than with urea likely because of the higher energy requirements needed to reduce
the former nitrogen source to ammonia They appreciably increased also when open ponds
were substituted by the tubular photobioreactor where a more efficient light distribution
ensured a remarkably higher cell mass concentration The estimated percentages of the energy
absorbed by the cell showed that compared with nitrate the use of urea as nitrogen source
allowed the system to address higher energy fractions to ATP production and light fixation by
the photosynthetic apparatus as well as a lower fraction released as heat Thanks to this better
bioenergetic situation urea appears to be a quite promising low-cost alternative nitrogen
source for A platensis cultures in photobioreactors
Keywords Arthrospira (Spirulina) platensis bioenergetics nitrogen source light intensity
bioreactor configuration
187
1 Introduction
The production of the cyanobacterium Arthrospira platensis is increasing due to its high
content of highly-valuable proteins fundamental amino acids vitamins β-carotene and other
pigments mineral substances essential fatty acids and polysaccharides which find
application in several industrial productions like those of health foods and therapeutics [1]
Environmental factors such as light intensity and nitrogen source are well known to
influence the growth of photosynthetic microorganism In the absence of any other limiting
factor cell concentration increases with light intensity until reaching maximum biomass
concentration that is denominated ldquosaturation levelrdquo Light intensities higher than the
saturation level provoke damage of cell photosynthetic apparatus due to a phenomenon called
ldquophotooxidationrdquo or ldquophotoinhibitionrdquo
The nitrogen source is an additional environmental factor influencing cell growth
because this element is mainly used to form proteins and nucleic acids Alternative sources of
nitrogen such as urea [23] and ammonium salts [4] have been investigated in substitution of
nitrate to reduce the cost of large-scale A platensis cultivation
Also the reactor configuration can impact on cell growth Appropriately-designed
photobioreactors can in fact reduce the cultivation area by a vertical distribution of the
photosynthetic organism and enlarge the surface exposed to light thus increasing cell
concentration Tubular reactors allow for better light distribution and then higher
photosynthetic efficiency with respect to the conventional mini-ponds [56] where the cells
are subject to full light radiation at the surface and darkness at the bottom [7]
Only a few studies emphasized the bioenergetic aspects of the growth of
photosynthetic microorganisms based on Gibbs energy balances The Gibbs energy
dissipation per C-mol of biomass can be regarded as a simple thermodynamic measure of the
amount of biochemical work required to convert the carbon source into biomass by the
proper irreversible carbon-carbon coupling and oxidationreduction reactions [8] Up to now
188
the bioenergetics of the cyanobacterium A platensis were uninvestigated either in bench-scale
open ponds using urea and KNO3 as nitrogen sources [910] or in rectangular vessel under
different light intensities [11] To shed further light on these aspects in this study we
investigated the bioenergetics of this cyanobacterium when cultivated in tubular
photobioreactor under different light intensities and using different nitrogen sources and
compared these results with those previously obtained in open ponds [9]
2 Material and methods
21 Photobioreactors and culture conditions
Arthrospira (Spirulina) platensis UTEX 1926 was cultivated either in open ponds [9] on the
medium of Paoletti et al [12] or in tubular photobioreactor [13] on the medium of Schloumlsser
[14] both containing nitrate as nitrogen source The initial cell concentration and pH were set
at 400 mg l-1
[15] and 95 [1617] respectively
Open ponds cultivations were carried out elsewhere in the same medium of Paoletti et
al [12] at photosynthetic photon flux density (PPFD) of 72 μmol photons mndash2
sndash1
25 ordmC [9]
On the other hand for tubular photobioreactor cultivations we used the medium of Schloumlsser
[14] as well as medium in which NaNO3 was substituted by urea These runs were carried out
at 60 le PPFD le 240 μmol photons mndash2
sndash1
29 ordmC and the pH was controlled at 95 plusmn 02 by
pure CO2 addition Since the operating conditions at the lowest PPFD values were very
similar any difference in the kinetics and bioenergetics was ascribed to the different
bioreactor configurations The amount of urea to be daily added was estimated by an equation
describing the experimental growth curve obtained under non-limited conditions with NaNO3
as nitrogen source as previously described [13] Under these conditions the bioenergetics of
the system was investigated comparing the different nitrogen sources
189
22 Analytical determinations
The cell concentration of A platensis was determined by measuring the optical density of
cultures at 560 nm using a spectrophotometer model 600 PLUS (FEMTO Satildeo Paulo Brazil)
The optical density data were converted to cell dry weight by a calibration curve The
elemental composition of biomass obtained at the end of each run was determined by an
elemental analyzer Flash EA1112 series (CE Instruments Wigan UK)
Light intensity at the culture surface was measured using a quantum sensor model LI-
190 SB (Li-Cor Inc Lincoln NE USA) connected to a quantumradiometerphotometer
model LI-189 B
23 Theory
The Gibbs energy dissipation for cell growth and maintenance (1YGX) was estimated
according to Heijnen [18] by the equation (1)
G
GXGX
m
YY
max
11
(1)
in which max
GXY is the maximum biomass yield on Gibbs energy that corresponds to 986 C-
molX kJ-1
in photoautotrophic cultivation with CO2 as a carbon source [18]
In this equation the specific growth rate μ was defined according to Leduy and Zajic
[19] as
190
1
ln1
i
i
X
X
t
(2)
where Xi and Xi-1 are the biomass concentrations at the end and the beginning of the time
interval elapsing between two consecutive measurements (Δt = 1 day) while mG is the
biomass specific rate of Gibbs energy dissipation for maintenance corresponding to 45 and
712 kJ C-molX-1
h-1
at 25 and 29 degC respectively [18]
To estimate the moles of photons (Einsteins) to sustain the autotrophic growth nPh it
was necessary to resort to the Gibbs energy balance taking into account the energy
contributions for the growth 1YGX and the absorption of 1 Einstein of photons ΔgPh in
addition to those of formation of substrates and products Δgfi as described by the equation
ΔgfHCO3- +ΔgfN + ΔgfH2O + ΔgfO2
+ ΔgfH+ + ΔgfX + 1YGX + nPh ΔgPh = 0
(3)
The value of ΔgPh = 2062 kJ mol-1
was estimated through the equation
A
Ph
hcNg
(4)
being h = 6626 10
-34 J the Planck constant c = 299
10
8 m s
-1 the light velocity NA = 6022
10
23 photons Einstein
-1 the Avogadro number and λ = 580 nm the wavelength of absorbed
photons [9]
191
According to Torre et al [9] 2 photons at 580 nm are absorbed by the second
photosystem (PSII) and used to transfer 2 electrons to the first one (PSI) releasing two
photons with less energy Therefore knowing nPh we estimated the total molar Gibbs energy
absorbed by the photosynthesis (-ΔGa)
ΔGa = nPh ΔgPh
(5)
According to Torre et al [9] the molar O2 production (qO2) and H
+ consumption
(qH+) were calculated by multiplying their respective stoichiometric coefficients by the cell
concentration expressed in C-mol l-1
using the experimental biomass elemental composition
-ΔGa was assumed to be the sum of the energy fixed by the system to increase its own
enthalpic content (ΔH) that transformed into ATP and used for the growth and maintenance
(ΔGATP) and the released heat (Q)
ΔGa + ΔGATP + ΔH + Q = 0
(6)
where ΔGATP and ΔH were calculated from nPh the Gibbs energy associated to 1 ATP mol
and the average potential variation between PSI and PSII [9]
3 Results and discussion
Fig 1 shows the growth curves of A platensis using nitrate (A) or urea (B) as nitrogen
sources in open ponds [910] or in tubular photobioreactor at different PPFD values A
192
progressive increase in PPFD up to 240 μmol photons m-2
s-1
favored the growth of this
cyanobacterium and a maximum cell concentration of about 3500 mg l-1
was obtained almost
irrespectively of the nitrogen source These results suggest that the light intensity was the
factor limiting the growth under the selected conditions while ongoing experiments (results
not shown) point out that photosaturation takes place at PPFD ge 240 μmol photons m-2
s-1
Such a maximum PPFD threshold is higher than those reported for Erlenmeyer flasks (100-
150 μmol photons m-2
s-1
) [21] rectangular photobioreactor (138 - 229 μmol photons mndash2
sndash1
)
[22] and long open ponds (156 μmol photons mndash2
sndash1
) [23] Moreover even at PPFD of only
60 μmol photons m-2
s-1
(Fig 1) the final cell concentration was more than twice that
previously obtained in open pond under similar experimental conditions (25 degC 72 μmol
photons m-2
s-1
) [10] which suggests a better light distribution in the tubular photobioreactor
Fig 2 illustrates the behavior of Gibbs energy dissipation for cell growth and
maintenance 1YGX versus the time As a general rule this bioenergetic parameter increased
with the time under all the tested conditions as a result of the increasing biomass level that
was responsible for a decrease in the specific growth rate An increase in PPFD up to 120
μmol photons m-2
s-1
favored cell growth because of photolimitation therefore the energy
requirements mainly for maintenance remarkably increased On the contrary none (urea) or
very little (nitrate) increase in 1YGX took place in the PPFD range of 120-240 μmol photons
m-2
s-1
because of the achievement of light saturation conditions This behavior is also
consistent with lower 1YGX values previously observed in open ponds [9] where the well-
known shadowing effect [24] hindered the growth
The photoautotrophic growth can be represented by an overall mass balance equation
where the nitrogen (NO3- or NH4
+) and carbon (HCO3
-) sources H2O O2 SO4
-2 and H
+ are
involved in the formation of 1 C-mol biomass
193
a HCO3- + b NO3
- (or NH4
+) + c H2O + d O2 + e H
+ + f SO4
-2 + CH1650O0531N0170S00007 = 0
(7)
To this purpose we used either the elemental composition of biomass reported by
Cornet et al [25] utilized here as an example or those experimentally determined as
described in Material and methods
To make these redox reactions between electron acceptor and donor possible the
Gibbs energy is used by the cell to enable the construction of the complex biomass molecules
from the inorganic carbon source The respective stoichiometric coefficients estimated
through material balances of carbon nitrogen oxygen sulfur charge and reduction degree are
listed in Table 1 It should be noticed that the reduction degree of biomass (γX) calculated
from biomass composition experimentally determined in this work was always appreciably
higher with nitrate (489-519) than with urea (399-432) as expected by the higher oxidation
number of the former compound [18] In addition both this parameter and the nitrogen
stoichiometric coefficient were appreciably lower when using the elemental composition
experimentally determined in this work (Table 1) because the nitrogen content of biomass
under the selected conditions was always lower than that reported by Cornet et al [25]
The moles of photons (Einsteins) to sustain the autotrophic growth of 1 C-mol
biomass (nPh) were calculated by Eq (3) Although the actual Δgfi values should have been
used for this calculation Torre et al [9] demonstrated that the Gibbs energy of formation
under the actual variable conditions of a cultivation does not differ at all or differs by no more
than 3 from that estimated under standard biological conditions On the contrary ΔgfH+ is
by definition a function of the pH So this parameter was recalculated for the actual
conditions by the well-known equation of Gibbs
194
7
pH
ff10
10ln
HH
RTgg
(8)
As shown in Fig 3 the progressive decrease in the specific growth rate throughout the
cultivations brought about a corresponding increase (in absolute value) in the Einsteins
absorbed to produce one C-mol biomass (nPh) As expected at the highest growth rates this
parameter approached theoretical values very close to that reported by Richmond [26] to
sustain growth under ideal conditions (only 8 effective Einsteins C-molDM-1
)
During the light reactions of photosynthesis the free energy carried by photons is in
fact captured by pigments (ex chlorophyll) held in large protein complexes called ldquoreaction
centersrdquo When a special chlorophyll molecule of PSII absorbs the energy of a photon (hν) an
electron gains higher energy level Because this state of an electron is very unstable it is
transferred from one to another molecule creating a chain of redox reactions referred to as
Electron Transport Chain (ETC) The electron flow goes from PSII to cytochrome b6f of PSI
where the electron gets the energy from another photon The final electron acceptor is
NADP+ which produces NADPH A minimum of 8 photons is then required to transfer 4
electrons from 2 H2O molecules to produce 2 NAPDH molecules according to the equation
2 H2O + 8 hν +2 NADP+ rarr 2 NADPH + O2 + 2 H
+
(9)
Subsequently the electrons are transferred from NAPDH to CO2 through the Calvin cycle to
produce biomass constituents [27]
As already observed in previous work [9] the additional energy requirement with
respect to the ideal situation of 8 effective Einsteins C-molDM-1
is negligible at the beginning
195
of cultivations (high specific growth rates) and then considerably increases during the
stationary phase This suggests that under conditions likely limited by shadowing biomass
uses energy preferentially for maintenance rather than for growth Although the behavior of
nPh was qualitatively similar for cultivations performed in open ponds and in tubular
photobioreactor (Fig 3) the excess light requirements in the latter configuration were
certainly due to the higher levels of biomass ensured by more effective distribution As
expected a progressive increase in the light intensity did not exert any appreciable influence
on this nPh (Einstein C-molDM-1
)
In addition the cultures with nitrate needed highest nPh values to sustain the
autotrophic growth compared to those with urea even though the cell concentration was
similar at all the PPFD values (Fig 1) Thus the additional photon requirement was likely
utilized to reduce nitrate to ammonia [28] which is the preferential nitrogen form assimilated
by A platensis [29] This effect was also observed by Torre et al [9] in open ponds It should
also be noticed that the use in the above bioenergetic model of the coefficients reported by
Cornet et al [25] for A platensis biomass composition (CH1650O0531N0170S00007) led to
results practically coincident to those obtained using the experimental ones determined in this
work (Fig 3) This observation demonstrates that biomass composition has a negligible
impact on the predictions by the model and then it could be used as a general tool to elaborate
data from the literature without any determination of biomass composition
Fig 4 shows the time behaviors of molar development of O2 and consumption of H+
during the cultivations performed either in open pond or in the tubular photobioreactor at
variable PPFD These trends clearly demonstrate that both activities faithfully followed cell
growth being biomass the final product of the photosynthetic metabolism and were lower in
the open pond compared with the tubular photobioreactor consistently with the better light
distribution in the latter reactor configuration Moreover their progressive increase with
PPFD confirms that the light intensity was the factor actually limiting the growth and that the
196
system never reached photoinhibition conditions This behavior was qualitatively similar in
the cultures using nitrate as nitrogen source (data not shown) As expected by the above-
mentioned need of reducing nitrate to ammonia as an obligatory intermediate to utilize any
nitrogen source [30] both parameters were higher using nitrate than urea
As is well known the energy from flow of electrons between PSII and NADPH drives
protons across the plasma membrane creating a proton-motive force that provides the energy
for ATP synthesis by ATP synthase [31] Therefore it was assumed that a portion of molar
Gibbs energy absorbed by the two photosystems was used to convert ADP to ATP As shown
in Fig 5 the highest -ΔGa and ΔGATP values were obtained at end of cultivation due to
unfavorable environmental conditions such as the lack of nutrients or release of cell
metabolites As far as the influence of light intensity is concerned the highest energy
requirements were observed for cultures performed at PPFD up to 120 μmol photons m-2
s-1
which ensured the highest cell concentration (Fig 1) As previously mentioned the -ΔGa and
ΔGATP values did not increase (urea) or increased very little (nitrate) in the PPFD range of 120
ndash 240 μmol photons m-2
s-1
because of light saturation conditions A qualitatively similar
behavior was observed for cultures using nitrate in tubular photobioreactor (results not
shown) Moreover at the lowest PPFD values both parameters showed similar behaviors in
open pond and in tubular photobioreactor which means that the reactor configuration had
negligible influence on them
Fig 6 shows the results of the energy fixed by photosynthesis (-ΔH) and that released
as heat (Q) under different conditions of light intensity nitrogen source and reactor
configuration It can be seen that at the end of cultivations both parameters increased with
light intensity Almost coincident results were also obtained using nitrate as nitrogen source
(results not shown) As is well known under excess light conditions part of the absorbed
energy is thermally dissipated via a mechanism called Non-Photochemical Quenching (NPQ)
[32] and a significant quantity of free energy is lost as heat during the biochemical reactions
197
between light absorption and carbohydrate formation [33] Such a result has been ascribed to
a certain physiological mechanism to protect the photosynthetic apparatus against
photodestruction [3435] where a fundamental role is played by the antenna complexes of
photosynthetic apparatus which would switch from a light harvesting form to an efficient
thermal dissipation form [32]
As expected by the fact that both the ATP synthesis and the formation of NADPH
implied in the biosynthetic pathways are resulting from the activity of the same
photosynthetic apparatus [33] the ΔH behavior was quite similar to that observed for ΔGATP
Fig 7 shows the percentage distribution of the light energy absorbed versus time at the
lowest PPFD chosen as an example but qualitatively similar results were observed at higher
PPFD values As expected by the additional energy requirements of nitrate-to-ammonia
reduction cultures with urea compared with those with nitrate exhibited higher energy
fractions stored as ATP (ηATP) and fixed by the system to increase its enthalpic content (ηF)
and lower fraction released as heat (ηQ) Moreover in all the experiments both ηATP and ηF
decreased along the time whereas ηQ increased
The highest ηATP and ηF values were around 12 and 23ndash27 in cultures with nitrate
and 15 and 31ndash34 in those with urea respectively In cultures performed at the highest
PPFD values (120 and 240 μmol photons mndash2
sndash1
) ηF decreased more sharply than at the
lowest ones (results not shown) because of the highest cell concentrations (Fig 1) that
reduced the light availability to the cell (shading effect) The nutrient availability is another
important environmental factor influencing the composition of cyanobacterial photosynthetic
apparatus Murakami et al [36] have shown that the responses to CO2 Na+
and light stresses
in Synechocystis sp cause alterations in the redox state of intersystem electron transport
components Likewise the decrease in the availability of some nutrient at the end of our A
platensis cultivations may have contributed to lower ηF As expected ηQ showed an opposite
behavior progressively increasing from minimum values at the beginning of cultures (60-
198
66 with nitrate and 49-54 with urea) to around 90 at the end This means that at the end
of any cultivation most of the energy absorbed is released as heat
Similar behaviors were observed using either open ponds with nitrate or the tubular
photobioreactor with both nitrogen sources which means that the energy distribution was not
appreciably influenced by the reactor configuration
4 Conclusions
The results of the current study indicate that the bioenergetic parameters of the blue-green
cyanobacterium Arthrospira (Spirulina) platensis were influenced by bioreactor
configuration nitrogen source and photosynthetic photon flux density (PPFD) In particular
the highest values of the Gibbs energy dissipation for cell growth and maintenance were
obtained at 120-240 μmol photons m-2
s-1
irrespective of the selected nitrogen source while
the number of photons moles absorbed by the cell to produce one C-mol biomass was higher
in the cultures with nitrate irrespective of light intensity The highest values of the molar
production of O2 and consumption of H+ were obtained at the highest PPFD values using
nitrate as a nitrogen source and the tubular photobioreactor Contrarily the bioreactor
configuration did not exert any appreciable influence on the fractions of the absorbed energy
addressed to the synthesis of ATP fixed by the cell and released as heat The first two
fractions were higher in cultures performed with urea which proved a nitrogen source able to
energetically sustain A platensis growth
Acknowledgements
The authors grateful acknowledge the financial support of the Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
Pesquisa do Estado de Satildeo Paulo (FAPESP) Satildeo Paulo Brazil (process no 0654959-3 and
199
0656976-2) of the Coordenaccedilatildeo de Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES)
Brazil (process no 397808-7 and Prof A Converti Fellowship no 0350-112010) of the
Italian Ministry of Education University and Research (MIUR) (PRIN ProtN 200744HMBN
and FIRB Prot N RBIP06993E) and of the Vigoni Program (Deutsch-Italienisches
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204
Caption of Figures
Fig 1 Growth of A platensis using nitrate (A) and urea (B) as nitrogen sources at different
PPFD values (μmol photons m-2
s-1
) Tubular photobioreactor () 60 ( ) 120 and () 240
Open ponds [10] 72 ()
Fig 2 Dependence of Gibbs energy dissipation for A platensis growth and maintenance
(1YGX) on PPFD (μmol photons m-2
s-1
) Tubular photobioreactor () 60 ( ) 120
() 240 Open ponds [10] 72 () Nitrogen source nitrate (open symbols or ) urea
(full symbols)
Fig 3 Influence of A platensis specific growth rate (μ) on the moles of photons absorbed to
produce one C-mol biomass (nPh) under different culture conditions Tubular photobioreactor
() elemental biomass composition reported by Cornet et al [25] PPFD = 60 μmol photons
m-2
s-1
elemental biomass composition experimentally determined in this work PPFD (μmol
photons m-2
s-1
) () 60 () 120 () 240 () Open ponds [10] elemental
biomass composition reported by Cornet et al [25] PPFD = 72 μmol photons m-2
s-1
Nitrogen source nitrate (open symbols or ) urea (full symbols)
Fig 4 Time behaviors of molar development of O2 (full symbols) and consumption of H+
(open symbols) under different culture conditions Tubular photobioreactor PPFD (μmol
photons m-2
s-1
) () 60 () 120 () 240 Open ponds [10] PPFD = 72 μmol
photons m-2
s-1
() Nitrogen source nitrate (dashed line) urea (continuous lines)
Fig 5 Total Gibbs energy absorbed by the photosynthetic apparatus (full symbols) (-ΔGa)
and energy transformed into ATP (open symbols) (ΔGATP) during A platensis cultivations
205
Tubular photobioreactor with urea PPFD (μmol photons m-2
s-1
) () 60 ( ) 120
() 240 Open ponds with nitrate [10] PPFD = 72 μmol photons m-2
s-1
()
Fig 6 Energy fixed by the photosynthetic apparatus (full symbols) (-ΔH) and energy released
as heat (open symbols) (Q) during A platensis cultivations Tubular photobioreactor with
urea PPFD (μmol photons m-2
s-1
) () 60 ( ) 120 () 240 Open ponds with
nitrate [10] PPFD = 72 μmol photons m-2
s-1
()
Fig 7 Percentage distribution of the light energy absorbed during A platensis cultivations
using nitrate (full symbols) and urea (open symbols) as nitrogen sources Tubular
photobioreactor PPFD = 60 μmol photons photons mndash2
sndash1
(continuous lines) Open ponds
[10] PPFD = 72 μmol photons m-2
s-1
(dashed lines) Energy fixed by the photosynthesis
() energy transformed into ATP () energy released as heat ( )
206
Figure 1
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
Bio
ma
ss c
on
cen
tra
tio
n (
mg
l-1
)
Time (d)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
Bio
ma
ss c
on
cen
tra
tio
n (
mg
l-1
)
Time (d)
A
B
207
Figure 2
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
0 2 4 6 8 10 12
1Y
GX (
kJ
C-m
ol
DM
-1)
Time (d)
208
Figure 3
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
000 010 020 030 040 050 060 070 080
nP
h (
Ein
stei
n C
-mo
l D
M-1
)
(d -1)
209
-015
-010
-005
000
005
010
015
020
0 2 4 6 8 10 12
q (
mol
l-1)
Time (d)
210
Figure 4
Figure 5
-9000
-8000
-7000
-6000
-5000
-4000
-3000
-2000
-1000
0
1000
0 2 4 6 8 10 12
G
a
GA
TP (
kJ
C-m
ol
DM
-1)
Time (d)
211
Figure 6
-2000
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
0 2 4 6 8 10 12-H
Q
(k
J C
-mol
DM
-1)
Time (d)
212
Figure 7
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2 4 6 8 10 12
h(
)
Time (d)
213
Table 1 Stoichiometric coefficients estimated through material balances of carbon nitrogen
oxygen sulfur charge and reduction degree for biomass cultivated either in open ponds or in
tubular photobioreactor using nitrate or urea as nitrogen sources
HCO3- NO3
- NH4
+ a H2O O2 H
+ SO4
-2 Biomass
Δgf‟i
(kJ mol-1
)
-5872 -1114 -794 -2373 0 -399 -7446 -670
Stoichiometric coefficients (mol C-molDM-1
)
Run
PPFD
(μmol photons
m-2
s-1
)
a b b c d e f γX b
1 c 72 -1 -020 - 020 145 -120 - 580
2 d 60 -1 -020 - 020 145 -120 - 580
2 e 60 -1 -011 - 032 130 -111 000 519
3 e 60 -1 - -007 024 100 -093 000 399
4 e 120 -1 -011 - 023 122 -111 000 489
5 e 120 -1 - -008 042 103 -092 000 411
6 e 240 -1 -010 - 023 127 -110 000 509
7 e 240 -1 - -008 034 108 -092 000 432
a NH4
+ is the result of urea hydrolysis
b Reduction degree of biomass
c Minipond considering the elemental biomass composition reported by Cornet et al [25]
d Tubular photobioreactor considering the elemental biomass composition reported by Cornet et al
[25]
e Tubular photobioreactor elemental biomass composition experimentally determined
214
Anexo 3
Carbon dioxide from alcoholic fermentation as a carbon source for the
fed-batch cultivation of Arthrospira platensis
Raquel Pedrosa Bezerraab
Marcelo Chuei Matsudoa Sunao Sato
a Attilio Converti
bc Joatildeo
Carlos Monteiro de Carvalhoa
a Department of Biochemical and Pharmaceutical Technology Faculty of Pharmaceutical
Sciences University of Satildeo Paulo Av Prof Lineu Prestes 580 Bl 16 05508-900 Satildeo
Paulo-SP Brazil
b Department of Chemical and Process Engineering ldquoGB Boninordquo University of Genoa via
Opera Pia 15 16145 Genoa Italy
c CAPES Fellowship holder Brazil
_________
Author for correspondence phone +55-11-30913695 fax +55-11-38156386
E-mail jcmdcarvuspbr
215
Abstract
It was evaluated the Arthrospira platensis cultivation using CO2 from alcoholic fermentation
and either urea or nitrate as nitrogen source at different light intensities (60 le I le 240 μmol
photons m-2
s-1
) Whereas the CO2 source (pure CO2 or from alcoholic fermentation) did not
influence the maximum cell concentration (Xm) cell productivity (PX) and nitrogen-to-cell
conversion factor (YXN) the use of urea instead of nitrate led to higher YXN values Xm and PX
increased when I was increased from 60 to 120-240 μmol photons m-2
s-1
Using CO2 from
alcoholic fermentation the best performance (Xm = 2952 plusmn 35 mg L-1
PX = 425 plusmn 59 mg L-1
d-1
and YXN = 15 plusmn 020 mg mg-1
) was obtained at I = 120 μmol photons m-2
s-1
with urea The
results obtained in this work demonstrate that urea and CO2 from alcoholic fermentation could
be simultaneously used in large-scale cultivations to reduce the environmental impact
associated to the release of this greenhouse gas as well as the production cost of
cyanobacteria
Keywords
Arthrospira (Spirulina) platensis CO2 alcoholic fermentation fed-batch cultivation urea
light intensity
1 Introduction
Renewable energy sources such as ethanol have been seen as a promising alternative
to fossil fuel consumption providing environmental benefits by reduction in greenhouse gas
emissions and the national security benefits by less dependency on volatile crude oil imports
(Tyner and Taheripour 2007) Brazil is the worldrsquos largest exporter of bioethanol and second-
largest producer after the United States (Balat and Balat 2009) Considering the increasing
demand for this fuel and the fact that alcoholic fermentation is responsible for a CO2 release
216
on weight basis almost coincident with ethanol production it would be of great concern
developing a process for CO2 fixation able to turn it into a useful product Photosynthetic
microorganisms can fix CO2 efficiently from different sources including the atmosphere
industrial exhaust gases and soluble carbonate salts (Wang et al 2008) Moreover CO2
biofixation by microalgae leads to higher yield of biomass per hectare in comparison with
terrestrial plants (Packer 2009) It has been shown that the cost of CO2 in large-scale algal
cultures is of primary importance to the total economics (Tapie and Bernard 1988) Since 45ndash
50 of the dry algal mass is made up of carbon (Cornet et al 1992) 165ndash 183 g CO2 would
theoretically be needed for the biosynthesis of 1 g (DW) of algal biomass Thus CO2
biofixation by microalgae has the potential not only to offset carbon emissions but also to
reduce the costs of culture media on an industrial scale (Hughes and Benemann 1997)
Combination of CO2 fixation and production of biomass containing high-value bioactive
products may provide a very promising alternative to current CO2 mitigation strategies
Nowadays there are numerous commercial applications of A platensis such as the
enhancement of the nutritional value of foods and animal feed feed in aquaculture
bioremediation use in cosmetics and others applications (Spolaore et al 2006) Besides the
CO2 source the nitrogen source is an additional important factor in the cultivation of
photosynthetic microorganisms since this element is used mainly to provide proteins and
nucleic acids which are essential for cell maintenance and growth (Watanabe and Hall
1996) Salts of nitrate are largely used as nitrogen source for A platensis culture but urea
(Danesi et al 2004) and ammonium salts (Bezerra et al 2008) have recently been proposed
as alternative cheap nitrogen sources
Compared to open ponds appropriately designed closed photobioreactors are able to
minimize the loss of ammonia nitrogen sources by off gassing reducing the amount of this
nutrient necessary in a large-scale process Additionally these reactors can reduce the
217
cultivation area by distributing the photosynthetic organisms vertically and increase the CO2
residence time thereby improving its utilization efficiency (Ono and Cuello 2004)
The aim of this study was to check if the combined use of CO2 released from alcoholic
fermentation and urea in tubular photobioreactor could be a feasible and cheap alternative
way to cultivate A platensis For this purpose fed-batch cultivations were carried out at
variable light intensity using two different sources either of nitrogen (sodium nitrate or urea)
or of carbon (pure CO2 from cylinder or gaseous emissions from alcoholic fermentation) the
latter to simultaneously control the pH and maintain the desired carbon level The results
obtained were finally compared by means of analysis of variance to identify the statistically
significant effects of the above independent variables (light intensity nitrogen source and
carbon source) on the selected responses namely the maximum cell concentration cell
productivity and nitrogen-to-cell conversion factor
2 Materials and methods
21 Microorganism and culture medium
Arthrospira (Spirulina) platensis UTEX 1926 was maintained in the culture medium
of Schloumlsser (1982) having the following composition (per liter) 136 g NaHCO3 403 g
Na2CO3 050 g K2HPO4 250 g NaNO3 100 g K2SO4 100 g NaCl 020 g MgSO4middot7H2O
004 g CaCl2middot2H2O All the nutrients were dissolved in distilled water containing (per liter)
60 mL of metal solution (970 mg FeCl3middot6H2O 410 mg MnCl2middot4H2O 50 mg ZnCl2 20 mg
CoCl2middot6H2O 40 mg Na2MoO4middot2H2O) 10 mL of micronutrient solution (500 mg Na2EDTA
618 mg H3BO3 196 mg CuSO4middot5H2O 440 mg ZnSO4middot7H2O 200 mg CoCl2middot6H2O 126 mg
MnCl2middot4 H2O 126 mg Na2MoO4 middot2H2O) and 10 mL15 g Lminus1
B12 vitamin solution
Fed-batch runs were carried out either using the above medium containing NaNO3 as
the nitrogen source or after substituting in it NaNO3 with urea
218
22 Cultivation
The bench-scale tubular photobioreactor (Fig 1) utilized in this study was developed
at the Fermentation Technology Laboratory of the Department of Biochemical and
Pharmaceutical Technology of Satildeo Paulo University (Ferreira et al 2010) It was made up of
transparent glass tubes (10 m length 10 cm internal diameter 05 cm wall thickness) with
inclination of 2 (115ordm) to make the fluid flow easier PVC tubes were used to connect the
glass tubes The reactor was illuminated by 20 W fluorescent lamps Ambient air was injected
at the bottom of the tubes to drive the liquid from the bottom to the top of the reactor A
degassing bottle provided with magnetic stirrer ensured efficient medium homogeneity The
total and illuminated volumes of the reactor were 350 and 212 L respectively
Cultivations were carried out with initial biomass concentration of 400 mg Lminus1
(Ferreira et al 2010) in tubular photobioreactor (PBR) and temperature of 29 ordmC The pH was
set and maintained at 95 plusmn 02 (Saacutenchez-Luna et al 2007) by addition of pure CO2 from
cylinder or CO2 from continuous alcoholic fermentation under steady-state conditions using a
pH controller (Mettler Toledo Barueri SP Brazil) coupled to a solenoid valve In
experiments with NaNO3 nitrate concentration was maintained above 1 g L-1
(Faintuch
1989) to avoid growth limitation by this nutrient When urea was used as nitrogen source its
amount to be daily added was estimated as suggested by Ferreira et al (2010) Briefly from
the curve of cell concentration versus time of each standard run with nitrate (Fig 2) we
obtained an interpolated curve described by a third order-polynomial equation By derivation
of this equation it was possible to obtain the second order equation of cell productivity and
from that the equation expressing the amount of urea to be daily added to sustain the expected
cell growth taking into account that the dry mass of A platensis contains about 7 of
nitrogen (Bezerra et al 2008) The light intensity expressed as photosynthetic photon flux
density (PPFD) was varied in the range of 60-240 μmol photons mndash2
sndash1
Table 1 show the
219
different conditions adopted in this work for cultivations All experiments were carried out in
duplicate
221 CO2 sources
Pure CO2 of analytical grade (999) was obtained from a cylinder (Oxylumen Satildeo
Paulo SP Brazil)
CO2 from alcoholic fermentation was produced continuously by Saccharomyces
cerevisiae CCT7150 (Fundaccedilatildeo Tropical Andreacute Tosello Culture Collection Campinas SP
Brazil) cultivated in a glass bioreactor (Infors-HT Bottmingen Switzerland) containing 10 L
of diluted sugarcane blackstrap molasses at temperature of 30 plusmn 1 ordmC (Kock et al 2000)
impeller speed of 500 rpm and dilution rate of 0025 h-1
Sugar concentration in the feed
expressed as total reducing sugars (TRS) was 170 g L-1
(Guerreiro et al 1997) Urea (05 g
L-1
) was added to the mash After adjustment of pH at 45-50 by addition of H2SO4 it was
controlled at 45 plusmn 01 (Jones et al 1981) by addition of 15 N NaOH solution Penicillin (500
ui L-1
) was added to prevent contamination (Carvalho et al 2003) Continuous feeding was
started after 12 h of batch fermentation
23 Analytical techniques
231 A platensis cultivation
Cell concentration was determined by optical density (OD) measurements at 560 nm
using a calibration curve (Leduy and Therien 1977) The liquid phase of the medium was
used to determinate the concentrations of total carbonate (Pierce and Haenisch 1948) nitrate
(Vogel 2002) and volatile organic compounds (Joslyn 1970) The concentration of total
ammonia was determined immediately before the daily addition of urea on cell-free medium
samples using a potentiometer and selective ammonia ion electrode model 95-12 (Orion
Cambridge MA USA) (Leduy and Samson 1982) The residual urea level was determined
220
by the same way after previous hydrolysis with H2SO4 at 200 degC (Cezare 1998) Incident
photon flux density of photosynthetically active radiation (400-700 nm) was measured by
means of an integrating quantumradiometerphotometer model LI-190 SB (Li-Cor Lincoln
NE USA) provided with a LI-190 SB quantum sensor cell
232 Alcoholic fermentation
Cell concentration was measured by filtering 50 mL samples through Millipore
membranes with 12 μm pore diameter washing with 50 mL of distilled water and drying at
105-110 degC until constant weigh (Carvalho et al 2003) The total reducing sugars (TRS)
concentration was expressed as glucose and determined according to Somogy (1952) after
acid hydrolysis of samples (Falcone et al 1959)
Ethanol concentration was determined by the micro-dichromate method (Joslyn
1970) The effluent gas was qualitatively analyzed by a gas chromatograph coupled to mass
spectrometer model GCMS-QP5050A (Shimadzu Kyoto Japan) equipped with CP Sil
PONA CB column (100 m x 025 mm x 05 μm) Helium was used as a carrier gas at flow rate
of 1 mL min-1
Samples (1 mL) were injected in the column at a split ratio of 1100 Injector
and detector temperatures were 200 and 250 degC respectively The column temperature was
initially set at 40 degC and then increased at a rate of 2 degC min-1
up to 100 degC and subsequently
at 10 degC min-1
up to 250 degC
24 Calculation of A platensis cultivation parameters
The cell productivity (PX mg L-1
d-1
) was calculated by dividing the difference
between maximum and initial cell concentration (Xm - Xi) by the cultivation time
corresponding to Xm The nitrogen-to-cell conversion factor (YXN mg mg-1
) was calculated as
the mass ratio of dried produced cells and nitrogen added
221
24 Statistical analysis
Maximum cell concentration (Xm mg L-1
) maximum cell productivity (PX mg L-1
d-1
)
and nitrogen-to-cell conversion factor (YXN mg mg-1
) were evaluated by the analysis of
variance (ANOVA General Linear Model) and the Tukey test to compare the mean values at
a significance level of 5 (p lt 005) using the MINITAB 15 statistical software
3 Results and discussion
31 Continuous alcoholic fermentation
The mean results of continuous alcoholic fermentation of blackstrap molasses under
steady state conditions were the following cell concentration of 609 plusmn 054 gDW L-1
(dry
weight) TRS of 532 plusmn 567 g L-1
and ethanol concentration of 553 plusmn 757 g L-1
corresponding to a fermentation yield of 64 Such a process yield was of the same order of
magnitude as those previously obtained with the same carbon source (Carvalho et al 2003)
and ensured the release of a CO2 flux suitable to maintain the pH of A platensis culture at the
desired value (95 plusmn 02)
32 Effects of carbon dioxide and nitrogen sources and light intensity on A platensis
growth
Figs 2 to 4 show that the use of pure CO2 or CO2 from alcoholic fermentation led to
almost coincident cell concentration profiles and Xm values which points out no significant
influence of the CO2 source on A platensis growth These findings which were confirmed by
ANOVA (p 005 Table 2) highlight the feasibility of using such a by-product from
industrial bioethanol production as carbon source for cyanobacteria cultivation
It is well known that when bicarbonate is used for the photosynthetic growth of
microalgae there is a progressive release of OH- in the medium (Goldman et al 1982) thus
222
the pH control is fundamental in processes leading to high cell concentrations As stressed by
Watanabe et al (1995) high alkalinity (pH gt 110) restricts the productivity in the air-lift
photobioreactors using air not supplemented with CO2 In cultivations having high demand of
carbon due to high cell concentrations the addition of CO2 can ensure at the same time
control of pH and suited supply of the carbon source This has been done in the present work
where the culture pH was maintained at 95 plusmn 02 (Saacutenchez-Luna et al 2007) by addition of
CO2 either from a cylinder or from alcoholic fermentation so that the CO2 consumed by the
microorganism was permanently replaced Such a control also allowed maintaining the carbon
source level along the cultivations at a value (around 1208 g L-1
of total carbonate)
practically coincident with that of the medium of Schloumlsser (1982) thus avoiding any carbon
source limitation or accumulation and reducing its cost
In experiments carried out with CO2 from alcoholic fermentation the analysis of
effluent gas by headspace gas chromatography revealed it was mainly made up of CO2 with
only small contents of ethanol and acetaldehyde Despite of this it was not detected any
appreciable concentration of organic volatile compounds in the medium likely because this
microorganism has the enzymes needed to metabolize ethanol or even due to their
condensation in the pipe and consequently no influence of these compounds on A platensis
growth was observed In addition the use of CO2 from alcoholic fermentation did not lead to
any precipitation of salts or flocculation like those observed by Ferraz et al (1985) for A
maxima cultivations in open-ponds using a semi-synthetic medium constituted by malt and
yeast extracts peptone and sucrose
As far as the influence of the nitrogen source on A platensis growth is concerned
urea a classical fertilizer was chosen to substitute the conventional nitrogen sources (KNO3
NaNO3) because of its low cost and because it has been recognized as a promising alternative
nitrogen source in the cultivation of A platensis (Danesi et al 2004 Sassano et al 2007)
223
For a given light intensity and CO2 source no significant difference in growth curves
of cultivations carried out with nitrate (Fig 2) or urea (Figs 3 and 4) as nitrogen source was
observed and the Xm values obtained with both nitrogen sources were statistically coincident
(p 005 Table 2) These results point out the success of the approach of using standard
curves obtained with NaNO3 under non-limited conditions (Fig 2) to foresee the nitrogen
demand of fed-batch A platensis cultivations with urea and confirm the feasibility of using
this cheap nitrogen source
Ammonia and residual urea concentrations during the cultivation (lt 10-4
M) were
always much lower than those considered toxic (10 mM) or even inhibitory for cyanobacteria
growth (17 mM to 2 mM) (Abeliovich and Azov 1976) thereby demonstrating that there
was no accumulation either of ammonia or urea in the medium Since the pH of the culture
(95 plusmn 02) was higher than the pKa of the ammonium (93) this compound was likely
assimilated by simple diffusion and then trapped within the cell cytoplasm by protonation
(Boussiba et al 1984)
Light is the energy source that drives photosynthesis therefore its intensity is an
additional important growth factor which has been often associated with shifts in metabolic
activity (Vonshak et al 2000)
During photoautotrophic growth the amount of light energy received by the
photosynthetic apparatuses determines the amounts of inorganic carbon fixed Xm was
significantly increased (p lt 005 Table 2) by an increase in the light intensity from 60 to 120
micromol photons m-2
s-1
(Figs 2 to 4) whereas it reached a plateau in the range 120-240 micromol
photons m-2
s-1
(Table 3) This result is consistent with the typical behavior of the autotrophic
growth of A platensis (Vonshak et al 2000) which can be depending on I (i) light limited
(ii) light saturated or (iii) light inhibited and whose specific growth rate initially increases
linearly with light intensity then reaches a plateau and finally falls
224
The highest Xm value found in this work was higher than those reported for A
platensis cultivations in minipond (15 g L-1
) (Binaghi et al 2003) and conical tubular
photobioreactor (13 g L-1
) (Watanabe and Hall 1996)
33 Cell productivity
Table 2 shows that cell productivity (PX) was not statistically affected either by the
nitrogen or the CO2 source (p 005) Indeed the almost coincident PX values obtained in
cultures with urea and nitrate were expected by the fact that the amounts employed of the
former nitrogen source under every conditions were always based on the results of the
corresponding runs with nitrate As for Xm also the use of different CO2 sources did not
influence the productivity (p 005 Table 2) as well the cultivation time
On the other hand PX increased by about 45 when increasing the light intensity from
60 to 120 micromol photons m-2
s-1
while Xm increased by only 7 Since the higher the light
intensity the higher the biomass concentration in the middle of runs (Figs 2 to 4) it is likely
that the effect of I is more marked when the overall culture conditions are favorable and there
is some shadowing effect (Vonshak et al 2000) In fact the higher the light intensity the
larger the amount of energy converted into ATP to be utilized for cell growth and
maintenance and then the cells reach more quickly the maximum cell concentration (Vonshak
et al 2000)
This behavior was also observed by Danesi et al (2004) and Rangel-Yagui et al
(2004) in A platensis cultures carried out in miniponds with KNO3 or urea as nitrogen
sources On the other hand the similar PX values obtained at 120 and 240 micromol photons m-2
s-
1 (Table 3) were the likely result of photosaturation or shadowing (Chojnacka and Noworyta
2004 Vonshak et al 2000) as described earlier for Xm
225
Therefore the highest cell productivities were obtained at the highest light intensities
(443 plusmn 20 and 463 plusmn 16 mg L-1
d-1
at I = 120 and 240 micromol photons m-2
s-1
respectively)
irrespective of the nitrogen or CO2 sources used (Table 3) These values are close to that (510
mg L-1
d-1
) obtained by Watanabe et al (1995) who investigated the A platensis growth in
conical helical photobioreactor at 118 μmol photon m-2
s-1
Other studies showed that this parameter reached maximum values of 92 mg L-1
d-1
in
a cylindrical glass tank using urea at 108 μmol photons mndash2
sndash1
(Sassano et al 2007) and 96
mg L-1
d-1
in long minitanks using ammonium chloride at 13 klux (156 μmol photons mndash2
sndash1
)
(Bezerra et al 2008) Since these light intensity thresholds are close to that obtained in this
study the remarkably higher values of PX shown here demonstrate the excellent performance
of the tubular photobioreactor configuration
34 Nitrogen-to-cell conversion factor
The ANOVA statistical analysis indicates a significant effect of the nitrogen source (p
lt 005 Table 2) on the nitrogen-to-cell conversion factor (YXN) whose highest mean values
were achieved in cultures using urea (Table 1) Indeed in these cultures the nitrogen amount
added daily was based on the actual needs for cell growth and maintenance and then its
residual concentration was always lt 10-4
M therefore there was no limitation or excess of
nitrogen during cultivation On the other hand in cultures with nitrate its concentration was
always maintained above 1 g L-1
to avoid any growth limitation (Faintuch 1989) thus
resulting in a YXN decrease
Contrarily no significant effects of CO2 sources and light intensities on YXN (p 005
Table 2) were observed Taking into account that YXN is the ratio between the masses of dry
cell produced and nitrogen added such an observation had to be expected by the fact that the
amount of nitrogen added to the culture is associated to cell growth as stressed above These
results apparently disagree with those obtained by Bezerra et al (2008) and Danesi et al
226
(2004) who observed a YXN increase with light intensity However since those experiments
were carried out using the same amount of nitrogen regardless of the light intensity YXN was
only a function of Xm which was in turn an increasing function of I
The highest YXN value found in this study (138 plusmn 090 mg mg-1
) was remarkably
higher than those reported for urea (74-85 mg mg-1
) (Rangel-Yagui et al 2004) and
ammonium chloride (57 plusmn 017 mg mg-1
) (Bezerra et al 2008) as nitrogen sources in
miniponds because the use in this study of a closed tubular photobioreactor certainly reduced
the nitrogen loss as ammonia by off gassing (Ferreira et al 2010)
4 Conclusions
The results of this work showed that the simultaneous use of two low cost or even no-
cost nutrients (CO2 from alcoholic fermentation and urea) could be an interesting alternative
for A platensis cultivation in tubular photobioreactor The fed-batch cultivation of this
cyanobacterium at 120 μmol photons m-2
s-1
using these nutrients as carbon and nitrogen
sources respectively did in fact provide a maximum cell concentration of 2960 plusmn 35 mg L-1
and a cell productivity of 425 plusmn 59 mg L-1
d-1
The production of A platensis biomass which
is a source of valuable compounds using as carbon source the CO2-rich gaseous emissions
from the alcohol industry may contribute to reduce the release of such a greenhouse gas into
the atmosphere
Acknowledgements
The authors grateful acknowledge the financial support of the Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
Pesquisa do Estado de Satildeo Paulo (FAPESP) Satildeo Paulo Brazil (process no 0654959-3 and
065679-2) and of the Coordenaccedilatildeo de Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior
(CAPES) Brazil (processes n 397808-7 and 0350-112010)
227
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Caption of Figures
Figure 1 Scheme of the photobioreactor employed for fed-batch cultivations of A platensis
(1) Degasser (2) Condenser tube (3) Air pump (4) Rotameter (5) Magnetic stirrer (6)
20W Fluorescent lamps (7) Airlift system
Figure 2 Cell concentration (X mg L-1
) versus time during fed-batch A platensis cultivations
carried out using nitrate and A) CO2 from cylinder or B) gaseous emissions from alcoholic
fermentation at different light intensities (μmol photons m-2
s-1
) 60 (diams) 120 (times) and 240 (+)
The estimated curves are drawn as continuous lines
Figure 3 A) Cell concentration (X mg L-1
) (open symbols) and B) daily urea addition (mM
d-1
) (full symbols) versus time during fed-batch A platensis cultivations carried out using CO2
from cylinder at different light intensities (μmol photons m-2
s-1
) Triangle 60 Square 120
Circle 240
Figure 4 A) Cell concentration (X mg L-1
) (open symbols) and B) daily urea addition
(mM d-1
) (full symbols) versus time during fed-batch A platensis cultivations carried out
using CO2 from alcoholic fermentation at different light intensities (μmol photons m-2
s-1
)
Triangle 60 Square 120 Circle 240
233
Figure 1
234
Figure 2
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg L
-1)
Time (days)
A)
B)
235
Figure 3
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg L
-1)
Time (days)
000
020
040
060
080
100
120
140
160
0 2 4 6 8 10
Time (days)
ure
a ad
dit
ion (
mM
d-1
)
236
Table 1 Maximum cell concentration (Xm) cell productivity (PX) and nitrogen-to-cell
conversion factor (YXN) obtained in fed-batch A platensis cultures carried out at different
light intensities and using different CO2 and nitrogen sources
run
I
(mol m-2
s-1
)a
CO2
source
Nitrogen
source
Xm
(mg L-1
) b
PX
(mg L-1
d-1
) b
YXN
(mg mg-1
) b
1 60 C c NaNO3 2899plusmn17 250plusmn17 42plusmn003
2 60 C Urea 2847plusmn10 245plusmn00 14plusmn000
3 60 A d NaNO3 2789plusmn82 299plusmn10 40plusmn014
4 60 A Urea 2867plusmn28 308plusmn35 14plusmn017
5 120 C NaNO3 3209plusmn109 454plusmn18 45plusmn018
6 120 C Urea 2980plusmn103 408plusmn17 11plusmn050
7 120 A NaNO3 2968plusmn24 428plusmn40 43plusmn004
8 120 A Urea 2952plusmn35 425plusmn59 15plusmn020
9 240 C NaNO3 3291plusmn206 482plusmn34 54plusmn038
10 240 C Urea 3236plusmn72 473plusmn12 13plusmn034
11 240 A NaNO3 3102plusmn130 450plusmn22 50plusmn024
12 240 A Urea 3070plusmn112 445plusmn19 14plusmn056
a I = light intensity
b Values represent means of two experiments and its standard error
c C = cylinder
d A = alcoholic fermentation
237
Table 2 Values of the descriptive level (p) for the maximum cell concentration (Xm) cell
productivity (PX) and nitrogen-to-cell conversion factor (YXN) at different light intensities (60
120 or 240 mol photons m-2
s-1
) and using different sources of CO2 (cylinder or alcoholic
fermentation) and nitrogen (nitrate or urea)
Factors Xm PX YXN
CO2 0225 0256 0351
Light intensity 0000 0000 0700
Nitrogen 0922 0947 0000
238
Table 3 Means values of maximum cell concentration (Xm) and cell productivity (PX)
obtained in fed-batch A platensis cultivations carried out at variable light intensity
Light intensity
(mol photons m-2
s-1
)
Xm
(mg L-1
)
PX
(mg L-1
d-1
)
60 2851plusmn54ordf 306plusmn7a
120 3056plusmn115b 443plusmn20
b
240 3180plusmn96b 463plusmn16
b
Values with the same superscript are not significantly different according to the Tukey test
(p gt 005)
2
3
Raquel Pedrosa Bezerra
Cultivo descontiacutenuo alimentado de Arthrospira (Spirulina) platensis em
reator tubular utilizando ureacuteia como fonte de nitrogecircnio e CO2 puro ou
proveniente de fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Comissatildeo Julgadora da
Tese para obtenccedilatildeo do grau de doutor
Prof Dr Joatildeo Carlos Monteiro de Carvalho
orientadorpresidente
Prof Dr Attilio Converti Co-orientador
____________________________
1o examinador
____________________________ 2o examinador
____________________________ 3o examinador
Satildeo Paulo de de 2011
4
Agrave minha famiacutelia que eacute a alegria da minha
vida e me incentiva a seguir esse caminho
5
AGRADECIMENTOS
Ao Prof Dr Joatildeo Carlos Monteiro de Carvalho pela orientaccedilatildeo dedicaccedilatildeo
confianccedila amizade incentivo e paciecircncia que recebi durante os 6 anos de
convivecircncia no laboratoacuterio
Ao Prof Dr Attilio Converti pela orientaccedilatildeo apoio e confianccedila principalmente
durante minha estadia na Itaacutelia
Ao Prof Dr Sunao Sato chefe do setor de Tecnologia de Fermentaccedilotildees do
Departamento Bioquiacutemico-Farmacecircutica da Universidade de Satildeo Paulo-Brasil
Ao Prof Dr Adalberto Pessoa Juacutenior Profa Dr Ana Luacutecia Figueiredo Porto e
Prof Dr Adilson de Castro Chaves pela indicaccedilatildeo do laboratoacuterio e confianccedila
depositada em meu trabalho
Agrave FAPESP pelo auxiacutelio financeiro que permitiu a execuccedilatildeo desse trabalho
Agrave CAPES pela oportunidade de realizar o doutorado sanduiche na Itaacutelia
contribuindo para meu desenvolvimento pessoal e cientiacutefico
Aos meus pais Irene V P Bezerra e Adesson P Bezerra a minha irmatilde ao
meu cunhado e ao meu namorado Paulo Claudino Veacuteras pelo incentivo apoio
confianccedila e felicidade durante todo esse tempo
Aos meus amigos pernambucanos Fernanda Borba Eduardo Correia Anne
Priscila Croacutecia e Anabel Helena que mesmo distante sempre me incentivaram e a
minha amiga Ceacutelia Bolognesi pelos conselhos e palavras de conforto nos momentos
difiacuteceis
A todos os amigos Liacutevia Seno Ciacutenthia Hoch Ana Morocho Mayla Rodrigues
pelo apoio e carinho que me proporcionou durante a poacutes-graduaccedilatildeo e em especial a
Marcelo Chuei Matsudo
As secretaacuterias da poacutes-graduaccedilatildeo do Deptordm de Tecnologia Bioquiacutemico-
Farmacecircutico (FCF-USP) pela dedicaccedilatildeo apoio e por estarem sempre disponiacutevel
para ajudar e aos secretaacuterios da poacutes-graduaccedilatildeo Elaine Midori Ychico e Jorge Alves
de Lima
Aos funcionaacuterios da Biblioteca do Conjunto das Quiacutemicas pela atenccedilatildeo e
disponibilidade de ajuda sempre que precisei
6
RESUMO
A cianobacteacuteria fotossintetizante Arthrospira platensis eacute conhecida por apresentar
em sua biomassa altos teores proteacuteicos (50-70) presenccedila do aacutecido graxo essencial -
linolecircnico e diversas outras substacircncias importantes para a alimentaccedilatildeo humana e
animal Esses micro-organismos satildeo capazes de converter o CO2 em biomassa de
grande potencial na aacuterea de alimentos Durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica a produccedilatildeo de
CO2 eacute da mesma ordem de grandeza da produccedilatildeo de etanol e considerando a crescente
demanda interna e externa por esse combustiacutevel seria importante que houvesse um
processo que fixasse esse CO2 transformando-o em um produto que poderia ser uacutetil para
a nossa populaccedilatildeo Adicionalmente o uso de uma fonte de nitrogecircnio de baixo custo
(ureacuteia) em reatores tubulares contribuiria para a reduccedilatildeo do custo de produccedilatildeo da A
platensis O objetivo desse trabalho foi avaliar os paracircmetros cineacuteticos e bioenergeacuteticos
bem como a composiccedilatildeo centesimal da A platensis cultivadas em biorreator tubular
alimentados com CO2 proveniente de fermentaccedilatildeo alcooacutelica ou com utilizaccedilatildeo de CO2 puro
para o controle do pH sob diferentes intensidades luminosas (I) e fontes de nitrogecircnio (N)
adicionadas por meio de processo descontiacutenuo alimentado Os resultados mostraram que
maiores valores de I proporcionaram maiores valores de concentraccedilatildeo celular maacutexima
(Xm) e produtividade em ceacutelulas (Px) mas natildeo influenciaram nos valores do fator de
conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) As diferentes fontes de CO2 natildeo influenciaram
nos valores de Xm Px YXN O uso da ureacuteia aumentou os valores de YXN em relaccedilatildeo aos
cultivos com NO3- Na composiccedilatildeo centesimal pode-se observar que I influenciou nos
teores de clorofila proteiacutenas e lipiacutedios mas natildeo influenciou nos teores de cinzas e
carboidratos na biomassa final Em relaccedilatildeo aos paracircmetros bioenergeacuteticos dos cultivos
com CO2 puro observou-se que os maiores valores de dissipaccedilatildeo de energia de Gibbs
foram obtidos em tempos mais curtos a 120-240 μmol de foacutetons m-2 s-1
independentemente do N selecionado enquanto que o nuacutemero de moles de foacutetons
absorvidos pelas ceacutelulas para produzir um C-mol de biomassa foi maior nas culturas com
NO3- independentemente do I As fraccedilotildees da energia direcionada para a siacutentese de ATP e
fixada pela ceacutelula foram superiores em culturas com ureacuteia quando comparadas com as
culturas com NO3- que se revelou uma fonte de nitrogecircnio capaz de sustentar o
crescimento energicamente da A platensis
Palavras chaves Arthrospira platensis processo descontiacutenuo alimentado ureacuteia
intensidade luminosa dioacutexido de carbono fermentaccedilatildeo alcooacutelica bioenergeacutetica
7
ABSTRACT
Photosynthetic cyanobacterium A platensis contains in its biomass high protein
content (50-70) -linolenic acid and many other substances important for health
human These microorganisms are capable of converting CO2 into biomass of great
potential in the food industry During the alcoholic fermentation the production of
CO2 has the same magnitude of the production of ethanol Considering the
increasingly global demand for this fuel a process to fix this CO2 is of utmost
importance Furthermore the use of low cost nitrogen source (urea) in tubular
reactors would contribute to reducing the production cost of A platensis Therefore
the purpose of this work was to evaluate the kinetic and bioenergetics parameters as
well as the chemical composition of biomass obtained in A platensis cultures in
tubular bioreactor using CO2 from alcoholic fermentation or pure CO2 to control the
pH under different light intensity (I) and nitrogen sources (N) The results showed that
higher I induced higher maximum cell concentration (Xm) and cell productivity (Px)
values but it did not exert any influence on the nitrogen-cell conversion factor (YXN)
Urea increased the YXN values compared to use of NO3- In the centesimal
composition of biomass it can be observed that I influenced the chlorophyll protein
and lipid contents but not influenced the carbohydrate and ash contents For
bioenergetics parameters it was observed that the highest Gibbs energy dissipation
values for cell growth and maintenance were obtained in shorter time at 120-240
micromol photons m-2 s-1 in both nitrogen sources while the moles of photons absorbed
by the system to produce one C-mol biomass was higher in cultures with NO3- The
highest values of the molar production of O2 and consumption of H+ were obtained at
the highest I values using NO3- The estimated percentages of the energy absorbed
by the cell showed that compared with nitrate the use of urea as nitrogen source
allowed the system to address higher fractions to ATP production and light fixation by
the photosynthetic apparatus as well as a lower fraction released as heat Thanks to
this better bioenergetic situation urea appears to be a quite promising low-cost
alternative nitrogen source for A platensis cultures in photobioreactors
Key words Arthrospira platensis fed batch urea light intensity carbon dioxide
alcoholic fermentation bioenergetic
8
RIASSUNTO
Il cianobatterio fotosintetici Arthrospira platensis ha un alto contenuto di proteine (50-
70) presenza di acidi grassi essenziali come l‟acido -linolenico e altre sostanze
importanti per l‟alimentazione umana ed animale Questi microrganismi convertono CO2 in
biomassa di grande potenzialitagrave nellindustria alimentare Durante la fermentazione
alcolica la produzione di CO2 egrave dello stesso ordine di grandezza della produzione di
etanolo e in considerazione alla crescente necessitagrave interna ed europeo per questo
combustibile sarebbe importante lo svilupo di un processo che fissasse questo CO2
transformandolo in un prodotto che potrebbe essere utile per la nostra popolazione
Inoltre luso di una fonte di azoto a basso costo (urea) in reattori tubolari contribuirebbe a
ridurre il costo di produzione di A platensis Lobiettivo di questo studio egrave di valutare i
parametri cinetici bioenergetiche e la composizione della biomassa ottenuta in colture di
A platensis in bioreattori tubolare alimentato con CO2 puro di cilindro o con CO2 della
fermentazione alcolica per il controllo del pH in diverse intensitagrave di luce (I) e fonti di azoto
(N) usando il processo discontinuo alimentato I risultati hanno dimostrato che valori piugrave
alti di I fornire i piugrave alti valori di concentrazione massima delle cellule (Xm) e la produttivitagrave
delle cellule (Px) ma non influenza i valori del fattore di conversione di azoto nelle cellule
(YXN) Luso di urea come fonte di azoto aumentato i valori di YXN rispetto alle culture con
NO3- La composizione chimica di biomassa puograve osservare che I ha influenzato la
percentuale di clorofilla proteine e lipidi ma non ha influenzato la percentuale di
carboidrati e cenere nella biomassa finale In relazioni ai parametri bioenergetici dei cultivi
usando CO2 di cilindri abbiamo osservato che i piugrave alti valori di dissipazione di energia di
Gibbs per la crescita cellulare e la manutenzione sono stati ottenuti in tempo piugrave brevi nel
120-240 μmol di fotoni m-2 s-1 per entrambe le fonti di N mentre il numero di moli di fotoni
assorbiti dalle cellule por produrre una biomassa C-mol era maggiore nelle culture con
NO3- a prescindere dalla I I valori piugrave alti della produzione molare di O2 e il consumo di H+
sono stati ottenuti con valori piugrave alti di I coltivati con NO3- Le frazioni di energia per la
sintese di ATP e fissato per la cellula erano piugrave alti nelle culture con urea che nelle culture
con NO3- che si egrave rivelata una fonte di azoto in grado di sostenere la crescita di A
platensis
Parole chiave Arthrospira platensis processo discontinuo alimentato urea intensitagrave
luminosa anidride carbonica fermentazione alcolica bioenergetica
9
Lista de graacuteficos
Graacutefico 1 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular de A
platensis 73
Graacutefico 2 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia
Graacutefico 3 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo de clorofila a 77
Graacutefico 4 Logariacutetmico da concentraccedilatildeo celular em funccedilatildeo do tempo 88
Graacutefico 5 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 01 h-1 88
Graacutefico 6 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) Etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 005 h-1 89
Graacutefico 7 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) Etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 0025 h-1 89
Graacutefico 8 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 1 93
Graacutefico 9 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 2 (60 mol de foacutetons m-2 s-1) 94
Graacutefico 10 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 2 95
Graacutefico 11 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 3 96
Graacutefico 12 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 4 (120 mol de foacutetons m-2 s-1) 97
Graacutefico 13 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 4 98
Graacutefico 14 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 5 99
Graacutefico 15 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 6 (120 mol de foacutetons m-2 s-1) 100
Graacutefico 16 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 6 101
Graacutefico 17 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 7 102
Graacutefico 18 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 8 (120 mol de foacutetons m-2 s-1) 103
Graacutefico 19 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 8 104
Graacutefico 20 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 9 105
Graacutefico 21 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 10 (240mol de foacutetons m-2 s-1) 106
Graacutefico 22 concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 10 107
10
Graacutefico 23 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 11 108
Graacutefico 24 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 12 (240 mol de foacutetons m-2 s-1) 109
Graacutefico 25 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 12 110
Graacutefico 26 Energia de Gibbs de dissipaccedilatildeo durante o cultivo de A platensis
intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 ( ) 120 () 240
Fonte de nitrogecircnio nitrato (siacutembolo aberto) ureacuteia (siacutembolo fechado) 144
Graacutefico 27 Influecircncia da velocidade especiacutefica de crescimento da A platensis sobre
o nuacutemero de moles de foacutetons absorvido para produzir 1 C-mol de biomassa em
diferentes condiccedilotildees de cultivo () Composiccedilatildeo elementar da biomass descrita por
Cornet et al (1992) PPFD = 60 μmol de foacutetons m-2 s-1 Composiccedilatildeo elementar da
biomass determinada experimentalmente PPFD (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60
() 120 () 240 Fonte de nitrogecircnio nitrato (siacutembolos abertos) ureacuteia
(siacutembolos fechados) 147
Graacutefico 28 Produccedilatildeo molar de O2 (siacutembolo fechado) e consumo de H+ (siacutembolo
aberto) em funccedilatildeo do tempo em diferentes condiccedilotildees de cultivo Intensidades
luminosas (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 () 120 () 240 Fonte de
nitrogecircnio nitrato (linha rachurada) ureacuteia (linha contiacutenua) 149
Graacutefico 29 Energia total de Gibbs absorvida pelo aparato fotossinteacutetico (siacutembolo
fechado) (ΔGa) e energia transformada em ATP (siacutembolo aberto) (ΔGATP) durante o
cultivo da A platensis intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 (
) 120 () 240 Fonte de nitrogecircnio nitrato (linha tracejada) ureacuteia (linha
continua) 150
Graacutefico 30 Energia fixada pelo aparato fotossinteacutetico (siacutembolo fechado) (ΔH) e
energia liberada como calor (siacutembolo aberto) (Q) durante o cultivo de A platensis
intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 ( ) 120 () 240
Fonte de nitrogecircnio nitrato (linha rachurada) ureacuteia (linha contiacutenua) 151
Graacutefico 31 Porcentagem na distribuiccedilatildeo da energia luminosa absorvida durante o
cultivo de A platensis usando nitrato (siacutembolo fechado) e ureacuteia (siacutembolo aberto)
como fonte de nitrogecircnio Energia fixada pelos fotossistemas () energia
transformada em ATP () energia liberada como calor ( ) 152
Graacutefico 32 Concentraccedilatildeo celular nas duas diferentes configuraccedilotildees dos
fotobiorreatores tubulares ( ) horizontal e ( loz ) espiralado 153
11
Lista de Figuras
Figura 1 Spirulina platensis (UTEX 1926) 22
Figura 2 Principais rotas de assimilaccedilatildeo de nitrogecircnio em cianobacteacuterias cultivas em
pH acima de 92 35
Figura 3 Complexos fotossinteacuteticos em membranas tilacoacuteides 42
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do fotossistema 43
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da fase fotoquiacutemica 44
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da moleacutecula da clorofila a 48
Figura 7 Fotobiorreator tubular horizontal utilizado no cultivo de A platensis 67
Figura 8 Fotobiorreator tubular espiralado utilizado no cultivo de A platensis 68
12
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Produtores representativos de Spirulina 23
Tabela 2 - Planejamento experimental 84
Tabela 3 - Valores da concentraccedilatildeo celular meacutedias e desvio padratildeo em massa
seca obtidas a partir do melaccedilo natildeo clarificado e do melaccedilo clarificado 86
Tabela 4 - Variaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de leveduras em funccedilatildeo do tempo 87
Tabela 5 - Valores de XP ART Etanol e Rendimento do processo no regime
permanente para os diferentes valores de D com ART inicial de 170 gL-1 91
Tabela 6 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de carbonato
total referentes ao experimento 1 93
Tabela 7 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 2 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -44554x3 + 54865x2 + 14317x + 400 (60 mol de foacutetons
m-2 s-1) 94
Tabela 8 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 2 95
Tabela 9 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de carbonato
total referentes ao experimento 3 96
Tabela 10 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 4 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -20689x3 + 11591x2 + 33292x + 400 (60 mol de foacutetons
m-2 s-1) 97
Tabela 11 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 4 98
Tabela 12 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 5 99
Tabela 13 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 6 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -13286x3 + 14486x2 + 62226x + 400 (120 mol de
foacutetons m-2 s-1) 100
Tabela 14 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 6 101
Tabela 15 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 7 102
13
Tabela 16 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 8 de
acordo com a y = - 58128x3 + 38625x2 + 38606x + 400 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
103
Tabela 17 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 8 104
Tabela 18 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 9 105
Tabela 19 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 10
de acordo com a equaccedilatildeo y = -12057x3 + 10082x2 + 31899x + 400 (240 mol de
foacutetons m-2 s-1) 106
Tabela 20 - Valores meacutedios de concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 10 107
Tabela 21 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 11 108
Tabela 22 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 12
de acordo com a equaccedilatildeo y = -82763x3 + 62437x2 + 37265x + 400 (240 mol de
foacutetons m-2 s-1) 109
Tabela 23 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amonia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 12 110
Tabela 24 - Valores da concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) produtividade em ceacutelulas
(Px) e fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) com diferentes fontes de
CO2 fontes de nitrogecircnio e intensidades luminosas 119
Tabela 25 - Anaacutelise de variacircncia para a concentraccedilatildeo celular maacutexima 120
Tabela 26 - Meacutedias da concentraccedilatildeo celular maacutexima para a variaacutevel independente
fonte de nitrogecircnio 120
Tabela 27 - Meacutedias da concentraccedilatildeo celular maacutexima para a variaacutevel independente
intensidade luminosa 121
Tabela 28 - Anaacutelise de variacircncia para a produtividade em ceacutelulas 122
Tabela 29 - Meacutedias da produtividade em ceacutelulas para a variaacutevel independente fonte
de nitrogecircnio 123
Tabela 30 - Meacutedias da produtividade em ceacutelulas para a variaacutevel independente
intensidade luminosa 123
Tabela 31 - Anaacutelise de variacircncia para fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas
126
14
Tabela 32 - Meacutedias do fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas para a variaacutevel
independente fonte de nitrogecircnio 127
Tabela 33 - Meacutedias do fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas para a variaacutevel
independente intensidade luminosa 128
Tabela 34 - Concentraccedilatildeo de clorofila na biomassa final obtida nos experimentos
com o pH controlado com CO2 de cilindro 129
Tabela 35 - Anaacutelise de variacircncia para a concentraccedilatildeo de clorofila na biomassa final
130
Tabela 36 - Porcentagem de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos e cinzas na biomassa
seca final 134
Tabela 37 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de proteiacutena na biomassa final 136
Tabela 38 - Meacutedias do teor de proteiacutena na biomassa final para a variaacutevel
independente intensidade luminosa 136
Tabela 39 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de lipiacutedio na biomassa seca final 138
Tabela 40 - Meacutedias do teor de lipiacutedio na biomassa final para a variaacutevel independente
fonte de nitrogecircnio 138
Tabela 41 - Meacutedias do teor de lipiacutedio na biomassa final para a variaacutevel independente
intensidade luminosa 138
Tabela 42 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de carboidratos na biomassa seca final
141
Tabela 43 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de cinzas na biomassa seca final 142
Tabela 44 - Coeficientes estequiomeacutetricos estimados atraveacutes dos balanccedilos de
materiais de carbono nitrogecircnio oxigecircnio enxofre carga e grau de reduccedilatildeo da
biomassa cultivada em fotobiorreator tubular horizontal utilizando nitrato ou ureacuteia
como fontes de nitrogecircnio 145
15
Lista de abreviaturas e siglas
ART Accediluacutecares redutores totais
VOCs Compostos volaacuteteis orgacircnicos
C Carbono
N Nitrogecircnio
S Enxofre
O Oxigecircnio
H Hidrogecircnio
I Intensidade Luminosa
Ef Concentraccedilatildeo de etanol (g L-1)
fc Fraccedilatildeo em massa do carbono na biomassa seca (g g-1)
fi Fraccedilatildeo em massa do aacutetomo i na biomassa seca (g g-1)
Nt quantidade total de nitrogecircnio adicionado (mg)
Petanol Produtividade em etanol (g L h-1)
PX Produtividade em ceacutelulas (mg L-1 d -1)
Tc Tempo de cultivo (dias)
V Volume do meio (L)
Xi Concentraccedilatildeo celular inicial (mg L-1)
Xm Concentraccedilatildeo celular maacutexima obtida (mg L-1)
XP Meacutedias dos valores de concentraccedilotildees celulares ao longo do regime
permanente
YXN Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (mg mg-1)
Cl Clorofila a
GS glutamina sintetase
GOGAT glutamate sintase
FSII Fotossistema II
FSI Fotossistema I
16
Lista de siacutembolos
max
GXY Rendimento maacuteximo teoacuterico de biomassa sobre a energia de Gibbs
Velocidade especiacutefica de crescimento
1YGX Energia de Gibbs para o crescimento e manutenccedilatildeo celular
c Velocidade da luz (299108 m s-1)
D Vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo (h-1)
h Constante de Planck (662610-34 J)
mG Energia de Gibbs dissipada para a manutenccedilatildeo celular
MMc Massa molar do aacutetomo do carbono (g C-mol-1)
MMi Massa molar do aacutetomo i (g C-mol-1)
NA nuacutemero de Avogadro (6022 x 1023 foacutetons de Einstein -1)
nPh nuacutemero de foacutetons
Q Energia de Gibbs liberada como calor
qH+ Consumo molar de H+
qO2 Produccedilatildeo molar de O2
ΔGa Energia total de Gibbs absorvida pela fotossiacutentese
ΔGATP Energia de Gibbs transformada em ATP
ΔgPh Energia de Gibbs contida em 1 Einsten de foacuteton
ΔH Energia fixada pelos fotosistemas
η Rendimento do processo em etanol ()
λ Comprimento de onda
17
Sumaacuterio
1 Introduccedilatildeo 20
2 Revisatildeo bibliograacutefica 22
21 Caracteriacutesticas da A platensis22
22 Fotobiorreatores26
23 Processos de cultivo em fotobiorreatores31
24 Nutrientes para o crescimento da A platensis 33
241 Fontes de Nitrogecircnio33
242 Intensidade luminosa41
2421 Pigmentos 46
243 Fontes de carbono 50
2431 Fonte de carbono orgacircnico (Crescimento hetorotroacutefico) 50
2432 Fonte de carbono inorgacircnico (Crescimento autotroacutefico) 51
2433 Fonte de carbono inorgacircnico e orgacircnico simultaneamente (Crescimento
mixotroacuteficos) 54
3 Objetivos61
4 Materiais e meacutetodos 62
41 Fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua62
411 Testes preliminares para emprego da fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
62
4111 Teste para avaliar a influecircncia do tratamento do melaccedilo na determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo celular62
41111 Melaccedilo natildeo tratado62
41112 Melaccedilo tratado 62
41113 Preparaccedilatildeo do melaccedilo63
4112 Teste para avaliar a homogeneidade do reator 63
4113 Teste para determinar a vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo 63
412 Micro-organismo e condiccedilotildees de manutenccedilatildeo63
413 Preparo do inoacuteculo64
414 Dispositivo para a cultura 64
415 Descriccedilatildeo das condiccedilotildees de fermentaccedilatildeo contiacutenua64
42 Cultivo de A platensis65
421 Micro-organismo e manutenccedilatildeo 65
18
422 Meio de cultivo65
4221 Meio padratildeo para cultivo de A platensis 65
4222 Meio modificado66
423 Preparo do inoacuteculo66
424 Dispositivo da cultura67
4241 Fotobiorreator tubular horizontal67
4242 Fotobiorreator tubular espiralado68
425 Descriccedilatildeo de um experimento tiacutepico de cultivo da A platensis68
43 Teacutecnicas Analiacuteticas69
431 Acompanhamento da fermentaccedilatildeo alcooacutelica70
4311 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular70
4312 Determinaccedilatildeo do pH70
4313 Determinaccedilatildeo de ART70
4314 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol71
4315 Determinaccedilatildeo dos componentes volaacuteteis presentes no gaacutes efluente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua72
432 Acompanhamento do cultivo de A platensis72
4321 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular 72
43211 Densidade oacutetica 72
43212 Construccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo 73
4322 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de carbonato total 73
4323 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia total74
4324 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia75
4325 Determinaccedilatildeo do pH76
4326 Determinaccedilatildeo de nitrato76
4327 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol76
433 Avaliaccedilatildeo da biomassa de A platensis obtida no final do cultivo76
4331 Determinaccedilatildeo de Clorofila a 76
43311 Curva de calibraccedilatildeo para a determinaccedilatildeo de Clorofila a 77
4332 Determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal 77
43321 Proteiacutenas totais78
43322 Lipiacutedios totais78
43323 Cinzas78
43324 Carboidratos totais 79
19
434 Avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo elementar 79
4341 Determinaccedilatildeo de CNHS 79
4342 Determinaccedilatildeo de oxigecircnio 79
44 Caacutelculos 79
441 Produtividade em etanol no regime permanente 79
442 Rendimento do etanol no regime permanente 80
443 Produtividade em ceacutelulas nos cultivos de A platensis 80
444 Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas nos cultivos de A
platensis 80
445 Coeficientes atocircmicos para 1 C-mol de biomassa 81
446 Grau de reduccedilatildeo da biomassa82
45 Teoria dos paracircmetros bioenergeacuteticos 82
5 Planejamento experimental84
6 Resultados e discussotildees85
61 Testes preliminares para a realizaccedilatildeo da fermentaccedilatildeo alcooacutelica 85
611 Avaliaccedilatildeo da influecircncia da clarificaccedilatildeo do melaccedilo na determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo celular 86
612 Teste de homogeneidade do reator87
613 Avaliaccedilatildeo de diferentes vazotildees especiacuteficas de alimentaccedilatildeo (D) 88
614 Avaliaccedilatildeo dos volaacuteteis orgacircnicos no gaacutes de arraste92
62 Avaliaccedilatildeo do crescimento da A platensis 93
63 Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) Produtividade em
ceacutelulas (Px) e Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas
(YXN) 119
631 Concentraccedilatildeo celular maacutexima 119
632 Produtividade volumeacutetrica de ceacutelulas 122
633 Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas 125
64 Avaliaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de clorofila a 129
65 Avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal 134
66 Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros bioenergeacuteticos 143
67 Comparaccedilatildeo entre os fotobiorreatores 153
7 Conclusotildees 154
20
1 Introduccedilatildeo
O interesse na produccedilatildeo comercial da Spirulina sp eacute devido a algumas
propriedades particulares como alta digestibilidade menor concentraccedilatildeo de aacutecidos
nucleacuteicos teores de proteiacutenas elevados (50-70 da massa seca) e importacircncia
quantitativa de aminoaacutecidos essenciais Na sua biomassa encontram-se tambeacutem
pigmentos como a clorofila ficocianina e -caroteno aacutecidos graxos essenciais como
γ-linolecircnico o qual possui efeito terapecircutico em humanos (BELAY OTA 1994)
vitaminas e antioxidantes (PULZ SCHEIBENBOGEN 1998)
Tradicionalmente a Spirulina (Arthrospira) eacute cultivada autotroficamente na
presenccedila de altos niacuteveis de carbonatos e bicarbonatos como fontes de carbono por
serem de baixo custo e proporcionarem pH elevado no meio No entanto Spirulina
ssp tambeacutem podem crescer em condiccedilotildees mixotroacuteficas podendo apresentar uma
produtividade maior quando comparadas a cultivos fotoautotroacuteficos ou heterotroacuteficos
(OGBONNA et al 2000)
Em condiccedilotildees mixotroacuteficas eou fotoautotroacuteficas a intensidade luminosa eacute um
fator importante no crescimento celular da A platensis Baixas intensidades
luminosas podem limitar o crescimento celular Por outro lado altas intensidades
luminosas podem inibir o crescimento celular devido ao fenocircmeno de fotoinibiccedilatildeo
Por isso esse eacute um fator que deve ser controlado em cultivos de micro-organismos
fotossintetizantes
O pH do meio de cultivo eacute um outro fator no cultivo de micro-organismos O pH
determina a solubilidade do dioacutexido de carbono e minerais no meio de cultura e
influencia diretamente ou indiretamente no metabolismo dos micro-organismos
fotossintetizantes Durante o cultivo autotroacutefico da Spirulina sp ocorre um raacutepido
aumento do pH no meio de cultura o que pode atuar como um autoinibidor do
crescimento celular (RICHMOND 2000) e portanto o CO2 pode ser utilizado para a
manutenccedilatildeo do pH oacutetimo
A biofixaccedilatildeo do CO2 pelas microalgas estatildeo entre os meacutetodos bioloacutegicos mais
produtivos no tratamento de emissotildees de resiacuteduos industriais e o rendimento da
biomassa por hectare eacute maior quando comparadas a plantaccedilotildees na agricultura
(LAW BERNING 1991 AKIMOTO et al 1994) O uso direto dos resiacuteduos volaacuteteis
reduz os custos de preacute-tratamento mas a alta concentraccedilatildeo de CO2 pode inibir o
crescimento de cianobacteacuterias e microalgas No entanto alguns autores tecircm
21
recentemente relatado o isolamento de cianobacteacuterias e microalgas tolerantes a
altas concentraccedilotildees de CO2 e capazes de fixar esse gaacutes tais como Chlorella
Spirulina e Scenedesmus (CHANG et al 2003 WATANABE HALL 1995a
HANAGATA et al 1992) Cyanidium cladarium (AKIMOTO et al 1994)
Aleacutem do CO2 a fonte de nitrogecircnio tambeacutem eacute um fator determinante no cultivo
uma vez que este nutriente eacute utilizado principalmente para constituir proteiacutenas e
aacutecidos nucleacuteicos fundamentais para a manutenccedilatildeo e crescimento celular
(WATANABE HALL 1996) O meio de cultura convencional para a obtenccedilatildeo da S
platensis utiliza sais de nitrato como fonte de nitrogecircnio como por exemplo nitrato
de potaacutessio e nitrato de soacutedio Ureacuteia (DANESI et al 2002 SOLETTO et al 2005) e
sais de amocircnio (CARVALHO et al 2004 SOLETTO et al 2005) tecircm sido
pesquisadas como fontes alternativas de nitrogecircnio para o cultivo de S platensis
No caso de fontes de nitrogecircnio amoniacais o emprego dos reatores tubulares
pode ser considerado como uma vantagem por favorecer baixa perda de amocircnia
por volatilizaccedilatildeo reduzindo a necessidade de adiccedilatildeo de fonte de nitrogecircnio como
consequumlente reduccedilatildeo do custo de produccedilatildeo Assim pode-se concluir que os
esforccedilos em melhoria de condiccedilotildees de cultivo de A platensis natildeo sejam apenas
utilizando reatores abertos mas tambeacutem reatores fechados dentre os quais os
tubulares
O dioacutexido de carbono e os compostos volaacuteteis orgacircnicos (CVOs) de
fermentaccedilatildeo alcooacutelica podem ser utilizados como fontes de carbono no cultivo de A
platensis Durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica industrial toneladas de CO2 etanol e em
menor quantidade alguns CVOs satildeo liberados para a atmosfera como resiacuteduos No
entanto esses compostos podem ser reaproveitados como uma fonte de nutriente
juntamente como uma fonte de nitrogecircnio de baixo custo (ureacuteia) para o
desenvolvimento da A platensis que por sua vez permite a produccedilatildeo de
componentes com alto valor agregado e com menor custo de produccedilatildeo industrial
22
2 Revisatildeo bibliograacutefica
21 Caracteriacutesticas da A platensis
Arthrospira platensis eacute uma cianobacteacuteria filamentosa fotossintetizante
pertencente da ordem Oscillatoriales famiacutelia Cyanophyceae gecircnero Arthrospira
espeacutecie platensis Satildeo caracterizadas por tricomas ciliacutendricos multicelulares com
formas espiraladas (Figura 1) Estes possuem comprimentos de aproximadamente
500 μm e diacircmetro variando de 6-12 μm mas dependendo das condiccedilotildees de cultivo
podem adquirir morfologias diferentes Os filamentos natildeo possuem ramificaccedilotildees
nem heterocistos (TOMASELLI 1997)
Figura 1 Spirulina platensis (UTEX 1926) Fonte Universidade do Texas 2006
Arthrospira pode controlar sua flutuabilidade com vesiacuteculas gasosas para
receber a incidecircncia luminosa oacutetima para a fotossiacutentese Essas ceacutelulas podem
tambeacutem excretrar polissacariacutedeos extracelulares para formar agregados flutuantes
um fato que facilita sua recuperaccedilatildeo em lagos naturais e culturas outdoors (MATA
2007) Aleacutem disso devido a sua morfologia taxa de crescimento celular
relativamente alta e a caracteriacutestica das ceacutelulas se agregarem o custo operacional
para a recuperaccedilatildeo da biomassa eacute reduzido tornando-a economicamente viaacutevel
para a produccedilatildeo industrial (MATA 2007)
A Arthrospira sp eacute comercializada de forma inadequada com o nome de
Spirulina (GARRITY et al 2001) Atualmente a Arthrospira sp eacute produzida em
diferentes paiacuteses e sua produccedilatildeo mundial pode exceder 3000 toneladas
(SHIMAMATSU 2004) Na Tabela 1 estatildeo descritos algumas induacutestrias produtoras
de Spirulina (Arthrospira) sp e seu respectivo paiacutes
23
Tabela 1 - Produtores representativos de Spirulina
Induacutestria Paiacutesterritoacuterio
Spirulina Mexicana (Sosa Texcoco) SA
Meacutexico a
Siam Algae Co Ltd Thailand
Earthrise Farms USA
Cyanotech Corporation USA
Nan Pao Resins Chemical Co Ltd Taiwan
Far East Microalgae Co Ltd Taiwan
Parry Agro Industries Ltd (Parry Nutraceuticals)
Iacutendia
Yunnan Spirin Co Ltd Mainland China
Fonte Shimamatsu 2004 a Essa induacutestria faliu por volta do ano de 1990 (LEE 1997)
A biomassa da Spirulina sp eacute comercializada principalmente como alimentos
para seres humanos e animais devido a sua composiccedilatildeo quiacutemica A seguranccedila
como alimento tem sido estabelecida por seacuteculos atraveacutes do consumo pelos seres
humanos e pelos nuacutemerosos estudos toxicoloacutegicos (CHAMORRO et al 2002)
Na China em 1997 existiam cerca de 80 produtores de Spirulina com
produccedilatildeo anual variando de 3 a 500 toneladas A maioria dos produtores se
localizava no sul devido agrave vantagem de possuir verotildees longos e clima temperado
(LEE 1997) O maior produtor mundial de Arthrospira eacute Hainan Simai Enterprising
que estaacute localizado na provincia de Hainan na China Essa companhia tem uma
produccedilatildeo anual de 200 toneladas (SPOLAORE et al 2006) No Japatildeo de acordo
com Healfh Industry News a quantidade total de Spirulina comercializada foi de 400
toneladas em 1996 Em Taiwan 5 induacutestrias produzem um total de 480 toneladas
Na Tailacircndia os dois maiores produtores de Spirulina (Siam Algae Co Ltd e
Neotech Food Co Ltd) produzem 150 toneladas e 20 toneladas por ano
respectivamente Nos Estados Unidos a Cyanotech e a Earthrise Farms satildeo os dois
maiores produtores de Spirulina com produccedilatildeo de 380 toneladas e 500 toneladas
respectivamente Aleacutem dessas induacutestrias citadas acima existem outras produtoras
de Spirulina com uma produccedilatildeo anual menor em diversos paiacuteses como Chile Cuba
Filipinas Iacutendia (LEE 1997)
O potencial dessas cianobacteacuterias como um alimento baacutesico na dieta humana
tem sido investigado haacute muitos anos em diversos paiacuteses No Japatildeo a biomassa
24
algal (por exemplo Chlorella e Spirulina) eacute produzida comercialmente sendo
utilizada primeiramente como alimentos nutracecircuticos ou funcionais (OGBONNA
TANAKA 1997 BOROWITZKA 1986) Na China Spirulina and Chlorella satildeo os
dois maiores gecircneros cultivado na forma de biomassa ou extrato para a induacutestria
alimentiacutecia A biomassa eacute usada para produzir uma variedade de produtos
nutracecircuticos ou funcionais como tabletes caacutepsulas poacute ou para extraccedilatildeo de
ingredientes bioativos como β-caroteno e ficocianina A biomassa eacute suplementada
em patildees biscoitos doces sorvetes e o extrato satildeo suplementados em bebidas
como refrigerantes e chaacute principalmente para realccedilar seu valor nutritivo (LIANG et
al 2004)
Uma ampla variedade de pigmentos como clorofila a (Cl a) luteiacutena -caroteno
ficocianina (PC) e aloficocianina (APC) satildeo compostos bioativos na biomassa de S
platensis e tem sido usado como corantes naturais em alimentos em cosmeacuteticos e
como produtos farmacecircuticos no consumo humano e animal (CHEN et al 2006) O
efeito nocivo de corantes sinteacuteticos e a tendecircncia da sociedade utilizar produtos
naturais na alimentaccedilatildeo e cosmeacuteticos tecircm conduzido agrave exploraccedilatildeo das microalgas
como corantes naturais Esses pigmentos tecircm um grande valor comercial como
corantes naturais em induacutestrias nutracecircuticas cosmeacuteticas e farmacecircuticas
(PRASANNA et al 2007)
Recentemente a importacircncia de se estudar esses micro-organismos eacute devido
as suas propriedades terapecircuticas (BELAY et al 1993) e presenccedila de compostos
antioxidantes (ESTRADA et al 2001 MIRANDA et al 1998) Essas propriedades
tecircm sido provadas experimentalmente in vivo e in vitro que satildeo efetivas para o
tratamento de algumas alergias anemia doenccedilas virais e cardiovasculares
hiperglicemia hiperlipidemia processos inflamatoacuterios entre outros (CHAMORRO et
al 2002 BELAY et al 2002)
Essa cianobacteacuteria possui alto teor proteacuteico com importacircncia quantitativa dos
aminoaacutecidos essenciais e outros elementos nutricionais proporcionando seu alto
valor nutricional (MORIST et al 2001) Baixos teores de aacutecidos nucleacuteicos altos
conteuacutedos de vitaminas polissacariacutedeos e aacutecidos graxos essenciais como ocircmega-3
e ocircmega-6 satildeo paracircmetros importantes para avaliar a qualidade da biomassa algal
(OGBONNA TANAKA 1997 BOROWTIZKA 1986) Os polissacariacutedeos que
constituem a parede celular tecircm uma digestibilidade de 86 o que torna a biomassa
facilmente absorvida pelo corpo humano (LI 1997)
25
Haacute relatos tambeacutem do emprego da Arthrospira em cosmeacuteticos um extrato rico
em proteiacutenas feitos a partir da Arthrospira repara sinais de envelhecimento da pele
mais cedo exerce um efeito de firmeza e previne a formaccedilatildeo de estrias (Protulinesreg
Exsymol SAM Monaco) (SPOLAORE et al 2006)
Aleacutem da presenccedila dos compostos citados anteriomente a biomassa de
Spirulina tambeacutem pode ser utilizada no tratamento de aacuteguas residuais renovaccedilatildeo da
aacutegua atraveacutes da desintoxificaccedilatildeo bioloacutegica e remoccedilatildeo de metais pesados Por ser
um micro-organismo fotossintetizante tem a capacidade natildeo apenas de produzir
oxigecircnio mas tambeacutem de remover nutrientes como nitrogecircnio e foacutesforo reduzindo a
eutrofizaccedilatildeo dos efluentes Essa biomassa pode ser recuperada e utilizada para
extrair compostos de interesse industrial como por exemplo pigmentos e o restante
da biomassa pode ainda ser utilizado como combustiacutevel ou para produccedilatildeo de
metano (CIFERRI TIBONI 1985)
O cultivo de microalgas e cianobacteacuterias fornecem excelente perspectivas para
a produccedilatildeo de energia renovaacutevel podendo contribuir substancialmente para uma
reduccedilatildeo de emissotildees do CO2 Essas emissotildees satildeo resultados do processo de
queima dos combustiacuteveis foacutesseis e de praacuteticas agriacutecolas improacuteprias (as queimadas
por exemplo) produzindo elevados rendimentos da biomassa e possibilitando a
produccedilatildeo de compostos com alto valor agregado e biocombustiacutevel (CHISTI 2007
RICHMOND 1990)
As microalgas tecircm sido propostas como mateacuteria-prima para a produccedilatildeo de
biocombustiacuteveis devido ao alto teor de lipiacutedios que algumas espeacutecies podem
alcanccedilar O teor de oacuteleo de 20 a 50 de sua biomassa seca eacute comum entre as
espeacutecies como Nannochloropsis sp Chlorella sp Schizochytrium sp Algumas
microalgas podem exceder a 80 (MIAO 2006 CHISTI 2007 BANERJEE et al
2002) O percentual de lipiacutedios na biomassa de microalgas eacute funccedilatildeo das condiccedilotildees
de cultivo tais como salinidade do meio concentraccedilatildeo de nitrogecircnio natureza da
fonte de carbono assim eacute possiacutevel com certa facilidade e com tempo de resposta
relativamente curto aumentar o teor de oacuteleo nas microalgas de forma a alcanccedilar
valores bastante expressivos (CHISTI 2007)
As principais vantagens para a utilizaccedilatildeo de microalgas como biocombustiacuteveis
satildeo alta eficiecircncia de conversatildeo de foacutetons (como evidenciada pelo aumento do
rendimento da biomasa por hectare) podem ser coletados em lotes durante quase
todo o ano pode utilizar sais e aacutegua residuaacuteria reduzindo extremamente o uso de
26
aacutegua doce produz biocombustiacutevel altamente biodegradaacutevel e natildeo toacutexico podem ser
usado o CO2 liberado pela queima de combustiacuteveis foacutesseis esse CO2 eacute
frequentemente disponiacutevel a baixo custo ou ateacute mesmo sem custo (CHISTI 2007
SAWAYAMA et al 1995 SCHENK et al 2008 YUN et al 1997) As limitaccedilotildees
atuais existentes satildeo principalmente no processo de colheita e na fonte do CO2 para
a maior eficiecircncia de produccedilatildeo (SCHENK et al 2008)
22 Fotobiorreatores
A escolha do biorreator para o cultivo da microalga eacute um importante fator que
influecircncia na produtividade global (WATANABE HALL 1996) Haacute uma grande
variedade de biorreatores utilizados para o cultivo de microalga dentre os quais
alguns satildeo utilizados atualmente para produccedilatildeo industrial (LEE 2001)
Segundo Borowitzka (1999) as microalgas podem ser cultivadas em diversos
sistemas de cultivo com volume variando desde poucos litros ateacute bilhotildees de litros
Em geral os sistemas de produccedilatildeo satildeo pouco sofisticados uma vez que muitas
empresas desenvolvem cultivos a ceacuteu aberto em tanques com fundo de terra e com
baixo ou nenhum controle dos paracircmetros ambientais Nos uacuteltimos 50 anos alguns
cultivos desenvolvidos em fotobiorreatores podem ter os seus paracircmetros
ambientais controlados e isto implica numa elevada produtividade a qual viabiliza a
produccedilatildeo comercial de compostos de elevado valor agregado (KOMMAREDDY
ANDERSON 2005 TREDICI 2004)
Convencionalmente os cultivos de microalgas comerciais satildeo realizados em
reatores abertos por causa de baixa eficiecircncia dos fotobiorreatores fechados em
larga escala (OGBONNA TANAKA 1997) Portanto eacute difiacutecil de obter alta
produtividade em reatores ldquooutdoorsrdquo abertos por causa da dificuldade de controlar
fatores ambientais como temperatura e intensidade luminosa haacute uma grande
evaporaccedilatildeo de aacutegua no meio e aleacutem disso requer uma grande aacuterea superficial
facilitando a contaminaccedilatildeo por outros micro-organismos Esse meacutetodo natildeo deve ser
empregado para produccedilatildeo de componentes quiacutemicos finos e farmacecircuticos uma
vez que o custo de recuperaccedilatildeo desse produto e purificaccedilatildeo podem ser
extremamente altos principalmente devido a baixa concentraccedilatildeo celular e a
contaminaccedilatildeo com impurezas Vaacuterias alternativas tecircm sido propostas para contornar
esse problema como o emprego de fotobiorreatores fechados e processos
heterotroacuteficos (CHEN 1997)
27
Os fotobiorreatores abertos possuem certas desvantagens sobre os
fotobiorreatores fechados dentre elas destacam-se menor eficiecircncia fotossinteacutetica e
menor qualidade do produto da microalga (RICHMOND et al 1990 VONSHAK
RICHOMOND 1988) A menor eficiecircncia fotossinteacutetica eacute principalmente devido ao
efeito de sombreamento quando a densidade celular alcanccedila um determinado valor
a baixa eficiecircncia de utilizaccedilatildeo de CO2 gasoso devido agrave limitaccedilatildeo do suplemento de
CO2 para a microalga uma vez que quando o CO2 natildeo estaacute dissolvido no meio de
cultura este se volatiliza contaminaccedilatildeo do cultivo por bacteacuterias algas protozoaacuterios
e fungos tambeacutem influenciam no crescimento da microalga e na qualidade do
produto Os fotobiorreatores fechados tecircm a vantagem de aumentar a eficiecircncia de
utilizaccedilatildeo de CO2 controlando o pH da cultura e diminuir o niacutevel de contaminantes
(WATANABE HALL 1996) Tambeacutem dependendo da configuraccedilatildeo do reator pode
aumentar a aacuterea iluminada reduzindo o efeito de sombreamento (WATANABE et al
1995)
Fotobiorreatores fechados satildeo usados para cultivos de micro-organismos
fotoautotroacuteficos visando agrave produccedilatildeo de aacutecidos graxos poliinsaturados pigmentos
vitaminas e polissacariacutedeos (MOLINA GRIMA et al 1995 TAKANO et al 1995
MERCHUK et al 1996 MATSUNAGA et al 1996) Para muitas dessas aplicaccedilotildees
eacute essencial o uso desses tipos de fotobiorreatores nos quais as monoculturas
podem ser mantidas por longos periacuteodos preferencialmente se o cultivo for
ldquooutdoorrdquo utilizando luz solar como a uacutenica fonte de energia (JANSSEN et al 2003)
Diversas configuraccedilotildees de fotobiorreatores fechados tecircm sido usadas ou
propostas para o cultivo de Spirulina sp como o tubular horizontal (CONVERTI et
al 2006a) tubular helicoidal (BIOCOIL) (WATANABE et al 1995 NERANTZIS et
al 2002) espiralado vertical (TREDICI ZITTELLI 1998) e laminar inclinado (HU et
al 1996) Quase todas as configuraccedilotildees dos fotobiorreatores usam um recipiente
de degassing para desoxigenar o sistema pois um aumento no niacutevel de oxigecircnio no
meio reduz a produtividade (NERANTZIS et al 2002)
Um fator importante para a configuraccedilatildeo desses fotobiorreatores eacute o
fornecimento de luz eficientemente pela maximizaccedilatildeo da relaccedilatildeo superfiacutecie-volume
iluminada Por isso os tubos satildeo frequentemente estreitos e os ldquopanelsrdquo satildeo finos
No entanto alguns fotobiorreatores bem sucedidos em escala laboratorial podem
natildeo funcionar bem quando se aumenta a escala por causa da reduccedilatildeo da relaccedilatildeo
28
superfiacutecie-volume ocasionando uma pobre distribuiccedilatildeo luminosa dentro do reator
(OGBONNA TANAKA 1997)
Tredici e Zittelli (1998) observaram que cultivos de Arthrospira (Spirulina)
platensis em fotobiorreator tubular obtiveram maiores valores de produtividade
volumeacutetrica eficiecircncia fotossinteacutetica e velocidade especiacutefica de crescimento quando
comparadas com os cultivos em fotobiorreator plano Isso foi devido agrave diferenccedila
entre o fluxo de foacutetons nos cultivos com formas diferentes dos fotobiorreatores Uma
vez que os outros principais paracircmetros que conduzem o crescimento da S
platensis natildeo variaram entre os dois cultivos
Entre os diferentes tipos de fotobiorreatores aqueles do tipo air lift satildeo
particularmente interessantes por apresentarem uma maior transferecircncia de massa
liacutequido-gaacutes com menor gasto de energia podem ter o escoamento do liacutequido
facilmente controlado a circulaccedilatildeo de liacutequidos ocorre sem a remoccedilatildeo de partes do
reator e isto previne a contaminaccedilatildeo no cultivo Estes tipos de reatores satildeo
especialmente recomendados para as culturas de cianobacteacuterias por causa da
sensibilidade destas ao estresse de cisalhamento mecacircnico (CHOI et al 1995
SIEGEL ROBINSON et al 1992 CHISTI 1989 MERCHUK et al 1996
WATANABE et al 1995)
O sistema air lift tambeacutem permite a remoccedilatildeo de oxigecircnio produzido pela
fotossiacutentese (CAMACHO RUBIO et al 1998) A remoccedilatildeo contiacutenua do gaacutes oxigecircnio
em cultivos fotossinteacuteticos eacute essencial por que uma excessiva quantidade de
oxigecircnio dissolvido inibe a fotossiacutentese (MOLINA et al 2001)
O crescimento e a produtividade das ceacutelulas fotossinteacuteticas satildeo afetados por
diversos fatores incluindo composiccedilatildeo do meio de cultura temperatura pH
concentraccedilatildeo de O2 e CO2 no reator e fornecimento de luz sendo este o mais
importante durante o cultivo autotroacutefico de ceacutelulas fotossinteacuteticas (OGBONNA
TANAKA 1997)
Micro-organismos natildeo satildeo expostos a uma densidade de fluxo de foacutetons
constante em fotobiorreatores devido ao sombreamento muacutetuo das ceacutelulas e ao
movimento do liacutequido durante a agitaccedilatildeo Frequumlentemente tem sido sugerido que a
circulaccedilatildeo entre as zonas clara e escura poderia conduzir a uma eficiecircncia
fotossinteacutetica maior que aquela determinada sob iluminaccedilatildeo contiacutenua da densidade
de fluxo de foacutetons (JANSSEN et al 2003)
29
O fornecimento da luz em fotobiorreatores eacute uma variaacutevel importante em
culturas fotoautroacuteficas A alta razatildeo superfiacutecie-volume eacute um preacute-requisito importante
para o suprimento suficiente de luz nos fotobiorreatores Ateacute mesmo sob baixa
intensidade luminosa os organismos fotossintetizantes utilizam a luz exposta na
superfiacutecie dos fotobioreatores A energia de excitaccedilatildeo eacute parcialmente utilizada pelo
aparato fotossinteacutetico e a energia residual eacute perdida na forma teacutermica ou
fluorescecircncia (GRUSZECKI et al 1994) Um excesso da energia de excitaccedilatildeo pode
prejudicar o aparato fotossinteacutetico no processo chamado de fotoinibiccedilatildeo (MELIS
1999)
Dependendo do diacircmetro interno dos tubos (12 a 123 cm) os fotobiorreatores
tubulares fechados podem alcanccedilar valores de concentraccedilatildeo celular maiores que 20
g L-1 e produtividades volumeacutetricas de biomassa de 025 - 364 g L-1d-1 em cultivo
que possuem o ciclo claroescuro A alta turbulecircncia encontrada em reatores
tubulares garante uma oacutetima disponibilidade luminosa para as ceacutelulas e melhor
transferecircncia de massa dos gases (LEE 2001)
Outro fator importante eacute o escoamento turbulento da cultura A velocidade do
escoamento do liacutequido deve ser suficiente para garantir o escoamento turbulento
para evitar que as ceacutelulas fiquem estagnadas no interior escuro dos tubos Portanto
uma turbulecircncia execessiva pode danificar as ceacutelulas e haacute um limite superior para a
velocidade da cultura A turbulecircncia eacute conhecida por aumentar a produtividade da
biomassa quando comparada as condiccedilotildees de escoamento laminar A turbulecircncia
move as ceacutelulas do interior escuro de um tubo para uma zona perifeacuterica iluminada
evitando que as ceacutelulas natildeo recebam luz por longos periacuteodos Adicionalmente o
movimento das ceacutelulas da zona clara para a zona escura pode aumentar a
produtividade desde que a duraccedilatildeo de permanecircncia na zona escura seja curta
Intervalos no escuro na ordem de 1 segundo podem melhorar a conversatildeo da
energia solar em biomassa (LAWS et al 1987 TERRY 1986) Tais intervalos
permitem reaccedilotildees cataliacuteticas da fotossiacutentese no escuro permitindo o
restabelecimento do aparato fotossinteacutetico para sua eficiecircncia no proacuteximo periacuteodo
luminoso (ACIEacuteN FERNAacuteNDEZ et al 2001) Jansen et al (2002) relataram que a
turbulecircncia movimenta as ceacutelulas da zona escura no centro do fotobiorreator para a
zona foacutetica na parte mais externa do cilindro podendo conduzir a maior eficiecircncia do
reator
30
O fluxo laminar pode ser prejudicial agraves altas densidades celulares No entanto
eacute importante por proporcionar uma distribuiccedilatildeo uniforme da luz a todas as ceacutelulas na
cultura reduzir o crescimento da parede do fotobiorreator e diminuir a tensatildeo do
oxigecircnio na cultura (RICHMOND 2000) Carlozzi e Torzillo (1996) obtiveram maior
produtividade da Arthrospira platensis quando a velocidade da cultura densa (10 g L-1)
foi alterada de 018 m s-1 para 075 m s-1 Isto torna evidente a necessidade de se
manter uma velocidade de escoamento que permita um maior nuacutemero de ceacutelulas
captarem luminosidade suficiente e que ao mesmo tempo natildeo aumente a demanda
dos custos de produccedilatildeo
Converti et al (2006) observaram que cultivos de Arthrospira platensis em
fotobiorreator tubular a velocidade da cultura de 016 m s-1 eacute suficiente para garantir
uma boa mistura da cultura evitando danos agraves ceacutelulas Similarmente Tredici (1999)
descreve que cultivos em escala industrial de Arthrospira sp em fotobiorreator com
tubos plaacutesticos alongados sobre a terra com 35 cm de largura e 9 cm de altura a
densidade populacional oacutetima foi de 1 g Lminus1 e a velocidade do fluxo natildeo pode ser
menor que 50 cm sminus1 Baixa velocidade de circulaccedilatildeo 6 a 10 cm sminus1 prejudicou o
cultivo devido a produccedilatildeo O2 que inibiu o crescimento baixas taxas de saiacuteda e a
cultura deteriorou-se rapidamente devido ao seu crescimento na parede do tubo
(biofouling)
Como o crescimento dos micro-organismo fotossintetizantes nos
fotobiorreatores eacute fotossinteacutetico o suplemento de luz e CO2 satildeo provavelmente os
limitantes para o crescimento da microalga Aleacutem desses fatores a concentraccedilatildeo de
nitrogecircnio tambeacutem eacute um fator determinante no cultivo uma vez que este nutriente eacute
utilizado principalmente para constituir proteiacutenas e aacutecidos nucleacuteicos fundamentais
para a manutenccedilatildeo e crescimento celular (WATANABE HALL 1996)
No caso de fontes de nitrogecircnio amocircniacais o emprego dos reatores tubulares
pode ser considerado como uma vantagem por favorecer baixa perda de amocircnia
por volatilizaccedilatildeo reduzindo a necessidade de adiccedilatildeo de fonte de nitrogecircnio como
consequumlente reduccedilatildeo do custo de produccedilatildeo Assim pode-se concluir que os
esforccedilos em melhoria de condiccedilotildees de cultivo de A platensis natildeo sejam apenas
utilizando reatores abertos mas tambeacutem reatores fechados dentre os quais os
tubulares
31
23 Processos de cultivo em fotobiorreatores
S platensis habita naturalmente em lagos africanos e mexicanos (RICHMOND
1990) mas podem crescer artificialmente em meios sinteacuteticos empregando
diferentes tipos de processos de cultivo Estes tecircm sido desenvolvidos com a
finalidade de aumentar a produtividade do material desejado Segundo Sassano
(1999) a forma de adiccedilatildeo do substrato nas dornas pode interferir na qualidade da
biomassa produzida
No processo contiacutenuo eacute realizado por meio de uma alimentaccedilatildeo contiacutenua do
substrato limitante (ou meio de cultura) ao reator a uma determinada vazatildeo
constante e por uma retirada contiacutenua de meio cultivado de forma a se ter o volume
de reaccedilatildeo constante a fim de que o sistema atinja a condiccedilatildeo de estado
estacionaacuterio (steady-state) Esse estado consiste na situaccedilatildeo nas quais todas as
condiccedilotildees no interior do reator permanecem constantes ao longo do tempo
(FACCIOTTI 2001) Esse processo tem sido estudado por diferentes autores
comprovando sua aplicabilidade para no cultivo de Spirulina platensis Hirata et al
(1998) obtiveram concentraccedilotildees de S platensis sob condiccedilotildees fotoautotroacuteficas em
regime permanente nas diferentes intensidades luminosas analisadas 25 a 400 W
m-2 Nerantzis et al (2002) empregou o sistema contiacutenuo no fotobiorreator tubular
helicoidal (HELPBR) no cultivo de S platensis e provou sua flexibilidade ao aumento
de escala bem como sua alta produtividade volumeacutetrica em relaccedilatildeo a outros
fotobiorreatores fechados
Outro tipo de processo que tem sido utilizado no cultivo de S platensis em
fotobiorreatores eacute o semicontiacutenuo Esse processo consiste na alimentaccedilatildeo contiacutenua
do substrato limitante mas a remoccedilatildeo do produto eacute por bateladas (alimentaccedilatildeo
contiacutenua com descarga apoacutes a obtenccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular maacutexima desejada)
(BORZANI 2001) Travieso et al (2001) utilizando fotobiorreator tubular helicoidal
concluiacuteram que eacute possiacutevel empregar satisfatoriamente o sistema semicontiacutenuo no
cultivo de S platensis obtendo uma produtividade da biomassa maior que em
processos descontiacutenuo Isso por que em processo descontiacutenuo a produtividade em
ceacutelulas tende a diminuir quando os nutrientes satildeo totalmente consumidos De acordo
com Reichert et al (2006) a concentraccedilatildeo celular pode atingir valores de duas a
quatro vezes maiores no cultivo semicontiacutenuo de S platensis em relaccedilatildeo ao cultivo
descontiacutenuo utilizando fotobiorreator fechado
32
No processo descontiacutenuo todo o substrato eacute adicionado no iniacutecio do cultivo e
os produtos permanecem ateacute o final do cultivo (CARVALHO SATO 2001) No
processo descontiacutenuo alimentado que eacute uma variaccedilatildeo do processo descontiacutenuo a
alimentaccedilatildeo pode ser de forma intermitente ou contiacutenua O modo de operaccedilatildeo da
alimentaccedilatildeo em bioprocessos permite prevenir o acuacutemulo ou a falta do substrato no
cultivo Em processo microbiano uma apropriada taxa de alimentaccedilatildeo
exponencialmente crescente resulta na manutenccedilatildeo da concentraccedilatildeo do substrato
limitante residual controlando a taxa de formaccedilatildeo do produto (CARVALHO SATO
2001) Esse processo permite que o nutriente seja adicionado em determinados
intervalos de tempo durante todo o processo com isso eacute possiacutevel adicionar
nutrientes potencialmente toacutexicos quando presentes em altas concentraccedilotildees como
por exemplo o iacuteon amocircnio sem prejudicar o crescimento microbiano e prevenindo
seu acuacutemulo (CARVALHO et al 2004) Olguiacuten et al (2001) observaram que no
cultivo descontiacutenuo usando uma concentraccedilatildeo inicial de amocircnia de 1 mM incubada
a 32 ordmC ocorre uma grande perda desse iacuteon para a atmosfera aleacutem de ser
consumida pelo micro-organismo tornando-se deficiente depois de poucos dias
especificamente 12 dias Soletto et al (2005) observaram que o melhor crescimento
cineacutetico da S platensis foi empregando o processo descontiacutenuo alimentado quando
comparada com o processo descontiacutenuo utilizando a ureacuteia com fonte de nitrogecircnio
Comportamento semelhante foi observado por Zhang et al (1998) em cultivos
mixotroacuteficos de S platensis utilizando NaNO3 como fonte de nitrogecircnio
Costa et al (2004) observaram o emprego da aacutegua do lago Mangueira
suplementado com ureacuteia pelo processo descontiacutenuo alimentado no cultivo de S
platensis foi possiacutevel reduzir o custo de produccedilatildeo possibilitando o cultivo em larga
escala
Em casos particulares como por exemplo a necessidade de utilizaccedilatildeo de
nutriente viscoso no cultivo este processo geralmente reduz a viscosidade do meio
e o efeito dos componentes toacutexicos eacute tambeacutem limitado pela diluiccedilatildeo (WARD 1989)
Entre outras vantagens desse processo pode-se encontrar desvio do metabolismo
celular para via de interesse de formaccedilatildeo do produto evita repressatildeo cataboacutelica
evita formaccedilatildeo de produtos toacutexicos no metabolismo microbiano e controla a
velocidade de crescimento microbiano O melhor procedimento operacional para
esse sistema eacute iniciar com pequena quantidade de biomassa e substrato e adicionar
33
mais substrato quando a maior parte do substrato inicial ter sido consumida pelo
micro-organismo (GREGERSEN JORGENSEN 1999)
O processo descontiacutenuo alimentado deve ser usado para melhorar a densidade
celular no crescimento da S platensis desde que a concentraccedilatildeo do substrato
limitante possa ser adicionada ateacute alcanccedilar a produccedilatildeo maacutexima de biomassa sem
resultar na inibiccedilatildeo do crescimento
24 Nutrientes para o crescimento da A platensis
241 Fontes de Nitrogecircnio
O elemento nitrogecircnio constitui aproximadamente de 5 a 10 do peso seco das
cianobacteacuterias (FLORES HERRERO 1994) Diferentes fontes de nitrogecircnio
orgacircnica e inorgacircnica podem ser assimiladas por micro-organismos
fotossintetizantes Dentre as orgacircnicas encontramos aminoaacutecidos purinas ornitina
e as inorgacircnicas encontramos sais de amocircnio e sais de nitrato (BERMAN CHAVA
1999)
As cianobacteacuterias utilizam principalmente fontes de nitrogecircnio inorgacircnico como
nitrato nitrito amocircnia e nitrogecircnio atmosfeacuterico para suprir sua necessidade No
entanto amocircnia eacute a uacutenica fonte inorgacircnica de nitrogecircnio que eacute diretamente
incorporada em compostos orgacircnicos e entatildeo um intermediaacuterio obrigatoacuterio na
utilizaccedilatildeo do outras fontes de nitrogecircnio Essa moleacutecula eacute tambeacutem conhecida como
uma desacopladora na fotossiacutentese causando sob certas circunstacircncias o colapso
do ΔpH requerida pela siacutentese de ATP A amocircnia regula enzimas importantes no
metabolismo de nitrogecircnio tais como nitrato redutase glutamina sintetase e
nitrogenases (BOUSSIBA 1997)
Exceto para o N2 as cianobacteacuterias possuem um sistema de transporte
especiacutefico para as diferentes formas de nitrogecircnio mas a maioria deles pode entrar
na ceacutelula por difusatildeo dependendo de sua concentraccedilatildeo oue do pH do meio de
cultura Nitrato e nitrito satildeo reduzidos pela nitrato redutase e nitrito redutase
respectivamente ambas as enzimas usam ferredoxina como doador de eleacutetrons
(FLORES HERRERO 1994) Ureacuteia eacute convertida a amocircnia pela urease e o
dinitrogecircnio eacute reduzido agrave amocircnia pelo complexo nitrogenase (HERRERO et al
2001) Outras formas de nitrogecircnio como certos aminoaacutecidos requerem sistemas de
34
transporte especiacutefico e posteriormente seratildeo metabolizados para produzir amocircnio
(HERRERO et al 2001 MURO-PASTOR FLORENCO 2003)
Nesses organismos a hierarquia de preferecircncia da assimilaccedilatildeo tem sido
mostrada para esses compostos Quando amocircnio e nitrato estatildeo presentes
simultaneamente no meio externo o sistema para assimilaccedilatildeo de nitrato eacute expresso
somente ao niacutevel basal A inibiccedilatildeo da assimilaccedilatildeo do nitrato exercida pela amocircnia
opera em dois niacuteveis diferentes pelo menos Durante pouco tempo a adiccedilatildeo da
amocircnia interrompe a assimilaccedilatildeo ativa do nitrato pelas ceacutelulas Se as ceacutelulas
continuarem expostas ao amocircnio ateacute mesmo quando o nitrato estaacute
simultaneamente presente a longo prazo o sistema regulatoacuterio atua na repressatildeo
das proteiacutenas envolvendo a assimilaccedilatildeo do nitrato (HERRERO FLORES 1997) A
atividade da nitrato redutase em Spirulina platensis (strain ARM 729) eacute reduzida
mediante a retirada de nitrato do meio e eacute totalmente restaurada apoacutes duas horas
da adiccedilatildeo de nitrato indicando a induccedilatildeo pelo substrato A concentraccedilatildeo oacutetima de
nitrato de soacutedio necessaacuteria para a atividade maacutexima da enzima nitrato redutase eacute de
30 mM Os produtos da assimilaccedilatildeo do nitrato nitrito e amocircnio inibiram
significativamente a atividade da nitrato redutase quando em altas concentraccedilotildees A
acumulaccedilatildeo do nitrito eacute toacutexica para a ceacutelula mas seu niacutevel pode ser controlado tanto
pela inibiccedilatildeo da atividade da nitrato redutase eou transporte do nitrato ou pelo
aumento da atividade da nitrito redutase (JHA et al 2007)
Em cultivos de micro-organismo em larga escala a fonte de nitrogecircnio
preferencial eacute a amocircnia devido ao seu baixo custo e tambeacutem porque ela pode
previnir a contaminaccedilatildeo com zooplancton (BOUSSIBA 1997) A preponderacircncia de
NH3 sobre NH4+ em valores de pH acima de 92 o pKa para amocircnia a 20-30 ordmC
favoreceu a permeabilidade desta pela membrana plasmaacutetica forma natildeo ionizada
que apoacutes difundir pela membrana plasmaacutetica a amocircnia eacute aprisionada dentro da
ceacutelula na forma de iacuteon amocircnio carregado positivamente (BOUSSIBA 1997) O grau
de inibiccedilatildeo parece ser muito reduzido em cepas que crescem restritamente em
condiccedilotildees alcalinas 5 mM de amocircnia inibiu 90 a evoluccedilatildeo de O2 dependente de
luz em micro-organismo neutrofiacutelico Anabaena sp e somente 30 foi observada
em micro-organismo alcalofiacutelico Spirulina platensis no mesmo pH (pH 100) Em
concentraccedilatildeo de 10 mM Spirulina platensis obteve ainda 50 da capacidade
fotossinteacutetica e Anabaena sp natildeo obteve crescimento Essa resistecircncia da Spirulina
agrave amocircnia em pH 10 eacute conferida por um pH intratilacoidal relativamente alto no
35
valor de 65 em relaccedilatildeo ao pH intratilacoidal da Anabaena sp valor de pH de 53
Esta diferenccedila no valor do pH intratilacoidal sugere que menor eacute a ΔpH atraveacutes da
membrana que eacute a razatildeo para a resistecircncia relativa da Spirulina platensis a amocircnia
em pH 100 (BELKIN BOUSSIBA 1991a)
A adiccedilatildeo de 2-3 mM de amocircnia em cultivos de Spirulina mantida geralmente a
pH (95 - 100) causa a deterioraccedilatildeo do contamitante Chlorella no cultivo de
Spirulina A toxidade da amocircnia nas ceacutelulas da Chlorella eacute causada pela grande
entrada dessa moleacutecula devido ao menor pH interno reduzindo a variaccedilatildeo do pH na
membrana tilacoidal requerida para a siacutentese de ATP Logo o uso de amocircnia com
fonte de nitrogecircnio no cultivo de Spirulina pode previnir a proliferaccedilatildeo de outros
micro-organismos (BOUSSIBA 1997)
Ureacuteia e aminoaacutecidos tambeacutem podem ser assimilados pelas cianobacteacuterias A
ureacuteia e fontes de nitrogecircnio orgacircnico satildeo primeiramente metabolizadas para amocircnia
e a partir de entatildeo os aacutetomos de nitrogecircnio seratildeo utilizados como observado na
Figura 2 (FLORES HERRERO 1994)
Figura 2 Principais rotas de assimilaccedilatildeo de nitrogecircnio em cianobacteacuterias cultivas em pH acima de 92
A maioria dos organismos fotossintetizantes a assimilaccedilatildeo da amocircnia ocorre
pela accedilatildeo sequumlencial da glutamina sintetase (GS) e glutamanto sintase (GOGAT)
Ureacuteia
NO3-
aminoaacutecido
NH3
aminoaacutecido
Ureacuteia
NO3-
NH4+
Nucleotiacutedeos
Aminoaacutecidos
Aminoaccediluacutecar
Lipiacutedios
NH4+
Aacutecidos nucleacuteicos
Parede celular
Porfirinas
Proteiacutenas
Intracelular Exracelular
36
Essas reaccedilotildees conhecidas como ciclo GS-GOGAT constituem uma ligaccedilatildeo entre o
metabolismo de nitrogecircnio e de carbono e eacute o metabolismo mais importante para
assimilaccedilatildeo da amocircnia gerada tanto exogenamente como endogenamente
(BOUSSIBA 1997)
As enzimas do ciclo da glutamina sintetase e glutamato sintase satildeo importantes
pela introduccedilatildeo da amocircnia em formas orgacircnicas O glutamato produzido por esta
via aleacutem de ser o principal doador de nitrogecircnio para a siacutentese de outros
metaboacutelitos contendo nitrogecircnio eacute tambeacutem um precursor de alguns aminoaacutecidos e
da 5-aminolevulinato um precursor da biossiacutentese da porfirina ficobilina e clorofila
(FLORES HERRERO 1994)
A parede celular das cianobacteacuterias eacute como as das bacteacuterias gram-negativas
que conteacutem uma camada de peptidoglicano na parte externa da membrana
citoplasmaacutetica Nesta membrana conteacutem tipos de proteiacutenas especiais denominadas
de porinas a qual permite a passagem de pequenas moleacuteculas incluindo
aminoaacutecidos e iacuteons inorgacircnicos Isto eacute essas substacircncias apresentam um sistema
de transporte especializado (FLORES HERRERO 1994) A membrana
citoplasmaacutetica representa a principal barreira de permeabilidade das cianobacteacuterias
Portanto o nitrato provavelmente possui livre acesso ao periplasma das
cianobacteacuterias (HERRERO FLORES 1997)
Algumas cianobacteacuterias como Anabaena Nostoc Fischerella satildeo capazes de
fixar N2 atmosfeacuterico em condiccedilotildees aeroacutebias atraveacutes das nitrogenases (FLORES
HERRERO 1994) No entanto as ceacutelulas de S platensis natildeo podem fixar nitrogecircnio
atmosfeacuterico porque natildeo possuem heterocisto (MATA 2007 VACHHANI VONSHAK
1997) e eacute dentro dos heterocistos onde se encontram as nitrogenases em
cianobacteacuterias (LARA GUERRERO 2007)
O nitrato eacute provavelmente a fonte mais abundante de nitrogecircnio para a nutriccedilatildeo
de cianobacteacuterias A assimilaccedilatildeo do nitrato envolve a incorporaccedilatildeo do nitrato e
reduccedilatildeo do nitrato intracelular para amocircnio na qual eacute a forma de nitrogecircnio
incorporada em compostos orgacircnicos Nitrito na qual pode tambeacutem ser utilizado na
necessidade do nitrogecircnio eacute assimilado pelas ceacutelulas e entatildeo reduzido a amocircnio
(FLORES HERRERO 1994)
A assimilaccedilatildeo do nitrato pelas cianobacteacuterias envolve um sistema de transporte
que eacute carreado por uma proteiacutena e esta possui uma alta afinidade pelo nitrato Esta
alta afinidade permite que as cianobacteacuterias utilizem nitratos mesmo em baixas
37
concentraccedilotildees como eacute encontrado no meio ambiente natural O acuacutemulo intracelular
de nitrato permitiraacute o funcionamento da enzima nitrato redutase (FLORES
HERRERO 1994) Portanto a limitaccedilatildeo do transporte de nitrato pela inativaccedilatildeo de
alguns genes do transporte de nitrato natildeo impede o crescimento dependente de
nitrato quando este eacute suplementado a alta concentraccedilatildeo (20 mM) A entrada do
nitrato nas ceacutelulas nessas condiccedilotildees parece ser por difusatildeo passiva desde que a
concentraccedilatildeo de nitrato seja maior que 1 mM a assimilaccedilatildeo de nitrato aumenta
linearmente com o aumento da sua concentraccedilatildeo (OMATA et al 1989)
O nitrato intracelular eacute reduzido a nitrito em reaccedilatildeo utilizando 2 eleacutetrons
catalizados pela nitrato redutase o nitrito eacute convertido a amocircnio pela nitrito redutase
na reaccedilatildeo utilizando 6 eleacutetrons Ambas as enzimas encontradas nas membranas
tilacoidais utilizam ferrodoxina reduzida como doador de eleacutetrons A presenccedila de
nitrato ou nitrito geralmente tem um efeito positivo nos niacuteveis das enzimas nitrato
redutase e nitrito redutase (FLORES HERRERO 1994) Estas enzimas encontram-
se principalmente no citoplasma das cianobacteacuterias (GUERRERO LARA 1987) A
assimilaccedilatildeo do nitrato envolve a reduccedilatildeo citoplasmaacutetica para nitrito (NO2-)
catalizada pela enzima nitrato redutase (NR) usando NAD(P)H como doador de
eleacutetrons O nitrito eacute rapidamente reduzido a amocircnio (NH4+) pela enzima nitrito
redutase (NiR) que usa a ferrodoxina como doador de eleacutetrons e o amocircnio eacute entatildeo
incorporado a moleacuteculas de nitrogecircnio como aminoaacutecidos purinas pirimidinas e
aminas (LEA LEEGOOD 1993)
Quando somente o CO2 eacute o aceptor de eleacutetrons disponiacutevel e o escoamento de
eleacutetrons pelos fotossistemas natildeo eacute limitado pela luz o que determina a fotossiacutentese
eacute a fixaccedilatildeo de CO2 pelo ciclo das pentoses Quando se adiciona nitrato nessas
mesmas condiccedilotildees este usa os eleacutetrons diretamente da ferrodoxina reduzida
liberando o escoamento dos eleacutetrons natildeo ciacuteclico de sua limitaccedilatildeo e estimulando a
produccedilatildeo de O2 Esse efeito natildeo foi observado quando se adiciona amocircnio Na
intensidade luminosa saturante o nitrato estimula o fluxo de eleacutetrons natildeo ciacuteclico para
gerar um poder redutor utilizado para sua assimilaccedilatildeo No entanto a intensidade de
luz limitante o nitrato reprime a fixaccedilatildeo de CO2 para utilizar o poder redutor gerado
fotossinteticamente na sua reduccedilatildeo a amocircnia (ROMERO LARA 1987)
A nitrato redutase e nitrito redutase presentes na membrana tilacoidal permitem
a fotoreduccedilatildeo do nitrato ou nitrito em uma reaccedilatildeo dependente do fotossistema I na
qual eacute estimulada pela ferrodoxina Nos tilacoacuteides do Synechococcus a fotoreduccedilatildeo
38
do nitrato a amocircnio utiliza aacutegua como fonte de eleacutetrons foi observado na reaccedilatildeo
envolvendo ambos fotossistema I e fotossistema II Em condiccedilotildees heterotroacuteficas a
reduccedilatildeo do nitrato ocorre pela ferrodoxina reduzida produzida a partir do NADPH e
ferrodoxina-NADP oxiredutase NAPDH eacute provavelmente gerado pela glicose-6-
fosfato desidrogenase e 6-fosfogluconato desidrogenase (HERRERO FLORES
1997)
A assimilaccedilatildeo de amocircnio nas cianobacteacuterias pode ser pela difusatildeo de sua
forma gasosa (amocircnia) ou pela accedilatildeo de permeases especiacuteficas e eacute diretamente
incorporado no metabolismo GS-GOGAT (GS glutamina sintetase GOGAT
glutamate sintase) (MURO-PASTOR FLORENCIO 2003)
A ureacuteia eacute uma boa fonte de nitrogecircnio para cianobacteacuterias pertencentes a
diferentes grupos taxonocircmicos Esta parece ser assimilada intacta pelas ceacutelulas
ativas e entatildeo metabolizada intracelularmente (FLORES HERRERO 1994) Embora
o metabolismo assimilatoacuterio do nitrogecircnio tenha sido amplamente investigado
(FLORES HERRERO 1994) informaccedilatildeo sobre a assimilaccedilatildeo da ureacuteia eacute escassa e
a maioria relata sobre o uso da urease (RAI SINGH et al 1987 RAI 1989
PALINSKA et al 2000) A ureacuteia intracelular eacute degradada pela enzima urease
liberando uma moleacutecula de dioacutexido de carbono e duas moleacuteculas de amocircnia
Embora algumas leveduras e algas degradem a ureacuteia pela ureacuteia amidoliase
dependente de ATP e biotina a maioria dos micro-organismos usa a ureacuteia
amidohidrolase dependente de Ni+2 (VALLADARES et al 2002) Essa enzima
possui um Km para ureacuteia geralmente acima de 1 mM (MOBLEY HAUSINGER
1989) Valladares et al (2002) tem demonstrado que algumas cianobacteacuterias como
Synechocystis sp PCC 6803 e Anabaena sp PCC 7120 possuem um transportador
de ureacuteia denominado ABC tipo permease (ABC-type permease) essencial para a
assimilaccedilatildeo da ureacuteia
A atividade da urease em cianobacteacuterias Synechococcus sp eacute geralmente
maior em ceacutelulas rompidas em relaccedilatildeo as ceacutelulas intactas sugerindo que a urease
estaacute localizada intracelularmente no citoplasma (COLLIER et al 1999) A produccedilatildeo
da urease requer Ni+2 no meio de crescimento e tem sido purificada a partir da
Spirulina maxima (CARVAJAL et al 1982)
Em geral haacute dois principais metabolismos para que o amocircnio seja incorporado
em constituintes orgacircnicos nas ceacutelulas O primeiro eacute a incorporaccedilatildeo direta do
amocircnio incorporado do meio para produccedilatildeo do glutamato pela aminaccedilatildeo do 2-
39
oxoglutarato (-cetoglutarato) pela glutamato desidrogenase seguindo pela
aminaccedilatildeo do glutamato pela glutamina sintetase
(1)
No segundo duas moleacuteculas de glutamato satildeo produzidas na reaccedilatildeo de
transaminaccedilatildeo A amocircnia eacute incorporada ao glutamato originando a glutamina na
qual transfere seu grupo amino para 2-oxoglutarato (-cetoglutarato) pela glutamato
sintase ou glutamato-2-oxoglutarato aminotransferase este eacute o ciclo de reaccedilotildees
catalisadas pelo glutamato sintase e glutamina sintetase sendo esta a via mais
comum de assimilaccedilatildeo de amocircnio em cianobacteacuterias independente da fonte de
nitrogecircnio utilizada (FLORES HERRERO 1994)
(2)
Eacute evidente que na assimilaccedilatildeo de algumas formas de nitrogecircnio inorgacircnico
pelas enzimas GSGOGAT um requerimento obrigatoacuterio do esqueleto de carbono
principalmente cetoaacutecidos conduziraacute um desvio do fluxo de carbono da biossiacutentese
de carboidrato para a biossiacutentese de aminoaacutecidos (LARA GUERRERO 1997)
proporcionando um aumento no fluxo de carbono atraveacutes da via glicoliacutetica e dos
aacutecidos tricarboxiacutelicos para a formaccedilatildeo do oxalacetato e do α-cetoglutarato bem
como estimula o turnover de aminoaacutecidos em ceacutelulas de Anacystis nidulans uma
2
+
+
40
vez que um aumento da incorporaccedilatildeo do carbono em aminoaacutecidos induzido pela
assimilaccedilatildeo de nitrogecircnio natildeo foi acompanhado por um aumento no pool de
aminoaacutecidos Esse desvio eacute mais evidente sob altas intensidades luminosas
(CORONIL et al 1993)
Nas ceacutelulas de Phormidium laminosum adaptada ao crescimento com nitrato ou
amocircnia como fonte de nitrogecircnio possuem de 65 a 90 de glutamato em relaccedilatildeo a
quantidade de aminoaacutecidos totais (porccedilatildeo molar) dependendo da fase de
crescimento Essa proporccedilatildeo pode variar se a fonte de nitrogecircnio no cultivo for
alterada Quando o iacuteon amocircnio foi adicionado no cultivo com nitrato o conteuacutedo de
glutamato diminui enquanto que a maioria dos outros aminoaacutecidos aumentou O
niacutevel intracelular da maioria dos aminoaacutecidos (especialmente aspartato e alanina)
aumenta indicando que a siacutentese de aminoaacutecido foi maior que sua incorporaccedilatildeo em
proteiacutenas e outros compostos (OCHOA de ALDA et al 1996)
O meio de cultura convencional para a obtenccedilatildeo da S platensis utiliza sais de
nitrato como fonte de nitrogecircnio como por exemplo nitrato de potaacutessio e nitrato de
soacutedio Fontes alternativas de nitrogecircnio como ureacuteia (DANESI et al 2002 SOLETTO
et al 2005) e sais de amocircnio (CARVALHO et al 2004 SOLETTO et al 2005)
estatildeo sendo pesquisadas com a finalidade de diminuir os custos na produccedilatildeo
industrial Ambos o tipo e a quantidade da fonte de nitrogecircnio no meio de cultura
influenciam no crescimento e composiccedilatildeo da biomassa (STANCA POPOVICI
1996)
Considerando a substituiccedilatildeo de KNO3 por ureacuteia verifica-se que eacute altamente
vantajosa pois o custo desta eacute muito menor que a de KNO3 e aleacutem disso a ureacuteia eacute
facilmente assimilada por S platensis provavelmente devido agrave sua hidroacutelise no meio
de cultivo com formaccedilatildeo de amocircnia seja devido agrave accedilatildeo da urease (CARVAJAL et
al 1982) seja devido agrave alcalinidade do meio de cultivo (DANESI et al 2002
RANGEL-YAGUI et al 2004)
Soletto et al (2005) comparando o crescimento da S platensis no processo
descontiacutenuo observaram que o uso de ureacuteia como fonte de nitrogecircnio proporcionou
uma maior concentraccedilatildeo celular quando comparado com o sulfato de amocircnio Nesse
mesmo trabalho observaram que o melhor crescimento cineacutetico da S platensis foi
utilizando o processo descontiacutenuo alimentado com ureacuteia quando comparada com o
nitrato de soacutedio Portanto o uso de ureacuteia como uma fonte de nitrogecircnio mais
econocircmica pode ser uma alternativa interessante no cultivo de S platensis
41
Bezerra et al (2008) observaram que o emprego do processo descontiacutenuo
alimentado utilizando cloreto de amocircnio como fonte de nitrogecircnio pode ser uma
alternativa viaacutevel para o cultivo de S platensis natildeo influenciam nos teores proteacuteicos
e lipiacutedicos da biomassa final
242 Intensidade luminosa
A intensidade luminosa eacute um importante fator que interfere no crescimento
dos micro-organismos fotossintetizantes A luz absorvida por pigmentos direciona o
transporte de eleacutetrons fotossinteacutetico na qual resulta na reduccedilatildeo do NADP+ e
formaccedilatildeo de ATP (YANG et al 2000)
A soma da luz absorvida pelas ceacutelulas no fotobiorreator depende de muitos
fatores incluindo posiccedilatildeo especiacutefica da ceacutelula num determinado instante densidade
da cultura e pigmentaccedilatildeo das ceacutelulas (RUBIO et al 2003)
Um dos modos de obtenccedilatildeo de energia para o metabolismo da S platensis eacute a
fotossiacutentese e para a sua realizaccedilatildeo eacute necessaacuterio aacutegua dioacutexido de carbono e luz
No processo fotossinteacutetico ocorre o fenocircmeno de captaccedilatildeo de luz e outro conhecido
como oxido-reduccedilatildeo (NELSON YOCUM 2006)
A absorccedilatildeo da luz na faixa de 400-700 nm por pigmentos fotossinteacuteticos
absorve a energia de um foacuteton de dado comprimento de onda e entatildeo utiliza essa
energia para iniciar uma cadeia de eventos da fase fotoquiacutemica da fotossiacutentese
Esses pigmentos tais como clorofila carotenoacuteides e bilinas estatildeo organizados em
complexos fotossinteacuteticos e tecircm a funccedilatildeo de antenas captadoras de luz Centenas
de pigmentos antenas funcionam juntos para direcionar o processo para as etapas
seguintes ou dissipam o excesso de energia para diferentes rotas (ADIR et al
2003)
A faixa do espectro de absorccedilatildeo que eacute utilizada pelos organismos
fotossintetizantes como fonte de energia para as suas atividades metaboacutelicas eacute
comumente chamada de Radiaccedilatildeo Fotossinteticamente Ativa (PAR do inglecircs
Photosynthetically Active Radiation) A Densidade de Fluxo de Foacutetons (PPFD do
inglecircs Photosynthetic Photon Flux Density) cuja unidade eacute micromol de foacutetons m-2 s-1
expressa a irradiacircncia nesta faixa do espectro
A fotossiacutentese oxigecircnica eacute catalizada por quatro complexos proteiacutenas-
membranas formadas pelo fotossistema II (FSII) citocromo bf fotossistema I (FSI) e
42
ATP sintetase Esses complexos estatildeo arranjados nas membranas tilacoacuteidais que
nas cianobacteacuterias distribuem-se de forma concecircntrica ou irregular no citossol
(NELSON YOCUM 2006)
Os fotossistemas satildeo os complexos responsaacuteveis pela conversatildeo da energia
luminosa em energia quiacutemica Nos organismos que realizam fotossiacutentese oxigecircnica
existem dois fotossistemas agindo em seacuterie o fotossistema I (FSI) e o fotossistema II
(FSII) O fotossistema II (FSII) eacute definido como aacutegua-plastoquinona oxidoredutase
pois catalisa a transferecircncia de eleacutetrons entre a aacutegua e a plastoquinona o complexo
citocromo b6f eacute definido como plastoquinonandashplastocianina oxidoredutase
fotossistema I (FSI) como uma plastocianinandashferredoxina oxidoredutase e a ATPase
ou ATP sintetase que funciona como uma forccedila proacuteton motriz que direciona a
siacutentese de ATP (NELSON YOCUM 2006) (Figura 3)
Figura 3 Complexos fotossinteacuteticos em membranas de tilacoacuteides Fonte httpwwwportalsaofranciscocombralfafotossintesehistorico-da-fotossintesephp
Os FSI e FSII contecircm clorofilas e outros pigmentos que absorve a energia
luminosa e as direcionam para o centro de reaccedilatildeo (RC) (Figura 4) O centro de
reaccedilatildeo fotossinteacutetico do FSI possui proteiacutenas com o centro contendo agregados de
Ferro-enxofre (Fe-S) como uacuteltimo aceptor de eleacutetrons e o FSII possui quinona como
uacuteltimo aceptor de eleacutetrons (HEATHCOTE et al 2003) A energia capturada pelo
centro de reaccedilatildeo induz a excitaccedilatildeo de um par especial de clorofila na qual inicia a
translocaccedilatildeo de um eleacutetron atraveacutes da membrana Aacutegua doadora de eleacutetrons para
esse processo eacute oxidada fotoquimicamente a O2 liberando 4 H+ e 4 eleacutetrons pelo
centro fotooxidativo do FSII (P680) Este eacute responsaacutevel pela conversatildeo da energia
luminosa em energia de oxido-reduccedilatildeo (McEVOY et al 2005)
43
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do fotossistema Adaptaccedilatildeo Fontehttpkentsimmonsuwinnipegcacm1504lightreacthtm
Os eleacutetrons extraiacutedos da aacutegua satildeo lanccedilados para quinona (PQ) formando
quinona reduzida (PQH2) (BARBER 2006) A quinona reduzida tambeacutem conhecida
como quinol pode se dissociar do centro de reaccedilatildeo e difundir ateacute o complexo
citocromo b6f O complexo citocromo b6f transfere eleacutetrons da quinona reduzida
(PQH2) ateacute a plastocianina que eacute uma proteiacutena perifeacuterica moacutevel que conteacutem cobre e
que tem como principal funccedilatildeo transferir eleacutetrons do citocromo b6f ateacute o P700 centro
de reaccedilatildeo do Fotossistema I Esse processo permite a transferecircncia de proacutetons da
face externa para a face interna da membrana tilacoidal e a criaccedilatildeo de gradiente
eletroquiacutemico de proacutetons atraveacutes da membrana Energia luminosa absorvida pelo
FSI (P700) induz a transferecircncia de eleacutetrons da plastocianina localizada na face
interna da membrana para a ferredoxina localizada na face externa (NELSON
BEN-SHEM 2002) Outra proteiacutena associada ao Fotossistema I eacute a flavoproteiacutena
ferredoxina-NADP oxidoredutase que reduz o NADP+ a NADPH2 completando a
sequumlecircncia do transporte natildeo-ciacuteclico de eleacutetrons que comeccedila com a oxidaccedilatildeo da
moleacutecula de aacutegua (NELSON YOCUM 2006) A reduccedilatildeo da ferredoxina eacute
subsequentemente usada em numerosas reaccedilotildees de siacutentese e ciclos regulatoacuterios
incluindo assimilaccedilatildeo de nitrato desnaturaccedilatildeo de aacutecido graxo e produccedilatildeo de
NADPH (McCARTY et al 2000 CHITNIS 2001) Essas reaccedilotildees soacute ocorrem na
presenccedila de luz Independentemente da presenccedila de luz a reduccedilatildeo do CO2 a
44
carboidratos ciclo de Calvin ocorre devido a presenccedila de ATP e NADPH (NELSON
YOCUM 2006)
A diferenccedila de carga entre FSI e o FSII juntamente com a transferecircncia de
eleacutetrons atraveacutes do complexo citocromo b6f induz a formaccedilatildeo de um potencial
eletroquiacutemico atraveacutes da membrana na qual potencializa a siacutentese de ATP por um
complexo de quatro proteiacutenas denominadas de ATPase (McCARTY et al 2000)
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da fase fotoquiacutemica Adaptado Fonte httpwwwuiceduclassesbiosbios100lecturesf04amlect10htm
O controle metaboacutelico do consumo de energia isto eacute a soma de energia
capturada pelo aparato fotossinteacutetico e estocada na forma de energia quiacutemica a
taxa de fixaccedilatildeo do carbono e a produccedilatildeo de biomassa eacute um processo mediado por
enzimas Isto implica que a taxa maacutexima do consumo de energia depende da
natureza do micro-organismo (RUBIO et al 2003) A reaccedilatildeo de captura de luz eacute
muito mais raacutepida que as reaccedilotildees subsequumlentes mediada por enzimas a taxa
maacutexima da fotossiacutentese deve ser controlada pela concentraccedilatildeo de uma das enzimas
do ciclo de Calvin (SUKENIK et al 1997 RUBIO et al 2003)
Alguns autores como Hirata et al (1998) e Chojnacka Noworyta (2004a)
identificaram regiotildees que correlacionam o crescimento da Arthrospira ssp e a
intensidade luminosa Essas regiotildees satildeo
Regiatildeo limitada por luz baixa intensidade luminosa onde ocorre um aumento
da concentraccedilatildeo celular com um aumento da intensidade luminosa
Regiatildeo saturada por luz alta intensidade luminosa onde o crescimento celular
independe da intensidade luminosa
Regiatildeo inibida por luz a intensidade luminosa eacute muito alta inibindo o
crescimento celular e ateacute mesmo pode provocar a morte celular
45
A intensidade luminosa eacute fundamental para que ocorra o metabolismo
fotossinteacutetico mas por outro lado altas intensidades luminosas podem danificar o
complexo fotossinteacutetico levando a morte celular Esse processo eacute denominado de
fotoinibiccedilatildeo (RUBIO et al 2003) O excesso de luz pode danificar o centro de
reaccedilatildeo dos fotossitemas II (SAMUELSSON 1985 LU VONSHAK 1999) eou
fotossistema I (SONOIKE 1996)
A fotoinibiccedilatildeo eacute um estado de estresse fisioloacutegico que ocorre em todos os
organismos fotossintetizantes envolvendo o oxigecircnio causado devido a um excesso
de iluminaccedilatildeo A danificaccedilatildeo ocorre primeiramente no centro de reaccedilatildeo do
fotossistemas II reduzindo abruptamente a eficiecircncia do transporte de eleacutetrons
fotossinteacutetico somente quando a taxa da danificaccedilatildeo excede ao do seu reparo na
qual requer o turnover da siacutentese das proteiacutenas do PSII A inibiccedilatildeo pela luz pode
envolver a participaccedilatildeo de todas as atividades realizadas pelo sistema fotossinteacutetico
tais como degradaccedilatildeo e substituiccedilatildeo dos componentes e organizaccedilatildeo da unidade
funcional (ADIR et al 2003)
A fotoinibiccedilatildeo ocorre quando o sistema antena absorve luz em excesso
danificando o sistema fotossinteacutetico O excesso de excitaccedilatildeo pode ser obtido por um
aumento da intensidade luminosa acima do niacutevel de saturaccedilatildeo da taxa fotossinteacutetica
(CHOJNACKA NOWORYTA 2004a) Portanto isso tambeacutem pode ocorrer em
condiccedilotildees moderadas de intensidade luminosa se as ceacutelulas adaptadas a baixa
intensidade luminosa forem transferidas a maiores intensidade luminosas (RUBIO et
al 2003) ou se taxa fotossinteacutetica estiver limitada por fatores de estresse como
baixas temperaturas (GOMBOS et al 1994) eou excesso de sal no meio (LU
ZHANG 2000) o que pode induzir a fotoinibiccedilatildeo em condiccedilotildees de luz moderada
(SAMUELSSON 1985)
A danificaccedilatildeo do fotossistema II consiste na inativaccedilatildeo dos sistemas que
envolvem oxigecircnio carreadores de eleacutetrons e proteiacutenas D1D2 (RUBIO et al 2003)
No FSI a inibiccedilatildeo eacute iniciada pela inativaccedilatildeo do aceptor de eleacutetrons seguindo com a
destruiccedilatildeo do centro de reaccedilatildeo e degradaccedilatildeo do produto do gen psaB que eacute uma
das duas maiores subunidades peptiacutedicas do complexo do centro de reaccedilatildeo do FSI
Baixas temperaturas e estresse oxidativos satildeo caracteriacutesticas requeridas para a
fotoinibiccedilatildeo do FSI in vivo (SONOIKE 1996)
Adir et al (2003) relataram que a fotoinibiccedilatildeo eacute observada tanto sob altas
intensidades luminosas quando o mecanismo de reparo de proteiacutenas atinge sua
46
capacidade maacutexima ou em baixa intensidade luminosa quando fatores externos
adicionais prejudicam seu reparo e a exposiccedilatildeo a alta intensidade luminosa
prolongada induz a um excesso de efeitos secundaacuterios que contribui para uma
reduccedilatildeo na capacidade fotossinteacutetica
Fatores como efeito sombreamento em culturas densas de ceacutelulas a remoccedilatildeo
de O2 e o aumento da concentraccedilatildeo de CO2 podem proteger os micro-organismos
contra o efeito fotooxidativo (ELOFF et al 1976)
Van Eykelenburg (1979) observou que a intensidade luminosa natildeo afeta as
caracteriacutesticas morfoloacutegicas como o tamanho da heacutelice e o diacircmetro da S platensis
e que a concentraccedilatildeo dos gracircnulos de poliglicano diminui com o aumento da
intensidade luminosa
Bezerra et al (2008) observaram que os teores de lipiacutedios e proteiacutenas obtidos
nas biomassas finais foram influenciados pela intensiade luminosa menores
intensidades luminosas conduziram a um aumento no conteuacutedo total de lipiacutedios e de
proteiacutenas
2421 Pigmentos
Para a energia luminosa ser utilizaacutevel pelos organismos fotossinteacuteticos ela
deve inicialmente ser absorvida por pigmentos especiacuteficos tais como clorofila
carotenoacuteides e ficobilinas Esses pigmentos encontram-se associados a proteiacutenas
nas lamelas fotossinteacuteticas formadas por tilacoacuteides Isso permite uma disposiccedilatildeo
espacial que torna muito eficiente a propagaccedilatildeo de energia absorvida (MARZOCCO
TORRES 1999)
Nas cianobacteacuterias tais como A platensis a fotossiacutentese ocorre principalmente
nas membranas tilacoidais onde estatildeo localizados os pigmentos fotossitneacuteticos
clorofila a carotenoacuteides e ficocianina (COGNO et al 2003) As lamelas tilacoidais
satildeo duas linhas paralelas em formato de disco fechado onde estatildeo localizados a
clorofila celular (clorofila a) e os carotenoacuteides (VAN YKELENBURG 1979)
O aparato fotossinteacutetico das cianobacteacuterias consiste principalmente de trecircs
tipos de complexos macromoleculares fotossistema I fotossistema II e os
ficobilissomos O FSI e o FSII satildeo complexos intriacutensecos onde os ficobilissomos
estatildeo sobre a superfiacutecie externa dos tilacoiacutedes na forma de esferas (GANTT 1981
LIU et al 2005) Os ficobilissomos auxiliam na absorccedilatildeo da energia luminosa em
47
um intervalo do espectro maior que as clorofilas absorvem (500-680 nm) permitindo
as espeacutecies que possuem essas antenas a utilizar todo o intervalo da luz visiacutevel
emitido pelo sol (KUMAR MURHTY 2007)
Os ficobilissomos estatildeo unidos nas lamelas tilacoiacutedais e funcionam como
antenas captadoras de luz que transferem a energia excitante para o centro de
reaccedilatildeo dos fotossistemas (VAN EYKELENBURG 1979) A maior parte da energia
luminosa eacute absorvida por complexos pigmentos-proteiacutenas chamados de
ficobilissomos Os componentes dos ficobilissomos as ficobiliproteiacutenas satildeo
responsaacuteveis pela pigmentaccedilatildeo verde-azulada da maioria das cianobacteacuterias Os
ficobilissomos satildeo agregados de alto peso molecular compostos por ficocianina
aloficocianina e ficoeritrina (com pico de absorbacircncia de 615 nm 650 nm e 565 nm
respectivamente) Com o aumento da intensidade luminosa os ficobilissomos satildeo
menos abundantes (VAN EYKELENBURG 1979)
As ficobiliproteiacutenas presentes nos gracircnulos de ficobilissomos podem constituir
mais de 60 de proteiacutena soluacutevel em cianobacteacuterias (HOUMARD 1994) Isso eacute o
que caracteriza a Spirulina spp por ser comercializada como um suplemento
alimentar rico em proteiacutenas (TANDEAU de MARSAC HOUMARD 1993) As
ficobiliproteinas purificadas possuem uma variedade de funccedilotildees como substituinte
de corantes sinteacuteticos em alimentos e produtos cosmeacuteticos sondas para meacutetodos de
imunodiagnoacutesticos citometria de fluxo e microscopia de fluorescecircncia (STANIER e
COHEN-BAZIRE 1977 SPOLAORE et al 2006)
As maiores classes da ficobiliproteinas satildeo ficoeritrina (PE) ficoeritrocianina
(PEC) ficocianina (PC) e aloficocianina (APC) (CIFERRI 1983) A absorccedilatildeo
maacutexima satildeo 540ndash570 570ndash590 610ndash620 e 650ndash655 nm para PE PEC PC e APC
respectivamente (STANIER COHEN-BAZIRE 1977 CIFERRI 1983)
Aleacutem das ficobiliproteiacutenas as cianobacteacuterias contecircm as clorofilas e os
carotonoacuteides para absorccedilatildeo de energia luminosa Entre os carotenoacuteides encontram-
se o β-caroteno o mais importante e as xantofilas que satildeo carotenos oxigenados
(MARZZOCO TORRES 1999)
As clorofilas satildeo os pigmentos naturais presentes nas plantas cianobacteacuterias e
algas O nome clorofila foi proposto por Pelletier e Caventou em 1818 para
designar a substacircncia verde que se podia extrair das folhas com o auxiacutelio do aacutelcool
Atualmente os pigmentos clorofilianos satildeo de grande importacircncia comercial
podendo ser utilizados tanto como pigmentos quanto como antioxidantes Os
48
pigmentos fotossinteacuteticos presentes e a sua abundacircncia variam de acordo com a
espeacutecie A clorofila a (Chl a) estaacute presente em todos os organismos que realizam
fotossiacutentese oxigecircnica As bacteacuterias fotossintetizantes satildeo desprovidas de clorofila a
e possui em seu lugar a bacterioclorofila como pigmento fotossinteacutetico A Chl a eacute o
pigmento utilizado para realizar a fotoquiacutemica (o primeiro estaacutegio do processo
fotossinteacutetico) enquanto que os demais pigmentos auxiliam na absorccedilatildeo de luz e na
transferecircncia da energia radiante para os centros de reaccedilatildeo sendo assim chamados
de pigmentos acessoacuterios (STREIT et al 2005) As cianobacteacuterias possuem clorofila
a e ficobilinas mas natildeo possuem a clorofila b (GRIFFITHS 2006)
As clorofilas satildeo as moleacuteculas fotorreceptoras mais importantes Satildeo moleacuteculas
formadas por complexos derivados da porfirina tendo como aacutetomo central o Mg
(magneacutesio) (Figura 6) Esse composto eacute uma estrutura macrociacuteclica assimeacutetrica
totalmente insaturada constituiacuteda por quatro aneacuteis de pirrol Esses aneacuteis numeram-
se de 1 a 4 ou de ldquoardquo a ldquodrdquo de acordo com o sistema de numeraccedilatildeo de Fisher
(SCHOEFS 2002) A clorofila a o anel de porfirina conteacutem um grupo metil (-CH3) no
Carbono 3 A estrutura quiacutemica da clorofila estaacute representada na Figura 6
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da moleacutecula da clorofila a Fontehttp1381926868bioCoursesbiochem2PhotosynthesisPhotosynthesis1html
Os pigmentos que absorvem luz fazem parte de complexos proteacuteicos que
atravessam a membrana tilacoidal denominados de fotossistemas Esses satildeo
unidades funcionais das reaccedilotildees da fotossiacutentese Cada fotossistema pode conter
vaacuterias moleacuteculas de clorofila carotenoacuteides e ficobilinas todas capazes de absorver
luz por isso denominada de moleacuteculas-antena Os carotenoacuteides e as ficobilinas
apresentam absorccedilatildeo em regiatildeo do espectro luminoso em que as clorofilas
49
absorvem pouco e isso permite a ampliaccedilatildeo do espectro luminoso utilizado na
fotossiacutentese (MARZOCCO TORRES 1999)
A composiccedilatildeo de pigmentos da Spirulina eacute tiacutepica de uma cianobacteacuteria a uacutenica
clorofila presente eacute a clorofila a que tem seu peso variando entre 08 e 15 do
peso seco As proteiacutenas que possuem maior potencial econocircmico satildeo as
biliproteiacutenas Nas Spirulinas existem duas biliproteiacutenas c-ficonianina e a
aloficocianina A fraccedilatildeo proteacuteica pode conter mais de 20 de ficocianina um
pigmento azul soluacutevel em aacutegua (VONSHAK 1997) Entre os carotenoiacutedes 67-79 eacute
constituiacutedo do β-caroteno As maiorias dos carotenoacuteides da Spirulina satildeo β-caroteno
β-cryptoxantina e zeaxantina (LORENZ 1999)
Os carotenoacuteides carotenos e xantofilas aleacutem de sua funccedilatildeo de absorver
energia luminosa satildeo capazes de dissipar a energia de excitaccedilatildeo excedente na
forma de calor evitando danos ao aparato fotossinteacutetico Enquanto que como
transdutores de energia ateacute o centro de reaccedilatildeo natildeo satildeo muito eficiente (30 - 40
de eficiecircncia) como dissipadores de energia absorvida em excesso pela clorofila
satildeo altamente eficientes (MANRIQUE 2003)
A zeaxantina eacute capaz de receber a energia diretamente da clorofila excitada e
dissipa-laacute posteriormente na forma de calor sem emissatildeo de radiaccedilatildeo O processo
se inverte quando a luz desaparece ou vai se tornando menos intensa
progressivamente finalizando o ciclo A dissipaccedilatildeo da energia eacute devido a
zeaxantina (MANRIQUE 2003)
Os pigmentos acessoacuterios satildeo fundamentais para a realizaccedilatildeo da fotossiacutentese
pelos organismos Algas que possuem apenas a clorofila a como Ochromonas
malhamensis e a Nannochloris oculata crescem mais rapidamente em presenccedila de
substrato orgacircnico que em presenccedila apenas da luz como fonte de energia mesmo
sob condiccedilotildees oacutetimas de luz Os pigmentos acessoacuterios atuam somente absorvendo
energia contribuindo para a fotossiacutentese (BRODY BRODY 1962)
No entanto a captaccedilatildeo de energia para a funccedilatildeo fotossinteacutetica natildeo eacute a uacutenica
funccedilatildeo dos pigmentos fotossinteacuteticos estes satildeo sistemas fotoprotetores quando a
intensidade luminosa eacute excessiva Quando nem todos os foacutetons absorvidos pela
clorofila podem ser utilizados no processo fotoquiacutemico eacute desencadeado um
mecanismo para dissipar o excesso de energia e evitar danos as membranas
fotossinteacuteticas e a proacutepria clorofila resultando em um branqueamento das ceacutelulas
com uma consequumlente reduccedilatildeo ou perda da capacidade fotossinteacutetica Na presenccedila
50
de excesso de luz o oxigecircnio reage com a clorofila excitada originando um oxigecircno
singlete que eacute muito mais reativo podendo oxidar as clorofilas (branqueamento) os
aacutecidos graxos polinsaturados que forma peroacutexidos e outros compostos Entatildeo os
carotenoacuteides dissipam o radical peroacutexido e tambeacutem a clorofila excitada adquirindo o
estado triplete que por sua vez se dissipa despreendendo calor para o meio externo
(MANRIQUE 2003)
243 Fontes de carbono
De acordo com Chojnacka e Maacuterquez-Rocha (2004b) a fonte de carbono
empregada e a utilizaccedilatildeo ou natildeo de energia luminosa podem classificar os cultivos
em
Cultivo heterotroacutefico ndash emprego exclusivo de compostos orgacircnicos como fonte
energeacutetica O carbono orgacircnico serve tanto como fonte energeacutetica quanto para a
formaccedilatildeo da biomassa
Cultivo autotroacutefico (ou fotoautotroacutefico) ndash emprego da luz como exclusiva fonte
energeacutetica para a reduccedilatildeo (fixaccedilatildeo) do CO2 (considerado de fonte inorgacircnica)
formando substacircncias orgacircnicas
Cultivo mixotroacutefico ndash utilizaccedilatildeo simultacircnea de uma fonte luminosa e carbono
orgacircnico como fonte de energia
2431 Fonte de carbono orgacircnico (crescimento hetorotroacutefico)
A A platensis cresce principalmente em meios de cultura contendo carbono
inorgacircnico e poucos trabalhos tecircm sido publicados utilizando apenas fonte de
carbono orgacircnico Como fonte orgacircnica de carbono os accediluacutecares satildeo os substratos
mais utilizados para os cultivos heterotroacuteficos e mixotroacuteficos (ZHANG et al 1998
MARQUEZ et al 1993 CHOJNACKA NOWORYTA 2004b MUumlHLING et al 2005
ANDRADE COSTA 2007)
Ogawa and Terui (1970) foram os primeiros a relatar que uma cultura axecircnica
de Spirulina platensis cresce em meio mineral enriquecido com 1 de peptona e
tem uma taxa de crescimento maior que as culturas cultivadas em meio mineral
Marquez et al (1993) relataram que a Spirulina platensis cresce heterotroficamente
sob glicose em condiccedilotildees aeroacutebias no escuro bem como mixotroficamente na
presenccedila de luz Chojnacka e Noworyta (2004a) tambeacutem observaram o crescimento
51
da S platensis em condiccedilotildees heterotroacuteficas utilizando a glicose com fonte de
carbono e energia
S platensis podem utilizar tambeacutem glicerol como a uacutenica fonte de carbono no
entanto as ceacutelulas quando em contato com o glicerol pela primeira vez formam
agregados de ceacutelulas e passam por uma fase lag de adaptaccedilatildeo Apoacutes a sua sub-
cultura as ceacutelulas cresceram utilizando glicerol atingido 1287 mg L-1 e nos cultivos
com apenas bicarbonato como fonte de carbono obteve 1157mg L-1 (NARAYAN et
al 2005)
Por outro lado Soundarapandian e Vasanthi (2008) relataram que diferentes
cepas de S platensis isoladas de solo satildeo incapazes de utilizar apenas fontes de
carbono orgacircnico como D-glucose manitol sacarose e ureacuteia
2432 Fonte de carbono inorgacircnico (Crescimento autotroacutefico)
Microalgas fototroacuteficas requerem CO2 como fonte de carbono e este contribui
para o controle do pH no meio O pH do meio de cultivo eacute um dos fatores mais
importantes no cultivo de algas O pH determina a solubilidade do dioacutexido de
carbono e minerais no meio e influencia direta ou indiretamente o metabolismo das
algas O pH depende de vaacuterios fatores como composiccedilatildeo e capacidade tamponante
do meio quantidade de dioacutexido de carbono dissolvido temperatura (que determina a
solubilidade do CO2) e atividade metaboacutelica das ceacutelulas (BECKER 1995)
A fonte de carbono principal para a A platensis eacute o iacuteon bicarbonato no qual
entra na ceacutelula por transporte ativo O bicarbonato intracelular eacute entatildeo desidratado
via anidrase carbonica para CO2 o qual eacute incorporado no ciclo de Calvin via
ribulose-15-bifosfato carboxilase (RUBISCO) Este carbono eacute usado
simultaneamente para a siacutentese de todas as macromoleacuteculas nas ceacutelulas (proteiacutenas
carboidratos lipiacutedios e aacutecidos nucleacuteicos) a partir do 3-fosfoglicerato como metaboacutelito
intermediaacuterio (COGNE et al 2003)
Durante o cultivo autotroacutefico da Spirulina sp ocorre um raacutepido aumento do pH
no meio de cultura e isso eacute causado pela dissociaccedilatildeo do aacutecido carbocircnico (H2CO3)
em bicarbonato (HCO3-) e OH- (KIM et al 2007) e o bicarbonato eacute dissociado para
produzir CO2 e OH- (RICHMOND GROBBELAAR 1986) O aumento do pH atua
como um autoinibidor do crescimento celular (RICHMOND 2000) e portanto o CO2
pode ser utilizado para a manutenccedilatildeo do pH oacutetimo
52
Em cianobacteacuterias alcalofiacutelicas onde o pH de crescimento tiacutepico eacute 10 a
concentraccedilatildeo de CO2 eacute negligenciada sugerindo que o transporte de CO2 passivo
natildeo poderia contribuir significativamente para carbono inorgacircnico intracelular
Adicionalmente estudos tecircm mostrado que A platensis eacute fortemente dependente do
transporte simporte Na+HCO3- para a assimilaccedilatildeo do carbono inorgacircnico Como eacute
tiacutepico de alcalofiacutelicos a A platensis aparentemente natildeo manteacutem o gradiente de pH
externo positivo na sua membrana plasmaacutetica Consequentemente ocorre uma
extrusatildeo de soacutedio via bomba de soacutedio dependente de ATP em contraste com o
tranporte antiporte Na+H+ na maioria das cianobacteacuterias A Extrusatildeo de soacutedio na
presenccedila de um inibidor do FSII (diuron) indica que uma soma significante de ATP eacute
suplementada pelo transporte de eleacutetrons ciacuteclico em volta do FSI conteuacutedo na qual
em A platensis eacute excepcionalmente alto (BERRY et al 2003)
Anaacutelises quiacutemicas tecircm mostrado que biomassa algal consiste de 40 a 50 de
carbono na qual sugere que 15 a 2 kg de CO2 satildeo necessaacuterios para produzir 1 kg
de biomassa (SOBCZUK et al 2000) Do mesmo modo Chisti (2007) relata que
considerando que a biomassa microalgal possui aproximadamente 50 de carbono
em sua biomassa seca (SAacuteNCHEZ MIROacuteN et al 2003) todo esse carbono eacute
derivado do dioacutexido de carbono A produccedilatildeo de 100 toneladas de biomassa algal fixa
em torno de 183 toneladas de dioacutexido de carbono e este deve ser suplementado
continuamente durante o cultivo iluminado A adiccedilatildeo controlada do CO2 em
respostas aos sinais de sensores de pH minimizam a perda de CO2 e a variaccedilatildeo do
pH (CHISTI 2007)
O sistema de transporte do CO2 inclui a anidrase carbocircnica que converte o CO2
para HCO3- durante a passagem atraveacutes da membrana plasmaacutetica havendo um
acuacutemulo de HCO3- quando o CO2 eacute suplementado A concentraccedilatildeo de CO2
citoplasmaacutetico eacute abaixo do esperado no equiliacutebrio quiacutemico e de acordo com o
modelo proposto pelo mecanismo de concentraccedilatildeo de carbono esse desequiliacutebrio eacute
relatado pelo fato que a anidrase carbocircnica estaacute localizada dentro dos
carboxissomos na membrana plasmaacutetica eou membranas tilacoacuteidais e estaacute ausente
no citoplasma (KAPLAN REINHOLD 1999)
O CO2 entra na ceacutelula pela difusatildeo passiva e a conversatildeo do CO2 para o HCO3-
pela anidrase carbocircnica natildeo permite a sua passagem livremente para fora da ceacutelula
(CARRIERI et al 2007) A concentraccedilatildeo de CO2 nos carboxissomos eacute de 50000
vezes maior que a concentraccedilatildeo extracelular Isso implica em uma resistecircncia a
53
difusatildeo do CO2 pela membrana bioloacutegica extremamente alta apesar do CO2 ser
altamente permeaacutevel agrave membrana bilipiacutedica Geralmente as algas apresentam um
acuacutemulo de carbono inorgacircnico menor que em cianobacteacuterias isso por que a
RubisCO das algas apresentam maior afinidade pelo CO2 (KAPLAN REINHOLD
1999)
O CO2 que entra na ceacutelula por difusatildeo passiva eacute convertido para HCO3- pela
ldquoCA-likerdquo por uma reaccedilatildeo dependente de energia e a assimilaccedilatildeo ativa do HCO3-
que eacute contra seu potencial eletroquiacutemico depende do suplemento da energia
metaboacutelica Essa energia necessaacuteria eacute provavelmente dependente do transporte
ciacuteclico do eleacutetron em torno do FSI e da atividade do FSII (SOBCZUK et al 2000)
Portanto isso ainda natildeo tem sido estabelecido se esta dependecircncia eacute direta ou
indireta (via gradiente de iacuteons) A energia metaboacutelica deveria ser utilizada para
manter o gradiente de iacuteon O antiporte Na+H+ estaacute envolvido na regulaccedilatildeo e
manutenccedilatildeo do pH interno durante a entrada do HCO3- e subsequumlente fixaccedilatildeo do
CO2 (KAPLAN REINHOLD 1999)
As microalgas podem fixar carbono a partir de diferentes fontes tais como CO2
a partir da atmosfera CO2 a partir da exaustatildeo de gases industriais e CO2 na forma
de carbonatos soluacuteveis (eg NaHCO3 e Na2CO3) Tradicionalmente microalgas satildeo
cultivadas em reatores fechados ou abertos na qual satildeo aerados ou expostos ao ar
para permitir que a microalgas capturem o dioacutexido de carbono a partir da atmosfera
para o crescimento celular Como a atmosfera conteacutem somente 003 ndash 006 de
CO2 eacute esperado que a limitaccedilatildeo da transferecircncia de massa possa reduzir a
velocidade do crescimento das microalgas (CHELF et al 1993) Por outro lado
gases da exaustatildeo industrial tais como gases de combustatildeo possuem acima de 15
de CO2 fornecendo uma fonte rica de CO2 para o cultivo de microalgas e um
caminho potencialmente mais eficiente para biofixaccedilatildeo de CO2 Outra alternativa eacute
fixar o CO2 pela reaccedilatildeo quiacutemica para produzir carbonatos (exemplo Na2CO3) e usa-
la mais tarde como fonte de carbono para o cultivo de microalgas (WANG et al
2008)
Estudos sobre a eficiecircncia da utilizaccedilatildeo de CO2 por microalgas tecircm sido feitos
com o objetivo de melhorar a produtividade dos fotobiorreatores Morais e Costa
(2007b) observou que uma concentraccedilatildeo de Spirulina sp foi maior em cultivos
alimentados com 6 e 12 CO2 quando comparado ao cultivo utilizando somente o
ar atmosfeacuterico Watabane e Hall (1996) relataram um aumento na produtividade
54
correspondendo a 159 g de biomassa seca m-2 d-1 no cultivo utilizando o
fotobiorreator com air lift com ar enriquecido de CO2 (4)
Gordillo et al (1999) observaram uma reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo celular
maacutexima de S platensis devido a reduccedilatildeo na quantidade de proteiacutenas soluacuteveis
clorofila a carotenoacuteides totais e ficocianina nos cultivos enriquecido com 1 de CO2
em relaccedilatildeo aos cultivos enriquecidos com CO2 atmosfeacuterico (0035) Portanto altas
concentraccedilatildeo de CO2 podem inibir o crescimento dos micro-organismos
Em cultivo fotoautotroacutefico de Chlorella o conteuacutedo de proteiacutenas e pigmentos
foram maiores quando comparada com o cultivo heterotroacutefico (OGBONNA TANAKA
1997)
2433 Fonte de carbono inorgacircnico e orgacircnico simultaneamente
(crescimento mixotroacuteficos)
A presenccedila do metabolismo fotoautotroacutefico e heterotroacutefico simultacircneo tecircm sido
confirmado para o crescimento de microalgas como por exemplo Chlorella vulgaris
(MAacuteRQUEZ et al 1993) Heamatococcus pluvialis (KOBAYASHI et al 1992
MAacuteRQUEZ et al 1993) Chlorella pyrenoidosa (OGBANNA TANAKA 1996)
Euglena gracilis (OGBONNA et al 1999) Phaeodactylum tricornutum (CEacuteRON
GARCIA et al 2000) e cianobacteacuterias como Spirulina platensis (MARQUEZ et al
1995 CHOJANACKA NOWORYTA 2004 ZHANG et al 1998)
Durante o crescimento mixotroacutefico haacute dois processos metaboacutelicos
independentes dentro das ceacutelulas metabolismo fotossinteacutetico e a respiraccedilatildeo
aeroacutebia Nesse tipo de metabolismo a presenccedila do substrato orgacircnico significa que o
crescimento celular natildeo eacute estritamente dependente da fotossiacutentese e ateacute mesmo a
luz pode deixar de ser um fator indispensaacutevel para o crescimento celular
(CHOJNACKA NOWORYTA 2004a)
Eacute interessante notar que o crescimento especiacutefico de algumas microalgas (ex
Chlorella vulgares Haematococus pluvialis) crescendo mixotroficamente eacute a soma
de suas velocidades especiacuteficas de crescimento em culturas fotossinteacuteticas e
heterotroacuteficas (LEE 2001 OGBONNA et al 2000)
Um possiacutevel modo para obter uma alta concentraccedilatildeo de micro-organismos
fotossinteacuteticos eou produtos desses micro-organismos eacute o uso de cultura
mixotroacutefica onde fontes de carbono orgacircnicas e inorgacircnicas satildeo concomitantemente
fornecidas ao biorreator Sob determinadas condiccedilotildees de cultivo ambas a atividade
55
fotoautotroacutefica e a heterotroacutefica podem ocorrer simultaneamente e
independentemente resultando no aumento da velocidade especiacutefica de
crescimento como jaacute referido anteriormente
Maacuterquez et al (1993) relatam que a Spirulina platensis eacute capaz de crescer em
cultivo heterotroacutefico na presenccedila de glicose bem como mixotroficamente na
presenccedila de luz sugerindo que os crescimentos autotroacutefico e heterotroacutefico
funcionam independentemente no crescimento mixotroacutefico Nieva e Valiente (1996)
portanto observaram uma reduccedilatildeo na taxa de fixaccedilatildeo de CO2 em condiccedilotildees de
crescimento mixotroacutefico da Anabaena variabilis sugerindo que alguns aspectos do
metabolismo do CO2 podem ser modulados pela presenccedila de carbono orgacircnico Do
mesmo modo Kang et al (2004) observou que pode existir alguma interaccedilatildeo entre o
metabolismo de carbono orgacircnico e inorgacircnico uma vez que a presenccedila do carbono
inorgacircnico acelerou a assimilaccedilatildeo do carbono orgacircnico durante o cultivo do
Synechococcus spPCC7002 A intensidade luminosa favoreceu o crescimento
mixotroacutefico do Synechocystis sp PCC 6803 utilizando glicose como fonte de
carbono Este fenocircmeno pode ser explicado pelo efeito positivo da luz sobre o
fotossistema I (WANG et al 2002) A via glicoliacutetica o ciclo dos aacutecidos tricarboxiacutelicos
(TCA) e a fosforilaccedilatildeo oxidativa mitocondrial mantiveram alta atividade nos cultivos
de Chlorella pyrenoidosa durante a iluminaccedilatildeo indicando pouco efeito da luz nessas
vias metaboacutelicas Portanto o fluxo atraveacutes da via das pentoses fosfato durante a
iluminaccedilatildeo foi muito pequena devido a regulaccedilatildeo mediada pela luz (YANG et al
2000)
Adicionalmente Maacuterquez et al (1993) concluiacuteram que a Spirulina platensis tem
a habilidade de realizar a fermentaccedilatildeo embora soacute utilize essa estrateacutegia como um
modo de sobrevivecircncia sob condiccedilotildees anaeroacutebicas e no escuro
Nos cultivos de S platensis suplementados com glicose alcanccedilaram o
crescimento maior que nos cultivos sob condiccedilotildees de crescimento fotoautotroacuteficos
(MARQUEZ et al 1995 1993) Chen et al (2006) observaram que a suplementaccedilatildeo
de acetato como fonte de carbono proporcionou um aumento significante da
concentraccedilatildeo celular e da produccedilatildeo de clorofila a luteiacutena -caroteno ficocianina e
aloficocianina quando comparada ao cultivo fotoautotroacutefico
O melaccedilo subproduto da induacutestria de accediluacutecar que conteacutem mais do que 50 de
accediluacutecar tambeacutem pode ser um substrato suplementado de baixo custo na produccedilatildeo
56
industrial para o crescimento mixotroacutefico de Spirulina platensis (ANDRADE COSTA
2007)
O emprego de cultivos mixotroacuteficos pode levar as ceacutelulas agrave siacutentese de
compostos caracteriacutesticos tanto de cultivos fotoautotroacuteficos quanto heterotroacuteficos
como pode implicar em altas taxas de produccedilatildeo de biomassa (CERON GARCIA et
al 2000) Uma vez que num cultivo mixotroacutefico o CO2 e o carbono orgacircnico satildeo
simultaneamente assimilados este tipo de cultivo pode ser o processo mais eficiente
para a produccedilatildeo de biomassa microalgal visto que implica em uma economia na
energia gasta para a siacutentese de todo o aparato fotossinteacutetico e para a fixaccedilatildeo de
carbono (LEE 2004)
25 Produccedilatildeo de CO2 e VOCs proveniente da fermentaccedilatildeo alcoacuteolica
A revoluccedilatildeo industrial e a intesa utilizaccedilatildeo dos combustiacuteveis foacutesseis (carvatildeo
petroacuteleo e gaacutes natural) estatildeo associadas ao elevado niacutevel de vida das sociedades
ocidentais Contudo as reservas de combustiacuteveis foacutesseis satildeo limitadas e a sua
utilizaccedilatildeo tem impactos ambientais consideraacuteveis como por exemplo o aumento do
efeito estufa e as consequumlentes alteraccedilotildees do clima Neste contexto o etanol surge
como uma alternativa vaacutelida em termos de fonte de energia renovaacutevel e menos
poluente
Nas uacuteltimas deacutecadas o etanol tem ocupado um lugar de destaque e de grande
importacircncia tecnoloacutegica firmando-se como um produto estrateacutegico economicamente
por ser amigaacutevel com o meio ambiente pois eacute um aditivo ao combustiacutevel que reduz
a emissatildeo de monoacutexido de carbono oacutexido de nitrogecircnio e hidrocarbonos (WHEALS
et al 1999) e por ser produzido a partir de biomassa renovaacutevel como accediluacutecar e
amido atualmente e materiais de lignocelulose no futuro (GOLDEMBERG 2009)
Inicialmente o objetivo de utilizar o aacutelcool combustiacutevel era se tornar
independente do mercado do petroacuteleo e reduzir os custos de sua importaccedilatildeo Hoje
em dia a ecircnfase do uso do etanol combustiacutevel estaacute sobre a reduccedilatildeo da poluiccedilatildeo
devido ao protocolo de Quioto para limitar o aquecimento global (WHEALS et al
1999) Na produccedilatildeo e combustatildeo do etanol de milho pode reduzir em ateacute 12 a
emissatildeo de gases causadoras do efeito estufa quando comparado com o uso de
combustiacuteveis foacutesseis (HILL et al 2006) e quando utilizado etanol de cana-de-accediluacutecar
essa reduccedilatildeo pode ser de 66 (ANDREOLI SOUZA 2006)
57
O aacutelcool estaacute em expansatildeo por ser um combustiacutevel de baixo custo renovaacutevel e
cujo emprego como alternativa para a matriz energeacutetica mundial estaacute em fase de
crescimento A tendecircncia de aumento da produccedilatildeo de aacutelcool no Brasil ocorre por
vaacuterios fatores como aumento da frota de carros bi-combustiacutevel (demanda interna)
Protocolo de Quioto (demanda externa) e aumento do preccedilo do petroacuteleo Poliacuteticas
similares tecircm sido adotadas pela Uniatildeo Europeacuteia Japatildeo e Estados Unidos
(GOLDEMBERG et al 2007) Por essas razotildees a demanda por etanol no mercado
internacional tem sido crescente nos uacuteltimos anos O Brasil aleacutem de ser um dos
maiores produtores e consumidores de etanol eacute tambeacutem o maior exportador no
cenaacuterio global Segundo dados da Uniatildeo da Induacutestria de Cana de Accediluacutecar (Unica) ateacute
2016 o Brasil produziraacute 129 bilhotildees de litros de etanol para o mercado externo Na
safra 20082009 o total de etanol produzido foi de 275 bilhotildees de litros (UacuteNICA)
O Brasil e os Estados Unidos satildeo liacutederes mundiais na produccedilatildeo de etanol
utilizando como mateacuteria prima a cana de accediluacutecar e milho respectivamente Os dois
paiacuteses acumulam cerca de 70 da produccedilatildeo mundial (ROMERO 2007) Aleacutem disso
o Brasil lidera a produccedilatildeo mundial de cana-de-accediluacutecar (principal mateacuteria-prima do
etanol) sendo essa uma induacutestria que movimenta vaacuterios bilhotildees de doacutelares por ano
O fato de o etanol ser produzido dentro do Brasil representa uma menor
dependecircncia de petroacuteleo externo diminuindo substancialmente os gastos com
importaccedilotildees
O agronegoacutecio da cana-de-accediluacutecar movimenta R$ 40 bilhotildees por ano no paiacutes A
safra 20072008 ficou entre 547 milhotildees de toneladas de cana-de accediluacutecar 152 a
mais do que a safra anterior Metade dela eacute destinada agrave fabricaccedilatildeo de etanol o que
faz do Brasil o segundo maior produtor de combustiacutevel no mundo O primeiro lugar
cabe aos Estados Unidos que extraem etanol de milho a poder de pesados
subsiacutedios Dois terccedilos da produccedilatildeo nacional estatildeo no estado de Satildeo Paulo Avalia-
se que o Brasil precisaraacute dobrar sua produccedilatildeo num horizonte de 5 a 7 anos se
quiser suprir as demandas locais e internacionais do combustiacutevel Isso exigiraacute a
construccedilatildeo de novas usinas o crescimento das aacutereas plantadas melhorias no
manejo e principalmente ganhos de produtividade (MARQUES 2008)
O cenaacuterio futuro mostra que paiacuteses como Estados Unidos Japatildeo e Europa vatildeo
precisar importar mais de 10 bilhotildees de litros de etanol ateacute 201112 Se uma
tonelada de cana produz 88 litros de etanol precisaria adicionar mais de 110
milhotildees de toneladas de cana para atender o mercado futuro o que acrescentaria
58
mais 12 milhotildees de hectares A UNICA (Uniatildeo da induacutestria de cana-de-accediluacutecar)
prevecirc um crescimento da produccedilatildeo de 6 a 7 anualmente chegando a uma
produccedilatildeo de 560 milhotildees de toneladas de cana em 201011 (ANDREOLI SOUZA
2006)
A quantidade de CO2 liberada diretamente para a atmosfera devido ao aumento
da sua produccedilatildeo mundial pode causar prejuiacutezos ao meio ambiente No Brasil a
produccedilatildeo de etanol por processos fermentativos principalmente pelo processo
descontiacutenuo alimentado ou contiacutenuo utilizando mosto de melaccedilo de cana-de-accediluacutecar
eou caldo de cana-de-acuacutecar tem no cultivo da Saccharomyces cerevisiae um
grande impacto no acircmbito socioeconocircmico Existem cerca de 300 induacutestrias que
utilizam fermentaccedilatildeo alcooacutelica no Brasil que movimentam bilhotildees de doacutelares e
geram 6 dos empregos totais do Paiacutes (Uniatildeo da Agroinduacutestria Canavieira de Satildeo
Paulo 2006)
No Brasil 70 das destilarias de cana-de-accediluacutecar usam o processo
descontiacutenuo com uma capacidade fermentativa acima de 15 milhotildees de litros de
etanol por dia e aproximadamente 350 destilarias usam a fermentaccedilatildeo contiacutenua
(WHEALS et al 1999) Estudos comparativos e avaliaccedilotildees econocircmicas de diversos
processos utilizados na produccedilatildeo de etanol concluiacuteram que fermentaccedilatildeo contiacutenua
apresentava uma reduccedilatildeo de 57 no investimento de capital fixo em destilarias
quando comparado ao daquelas que utilizam processo em batelada Uma reduccedilatildeo
ainda maior de 68 e 71 eacute obtida para os processos que utilizam reciclo de ceacutelulas
e operaccedilatildeo a vaacutecuo respectivamente (CYSEWSKI WILKE 1978)
A fermentaccedilatildeo contiacutenua apresenta menor custo de investimento maior
facilidade para a instalaccedilatildeo de sistemas de automaccedilatildeo e ausecircncia de ldquotempos
mortosrdquo que eacute o tempo em dado momento do ciclo fermentativo natildeo estaacute produzindo
tiacutepico de processos descontiacutenuo Aleacutem disso a fermentaccedilatildeo contiacutenua tende a
consumir menos anti-espumante decorrecircncia da alimentaccedilatildeo mais estaacutevel de
accediluacutecar para o processo e tambeacutem da geometria dos fermentadores Por outro lado
a fermentaccedilatildeo contiacutenua apresenta maiores dificuldades quando temos que lidar com
contaminantes indesejaacuteveis no processo Natildeo eacute possiacutevel promover a assepsia de
fermentadores de bombas e de trocadores com frequumlecircncia como ocorre no sistema
em bateladas Desta maneira a fermentaccedilatildeo contiacutenua tende a consumir mais aacutecido
sulfuacuterico e mais antibioacutetico
59
Segundo Romano et al (2003) as transformaccedilotildees quiacutemicas que ocorrem
durante a fermentaccedilatildeo por leveduras satildeo a conversatildeo dos accediluacutecares em etanol e
CO2 e em menores quantidades a formaccedilatildeo de CVOs Basso et al (1996) relata
que durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica por levedura os produtos da fermentaccedilatildeo satildeo
constituiacutedos de 43 ndash 47 de etanol 41 - 45 de gaacutes carbocircnico e o restante satildeo
formados por outros compostos orgacircnicos tais como glicerol aacutecido succiacutenico aacutecido
aceacutetico entre outros Dentre os volaacuteteis orgacircnicos majoritaacuterios produzidos durante a
fermentaccedilatildeo de mosto de cana-de-accediluacutecar por Saccharomyces cerevisiae
encontram-se o etanol acetaldeiacutedo propanol isobutanol aacutelcool isoamiacutelico acetato
de etila (CACHOT et al 1991) Durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica do mosto de cana-
de-accediluacutecar os principais componentes gasosos satildeo o CO2 e o etanol mas outros
aacutelcoois e aacutecidos tambeacutem satildeo liberados em menores quantidades na forma gasosa
(VENTURINI FILHO e MENDES 2003)
A reaccedilatildeo quiacutemica simplificada da produccedilatildeo de etanol a partir da sacarose da
cana-de-accediluacutecar eacute
C12H22O11 +H2O rarr 4C2H5OH + 4CO2 (3)
Onde 342 g de sacarose produz 184 g de etanol e 176 g de CO2 Com isso
pode-se estimar que cada grama de sacarose produz 0514g de CO2 assumindo
uma recuperaccedilatildeo de CO2 em 100 no caso de induacutestrias dedicadas a produccedilatildeo de
etanol No entanto as induacutestrias de produccedilatildeo de etanol tambeacutem utilizam como
mateacuteria-prima o melaccedilo um sub-produto da produccedilatildeo de accediluacutecar industrial a partir
da cana-de-accediluacutecar que conteacutem cerca de 15 da sacarose inicial (MOLLERSTEN et
al 2003) e represeta mais de 75 do custo total de produccedilatildeo de etanol
(CYSEWSKI WILKE 1978)
Cada litro de etanol produzido pela fermentaccedilatildeo alcooacutelica resulta em
aproximadamente 076 kg de CO2 portanto a capacidade de produccedilatildeo de CO2
durante a fermentaccedilatildeo de etanol combustiacutevel nos EUA e o Brasil eacute de
aproximadamente 84 e 106 toneladas de CO2 por ano respectivamente
(KHESHGI PRICE 2005) No Brasil a produccedilatildeo meacutedia de etanol a partir da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica eacute de 180 milhotildees de litros por ano gerando
consequentemente 014 milhotildees de CO2 por ano (MOLLERTEN et al 2003)
O uso do biocombustiacutevel traz uma seacuterie de benefiacutecios associados agrave reduccedilatildeo
dos gases de efeito estufa e de outros poluentes atmosfeacutericos tais como o enxofre
aleacutem da reduccedilatildeo do consumo de combustiacuteveis foacutesseis Poreacutem no processo de
60
fabricaccedilatildeo uma seacuterie de resiacuteduos e subprodutos industriais eacute gerada os quais
podem quando adequadamente geridos contribuir para a viabilidade econocircmica da
produccedilatildeo de biocombustiacuteveis Esses resiacuteduos possuem potencial para uso na
induacutestria de alimentos e para a nutriccedilatildeo animal bem como na induacutestria quiacutemico-
farmacecircutica mas haacute uma grande carecircncia de estudos de anaacutelises de viabilidade
teacutecnica e financeira que possam apontar as melhores alternativas de custo-
benefiacutecio para o processamento e tratamento desses resiacuteduos os quais podem
agregar valor e reduzir os custos de produccedilatildeo de biocombustiacuteveis com o
aproveitamento e venda destes produtos e seus derivados
Um nuacutemero de subprodutos da induacutestria do etanol combustiacutevel pode ter o
potencial para a aplicaccedilatildeo de nutracecircuticos ou de alimentos funcionais que eacute uma
das aacutereas de grande interesse atualmente e representa um mercado potencial
enorme ainda em seu desenvolvimento inicial Por isso o interesse em utilizar
micro-organismos fotossintetizantes devido a sua capacidade de reduzir a emissatildeo
de CO2 e de CVOs na atmosfera subproduto da induacutestria de etanol produzindo
compostos de alto valor industrial
61
3 Objetivos
Geral
Este trabalho tem como objetivo verificar a influecircncia do efeito da adiccedilatildeo de
CO2 proveniente de cilindro ou da fermentaccedilatildeo alcooacutelica mantendo o pH no valor
oacutetimo igual a 95 no cultivo de A platensis em reatores tubulares utilizando nitrato ou
ureacuteia como fonte de nitrogecircnio em diferentes intensidades luminosas
Especiacuteficos
Avaliar os testes preliminares da fermentaccedilatildeo alcoacuteolica contiacutenua utilizada para
posterior acoplamento dos gases liberados durante a fermentaccedilatildeo com os
cultivos de A platensis
Avaliar os paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima produtividade em ceacutelulas
e fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas usando anaacutelise de variacircncia
multivariaacutevel nos cultivos de A platensis
Determinar a composiccedilatildeo centesimal da A platensis no final dos cultivos teor
de proteiacutenas lipiacutedios cinzas e carboidratos usando a anaacutelise de variacircncia
multivariaacutevel
Estudar os paracircmetros bioenergeacuteticos da A platensis durante os cultivos
utilizando CO2 de cilindro avaliando os andamentos em funccedilatildeo do tempo dos
paracircmetros valor teoacuterico da energia de Gibbs dissipada para o crescimento
(1YGX) das produccedilotildees molares de O2 consumo de H+ e absorccedilatildeo de foacutetons
para produzir 1 C-mol de biomassa
Calcular o rendimento teoacuterico da energia fixada pelo aparato fotossinteacutetico
energia transformada em ATP e a energia liberada como calor calculando-se a
partir da energia molar de Gibbs absorvida da luz pelo aparato fotossinteacutetico
Comparar o comportamento celular em duas diferentes configuraccedilotildees de
fotobiorreatores tubulares um horizontal e outro helicoidal
62
4 Materiais e meacutetodos
41 Fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
O CO2 proveniente da fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua foi utilizado como fonte
de carbono para o cultivo de A platensis O desprendimento desse gaacutes do reator foi
arrastar volaacuteteis orgacircnicos formados na fermentaccedilatildeo cujas interferecircncias nos
cultivos de A platensis foram avaliadas Para os cultivos contiacutenuos de fermentaccedilatildeo
alcooacutelica foi utilizado o mosto de melaccedilo de cana-de-accediluacutecar
411 Testes preliminares para emprego da fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
4111 Teste para avaliar a influecircncia do tratamento do melaccedilo na
determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular
Para a realizaccedilatildeo desse teste foi preparada uma suspensatildeo celular de 300g L-1
de levedura uacutemida em aacutegua destilada a partir dessa suspensatildeo foram retirados sob
agitaccedilatildeo 10 mL e adicionados em dois diferentes frascos um contendo 290 mL de
melaccedilo natildeo clarificado (item 41111) e outro contendo 290 mL de melaccedilo
previamente clarificado (item 41112) de modo que a concentraccedilatildeo celular final de
cada frasco tenha 10g L-1 em 300 mL de mosto A partir dessa suspensatildeo foram
retirados 5 mL para a anaacutelise da concentraccedilatildeo celular como descrito no item 4311
41111 Melaccedilo natildeo tratado
O melaccedilo natildeo tratado consiste apenas na sua diluiccedilatildeo com aacutegua potaacutevel e
preparado como descrito no item 41113
41112 Melaccedilo tratado
O tratamento do melaccedilo consistiu de sua preacutevia clarificaccedilatildeo diluiccedilatildeo e
suplementaccedilatildeo adequadas A clarificaccedilatildeo foi realizada com diluiccedilatildeo do melaccedilo pela
adiccedilatildeo de aacutegua potaacutevel em partes iguais e adiccedilatildeo de 15 g de fosfato de soacutedio
monobaacutesico como agente floculante em cada litro da soluccedilatildeo de melaccedilo diluiacutedo
Posteriormente esse melaccedilo diluiacutedo foi autoclavado a 121 ordmC por 10 minutos Apoacutes
o aquecimento foi mantido em repouso no miacutenimo por 48 horas para a
sedimentaccedilatildeo do material em suspensatildeo O melaccedilo clarificado foi entatildeo sifonado
63
pronto para ser diluiacutedo com aacutegua e preparado como descrito no item 41113 sem
a adiccedilatildeo do antibioacutetico O mosto foi esterilizado em autoclave a 121 ordmC durante 30
minutos (PEREGO JUacuteNIOR 1979)
41113 Preparaccedilatildeo do melaccedilo
O melaccedilo foi diluiacutedo ateacute concentraccedilatildeo 170 g L-1 em accediluacutecares redutores totais
(ART) (GUERREIRO et al 1997) e suplementado com ureacuteia na concentraccedilatildeo de 05
g L-1 suficiente para que a fonte de nitrogecircnio natildeo se torne fator limitante da
atividade da levedura (MAGALHAtildeES 1978 CARVALHO 1994 PEREGO-JUNIOR
1979) O pH do mosto foi ajustado em 45 (JONES et al 1981) pela adiccedilatildeo de aacutecido
sulfuacuterico concentrado ou pela adiccedilatildeo de soluccedilatildeo de hidroacutexido de soacutedio 4N Por fim
adicionou-se penicilina V aacutecida (500 UIL) como antibioacutetico (AQUARONE 1960
CARVALHO et al 2003)
4112 Teste para avaliar a homogeneidade do reator
Para a realizaccedilatildeo do teste de homogeneidade foi preparado 10 litros de uma
suspensatildeo celular de 9 g L-1 de levedura em aacutegua destilada e adicionada ao
fermentador Apoacutes 30 minutos de homogeneizaccedilatildeo mecacircnica do material iniciou
uma contiacutenua adiccedilatildeo de aacutegua destilada e retirada da amostra a uma vazatildeo
especiacutefica de alimentaccedilatildeo calculada (Dc) igual a 0124 h-1 No intervalo de 30
minutos em diferentes regiotildees do reator as amostras foram recolhidas para
determinar a concentraccedilatildeo celular A homogeneidade do reator eacute verificada se a
queda da concentraccedilatildeo celular for uma funccedilatildeo exponencial
4113 Teste para determinar a vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo
Foram realizados 3 experimentos com a fermentaccedilatildeo contiacutenua nas condiccedilotildees
descritas no item 415 Os valores de vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo (D) foram 01
h-1 005 h-1 e 0025 h-1
412 Micro-organismo e condiccedilotildees de manutenccedilatildeo
Saccharomyces cerevisiae CCT7150 uma cepa isolada de planta industrial de
fermentaccedilatildeo alcooacutelica nacional (Usina Nova Ameacuterica) e produtora de altas
concentraccedilotildees de etanol a partir de melaccedilo adquirida da Fundaccedilatildeo Andreacute Tosello
foi utilizada nos cultivos contiacutenuos Sua manutenccedilatildeo em tubo de ensaio foi no meio
Sabourand (Merckreg) A cultura foi armazenada sob refrigeraccedilatildeo a 4 ordmC
64
413 Preparo do inoacuteculo
As ceacutelulas de levedura estocada foram multiplicadas em tubos contendo meio
soacutelido Sabourand e incubadas em estufa a 30 ordmC por 24 h Posteriormente as
culturas foram inoculadas com alccedila de platina sob condiccedilotildees asseacutepticas em tubos
contendo 10 mL do meio Sabourand e incubadas em estufa a 30 ordmC por 24 h Cada
tubo por sua vez inoculou um frasco de Erlenmeyer de 500 mL contendo 90 mL de
mosto de melaccedilo de cana-de-accediluacutecar contendo 5 de ART que foi entatildeo incubado
a 30 ordmC por 12 h em agitador rotativo a 400 rpm Decorrido este tempo o conteuacutedo
de 10 frascos de Erlenmeyer preparados com o preacute-inoacuteculo (1 L) foi adicionado agrave
dorna juntamente com o mosto (9 L) nas condiccedilotildees em que se trabalhou no
processo contiacutenuo resultando em um volume uacutetil do fermentador de 10 litros que
deu iniacutecio a uma fermentaccedilatildeo descontiacutenua (PEREGO JUacuteNIOR 1979)
414 Dispositivo para a cultura
Foi utilizado um fermentador fabricado pela INFORs HT com dornas de vidro
de 10 litros de capacidade nominal com controles de temperatura pH niacutevel de
espuma e frequumlecircncia de agitaccedilatildeo com saiacutedas que foram conectadas a uma bomba
peristaacuteltica para alimentaccedilatildeo do mosto e retirada do material durante a fermentaccedilatildeo
contiacutenua
415 Descriccedilatildeo das condiccedilotildees de fermentaccedilatildeo contiacutenua
O cultivo contiacutenuo teve como iniacutecio o cultivo descontiacutenuo como descrito acima
(item 413) A alimentaccedilatildeo contiacutenua do mosto ocorreu apoacutes um periacuteodo de 6 a 8 h
da inoculaccedilatildeo do S cerevisiae na dorna para garantir que o micro-organismo se
encontre na fase exponencial de crescimento A concentraccedilatildeo de accediluacutecares no mosto
de alimentaccedilatildeo foi de 170 g L-1 (GUERREIRO et al 1997) expressa em ART O
mosto foi suplementado com sulfato de amocircnio na concentraccedilatildeo de 1 g L-1 A
temperatura de fermentaccedilatildeo foi mantida a 30 plusmn 1 ordmC (KOCK et al 2000) com
frequumlecircncia do agitador de 500 rpm A vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo foi
determinada em ensaios preliminares (item 61)
65
42 Cultivo de A platensis
421 Micro-organismo e manutenccedilatildeo
Spirulina (Arthrospira) platensis UTEX (1926) foi mantida em meio liacutequido de
cultivo padratildeo para Arthrospira (item 4221) em tubos hermeticamente fechados
422 Meio de cultivo
Foram utilizados dois tipos de meio Um meio padratildeo para o cultivo de
Arthrospira (SCHLOumlSSER 1982) ndash item 4221 com NaNO3 como fonte de
nitrogecircnio que foi utilizado para duas finalidades manutenccedilatildeo do micro-organismo e
preparo do inoacuteculo um meio modificado (item 4122) onde se utilizou ureacuteia como
fonte de nitrogecircnio
4221 Meio padratildeo para cultivo de A platensis
O meio mineral padratildeo foi o de Schloumlsser (1982) cuja composiccedilatildeo por litro de
aacutegua destilada eacute a seguinte
NaHCO3 1361g
Na2CO3 403g
K2HPO4 050g
NaNO3 250g
K2SO4 100g
NaCl 100g
MgSO47H2O 020g
CaCl22H2O 004g
Soluccedilatildeo de metal PIV 6mL
Soluccedilatildeo de micronutrientes Chu 1mL
Vitamina B12 (15g100mL H2O) 1mL
Soluccedilatildeo de metal PIV (em 1 litro de aacutegua destilada)
Na2EDTA 750 mg
FeCl36H2O 97 mg
MnCl24H2O 41 mg
ZnCl2 5 mg
CoCl26H2O 2 mg
Na2MoO42H2O 4 mg
66
Soluccedilatildeo de micronutrientes Chu (em 1 litro de aacutegua destilada)
Na2EDTA 50 mg
H3BO3 618 mg
CuSO45H2O 196 mg
ZnSO47H2O 44 mg
CoCl26H2O 20 mg
MnCl2middot4H2O 12 mg
Na2MoO4middot2H2O 12 mg
4222 Meio modificado
O meio de Schloumlsser (1982) foi utilizado com substituiccedilatildeo do nitrato de soacutedio
por ureacuteia
A massa diaacuteria de ureacuteia adicionada por unidade de volume foi determinada de
acordo com o experimento padratildeo utilizando nitrato de soacutedio como fonte de
nitrogecircnio (descrito no item 5)
423 Preparo do inoacuteculo
A A platensis foi inoculada em 10 mL de meio liacutequido (em tubo de ensaio) em
condiccedilotildees asseacutepticas Depois de 7 dias esse material foi utilizado para inocular
frascos de Erlenmeyer de 500 mL com 200mL de meio de cultivo padratildeo (item
4121) previamente esterilizado por autoclavaccedilatildeo
Os erlenmeyers apoacutes o repique foram imediatamente levados a agitador
rotativo a 100 min-1 (FERRAZ 1986) temperatura de 30 OC e iluminacircncia de 72
mol de foacutetons m-2 s-1 (CARVALHO et al 2004)
O crescimento celular foi acompanhado sendo utilizada para inoacuteculo uma
suspensatildeo de A platensis apoacutes de 6 a 8 dias de cultivo (PELIZER et al 2003) em
crescimento exponencial isenta de contaminaccedilatildeo Nos cultivos utilizando meio
mineral padratildeo a suspensatildeo foi filtrada lavada e ressuspensa em meio de cultivo
padratildeo Nos cultivos utilizando ureacuteia como fonte alternativa de nitrogecircnio a
suspensatildeo foi filtrada lavada com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada do NaNO3 e
ressuspensa em meio de cultivo padratildeo isento de NaNO3 Estas suspensotildees foram o
inoacuteculo para o cultivo no reator tubular onde foram realizados os estudos
empregando NaNO3 como fonte de nitrogecircnio padratildeo e a ureacuteia como fonte
67
alternativa de nitrogecircnio com o pH do cultivo controlado pela adiccedilatildeo de CO2
proveniente de cilindro ou da fermentaccedilatildeo alcooacutelica
424 Dispositivo para cultura
4241 Fotobiorreator tubular horizontal
O fotobiorreator tubular utilizado eacute apresentado na Figura 7 Este eacute constituiacutedo
por 20 tubos de vidro transparentes (diacircmetro interno de 10 cm) (CARLOZZI
PINZANI 2005) com inclinaccedilatildeo de 2 (115ordm) (TREDICI ZITTELLI 1998) para
facilitar o escoamento do liacutequido interligados com mangueiras de PVC de mesmo
diacircmetro interno de forma que o volume iluminado corresponde a 212 litros
(606) O volume total do sistema foi de 35 litros A recirculaccedilatildeo de liacutequido foi de
26 L h-1 para evitar a sedimentaccedilatildeo da biomassa e melhorar a transferecircncia de
massa
Na parte mais baixa dos tubos do reator tubular haacute um tubo na forma de Y que
recebe ar proveniente de uma bomba deslocando a suspensatildeo celular para um
frasco na parte superior provido de agitaccedilatildeo com um agitador magneacutetico Tambeacutem
na parte inferior do reator haacute uma conexatildeo no qual ocorre entrada de CO2 para
manutenccedilatildeo de pH quando da abertura da vaacutelvula solenoacuteide controlada por um
controlador de pH
Figura 7 Fotobiorreator tubular horizontal utilizado no cultivo de A platensis
68
4242 Fotobiorreator tubular espiralado
O fotobiorreator tubular espiralado utilizado eacute apresentado na Figura 8 Este eacute
constituiacutedo por 5 conjuntos de tubos espiralados de vidro transparentes (diacircmetro
interno de 10 cm) (CARLOZZI PINZANI 2005) interligados com mangueiras de
PVC de mesmo diacircmetro interno Cada conjunto eacute constituiacutedo por 3 tubos
espiralados logo o reator conteacutem no total 15 tubos de vidros espiralados de forma
que o volume iluminado corresponde a 665 ml (606 ) O volume total do sistema
foi de 11 litros A recirculaccedilatildeo de liacutequido foi de 26 L h-1 para evitar a sedimentaccedilatildeo
da biomassa e melhorar a transferecircncia de massa
Na parte mais baixa dos tubos do reator tubular haacute um tubo na forma de Y que
recebe ar proveniente de uma bomba deslocando a suspensatildeo celular para um
frasco na parte superior Tambeacutem na parte inferior do reator haacute uma conexatildeo no
qual ocorre entrada de CO2 para manutenccedilatildeo de pH
Figura 8 Fotobiorreator tubular espiralado utilizado no cultivo de A platensis
425 Descriccedilatildeo de um experimento tiacutepico de cultivo da A platensis
A suspensatildeo de Arthrospira (item 43) foi adicionada ao biorreator tubular na
concentraccedilatildeo inicial de 400 mg L-1 (SOLETTO et al 2008) e o volume de trabalho
foi de 35 L no fotobiorreator tubular horizontal e de 11 L no fotobiorreator tubular
espiralado Devido a evaporaccedilatildeo e a retirada de amostras o meio de cultura isento
da fonte de nitrogecircnio foi adicionado para manter o volume constante
69
Nos experimetos utilizando NaNO3 como fonte de nitrogecircnio a concentraccedilatildeo
inicial deste foi de 25 g L-1 e ocorreram adiccedilotildees do nitrato de soacutedio de modo que sua
concentraccedilatildeo natildeo fosse inferior a 1 g L-1 (FAINTUCH 1989) desta forma evitaria a
limitaccedilatildeo do crescimento celular pela fonte de nitrogecircnio No cultivo utilizando a
fonte de nitrogecircnio alternativa (ureacuteia) a adiccedilatildeo diaacuteria foi efetuada por pulsos (adiccedilatildeo
intermitente) (SAacuteNCHEZ-LUNA et al 2004) As intensidades luminosas foram
medidas com um sensor quantum (model LI-190 SB Li-Cor Lincoln Neb USA) As
diferentes fontes de nitrogecircnio e intensidades luminosas foram preacute-estabelecida de
acordo com o plano de trabalho (Item 5)
O valor de pH nos cultivos foi mantido em 95 plusmn 02 (SANCHEZ-LUNA et al
2007 TREDICI ZITTELLI 1998) com auxiacutelio de um aparelho controlador de pH
METTLER TOLEDO acoplado a uma vaacutelvula solenoacuteide Nos ensaios com CO2 puro
(999) a valvula solenoiacutede estava ligada a um cilindro de CO2 e nos ensaios com
CO2 proveniente de fermentaccedilatildeo alcooacutelica a vaacutelvula solenoacuteide foi ligada agrave tubulaccedilatildeo
proveniente de um reator operando com processo contiacutenuo de fermentaccedilatildeo alcooacutelica
em regime permanente
A temperatura de 29 plusmn 1ordmC (SAacuteNCHEZ-LUNA et al 2007) foi mantida por ar
condicionado que climatizou a temperatura da sala onde estaacute localizada o reator
No final do experimento o reator foi lavado com soluccedilatildeo de hipoclorito de soacutedio
5 por 16 h e com uma soluccedilatildeo de tiosulfato de soacutedio (Na2S2O3) 50 mM para
neutralizar o clorito residual de acordo com De Beer et al (1994)
43 Teacutecnicas Analiacuteticas
Na fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua ateacute o estabelecimento de regime
permanente as determinaccedilotildees de concentraccedilatildeo celular pH ART etanol no caldo
fermentado foram determinados a cada 12 horas Estabelecido o regime
permanente as determinaccedilotildees de concentraccedilatildeo celular pH ART etanol foram
feitas diariamente O efluente gasoso foi analisado qualitativamente para
identificaccedilatildeo dos principais compostos volaacuteteis orgacircnicos
No cultivo de Arthrospira a concentraccedilatildeo celular foi feita diariamente ateacute atingir
concentraccedilatildeo celular maacutexima As medidas de concentraccedilatildeo de nitrato ureacuteia residual
amocircnia e de carbonato total em funccedilatildeo dos relativos grandes volumes necessaacuterios
para a execuccedilatildeo das teacutecnicas foram realizadas a cada dois dias Nos cultivos
utilizando o CO2 proveniente da fermentaccedilatildeo alcooacutelica foram analisados os
70
compostos volaacuteteis orgacircnicos presentes no meio isento de ceacutelulas A concentraccedilatildeo
de clorofila a foi determinada no final de cada experimento bem como a
determinaccedilatildeo de proteiacutenas lipiacutedios totais carboidratos e cinzas
431 Acompanhamento da fermentaccedilatildeo alcooacutelica
4311 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular
A concentraccedilatildeo celular expressa em massa seca foi determinada por filtraccedilatildeo
de acordo com metodologia descrita por Carvalho et al (2003) Um volume de 5 mL
da amostra foi filtrada em membrana millipore 12 microm de porosidade previamente
seca em estufa a 105 ordmC por 4 horas e em dessecador por 1 h e pesada A biomassa
filtrada e lavada com 50 mL de aacutegua destilada foi seca em estufa a 105 ordmC por 4
horas e em dessecador por 1 h e posteriormente pesada A concentraccedilatildeo celular foi
determinada por diferenccedila de massa antes e apoacutes a filtraccedilatildeo
4312 Determinaccedilatildeo do pH
O pH seraacute acompanhado por potenciometria com um aparelho da marca
METTLER TOLEDO
4313 Determinaccedilatildeo de ART
A determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ART foi realizada por espectrofotometria a
540 nm pelo meacutetodo de SOMOGYI-NELSON (1952) precedido da hidroacutelise da
sacarose contida na fase liacutequida do meio de fermentaccedilatildeo realizada pela teacutecnica de
Falcone e Marques (1965)
A hidroacutelise da sacarose foi feita por hidroacutelise aacutecida utilizando 5 mL da amostra
e 25 mL da soluccedilatildeo de aacutecido cloriacutedrico 13 N e deixou-se em banho de aacutegua a 70 ordmC
por 15 minutos Deixou-se esfriar essa soluccedilatildeo ateacute a temperatura ambiente e foi
adicionado NaOH 6N ateacute verificar uma mudanccedila no pH utilizando fenolfitaleiacutena
como indicador Posteriormente completou-se o volume final para 100 mL com aacutegua
destilada diluindo-se assim a amostra 20 vezes A partir dessa soluccedilatildeo jaacute diluiacuteda
fizeram-se novas diluiccedilotildees necessaacuterias para a determinaccedilatildeo do ART pelo meacutetodo de
Somogyi-Nelson (1952)
71
A anaacutelise compreende na adiccedilatildeo de 1 mL da amostra convenientemente diluiacuteda
e 1 mL do reativo de Somogy em tubo de Folin-Wu onde foi fervido durante 10
minutos resfriado em aacutegua com gelo Apoacutes o resfriamento adicionou-se 2 mL do
reativo de Nelson e agitou-se os tubos em agitador ateacute expulsar os gases formados
Completou-se o volume para 25 mL com aacutegua destilada e a soluccedilatildeo foi lida em
espectrofotometro a 520 nm Foi feito um branco substituindo a amostra por aacutegua
destilada
O accediluacutecar aquecido com uma soluccedilatildeo alcalina de tartarato de cobre leva agrave
obtenccedilatildeo de oacutexido cuproso que reagindo com molibdato de arsecircnio possibilita a
produccedilatildeo de um composto de coloraccedilatildeo azul passiacutevel de ser quantificada por
colorimetria a adiccedilatildeo de sulfato de soacutedio a mistura minimiza a entrada de oxigecircnio
na soluccedilatildeo responsaacutevel pela reoxidaccedilatildeo do oacutexido cuproso
4314 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol
A determinaccedilatildeo do etanol foi realizada atraveacutes do meacutetodo de oxidaccedilatildeo por
dicromato de potaacutessio proposto por Joslyn (1907)
O etanol foi determinado mediante a destilaccedilatildeo atraveacutes de um microdestilador
de KJELDHAL e recolhido em 20 mL de uma soluccedilatildeo de dicromato de potaacutessio
fortemente acidulada com aacutecido sulfuacuterico A determinaccedilatildeo consiste na destilaccedilatildeo de
1 mL do meio fermentado isento de ceacutelulas recolhido na soluccedilatildeo de dicromato
contida em erlenmeyer onde o etanol reagiu com os iacuteons dicromato como mostrado
na eq 1 produzindo acetaldeiacutedo e iacuteons Cr(III) Conforme o etanol reage haacute uma
mudanccedila da coloraccedilatildeo laranja caracteriacutestica desta soluccedilatildeo para um tom esverdeado
A reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo do etanol com iacuteons dicromato envolve pelo menos duas
etapas Na primeira etapa o etanol introduzido na soluccedilatildeo reage com os iacuteons
dicromato produzindo um aldeiacutedo que neste caso eacute o acetaldeiacutedo (reaccedilatildeo 4)
Na segunda etapa como o aldeiacutedo produzido tambeacutem eacute susceptiacutevel agrave oxidaccedilatildeo o
acetaldeiacutedo eacute consumido produzindo aacutecido aceacutetico (um aacutecido carboxiacutelico) com a
correspondente reduccedilatildeo dos iacuteons Cr(VI) para iacuteons Cr(III) (reaccedilatildeo 5) A reaccedilatildeo
entre o etanol e os iacuteons dicromato pode ser descrita de forma global como mostrado
na (reaccedilatildeo 6)
3 CH3CH2OH + CrO7-2 rarr 3 CH3COH 2 Cr+3 + 7 H20 (reaccedilatildeo 4)
3 CH3COH + CrO7-2 + 8H+ rarr 3 CH3COOH + 2 Cr+3 + 4 H20 (reaccedilatildeo 5)
72
3 CH3CH2OH + 2 CrO7-2 + 16H+ rarr 4Cr+3 + 3 CH3COOH 11 H2O (reaccedilatildeo 6)
Apoacutes a destilaccedilatildeo o erlenmeyer foi levado a um banho de aacutegua a 70 ordmC
durante 20 minutos para que se complete a oxidaccedilatildeo do etanol Apoacutes esse tempo
deixou-se esfriar ateacute temperatura ambiente e essa soluccedilatildeo foi titulada com soluccedilatildeo
de sulfato ferroso amoniacal Foi feita concomitantemente uma soluccedilatildeo utilizando
aacutegua em vez do destilado para determinar o poder redutor do sulfato ferroso
amoniacal
4315 Determinaccedilatildeo dos componentes volaacuteteis presentes no gaacutes efluente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
Os voltaacuteteis majoritaacuterios liberados durante o regime permanente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica foram determinados pelo Laboratoacuterio de Anaacutelises Quiacutemicas do
Instituto de Pesquisa Tecnoloacutegis (IPT) usando um cromatoacutegrafo a gaacutes (marca
Shimadzu modelo CG-2010) acoplado ao espectrocircmetro de massas (Shimadzu
Modelo GCMS ndash QP5050A)
432 Acompanhamento do cultivo de A platensis
O volume das amostras diaacuterias retiradas para o acompanhamento celular foram
de 50 mL Apoacutes a remoccedilatildeo da amostra igual volume de meio de cultura isento da
fonte de nitrogecircnio foi adicionado para manter o volume constante Similarmente a
evaporaccedilatildeo de aacutegua diaacuteria foi compensada pela adiccedilatildeo do meio de cultura
4321 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular
43211 Densidade oacutetica
O acompanhamento do crescimento celular foi realizado diariamente em
duplicata por turbidimetria a 560 nm (LEDUY THERIEN 1977) Os valores de
transmitacircncia obtidos no espectrofotocircmetro foram convertidas em concentraccedilatildeo
celular atraveacutes de uma curva de calibraccedilatildeo (Item 43212)
43212 Construccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo
A curva de calibraccedilatildeo foi obtida tomando-se um volume de 25 mL de uma
suspensatildeo concentrada de ceacutelulas em fase de crescimento exponencial que foi
73
filtrada e lavada com aacutegua destilada em uma membrana de acetato de celulose de
12 μm previamente seca a 70 ordmC por 12 horas e previamente pesada A amostra
foi levada agrave estufa a 100ndash105 ordmC por um periacuteodo de 5 horas suficiente para que
mantivesse uma massa constante A massa das ceacutelulas foi calculada por diferenccedila
dos valores das massas das membranas antes e depois da filtraccedilatildeo e dividido pelo
volume filtrado para obter-se a concentraccedilatildeo celular na suspensatildeo A partir desta
mesma suspensatildeo foram preparadas diferentes diluiccedilotildees e aliacutequotas dessas
diluiccedilotildees foram levadas ao espectrofotocircmetro para leitura da transmitacircncia a 560 nm
de comprimento de onda e caminho oacuteptico de 1 cm com aacutegua destilada como
branco Dessa forma foi obtida uma curva que relaciona concentraccedilatildeo celular com o
logaritmo da transmitacircncia (Graacutefico 1)
Graacutefico 1 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular de A platensis
4322 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de carbonato total
Embora a concentraccedilatildeo de carbonato total deva se manter constante em
decorrecircncia do fornecimento de CO2 para a manutenccedilatildeo do pH foi acompanhado na
fase liacutequida do meio em cultivo
No meio isento de ceacutelulas o acompanhamento da concentraccedilatildeo de fonte de
carbono na forma de carbonato total foi atraveacutes de titulometria Inicialmente
adiciona-se hidroacutexido de soacutedio na amostra (Reaccedilatildeo 7) e titula-se com HCl
(Reaccedilatildeo 8) na presenccedila do indicador fenolftaleiacutena para a conversatildeo de carbonato
em bicarbonato Posteriormente foi titulada novamente com HCl (Reaccedilatildeo 9) na
74
presenccedila do indicador alaranjado de metila para que todo o bicarbonato transforme-
se em aacutecido carbocircnico por deslocamento de equiliacutebrio O carbonato total foi
quantificado pelos dois intervalos de viragem (PIERCE HAENISCH 1948)
NaOH + NaHCO3 = Na2CO3 + H2O (Reaccedilatildeo 7)
Na2CO3 + HCl = NaHCO3 + NaCl (Reaccedilatildeo 8)
NaHCO3 + 1 HCl = H2CO3 + 1 NaCl (Reaccedilatildeo 9)
4323 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia total
A amocircnia total foi quantificada no meio isento de ceacutelulas de 2 em 2 dias em
potenciocircmetro marca ORION modelo 710-A por meio de um eletrodo seletivo para
amocircnia modelo 95-12 ORION Tendo em vista que o eletrodo soacute eacute sensiacutevel ao iacuteon
amocircnia e que no pH de cultivo existe equiliacutebrio entre os iacuteons amocircnia e amocircnio para
se fazer a leitura foi necessaacuterio corrigir o pH da amostra para 13 pela adiccedilatildeo de
NaOH 15 M antes da leitura no eletrodo de forma que todo iacuteon amocircnio fosse
convertido em amocircnia (LEDUY SAMSON 1982) O volume utilizado foi de 15 mL e
nesse procedimento foi necessaacuteria agrave calibraccedilatildeo do aparelho em todos os dias em
que foram realizadas as determinaccedilotildees Isso foi feito atraveacutes da construccedilatildeo de uma
curva que correlaciona a milivoltagem lida no potenciocircmetro com soluccedilotildees de NH4Cl
em diferentes diluiccedilotildees com concentraccedilotildees conhecidas A partir da equaccedilatildeo dessa
curva com a milivoltagem lida na amostra do cultivo foi calculada a concentraccedilatildeo
de amocircnia total Esta metodologia tambeacutem serviu para auxiliar na determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de ureacuteia conforme se observa no item a seguir
43231 Construccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da amocircnia
A metodologia empregada para a determinaccedilatildeo de amocircnia requer a construccedilatildeo
de uma curva de calibraccedilatildeo para cada dia em que foi analisada a amocircnia Desta
forma no Graacutefico 2 tecircm-se uma das curvas de calibraccedilatildeo utilizada
75
Graacutefico 2 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia
Nesse caso a curva de calibraccedilatildeo corresponde agrave Log [NH3] -00213 x mV ndash
10583 A maior diluiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia foi de 5x10-6 (cujo o valor de
Log eacute -53) que corresponde a um valor de milivoltagem de 182 detectado no
eletrodo de amocircnia
4324 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia
Para a determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia inicialmente foi hidrolisada em
meio aacutecido como segue 10 mL do meio de cultivo isento de ceacutelulas foi submetido a
um tratamento com H2SO4 (1 mL de H2SO4 5 N) a 200 ordmC por 6 horas em bloco
digestor Tecnal modelo TE-106 (CEZARE 1998) Apoacutes esse tempo o conteuacutedo
presente no tubo onde ocorreu a hidroacutelise aacutecida foi quantitativamente transferido
para um balatildeo volumeacutetrico de 50 mL com neutralizaccedilatildeo do pH com NaOH 15 M
utilizando fenolftaleiacutena como indicador e finalmente o volume completado com aacutegua
destilada Desse balatildeo foi retirado um volume de 15 mL para a determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de amocircnia conforme meacutetodo descrito no item anterior Considerando
ainda a diluiccedilatildeo da amostra calcula-se a concentraccedilatildeo de amocircnia global que
representa a amocircnia que jaacute estava presente no meio de cultivo mais a amocircnia
proveniente da hidroacutelise da ureacuteia Assim por diferenccedila eacute possiacutevel calcular a
concentraccedilatildeo de ureacuteia no meio de cultivo
76
4325 Determinaccedilatildeo do pH
O pH foi acompanhado por potenciometria com um aparelho da marca
METTLER TOLEDO
4326 Determinaccedilatildeo de nitrato
A anaacutelise de nitrato foi realizada atraveacutes da adaptaccedilatildeo do meacutetodo descrito por
Vogel (2002) Foram pipetados 10 mL do meio isento de ceacutelulas 10 ml de NaOH
(05 N) e 700 mg de liga de devarda ( 50 de cobre 45 de alumiacutenio 5 zinco) em
balatildeo volumeacutetrico onde foi aquecido em bico de busen durante 1 hora para que todo
o nitrato presente na amostra seja reduzido a amocircnio como descrito na reaccedilatildeo a
seguir
NO3- + 8 Al + 5 OH- + 2 H2O rarr 8 Al2
- + 3 NH3 (Reaccedilatildeo 10)
Durante o aquecimento os iacuteons amocircnio satildeo desprendidos e recolhidos em uma
soluccedilatildeo padronizada de 10 mL de aacutecido cloriacutedrico (01 N) formando o cloreto de
amocircnio Essa soluccedilatildeo foi titulada com NaOH (005 N) padronizada usando vermelho
de metila como indicador e a quantificaccedilatildeo do amocircnio formado foi feita por diferenccedila
entre a quantidade de HCl inicial e final depois da destilaccedilatildeo A conversatildeo de
volume do aacutecido tilulado (mililitros) em massa de iacuteons nitrato (gramas) foi baseada
na informaccedilatildeo de que 1 mL de aacutecido cloriacutedrico 1 N corresponde a 006201g de iacuteons
nitrato (VOGEL 2002)
4327 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol
A determinaccedilatildeo do etanol foi realizada atraveacutes do meacutetodo de oxidaccedilatildeo por
dicromato de potaacutessio proposto por Joslyn (1907) como descrito no item 4314
433 Avaliaccedilatildeo da biomassa de A platensis obtida no final do cultivo
4331 Determinaccedilatildeo de Clorofila a
A anaacutelise de clorofila a foi realizada utilizando uma suspensatildeo celular de 5 mL
correspondente agrave concentraccedilatildeo celular maacutexima obtida Essa suspensatildeo foi filtrada e
a biomassa foi ressuspendida em 5 mL de metanol e incubada em banho maria a
70ordmC por 2 minutos Apoacutes esse tempo a amostra foi filtrada em filtro de
77
politetrafluoretileno 10 microm de diacircmetro (Milliporereg) e o sobrenadante contendo a
clorofila foi determinado espectofotometricamente a 665 nm adotando-se o
procedimento descrito por Vonshak (1997a) A curva de calibraccedilatildeo foi feita
previamente utilizando clorofila areg padratildeo
43311 Curva de calibraccedilatildeo para a determinaccedilatildeo de Clorofila a
A curva de calibraccedilatildeo foi construiacuteda utilizando uma soluccedilatildeo de clorofila a
padratildeo (Sigmareg) obtida comercialmente em metanol A partir dessa soluccedilatildeo foram
realizadas diferentes diluiccedilotildees que resultaram em leituras espectrofotomeacutetricas em
comprimento de onda de 665nm obtendo valores de absorbacircncia entre 0200 e
0800 A relaccedilatildeo entre as diferentes concentraccedilotildees de clorofila em miligrama por
litro com os valores de aborbacircncia obtem-se a equaccedilatildeo como mostrada no graacutefico
3 que foi utilizada para a determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de clorofila nos ensaios
Graacutefico 3 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo de clorofila a
4332 Determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal
Ao final do cultivo o meio contendo a A platensis foi centrifugado com 3
lavagens sucessivas com aacutegua destilada para retirada do sal adsorvido agraves ceacutelulas e
apoacutes secagem com ventilaccedilatildeo a 55 ordmC por 12 horas (PELIZER et al 1999) foi
avaliada a composiccedilatildeo centesimal da biomassa seca
78
43321 Proteiacutenas totais
O teor proteacuteico total na biomassa seca foi determinado pelo claacutessico meacutetodo de
KJELDHAL adotando-se o fator de 625 para a conversatildeo a partir dos teores de
nitrogecircnio total (ASSOCIATION OF OFFICIAL METHODS OF FOOD ANALYSIS
1984) Esse meacutetodo caracteriza-se pela destruiccedilatildeo da mateacuteria orgacircnica com aacutecido
sulfuacuterico concentrado em presenccedila de um catalizador e aquecimento com
formaccedilatildeo de nitrogecircnio inorgacircnico na forma de sulfato de amocircnio A seguir em
aparelho destilador de nitrogecircnio adiciona-se hidroacutexido de soacutedio no tubo
proveniente da digestatildeo para alcalinizaccedilatildeo do meio e desta forma o sal de
amocircnio eacute convertido agrave amocircnia que eacute destilada para uma soluccedilatildeo saturada de aacutecido
boacuterico Posteriormente titula-se essa soluccedilatildeo com HCl 002N fatorada para se
quantificar a concentraccedilatildeo de nitrogecircnio (FERRAZ 1986)
43322 Lipiacutedios totais
A fraccedilatildeo lipiacutedica total foi obtida por extraccedilatildeo com solvente orgacircnico (FERRAZ
1986) A amostra foi triturada em gral e entatildeo transferida para um extrator contiacutenuo
de Soxhlet com refluxo da mistura de solventes clorofoacutermio-metanol (21 vv) ateacute o
liacutequido ficar liacutempido (PIORRECK 1984 OLGUIacuteN et al 2001) A fraccedilatildeo lipiacutedica total
juntamente com os solventes foram tratados em sistema evaporador rotativo a
vaacutecuo O material obtido reuacutene aacutecidos graxos trigliceriacutedeos fosfolipiacutedios
carotenoacuteides pigmentos fotossintetizantes esteroacuteides e hidrocarbonetos sendo
chamados de fraccedilatildeo lipiacutedica total (GIOIELLI 1997)
43323 Cinzas
O teor de cinzas das ceacutelulas secas foi determinado por aquecimento de acordo
com meacutetodo descrito pelo Instituto Adolfo Lutz (1985) 1g da amostra foi pesada em
caacutepsula de porcelana previamente aquecida em mufla a 550 ordmC resfriada em
dessecador ateacute a temperatura ambiente e pesada A amostra foi seca em estufa a
105 ordmC carbonizada e incinerada em mufla a 550 ordmC durante 4 horas tempo
necessaacuterio para obter peso constante Posteriomente resfriou-se a amostra em
dessecador durante 1 hora ateacute atingir a temperatura ambiente e pesada As cinzas
devem ficar brancas ou ligeiramente acinzentadas
79
43324 Carboidratos totais
A porcentagem de carboidratos foi calculada pela diferenccedila entre e as
porcentagens dos demais componentes analisados na biomassa seca
434 Avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo elementar
As determinaccedilotildees de CNHSO foram realizadas pela CE instruments flash
EA1112 series acoplada com um detector de condutividade teacutermica (TCD) Para as
anaacutelises de Carbono Nitrogecircnio Hidrogecircnio e Enxofre foi utilizada a meteonina (C =
4025 N = 939 H = 743 S = 2149) como padratildeo e para a anaacutelise de
oxigecircnio foi utilizado o aacutecido aspaacutertico (C = 3609 N = 1052 H =53 S =
000 O = 4908)
4341 Determinaccedilatildeo de CNHS
Foram determinados pesando aproximadamente 1 a 4 mg da amostra em
recipiente de estanho e adicionar V2O5 (oacutexido de vanaacutedio) para que toda a biomassa
seja carbonizada Utiliza-se gaacutes oxigecircnio (99995) para carregar as amostras e
fazer a combustatildeo a 900degC formando os compostos reduzidos N2 CO2 H20 e SO2
Esses gases vatildeo para a coluna cromatograacutefica onde seratildeo separados e
posteriormente detectados por sinais eleacutetricos no detector de condutividade teacutermica
usando o software EAGER 300 na qual fornece a porcentagem de N C H S
contida na amostra
4342 Determinaccedilatildeo de oxigecircnio
Pesar aproximadamente 1 a 4 mg da amostra em recipiente de prata eleva-se
a temperatura a 1060degC onde ocorre a piroacutelise Durante a piroacutelise satildeo formados N2
CO e H2 estes satildeo filtrados onde os compostos halogenados satildeo retidos
Posteriormente esses gases vatildeo para a coluna cromatograacutefica onde o CO eacute
separado dos outros gases utilizando gaacutes heacutelio como carreador detectados por
sinais eleacutetricos no detector de condutividade teacutermica
44 Caacutelculos
441 Produtividade em etanol no regime permanente
Petanol = DEf (Equaccedilatildeo 1)
80
Onde Petanol = Produtividade em etanol (g L-1 h-1)
D = vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo (h-1)
Ef = concentraccedilatildeo de etanol (g L-1)
442 Rendimento do etanol no regime permanente
η = 1005110
1
ARTi
Ef (Equaccedilatildeo 2)
Onde η = rendimento em etanol ()
Ef = concentraccedilatildeo de etanol (g L-1)
ARTi = Accediluacutecares redutores totais no mosto de entrada no reator (g L-1)
0511 = rendimento teoacuterico (estequiomeacutetrico) da conversatildeo de glicose em
etanol
443 Produtividade em ceacutelulas nos cultivos de A platensis
Tc
XiXmPx
(Equaccedilatildeo 3)
Onde PX = produtividade em ceacutelulas (mg L-1 d -1)
Xm = concentraccedilatildeo celular maacutexima obtida (mg L-1)
Xi = concentraccedilatildeo celular inicial (mg L-1)
Tc = tempo de cultivo (dias)
444 Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas nos cultivos de A
platensis
Nt
VXiXmY NX
(Equaccedilatildeo 4)
81
OndeYXN = Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (mg mg-1)
Xm = concentraccedilatildeo celular maacutexima obtida (mg L-1)
Xi = concentraccedilatildeo celular inicial (mg L-1)
V = volume do meio (L)
Nt = quantidade total de nitrogecircnio adicionado (mg)
445 Coeficientes atocircmicos para 1 C-mol de biomassa
Foram escolhidos os principais aacutetomos (C H 0 N e S) que formam as
macromoleacuteculas proteiacutenas carboidratos lipiacutedios RNA e DNA Um C-mol de
biomassa eacute definida como CX1HX2NX3OX4SX5 e os coeficientes atocircmicos Xi satildeo
calculados a partir da Equaccedilatildeo 5
MMc
fc
MMi
fiXi (Equaccedilatildeo 5)
fi = fraccedilatildeo em massa do aacutetomo i na biomassa seca (g g-1)
MMi = Massa molar do aacutetomo i (g C-mol-1)
fc = fraccedilatildeo em massa do carbono na biomassa seca (g g-1)
MMc = Massa molar do aacutetomo do carbono (g C-mol-1)
Exemplo
Para se calcular o coeficiente atocircmico do hidrogecircnio em 1 C-mol de biomassa
no experimento 1 (Fonte de Carbono cilindro fonte de nitrogecircnio nitrato
intensidade luminosa 60 μmol de foacutetons m-2 s-1)
Teor de hidrogecircnio na biomassa foi de 662 e o teor de carbono foi de 543
o que corresponde a 662 mg de hidrogecircnio e 543 mg de carbono em 1 g da
biomassa Logo substituindo esses valores na Equaccedilatildeo 5 se encontra o coeficiente
atocircmico do hidrogecircnio de 146
12
543
1
66HX
XH = 146
82
446 Grau de reduccedilatildeo da biomassa
O grau de reduccedilatildeo (γ) de um composto orgacircnico eacute definido como o nuacutemero de
eleacutetrons envolvido na sua oxidaccedilatildeo Esse valor eacute a somatoacuteria da multiplicaccedilatildeo entre
os coeficientes atocircmicos e seu respectivo grau de reduccedilatildeo (HEI JNEN 2001)
45 Teoria dos paracircmetros bioenergeacuteticos
A energia de Gibbs dissipada para o crescimento e manutenccedilatildeo celular por
unidade de biomassa (1YGX kJC-mol) foi estimada de acordo com Heijnen (2001)
pela Equaccedilatildeo 6
G
GXGX
m
YY
max
11 (Equaccedilatildeo 6)
max
GXY eacute o rendimento maacuteximo teoacuterico de biomassa sobre a energia de Gibbs que
corresponde a um valor de 986 C-molX kJ-1 em cultivos fotoautotroacutefico com CO2
como fonte de carbono (HEIJNEN 2001)
Nesta equaccedilatildeo a velocidade especiacutefica de crescimento μ foi definida de
acordo com Leduy e Zajic (1973) como
1
ln1
i
i
X
X
t (Equaccedilatildeo 7)
Onde Xi e Xi-1 satildeo as concentraccedilotildees de biomassa no final e iniacutecio do intervalo de
tempo decorrido entre as duas determinaccedilotildees consecutivas (Δt = 1 dia) enquanto
que mG eacute a energia de Gibbs utilizada para a manutenccedilatildeo celular correspondendo a
712 kJ C-molX -1 h-1 a 30degC (HEIJNEN 2001)
A estimativa o nuacutemero de foacutetons (Einsteins) para sustentar o crescimento
autotroacutefico nPh foi necessaacuterio recorrer ao balanccedilo de energia de Gibbs tendo em
conta as contribuiccedilotildees de energia para o crescimento e manutenccedilatildeo 1YGX e a
absorccedilatildeo de 1 Einstein de foacutetons ΔgPh em adiccedilatildeo aqueles de formaccedilatildeo de
substratos e produtos Δgfi como descitos pela equaccedilatildeo
ΔgfHCO3- + ΔgfN + ΔgfH2O + ΔgfH
+ + ΔgfX + 1YGX + nPh ΔgPh = 0 (Equaccedilatildeo 8)
83
O valor de ΔgPh = 2062 kJ mol-1 foi estimado atraveacutes da equaccedilatildeo
A
Ph
hcNg (Equaccedilatildeo 9)
Sendo h = 662610-34 J a constante de Planck c = 299108 m s-1 a velocidade da
luz NA = 6022 x 1023 foacutetons de Einstein -1 o numero de Avogadro e λ = 580 nm o
comprimento de onda do foton absorvido (Li et al 2001)
Calculando os valores de ΔgPh e nPh eacute possiacutevel estimar a energia molar de
Gibbs absorvida pela equaccedilatildeo 10
ΔGa = nPh ΔgPh (Equaccedilatildeo 10)
A energia total de Gibbs absorvida pela fotossiacutentese (ΔGa) foi assumida como a
soma da energia fixada pelo sistema para aumentar o seu proacuteprio conteuacutedo
entaacutelpicos (ΔH) a energia transformada em ATP usada para o crescimento e
manutenccedilao celular (ΔGATP) e a liberada como calor (Q)
ΔGa + ΔGATP + ΔH + Q = 0 (Equaccedilatildeo 11)
Onde ΔGATP e ΔH foram calculados a partir do nPh a energia de Gibbs associada a 1
ATP mol e a media da variaccedilatildeo de potencial entre FSI e FSII (TORRE et al 2003)
A produccedilatildeo molar de O2 (qO2) e o consumo de H+ (qH+) foram calculados de
acordo com Torre et al (2003) multiplicando-se os seus coeficientes
estequiomeacutetricos pela concentraccedilatildeo celular expressa em C-mol L-1 e usando a
composiccedilatildeo elementar da biomassa experimental
84
5 Planejamento experimental
Os experimentos realizados estatildeo descritos na Tabela 2 Os valores de
intensidade luminosa foram escolhidos em funccedilatildeo do trabalho de Watanabe e Hall
(1995) O valor de pH foi fixado em 95 plusmn 02 de acordo com trabalho de Sanchez-
Luna et al (2007) e Tredici e Zittelli (1998) As adiccedilotildees diaacuterias de ureacuteia foram fixadas
com base na necessidade de nitrogecircnio da ceacutelula calculadas a partir dos resultados
das produtividades celulares obtidos nos experimentos padrotildees realizados utilizando
a fonte convencional de nitrogecircnio (NaNO3)
Para a realizaccedilatildeo dos ensaios padrotildees a concentraccedilatildeo de NaNO3
(SCHLOumlSSER 1982) foi mantida acima de 1 g L-1 para evitar a limitaccedilatildeo do
crescimento pela fonte de nitrogecircnio A partir da curva de crescimento experimental
utilizando o nitrato como fonte de nitrogecircnio para cada intensidade luminosa
estudada obteacutem-se uma equaccedilatildeo que representa a curva de crescimento teoacuterica e a
partir desta calcula-se a produtividade celular diaacuteria Considerando que as ceacutelulas
possuem 7 de nitrogecircnio (BEZERRA 2006) calcula-se a quantidade diaacuteria de
nitrogecircnio necessaacuteria para o crescimento celular obtendo-se assim a equaccedilatildeo de
adiccedilatildeo de nitrogecircnio amoniacal Por isso eacute necessaacuterio realizar uma curva de
crescimento padratildeo com NaNO3 para cada condiccedilatildeo analisada (diferentes
intensidades luminosas) A exemplificaccedilatildeo do escrito acima esta representado no
Item 62
Tabela 2 - Planejamento experimental
Experimento
Intensidade luminosa
( mol de foacutetons m-
2 s-1)
Fonte de nitrogecircnio
Controle de pH por CO2 de cilindro
Controle de pH por CO2 de
fermentaccedilatildeo alcooacutelica
1 60 NaNO3 Sim Natildeo
2 60 Ureacuteia Sim Natildeo
3 60 NaNO3 Natildeo Sim
4 60 Ureacuteia Natildeo Sim
5 120 NaNO3 Sim Natildeo
6 120 Ureacuteia Sim Natildeo
7 120 NaNO3 Natildeo Sim
8 120 Ureacuteia Natildeo Sim
9 240 NaNO3 Sim Natildeo
10 24 0 Ureacuteia Sim Natildeo
11 240 NaNO3 Natildeo Sim
12 240 Ureacuteia Natildeo Sim
valor fixado em 95 com uso de CO2
85
6 Resultados e discussatildeo
No item 61 estatildeo descritos os resultados dos testes preliminares da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica e no item 62 estatildeo apresentados os resultados dos
experimentos 1 ao 12 referentes aos acompanhamentos dos cultivos ao longo do
tempo A concentraccedilatildeo celular concentraccedilatildeo de carbonato de nitrato de amocircnia e
ureacuteia foram apresentadas neste item
As determinaccedilotildees da concentraccedilatildeo celular foram feitas diariamente enquanto
que as medidas de concentraccedilatildeo de nitrato amocircnia ureacuteia e de carbonato total no
meio de cultura em funccedilatildeo dos relativos grandes volumes de amostra necessaacuterios
para a execuccedilatildeo das teacutecnicas foram realizadas de dois em dois dias
Os paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima produtividade em ceacutelulas e fator
de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas estatildeo descritos no item 63 As
determinaccedilotildees da concentraccedilatildeo de clorofila foram realizadas no final de cada
experimento e estatildeo descritas no item 64 e a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal
teor de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos e cinzas estatildeo descritos no item 65
As anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas atraveacutes de anaacutelise de multivariacircncia e
diferenccedila entre as meacutedias em niacutevel de 5 de significacircncia visando-se examinar a
influecircncia de cada variaacutevel independente para os paracircmetros cineacuteticos Xm Px e
YXN bem como para o conteuacutedo de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos cinzas e teores
de clorofila a
As anaacutelises dos paracircmetros bioenergeacuteticos dos cultivos de A platensis
utilizando CO2 de cilindro estatildeo descritas no item 66 e a comparaccedilatildeo entre o perfil
de crescimento da A platensis em duas diferentes configuraccedilotildees de fotobioreator
tubular estaacute descrito no item 67
61 Testes preliminares para a realizaccedilatildeo da fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Antes de iniciar os experimentos acoplando a fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
com a produccedilatildeo de A platensis foram realizados testes para avaliar a influecircncia da
clarificaccedilatildeo do melaccedilo na determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular a homogeneidade
do reator as vazotildees especiacuteficas de alimentaccedilatildeo no processo contiacutenuo de modo a
obter regime permanente e produccedilatildeo gases suficiente para a correccedilatildeo do pH
durante o cultivo de A platensis
86
611 Avaliaccedilatildeo da influecircncia da clarificaccedilatildeo do melaccedilo na determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo celular
Inicialmente foi proposto utilizar o melaccedilo de cana-de-accediluacutecar clarificado e
esterilizado no entanto devido as dificuldade operacionais como por exemplo
grandes volumes de melaccedilo que seria utilizado para a manutenccedilatildeo do processo
contiacutenuo optou-se por utilizar o melaccedilo natildeo clarificado e natildeo esterilizado uma vez
que nas usinas brasileiras natildeo eacute empregado atualmente esse preacute-tratamento do
melaccedilo (LIMA et al 2001) Dhamija et al (1982) relata que os custos adicionais
para o preacute-tratamento de melaccedilo e da levedura reciclada pode limitar o uso do
processo Portanto a teacutecnica de reciclo de leveduras por centrifugaccedilatildeo e uso de
melaccedilo natildeo clarificado torna o processo mais econocircmico
O melaccedilo de cana-de-accediluacutecar possui aproximadamente 50 de accediluacutecares
(sacarose 25 a 40 glicose e frutose 12 a 35) aacutegua carboidratos cinzas
metais pesados compostos nitrogenados e em menor quantidade aacutecidos natildeo
nitrogenados (aacutecido ciacutetrico acido maacutelico oxaacutelico glicoacutelico) ceras esteroacuteides e
vitaminas (ROUKAS 1998) Vaacuterios fatores influenciam na composiccedilatildeo do melaccedilo ou
mel final os meacutetodos de fabricaccedilatildeo do accediluacutecar o tempo de armazenamento e as
regiotildees do plantio Este elevado teor de accediluacutecar eacute a razatildeo porque o melaccedilo eacute
largamente utilizado na induacutestria de fermentaccedilatildeo em particular produccedilatildeo de etanol
O emprego do melaccedilo natildeo tratado poderia influenciar a determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo celular por massa seca uma vez que no melaccedilo conteacutem aleacutem da
sacarose diversos outros resiacuteduos que poderiam ficar retidos na membrana de
filtraccedilatildeo dificultando esse processo eou resultando no falso aumento da
concentraccedilatildeo celular Por isso realizou-se um teste para avaliar se o natildeo tratamento
do melaccedilo influenciaria na determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular Os resultados e a
anaacutelise estatiacutestica da diferenccedila entre as meacutedias estatildeo descritos na Tabela 3
Tabela 3 - Valores da concentraccedilatildeo celular meacutedias e desvio padratildeo em massa seca obtidas a partir do melaccedilo natildeo clarificado e do melaccedilo clarificado
Melaccedilo natildeo clarificado (gL-1) Melaccedilo clarificado (gL-1)
1110 1010
1094 1074
1082 1004
Meacutedia = 109 plusmn 014ordf Meacutedia = 103 plusmn 040a
Diferenccedila percentual = 640
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
87
Como se pode observar na Tabela 3 as meacutedias da concentraccedilatildeo celular
determinada por massa seca foram estatisticamente iguais nas duas condiccedilotildees de
melaccedilo avaliadas melaccedilo clarificado e melaccedilo natildeo clarificado Com esses
resultados optou-se utilizar o melaccedilo natildeo clarificado uma vez que no acircmbito
industrial o processo de clarificaccedilatildeo aumenta os custos operacionais resultando em
um aumento dos custos do produto final Por isso estudos sobre os preacute-tratamentos
do melaccedilo de cana-de-accediluacutecar tecircm sido desenvolvidos para que viabilizem natildeo soacute a
obtenccedilatildeo dos produtos mas tambeacutem as etapas de recuperaccedilatildeo e purificaccedilatildeo sem
aumento excessivo no custo do processo (VALDUGA et al 2007)
612 Teste de homogeneidade do reator
O teste de homogeneidade no reator foi realizado com o objetivo de se avaliar
se as amostras retiradas em qualquer lugar do reator podem ser consideradas
equivalentes com um risco de erro estatisticamente determinado neste trabalho em
10 Para isso o teste de homogeneidade foi realizado de acordo com Koshimizu et
al (1983)
Na Tabela 4 estatildeo descritos os valores da concentraccedilatildeo celular e o logaritmo
da concentraccedilatildeo celular em funccedilatildeo do tempo com uma vazatildeo de alimentaccedilatildeo de
0124 h-1 A homogeneidade do reator eacute verificada se a queda da concentraccedilatildeo
celular for uma funccedilatildeo exponencial
Tabela 4 - Variaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de leveduras em funccedilatildeo do tempo
Tempo (horas) [X] (g L-1) Ln X
05 89 094939 10 72 085733 15 62 079379
20 57 075587
25 50 070070 30 46 066651 35 39 059988 40 33 051851 45 30 048287 50 25 039445
Aplicando-se o logaritmo neperiano aos valores do [X] (Tabela 4) e
construindo um graacutefico ln X em funccedilatildeo do tempo obtecircm-se a equaccedilatildeo da reta onde
o coeficiente angular da reta obtida eacute igual agrave vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo do
sistema teoacuterico (Dt)
88
Graacutefico 4 Logariacutetmico da concentraccedilatildeo celular em funccedilatildeo do tempo
O valor de Dt obtido pela reta eacute igual a 0115 h-1 que se comparado ao valor
calculado 0124 h-1 apresenta uma diferenccedila de 78 indicando que o sistema
pode ser considerado homogecircneo (KOSHIMIZU et al 1983)
613 Avaliaccedilatildeo de diferentes vazotildees especiacuteficas de alimentaccedilatildeo (D)
O efeito da vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo (D 01 h-1 005 h-1 e 0025 h-1) na
fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua foi avaliada para a produccedilatildeo de etanol Os
resultados satildeo mostrados nos Graacuteficos de 5 a 7
Graacutefico 5 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) etanol () e
accediluacutecar redutor total (ART) para D = 01 h-1
y = -01151x + 09884 Rsup2 = 09912
0010203040506070809
1
0 1 2 3 4 5 6
Ln
X
Tempo (h)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 20 40 60 80 100 120 140
Co
nc
en
tra
ccedilatilde
o (
g L
-1)
Tempo (horas)
Iniacutecio do regime permanente
89
Graacutefico 6 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) Etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 005 h-1
Graacutefico 7 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) Etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 0025 h-1
Como se pode observar nos Graacuteficos de 5 a 7 foi possiacutevel a obtenccedilatildeo do
regime permanente nos 3 valores de D empregados indicando a adequaccedilatildeo desses
valores e da concentraccedilatildeo de ART agrave velocidade de crescimento do micro-organismo
Nos ensaios de fermentaccedilatildeo contiacutenua a condiccedilatildeo de estado estacionaacuterio foi
obtida apoacutes trecircs tempos de residecircncia sem qualquer tipo de problema operacional
como obstruccedilatildeo do tubo de retirada de caldo crescimento na parede e mistura
imperfeita O Graacutefico 5 mostra um resultado tiacutepico em termos de perfis de
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Co
nc
en
tra
ccedilatilde
o (
g L
-1)
Tempo (horas)
Iniacutecio do regime permanente
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 20 40 60 80 100 120 140
Co
nc
en
tra
ccedilatilde
o (
g L
-1)
Tempo (horas)
Iniacutecio do regime permanente
90
concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de glicose (S) e concentraccedilatildeo de etanol (E)
No estado estacionaacuterio (D = 01 h-1) a concentraccedilatildeo de ART residual na saiacuteda do
reator foi de 9421plusmn449 g L-1 a concentraccedilatildeo celular foi de 547plusmn047 g L-1 e a
concentraccedilatildeo de etanol de 4169plusmn163 g L-1 Com a reduccedilatildeo da vazatildeo especiacutefica de
alimentaccedilatildeo para D = 005 h-1 (Graacutefico 5) a concentraccedilatildeo de glicose residual reduziu
para cerca de 4780plusmn870 g L-1 e as concentraccedilotildees de etanol e celular aumentaram
para 4542plusmn31 g L-1 e 618plusmn077 g L-1 respectivamente devido ao maior tempo de
residecircncia nessa segunda condiccedilatildeo Reduzindo a vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo
para 0025 h-1 (Graacutefico 6) a concentraccedilatildeo de etanol aumentou para 553plusmn757 g L-1
Isso porque menor a vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo maior o tempo de contato
entre as ceacutelulas e o accediluacutecar convertendo-o mais eficientemente no etanol Esse
resultado mostra que a reduccedilatildeo da vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo aumenta a
produtividade em etanol
Similarmente Perego Jr (1979) observaram que a diminuiccedilatildeo da vazatildeo
especiacutefica de 0117 para 0049 h-1 durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
menores foram os valores de ART residual 58 g L-1 e 28 g L-1 respectivamente Por
outro lado a concentraccedilatildeo de etanol aumentou de 496 g L-1 para 68 g L-1 e a
concentraccedilatildeo celular reduziu de 67 g L-1 para 53 g L-1 Esses valores diferiram do
presente trabalho devido agraves diferentes cepas de Saccharomyces cerevisieae bem
como o melaccedilo utilizado O melaccedilo por ser um produto natural varia de composiccedilatildeo
de acordo com o clima solo tempo de colheira
Na Tabela 5 mostra que a reduccedilatildeo da vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo levou a
um aumento no rendimento do processo obtendo maior valor de 636 no emprego
de D igual a 0025 h-1 O aumento na vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo proporciona
um aumento do fluxo de entrada de accediluacutecar provavelmente superior ao aumento da
velocidade de consumo levando a uma diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol
aumento da concentraccedilatildeo de ART residual e consequentemente diminuiccedilatildeo da
eficiecircncia de transformaccedilatildeo O rendimento representa a eficiecircncia da fermentaccedilatildeo
alcooacutelica tomando como base a equaccedilatildeo estequiomeacutetrica de Gay-Lussac onde a
relaccedilatildeo teoacuterica para 100 de eficiecircncia de conversatildeo de hexose em etanol eacute de
0511g de etanol produzido para cada grama de hexose consumida
91
Tabela 5 - Valores de XP ART Etanol e Rendimento do processo no regime
permanente para os diferentes valores de D com ART inicial de 170 gL-1
D (h-1)
XP (gL-1)
ARTf
(gL-1) Ef
(gL-1) η
() Px
(g L-1 h-1) Pe
(g L-1 h-1)
0100 547plusmn047 942plusmn449 417plusmn163 4799 055 417
0050 618plusmn077 478plusmn870 454plusmn310 5229 031 227
0025 609plusmn054 532plusmn567 553plusmn757 6364 015 138
D vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo Xp meacutedia dos valores de concentraccedilatildeo celular ao longo do regime permanente e seus desvios padrotildees ARTf accediluacutecares redutores totais no caldo fermentado Ef oncentraccedilatildeo de etanol no caldo fermentado η Rendimento do processo Px Produtividade em ceacutelulas Pe Produtividade em etanol
Na fermentaccedilatildeo alcooacutelica vaacuterios fatores podem influenciar no rendimento do
processo ou seja a conversatildeo de accediluacutecar em etanol entre eles a concentraccedilatildeo de
accediluacutecar e o fluxo pelo qual ele eacute adicionado e removido do reator (em processos
contiacutenuos) pH concentraccedilatildeo celular presenccedila de bacteacuterias contaminantes e o tipo
de processo adotado Na induacutestria o rendimento do processo eacute calculado baseado
na concentraccedilatildeo de accediluacutecar total que entra no sistema fermentativo sem considerar o
accediluacutecar residual podendo ser maior que 90 a 93 do valor teoacuterico da conversatildeo de
glicose em etanol (INGLEDEW 1999)
O processo de fermentaccedilatildeo mais comumente utilizado nas destilarias do
Brasil eacute utilizando a recuperaccedilatildeo de leveduras atraveacutes da centrifugaccedilatildeo do vinho
Aproximadamente 90 da levedura satildeo reutilizadas de uma fermentaccedilatildeo para a
proacutexima Esta suspensatildeo de fermento diluiacutedo e acidificado conhecido na praacutetica
com o nome de peacute-de-cuba permanece em agitaccedilatildeo de uma a trecircs horas antes de
retornar agrave dorna de fermentaccedilatildeo resultando em altas densidades celulares dentro
do reator (10-17 pv) e contribuindo para um tempo de fermentaccedilatildeo curto Isso
favorece a valores de conversotildees teoacutericos de accediluacutecares em etanol de 90 a 92
(BASSO et al 2008) valores maiores do que os obtidos no presente trabalho
(Tabela 5)
Em termos de produtividades a Tabela 5 mostra que as maacuteximas
produtividades em ceacutelulas (Px) e em etanol (Pe) foram obtidas para um alto valor de
D (01 h-1) de cerca de 055 g L-1 h-1 e 417 g L-1 h-1 respectivamente Por outro
92
lado nessas condiccedilotildees o rendimento em etanol obteve menor valor (48) Quando
a taxa de diluiccedilatildeo eacute alta os accediluacutecares satildeo adicionados a uma velocidade mais raacutepida
do que satildeo consumidos logo a perda de accediluacutecar aumenta e a concentraccedilatildeo de
etanol reduz diminuindo consequentemente a eficiecircncia do processo Como se pode
observar no trabalho de Melzoch et al (1991) a produtividade de etanol maacutexima foi
de 15 g L-1 h-1 no regime permanente com uma concentraccedilatildeo de S cereviseae de 46
g L-1 e concentraccedilatildeo de etanol de 81 g L-1 em bioreator agitado continuamente com
reciclo total de ceacutelulas utilizando a ultrafiltraccedilatildeo
Nas condiccedilotildees adotadas nessa fermentaccedilatildeo com ART de 170gL-1 optou-se
por aplicar D igual a 0025 h-1 por obter um maior valor de rendimento alcooacutelico e
gerar CO2 suficiente a ser incorporado nos cultivos de A platensis em fotobiorreator
tubular
614 Avaliaccedilatildeo dos volaacuteteis orgacircnicos no gaacutes de arraste
De acordo com os resultados obtidos pelo Instituto de Pesquisas Tecnoloacutegicas
foram encontrados nos gaacutes de arraste da fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
predominacircncia de (CO2) pequenas proporccedilotildees de etanol (C2H6O) e elementos
traccedilos de acetaldeiacutedo (C2H4O) Isso estaacute de acordo com Romano et al (2003) que
relataram as transformaccedilotildees quiacutemicas durante a fermentaccedilatildeo por leveduras
produzem principalmente CO2 e etanol e em menores quantidades a formaccedilatildeo de
CVOs Basso et al (1996) relata que durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica por levedura
os produtos da fermentaccedilatildeo satildeo constituiacutedos de 43 ndash 47 de etanol 41 - 45 de
gaacutes carbocircnico e o restante satildeo formados por outros compostos orgacircnicos tais como
glicerol aacutecido succiacutenico aacutecido aceacutetico entre outros Dentre os volaacuteteis orgacircnicos
majoritaacuterios produzidos durante a fermentaccedilatildeo de mosto de cana-de-accediluacutecar por
Saccharomyces cerevisiae encontram-se o etanol acetaldeiacutedo propanol isobutanol
aacutelcool isoamiacutelico acetato de etila (CAEHOT et al 1991)
93
62 Avaliaccedilatildeo do crescimento da A platensis
Experimento 1
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 60 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Cilindro
Tabela 6 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de carbonato
total referentes ao experimento 1
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 405 plusmn 27 1155 plusmn 000
1 590 plusmn 32 -
2 884 plusmn 24 1193 plusmn 027
3 1248 plusmn 202 -
4 1368 plusmn 99 1186 plusmn 026
5 1914 plusmn 19 -
6 2292 plusmn 103 1131 plusmn 021
7 2379 plusmn 46 -
8 2899 plusmn 17 1124 plusmn 021
9 2831 plusmn 22 -
10 2952 plusmn 76 1106 plusmn 064
Graacutefico 8 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 1
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
94
Experimento 2
Fonte de nitrogecircnio = ureacuteia Intensidade luminosa= 60 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = Cilindro
Tabela 7 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 2 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -44554x3 + 54865x2 + 14317x + 400 (60 mol de foacutetons
m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de
nitrogecircnio (mM dia -1)
0 0484
1 0691
2 0832
3 0906
4 0913
5 0853
6 0726
7 0533
8 0277
Graacutefico 9 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 2 (60 mol de foacutetons m-2 s-1)
0
02
04
06
08
1
0 2 4 6 8 10
mM
Ureacute
ia
Tempo (dias)
95
Tabela 8 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 2
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
Amocircnia total (mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 406 plusmn 000 1155 plusmn 000 - -
1 534 plusmn 49 - - -
2 906 plusmn 18 1155 plusmn 027- 132E-05 240E-04
3 1059 plusmn 37 - - -
4 1538 plusmn 137 1290 plusmn 004 136E-05 197E-04
5 2003 plusmn 94 - - -
6 2330 plusmn 28 1154 plusmn 125 135E-05 212E-04
7 2602 plusmn 25 - - -
8 2847 plusmn 0 1002 plusmn 089 338E-06 827E-04
9 2869 plusmn 14 - - -
10 2847 plusmn 56 1078 plusmn 018 681E-04
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 10 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 2
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
96
Experimento 3
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 60 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 9 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de carbonato
total referentes ao experimento 3
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 490plusmn0 1155 plusmn 000
1 591plusmn92 -
2 1193plusmn87 1224 plusmn 05
3 1430plusmn10 -
4 1959plusmn197 1234 plusmn 023
5 2161plusmn171 -
6 2445plusmn48 129 plusmn 005
7 2621plusmn102 -
8 2789plusmn82 1138 plusmn 104
9 2782plusmn125 -
10 2832plusmn89 111 plusmn 104
Graacutefico 11 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 3
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 5 10 15
X (
mg
L
-1)
Tempo (dias)
97
Experimento 4
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa = 60 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 10 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 4 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -20689x3 + 11591x2 + 33292x + 400 (60 mol de foacutetons
m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 086
1 088
2 088
3 084
4 078
5 068
6 055
7 039
8 020
Graacutefico 12 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 4 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
000
020
040
060
080
100
0 2 4 6 8 10
mM
ureacute
ia
Tempo (dias)
98
Tabela 11 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 4
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
Amocircnia total (mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 494plusmn0 1155plusmn000 - 284E-04
1 618plusmn74 - - -
2 1213plusmn59 1139 plusmn 069 218E-04
3 1498plusmn33 - - -
4 1874plusmn76 1095 plusmn 05 324E-05 221E-04
5 2250plusmn44 - - -
6 2516plusmn147 1083 plusmn 139 42E-04 829E-04
7 2694plusmn105 - - -
8 2867plusmn28 1086 plusmn 091 13E-03 308E-05
9 2871plusmn34 - -
10 2860plusmn61 118 plusmn 071 35E-04 202E-03
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 13 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 4
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg
L
-1)
Tempo (dias)
99
Experimento 5
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 120 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Cilindro
Tabela 12 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 5
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 406 plusmn 0 1155 plusmn 000
1 529 plusmn 22 -
2 894 plusmn 4 1155 plusmn 080
3 1401 plusmn 76 -
4 2118 plusmn 82 1191 plusmn 136
5 2584 plusmn 50 -
6 3209 plusmn 110 1134 plusmn 003
7 3262 plusmn 115 -
8 3302 plusmn 100 1212 plusmn 000
Graacutefico 14 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 5
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
100
Experimento 6
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa= 120 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = Cilindro
Tabela 13 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 6 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -13286x3 + 14486x2 + 62226x + 400 (120 mol de
foacutetons m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 0485
1 1010
2 1335
3 1462
4 1389
5 1117
6 0645
Graacutefico 15 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 6 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
0
02
04
06
08
1
12
14
16
0 2 4 6 8
mM
ureacute
ia
Tempo (dias)
101
Tabela 14 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 6
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total
(g L-1)
Amocircnia total
(mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 309 plusmn 00 1155 plusmn 000 - -
1 548 plusmn 10 - - -
2 797 plusmn 7 1117 plusmn 134 214E-05 197E-05
3 1267 plusmn 163 - - -
4 2062 plusmn 92 1101 plusmn 004 291E-06 182E-06
5 2558 plusmn 170 - - -
6 2980 plusmn 103 1253 plusmn 058 119E-06 252E-06
7 3093 plusmn 234 - - -
8 3266 plusmn 50 1033 plusmn 004 275E-06
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 16 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 6
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
102
Experimento 7
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 120 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 15 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 7
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 477 plusmn000 1155 plusmn 000
1 954 plusmn135 -
2 1151 plusmn140 1224 plusmn 080
3 1667 plusmn70 -
4 2165 plusmn256 1233 plusmn 136
5 2516 plusmn147 -
6 2969 plusmn23 1134 plusmn 035
7 2827 plusmn28 -
8 2969 plusmn59 1112 plusmn 114
Graacutefico 17 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 7
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
103
Experimento 8
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa= 120 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 16 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 8 de
acordo com a y = - 58128x3 + 38625x2 + 38606x + 400 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 105
1 115
2 117
3 110
4 095
5 070
6 037
Graacutefico 18 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 8 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
000
020
040
060
080
100
120
140
0 1 2 3 4 5 6 7
mM
ureacute
ia
Tempo (dias)
104
Tabela 17 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 8
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total
(g L-1) Amocircnia total
(mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 445 plusmn0 1155 plusmn 000 - -
1 767 plusmn46 - - -
2 1053 plusmn50 1117 plusmn 134 430E-04 307E-05
3 1554 plusmn31 - - -
4 2158 plusmn143 1101 plusmn 004 477E-04 273E-06
5 2552 plusmn87 - - -
6 2952 plusmn35 1253 plusmn 058 166E-04 54E-06
7 3048 plusmn96 - - -
8 3079 plusmn86 1033 plusmn 004 367E-05 194E-06
Graacutefico 19 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 8
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
105
Experimento 9
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 240 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Cilindro
Tabela 18 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 9
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 410 plusmn 0 1155plusmn000
1 815 plusmn 94 -
2 1297 plusmn 206 1117plusmn027
3 2174 plusmn 90 -
4 2625 plusmn 297 1264plusmn033
5 2994 plusmn 213 -
6 3291 plusmn 207 1246plusmn112
7 3422 plusmn 172 -
8 3299 plusmn 117 1045plusmn064
Graacutefico 20 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 9
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
106
Experimento 10
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa= 240 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = Cilindro
Tabela 19 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 10
de acordo com a equaccedilatildeo y = -12057x3 + 10082x2 + 31899x + 400 (240 mol de
foacutetons m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 101
1 134
2 148
3 145
4 123
5 083
6 025
Graacutefico 21 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 10 (240 mol de foacutetons m-2 s-1)
0
02
04
06
08
1
12
14
16
0 1 2 3 4 5 6 7
mM
Ureacute
ia
Tempo (dias)
107
Tabela 20 - Valores meacutedios de concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 10
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total
(g L-1)
Amocircnia total (mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 402 plusmn 000 1155plusmn000 - -
1 461 plusmn 62 - - -
2 839 plusmn 139 1003 plusmn 080 27994E-05
3 1705 plusmn 89 - - -
4 2663 plusmn 95 1120 plusmn 130 153E-05 65768E-06
5 3015 plusmn 78 - - -
6 3236 plusmn 72 1101 plusmn 058 178E-05 95016E-05
7 3307 plusmn 30 - - -
8 3293 plusmn 113 1200 plusmn 017 232E-06 75662E-05
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 22 concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 10
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10
Xm
(m
gL
-1)
Tempo (dias)
108
Experimento 11
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 240 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 21 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 11
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 358plusmn0 1155plusmn000
1 976plusmn53 -
2 1298plusmn61 1003plusmn27
3 1928plusmn78 -
4 2428plusmn207 1141plusmn014
5 2834plusmn199 -
6 3102plusmn130 1053plusmn161
7 2969plusmn59 -
8 3109plusmn19 965plusmn079
Graacutefico 23 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 11
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
109
Experimento 12
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa= 240 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 22 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 12
de acordo com a equaccedilatildeo y = -82763x3 + 62437x2 + 37265x + 400 (240 mol de
foacutetons m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 107
1 126
2 132
3 126
4 107
5 077
6 033
Graacutefico 24 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 12 (240 mol de foacutetons m-2 s-1)
000
020
040
060
080
100
120
140
0 2 4 6 8
mM
ureacute
ia
Tempo (dias)
110
Tabela 23 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amonia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 12
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total
(g L-1) Amocircnia total
(mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 400plusmn0 1155plusmn000 - -
1 625plusmn228 - - -
2 1095plusmn802 1003 plusmn 080 477E-05
3 1562plusmn357 - -
4 1912plusmn47 1120 plusmn 130 95E-05 110E-04
5 2609plusmn231 - -
6 3071plusmn111 1101 plusmn 058 220E-05 126E-04
7 3180plusmn820 - -
8 3200plusmn734 1200 plusmn 017 25E-06
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 25 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 12
Resultados do processo descontiacutenuo alimentado no cultivo de Arthrospira
(Spirulina) platensis utilizando CO2 proveniente de cilindro ou de fermentaccedilatildeo
alcooacutelica com diferentes fontes de nitrogecircnio (nitrato de soacutedio ou ureacuteia) e intensidade
luminosas (60 120 ou 240 mol de foacutetons m-2 s-1) podem ser observados nos
Graacuteficos 8 10 11 13 14 17 18 20 22 23 e 26
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
X (
mg
L
-1)
Tempo (dias)
111
Os perfis das curvas de crescimento foram semelhantes com ausecircncia da fase
lag no cultivo de A platensis no iniacutecio do cultivo crescendo exponencialmente e
estabilizando na fase estacionaacuteria As diferentes fontes de nitrogecircnio (nitrato e ureacuteia)
utilizadas nas diferentes intensidades luminosas (60 120 e 240 mol de foacutetons m-2 s-1
avaliadas) natildeo influenciaram nos perfis das curvas de crescimento Essa
caracteriacutestica foi observada em trabalhos anteriores de Pelizer et al (2003) e Danesi
et al (2002) Isso se deve a semelhanccedila nas condiccedilotildees de crescimento tais como
composiccedilatildeo quiacutemica do meio de cultura e temperatura de crescimento entre a
preparaccedilatildeo do inoacuteculo e o cultivo Outro fator eacute que as ceacutelulas para a preparaccedilatildeo do
inoacuteculo estavam na fase exponencial de crescimento isto eacute o inoacuteculo era um cultivo
jovem constituiacutedo de ceacutelulas ativas De fato Pelizer et al (2003) que trabalharam
com KNO3 como fonte de nitrogecircnio relataram a influecircncia da idade do inoacuteculo no
crescimento da S platensis comprovando que a utilizaccedilatildeo de inoacuteculo no 6ordm dia de
cultivo proporcionou maiores valores no crescimento celular em cultivos realizados
em minitanques Nessas condiccedilotildees tambeacutem natildeo detectaram fase lag de
crescimento
Autores como Danesi et al (2002) trabalhando com ureacuteia como fonte de
nitrogecircnio tambeacutem natildeo observaram a presenccedila de fase lag no cultivo de S
platensis De fato mesmo em cultivos onde o inoacuteculo foi cultivado em meio com
nitrato como eacute o caso do presente trabalho seria esperado que o uso de fontes de
nitrogecircnio que levem agrave presenccedila de amocircnia no meio de cultivo natildeo apresentasse
fase lag de crescimento celular pois a amocircnia eacute a fonte de nitrogecircnio
preferencialmente utilizada pela S platensis (BOUSSIBA 1989 BELKIN
BOUSSIBA 1991b)
A fonte de nitrogecircnio no meio de cultura eacute nutriente fundamental para o
crescimento de micro-organismos fotossintetizantes (WEN CHEN 2001) Diferentes
fontes de nitrogecircnio inorgacircnico para o cultivo de S platensis tem sido estudados tais
como cloreto de amocircnio (CARVALHO et al 2004) sulfato de amocircnio (SOLETTO et
al 2005) nitrato de amocircnio fosfato de amocircnio (COSTA et al 2001) nitrato de soacutedio
(SCHLOumlSSER 1982) nitrato de potaacutessio (PAOLLETI 1975) e ureacuteia (SAacuteNCHEZ-
LUNA et al 2004)
Comparando-se os cultivos com nitrato (Graacuteficos 8 11 14 17 20 e 23) e os
cultivos com ureacuteia (Graacuteficos 10 13 16 19 22 e 25) para cada intensidade luminosa
e fonte de CO2 estudada observam-se que as curvas de crescimento dos cultivos e
112
as concentraccedilotildees celulares diaacuterias com ureacuteia foram semelhantes as curvas de
crescimentos e as concentraccedilotildees celulares diaacuterias utilizando nitrato Isso mostra que
a equaccedilatildeo de alimentaccedilatildeo com ureacuteia (Graacuteficos 9 12 15 18 21 e 24) obtida em
cada intensidade luminosa e fonte de CO2 reproduziu seu respectivo cultivo
utilizando o nitrato
Como pode ser observado nas Tabelas 8 1114 17 20 e 23 as concentraccedilotildees
de amocircnia e ureacuteia residual durante os cultivos sempre apresentaram concentraccedilotildees
inferiores ou proacuteximas 10-4 molar mostrando que natildeo houve acuacutemulo de amocircnia e
ureacuteia residual nos cultivos e essa concentraccedilatildeo tambeacutem satildeo consideradas natildeo
toacutexicas pois esta concentraccedilatildeo torna-se toacutexica numa concentraccedilatildeo acima de 10 mM
e inibitoacuteria na concentraccedilatildeo de 17 mM a 2 mM (ABELIOVICH AZOV 1976
CARVALHO et al 2004 CONVERTI et al 2006b)
O nitrato eacute fonte de nitrogecircnio convencional nos cultivos de micro-oganismo e eacute
encontrado em abundacircncia em ambientes naturais No entanto o emprego de
nitrato em meio sinteacutetico utilizado na produccedilatildeo comercial de micro-organismos
pode aumentar custo do produto final Por isso fontes de nitrogecircnio alternativas tecircm
sido estudadas visando agrave reduccedilatildeo nos custo de produccedilatildeo
Ureacuteia tem sido considerada uma fonte alternativa de nitrogecircnio no cultivo de S
platensis por proporcionar um aumento da concentraccedilatildeo celular (SASSANO et al
2004 SOLETTO et al 2005 DANESI et al 2004) e por ter alta competitividade
econocircmica Isso decorre do seu baixo custo e alto conteuacutedo de nitrogecircnio tendo
como consequumlecircncia o baixo custo por unidade de nitrogecircnio quando comparada a
outras fontes de nitrogecircnio
A ureacuteia quando hidrolisada origina duas moleacuteculas de amocircnia e uma de
dioacutexido de carbono Essa conversatildeo ocorre primeiramente quando a ureacuteia
(CO(NH2)2) combina com a aacutegua (hidroacutelise) e forma o carbonato de amocircnio
((NH4)2CO3) Esse composto eacute instaacutevel e decompotildee para formar o gaacutes amocircnia (NH3)
e o dioacutexido de carbono (CO2) (DORN 2007) A amocircnia por sua vez eacute uma moleacutecula
pequena e natildeo carregada que se move relativamente livre atraveacutes da bicamada
lipiacutedica Um possiacutevel mecanismo para a assimilaccedilatildeo da amocircnia pode envolver a
simples difusatildeo da amocircnia seguindo pelo seu aprisionamento atraveacutes da
protonaccedilatildeo uma vez que dependendo do pH (pH 8) em que se encontra a amocircnia
reage com a aacutegua formando o iacuteon amocircnio (NH4+) Portanto a membrana eacute
permeaacutevel agrave amocircnia mas impermeaacutevel ao iacuteon amocircnio (BOUSSIBA et al 1984)
113
Costa et al (2001) em estudos comparativos usando diferentes fontes de
nitrogecircnio em processo descontiacutenuo no cultivo de S platensis observaram que
001 M de ureacuteia ou nitrato de amocircnio proporcionaram maiores concentraccedilotildees
celulares de aproximadamente 1g L-1 natildeo diferindo estatisticamente do cultivo com
o nitrato de soacutedio No entanto nos cultivos com maiores concentraccedilotildees dessas
fontes de nitrogecircnio (003 M e 005 M) natildeo houve crescimento celular
Costa et al (2004) avaliaram o crescimento da S platensis na lagoa Mangueira
suplementando ureacuteia por processo descontiacutenuo alimentado e observaram um
aumento de 267 vezes na concentraccedilatildeo da biomassa no cultivo suplementado com
1125 mg L-1 de ureacuteia quando comparada nos cultivos natildeo suplementado com ureacuteia
No entanto nos cultivos com 2250 mg L-1 de ureacuteia houve uma reduccedilatildeo na
concentraccedilatildeo celular Isso sugere que a adiccedilatildeo de ureacuteia na lagoa Mangueira eacute
beneacutefica ao crescimento da S platensis mas se adicionada em altas concentraccedilotildees
podem inibir o crescimento Por outro lado Soletto et al (2005) compararam cultivos
de S platensis utilizando processo descontiacutenuo com a mesma concentraccedilatildeo de
sulfato de amocircnio ou ureacuteia como fonte de nitrogecircnio e observaram que na
concentraccedilatildeo de 17 mM houve um raacutepido crescimento da biomassa quando
utilizado ureacuteia e houve uma inibiccedilatildeo no crescimento quando utilizado o sulfato de
amocircnio Como sugerido em trabalhos preacutevios a accedilatildeo simultacircnea das condiccedilotildees
alcalina (DANESI et al 2002) e a accedilatildeo da urease (CARVAJAL et al 1982
SHIMAMATSU 2004) poderia ter promovido a hidroacutelise da ureacuteia em amocircnia
acoplado com a assimilaccedilatildeo da amocircnia pelas ceacutelulas minimizando portanto a
inibiccedilatildeo pela amocircnia
Sassano et al (2004) observaram que utilizando 500 mg L-1 de massa total de
ureacuteia alimentada durante 12 dias proporcionou aumento na concentraccedilatildeo de S
platensis em minitanques quando comparadas ao emprego do nitrato
Su et al (2007) observaram que o maior desempenho em termos de
rendimento de biomassa e conteuacutedo de lipiacutedios durante o crescimento da Isochrysis
galbana foi no meio contendo ureacuteia como fonte de nitrogecircnio indicando que a ureacuteia
eacute a fonte preferencial de nitrogecircnio em relaccedilatildeo ao (NH4)2SO4 e NH4Cl
O emprego da ureacuteia pode levar a inibiccedilatildeo do crescimento celular Em condiccedilatildeo
alcalina ou a presenccedila de urease no meio de cultivo hidrolisa uma moleacutecula de ureacuteia
em duas moleacuteculas de amocircnia e esta em altas concentraccedilotildees eacute considerada toacutexica
para as ceacutelulas (SASSANO et al 2004) Por outro lado quando em baixas
114
concentraccedilotildees podem limitar o crescimento uma vez que a presenccedila nitrogecircnio eacute
fundamental para o crescimento e manutenccedilatildeo celular Por isso o modo de adiccedilatildeo
de ureacuteia eacute importante para melhorar a produtividade do cultivo
O modo de alimentaccedilatildeo empregado no cultivo de ureacuteia pode prevenir o
acuacutemulo ou a falta desse nutriente no cultivo Sanchez-Luna et al (2004) relataram
que a adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia a uma taxa constante pode ser usada no cultivo de S
platensis implicando em baixo custo na produccedilatildeo da biomassa por natildeo precisar de
bombas para alimentaccedilatildeo
A baixa concentraccedilatildeo de nitrogecircnio no cultivo limita o crescimento celular Por
outro lado a alta concentraccedilatildeo de nitrogecircnio inibe o mesmo Deste modo foram
feitos cultivos de A platensis utilizando a fonte de nitrogecircnio convencional (NaNO3)
para se observar a necessidade diaacuteria de nitrogecircnio consumida pelas ceacutelulas nas
diferentes intensidades luminosas e com base nessas curvas de crescimento
obtidas foram calculadas as quantidades de ureacuteia diaacuteria necessaacuterias visando evitar
a limitaccedilatildeo ou inibiccedilatildeo de crescimento celular pela fonte de nitrogecircnio como pode-se
observar nas Tabelas 7 9 10 13 16 19 e 22 Aleacutem disso foi empregado o
processo descontiacutenuo alimentado que deve ser usado para melhorar a densidade
celular no crescimento da A platensis desde que a concentraccedilatildeo de nitrogecircnio
soluacutevel possa ser adicionada ateacute alcanccedilar a produccedilatildeo maacutexima de biomassa sem
resultar na inibiccedilatildeo do crescimento
Outro fator importante no crescimento celular de micro-organismos
fotossintetizantes eacute a intensidade luminosa Nas culturas fotossinteacuteticas a
quantidade de energia luminosa captadas pelas ceacutelulas tem uma relaccedilatildeo direta com
a capacidade de fixaccedilatildeo do CO2 consequentemente a luz determina a
produtividade e a taxa de crescimento celular As diferentes intensidades luminosas
estudadas influenciaram nas concentraccedilotildees celulares maacuteximas Um aumento da
intensidade luminosa de 60 mol de foacutetons m-2 s-1 para 120 mol de foacutetons m-2 s-1
houve um aumento no valor da concentraccedilatildeo celular maacutexima No entanto um
aumento da intensidade luminosa de 120 mol de foacutetons m-2 s-1 para 240 mol de
foacutetons m-2 s-1 as concentraccedilotildees celulares maacuteximas obtiveram valores proacuteximos
Geralmente a taxa de crescimento das ceacutelulas microalgas aumenta com a
intensidade luminosa e a taxa atinge um valor de saturaccedilatildeo quanto maior for a
intensidade luminosa porque o excesso da energia luminosa natildeo pode ser utilizada
para a fotossiacutentese nas ceacutelulas e quando submetidas a um valor de intensidade
115
luminosa ainda maior o crescimento celular eacute reprimido como relatado por Hirata et
al (1998) e Chojnacka e Noworyta (2004a)
Segundo Hirata et al (1998) e Chojnacka e Noworyta (2004a) existe uma
correlaccedilatildeo entre o crescimento da Arthrospira ssp e a intensidade luminosa que satildeo
definidas por regiotildees denominadas regiatildeo limitada por luz saturada por luz e inibida
por luz A regiatildeo saturada por luz eacute definida como alta intensidade luminosa onde o
crescimento celular independe da intensidade luminosa Essa regiatildeo saturada por
luz pode ser observada no presente trabalho uma vez que o aumento da
intensidade luminosa natildeo interferiu na concentraccedilatildeo celular maacutexima O intervalo da
intensidade luminosa dessas regiotildees depende de vaacuterios fatores como configuraccedilatildeo
do reator micro-organismo condiccedilotildees de cultivo
S platensis cultivada em reator retangular alcanccedilou um aumento no valor da
velocidade especiacutefica de crescimento com o aumentou da intensidade luminosa de 8
a 34 W m-2 mas foi reduzido quando a intensidade luminosa aumentou de 34 W m-2
(156 mol de foacutetons m-2 s-1) para 158 W m-2 (724 mol de foacutetons m-2 s-1) e foi
completamente reprimida a 158 W m-2 (HIRATA et al 1998) Chojnacka e Noworyta
(2004a) avaliando o cultivo fotoautotroacutefico da S platensis em reator retangular
tambeacutem concluiacuteram que a velocidade de crescimento especiacutefica aumenta com o
aumento da intensidade luminosa ateacute um valor de 30 W m-2 Entre os valores de
intensidade luminosa de 30 W m-2 (138 mol de foacutetons m-2 s-1) a 50 W m-2 (229 mol
de foacutetons m-2 s-1) observa-se a regiatildeo de saturaccedilatildeo luminosa e acima desse valor
(50 W m-2) ocorre o fenocircmeno da fotoinibiccedilatildeo
Nos cultivos sob maiores intensidades luminosas (120 e 240 mol de foacutetons m-2
s-1) desenvolveram uma coloraccedilatildeo amarelada no decorrer do cultivo por outro lado
no cultivo a 60 mol de foacutetons m-2 s-1 as ceacutelulas apresentaram uma coloraccedilatildeo mais
verde-azulada claacutessica Como eacute bem conhecido sob condiccedilotildees limitantes de
nitrogecircnio o conteuacutedo de clorofila da S platensis diminui apresentando uma
coloraccedilatildeo verde-amarelada ao contraacuterio da coloraccedilatildeo verde-azulada claacutessica
(CARVALHO et al 2004) No entanto no presente estudo como natildeo houve
limitaccedilatildeo de nitrogecircnio durante os cultivos essa coloraccedilatildeo amarelada pode ser
devido agrave alta intensidade luminosa uma vez que as intensidades luminosas
estudadas atingiram a regiatildeo saturado por luz como definido por Hirata et al (1998)
e Chojnacka e Noworyta (2004a) Do mesmo modo Vonshak et al (1996) relataram
que o crescimento da S platensis torna-se saturado a um intervalo de 150 a 200
116
mol de foacutetons m-2 s-1 e esta faixa da intensidade luminosa corresponde a
aproximadamente de 10-15 da radiaccedilatildeo solar total a 400-700 nm
Geralmente o pH do meio aumenta durante o crescimento celular devido agrave
assimilaccedilatildeo da fonte de carbono o bicarbonato durante a fotossiacutentese (WATANABE
et al 1995 BINAGHI et al 2003) Os iacuteons bicarbonato satildeo transportados
ativamente para o interior celular convertidos a carbonato e gaacutes carbocircnico que eacute
utilizado na fotossiacutentese Para cada moleacutecula de CO2 utilizada pela ceacutelula ocorre a
liberaccedilatildeo de um iacuteon carbonato O pH da cultura foi mantido a 95 02 (SANCHEZ-
LUNA et al 2007 TREDICI ZITTELLI 1998) logo o CO2 consumido pelo micro-
organismo foi reposto por CO2 natildeo havendo modificaccedilotildees severas do pH o que
acarretaria uma reduccedilatildeo no crescimento da S platensis Valores de pH altos por
exemplo acima de 11 pode ser um fator no qual restringe a produtividade no
sistema air-lift usando ar natildeo suplementado com CO2 (WATANABE et al 1995)
Normalmente culturas de microorganismos fotossinteacuteticos usam como fonte
de carbono o bicarbonato eou carbonato Estes nutrientes satildeo adicionados em
grande quantidade no meio Schloumlsser para o cultivo de A platensis (1208 g L-1)
Adicionalmente estes micro-organismos tecircm a capacidade de fixar CO2 como fonte
de carbono na qual eacute liberado pelos efluentes industriais Logo este CO2 pode ser
adicionado ou substituiacutedo no meio de cultura reduzindo os custos da produccedilatildeo de
microorganismos fotossinteacuteticos bem como reduzindo os problemas ambientais
causados por esse gaacutes
O sequestramento de CO2 mostrou ser efetivo nas ceacutelulas de Chlorella
vulgaris e a presenccedila da mistura de CVOs (benzeno tolueno acetona metanol e
naftaleno) presente no efluente natildeo interferiu no uso desse CO2 e adicionalmente
11 dos CVOs foram removidos (KEFFER KLEINHEINZ 2002)
Diferentes autores relataram sobre o crescimento mixotroacutefico da A platensis
na presenccedila de glicose (ZHANG et al 1998 CHOJNACKA NOWORYTA 2004) ou
acetato (CHEN et al 2006) Maacuterquez et al (1993) mostraram que a S platensis eacute
capaz de crescer heterotroficamente ou mixotroficamente na presenccedila de glicose
sugerindo que o crescimento autotroacutefico e heterotroacutefico satildeo independentes Em
cultivos mixotroacuteficos o CO2 e composto orgacircnico satildeo assimilados conjuntamente
podendo ser um processo mais eficiente para a produccedilatildeo de biomassa microalgal
desde que isto implica em uma economia em energia usada para a siacutentese do
aparato fotossinteacutetico e para a fixaccedilatildeo do carbono (LEE 2004) Chen et al (2006)
117
mostraram que o acetato pode ser usado como fonte de carbono em cultivos
mixotroacuteficos de S platensis para a produccedilatildeo de vaacuterios pigmentos fotossinteacuteticos e
obtenccedilatildeo da concentraccedilatildeo de biomassa maacutexima (165 g Lminus1) na qual obtiveram
valores maiores que usando apenas bicarbonato (108 g L-1)
Menzyanova et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de pequenas quantidades
de etanol (01 - 03) aumentou a concentraccedilatildeo de Dunaliella viridis enquanto que
em quantidades maiores que 05 natildeo houve efeito no crescimento A adiccedilatildeo
muacuteltipla e sucessiva de etanol no cultivo favoreceu a um acuacutemulo de etanol no meio
de cultivo o que provocou uma inibiccedilatildeo o crescimento da D viridis quando a
concentraccedilatildeo de etanol foi de 03 e causou a morte celular na concentraccedilatildeo de
etanol de 05
Apesar do etanol ser o CVO predominante no material gasoso sua proporccedilatildeo
em relaccedilatildeo ao CO2 eacute pequena (resultados obtidos pelo instituto de Pesquisa
Tecnoloacutegica) Assim no presente trabalho natildeo se observou um efeito dos volaacuteteis
orgacircnicos (CVOs) liberados da fermentaccedilatildeo alcooacutelica no cultivo de A platensis
Esses CVOs satildeo constituiacutedos a maior parte por 43 ndash 47 de etanol (Basso et al
1996) e em menor quantidade acetaldeiacutedo propanol isobutanol aacutelcool isoamiacutelico e
acetato de etila (CAEHOT et al 1991) Logo A platensis pode ser usada para o
tratamento de efluentes gasosos nas induacutestrias de fermentaccedilatildeo alcooacutelica Logo
observou-se que o efluente gasoso liberado das induacutestrias de fermentaccedilatildeo alcooacutelica
pode ser usado no cultivo de A platensis sem prejudicar o crescimento celular
Similarmente Ferraz et al (1985) observaram que eacute possiacutevel cultivar S
maxima em reatores abertos (open ponds) borbulhando o CO2 proveniente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica de modo descontiacutenuo e usando nitrato com fonte de
nitrogecircnio
A adiccedilatildeo de CO2 no reator aleacutem de controlar o pH fornece a fonte de
carbono para o crescimento celular Como pode ser observado nas Tabelas 6 8 9
11 12 14 15 17 18 20 21 e 23 mesmo ocorrendo o crescimento celular as
concentraccedilotildees de carbonato total sempre apresentaram valores altos de um modo
geral proacuteximos aos 1208 g L-1 iniciais (concentraccedilatildeo indicada em Schloumlsser et al
1982) indicando que os cultivos tambeacutem natildeo foram limitados pela fonte de carbono
Durante a fotossiacutentese oxigecircnica realizada pela S platensis ocorre a
liberaccedilatildeo de O2 no meio de cultura Elevadas concentraccedilotildees de O2 no meio de
cultura pode prejudicar o crescimento celular uma vez que este pode danificar o
118
aparato fotossinteacutetico dificultando a realizaccedilatildeo da fotossiacutentese Por isso a
concentraccedilatildeo de O2 deve ser controlada durante o crescimento celular As
concentraccedilotildees de oxigecircnio foram analisadas diariamente e os valores natildeo atnigiram
niacuteveis inibitoacuterios pois foram sempre menores que 10 mg L-1 (Vonshak 1997)
119
63 Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm)
Produtividade em ceacutelulas (Px) e Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN)
Na Tabela 24 estatildeo descritos os valores da concentraccedilatildeo celular maacutexima
produtividade em ceacutelulas e fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas Nas Tabelas
25 28 e 31 estatildeo descritos a anaacutelise de variacircncia dos paracircmetros cineacuteticos Xm Px
e YXN respectivamente Os valores meacutedios de Xm Px e YXN para cada variaacutevel
independente estatildeo descritos nas Tabelas 26 27 29 30 32 e 33
Tabela 24 - Valores da concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) produtividade em ceacutelulas
(Px) e fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) com diferentes fontes de
CO2 fontes de nitrogecircnio e intensidades luminosas
Experimento Fonte de CO2 Intensidade luminosa (I)
Fonte de nitrogecircnio
Xm
(mg L-1)
Px
(mg L-1 d-1)
YXN
(g g-1)
1 Cilindro 60 NaNO3 2899 plusmn 17 250 plusmn 2 42 plusmn 003
2 Cilindro 60 Ureacuteia 2847plusmn 1 245 plusmn 1 14 plusmn 000
3 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 60 NaNO3 3120plusmn156 299 plusmn10 40 plusmn 014
4 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 60 Ureacuteia 2957 plusmn 99 308 plusmn 4 14 plusmn 017
5 Cilindro 120 NaNO3 3209plusmn109 454 plusmn18 45 plusmn 018
6 Cilindro 120 Ureacuteia 2980plusmn103 408 plusmn17 11 plusmn 050
7 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 120 NaNO3 2728 plusmn 27 428 plusmn 4 43 plusmn 004
8 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 120 Ureacuteia 2855 plusmn 11 425 plusmn 6 15 plusmn 02
9 Cilindro 240 NaNO3 3291plusmn206 482 plusmn 34 54 plusmn 038
10 Cilindro 240 Ureacuteia 3236 plusmn 72 473 plusmn 12 133plusmn034
11 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 240 NaNO3 3102plusmn130 450 plusmn 22 50 plusmn 024
12 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 240 Ureacuteia 3070plusmn112 445 plusmn19 14 plusmn 056
I = mol de foacutetons m-2
s-1
631 Concentraccedilatildeo celular maacutexima
Na Tabela 25 estatildeo apresentados os resultados da anaacutelise de variacircncia da
concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) e nas Tabelas 26 e 27 estatildeo apresentadas as
120
meacutedias do Xm nas variaacuteveis independentes fontes de nitrogecircnio e intensidades
luminosas respectivamente
Tabela 25 - Anaacutelise de variacircncia para a concentraccedilatildeo celular maacutexima
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
13585 1 13585 157 0225
Fonte de Nitrogecircnio
84 1 84 001 0922
Intensidade luminosa
443083 2 221542 2566 0000
Resiacuteduos 164033 19
total 620786 23
Como se observa na Tabela 25 a variaacutevel independente intensidade luminosa
foi estatisticamente significante na determinaccedilatildeo do Xm (p = 0000) enquanto que
as variaacuteveis independentes fontea de CO2 (p = 0225) e fonte de nitrogecircnio (p =
0922) natildeo influenciaram estatisticamente no valor de Xm De fato a similaridade das
fontes de nitrogecircnio jaacute era esperada uma vez que a adiccedilatildeo de ureacuteia nos cultivos para
cada intensidade luminosa foram baseadas em seus respectivos cultivos com nitrato
visando um crescimento celular natildeo limitado e nem inibido pela fonte de nitrogecircnio e
obtendo portanto valores de Xm meacutedios semelhantes Ambas as fontes de nitrogecircnio
utilizadas satildeo facilmente assimiladas pela A platensis os valores de Xm foram
estatisticamente iguais para cada intensidade luminosa avaliada (Tabela 26)
Em relaccedilatildeo agrave fonte de CO2 Isto mostra que o CO2 e os volaacuteteis orgacircnicos
liberados na atmosfera como resiacuteduo podem ser utilizados como fonte de carbono
no cultivo de A platensis sem prejudicar o crescimento celular
Tabela 26 - Meacutedias das concentraccedilotildees celular maacutexima para a variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio
Fonte de nitrogecircnio Xm meacutedia (mgL-1)
Nitrato 3027 plusmn 162ordf
Ureacuteia 3031 plusmn 174ordf
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
121
Comparando-se as meacutedias de Xm entre as diferentes intensidades luminosas
observa-se que o valor meacutedio de Xm na intensidade luminosa de 60 mol de foacutetons
m-2 s-1 foi estatisticamente diferente ao valor meacutedio de Xm quando a intensidade
luminosa foi de 120 mol de foacutetons m-2 s-1 e este foi estatisticamente semelhante ao
valor meacutedio de Xm quando a intensidade luminosa foi de 240 mol de foacutetons m-2 s-1
(Tabela 27) Essas comparaccedilotildees das meacutedias de Xm explicam o valor do niacutevel
descritivo obtido pela anaacutelise de variacircncia para a variaacutevel intensidade luminosa (p
=0000 Tabela 25) mostrando que a esta influencia no valor de Xm Esses
resultados estatildeo de acordo com Chojnacka e Noworyta (2004a) que avaliaram o
cultivo fotoautotroacutefico da S platensis em reator retangular tambeacutem concluiacuteram que a
velocidade de crescimento especiacutefica aumenta com o aumento da intensidade
luminosa ateacute um valor de 30 W m-2 (138 mol de foacutetons m-2 s-1) Entre os valores de
intensidade luminosa de 30 W m-2 (138 mol de foacutetons m-2 s-1) a 50 W m-2 (229 mol
de foacutetons m-2 s-1) observa-se a regiatildeo de saturaccedilatildeo luminosa Acima desse valor (50
W m-2) ocorre o fenocircmeno da fotoinibiccedilatildeo Do mesmo modo no presente trabalho
os valores de Xm foram estatisticamente iguais nas intensidades luminosas de 120
mol de foacutetons m-2 s-1 e 240 mol de foacutetons m-2 s-1 cujas intensidades luminosas satildeo
proacuteximas agraves intensidades luminosas que correspondem agrave regiatildeo de saturaccedilatildeo
luminosa observada por Chojnacka e Noworyta (2004a)
Tabela 27 - Meacutedias das concentraccedilotildees celular maacutexima para a variaacutevel independente
intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(mol de foacutetons m-2 s-1)
Xm meacutedia (mgL-1)
60 2851plusmn54ordf
120 3056plusmn115b
240 3180plusmn96b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
A maior concentraccedilatildeo celular maacutexima encontrada nesse trabalho foi maior do
que a obtida por Binaghi et al (2003) utilizando minitanques no cultivo de S
platensis (15 g L-1) e tambeacutem maior que a obtida por Watanabe e Hall (1996)
utilizando fotobiorreator tubular cocircnico no cultivo de S platensis (13 g L-1)
122
Morais e Costa (2007a) relataram que em cultivo de S platensis em
fotobiorreator tubular vertical obtiveram maiores valores de Xm de 413 g L-1
suplementado com 6 CO2 quando comparadas em cultivos em Erlenmeyer Esses
autores relatam que a S platensis podem crescer com 18 CO2 demonstrando que
estes suportam altas concentraccedilotildees de CO2 podendo ser usado para mitigar o efeito
do CO2 emitido pelos gases efluentes
Olguiacuten et al (2001) avaliando o crescimento da S platensis em meio contendo
aacutegua do mar suplementado com efluentes anaeroacutebicos a partir da digestatildeo de
resiacuteduo da suinocultura e em meio Zarrouk tambeacutem observaram um aumento no
valor de Xm com o aumento da intensidade luminosa de 66 mol de foacutetons m-2 s-1
para 144 mol de foacutetons m-2 s-1
632 Produtividade volumeacutetrica de ceacutelulas
Na Tabela 28 estatildeo apresentados os resultados da anaacutelise de variacircncia da
produtividade em ceacutelulas (Px) e nas Tabelas 29 e 30 estatildeo apresentadas as meacutedias
do Px nas variaacuteveis independentes fontes de nitrogecircnio e intensidades luminosas
respectivamente
Tabela 28 - Anaacutelise de variacircncia para a produtividade em ceacutelulas
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
315 1 315 137 0256
Fonte de Nitrogecircnio
1 1 1 000 0947
Intensidade luminosa
116579 2 58289 25372 0000
Resiacuteduos 4365 19 230
total 121260 23
Avaliando-se os paracircmetros produtividades em ceacutelulas pela anaacutelise de
variacircncia (Tabela 28) pode-se notar que a fonte de CO2 (p=0256) e a de nitrogecircnio
(p=0947) natildeo interferiram nas produtividades em celulares Portanto a intensidade
luminosa mostrou ser estatisticamente significante no valor de Px (p=0000)
123
Tabela 29 - Meacutedias das produtividades em ceacutelulas para a variaacutevel independente
fonte de nitrogecircnio
Fonte de nitrogecircnio Px meacutedio (mgL-1 d-1)
Nitrato 404 plusmn 74ordf
Ureacuteia 405 plusmn 75ordf
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
Como se pode observar na Tabela 29 os valores meacutedios de Px para as
diferentes fontes de nitrogecircnio estudadas natildeo diferiram estatisticamente Do mesmo
modo como ocorreu com o paracircmetro Xm os valores de Px nos cultivos com ureacuteia e
nitrato foram semelhantes para cada intensidade luminosa Isso jaacute era esperado
uma vez que a adiccedilatildeo de ureacuteia nos cultivos para cada intensidade luminosa foram
baseadas em seus respectivos cultivos com nitrato Spirulina platensis cultivadas em
minitanques com 257 mg L-1 de KNO3 ou 500 mg L-1 de ureacuteia obtiveram valores de
Px semelhantes para as intensidades luminosas estudadas 14 klux (168 mol de
foacutetons m-2 s-1) ou 56 klux (672 mol de foacutetons m-2 s-1) (RANGEL-YAGUI et al 2004)
Tabela 30 - Meacutedias das produtividades em ceacutelulas para a variaacutevel independente intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(mol de foacutetons m-2 s-1)
Px meacutedio (mgL-1)
60 306plusmn7a
120 443plusmn19b
240 463plusmn16b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
Os maiores valores de produtividade em ceacutelulas foram encontrados nas
maiores intensidades luminosas obtendo valores meacutedios de 443 plusmn 19 mg L-1 d-1 a
120 μmol de foacutetons m-2 s-1 e 463 plusmn 16 mg L-1 d-1 a 240 μmol de foacutetons m-2 s-1
independente da fonte de nitrogecircnio utilizada (Tabela 30) Durante a fotossiacutentese as
ceacutelulas podem utilizar somente uma soma limitada de energia luminosa por vez
Este fenocircmeno de saturaccedilatildeo luminosa eacute provavelmente resultado de um mecanismo
interno onde as ceacutelulas podem realizar a fotossiacutentese usando somente uma
124
determinada quantidade de luz (CARLOZZI 2003) Isso significa que durante a
saturaccedilatildeo luminosa um aumento da intensidade luminosa natildeo permitiraacute um
aumento da concentraccedilatildeo celular e nem reduziraacute o tempo de cultivo mantendo
proacuteximos os valores de produtividades de ceacutelulas nesse intervalo de saturaccedilatildeo
luminosa
Na menor intensidade luminosa (60 mol de foacutetons m-2 s-1) o valor de Px foi
menor em relaccedilatildeo agraves outras intensidades luminosas obtendo valor meacutedio de 306 plusmn 7
mg L-1 d-1 Do mesmo modo como observado nas outras intensidades luminosas as
fontes de nitrogecircnio estudadas natildeo influenciaram na produtividade celular Essa
diferenccedila nos valores de Px entre as intensidades luminosas foi devido a um maior
tempo de cultivo nos experimentos submetidos agrave intensidade luminosa de 60 mol
de foacutetons m-2 s-1 A produtividade eacute uma razatildeo inversa do tempo de cultivo logo
quanto maior a intensidade luminosa mais raacutepida as ceacutelulas atingem a concentraccedilatildeo
celular maacutexima e consequentemente maior seraacute a produtividade celular diaacuteria
Quanto maior a intensidade luminosa maior eacute a quantidade de foacutetons emitidos e
estes podem ser absorvidos pelas ceacutelulas isto eacute maior eacute a quantidade de energia
luminosa que seraacute convertido em energia quiacutemica que por sua vez as ceacutelulas
utilizam essa energia quiacutemica para a manutenccedilatildeo e o crescimento celular Esse
efeito tambeacutem foi observado por Danesi et al (2004) Rangel-Yagui et al (2004) em
cultivos de S platensis em minitanques utilizando KNO3 ou ureacuteia como fontes de
nitrogecircnio
O maior valor da produtividade encontrada nesse trabalho foi proacuteximo a 510 mg
L-1 d-1 obtido por Watanabe e Hall (1996) investigando o crescimento da S platensis
em fotobiorreator helicoidal cocircnico sob ciclos 12h12h (claroescuro) e uma meacutedia
de fluxo de foacutetons de 546 mol de foacutetons m-2 s-1 Watanabe et al (1995) em
processo descontiacutenuo utilizando a S platensis cultivada em fotobiorreator tubular
helicoidal cocircnico utilizando luz artificial (118 mol de foacutetons m-2 s-1) tambeacutem
obtiveram uma produtividade volumeacutetrica diaacuteria de 051 g L-1d-1 Foram usados dois
sistemas (airlift e bomba) para reciclar a cultura Com o sistema airlift os autores
encontraram a maior concentraccedilatildeo da biomassa de 16 g L-1 apoacutes 5 dias de
crescimento da S platensis e uma menor concentraccedilatildeo da biomassa quando
utilizado o sistema de bomba No fotobiorreator tubular helicoidal cocircnico quando
cultivado em ambiente externo a produtividade foi de 900 mg L-1 d-1 (TREDICI
125
ZITTELLI 1998) Travieso et al (2001) encontrou uma produtividade maacutexima de
040 g Lminus1 dminus1 em fotobiorreator tubular helicoidal operado de modo semicontiacutenuo
No presente trabalho os maiores valores da produtividade em ceacutelulas
encontradas foram maiores do que a relatada por Richmond (1990) em reatores
tubulares em ambiente externo que foi de 370 mg L-1 d-1 e Morais e Costa (2007b)
que obteve Xmax de 022 g Lminus1 dminus1 no cultivo de Spirulina sp na presenccedila de 6 de
dioacutexido de carbono em fotobiorreator tubular com trecircs estaacutegios em seacuterie Por outro
lado autores como Carlozzi e Pinzani (2005) conseguiram uma produtividade em
ceacutelulas maacutexima de 182 g L-1 dminus1 utilizando o processo descontiacutenuo em ambiente
externo Lee (2001) relata que dependendo da configuraccedilatildeo de fotobiorreator tubular
fechado e de placas retangulares a produtividade volumeacutetrica foi de 025 a 364 g L-1
d-1 utilizando o processo descontiacutenuo alimentado
Travieso et al (2001) relataram uma produtividade maacutexima de 04 g L-1 d-1 em
processo semicontiacutenuo de Spirulina utilizando uma diluiccedilatildeo de 15 e taxa de diluiccedilatildeo
de 00078 hminus1 Esses autores utilizaram o fotobiorreator patenteado bdquobdquoBiocoil‟‟ da
Biotechna Grasser UK (European patent EPO239272 March 6 1987)
Vernerey et al (2001) utilizando uma nova configuraccedilatildeo de fotobioretator para o
aumento da escala (72 litros) na produccedilatildeo de S platensis conseguiram uma
produtividade de 138 g L-1 d-1 com intensidade luminosa de 300 W m-2 e pH
controlado a 95 pela adiccedilatildeo de CO2
Cultivos de Arthrospira platensis em fotobiorreator tubular outdoor no periacuteodo
de marccedilo a setembro de 2002 na Repuacuteblica Checa com a maioria dos dias
ensolarados a irradiacircncia do ambiente maacutexima foi entre 15 and 18 mmol de foacutetons
mminus2 sminus1 Nessas condiccedilotildees a produtividade maacutexima atingida foi de 05 g Lminus1 dminus1
correspondendo a um rendimento de aacuterea (baseada na aacuterea superficial) de
aproximadamente 325 g mminus2 dminus1 na qual eacute um valor relativamente alto se considerar
que foi obtida no mecircs de setembro A concentraccedilatildeo celular oacutetima da cultura foi
obtida em um intervalo de 1 a 2 g L-1 demostrando que a faixa da concentraccedilatildeo
celular oacutetima no cultivo de Spirulina natildeo eacute muito restrita (MASOJIDEK et al 2003)
633 Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas
Na Tabela 31 estatildeo os resultados da anaacutelise de variacircncia para o fator de
conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) e nas Tabelas 32 e 33 estatildeo os valores
126
meacutedios do YXN nas variaacuteveis independentes fontes de nitrogecircnio e intensidades
luminosas respectivamente
Tabela 31 - Anaacutelise de variacircncia para fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
054 1 054 091 0351
Fonte de Nitrogecircnio
5078 1 5078 8453 0000
Intensidade luminosa
043 2 022 036 0700
Resiacuteduos 1123 19 059
total 520 23
Como observado na Tabela 24 os maiores valores do fator de conversatildeo (YXN)
foram obtidos nos cultivos utilizando ureacuteia como fonte de nitrogecircnio independente
da fonte de CO2 e da intensidade luminosa utilizada Isso pode ser avaliado pela
anaacutelise de variacircncia (Tabela 31) onde apresenta o niacutevel descritivo para a fonte de
CO2 fonte de nitrogecircnio de p = 0000 e para a intensidade luminosa o p = 0700 A
maior meacutedia dos valores de YXN foi 1380 plusmn 090 g g-1 obtida nos cultivos utilizando
ureacuteia como fonte de nitrogecircnio (Tabela 32) diferindo estatisticamente dos valores
obtidos nos cultivos com nitrato (460 plusmn 055 g g-1) De fato nos cultivo utilizando
ureacuteia a concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente foi calculada com base
na necessidade das ceacutelulas para o crescimento e a manutenccedilatildeo celular natildeo
ocorrendo uma limitaccedilatildeo ou um excesso de nitrogecircnio adicionado durante o cultivo
(item 5) Como mencionado por Rangel-Yagui et al (2004) o excesso de ureacuteia
diminui a eficiecircncia de utilizaccedilatildeo desse nutriente e portanto menor o valor de YXN
Da mesma forma a menor massa total adicionada no cultivo proporcionou maiores
valores de YXN (739 g g-1) no cultivo de S platensis em minitanques utilizando o
cloreto de amocircnio como fonte de nitrogecircnio (Carvalho et al 2004) Por outro lado
nos cultivos com nitrato a concentraccedilatildeo deste foram mantidas acima de 1 g L-1 de
modo a evitar a limitaccedilatildeo do crescimento pela fonte de nitrogecircnio Por isso os
maiores valores de YXN foram obtidos nos cultivos utilizando ureacuteia Resultados
similares foram obtidos por Danesi et al (2003) empregando 25 g de ureacuteia em
127
diferentes protocolos de alimentaccedilatildeo e temperatura em relaccedilatildeo a KNO3 e por Danesi
et al (2004) que tambeacutem observaram um maior fator de conversatildeo utilizando ureacuteia
em relaccedilatildeo a KNO3 independente da intensidade luminosa utilizada (2 e 5 klux)
Rangel-Yagui et al (2004) tambeacutem observaram maiores valores de YXN nos cultivos
utilizando ureacuteia
Tabela 32 - Meacutedias dos fatores de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas para a
variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio
Fonte de nitrogecircnio YXN (mgmg-1)
Nitrato 460 plusmn 055ordf
Ureacuteia 1380 plusmn 090b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
Em relaccedilatildeo agrave variaacutevel independente intensidade luminosa pode-se observar na
Tabela 33 que natildeo diferiram estatisticamente nos valores de YXN Isto eacute
independente da intensidade luminosa utilizada os valores de conversatildeo de
nitrogecircnio em ceacutelulas foram estatisticamente iguais De fato a quantidade de
nitrogecircnio adicionada nos cultivos estaacute relacionada com o crescimento celular
portanto quanto maior o valor de Xm maior foi a quantidade de nitrogecircnio
adicionada nos cultivos independente da fonte nitrogecircnio utilizada (nitrato ou ureacuteia)
Com isso razatildeo entre biomassa formada e nitrogecircnio adicionado foi estatisticamente
igual nas diferentes intensidades luminosas estudas
A Intensidade luminosa influencionou no crescimento celular (Item 62) e a
fonte de nitrogecircnio (nitrato ou ureacuteia) foi adicionada de acordo com a necessidade da
ceacutelula para o crescimento celular (Item 5) Por isso o YXN foi estatisticamente igual
(p = 0245) nas diferentes intensidades luminosas estudadas (Tabela 31)
O fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas eacute definido como a quantidade de
nitrogecircnio utilizada para a formaccedilatildeo de biomassa como no presente trabalho o
nitrogecircnio adicionado foi de acordo com a necessidade diaacuteria das ceacutelulas os valores
meacutedios de YXN para cada intensidade luminosa natildeo poderiam variar como pode ser
observado na Tabela 33
Nos trabalhos apresentados por Bezerra et al (2008) Danesi et al (2004) e
Rangel-Yagui et al (2004) observaram que os valores de Xm e YXN aumentam com
128
o aumento da intensidade luminosa fornecida ao cultivo Maiores energias
fornecidas pelas mais altas luminosidades empregadas nos cultivos permitem as
ceacutelulas de consumirem o nitrogecircnio disponiacutevel levando a maiores valores de Xm e
YXN Isso ocorreu porque a mesma quantidade de nitrogecircnio foi adicionada nos
ensaios com diferentes intensidades luminosas logo o YXN foi uma funccedilatildeo de Xm
Por outro lado no presente trabalho os valores meacutedios YXN natildeo diferiram
estatisticamente com o aumento da intensidade luminosa porque a quantidade total
de nitrogecircnio adicionada variou nos cultivos com as diferentes intensidades
luminosas isto eacute quanto maior a intensidade luminosa maior foi a quantidade de
nitrogecircnio adicionada e consequentemente maior concentraccedilatildeo celular Por isso o
YXN natildeo diferiram nas diferentes intensidades luminosas estudadas (Tabela 26)
Tabela 33 - Meacutedias dos fatores de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas para a
variaacutevel independente intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(mol de foacutetons m-2 s-1)
YXN (mgmg-1)
60 922 plusmn 034ordf
120 902 plusmn 034a
240 935 plusmn 034a
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
Os maiores valores do fator de conversatildeo encontrado nesse trabalho (1327 plusmn
028 mg mg-1) foi maior do que 739 g g-1 (CARVALHO et al 2004) 85 g g-1
(RANGEL-YAGUI et al 2004a) utilizando ureacuteia e 57 plusmn 017 g g-1 utilizando cloreto de
amocircnio como fonte de nitrogecircnio nos cultivos de S platensis em minitaques
(BEZERRA et al 2008) Isso porque no presente trabalho a S platensis foi
cultivada em fotobiorreator tubular fechado o que proporciona menor volatilizaccedilatildeo
da amocircnia e melhor eacute o seu aproveitamento pelas ceacutelulas ocasionando maiores
valores de YXN
129
64 Avaliaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de clorofila a
No final de cada experimento foi realizada a determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de
clorofila a na concentraccedilatildeo celular final e os resultados estatildeo descritos na Tabela
34
Tabela 34 ndash Concentraccedilotildees de clorofila na biomassa final
Experimento Fonte de CO2 Intensidade luminosaa
Fonte de nitrogecircnio
Concentraccedilatildeo de clorofila (mg cl g cel -1)
1 Cilindro 60 NaNO3 521plusmn028
2 Cilindro 60 Ureacuteia 415plusmn020
3 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 60 NaNO3 392plusmn008
4 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 60 Ureacuteia 326plusmn030
5 Cilindro 120 NaNO3 344plusmn010
6 Cilindro 120 Ureacuteia 296plusmn009
7 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 120 NaNO3 294plusmn040
8 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 120 Ureacuteia 210plusmn023
9 Cilindro 240 NaNO3 175plusmn037
10 Cilindro 240 Ureacuteia 181plusmn 015
11 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 240 NaNO3 294plusmn035
12 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 240 Ureacuteia 210plusmn023
a mol de foacutetons m-2 s-1
Dentre os metaboacutelitos microalgais a clorofila foi muito pouco investigada Satildeo
os uacutenicos pigmentos naturais de coloraccedilatildeo verde em abundacircncia mas sua
instabilidade ao isolamento tem restringindo a sua utilizaccedilatildeo como corante natural na
induacutestria de alimentos As clorofilas utilizadas como corantes alimentares provecircm
principalmente de plantas terrestres (HENDRY 1996)
Microalgas fotossinteacuteticas satildeo organismos que capturam energia luminosa
eficiententemente O pigmento fotossinteacutetico clorofila a eacute o principal componente
130
fotoquiacutemico ativo na qual funciona como um receptor de luz para direcionar a
fotossiacutentese O conteuacutedo deste pigmento em microalga eacute portanto relatado para
atividade fotossinteacutetica (MACINTYRE et al 2002) A intensidade de luz captada
pelos pigmentos influencia na produccedilatildeo da biomassa e no acuacutemulo de produtos
alvos na microalga cultivada sob diferentes condiccedilotildees
As clorofilas satildeo pigmentos verdes de alto valor comercial encontradas em
plantas microalgas e cianobacteacuterias como A platensis A concentraccedilatildeo desse
pigmento nas ceacutelulas depende das condiccedilotildees ambientais Devido a sua cor e as
propriedades fiacutesico-quiacutemicas satildeo utilizadas como corantes naturais em produtos
alimentiacutecios
Na Tabela 35 observa-se que ambas as variaacuteveis independentes avaliadas
nesse estudo fonte de nitrogecircnio e intensidade luminosa interferiram na
concentraccedilatildeo de clorofila a na biomassa final Isso foi confirmada pela anaacutelise
estatiacutestica ANOVA onde apresentou um valor de niacutevel descritivo de 0011 para a
variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio e de 0000 para a intensidade luminosa
Tabela 35 - Anaacutelise de variacircncia para a concentraccedilatildeo de clorofila na biomassa final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Meacutedia dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
03725 1 03725 101 0328
Fonte de Nitrogecircnio
29751 1 29751 804 0011
Intensidade luminosa
158306 2 79153 2139 0000
Resiacuteduos 70318 19 01272
Total 26210 23
Avaliando-se as meacutedias da concentraccedilatildeo de clorofila a nas diferentes fontes de
nitrogecircnio (Tabela 34) observa-se que nos cultivos utilizando nitrato obtiveram
maiores concentraccedilotildees de clorofila em relaccedilatildeo aos cultivos com ureacuteia nas
intensidades luminosas de 60 mol de foacutetons m-2 s-1 e 120 mol de foacutetons m-2 s-1
Essa diferenccedila na concentraccedilatildeo de clorofila pode ser explicada pelo fato dos cultivos
com nitrato a concentraccedilatildeo de nitrato no meio de cultura foi mantida sempre
superior a 1 g L-1 enquanto que nos cultivos com ureacuteia a concentraccedilatildeo de ureacuteia no
131
meio cultura foi abaixo de 10-4 M (item 62) Essa concentraccedilatildeo de ureacuteia apesar de
natildeo interferir na concentraccedilatildeo celular pode ter influenciado na concentraccedilatildeo de
clorofila nas ceacutelulas Resultados similares foram observados por Danesi et al (2004)
e Rangel-Yagui et al (2004) em cultivos de S platensis em minitanques
substituindo a fonte de nitrogecircnio KNO3 por ureacuteia
O efeito da limitaccedilatildeo de nitrogecircnio e ferro comprometeu a capacidade
fotossinteacutetica reduziu o conteuacutedo de clorofila celular e diminuiu o rendimento
quacircntico do fotossintema II (YOUNG BEARDALL 2005) Muggli e Harrison (1996)
observaram que a concentraccedilatildeo de clorofila nas ceacutelulas de Emiliania huxleyi
cultivadas com nitrato foi estatisticamente maior que nas celulas cultivadas com
amocircnia sob condiccedilotildees limitadas de ferro e intensidade luminosa abaixo da
saturaccedilatildeo Por outro lado nos cultivos natildeo limitados com ferro as concentraccedilotildees de
clorofilas foram estatisticamente iguais Sob duas diferentes intensidades luminosas
abaixo da regiatildeo de saturaccedilatildeo (45 e 70 mol de foacutetons m-2 s-1) as ceacutelulas cultivadas
em nitrato mantiveram uma maior taxa de clorofila por volume de ceacutelulas que nas
ceacutelulas cultivadas com amocircnio similar ao que aconteceu nas condiccedilotildees limitadas
por ferro
A intensidade luminosa eacute uma importante variaacutevel que interfere na
concentraccedilatildeo de clorofila Como podemos observar na Tabela 34 maiores
concentraccedilotildees de clorofilas meacutedias independente da fonte de nitrogecircnio e de CO2
satildeo encontradas nas menores intensidades luminosas De um modo geral o
aumento da concentraccedilatildeo de clorofila com a reduccedilatildeo da luminosidade aumenta a
capacidade de absorccedilatildeo de luz pois a clorofila eacute quem efetivamente atua nas
reaccedilotildees fotoquiacutemicas da fotossiacutentese e representa um mecanismo de adaptaccedilatildeo agrave
condiccedilatildeo de menor intensidade luminosa A reduccedilatildeo do conteuacutedo de pigmentos a
altas irradiacircncias permite as algas reduzirem a taxa de fornecimento de energia pela
absorccedilatildeo da luz nas ceacutelulas com a finalidade de balancear a energia absorvida e a
energia necessaacuteria para a fixaccedilatildeo do carbono e crescimento celular (GEIDER et al
1997) Geralmente a clorofila e as ficobiliproteiacutenas tendem a aumentar sua
concentraccedilatildeo com a reduccedilatildeo da intensidade luminosa (TOMASELLI et al 1997)
Nas menores intensidades luminosas onde a competiccedilatildeo pelo poder redutor eacute
maior observa-se que as ceacutelulas cultivadas em nitrato mantem maior niacuteveis de
clorofila que nas ceacutelulas cultivadas em amocircnia Portanto as ceacutelulas cultivadas em
nitrato precisam mais do poder redutor para transportar e utilizar sua fonte de
132
nitrogecircnio eles podem requerer mais clorofila que as ceacutelulas cultivadas em amocircnio
para suprir tais necessidades Por outro lado altas intensidades luminosas alteram o
complexo proteacuteico contendo pigmentos captadores de luz como observado por
Smith et al (1990) em ceacutelulas de Dunaliella salina Telfar et al (1990) mostrou que
iluminaccedilatildeo prolongada causa destruiccedilatildeo dos pigmentos da clorofila e conduz a
inibiccedilatildeo fotoquiacutemica do FSII
Cultivos de Spirulina subsalsa exposto agrave alta intensidade luminosa (100 mol
de foacutetons m-2 s-1) mostrou uma reduccedilatildeo no conteuacutedo de pigmentos nas ceacutelulas O
conteuacutedo de carotenoacuteide e clorofila a reduziu com o aumento da intensidade
luminosa de 25 mol de foacutetons m-2 s-1 para 100 mol de foacutetons m-2 s-1 O conteuacutedo
de ficobilissomos obteve uma maior reduccedilatildeo quando comparados com o conteuacutedo
de clorofila a (aproximadamente 70 e 57 respectivamente) Devido a uma
reduccedilatildeo nos carotenoacuteides zeaxantina foi o carotenoacuteide predominante a maior
intensidade luminosa (TOMASELLI et al 1995) Um aumento da intensidade
luminosa de 2 klux (24 mol de foacutetons m-2 s-1 ) para 5 klux (60 mol de foacutetons m-2 s-
1) houve uma reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de clorofila de 14 plusmn 18 mg cl g cel -1 para
80 plusmn 18 mg cl g cel -1 nos cultivos com KNO3 e 142 plusmn 08 mg cl g cel -1 para 72 plusmn
14 mg cl g cel -1 para os cultivos com ureacuteia respectivamente (DANESI et al 2004)
Pode-se observar que a concentraccedilatildeo de clorofila nos cultivos a 5 klux (60 mol de
foacutetons m-2 s-1) foram proacuteximas as concentraccedilotildees obtidas no presente trabalho nos
cultivos a 60 mol de foacutetons m-2 s-1 (NaNO3 = 521 plusmn 03 mg cl g cel -1 Ureacuteia = 415
plusmn 02 mg cl g cel -1 Tabela 34) Essa diferenccedila pode ser devido ao aumento do
efeito sombreamento ser maior em minitanques quando comparada aos
fotobiorreatores tubulares o que favorece a um aumento da concentraccedilatildeo de
clorofila nos cultivos em minitanques Soundarapandian e Vasanthi (2008)
observaram um maior teor de clorofila em diferentes cepas de S platensis cultivadas
a 3 klux (36 mol de foacutetons m-2 s-1) intensidade luminosa com ciclos alternados de 16
horas no claro e 8 horas no escuro
Dados na literatura mostram que na biomassa de A platensis possuem 1 de
clorofila (VONSHAK 1997 COGNO et al 2003) No entanto no presente trabalho a
maior concentraccedilatildeo de clorofila foi de 05 correspondendo ao experimento 1 (60
mol de foacutetons m-2 s-1 NaNO3 Tabela 13) Esse baixo valor de concentraccedilatildeo de
clorofila em relaccedilatildeo aos valores citados na literatura eacute devido agraves altas intensidades
luminosas utilizadas no neste trabalho Soundarapandian e Vasanthi (2008)
133
relataram que a concentraccedilatildeo de clorofila nas S platensis cultivadas a 3 klux pode
variar de 085 (8526 μg mg cel-1) a 097 (9723 μg mg cel-1) dependendo da
cepa utilizada Jimenez et al (2003) em cultivos de S platensis em minitanques
utilizando a energia solar no sul da Espanha obtiveram uma concentraccedilatildeo de
clorofila de 79 g kgminus1 (079)
Carlozzi e Pinzani (2005) observaram uma concentraccedilatildeo maacutexima de clorofila
de 2 em cultivos outdoor de S platensis em fotobiorreator espiralado fechado
Esta concentraccedilatildeo permaneceu constante do 6deg ao 10deg dia de cultivo Tomaselli et
al (1997) tambeacutem observaram um aumento na concentraccedilatildeo de clorofila de 151 μg
mg cel-1 para 263 μg mg cel-1 nos cultivos de A maacutexima em reator de vidro
retangular a intensidade luminosa de 144 mol de foacutetons m-2 s-1 e 25 mol de foacutetons
m-2 s-1 respectivamente Tredici e Zittelli (1998) em cultivos continuos ldquooutdoorsrdquo de
A platensis em fotobiorreator tubular e plano obtiveram a concentraccedilatildeo de clorofila
de 155plusmn002 e 163 plusmn002 na massa seca no iniacutecio do periacuteodo luminoso
De fato a concentraccedilatildeo de clorofila depende das condiccedilotildees ambientais
principalmente da intensidade luminosa No presente estudo nos cultivos
submetidos agrave alta intensidade luminosa favoreceram a uma reduccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de clorofila principalmente nos cultivos a 240 mol de foacutetons m-2 s-1
Do mesmo modo Nakajima e Ueda (1997) observaram um aumento no crescimento
celular de Chlorella pyrenoidosa e uma reduccedilatildeo no conteuacutedo de pigmentos
captadores de luz nas ceacutelulas cultivadas a altas intensidades luminosas (50 μmol de
foacutetons m-2 s-1) Na presenccedila de excesso de luz o oxigecircnio produzido durante a
fotossiacutentese reage com a clorofila excitada originando um oxigecircnio singlete que eacute
muito mais reativo podendo oxidar as clorofilas e ocasionando consequentemente o
fenocircmeno denominado de branqueamento (MARIQUE 2003) As clorofilas tendem a
ser foto-oxidadas a alta irradiaccedilatildeo e devido aos carotenoacuteides poderem prevenir a
foto-oxidaccedilatildeo das clorofilas a relaccedilatildeo entre as clorofilas e carotenoacuteides pode ser
usada como um indicador potencial de perdas foto-oxidativas causadas por fortes
irradiaccedilotildees (HENDRY amp PRICE 1993)
134
65 Avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal
Micro-organismos fotossintetizantes usam fonte de carbono inorgacircnico energia
luminosa e nitrogecircnio para sintetizar compostos orgacircnicos como proteiacutenas
carboidratos vitaminas lipiacutedios pigmentos entre outros Com isso a composiccedilatildeo
centesimal da biomassa pode variar com as condiccedilotildees ambientais (RAFIQUL et al
2005 MOHANTY et al 1997)
Na Tabela 36 estatildeo apresentados os teores de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos
e cinzas das biomassas secas obtidas no final dos experimentos
Tabela 36 - Porcentagem de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos e cinzas na biomassa
seca final
Experimento Intensidade
luminosa (I)
Fonte de CO2
Fonte de nitrogecircnio
Proteiacutenas totais ()
Lipiacutedios totais ()
Cinzas ()
Carboidratos totais ()
1 60 Cilindro NaNO3 319plusmn01 863plusmn03 442plusmn001 5226plusmn358
2 60 Cilindro Ureacuteia 233plusmn07 660plusmn09 442plusmn004 6471plusmn064
3 60 Alcooacutelica NaNO3 324plusmn07 101plusmn08 583plusmn002 5222plusmn341
4 60 Alcooacutelica Ureacuteia 427plusmn23 112plusmn14 508plusmn091 6492plusmn336
5 120 Cilindro NaNO3 281plusmn04 121plusmn06 476plusmn002 5500plusmn-016
6 120 Cilindro Ureacuteia 299plusmn06 730plusmn07 482plusmn018 5794plusmn005
7 120 Alcooacutelica NaNO3 315plusmn18 862plusmn06 497plusmn018 5576plusmn341
8 120 Alcooacutelica Ureacuteia 404plusmn07 953plusmn07 394plusmn063 4642plusmn091
9 240 Cilindro NaNO3 213plusmn01 142plusmn23 428plusmn004 6004plusmn243
10 240 Cilindro Ureacuteia 319plusmn09 129plusmn05 540plusmn050 5079plusmn147
11 240 Alcooacutelica NaNO3 278plusmn04 144plusmn29 579plusmn048 5222plusmn341
12 240 Alcooacutelica Ureacuteia 210plusmn03 117plusmn28 449plusmn004 6492plusmn336
I = Intensidade luminosa (mol de foacutetons m-2 s-1)
A Fotossiacutentese eacute o processo pelo qual a energia luminosa eacute convertida em
energia quiacutemica pelas plantas bacteacuterias fotossinteacuteticas e cianobacteacuterias A energia
luminosa eacute capturada pelos pigmentos fotossinteacuteticos como clorofila carotenoacuteides e
ficocianina na qual satildeo complexados com proteiacutenas que satildeo partes do fotossistema I
e II em cianobacteacuterias O sistema fotossinteacutetico eacute fortemente conectado com outras
135
vias metaboacutelicas como biossiacutentese de proteiacutenas e lipiacutedios nas quais satildeo
necessaacuterias para o crescimento celular (MOHANTY et al 1997)
Os teores de proteiacutena variaram de 21 a 42 Esses valores estatildeo proacuteximos
aos valores encontrados por Cantildeizares-Villanueva et al (1994) cultivando S maxima
em meio de cultura constituiacutedo por resiacuteduo da criaccedilatildeo de porcos (diluiacutedo a 50 em
aacutegua) Embora o teor de proteiacutena seja baixo (36) a biomassa ainda eacute apropriada
para o uso como suplemento aliementar para animais Jimeacutenez et al (2003) tambeacutem
encontraram um baixo teor de proteiacutena de 47 do peso seco em meacutedia na
produccedilatildeo industiral da Spirulina em Malaga no sul da Espanha
A biossiacutentese de proteiacutena depende principalmente da disponibilidade de
nitrogecircnio de carbono para formaccedilatildeo do esqueleto carbocircnico e da intensidade
luminosa na qual fornece energia para fixaccedilatildeo do CO2 Nos cultivos utilizando
nitrato bem como nos cultivos utilizando ureacuteia natildeo houve limitaccedilatildeo do crescimento
pela fonte de nitrogecircnio (Item 611) A fonte de carbono tambeacutem natildeo foi limitada
uma vez que o pH foi mantido durante todo o tempo de cultivo com a adiccedilatildeo de CO2
As intensidades luminosas foram altas pertencendo agrave regiatildeo de saturaccedilatildeo luminosa
(Item 611) Logo mesmo dispondo de nitrogecircnio carbono e energia as ceacutelulas natildeo
converteram o nitrogecircnio disponiacutevel em proteiacutenas SAKAMOTO e BRYAN (1999)
observaram que um aumento da intensidade luminosa de 250 mol de foacutetons m-2 s-1
para 1 mmol foacutetons m-2 s-1 no cultivo de Synechococcus sp PCC 6301 natildeo foi
observado um aumento na absorccedilatildeo de nitrato mostranto que a taxa do consumo
de nitrato foi saturado a intensidade luminosa de 250 mol de foacutetons m-2 s-1
Soundarapandian e Vasanthi (2008) observaram que o conteuacutedo de proteiacutena
nas S platensis cultivadas a 3 klux (36 mol de foacutetons m-2 s-1) com ciclos alternados
de 16 horas no claro e 8 horas no escuro pode variar de 5937 (5937μg mg-1 cel)
a 6421 (6421 μg mg-1 cel) dependendo da cepa utilizada Torzillo et al (1991)
observaram um aumento na siacutentese de carboidrato nas ceacutelulas de S platensis
cultivadas ldquooutdoorsrdquo a altas intensidades luminosas e temperatura de 25ordmC O
execesso do carboidrato sintetizado foi parcialmente utilizado a noite para a siacutentese
de proteiacutena Isso pode ter contribuiacutedo a um baixo teor de proteiacutena no presente
trabalho uma vez que os cultivos foram submetidos sempre a altas intensidades
luminosas natildeo obtendo ciclos claroescuro durante o cultivo
A anaacutelise de variacircncia (Tabela 37) indicou que a fonte de nitrogecircnio e de CO2
natildeo influenciaram na variaacutevel dependente teor de proteiacutena enquanto que a
136
intensidade luminosa influenciou como pode-se obversar na anaacutelise de diferenccedila
entre as meacutedias para essa variaacutevel (Tabela 38)
Tabela 37 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de proteiacutena na biomassa final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
5304 1 5304 235 0142
Fonte de Nitrogecircnio
1134 1 1134 050 0487
Intensidade luminosa
4341 2 2170 963 0001
Resiacuteduos 42833 19 2254
total 9268 23
Tabela 38 - Meacutedias do teor de proteiacutena na biomassa final para a variaacutevel
independente intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(mol foacutetons m-2 s-1)
Proteiacutena ()
60 358plusmn43ordf
120 326plusmn50ordf
240 256plusmn51b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
O modelo da biossiacutentese e metabolismo de lipiacutedios em cianobacteacuterias eou
algas satildeo afetados pelos fatores ambientais dentre esses as condiccedilotildees de
iluminaccedilatildeo (BABADZHANOV et al 2004 KHOTIMCHENKO e YAKOVLEVA 2005)
As ceacutelulas de Tichocarpus crinitus satildeo capazes de mudar o conteuacutedo de
armazenamento e estrutural de lipiacutedios e a composiccedilatildeo de aacutecidos graxos Altas
intensidades luminosas estimulam o acuacutemulo de lipiacutedios de armazenamento
(triacilgliceroacuteis) enquanto a baixas intensidades luminosas induzem a um aumento
nos lipiacutedios estruturais (glicolipiacutedios) Isto indica um alto grau de controle de
estrutura nas membranas das algas porque o grau de insaturaccedilatildeo dos aacutecidos
graxos tem sido considerado um dos fatores mais importantes no controle da fluidez
e funcionalidade da membrana celular Adicionalmente as diferenccedilas na
137
composiccedilatildeo dos lipiacutedios nas T crinitus cultivadas a altas e baixas irradiaccedilotildees solar
podem ser consideradas como uma resposta adaptativa das ceacutelulas algais para as
vaacuterias condiccedilotildees de crescimento Portanto a sobrevivecircncia das ceacutelulas nas
mudanccedilas ambientais pode ser atribuiacuteda agrave funcionalidade das membranas onde o
aparato fotossinteacutetico eacute formado (KHOTIMCHENKO e YAKOVLEVA 2005)
Nos cultivos com disponibilidade de nitrogecircnio carbono e altas intensidades
luminosas as ceacutelulas utilizam a energia e o carbono disponiacutevel para crescimento
manutenccedilatildeo celular e formaccedilatildeo de componentes orgacircnicos tais como proteiacutenas
lipiacutedios e carboidratos Como apresentados na Tabela 41 o teor de lipiacutedio aumenta
com a intensidade luminosa Esse efeito foi observado por Solovchenko et al
(2008) nos cultivos da microalga Parietochloris incisa Isto pode ser consequecircncia da
produccedilatildeo excessiva de aacutecidos graxos entre eles triacilgliceroacuteis provavelmente como
um modo de converter o excesso de luz em energia quiacutemica para evitar o dano
fotooxidativo (ASADA 1994 RABBANI et al 1998 MENDOZA et al 1999 NIYOGI
1999) Kaixian et al (1993) observaram um aumento no teor de lipiacutedios com o
aumento da intensidade luminosa nas ceacutelulas de Phaeodactylum tricornutum
Solovchenko et al (2008) relataram que os triacilgliceroacuteis acumuladas em algas
(Parietochloris incisa) sob condiccedilotildees de stress satildeo frequentemente depositadas em
gloacutebulos de lipiacutedios citoplasmaacutetico referidos como corpos oleosos na qual aumentam
em tamanho e nuacutemero sob deficiecircncia na nutriccedilatildeo mineral especialmente na falta de
nitrogecircnio e altas irradiacircncias
Como observado na Tabela 41 os cultivos a 240 mol de foacutetons m-2 s-1
obtiveram maiores teores de lipiacutedios Steiner et al (1970) observaram que as ceacutelulas
de Chromatium cultivadas a baixas intensidades luminosas (100 ftc = 01 klux = 12
mol de foacutetons m-2 s-1) obteve menor teor de fosfolipiacutedios em relaccedilatildeo aos cultivos a
altas intensidades luminosas (7500 ftc = 8 kux = 96mol de foacutetons m-2 s-1) 1 lux =
0929 foot-candles
Na Tabela 39 estatildeo apresentados os valores da anaacutelise de variacircncia dos teores
de lipiacutedios Como se pode observar apenas a intensidade luminosa influenciou nos
valores de lipiacutedios apresentando um valor de niacutevel descritivo menor que 5
Embora o niacutevel de significacircncia da variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio seja
menor que 5 a anaacutelise estatiacutestica diferenccedila entre as meacutedias mostraram essa
variaacutevel natildeo interfere no teor de lipiacutedio apresenta um valor de niacutevel descritivo maior
que 5 (Tabela 40)
138
Tabela 39 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de lipiacutedios na biomassa seca final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
143 1 143 059 0453
Fonte de Nitrogecircnio
1853 1 1853 762 0012
Intensidade luminosa
141 2 71 29 0000
Resiacuteduos 46 19 244
total 207 23
Tabela 40 - Meacutedias do teor de lipiacutedio na biomassa final para a variaacutevel independente
fonte de nitrogecircnio
Fonte de nitrogecircnio Lipiacutedios ()
Nitrato 109 plusmn 310ordf
Ureacuteia 918 plusmn 275a
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um
intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
Tabela 41 - Meacutedias do teor de lipiacutedio na biomassa final para a variaacutevel independente
intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(μmoles m-2 s-1)
Lipiacutedios ()
60 763 plusmn 11a
120 972 plusmn 19a
240 136 plusmn 21b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
A similaridade entre as fontes de nitrogecircnio (Tabela 40) podem ser explicadas
pelo fato de que nos cultivos com ureacuteia a quantidade de ureacuteia adicionada foi
calculada com base nos seus respectivos cultivos com nitrato nas quais foram
139
cultivos natildeo limitados por nitrogecircnio (concentraccedilatildeo de nitrogecircnio superior a 1 g L-1)
Logo isso favoreceu a semelhanccedila entre os teores de lipiacutedios nos cultivos a
diferentes fontes de nitrogecircnio
Os valores de lipiacutedios encontrados variaram de 66 plusmn 09 a 144 plusmn 29
dependendo das condiccedilotildees de cultivo Esses valores estatildeo de acordo com Cogno et
al (2003) e Vonshak (1997) na qual relataram que o conteuacutedo de lipiacutedios da A
platensis em condiccedilotildees fotoautotroacuteficas podem variar de 8 ndash 12 quando cultivadas
em meio sinteacutetico Tokusoglu e Uumlnal (2003) encontraram um teor de lipiacutedio meacutedio
entre trecircs diferentes cepas de Splatensis de 753 natildeo diferindo estatisticamente
entre si
O teor de lipiacutedio foi de 863 plusmn 03 com NaNO3 e 66 plusmn 09 com ureacuteia na
intensidade luminosa de 60 μmoles de foacutetons m-2 s-1 utilizando CO2 de cilindro
Esses valores foram proacuteximos aos teores de lipiacutedios encontrados por Rafiqul et al
(2005) cultivando S platensis (74) e para S fusiformis (82) a 25 klux (30 μmol
de foacutetons m-2 s-1) Oliveira et al (1999) observaram um teor de lipiacutedios de 696 plusmn
086 nas ceacutelulas de S platensis cultivadas em 4 l Virtis fermenter a 180 μmol de
foacutetons mndash2 sndash1
Olguiacuten et al (2001) observaram uma menor concentraccedilatildeo de lipiacutedios nos
cultivos a maior intensidade luminosa em cultivos de S platensis cultivada tanto em
meio sinteacutetico (meio Zarrouk) como em meio complexo (aacutegua do mar do Golf do
Meacutexico suplementado com 2 de efluente anaeroacutebico da criaccedilatildeo de porcos) A
concentraccedilatildeo de nitrogecircnio no meio complexo possui 10 vezes a menos que o meio
sinteacutetico (25 g L-1 NaNO3) O teor de lipiacutedio de 8 encontrado no meio de cultivo
com 25 g L-1 NaNO3 a 66 μmols de foacutetons m-2 s-1 foi proacuteximo ao encontrado no
presente trabalho 66 plusmn 09 no cultivo natildeo limitado por NaNO3 e 60 μmols de foacutetons
m-2 s-1
Nos cultivos a 60 mol de foacutetons m-2 s-1 mostrou maiores valores de lipiacutedios
quando cultivadas com CO2 proveniente de fermentaccedilatildeo alcooacutelica em relaccedilatildeo aos
cultivos utilizando CO2 de cilindro Sob condiccedilotildees autotroacuteficas a produtividade de
lipiacutedios foram menores quando comparadas com o crescimento heterotroacutefico em
culturas de Chlorella vulgareis (LIANG et al 2009) e crescimento heterotroacutefico e
mixotroacutefico nas ceacutelulas de Chlamydomonas reinhardtii (BOYLE MORGAN 2009)
O teor de carboidrato nas ceacutelulas A platensis natildeo diferiram estatisticamente
pela anaacutelise de variacircncia nas diferentes condiccedilotildees estudadas (Tabela 44) obtendo
140
um niacutevel de significacircncia de 0118 0974 e 0562 para as variaacuteveis independentes
fontes de CO2 fonte de nitrogecircnio e intensidades luminosas respectivamente O
teor de carboidrato encontrado variou de 38 a 51 valores considerados altos No
entanto esses valores foram proacuteximos aos valores obtidos por Cantildeizares-Villanueva
et al (1994) que observaram um teor de carboidrato de 42 e 44 em ceacutelulas de S
maxima cultivadas em meio sinteacutetico (Zarrouk) e meio constituiacutedo por resiacuteduo da
criaccedilatildeo de porcos (diluiacutedo a 50) respectivamente sob intensidade luminosa de 3
klux (36 μmol de foacutetons m-2 s-1) O teor de carboidrato neste trabalho foi um pouco
maior que o observado por Cantildeizares-Villanueva et al (1994) provavelmente devido
a diferenccedila de intensidade luminosa pois maiores teores de carboidratos satildeo
obtidos nos cultivos sob maior intensidade luminosa
Olguiacuten et al (2001) obtiveram um alto teor de polissacariacutedeos de 2841 nas
ceacutelulas de S platensis cultivadas em meio complexo quando exposta a intensidade
luminosa de 144 μmol de foacutetons mminus2 sminus1 Esse alto valor poderia ter sido devido a
dois fatores simultacircneos deficiecircncia de nitrogecircnio e alta intensidade luminosa
Desse modo no presente trabalho natildeo houve deficiecircncia de nitrogecircnio nos cultivos
no entanto a aacuterea iluminada no fotobioreator tubular usado no presente trabalho eacute
maior quando comparada com os cultivos em bench raceway utilizados por Olguiacuten et
al (2001) e esse aumento pode ter favorecido a obtenccedilatildeo dos altos teores de
carboidratos
Tomaselli et al (1997) observaram uma reduccedilatildeo no teor de carboidrato nas
ceacutelulas de A maacutexima de 282 mgg-1 (28) para 180 mgg-1 (18) quando a
intensidade luminosa reduziu de 144 μmol de foacutetons mminus2 sminus1 para 25 μmol de foacutetons
mminus2 sminus1 A capacidade dos microganismos fototroacuteficos em estocar na forma de
carboidratos o excesso do carbono fixado durante a aclimataccedilatildeo a altas intensidades
luminosas e mobilizar esse esqueleto carbocircnico para a siacutentese de proteiacutena
representa um requisito importante para a sobrevivecircncia
141
Tabela 42 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de carboidratos na biomassa seca final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
107 1 107 268 0118
Fonte de Nitrogecircnio
004 1 004 000 0974
Intensiade luminosa
48 2 24 059 0562
Resiacuteduos 763 19 40
total 918 23
A partir dos estudos relatados previamente na literatura mostram que o teor de
carboidrato eacute 12 a 16 nas ceacutelulas de Arthrospira platensis cultivadas em meio
sinteacutetico e em condiccedilotildees fotoautotroacuteficas sem condiccedilotildees de stress como alta
salinidade alta intensidade luminosa deficiecircncia em nitrogecircnio (COGNO et al
2003 VONSHAK 1997) Carlozzi e Pinzani (2005) relataram que as ceacutelulas de
Artrospira platensis foram estimuladas para sintetizar carboidratos durante o dia e
estes foram consumidos para permitir a siacutentese de proteiacutenas durante a noite De
acordo com Ma et al (1997) uma menor taxa na siacutentese de proteiacutena eacute observado a
altas irradiaccedilotildees comparando com a siacutentese de carboidrato Isto pode conduzir a
um acuacutemulo de carboidrato nas ceacutelulas sem um concomitante aumento na siacutentese
de proteiacutena Tem sido sugerido que o carbono a partir dos poliacutemeros de carboidratos
estocados pode ser transferido para formaccedilatildeo de proteiacutenas durante a noite (Ma et
al 1997) No entanto como no presente trabalho natildeo houve fotoperiacuteodo de fase
claroescuro propiciou a um acuacutemulo de carboidrato nas ceacutelulas e a reduziu a
concentraccedilatildeo de proteiacutenas Adicionalmente Torzillo et al (1991) relataram que as
ceacutelulas de Spirulina expostas a altas irradiacircncais direcionam a biomassa a sintetizar
carboidratos na qual pode ser usado como um reservatoacuterio do poder redutor e a
uma reduccedilatildeo na siacutentese de proteiacutenas
Como podemos observar na anaacutelise de variacircncia (Tabela 43) o teor de cinzas
natildeo foi influenciado pelas variaacuteveis estudadas atingindo valores que variaram de
428 plusmn 004 a 583 plusmn 002 Esses valores estatildeo de acordo com os valores obtidos
por Miao (2005) que obtiveram um teor de cinzas de 636 plusmn 005 em cultivos
autotroacuteficos e 593 plusmn 004 em cultivos heterotroacuteficos de Chlorella protothecoides
Similarmente Tokusoglu e Uumlnal (2003) observaram um conteuacutedo de cinzas em trecircs
142
diferentes cepas de Spirulina denominada de 1 2 e 3 foram de 743 751 and
1038 respectivamente A microalga marinha Isochrisis obteve o maior conteuacutedo
de cinzas (1608)
Tabela 43 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de cinzas na biomassa seca final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
068 1 069 18 0192
Fonte de Nitrogecircnio
058 1 058 152 0232
Intensiade luminosa
112 2 056 147 0255
Resiacuteduos 723 19 038
total 962 23
Jimeacutenez et al (2003) encontraram um alto teor de cinzas no cultivo de S
platensis aproximadamente 20 (valores tiacutepicos satildeo de 5ndash7) esse alto valor pode
ser explicado pelo fato de que a alga obtida a partir do filtro foi introduzida
diretamente spray drier sem passar pelo processo de lavagem Como o meio de
crescimento eacute altamente enriquecido com bicarbonato a lavagem eacute necessaacuteria para
eliminaacute-los Esse processo normalmente reduz o conteuacutedo de cinzas
No presente trabalho a composiccedilatildeo do meio de cultura foi mantido em todas as
condiccedilotildees experimentais com modificaccedilatildeo apenas da fonte de nitrogecircnio de nitrato
de soacutedio para ureacuteia em alguns experimentos Adicionalmente a biomassa passou
por um processo de lavagem antes da etapa de secagem que removeu os sais
adsorvidos nas ceacutelulas Portanto isso favoreceu a manutenccedilatildeo no teor de cinzas na
biomassa seca Canizares et al (2004) obtiveram elevados teores de cinzas (14)
na biomassa de Spirulina maacutexima utilizando 50 de efluente suiacuteno no meio de
cultura Isso foi atribuiacutedo ao elevado quantidade de partiacuteculas minerais presente no
meio
143
66 Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros bioenergeacuteticos
Foram avaliados os paracircmetros bioenergeacuteticos da A platensis durante os
cultivos avaliando os andamentos em funccedilatildeo do tempo dos paracircmetros energia de
Gibbs dissipada para o crescimento e manutenccedilatildeo celular (1YGX) das produccedilotildees
molares de O2 consumo de H+ e nuacutemero de foacutetons para sustentar o crescimento
fotoautotroacutefico Foi avaliada a eficiecircncia da fotossiacutentese em A platensis calculando-
se a energia molar de Gibbs absorvida da luz para produzir um C-mol de biomassa
a partir do correspondente nuacutemero de Einsteins absorvidos e da energia meacutedia
molar dos foacutetons
A energia de Gibbs dissipada por unidade da biomassa (1YGX kJ por C-mol X)
foi calculada pela Equaccedilatildeo 6 como descrita no item 45 A equaccedilatildeo mostra que na
dissipaccedilatildeo da energia de Gibbs estatildeo inclusos tanto a manutenccedilatildeo como o
crescimento celular A energia de Gibbs eacute utilizada tambeacutem para a manutenccedilatildeo das
funccedilotildees celulares como reposiccedilatildeo dos gradientes que faltam degradaccedilatildeo proteiacutenas
Esta energia de Gibbs eacute produzida pelo catabolismo de certas quantidades de
doadores de eleacutetrons (substratos)
No Graacutefico 26 ilustra o comportamento da dissipaccedilatildeo da energia de Gibbs para
o crescimento e manutenccedilatildeo celular 1YGX em relaccedilatildeo ao tempo Como regra geral
esse paracircmetro bioenergeacutetico aumentou com o tempo em todas as condiccedilotildees
testadas como resultado do crescente niacutevel de biomassa que foi responsaacutevel por
diminuir a velocidade especiacutefica de crescimento Um aumento na intensidade
luminosa ateacute 120 mol de foacutetons m-2 s-1 favoreceu o crescimento de ceacutelulas por
causa de fotolimitaccedilatildeo com isso as exigecircncias de energia aumentaram
notavelmente no periacuteodo de tempo mais curto Por outro lado nenhum (ureacuteia) ou
muito pouco (nitrato) aumento de 1YGX foram observados na faixa da intensidade
luminosa de 120-240 mol de foacutetons m-2 s-1 por causa da obtenccedilatildeo das condiccedilotildees
de saturaccedilatildeo de luz Esse comportamento tambeacutem eacute consistente com os menores
valores de 1YGX previamente observados em tanques abertos (TORRE et al 2003)
o que permitiu um menor crescimento devido ao efeito de sombreamento (DANESI
et al 2004)
144
Graacutefico 26 Energia de Gibbs de dissipaccedilatildeo durante o cultivo de A platensis
intensidade luminosa (μmol m-2 s-1) () 60 ( ) 120 () 240 Fonte de
nitrogecircnio nitrato (siacutembolo aberto) ureacuteia (siacutembolo fechado)
Com os dados da composiccedilatildeo elementar da biomassa seca obtida no final de
cada experimento foram calculados os coeficientes atocircmicos para os elementos C
N H O S principais elementos que constituem a composiccedilatildeo elementar da
biomassa Determinado o coeficiente atocircmico dos elementos C H O N S (descrito
no item 4653) e conhecendo-se os graus de reduccedilatildeo desses elementos (C = 4 H
=1 O = -2 S = 6 N-NH4+ = -3 ou N-NO3
- = 5) de acordo com os iacuteons nas quais satildeo
inseridos na biomassa (HCO3- H2O H+ O2 NH4
+ e SO4-2) foi possiacutevel calcular o
grau de reduccedilatildeo da biomassa (descrito no item 4654 Tabela 44) bem como os
coeficientes estequiomeacutetricos para balanccedilos de carbono nitrogecircnio oxigecircnio
enxofre carga iocircnica e poder de reduccedilatildeo para a produccedilatildeo fotoautotroacutefica de 1 mol
de carbono (C-mol) de biomassa seca usando NaNO3 e ureacuteia como fonte de
nitrogecircnio de acordo com Heijnen (2001) em cada condiccedilatildeo estudada de acordo
com a aplicaccedilatildeo do princiacutepio de conservaccedilatildeo
O crescimento autotroacutefico pode ser representado por uma equaccedilatildeo de
balanccedilo de massa global onde as fontes de nitrogecircnio (NO3- ou NH4
+) e carbono
(HCO3-) H2O e H+ estatildeo envolvidas para a formaccedilatildeo de 1 C-mol de biomassa
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
0 2 4 6 8 10 12
1Y
GX (
kJ
C-m
ol
DM
-1)
Tempo (dias)
145
a HCO3- + b NO3
- (or NH4+) + c H2O + d O2 + e H+ + f SO4
-2 +
CH1650O0531N0170S00007 = 0 (11)
Para esse propoacutesito foi usada a composiccedilatildeo elementar descrita por Cornet et
al (1992) (Equaccedilatildeo 11) ou a composiccedilatildeo elementar determinada
experimentalmente como descrita no item Materiais e meacutetodos
Os coeficientes estequiomeacutetricos foram estimados atraveacutes dos balanccedilos de
materiais de carbono nitrogecircnio oxigecircnio enxofre carga e grau de reduccedilatildeo da
biomassa usados para a formaccedilatildeo da biomassa Os principais iacuteons envolvidos na
formaccedilatildeo da biomassa e seus respectivos coeficientes estequiomeacutetricos estatildeo
descritos na Tabela 44
Como pode ser observado o grau de reduccedilatildeo da biomassa (γX) calculado no
modelo da composiccedilatildeo da biomassa determinado experimentalmente neste trabalho foi
sempre um pouco maior com o nitrato (489 ndash 519) do que com ureacuteia (399 ndash 432)
como esperado pelo maior nuacutemero de oxidaccedilatildeo do nitrato (HEIJNEN 2001)
Tabela 44 - Coeficientes estequiomeacutetricos estimados atraveacutes dos balanccedilos de materiais de
carbono nitrogecircnio oxigecircnio enxofre carga e grau de reduccedilatildeo da biomassa cultivada em
fotobiorreator tubular horizontal utilizando nitrato ou ureacuteia como fontes de nitrogecircnio
HCO3- NO3
- NH4+ H2O O2 H+ SO4
-2 Biomassa
Δgf‟i
(kJ mol-1) -5872 -1114 -794 -2373 0 -399 -7446 -670
Coeficiente estequiomeacutetrico (mol C-molDM-1)
testes Ia a b b C d e f γX b
1 c 60 -1 -020 - 020 145 -120 - 58
1 d 60 -1 -011 - 032 130 -111 000 519
2 d 60 -1 - -007 024 100 -093 000 399
3 d 120 -1 -011 - 023 122 -111 000 489
4 d 120 -1 - -008 042 103 -092 000 411
5 d 240 -1 -010 - 023 127 -110 000 509
6 d 240 -1 - -008 034 108 -092 000 432 a Intensidade luminosa (μmol m
-2 s
-1)
b Grau de reduccedilao da biomassa
c Composiccedilatildeo elementar da biomassa descrita por Cornet et al (1992)
d Composiccedilatildeo elementar da biomassa determinada experimentalmente
146
Estimando os coeficientes estequiomeacutetricos da reaccedilatildeo 11 e conhecendo a
energia de Gibbs de formaccedilatildeo de produtos e reagentes (Tabela 44) (HEIJNEN
2001) eacute possiacutevel calcular o numero de moles de foacutetons (Einsteins) para sustentar o
crescimento autotroacutefico de 1 C-mol de biomassa (nPh) pela Equaccedilatildeo 8 (item 45)
Embora os valores reais de Δgfi deveriam ter sido utilizados para este caacutelculo
foram utilizados os valores das condiccedilotildees bioloacutegicas padratildeo Torre et al (2003)
demostraram que as diferenccedilas entre a energia de Gibbs de formaccedilatildeo nas
condiccedilotildees reais de cultivo natildeo diferem entre si ou diferem natildeo mais que 3 apartir
de seus respectivos valores estimados com base nas condiccedilotildees bioloacutegicas padratildeo
(T = 2984K C = 10M pH = 70) Por isso foram utilizados os valores de energia de
Gibbs nas condiccedilotildees bioloacutegicas padratildeo
No entanto para o iacuteon H+ a energia de Gibbs de formaccedilatildeo (ΔgfH+) eacute por
definiccedilatildeo uma funccedilatildeo da cultura do pH Assim esse paracircmetro foi recalculado para
as condiccedilotildees reais da equaccedilatildeo de Gibbs
7
pH
ff10
10ln
HH
RTgg (Equaccedilatildeo 12)
Durante as reaccedilotildees luminosas da fotossiacutentese a energia livre carregada
pelos foacutetons eacute capturada por pigmentos (por exemplo a clorofila) organizadas em
grandes complexos de proteiacutenas chamado de centros de reaccedilatildeo A energia de um
foacuteton provoca excitaccedilatildeo eletrocircnica elevando um eleacutetron para um niacutevel maior de
energia exatamente igual agrave energia do foacuteton (hν) Satildeo exigidos um miacutenio de 8 foacutetons
para transferir 4 eleacutetrons de 2 moleacuteculas de H2O para reduzir a 2 moleacuteculas de
NADPH2 de acordo com a equaccedilatildeo
2 H2O + 8 hν +2 NADP+ rarr 2 NADPH + O2 + 2H+ (Reaccedilatildeo 12)
Subsequentemente os eleacutetrons satildeo transferidos do NADPH para o CO2
atraveacutes do ciclo de Calvin para produzir os constituintes da biomassa (RAVEN et al
2000)
Como mostrado na Graacutefico 27 a diminuiccedilatildeo progressiva da velocidade
especiacutefica de crescimento () ao longo do cultivo provocou um aumento (em valor
absoluto) no nuacutemero de Einsteins absorvido para produzir 1 C-mol de biomassa
147
(nPh) Nos maiores valores de quase atingiu o valor teoacuterico de nPh relatado por
Richmond (1983) para sustentar o crescimento sob condiccedilotildees ideais que eacute de 8
Einsteins por C-mol de biomassa
Como jaacute foi observado em trabalho anterior (TORRE et al 2003) a exigecircncia
de energia adicional em relaccedilatildeo agrave situaccedilatildeo ideal de 8 Einsteins C-mol DM-1 foi
insignificante no iniacutecio dos cultivos (alta velocidade especiacutefica de crescimento) e em
seguida aumentou consideravelmente durante a fase estacionaacuteria de cada
experimento sugerindo que em condiccedilotildees provavelmente limitada pelo
sombreamento a biomassa usa a energia preferencialmente para a manutenccedilatildeo
do que para o crescimento Em condiccedilotildees de limitaccedilatildeo de luz (no iniacutecio) ou de
sombreamento (na fase estacionaacuteria) um aumento progressivo da intensidade de
luz natildeo excedeu qualquer influecircncia significativa sobre este paracircmetro
Graacutefico 27 Influecircncia da velocidade especiacutefica de crescimento da A platensis sobre
o nuacutemero de moles de foacutetons absorvido para produzir 1 C-mol de biomassa em
diferentes condiccedilotildees de cultivo () Composiccedilatildeo elementar da biomass descrita por
Cornet et al (1992) PPFD = 60 μmol de foacutetons m-2 s-1 Composiccedilatildeo elementar da
biomass determinada experimentalmente PPFD (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60
() 120 () 240 Fonte de nitrogecircnio nitrato (siacutembolos abertos) ureacuteia
(siacutembolos fechados)
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
000 010 020 030 040 050 060 070 080
nP
h (
Ein
stei
n C
-mol
DM
-1)
(dias -1)
148
Como mostrado no Graacutefico 27 as culturas com nitrato necessitam de maiores
valores de nPh para sustentar o crescimento autotroacutefico em relaccedilatildeo agraves culturas
utilizando ureacuteia Como as concentraccedilotildees celulares dos cultivos utilizando nitrato ou
ureacuteia foram semelhante em todas as intensidades luminosas (Item 61) a exigecircncia
adicional foacuteton nos cultivos com nitrato foi provavelmente utilizado para reduzir o
nitrato a amocircnio (HATORI MYERS 1966) que eacute a forma preferencial de nitrogecircnio
assimilado pela A platensis (BOUSSIBA et al 1984) Este efeito tambeacutem foi
observada por Torre et al (2003) em tanques abertos
Finalmente pode ser observado na mesma figura que o uso do modelo
bioenergeacutetico acima com os coeficientes relatados por Cornet et al (1992) para a
composiccedilatildeo da biomassa de A platensis (CHNOS) levou a resultados praticamente
coincidentes com aqueles obtidos utilizando as experimentais determinadas neste
trabalho Essa constataccedilatildeo demonstra que a composiccedilatildeo da biomassa tem um
impacto pouco significativo sobre os resultados de tal modelo bioenergeacutetico logo
poderia simplesmente ser usado como um instrumento geral assumindo os dados da
literatura sem a necessidade de qualquer determinaccedilatildeo da biomassa
No Graacutefico 28 mostra os comportamentos da produccedilatildeo molar de O2 e do
consumo de H+ durante os cultivos nas diferentes intensidades luminosas Essas
tendecircncias demonstram que as diferentes atividades de consumo e produccedilatildeo
seguem fielmente o crescimento celular O aumento progressivo desses paracircmetros
com a intensidade luminosa confirma que esta foi o fator limitante ao crescimento
nunca atingindo as condiccedilotildees de inibiccedilatildeo da luz Como esperado este
comportamento foi qualitativamente semelhante nas culturas utilizando nitrato como
fonte de nitrogecircnio
149
Graacutefico 28 Produccedilatildeo molar de O2 (siacutembolo fechado) e consumo de H+ (siacutembolo
aberto) em funccedilatildeo do tempo em diferentes condiccedilotildees de cultivo Intensidades
luminosas (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 () 120 () 240 Fonte de
nitrogecircnio nitrato (linha rachurada) ureacuteia (linha contiacutenua)
Como eacute conhecido a energia do fluxo de eleacutetrons entre o FSII e NADPH
direciona proacutetons atraveacutes da membrana plasmaacutetica criando uma forccedila motriz de
proacutetons que fornece energia para a siacutentese de ATP pela ATP sintase (LEHNINGER
2004) Portanto assumiu-se que uma parte da energia molar de Gibbs absorvida
pelos dois fotossistemas foi usada para converter ADP em ATP Como mostrado no
Graacutefico 29 os maiores valores de ΔGa e ΔGATP foram obtidos no final do cultivo
devido a condiccedilotildees ambientais desfavoraacuteveis como a falta de nutrientes ou
liberaccedilatildeo de metaboacutelitos celulares No que se refere agrave intensidade luminosa os
maiores valores de ΔGa e ΔGATP foram observados nas culturas a intensidades
luminosas iguais e maiores que 120 μmol de foacutetons m-2 s-1 que garantiu a maior
concentraccedilatildeo de ceacutelulas (Item 61) Os valores de ΔGa e ΔGATP natildeo aumentaram no
caso dos cultivos utilizando ureacuteia ou aumentou muito pouco no caso dos cultivos
utilizando nitrato na faixa de intensidade luminosa de 120 - 240 μmol de foacutetons m-2
s-1 devido agraves condiccedilotildees de saturaccedilatildeo de luz como mencionado anteriormente
-015
-010
-005
000
005
010
015
020
0 2 4 6 8 10 12
q (
mo
lL
)
Tempo (dias)
150
Graacutefico 29 Energia total de Gibbs absorvida pelo aparato fotossinteacutetico (siacutembolo
fechado) (ΔGa) e energia transformada em ATP (siacutembolo aberto) (ΔGATP) durante o
cultivo da A platensis intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 (
) 120 () 240 Fonte de nitrogecircnio nitrato (linha tracejada) ureacuteia (linha
continua)
No Graacutefico 30 mostra os resultados da energia fixada pela fotossiacutentese (ΔH)
e a liberada como calor (Q) a diferentes condiccedilotildees de intensidades luminosas e
fontes de nitrogecircnio Pode ser visto que no final de cultivos tanto ΔH como Q
aumentaram com a intensidade luminosa Como eacute bem conhecido sob condiccedilotildees de
excesso de luz parte da energia absorvida eacute dissipada termicamente atraveacutes de um
mecanismo natildeo fotoquiacutemico (Non-Photochemical Quenching) (MOZZO et al 2008)
e uma quantidade significativa de energia livre eacute perdida como calor durante as
reaccedilotildees bioquiacutemicas entre a absorccedilatildeo luz e a formaccedilatildeo carboidratos (HAUSKA
ARNALD 2000) Esse resultado foi atribuiacutedo a um mecanismo fisioloacutegico para
proteger o aparelho fotossinteacutetico contra fotodestruiccedilatildeo (KARAPETYAN 2008
HEBER et al 2006) cuja funccedilatildeo eacute desempenhada pelos complexos antena do
aparato fotossinteacutetico que muda forma de captaccedilatildeo de luz para uma forma de
dissipaccedilatildeo teacutermica eficiente (MOZZO et al 2008)
-10000
-8000
-6000
-4000
-2000
0
2000
0 2 4 6 8 10 12
G
AT
P (
kJ
C-m
ol
DM
-1)
Tempo (dias)
151
Graacutefico 30 Energia fixada pelo aparato fotossinteacutetico (siacutembolo fechado) (ΔH) e
energia liberada como calor (siacutembolo aberto) (Q) durante o cultivo de A platensis
intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 ( ) 120 () 240
Fonte de nitrogecircnio nitrato (linha rachurada) ureacuteia (linha contiacutenua)
Como era esperado pelo fato de que tanto a siacutentese de ATP como a formaccedilatildeo
de NADPH satildeo resultantes do mesmo complexo fotossinteacutetico o comportamento do
ΔH foi bastante semelhante ao observado para o ΔGATP
No Graacutefico 31 mostra a distribuiccedilatildeo percentual da energia luminosa absorvida
em funccedilatildeo do tempo nos cultivos a 60 μmol de foacutetons mndash2 sndash1 escolhidos como
exemplo Resultados qualitativamente semelhantes foram observados nos cultivos a
maiores intensidades luminosos (dados natildeo mostrados) Os cultivos com ureacuteia
apresentaram maiores valores de ηATP e ηF e menores valores de ηQ quando
comparado aos cultivos usando nitrato Isso pode ser explicado pelo fato de um
maior requerimento energeacutetico para a reduccedilatildeo de nitrato de amocircnia Aleacutem disso em
todos os experimentos a fraccedilatildeo de energia armazenada como ATP (ηATP) e a fixada
pelos sistemas (ηF) diminuiram ao longo do tempo enquanto que o liberado em
forma de calor (ηQ) aumentou
-2000
0
2000
4000
6000
8000
0 2 4 6 8 10
-H
Q
(k
J C
-mo
l D
M -1
)
Tempo (dias)
152
Graacutefico 31 Porcentagem na distribuiccedilatildeo da energia luminosa absorvida durante o
cultivo de A platensis usando nitrato (siacutembolo fechado) e ureacuteia (siacutembolo aberto)
como fonte de nitrogecircnio Energia fixada pelos fotossistemas () energia
transformada em ATP () energia liberada como calor ( )
Os maiores valores ηATP e ηF foram por volta de 12 e 23-27 nas culturas
com nitrato e 15 e 31-34 em culturas com ureacuteia respectivamente Nos cultivos a
maiores intensidades luminosas (120 e 240 μmol de foacutetons mndash2 sndash1) os valores de ηF
diminuem mais acentuadamente que os cultivos a 60 μmol de foacutetons mndash2 sndash1 devido
agrave maior concentraccedilatildeo de ceacutelulas (item 61) que reduziu a disponibilidade de luz para
a ceacutelula (efeito de sombreamento) A disponibilidade de nutrientes eacute outro importante
fator ambiental influenciando a composiccedilatildeo do aparato fotossinteacutetico de
cianobacteacuterias Murakami et al (1997) tecircm mostrado que as respostas ao CO2 Na+
e estresse pela luz em Synechocystis sp provocam alteraccedilotildees no estado redox de
componentes entre os sistemas de transporte de eleacutetrons Da mesma forma a
diminuiccedilatildeo na disponibilidade de alguns nutrientes no final do cultivo de A platensis
pode ter contribuiacutedo para diminuir os valores de ηF Como esperado ηQ mostraram
um comportamento oposto aumentando progressivamente a partir dos valores
miacutenimos (60-66 com nitrato e 49-54 com ureacuteia) no iniacutecio do cultivo e cerca de
90 no final Isto significa que no final do cultivo da maior parte da energia
absorvida foi liberada como calor
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2 4 6 8 10 12
h (
)
Tempo (dias)
153
67 Comparaccedilatildeo entre os fotobiorreatores de diferentes configuraccedilotildees
Apoacutes a escolha da melhor condiccedilatildeo do cultivo de A platensis em
fotobiorreator tubular horizontal utilizando CO2 de cilindro foram realizados
experimentos nas mesmas condiccedilotildees em fotobiorreator tubular espiralado para
avaliar o comportamento celular em duas diferentes configuraccedilotildees de
fotobiorreatores tubulares Luo et al (2003) tem mostrado que a configuraccedilatildeo de
cada reator eacute um dos principais fatores que controlam a produtividade do cultivo
fotossinteacutetico Por isso foram comparadas as curvas de crescimento A platensis
duas diferentes configuraccedilotildees dos fotobiorreatores tubulares uma horizonal (Figura
7) e outra espiralada (Figura 8)
Como observado no Graacutefico 32 os crescimentos celulares da A platensis nos
diferentes fotobiorreatores foram semelhantes obtendo valores de concentraccedilotildees
celulares diaacuterias proacuteximas Isso pode ser explicado pela semelhanccedila nas condiccedilotildees
fiacutesicas entre os fotobiorreatores tais como diacircmetro interno do tubo velocidade de
escoamento do liacutequido bem como as condiccedilotildees de cultivos como a intensidade
luminosa temperatura meio de cultivo que foram mantidas as mais semelhantes
possiacuteveis
Graacutefico 32 Concentraccedilatildeo celular nas duas diferentes configuraccedilotildees dos
fotobiorreatores tubulares ( ) horizontal e ( loz ) espiralado
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
Tempo (dias)
X (
mg
L-1)
154
7 Conclusotildees
Os paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) e produtividade em ceacutelulas
(Px) foram influenciados pela variaacutevel independente intensidade luminosa (I)
obtendo maiores valores quando submetidos a maiores intensidades luminosas Por
outro lado a variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio (N) natildeo influenciou nesses
paracircmetros mostrando a viabilidade na substituiccedilatildeo do nitrato pela ureacuteia nos cultivos
de Artrhospira platensis
A variaacutevel independente intensidade luminosa natildeo influenciou no paracircmetro
fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) No entanto para variaacutevel
independente fonte de nitrogecircnio os cultivos utilizando ureacuteia apresentaram maiores
valores de YXN quando comparados aos cultivos com nitrato As diferentes fontes de
CO2 natildeo influenciaram nos paracircmetros analisados Xm Px e YXN Logo o CO2
juntamente com os volaacuteteis orgacircnicos liberados durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica
pode ser utilizado para o cultivo da A plantesis sem interferir no crescimento celular
Na composiccedilatildeo centesimal da biomassa pode-se observar que intensidade
luminosa influenciou nos teores de clorofila proteiacutenas e lipiacutedios obtendo maiores
valores de clorofila e proteiacutena nos cultivos a baixa intensidade luminosa enquanto
que nessas condiccedilotildees foram obtidos menores teores de lipiacutedios A fonte de
nitrogecircnio influenciou apenas no teor de clorofila obtendo maiores valores utilizando
nitrato como fonte de nitrogecircnio A fonte de CO2 natildeo influenciou na composiccedilatildeo da
biomassa Nenhuma das variaacuteveis independentes estudadas influenciou nos teores
de cinzas e carboidratos na biomassa final
Os resultados tambeacutem indicaram que todas as variaacuteveis independentes tiveram
uma certa influecircncia nos paracircmetros de bioenergeacutetica A dissipaccedilatildeo de energia de
Gibbs aumento com o tempo em todas as condiccedilotildees analisadas obtendo os maiores
valores em tempos mais curtos nos cultivos a 120-240 μmol de foacutetons m-2 s-1
independentemente da fonte de nitrogecircnio selecionado O nuacutemero de moles de
foacutetons absorvidos pelas ceacutelulas para produzir um C-mol de biomassa foi maior nas
culturas com nitrato independentemente da intensidade luminosa Os maiores
valores de produccedilatildeo molar de O2 e do consumo de H+ foram obtidos com os valores
mais elevados de intensidade luminosa utilizando nitrato As fraccedilotildees da energia
direcionada para a siacutentese de ATP fixada pela ceacutelula foram superiores em culturas
com ureacuteia quando comparadas com as culturas com nitrato que se revelou uma
fonte de nitrogecircnio capaz de sustentar o crescimento energicamente da A platensis
155
As diferentes configuraccedilotildees dos fotobiorreatores tubulares natildeo influenciaram
nas concentraccedilotildees celulares indicando que o formato do tubo que forma o
fotobiorreator seja horizontal ou espiralado natildeo interferem no crescimento da A
platensis
Com isso pode-se concluir que a intensidade luminosa eacute uma importante
variaacutevel que influencia nos paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima produtividade
celular fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas bioenergeacuteticos e na
composiccedilatildeo quiacutemica da A platensis e que o emprego do CO2 proveniente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica juntamente com a ureacuteia como fonte de nitrogecircnio pode ser
uma alternativa viaacutevel para o cultivo de A platensis em escala industrial
proporcionando uma reduccedilatildeo no custo de produccedilatildeo
156
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178
ANEXOS
Artigos publicados submetidos e em fase de redaccedilatildeo para perioacutedicos internacionais
ANEXO 1 - BEZERRA RP MONTOYA EYO SATO S PEREGO P
CARVALHO JCM CONVERTI A Effects of light intensity and dilution rate on the
semicontinuous cultivation of Arthrospira (Spirulina) platensis A kinetic Monod-type
approach Bioresource Technology 102 p3215 - 3219 2011
ANEXO 2 - BEZERRA RP MATSUDO MC SATO S CONVERTI A
CARVALHO JCM Effects of photobioreactor configuration nitrogen source and
light intensity on the fed-batch cultivation of Arthrospira (Spirulina) platensis
Bioenergetic aspects Biomass and Bioenergy
ANEXO 3 - BEZERRA RP MATSUDO MC SATO S CONVERTI A
CARVALHO JCM Carbon dioxide from alcoholic fermentation as a carbon source
for the fed-batch cultivation of Arthrospira platensis Biomass and Bioenergy
BEZERRA RP MATSUDO MC SATO S CONVERTI A CARVALHO JCM
Chemical composition of the A platensis biomass cultivated on CO2 from alcoholic
fermentation Em fase de Redaccedilatildeo
179
ANEXOS
180
Anexo 1
181
182
183
184
185
Anexo 2
Effects of photobioreactor configuration nitrogen source and light intensity
on the fed-batch cultivation of Arthrospira (Spirulina) platensis
Bioenergetic aspects
Raquel Pedrosa Bezerraab
Marcelo Chuei Matsudoa Sunao Sato
a Patrizia Perego
b Attilio
Convertibc
Joatildeo Carlos Monteiro de Carvalhoa
a Department of Biochemical and Pharmaceutical Technology Faculty of Pharmaceutical
Sciences University of Satildeo Paulo Av Prof Lineu Prestes 580 Bl 16 05508-900 Satildeo Paulo-
SP Brazil
b Department of Chemical and Process Engineering ldquoGB Boninordquo University of Genoa via
Opera Pia 15 16145 Genoa Italy
c CAPES Fellowship holder Brazil
_________
Author for correspondence phone +55-11-30913695 fax +55-11-38156386
E-mail jcmdcarvuspbr
186
ABSTRACT
The bioenergetics of the photoautotrophic growth of the cyanobacterium Arthrospira
(Spirulina) platensis was investigated in different bioreactor configurations (tubular
photobioreactor and open ponds) using different nitrogen sources (nitrate and urea) and under
different light intensity conditions Although an increase in the light intensity increased the
Gibbs energy dissipated for cell growth and maintenance in both nitrogen sources it did not
exert any appreciable influence on the moles of photons absorbed by the system to produce
one C-mol biomass On the other hand both bioenergetic parameters were higher in cultures
with nitrate than with urea likely because of the higher energy requirements needed to reduce
the former nitrogen source to ammonia They appreciably increased also when open ponds
were substituted by the tubular photobioreactor where a more efficient light distribution
ensured a remarkably higher cell mass concentration The estimated percentages of the energy
absorbed by the cell showed that compared with nitrate the use of urea as nitrogen source
allowed the system to address higher energy fractions to ATP production and light fixation by
the photosynthetic apparatus as well as a lower fraction released as heat Thanks to this better
bioenergetic situation urea appears to be a quite promising low-cost alternative nitrogen
source for A platensis cultures in photobioreactors
Keywords Arthrospira (Spirulina) platensis bioenergetics nitrogen source light intensity
bioreactor configuration
187
1 Introduction
The production of the cyanobacterium Arthrospira platensis is increasing due to its high
content of highly-valuable proteins fundamental amino acids vitamins β-carotene and other
pigments mineral substances essential fatty acids and polysaccharides which find
application in several industrial productions like those of health foods and therapeutics [1]
Environmental factors such as light intensity and nitrogen source are well known to
influence the growth of photosynthetic microorganism In the absence of any other limiting
factor cell concentration increases with light intensity until reaching maximum biomass
concentration that is denominated ldquosaturation levelrdquo Light intensities higher than the
saturation level provoke damage of cell photosynthetic apparatus due to a phenomenon called
ldquophotooxidationrdquo or ldquophotoinhibitionrdquo
The nitrogen source is an additional environmental factor influencing cell growth
because this element is mainly used to form proteins and nucleic acids Alternative sources of
nitrogen such as urea [23] and ammonium salts [4] have been investigated in substitution of
nitrate to reduce the cost of large-scale A platensis cultivation
Also the reactor configuration can impact on cell growth Appropriately-designed
photobioreactors can in fact reduce the cultivation area by a vertical distribution of the
photosynthetic organism and enlarge the surface exposed to light thus increasing cell
concentration Tubular reactors allow for better light distribution and then higher
photosynthetic efficiency with respect to the conventional mini-ponds [56] where the cells
are subject to full light radiation at the surface and darkness at the bottom [7]
Only a few studies emphasized the bioenergetic aspects of the growth of
photosynthetic microorganisms based on Gibbs energy balances The Gibbs energy
dissipation per C-mol of biomass can be regarded as a simple thermodynamic measure of the
amount of biochemical work required to convert the carbon source into biomass by the
proper irreversible carbon-carbon coupling and oxidationreduction reactions [8] Up to now
188
the bioenergetics of the cyanobacterium A platensis were uninvestigated either in bench-scale
open ponds using urea and KNO3 as nitrogen sources [910] or in rectangular vessel under
different light intensities [11] To shed further light on these aspects in this study we
investigated the bioenergetics of this cyanobacterium when cultivated in tubular
photobioreactor under different light intensities and using different nitrogen sources and
compared these results with those previously obtained in open ponds [9]
2 Material and methods
21 Photobioreactors and culture conditions
Arthrospira (Spirulina) platensis UTEX 1926 was cultivated either in open ponds [9] on the
medium of Paoletti et al [12] or in tubular photobioreactor [13] on the medium of Schloumlsser
[14] both containing nitrate as nitrogen source The initial cell concentration and pH were set
at 400 mg l-1
[15] and 95 [1617] respectively
Open ponds cultivations were carried out elsewhere in the same medium of Paoletti et
al [12] at photosynthetic photon flux density (PPFD) of 72 μmol photons mndash2
sndash1
25 ordmC [9]
On the other hand for tubular photobioreactor cultivations we used the medium of Schloumlsser
[14] as well as medium in which NaNO3 was substituted by urea These runs were carried out
at 60 le PPFD le 240 μmol photons mndash2
sndash1
29 ordmC and the pH was controlled at 95 plusmn 02 by
pure CO2 addition Since the operating conditions at the lowest PPFD values were very
similar any difference in the kinetics and bioenergetics was ascribed to the different
bioreactor configurations The amount of urea to be daily added was estimated by an equation
describing the experimental growth curve obtained under non-limited conditions with NaNO3
as nitrogen source as previously described [13] Under these conditions the bioenergetics of
the system was investigated comparing the different nitrogen sources
189
22 Analytical determinations
The cell concentration of A platensis was determined by measuring the optical density of
cultures at 560 nm using a spectrophotometer model 600 PLUS (FEMTO Satildeo Paulo Brazil)
The optical density data were converted to cell dry weight by a calibration curve The
elemental composition of biomass obtained at the end of each run was determined by an
elemental analyzer Flash EA1112 series (CE Instruments Wigan UK)
Light intensity at the culture surface was measured using a quantum sensor model LI-
190 SB (Li-Cor Inc Lincoln NE USA) connected to a quantumradiometerphotometer
model LI-189 B
23 Theory
The Gibbs energy dissipation for cell growth and maintenance (1YGX) was estimated
according to Heijnen [18] by the equation (1)
G
GXGX
m
YY
max
11
(1)
in which max
GXY is the maximum biomass yield on Gibbs energy that corresponds to 986 C-
molX kJ-1
in photoautotrophic cultivation with CO2 as a carbon source [18]
In this equation the specific growth rate μ was defined according to Leduy and Zajic
[19] as
190
1
ln1
i
i
X
X
t
(2)
where Xi and Xi-1 are the biomass concentrations at the end and the beginning of the time
interval elapsing between two consecutive measurements (Δt = 1 day) while mG is the
biomass specific rate of Gibbs energy dissipation for maintenance corresponding to 45 and
712 kJ C-molX-1
h-1
at 25 and 29 degC respectively [18]
To estimate the moles of photons (Einsteins) to sustain the autotrophic growth nPh it
was necessary to resort to the Gibbs energy balance taking into account the energy
contributions for the growth 1YGX and the absorption of 1 Einstein of photons ΔgPh in
addition to those of formation of substrates and products Δgfi as described by the equation
ΔgfHCO3- +ΔgfN + ΔgfH2O + ΔgfO2
+ ΔgfH+ + ΔgfX + 1YGX + nPh ΔgPh = 0
(3)
The value of ΔgPh = 2062 kJ mol-1
was estimated through the equation
A
Ph
hcNg
(4)
being h = 6626 10
-34 J the Planck constant c = 299
10
8 m s
-1 the light velocity NA = 6022
10
23 photons Einstein
-1 the Avogadro number and λ = 580 nm the wavelength of absorbed
photons [9]
191
According to Torre et al [9] 2 photons at 580 nm are absorbed by the second
photosystem (PSII) and used to transfer 2 electrons to the first one (PSI) releasing two
photons with less energy Therefore knowing nPh we estimated the total molar Gibbs energy
absorbed by the photosynthesis (-ΔGa)
ΔGa = nPh ΔgPh
(5)
According to Torre et al [9] the molar O2 production (qO2) and H
+ consumption
(qH+) were calculated by multiplying their respective stoichiometric coefficients by the cell
concentration expressed in C-mol l-1
using the experimental biomass elemental composition
-ΔGa was assumed to be the sum of the energy fixed by the system to increase its own
enthalpic content (ΔH) that transformed into ATP and used for the growth and maintenance
(ΔGATP) and the released heat (Q)
ΔGa + ΔGATP + ΔH + Q = 0
(6)
where ΔGATP and ΔH were calculated from nPh the Gibbs energy associated to 1 ATP mol
and the average potential variation between PSI and PSII [9]
3 Results and discussion
Fig 1 shows the growth curves of A platensis using nitrate (A) or urea (B) as nitrogen
sources in open ponds [910] or in tubular photobioreactor at different PPFD values A
192
progressive increase in PPFD up to 240 μmol photons m-2
s-1
favored the growth of this
cyanobacterium and a maximum cell concentration of about 3500 mg l-1
was obtained almost
irrespectively of the nitrogen source These results suggest that the light intensity was the
factor limiting the growth under the selected conditions while ongoing experiments (results
not shown) point out that photosaturation takes place at PPFD ge 240 μmol photons m-2
s-1
Such a maximum PPFD threshold is higher than those reported for Erlenmeyer flasks (100-
150 μmol photons m-2
s-1
) [21] rectangular photobioreactor (138 - 229 μmol photons mndash2
sndash1
)
[22] and long open ponds (156 μmol photons mndash2
sndash1
) [23] Moreover even at PPFD of only
60 μmol photons m-2
s-1
(Fig 1) the final cell concentration was more than twice that
previously obtained in open pond under similar experimental conditions (25 degC 72 μmol
photons m-2
s-1
) [10] which suggests a better light distribution in the tubular photobioreactor
Fig 2 illustrates the behavior of Gibbs energy dissipation for cell growth and
maintenance 1YGX versus the time As a general rule this bioenergetic parameter increased
with the time under all the tested conditions as a result of the increasing biomass level that
was responsible for a decrease in the specific growth rate An increase in PPFD up to 120
μmol photons m-2
s-1
favored cell growth because of photolimitation therefore the energy
requirements mainly for maintenance remarkably increased On the contrary none (urea) or
very little (nitrate) increase in 1YGX took place in the PPFD range of 120-240 μmol photons
m-2
s-1
because of the achievement of light saturation conditions This behavior is also
consistent with lower 1YGX values previously observed in open ponds [9] where the well-
known shadowing effect [24] hindered the growth
The photoautotrophic growth can be represented by an overall mass balance equation
where the nitrogen (NO3- or NH4
+) and carbon (HCO3
-) sources H2O O2 SO4
-2 and H
+ are
involved in the formation of 1 C-mol biomass
193
a HCO3- + b NO3
- (or NH4
+) + c H2O + d O2 + e H
+ + f SO4
-2 + CH1650O0531N0170S00007 = 0
(7)
To this purpose we used either the elemental composition of biomass reported by
Cornet et al [25] utilized here as an example or those experimentally determined as
described in Material and methods
To make these redox reactions between electron acceptor and donor possible the
Gibbs energy is used by the cell to enable the construction of the complex biomass molecules
from the inorganic carbon source The respective stoichiometric coefficients estimated
through material balances of carbon nitrogen oxygen sulfur charge and reduction degree are
listed in Table 1 It should be noticed that the reduction degree of biomass (γX) calculated
from biomass composition experimentally determined in this work was always appreciably
higher with nitrate (489-519) than with urea (399-432) as expected by the higher oxidation
number of the former compound [18] In addition both this parameter and the nitrogen
stoichiometric coefficient were appreciably lower when using the elemental composition
experimentally determined in this work (Table 1) because the nitrogen content of biomass
under the selected conditions was always lower than that reported by Cornet et al [25]
The moles of photons (Einsteins) to sustain the autotrophic growth of 1 C-mol
biomass (nPh) were calculated by Eq (3) Although the actual Δgfi values should have been
used for this calculation Torre et al [9] demonstrated that the Gibbs energy of formation
under the actual variable conditions of a cultivation does not differ at all or differs by no more
than 3 from that estimated under standard biological conditions On the contrary ΔgfH+ is
by definition a function of the pH So this parameter was recalculated for the actual
conditions by the well-known equation of Gibbs
194
7
pH
ff10
10ln
HH
RTgg
(8)
As shown in Fig 3 the progressive decrease in the specific growth rate throughout the
cultivations brought about a corresponding increase (in absolute value) in the Einsteins
absorbed to produce one C-mol biomass (nPh) As expected at the highest growth rates this
parameter approached theoretical values very close to that reported by Richmond [26] to
sustain growth under ideal conditions (only 8 effective Einsteins C-molDM-1
)
During the light reactions of photosynthesis the free energy carried by photons is in
fact captured by pigments (ex chlorophyll) held in large protein complexes called ldquoreaction
centersrdquo When a special chlorophyll molecule of PSII absorbs the energy of a photon (hν) an
electron gains higher energy level Because this state of an electron is very unstable it is
transferred from one to another molecule creating a chain of redox reactions referred to as
Electron Transport Chain (ETC) The electron flow goes from PSII to cytochrome b6f of PSI
where the electron gets the energy from another photon The final electron acceptor is
NADP+ which produces NADPH A minimum of 8 photons is then required to transfer 4
electrons from 2 H2O molecules to produce 2 NAPDH molecules according to the equation
2 H2O + 8 hν +2 NADP+ rarr 2 NADPH + O2 + 2 H
+
(9)
Subsequently the electrons are transferred from NAPDH to CO2 through the Calvin cycle to
produce biomass constituents [27]
As already observed in previous work [9] the additional energy requirement with
respect to the ideal situation of 8 effective Einsteins C-molDM-1
is negligible at the beginning
195
of cultivations (high specific growth rates) and then considerably increases during the
stationary phase This suggests that under conditions likely limited by shadowing biomass
uses energy preferentially for maintenance rather than for growth Although the behavior of
nPh was qualitatively similar for cultivations performed in open ponds and in tubular
photobioreactor (Fig 3) the excess light requirements in the latter configuration were
certainly due to the higher levels of biomass ensured by more effective distribution As
expected a progressive increase in the light intensity did not exert any appreciable influence
on this nPh (Einstein C-molDM-1
)
In addition the cultures with nitrate needed highest nPh values to sustain the
autotrophic growth compared to those with urea even though the cell concentration was
similar at all the PPFD values (Fig 1) Thus the additional photon requirement was likely
utilized to reduce nitrate to ammonia [28] which is the preferential nitrogen form assimilated
by A platensis [29] This effect was also observed by Torre et al [9] in open ponds It should
also be noticed that the use in the above bioenergetic model of the coefficients reported by
Cornet et al [25] for A platensis biomass composition (CH1650O0531N0170S00007) led to
results practically coincident to those obtained using the experimental ones determined in this
work (Fig 3) This observation demonstrates that biomass composition has a negligible
impact on the predictions by the model and then it could be used as a general tool to elaborate
data from the literature without any determination of biomass composition
Fig 4 shows the time behaviors of molar development of O2 and consumption of H+
during the cultivations performed either in open pond or in the tubular photobioreactor at
variable PPFD These trends clearly demonstrate that both activities faithfully followed cell
growth being biomass the final product of the photosynthetic metabolism and were lower in
the open pond compared with the tubular photobioreactor consistently with the better light
distribution in the latter reactor configuration Moreover their progressive increase with
PPFD confirms that the light intensity was the factor actually limiting the growth and that the
196
system never reached photoinhibition conditions This behavior was qualitatively similar in
the cultures using nitrate as nitrogen source (data not shown) As expected by the above-
mentioned need of reducing nitrate to ammonia as an obligatory intermediate to utilize any
nitrogen source [30] both parameters were higher using nitrate than urea
As is well known the energy from flow of electrons between PSII and NADPH drives
protons across the plasma membrane creating a proton-motive force that provides the energy
for ATP synthesis by ATP synthase [31] Therefore it was assumed that a portion of molar
Gibbs energy absorbed by the two photosystems was used to convert ADP to ATP As shown
in Fig 5 the highest -ΔGa and ΔGATP values were obtained at end of cultivation due to
unfavorable environmental conditions such as the lack of nutrients or release of cell
metabolites As far as the influence of light intensity is concerned the highest energy
requirements were observed for cultures performed at PPFD up to 120 μmol photons m-2
s-1
which ensured the highest cell concentration (Fig 1) As previously mentioned the -ΔGa and
ΔGATP values did not increase (urea) or increased very little (nitrate) in the PPFD range of 120
ndash 240 μmol photons m-2
s-1
because of light saturation conditions A qualitatively similar
behavior was observed for cultures using nitrate in tubular photobioreactor (results not
shown) Moreover at the lowest PPFD values both parameters showed similar behaviors in
open pond and in tubular photobioreactor which means that the reactor configuration had
negligible influence on them
Fig 6 shows the results of the energy fixed by photosynthesis (-ΔH) and that released
as heat (Q) under different conditions of light intensity nitrogen source and reactor
configuration It can be seen that at the end of cultivations both parameters increased with
light intensity Almost coincident results were also obtained using nitrate as nitrogen source
(results not shown) As is well known under excess light conditions part of the absorbed
energy is thermally dissipated via a mechanism called Non-Photochemical Quenching (NPQ)
[32] and a significant quantity of free energy is lost as heat during the biochemical reactions
197
between light absorption and carbohydrate formation [33] Such a result has been ascribed to
a certain physiological mechanism to protect the photosynthetic apparatus against
photodestruction [3435] where a fundamental role is played by the antenna complexes of
photosynthetic apparatus which would switch from a light harvesting form to an efficient
thermal dissipation form [32]
As expected by the fact that both the ATP synthesis and the formation of NADPH
implied in the biosynthetic pathways are resulting from the activity of the same
photosynthetic apparatus [33] the ΔH behavior was quite similar to that observed for ΔGATP
Fig 7 shows the percentage distribution of the light energy absorbed versus time at the
lowest PPFD chosen as an example but qualitatively similar results were observed at higher
PPFD values As expected by the additional energy requirements of nitrate-to-ammonia
reduction cultures with urea compared with those with nitrate exhibited higher energy
fractions stored as ATP (ηATP) and fixed by the system to increase its enthalpic content (ηF)
and lower fraction released as heat (ηQ) Moreover in all the experiments both ηATP and ηF
decreased along the time whereas ηQ increased
The highest ηATP and ηF values were around 12 and 23ndash27 in cultures with nitrate
and 15 and 31ndash34 in those with urea respectively In cultures performed at the highest
PPFD values (120 and 240 μmol photons mndash2
sndash1
) ηF decreased more sharply than at the
lowest ones (results not shown) because of the highest cell concentrations (Fig 1) that
reduced the light availability to the cell (shading effect) The nutrient availability is another
important environmental factor influencing the composition of cyanobacterial photosynthetic
apparatus Murakami et al [36] have shown that the responses to CO2 Na+
and light stresses
in Synechocystis sp cause alterations in the redox state of intersystem electron transport
components Likewise the decrease in the availability of some nutrient at the end of our A
platensis cultivations may have contributed to lower ηF As expected ηQ showed an opposite
behavior progressively increasing from minimum values at the beginning of cultures (60-
198
66 with nitrate and 49-54 with urea) to around 90 at the end This means that at the end
of any cultivation most of the energy absorbed is released as heat
Similar behaviors were observed using either open ponds with nitrate or the tubular
photobioreactor with both nitrogen sources which means that the energy distribution was not
appreciably influenced by the reactor configuration
4 Conclusions
The results of the current study indicate that the bioenergetic parameters of the blue-green
cyanobacterium Arthrospira (Spirulina) platensis were influenced by bioreactor
configuration nitrogen source and photosynthetic photon flux density (PPFD) In particular
the highest values of the Gibbs energy dissipation for cell growth and maintenance were
obtained at 120-240 μmol photons m-2
s-1
irrespective of the selected nitrogen source while
the number of photons moles absorbed by the cell to produce one C-mol biomass was higher
in the cultures with nitrate irrespective of light intensity The highest values of the molar
production of O2 and consumption of H+ were obtained at the highest PPFD values using
nitrate as a nitrogen source and the tubular photobioreactor Contrarily the bioreactor
configuration did not exert any appreciable influence on the fractions of the absorbed energy
addressed to the synthesis of ATP fixed by the cell and released as heat The first two
fractions were higher in cultures performed with urea which proved a nitrogen source able to
energetically sustain A platensis growth
Acknowledgements
The authors grateful acknowledge the financial support of the Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
Pesquisa do Estado de Satildeo Paulo (FAPESP) Satildeo Paulo Brazil (process no 0654959-3 and
199
0656976-2) of the Coordenaccedilatildeo de Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES)
Brazil (process no 397808-7 and Prof A Converti Fellowship no 0350-112010) of the
Italian Ministry of Education University and Research (MIUR) (PRIN ProtN 200744HMBN
and FIRB Prot N RBIP06993E) and of the Vigoni Program (Deutsch-Italienisches
Hochschulzentrum)
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204
Caption of Figures
Fig 1 Growth of A platensis using nitrate (A) and urea (B) as nitrogen sources at different
PPFD values (μmol photons m-2
s-1
) Tubular photobioreactor () 60 ( ) 120 and () 240
Open ponds [10] 72 ()
Fig 2 Dependence of Gibbs energy dissipation for A platensis growth and maintenance
(1YGX) on PPFD (μmol photons m-2
s-1
) Tubular photobioreactor () 60 ( ) 120
() 240 Open ponds [10] 72 () Nitrogen source nitrate (open symbols or ) urea
(full symbols)
Fig 3 Influence of A platensis specific growth rate (μ) on the moles of photons absorbed to
produce one C-mol biomass (nPh) under different culture conditions Tubular photobioreactor
() elemental biomass composition reported by Cornet et al [25] PPFD = 60 μmol photons
m-2
s-1
elemental biomass composition experimentally determined in this work PPFD (μmol
photons m-2
s-1
) () 60 () 120 () 240 () Open ponds [10] elemental
biomass composition reported by Cornet et al [25] PPFD = 72 μmol photons m-2
s-1
Nitrogen source nitrate (open symbols or ) urea (full symbols)
Fig 4 Time behaviors of molar development of O2 (full symbols) and consumption of H+
(open symbols) under different culture conditions Tubular photobioreactor PPFD (μmol
photons m-2
s-1
) () 60 () 120 () 240 Open ponds [10] PPFD = 72 μmol
photons m-2
s-1
() Nitrogen source nitrate (dashed line) urea (continuous lines)
Fig 5 Total Gibbs energy absorbed by the photosynthetic apparatus (full symbols) (-ΔGa)
and energy transformed into ATP (open symbols) (ΔGATP) during A platensis cultivations
205
Tubular photobioreactor with urea PPFD (μmol photons m-2
s-1
) () 60 ( ) 120
() 240 Open ponds with nitrate [10] PPFD = 72 μmol photons m-2
s-1
()
Fig 6 Energy fixed by the photosynthetic apparatus (full symbols) (-ΔH) and energy released
as heat (open symbols) (Q) during A platensis cultivations Tubular photobioreactor with
urea PPFD (μmol photons m-2
s-1
) () 60 ( ) 120 () 240 Open ponds with
nitrate [10] PPFD = 72 μmol photons m-2
s-1
()
Fig 7 Percentage distribution of the light energy absorbed during A platensis cultivations
using nitrate (full symbols) and urea (open symbols) as nitrogen sources Tubular
photobioreactor PPFD = 60 μmol photons photons mndash2
sndash1
(continuous lines) Open ponds
[10] PPFD = 72 μmol photons m-2
s-1
(dashed lines) Energy fixed by the photosynthesis
() energy transformed into ATP () energy released as heat ( )
206
Figure 1
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
Bio
ma
ss c
on
cen
tra
tio
n (
mg
l-1
)
Time (d)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
Bio
ma
ss c
on
cen
tra
tio
n (
mg
l-1
)
Time (d)
A
B
207
Figure 2
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
0 2 4 6 8 10 12
1Y
GX (
kJ
C-m
ol
DM
-1)
Time (d)
208
Figure 3
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
000 010 020 030 040 050 060 070 080
nP
h (
Ein
stei
n C
-mo
l D
M-1
)
(d -1)
209
-015
-010
-005
000
005
010
015
020
0 2 4 6 8 10 12
q (
mol
l-1)
Time (d)
210
Figure 4
Figure 5
-9000
-8000
-7000
-6000
-5000
-4000
-3000
-2000
-1000
0
1000
0 2 4 6 8 10 12
G
a
GA
TP (
kJ
C-m
ol
DM
-1)
Time (d)
211
Figure 6
-2000
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
0 2 4 6 8 10 12-H
Q
(k
J C
-mol
DM
-1)
Time (d)
212
Figure 7
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2 4 6 8 10 12
h(
)
Time (d)
213
Table 1 Stoichiometric coefficients estimated through material balances of carbon nitrogen
oxygen sulfur charge and reduction degree for biomass cultivated either in open ponds or in
tubular photobioreactor using nitrate or urea as nitrogen sources
HCO3- NO3
- NH4
+ a H2O O2 H
+ SO4
-2 Biomass
Δgf‟i
(kJ mol-1
)
-5872 -1114 -794 -2373 0 -399 -7446 -670
Stoichiometric coefficients (mol C-molDM-1
)
Run
PPFD
(μmol photons
m-2
s-1
)
a b b c d e f γX b
1 c 72 -1 -020 - 020 145 -120 - 580
2 d 60 -1 -020 - 020 145 -120 - 580
2 e 60 -1 -011 - 032 130 -111 000 519
3 e 60 -1 - -007 024 100 -093 000 399
4 e 120 -1 -011 - 023 122 -111 000 489
5 e 120 -1 - -008 042 103 -092 000 411
6 e 240 -1 -010 - 023 127 -110 000 509
7 e 240 -1 - -008 034 108 -092 000 432
a NH4
+ is the result of urea hydrolysis
b Reduction degree of biomass
c Minipond considering the elemental biomass composition reported by Cornet et al [25]
d Tubular photobioreactor considering the elemental biomass composition reported by Cornet et al
[25]
e Tubular photobioreactor elemental biomass composition experimentally determined
214
Anexo 3
Carbon dioxide from alcoholic fermentation as a carbon source for the
fed-batch cultivation of Arthrospira platensis
Raquel Pedrosa Bezerraab
Marcelo Chuei Matsudoa Sunao Sato
a Attilio Converti
bc Joatildeo
Carlos Monteiro de Carvalhoa
a Department of Biochemical and Pharmaceutical Technology Faculty of Pharmaceutical
Sciences University of Satildeo Paulo Av Prof Lineu Prestes 580 Bl 16 05508-900 Satildeo
Paulo-SP Brazil
b Department of Chemical and Process Engineering ldquoGB Boninordquo University of Genoa via
Opera Pia 15 16145 Genoa Italy
c CAPES Fellowship holder Brazil
_________
Author for correspondence phone +55-11-30913695 fax +55-11-38156386
E-mail jcmdcarvuspbr
215
Abstract
It was evaluated the Arthrospira platensis cultivation using CO2 from alcoholic fermentation
and either urea or nitrate as nitrogen source at different light intensities (60 le I le 240 μmol
photons m-2
s-1
) Whereas the CO2 source (pure CO2 or from alcoholic fermentation) did not
influence the maximum cell concentration (Xm) cell productivity (PX) and nitrogen-to-cell
conversion factor (YXN) the use of urea instead of nitrate led to higher YXN values Xm and PX
increased when I was increased from 60 to 120-240 μmol photons m-2
s-1
Using CO2 from
alcoholic fermentation the best performance (Xm = 2952 plusmn 35 mg L-1
PX = 425 plusmn 59 mg L-1
d-1
and YXN = 15 plusmn 020 mg mg-1
) was obtained at I = 120 μmol photons m-2
s-1
with urea The
results obtained in this work demonstrate that urea and CO2 from alcoholic fermentation could
be simultaneously used in large-scale cultivations to reduce the environmental impact
associated to the release of this greenhouse gas as well as the production cost of
cyanobacteria
Keywords
Arthrospira (Spirulina) platensis CO2 alcoholic fermentation fed-batch cultivation urea
light intensity
1 Introduction
Renewable energy sources such as ethanol have been seen as a promising alternative
to fossil fuel consumption providing environmental benefits by reduction in greenhouse gas
emissions and the national security benefits by less dependency on volatile crude oil imports
(Tyner and Taheripour 2007) Brazil is the worldrsquos largest exporter of bioethanol and second-
largest producer after the United States (Balat and Balat 2009) Considering the increasing
demand for this fuel and the fact that alcoholic fermentation is responsible for a CO2 release
216
on weight basis almost coincident with ethanol production it would be of great concern
developing a process for CO2 fixation able to turn it into a useful product Photosynthetic
microorganisms can fix CO2 efficiently from different sources including the atmosphere
industrial exhaust gases and soluble carbonate salts (Wang et al 2008) Moreover CO2
biofixation by microalgae leads to higher yield of biomass per hectare in comparison with
terrestrial plants (Packer 2009) It has been shown that the cost of CO2 in large-scale algal
cultures is of primary importance to the total economics (Tapie and Bernard 1988) Since 45ndash
50 of the dry algal mass is made up of carbon (Cornet et al 1992) 165ndash 183 g CO2 would
theoretically be needed for the biosynthesis of 1 g (DW) of algal biomass Thus CO2
biofixation by microalgae has the potential not only to offset carbon emissions but also to
reduce the costs of culture media on an industrial scale (Hughes and Benemann 1997)
Combination of CO2 fixation and production of biomass containing high-value bioactive
products may provide a very promising alternative to current CO2 mitigation strategies
Nowadays there are numerous commercial applications of A platensis such as the
enhancement of the nutritional value of foods and animal feed feed in aquaculture
bioremediation use in cosmetics and others applications (Spolaore et al 2006) Besides the
CO2 source the nitrogen source is an additional important factor in the cultivation of
photosynthetic microorganisms since this element is used mainly to provide proteins and
nucleic acids which are essential for cell maintenance and growth (Watanabe and Hall
1996) Salts of nitrate are largely used as nitrogen source for A platensis culture but urea
(Danesi et al 2004) and ammonium salts (Bezerra et al 2008) have recently been proposed
as alternative cheap nitrogen sources
Compared to open ponds appropriately designed closed photobioreactors are able to
minimize the loss of ammonia nitrogen sources by off gassing reducing the amount of this
nutrient necessary in a large-scale process Additionally these reactors can reduce the
217
cultivation area by distributing the photosynthetic organisms vertically and increase the CO2
residence time thereby improving its utilization efficiency (Ono and Cuello 2004)
The aim of this study was to check if the combined use of CO2 released from alcoholic
fermentation and urea in tubular photobioreactor could be a feasible and cheap alternative
way to cultivate A platensis For this purpose fed-batch cultivations were carried out at
variable light intensity using two different sources either of nitrogen (sodium nitrate or urea)
or of carbon (pure CO2 from cylinder or gaseous emissions from alcoholic fermentation) the
latter to simultaneously control the pH and maintain the desired carbon level The results
obtained were finally compared by means of analysis of variance to identify the statistically
significant effects of the above independent variables (light intensity nitrogen source and
carbon source) on the selected responses namely the maximum cell concentration cell
productivity and nitrogen-to-cell conversion factor
2 Materials and methods
21 Microorganism and culture medium
Arthrospira (Spirulina) platensis UTEX 1926 was maintained in the culture medium
of Schloumlsser (1982) having the following composition (per liter) 136 g NaHCO3 403 g
Na2CO3 050 g K2HPO4 250 g NaNO3 100 g K2SO4 100 g NaCl 020 g MgSO4middot7H2O
004 g CaCl2middot2H2O All the nutrients were dissolved in distilled water containing (per liter)
60 mL of metal solution (970 mg FeCl3middot6H2O 410 mg MnCl2middot4H2O 50 mg ZnCl2 20 mg
CoCl2middot6H2O 40 mg Na2MoO4middot2H2O) 10 mL of micronutrient solution (500 mg Na2EDTA
618 mg H3BO3 196 mg CuSO4middot5H2O 440 mg ZnSO4middot7H2O 200 mg CoCl2middot6H2O 126 mg
MnCl2middot4 H2O 126 mg Na2MoO4 middot2H2O) and 10 mL15 g Lminus1
B12 vitamin solution
Fed-batch runs were carried out either using the above medium containing NaNO3 as
the nitrogen source or after substituting in it NaNO3 with urea
218
22 Cultivation
The bench-scale tubular photobioreactor (Fig 1) utilized in this study was developed
at the Fermentation Technology Laboratory of the Department of Biochemical and
Pharmaceutical Technology of Satildeo Paulo University (Ferreira et al 2010) It was made up of
transparent glass tubes (10 m length 10 cm internal diameter 05 cm wall thickness) with
inclination of 2 (115ordm) to make the fluid flow easier PVC tubes were used to connect the
glass tubes The reactor was illuminated by 20 W fluorescent lamps Ambient air was injected
at the bottom of the tubes to drive the liquid from the bottom to the top of the reactor A
degassing bottle provided with magnetic stirrer ensured efficient medium homogeneity The
total and illuminated volumes of the reactor were 350 and 212 L respectively
Cultivations were carried out with initial biomass concentration of 400 mg Lminus1
(Ferreira et al 2010) in tubular photobioreactor (PBR) and temperature of 29 ordmC The pH was
set and maintained at 95 plusmn 02 (Saacutenchez-Luna et al 2007) by addition of pure CO2 from
cylinder or CO2 from continuous alcoholic fermentation under steady-state conditions using a
pH controller (Mettler Toledo Barueri SP Brazil) coupled to a solenoid valve In
experiments with NaNO3 nitrate concentration was maintained above 1 g L-1
(Faintuch
1989) to avoid growth limitation by this nutrient When urea was used as nitrogen source its
amount to be daily added was estimated as suggested by Ferreira et al (2010) Briefly from
the curve of cell concentration versus time of each standard run with nitrate (Fig 2) we
obtained an interpolated curve described by a third order-polynomial equation By derivation
of this equation it was possible to obtain the second order equation of cell productivity and
from that the equation expressing the amount of urea to be daily added to sustain the expected
cell growth taking into account that the dry mass of A platensis contains about 7 of
nitrogen (Bezerra et al 2008) The light intensity expressed as photosynthetic photon flux
density (PPFD) was varied in the range of 60-240 μmol photons mndash2
sndash1
Table 1 show the
219
different conditions adopted in this work for cultivations All experiments were carried out in
duplicate
221 CO2 sources
Pure CO2 of analytical grade (999) was obtained from a cylinder (Oxylumen Satildeo
Paulo SP Brazil)
CO2 from alcoholic fermentation was produced continuously by Saccharomyces
cerevisiae CCT7150 (Fundaccedilatildeo Tropical Andreacute Tosello Culture Collection Campinas SP
Brazil) cultivated in a glass bioreactor (Infors-HT Bottmingen Switzerland) containing 10 L
of diluted sugarcane blackstrap molasses at temperature of 30 plusmn 1 ordmC (Kock et al 2000)
impeller speed of 500 rpm and dilution rate of 0025 h-1
Sugar concentration in the feed
expressed as total reducing sugars (TRS) was 170 g L-1
(Guerreiro et al 1997) Urea (05 g
L-1
) was added to the mash After adjustment of pH at 45-50 by addition of H2SO4 it was
controlled at 45 plusmn 01 (Jones et al 1981) by addition of 15 N NaOH solution Penicillin (500
ui L-1
) was added to prevent contamination (Carvalho et al 2003) Continuous feeding was
started after 12 h of batch fermentation
23 Analytical techniques
231 A platensis cultivation
Cell concentration was determined by optical density (OD) measurements at 560 nm
using a calibration curve (Leduy and Therien 1977) The liquid phase of the medium was
used to determinate the concentrations of total carbonate (Pierce and Haenisch 1948) nitrate
(Vogel 2002) and volatile organic compounds (Joslyn 1970) The concentration of total
ammonia was determined immediately before the daily addition of urea on cell-free medium
samples using a potentiometer and selective ammonia ion electrode model 95-12 (Orion
Cambridge MA USA) (Leduy and Samson 1982) The residual urea level was determined
220
by the same way after previous hydrolysis with H2SO4 at 200 degC (Cezare 1998) Incident
photon flux density of photosynthetically active radiation (400-700 nm) was measured by
means of an integrating quantumradiometerphotometer model LI-190 SB (Li-Cor Lincoln
NE USA) provided with a LI-190 SB quantum sensor cell
232 Alcoholic fermentation
Cell concentration was measured by filtering 50 mL samples through Millipore
membranes with 12 μm pore diameter washing with 50 mL of distilled water and drying at
105-110 degC until constant weigh (Carvalho et al 2003) The total reducing sugars (TRS)
concentration was expressed as glucose and determined according to Somogy (1952) after
acid hydrolysis of samples (Falcone et al 1959)
Ethanol concentration was determined by the micro-dichromate method (Joslyn
1970) The effluent gas was qualitatively analyzed by a gas chromatograph coupled to mass
spectrometer model GCMS-QP5050A (Shimadzu Kyoto Japan) equipped with CP Sil
PONA CB column (100 m x 025 mm x 05 μm) Helium was used as a carrier gas at flow rate
of 1 mL min-1
Samples (1 mL) were injected in the column at a split ratio of 1100 Injector
and detector temperatures were 200 and 250 degC respectively The column temperature was
initially set at 40 degC and then increased at a rate of 2 degC min-1
up to 100 degC and subsequently
at 10 degC min-1
up to 250 degC
24 Calculation of A platensis cultivation parameters
The cell productivity (PX mg L-1
d-1
) was calculated by dividing the difference
between maximum and initial cell concentration (Xm - Xi) by the cultivation time
corresponding to Xm The nitrogen-to-cell conversion factor (YXN mg mg-1
) was calculated as
the mass ratio of dried produced cells and nitrogen added
221
24 Statistical analysis
Maximum cell concentration (Xm mg L-1
) maximum cell productivity (PX mg L-1
d-1
)
and nitrogen-to-cell conversion factor (YXN mg mg-1
) were evaluated by the analysis of
variance (ANOVA General Linear Model) and the Tukey test to compare the mean values at
a significance level of 5 (p lt 005) using the MINITAB 15 statistical software
3 Results and discussion
31 Continuous alcoholic fermentation
The mean results of continuous alcoholic fermentation of blackstrap molasses under
steady state conditions were the following cell concentration of 609 plusmn 054 gDW L-1
(dry
weight) TRS of 532 plusmn 567 g L-1
and ethanol concentration of 553 plusmn 757 g L-1
corresponding to a fermentation yield of 64 Such a process yield was of the same order of
magnitude as those previously obtained with the same carbon source (Carvalho et al 2003)
and ensured the release of a CO2 flux suitable to maintain the pH of A platensis culture at the
desired value (95 plusmn 02)
32 Effects of carbon dioxide and nitrogen sources and light intensity on A platensis
growth
Figs 2 to 4 show that the use of pure CO2 or CO2 from alcoholic fermentation led to
almost coincident cell concentration profiles and Xm values which points out no significant
influence of the CO2 source on A platensis growth These findings which were confirmed by
ANOVA (p 005 Table 2) highlight the feasibility of using such a by-product from
industrial bioethanol production as carbon source for cyanobacteria cultivation
It is well known that when bicarbonate is used for the photosynthetic growth of
microalgae there is a progressive release of OH- in the medium (Goldman et al 1982) thus
222
the pH control is fundamental in processes leading to high cell concentrations As stressed by
Watanabe et al (1995) high alkalinity (pH gt 110) restricts the productivity in the air-lift
photobioreactors using air not supplemented with CO2 In cultivations having high demand of
carbon due to high cell concentrations the addition of CO2 can ensure at the same time
control of pH and suited supply of the carbon source This has been done in the present work
where the culture pH was maintained at 95 plusmn 02 (Saacutenchez-Luna et al 2007) by addition of
CO2 either from a cylinder or from alcoholic fermentation so that the CO2 consumed by the
microorganism was permanently replaced Such a control also allowed maintaining the carbon
source level along the cultivations at a value (around 1208 g L-1
of total carbonate)
practically coincident with that of the medium of Schloumlsser (1982) thus avoiding any carbon
source limitation or accumulation and reducing its cost
In experiments carried out with CO2 from alcoholic fermentation the analysis of
effluent gas by headspace gas chromatography revealed it was mainly made up of CO2 with
only small contents of ethanol and acetaldehyde Despite of this it was not detected any
appreciable concentration of organic volatile compounds in the medium likely because this
microorganism has the enzymes needed to metabolize ethanol or even due to their
condensation in the pipe and consequently no influence of these compounds on A platensis
growth was observed In addition the use of CO2 from alcoholic fermentation did not lead to
any precipitation of salts or flocculation like those observed by Ferraz et al (1985) for A
maxima cultivations in open-ponds using a semi-synthetic medium constituted by malt and
yeast extracts peptone and sucrose
As far as the influence of the nitrogen source on A platensis growth is concerned
urea a classical fertilizer was chosen to substitute the conventional nitrogen sources (KNO3
NaNO3) because of its low cost and because it has been recognized as a promising alternative
nitrogen source in the cultivation of A platensis (Danesi et al 2004 Sassano et al 2007)
223
For a given light intensity and CO2 source no significant difference in growth curves
of cultivations carried out with nitrate (Fig 2) or urea (Figs 3 and 4) as nitrogen source was
observed and the Xm values obtained with both nitrogen sources were statistically coincident
(p 005 Table 2) These results point out the success of the approach of using standard
curves obtained with NaNO3 under non-limited conditions (Fig 2) to foresee the nitrogen
demand of fed-batch A platensis cultivations with urea and confirm the feasibility of using
this cheap nitrogen source
Ammonia and residual urea concentrations during the cultivation (lt 10-4
M) were
always much lower than those considered toxic (10 mM) or even inhibitory for cyanobacteria
growth (17 mM to 2 mM) (Abeliovich and Azov 1976) thereby demonstrating that there
was no accumulation either of ammonia or urea in the medium Since the pH of the culture
(95 plusmn 02) was higher than the pKa of the ammonium (93) this compound was likely
assimilated by simple diffusion and then trapped within the cell cytoplasm by protonation
(Boussiba et al 1984)
Light is the energy source that drives photosynthesis therefore its intensity is an
additional important growth factor which has been often associated with shifts in metabolic
activity (Vonshak et al 2000)
During photoautotrophic growth the amount of light energy received by the
photosynthetic apparatuses determines the amounts of inorganic carbon fixed Xm was
significantly increased (p lt 005 Table 2) by an increase in the light intensity from 60 to 120
micromol photons m-2
s-1
(Figs 2 to 4) whereas it reached a plateau in the range 120-240 micromol
photons m-2
s-1
(Table 3) This result is consistent with the typical behavior of the autotrophic
growth of A platensis (Vonshak et al 2000) which can be depending on I (i) light limited
(ii) light saturated or (iii) light inhibited and whose specific growth rate initially increases
linearly with light intensity then reaches a plateau and finally falls
224
The highest Xm value found in this work was higher than those reported for A
platensis cultivations in minipond (15 g L-1
) (Binaghi et al 2003) and conical tubular
photobioreactor (13 g L-1
) (Watanabe and Hall 1996)
33 Cell productivity
Table 2 shows that cell productivity (PX) was not statistically affected either by the
nitrogen or the CO2 source (p 005) Indeed the almost coincident PX values obtained in
cultures with urea and nitrate were expected by the fact that the amounts employed of the
former nitrogen source under every conditions were always based on the results of the
corresponding runs with nitrate As for Xm also the use of different CO2 sources did not
influence the productivity (p 005 Table 2) as well the cultivation time
On the other hand PX increased by about 45 when increasing the light intensity from
60 to 120 micromol photons m-2
s-1
while Xm increased by only 7 Since the higher the light
intensity the higher the biomass concentration in the middle of runs (Figs 2 to 4) it is likely
that the effect of I is more marked when the overall culture conditions are favorable and there
is some shadowing effect (Vonshak et al 2000) In fact the higher the light intensity the
larger the amount of energy converted into ATP to be utilized for cell growth and
maintenance and then the cells reach more quickly the maximum cell concentration (Vonshak
et al 2000)
This behavior was also observed by Danesi et al (2004) and Rangel-Yagui et al
(2004) in A platensis cultures carried out in miniponds with KNO3 or urea as nitrogen
sources On the other hand the similar PX values obtained at 120 and 240 micromol photons m-2
s-
1 (Table 3) were the likely result of photosaturation or shadowing (Chojnacka and Noworyta
2004 Vonshak et al 2000) as described earlier for Xm
225
Therefore the highest cell productivities were obtained at the highest light intensities
(443 plusmn 20 and 463 plusmn 16 mg L-1
d-1
at I = 120 and 240 micromol photons m-2
s-1
respectively)
irrespective of the nitrogen or CO2 sources used (Table 3) These values are close to that (510
mg L-1
d-1
) obtained by Watanabe et al (1995) who investigated the A platensis growth in
conical helical photobioreactor at 118 μmol photon m-2
s-1
Other studies showed that this parameter reached maximum values of 92 mg L-1
d-1
in
a cylindrical glass tank using urea at 108 μmol photons mndash2
sndash1
(Sassano et al 2007) and 96
mg L-1
d-1
in long minitanks using ammonium chloride at 13 klux (156 μmol photons mndash2
sndash1
)
(Bezerra et al 2008) Since these light intensity thresholds are close to that obtained in this
study the remarkably higher values of PX shown here demonstrate the excellent performance
of the tubular photobioreactor configuration
34 Nitrogen-to-cell conversion factor
The ANOVA statistical analysis indicates a significant effect of the nitrogen source (p
lt 005 Table 2) on the nitrogen-to-cell conversion factor (YXN) whose highest mean values
were achieved in cultures using urea (Table 1) Indeed in these cultures the nitrogen amount
added daily was based on the actual needs for cell growth and maintenance and then its
residual concentration was always lt 10-4
M therefore there was no limitation or excess of
nitrogen during cultivation On the other hand in cultures with nitrate its concentration was
always maintained above 1 g L-1
to avoid any growth limitation (Faintuch 1989) thus
resulting in a YXN decrease
Contrarily no significant effects of CO2 sources and light intensities on YXN (p 005
Table 2) were observed Taking into account that YXN is the ratio between the masses of dry
cell produced and nitrogen added such an observation had to be expected by the fact that the
amount of nitrogen added to the culture is associated to cell growth as stressed above These
results apparently disagree with those obtained by Bezerra et al (2008) and Danesi et al
226
(2004) who observed a YXN increase with light intensity However since those experiments
were carried out using the same amount of nitrogen regardless of the light intensity YXN was
only a function of Xm which was in turn an increasing function of I
The highest YXN value found in this study (138 plusmn 090 mg mg-1
) was remarkably
higher than those reported for urea (74-85 mg mg-1
) (Rangel-Yagui et al 2004) and
ammonium chloride (57 plusmn 017 mg mg-1
) (Bezerra et al 2008) as nitrogen sources in
miniponds because the use in this study of a closed tubular photobioreactor certainly reduced
the nitrogen loss as ammonia by off gassing (Ferreira et al 2010)
4 Conclusions
The results of this work showed that the simultaneous use of two low cost or even no-
cost nutrients (CO2 from alcoholic fermentation and urea) could be an interesting alternative
for A platensis cultivation in tubular photobioreactor The fed-batch cultivation of this
cyanobacterium at 120 μmol photons m-2
s-1
using these nutrients as carbon and nitrogen
sources respectively did in fact provide a maximum cell concentration of 2960 plusmn 35 mg L-1
and a cell productivity of 425 plusmn 59 mg L-1
d-1
The production of A platensis biomass which
is a source of valuable compounds using as carbon source the CO2-rich gaseous emissions
from the alcohol industry may contribute to reduce the release of such a greenhouse gas into
the atmosphere
Acknowledgements
The authors grateful acknowledge the financial support of the Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
Pesquisa do Estado de Satildeo Paulo (FAPESP) Satildeo Paulo Brazil (process no 0654959-3 and
065679-2) and of the Coordenaccedilatildeo de Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior
(CAPES) Brazil (processes n 397808-7 and 0350-112010)
227
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Caption of Figures
Figure 1 Scheme of the photobioreactor employed for fed-batch cultivations of A platensis
(1) Degasser (2) Condenser tube (3) Air pump (4) Rotameter (5) Magnetic stirrer (6)
20W Fluorescent lamps (7) Airlift system
Figure 2 Cell concentration (X mg L-1
) versus time during fed-batch A platensis cultivations
carried out using nitrate and A) CO2 from cylinder or B) gaseous emissions from alcoholic
fermentation at different light intensities (μmol photons m-2
s-1
) 60 (diams) 120 (times) and 240 (+)
The estimated curves are drawn as continuous lines
Figure 3 A) Cell concentration (X mg L-1
) (open symbols) and B) daily urea addition (mM
d-1
) (full symbols) versus time during fed-batch A platensis cultivations carried out using CO2
from cylinder at different light intensities (μmol photons m-2
s-1
) Triangle 60 Square 120
Circle 240
Figure 4 A) Cell concentration (X mg L-1
) (open symbols) and B) daily urea addition
(mM d-1
) (full symbols) versus time during fed-batch A platensis cultivations carried out
using CO2 from alcoholic fermentation at different light intensities (μmol photons m-2
s-1
)
Triangle 60 Square 120 Circle 240
233
Figure 1
234
Figure 2
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg L
-1)
Time (days)
A)
B)
235
Figure 3
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg L
-1)
Time (days)
000
020
040
060
080
100
120
140
160
0 2 4 6 8 10
Time (days)
ure
a ad
dit
ion (
mM
d-1
)
236
Table 1 Maximum cell concentration (Xm) cell productivity (PX) and nitrogen-to-cell
conversion factor (YXN) obtained in fed-batch A platensis cultures carried out at different
light intensities and using different CO2 and nitrogen sources
run
I
(mol m-2
s-1
)a
CO2
source
Nitrogen
source
Xm
(mg L-1
) b
PX
(mg L-1
d-1
) b
YXN
(mg mg-1
) b
1 60 C c NaNO3 2899plusmn17 250plusmn17 42plusmn003
2 60 C Urea 2847plusmn10 245plusmn00 14plusmn000
3 60 A d NaNO3 2789plusmn82 299plusmn10 40plusmn014
4 60 A Urea 2867plusmn28 308plusmn35 14plusmn017
5 120 C NaNO3 3209plusmn109 454plusmn18 45plusmn018
6 120 C Urea 2980plusmn103 408plusmn17 11plusmn050
7 120 A NaNO3 2968plusmn24 428plusmn40 43plusmn004
8 120 A Urea 2952plusmn35 425plusmn59 15plusmn020
9 240 C NaNO3 3291plusmn206 482plusmn34 54plusmn038
10 240 C Urea 3236plusmn72 473plusmn12 13plusmn034
11 240 A NaNO3 3102plusmn130 450plusmn22 50plusmn024
12 240 A Urea 3070plusmn112 445plusmn19 14plusmn056
a I = light intensity
b Values represent means of two experiments and its standard error
c C = cylinder
d A = alcoholic fermentation
237
Table 2 Values of the descriptive level (p) for the maximum cell concentration (Xm) cell
productivity (PX) and nitrogen-to-cell conversion factor (YXN) at different light intensities (60
120 or 240 mol photons m-2
s-1
) and using different sources of CO2 (cylinder or alcoholic
fermentation) and nitrogen (nitrate or urea)
Factors Xm PX YXN
CO2 0225 0256 0351
Light intensity 0000 0000 0700
Nitrogen 0922 0947 0000
238
Table 3 Means values of maximum cell concentration (Xm) and cell productivity (PX)
obtained in fed-batch A platensis cultivations carried out at variable light intensity
Light intensity
(mol photons m-2
s-1
)
Xm
(mg L-1
)
PX
(mg L-1
d-1
)
60 2851plusmn54ordf 306plusmn7a
120 3056plusmn115b 443plusmn20
b
240 3180plusmn96b 463plusmn16
b
Values with the same superscript are not significantly different according to the Tukey test
(p gt 005)
3
Raquel Pedrosa Bezerra
Cultivo descontiacutenuo alimentado de Arthrospira (Spirulina) platensis em
reator tubular utilizando ureacuteia como fonte de nitrogecircnio e CO2 puro ou
proveniente de fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Comissatildeo Julgadora da
Tese para obtenccedilatildeo do grau de doutor
Prof Dr Joatildeo Carlos Monteiro de Carvalho
orientadorpresidente
Prof Dr Attilio Converti Co-orientador
____________________________
1o examinador
____________________________ 2o examinador
____________________________ 3o examinador
Satildeo Paulo de de 2011
4
Agrave minha famiacutelia que eacute a alegria da minha
vida e me incentiva a seguir esse caminho
5
AGRADECIMENTOS
Ao Prof Dr Joatildeo Carlos Monteiro de Carvalho pela orientaccedilatildeo dedicaccedilatildeo
confianccedila amizade incentivo e paciecircncia que recebi durante os 6 anos de
convivecircncia no laboratoacuterio
Ao Prof Dr Attilio Converti pela orientaccedilatildeo apoio e confianccedila principalmente
durante minha estadia na Itaacutelia
Ao Prof Dr Sunao Sato chefe do setor de Tecnologia de Fermentaccedilotildees do
Departamento Bioquiacutemico-Farmacecircutica da Universidade de Satildeo Paulo-Brasil
Ao Prof Dr Adalberto Pessoa Juacutenior Profa Dr Ana Luacutecia Figueiredo Porto e
Prof Dr Adilson de Castro Chaves pela indicaccedilatildeo do laboratoacuterio e confianccedila
depositada em meu trabalho
Agrave FAPESP pelo auxiacutelio financeiro que permitiu a execuccedilatildeo desse trabalho
Agrave CAPES pela oportunidade de realizar o doutorado sanduiche na Itaacutelia
contribuindo para meu desenvolvimento pessoal e cientiacutefico
Aos meus pais Irene V P Bezerra e Adesson P Bezerra a minha irmatilde ao
meu cunhado e ao meu namorado Paulo Claudino Veacuteras pelo incentivo apoio
confianccedila e felicidade durante todo esse tempo
Aos meus amigos pernambucanos Fernanda Borba Eduardo Correia Anne
Priscila Croacutecia e Anabel Helena que mesmo distante sempre me incentivaram e a
minha amiga Ceacutelia Bolognesi pelos conselhos e palavras de conforto nos momentos
difiacuteceis
A todos os amigos Liacutevia Seno Ciacutenthia Hoch Ana Morocho Mayla Rodrigues
pelo apoio e carinho que me proporcionou durante a poacutes-graduaccedilatildeo e em especial a
Marcelo Chuei Matsudo
As secretaacuterias da poacutes-graduaccedilatildeo do Deptordm de Tecnologia Bioquiacutemico-
Farmacecircutico (FCF-USP) pela dedicaccedilatildeo apoio e por estarem sempre disponiacutevel
para ajudar e aos secretaacuterios da poacutes-graduaccedilatildeo Elaine Midori Ychico e Jorge Alves
de Lima
Aos funcionaacuterios da Biblioteca do Conjunto das Quiacutemicas pela atenccedilatildeo e
disponibilidade de ajuda sempre que precisei
6
RESUMO
A cianobacteacuteria fotossintetizante Arthrospira platensis eacute conhecida por apresentar
em sua biomassa altos teores proteacuteicos (50-70) presenccedila do aacutecido graxo essencial -
linolecircnico e diversas outras substacircncias importantes para a alimentaccedilatildeo humana e
animal Esses micro-organismos satildeo capazes de converter o CO2 em biomassa de
grande potencial na aacuterea de alimentos Durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica a produccedilatildeo de
CO2 eacute da mesma ordem de grandeza da produccedilatildeo de etanol e considerando a crescente
demanda interna e externa por esse combustiacutevel seria importante que houvesse um
processo que fixasse esse CO2 transformando-o em um produto que poderia ser uacutetil para
a nossa populaccedilatildeo Adicionalmente o uso de uma fonte de nitrogecircnio de baixo custo
(ureacuteia) em reatores tubulares contribuiria para a reduccedilatildeo do custo de produccedilatildeo da A
platensis O objetivo desse trabalho foi avaliar os paracircmetros cineacuteticos e bioenergeacuteticos
bem como a composiccedilatildeo centesimal da A platensis cultivadas em biorreator tubular
alimentados com CO2 proveniente de fermentaccedilatildeo alcooacutelica ou com utilizaccedilatildeo de CO2 puro
para o controle do pH sob diferentes intensidades luminosas (I) e fontes de nitrogecircnio (N)
adicionadas por meio de processo descontiacutenuo alimentado Os resultados mostraram que
maiores valores de I proporcionaram maiores valores de concentraccedilatildeo celular maacutexima
(Xm) e produtividade em ceacutelulas (Px) mas natildeo influenciaram nos valores do fator de
conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) As diferentes fontes de CO2 natildeo influenciaram
nos valores de Xm Px YXN O uso da ureacuteia aumentou os valores de YXN em relaccedilatildeo aos
cultivos com NO3- Na composiccedilatildeo centesimal pode-se observar que I influenciou nos
teores de clorofila proteiacutenas e lipiacutedios mas natildeo influenciou nos teores de cinzas e
carboidratos na biomassa final Em relaccedilatildeo aos paracircmetros bioenergeacuteticos dos cultivos
com CO2 puro observou-se que os maiores valores de dissipaccedilatildeo de energia de Gibbs
foram obtidos em tempos mais curtos a 120-240 μmol de foacutetons m-2 s-1
independentemente do N selecionado enquanto que o nuacutemero de moles de foacutetons
absorvidos pelas ceacutelulas para produzir um C-mol de biomassa foi maior nas culturas com
NO3- independentemente do I As fraccedilotildees da energia direcionada para a siacutentese de ATP e
fixada pela ceacutelula foram superiores em culturas com ureacuteia quando comparadas com as
culturas com NO3- que se revelou uma fonte de nitrogecircnio capaz de sustentar o
crescimento energicamente da A platensis
Palavras chaves Arthrospira platensis processo descontiacutenuo alimentado ureacuteia
intensidade luminosa dioacutexido de carbono fermentaccedilatildeo alcooacutelica bioenergeacutetica
7
ABSTRACT
Photosynthetic cyanobacterium A platensis contains in its biomass high protein
content (50-70) -linolenic acid and many other substances important for health
human These microorganisms are capable of converting CO2 into biomass of great
potential in the food industry During the alcoholic fermentation the production of
CO2 has the same magnitude of the production of ethanol Considering the
increasingly global demand for this fuel a process to fix this CO2 is of utmost
importance Furthermore the use of low cost nitrogen source (urea) in tubular
reactors would contribute to reducing the production cost of A platensis Therefore
the purpose of this work was to evaluate the kinetic and bioenergetics parameters as
well as the chemical composition of biomass obtained in A platensis cultures in
tubular bioreactor using CO2 from alcoholic fermentation or pure CO2 to control the
pH under different light intensity (I) and nitrogen sources (N) The results showed that
higher I induced higher maximum cell concentration (Xm) and cell productivity (Px)
values but it did not exert any influence on the nitrogen-cell conversion factor (YXN)
Urea increased the YXN values compared to use of NO3- In the centesimal
composition of biomass it can be observed that I influenced the chlorophyll protein
and lipid contents but not influenced the carbohydrate and ash contents For
bioenergetics parameters it was observed that the highest Gibbs energy dissipation
values for cell growth and maintenance were obtained in shorter time at 120-240
micromol photons m-2 s-1 in both nitrogen sources while the moles of photons absorbed
by the system to produce one C-mol biomass was higher in cultures with NO3- The
highest values of the molar production of O2 and consumption of H+ were obtained at
the highest I values using NO3- The estimated percentages of the energy absorbed
by the cell showed that compared with nitrate the use of urea as nitrogen source
allowed the system to address higher fractions to ATP production and light fixation by
the photosynthetic apparatus as well as a lower fraction released as heat Thanks to
this better bioenergetic situation urea appears to be a quite promising low-cost
alternative nitrogen source for A platensis cultures in photobioreactors
Key words Arthrospira platensis fed batch urea light intensity carbon dioxide
alcoholic fermentation bioenergetic
8
RIASSUNTO
Il cianobatterio fotosintetici Arthrospira platensis ha un alto contenuto di proteine (50-
70) presenza di acidi grassi essenziali come l‟acido -linolenico e altre sostanze
importanti per l‟alimentazione umana ed animale Questi microrganismi convertono CO2 in
biomassa di grande potenzialitagrave nellindustria alimentare Durante la fermentazione
alcolica la produzione di CO2 egrave dello stesso ordine di grandezza della produzione di
etanolo e in considerazione alla crescente necessitagrave interna ed europeo per questo
combustibile sarebbe importante lo svilupo di un processo che fissasse questo CO2
transformandolo in un prodotto che potrebbe essere utile per la nostra popolazione
Inoltre luso di una fonte di azoto a basso costo (urea) in reattori tubolari contribuirebbe a
ridurre il costo di produzione di A platensis Lobiettivo di questo studio egrave di valutare i
parametri cinetici bioenergetiche e la composizione della biomassa ottenuta in colture di
A platensis in bioreattori tubolare alimentato con CO2 puro di cilindro o con CO2 della
fermentazione alcolica per il controllo del pH in diverse intensitagrave di luce (I) e fonti di azoto
(N) usando il processo discontinuo alimentato I risultati hanno dimostrato che valori piugrave
alti di I fornire i piugrave alti valori di concentrazione massima delle cellule (Xm) e la produttivitagrave
delle cellule (Px) ma non influenza i valori del fattore di conversione di azoto nelle cellule
(YXN) Luso di urea come fonte di azoto aumentato i valori di YXN rispetto alle culture con
NO3- La composizione chimica di biomassa puograve osservare che I ha influenzato la
percentuale di clorofilla proteine e lipidi ma non ha influenzato la percentuale di
carboidrati e cenere nella biomassa finale In relazioni ai parametri bioenergetici dei cultivi
usando CO2 di cilindri abbiamo osservato che i piugrave alti valori di dissipazione di energia di
Gibbs per la crescita cellulare e la manutenzione sono stati ottenuti in tempo piugrave brevi nel
120-240 μmol di fotoni m-2 s-1 per entrambe le fonti di N mentre il numero di moli di fotoni
assorbiti dalle cellule por produrre una biomassa C-mol era maggiore nelle culture con
NO3- a prescindere dalla I I valori piugrave alti della produzione molare di O2 e il consumo di H+
sono stati ottenuti con valori piugrave alti di I coltivati con NO3- Le frazioni di energia per la
sintese di ATP e fissato per la cellula erano piugrave alti nelle culture con urea che nelle culture
con NO3- che si egrave rivelata una fonte di azoto in grado di sostenere la crescita di A
platensis
Parole chiave Arthrospira platensis processo discontinuo alimentato urea intensitagrave
luminosa anidride carbonica fermentazione alcolica bioenergetica
9
Lista de graacuteficos
Graacutefico 1 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular de A
platensis 73
Graacutefico 2 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia
Graacutefico 3 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo de clorofila a 77
Graacutefico 4 Logariacutetmico da concentraccedilatildeo celular em funccedilatildeo do tempo 88
Graacutefico 5 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 01 h-1 88
Graacutefico 6 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) Etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 005 h-1 89
Graacutefico 7 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) Etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 0025 h-1 89
Graacutefico 8 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 1 93
Graacutefico 9 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 2 (60 mol de foacutetons m-2 s-1) 94
Graacutefico 10 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 2 95
Graacutefico 11 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 3 96
Graacutefico 12 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 4 (120 mol de foacutetons m-2 s-1) 97
Graacutefico 13 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 4 98
Graacutefico 14 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 5 99
Graacutefico 15 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 6 (120 mol de foacutetons m-2 s-1) 100
Graacutefico 16 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 6 101
Graacutefico 17 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 7 102
Graacutefico 18 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 8 (120 mol de foacutetons m-2 s-1) 103
Graacutefico 19 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 8 104
Graacutefico 20 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 9 105
Graacutefico 21 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 10 (240mol de foacutetons m-2 s-1) 106
Graacutefico 22 concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 10 107
10
Graacutefico 23 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 11 108
Graacutefico 24 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 12 (240 mol de foacutetons m-2 s-1) 109
Graacutefico 25 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 12 110
Graacutefico 26 Energia de Gibbs de dissipaccedilatildeo durante o cultivo de A platensis
intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 ( ) 120 () 240
Fonte de nitrogecircnio nitrato (siacutembolo aberto) ureacuteia (siacutembolo fechado) 144
Graacutefico 27 Influecircncia da velocidade especiacutefica de crescimento da A platensis sobre
o nuacutemero de moles de foacutetons absorvido para produzir 1 C-mol de biomassa em
diferentes condiccedilotildees de cultivo () Composiccedilatildeo elementar da biomass descrita por
Cornet et al (1992) PPFD = 60 μmol de foacutetons m-2 s-1 Composiccedilatildeo elementar da
biomass determinada experimentalmente PPFD (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60
() 120 () 240 Fonte de nitrogecircnio nitrato (siacutembolos abertos) ureacuteia
(siacutembolos fechados) 147
Graacutefico 28 Produccedilatildeo molar de O2 (siacutembolo fechado) e consumo de H+ (siacutembolo
aberto) em funccedilatildeo do tempo em diferentes condiccedilotildees de cultivo Intensidades
luminosas (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 () 120 () 240 Fonte de
nitrogecircnio nitrato (linha rachurada) ureacuteia (linha contiacutenua) 149
Graacutefico 29 Energia total de Gibbs absorvida pelo aparato fotossinteacutetico (siacutembolo
fechado) (ΔGa) e energia transformada em ATP (siacutembolo aberto) (ΔGATP) durante o
cultivo da A platensis intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 (
) 120 () 240 Fonte de nitrogecircnio nitrato (linha tracejada) ureacuteia (linha
continua) 150
Graacutefico 30 Energia fixada pelo aparato fotossinteacutetico (siacutembolo fechado) (ΔH) e
energia liberada como calor (siacutembolo aberto) (Q) durante o cultivo de A platensis
intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 ( ) 120 () 240
Fonte de nitrogecircnio nitrato (linha rachurada) ureacuteia (linha contiacutenua) 151
Graacutefico 31 Porcentagem na distribuiccedilatildeo da energia luminosa absorvida durante o
cultivo de A platensis usando nitrato (siacutembolo fechado) e ureacuteia (siacutembolo aberto)
como fonte de nitrogecircnio Energia fixada pelos fotossistemas () energia
transformada em ATP () energia liberada como calor ( ) 152
Graacutefico 32 Concentraccedilatildeo celular nas duas diferentes configuraccedilotildees dos
fotobiorreatores tubulares ( ) horizontal e ( loz ) espiralado 153
11
Lista de Figuras
Figura 1 Spirulina platensis (UTEX 1926) 22
Figura 2 Principais rotas de assimilaccedilatildeo de nitrogecircnio em cianobacteacuterias cultivas em
pH acima de 92 35
Figura 3 Complexos fotossinteacuteticos em membranas tilacoacuteides 42
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do fotossistema 43
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da fase fotoquiacutemica 44
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da moleacutecula da clorofila a 48
Figura 7 Fotobiorreator tubular horizontal utilizado no cultivo de A platensis 67
Figura 8 Fotobiorreator tubular espiralado utilizado no cultivo de A platensis 68
12
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Produtores representativos de Spirulina 23
Tabela 2 - Planejamento experimental 84
Tabela 3 - Valores da concentraccedilatildeo celular meacutedias e desvio padratildeo em massa
seca obtidas a partir do melaccedilo natildeo clarificado e do melaccedilo clarificado 86
Tabela 4 - Variaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de leveduras em funccedilatildeo do tempo 87
Tabela 5 - Valores de XP ART Etanol e Rendimento do processo no regime
permanente para os diferentes valores de D com ART inicial de 170 gL-1 91
Tabela 6 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de carbonato
total referentes ao experimento 1 93
Tabela 7 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 2 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -44554x3 + 54865x2 + 14317x + 400 (60 mol de foacutetons
m-2 s-1) 94
Tabela 8 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 2 95
Tabela 9 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de carbonato
total referentes ao experimento 3 96
Tabela 10 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 4 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -20689x3 + 11591x2 + 33292x + 400 (60 mol de foacutetons
m-2 s-1) 97
Tabela 11 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 4 98
Tabela 12 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 5 99
Tabela 13 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 6 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -13286x3 + 14486x2 + 62226x + 400 (120 mol de
foacutetons m-2 s-1) 100
Tabela 14 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 6 101
Tabela 15 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 7 102
13
Tabela 16 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 8 de
acordo com a y = - 58128x3 + 38625x2 + 38606x + 400 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
103
Tabela 17 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 8 104
Tabela 18 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 9 105
Tabela 19 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 10
de acordo com a equaccedilatildeo y = -12057x3 + 10082x2 + 31899x + 400 (240 mol de
foacutetons m-2 s-1) 106
Tabela 20 - Valores meacutedios de concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 10 107
Tabela 21 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 11 108
Tabela 22 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 12
de acordo com a equaccedilatildeo y = -82763x3 + 62437x2 + 37265x + 400 (240 mol de
foacutetons m-2 s-1) 109
Tabela 23 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amonia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 12 110
Tabela 24 - Valores da concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) produtividade em ceacutelulas
(Px) e fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) com diferentes fontes de
CO2 fontes de nitrogecircnio e intensidades luminosas 119
Tabela 25 - Anaacutelise de variacircncia para a concentraccedilatildeo celular maacutexima 120
Tabela 26 - Meacutedias da concentraccedilatildeo celular maacutexima para a variaacutevel independente
fonte de nitrogecircnio 120
Tabela 27 - Meacutedias da concentraccedilatildeo celular maacutexima para a variaacutevel independente
intensidade luminosa 121
Tabela 28 - Anaacutelise de variacircncia para a produtividade em ceacutelulas 122
Tabela 29 - Meacutedias da produtividade em ceacutelulas para a variaacutevel independente fonte
de nitrogecircnio 123
Tabela 30 - Meacutedias da produtividade em ceacutelulas para a variaacutevel independente
intensidade luminosa 123
Tabela 31 - Anaacutelise de variacircncia para fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas
126
14
Tabela 32 - Meacutedias do fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas para a variaacutevel
independente fonte de nitrogecircnio 127
Tabela 33 - Meacutedias do fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas para a variaacutevel
independente intensidade luminosa 128
Tabela 34 - Concentraccedilatildeo de clorofila na biomassa final obtida nos experimentos
com o pH controlado com CO2 de cilindro 129
Tabela 35 - Anaacutelise de variacircncia para a concentraccedilatildeo de clorofila na biomassa final
130
Tabela 36 - Porcentagem de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos e cinzas na biomassa
seca final 134
Tabela 37 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de proteiacutena na biomassa final 136
Tabela 38 - Meacutedias do teor de proteiacutena na biomassa final para a variaacutevel
independente intensidade luminosa 136
Tabela 39 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de lipiacutedio na biomassa seca final 138
Tabela 40 - Meacutedias do teor de lipiacutedio na biomassa final para a variaacutevel independente
fonte de nitrogecircnio 138
Tabela 41 - Meacutedias do teor de lipiacutedio na biomassa final para a variaacutevel independente
intensidade luminosa 138
Tabela 42 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de carboidratos na biomassa seca final
141
Tabela 43 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de cinzas na biomassa seca final 142
Tabela 44 - Coeficientes estequiomeacutetricos estimados atraveacutes dos balanccedilos de
materiais de carbono nitrogecircnio oxigecircnio enxofre carga e grau de reduccedilatildeo da
biomassa cultivada em fotobiorreator tubular horizontal utilizando nitrato ou ureacuteia
como fontes de nitrogecircnio 145
15
Lista de abreviaturas e siglas
ART Accediluacutecares redutores totais
VOCs Compostos volaacuteteis orgacircnicos
C Carbono
N Nitrogecircnio
S Enxofre
O Oxigecircnio
H Hidrogecircnio
I Intensidade Luminosa
Ef Concentraccedilatildeo de etanol (g L-1)
fc Fraccedilatildeo em massa do carbono na biomassa seca (g g-1)
fi Fraccedilatildeo em massa do aacutetomo i na biomassa seca (g g-1)
Nt quantidade total de nitrogecircnio adicionado (mg)
Petanol Produtividade em etanol (g L h-1)
PX Produtividade em ceacutelulas (mg L-1 d -1)
Tc Tempo de cultivo (dias)
V Volume do meio (L)
Xi Concentraccedilatildeo celular inicial (mg L-1)
Xm Concentraccedilatildeo celular maacutexima obtida (mg L-1)
XP Meacutedias dos valores de concentraccedilotildees celulares ao longo do regime
permanente
YXN Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (mg mg-1)
Cl Clorofila a
GS glutamina sintetase
GOGAT glutamate sintase
FSII Fotossistema II
FSI Fotossistema I
16
Lista de siacutembolos
max
GXY Rendimento maacuteximo teoacuterico de biomassa sobre a energia de Gibbs
Velocidade especiacutefica de crescimento
1YGX Energia de Gibbs para o crescimento e manutenccedilatildeo celular
c Velocidade da luz (299108 m s-1)
D Vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo (h-1)
h Constante de Planck (662610-34 J)
mG Energia de Gibbs dissipada para a manutenccedilatildeo celular
MMc Massa molar do aacutetomo do carbono (g C-mol-1)
MMi Massa molar do aacutetomo i (g C-mol-1)
NA nuacutemero de Avogadro (6022 x 1023 foacutetons de Einstein -1)
nPh nuacutemero de foacutetons
Q Energia de Gibbs liberada como calor
qH+ Consumo molar de H+
qO2 Produccedilatildeo molar de O2
ΔGa Energia total de Gibbs absorvida pela fotossiacutentese
ΔGATP Energia de Gibbs transformada em ATP
ΔgPh Energia de Gibbs contida em 1 Einsten de foacuteton
ΔH Energia fixada pelos fotosistemas
η Rendimento do processo em etanol ()
λ Comprimento de onda
17
Sumaacuterio
1 Introduccedilatildeo 20
2 Revisatildeo bibliograacutefica 22
21 Caracteriacutesticas da A platensis22
22 Fotobiorreatores26
23 Processos de cultivo em fotobiorreatores31
24 Nutrientes para o crescimento da A platensis 33
241 Fontes de Nitrogecircnio33
242 Intensidade luminosa41
2421 Pigmentos 46
243 Fontes de carbono 50
2431 Fonte de carbono orgacircnico (Crescimento hetorotroacutefico) 50
2432 Fonte de carbono inorgacircnico (Crescimento autotroacutefico) 51
2433 Fonte de carbono inorgacircnico e orgacircnico simultaneamente (Crescimento
mixotroacuteficos) 54
3 Objetivos61
4 Materiais e meacutetodos 62
41 Fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua62
411 Testes preliminares para emprego da fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
62
4111 Teste para avaliar a influecircncia do tratamento do melaccedilo na determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo celular62
41111 Melaccedilo natildeo tratado62
41112 Melaccedilo tratado 62
41113 Preparaccedilatildeo do melaccedilo63
4112 Teste para avaliar a homogeneidade do reator 63
4113 Teste para determinar a vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo 63
412 Micro-organismo e condiccedilotildees de manutenccedilatildeo63
413 Preparo do inoacuteculo64
414 Dispositivo para a cultura 64
415 Descriccedilatildeo das condiccedilotildees de fermentaccedilatildeo contiacutenua64
42 Cultivo de A platensis65
421 Micro-organismo e manutenccedilatildeo 65
18
422 Meio de cultivo65
4221 Meio padratildeo para cultivo de A platensis 65
4222 Meio modificado66
423 Preparo do inoacuteculo66
424 Dispositivo da cultura67
4241 Fotobiorreator tubular horizontal67
4242 Fotobiorreator tubular espiralado68
425 Descriccedilatildeo de um experimento tiacutepico de cultivo da A platensis68
43 Teacutecnicas Analiacuteticas69
431 Acompanhamento da fermentaccedilatildeo alcooacutelica70
4311 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular70
4312 Determinaccedilatildeo do pH70
4313 Determinaccedilatildeo de ART70
4314 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol71
4315 Determinaccedilatildeo dos componentes volaacuteteis presentes no gaacutes efluente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua72
432 Acompanhamento do cultivo de A platensis72
4321 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular 72
43211 Densidade oacutetica 72
43212 Construccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo 73
4322 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de carbonato total 73
4323 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia total74
4324 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia75
4325 Determinaccedilatildeo do pH76
4326 Determinaccedilatildeo de nitrato76
4327 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol76
433 Avaliaccedilatildeo da biomassa de A platensis obtida no final do cultivo76
4331 Determinaccedilatildeo de Clorofila a 76
43311 Curva de calibraccedilatildeo para a determinaccedilatildeo de Clorofila a 77
4332 Determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal 77
43321 Proteiacutenas totais78
43322 Lipiacutedios totais78
43323 Cinzas78
43324 Carboidratos totais 79
19
434 Avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo elementar 79
4341 Determinaccedilatildeo de CNHS 79
4342 Determinaccedilatildeo de oxigecircnio 79
44 Caacutelculos 79
441 Produtividade em etanol no regime permanente 79
442 Rendimento do etanol no regime permanente 80
443 Produtividade em ceacutelulas nos cultivos de A platensis 80
444 Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas nos cultivos de A
platensis 80
445 Coeficientes atocircmicos para 1 C-mol de biomassa 81
446 Grau de reduccedilatildeo da biomassa82
45 Teoria dos paracircmetros bioenergeacuteticos 82
5 Planejamento experimental84
6 Resultados e discussotildees85
61 Testes preliminares para a realizaccedilatildeo da fermentaccedilatildeo alcooacutelica 85
611 Avaliaccedilatildeo da influecircncia da clarificaccedilatildeo do melaccedilo na determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo celular 86
612 Teste de homogeneidade do reator87
613 Avaliaccedilatildeo de diferentes vazotildees especiacuteficas de alimentaccedilatildeo (D) 88
614 Avaliaccedilatildeo dos volaacuteteis orgacircnicos no gaacutes de arraste92
62 Avaliaccedilatildeo do crescimento da A platensis 93
63 Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) Produtividade em
ceacutelulas (Px) e Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas
(YXN) 119
631 Concentraccedilatildeo celular maacutexima 119
632 Produtividade volumeacutetrica de ceacutelulas 122
633 Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas 125
64 Avaliaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de clorofila a 129
65 Avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal 134
66 Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros bioenergeacuteticos 143
67 Comparaccedilatildeo entre os fotobiorreatores 153
7 Conclusotildees 154
20
1 Introduccedilatildeo
O interesse na produccedilatildeo comercial da Spirulina sp eacute devido a algumas
propriedades particulares como alta digestibilidade menor concentraccedilatildeo de aacutecidos
nucleacuteicos teores de proteiacutenas elevados (50-70 da massa seca) e importacircncia
quantitativa de aminoaacutecidos essenciais Na sua biomassa encontram-se tambeacutem
pigmentos como a clorofila ficocianina e -caroteno aacutecidos graxos essenciais como
γ-linolecircnico o qual possui efeito terapecircutico em humanos (BELAY OTA 1994)
vitaminas e antioxidantes (PULZ SCHEIBENBOGEN 1998)
Tradicionalmente a Spirulina (Arthrospira) eacute cultivada autotroficamente na
presenccedila de altos niacuteveis de carbonatos e bicarbonatos como fontes de carbono por
serem de baixo custo e proporcionarem pH elevado no meio No entanto Spirulina
ssp tambeacutem podem crescer em condiccedilotildees mixotroacuteficas podendo apresentar uma
produtividade maior quando comparadas a cultivos fotoautotroacuteficos ou heterotroacuteficos
(OGBONNA et al 2000)
Em condiccedilotildees mixotroacuteficas eou fotoautotroacuteficas a intensidade luminosa eacute um
fator importante no crescimento celular da A platensis Baixas intensidades
luminosas podem limitar o crescimento celular Por outro lado altas intensidades
luminosas podem inibir o crescimento celular devido ao fenocircmeno de fotoinibiccedilatildeo
Por isso esse eacute um fator que deve ser controlado em cultivos de micro-organismos
fotossintetizantes
O pH do meio de cultivo eacute um outro fator no cultivo de micro-organismos O pH
determina a solubilidade do dioacutexido de carbono e minerais no meio de cultura e
influencia diretamente ou indiretamente no metabolismo dos micro-organismos
fotossintetizantes Durante o cultivo autotroacutefico da Spirulina sp ocorre um raacutepido
aumento do pH no meio de cultura o que pode atuar como um autoinibidor do
crescimento celular (RICHMOND 2000) e portanto o CO2 pode ser utilizado para a
manutenccedilatildeo do pH oacutetimo
A biofixaccedilatildeo do CO2 pelas microalgas estatildeo entre os meacutetodos bioloacutegicos mais
produtivos no tratamento de emissotildees de resiacuteduos industriais e o rendimento da
biomassa por hectare eacute maior quando comparadas a plantaccedilotildees na agricultura
(LAW BERNING 1991 AKIMOTO et al 1994) O uso direto dos resiacuteduos volaacuteteis
reduz os custos de preacute-tratamento mas a alta concentraccedilatildeo de CO2 pode inibir o
crescimento de cianobacteacuterias e microalgas No entanto alguns autores tecircm
21
recentemente relatado o isolamento de cianobacteacuterias e microalgas tolerantes a
altas concentraccedilotildees de CO2 e capazes de fixar esse gaacutes tais como Chlorella
Spirulina e Scenedesmus (CHANG et al 2003 WATANABE HALL 1995a
HANAGATA et al 1992) Cyanidium cladarium (AKIMOTO et al 1994)
Aleacutem do CO2 a fonte de nitrogecircnio tambeacutem eacute um fator determinante no cultivo
uma vez que este nutriente eacute utilizado principalmente para constituir proteiacutenas e
aacutecidos nucleacuteicos fundamentais para a manutenccedilatildeo e crescimento celular
(WATANABE HALL 1996) O meio de cultura convencional para a obtenccedilatildeo da S
platensis utiliza sais de nitrato como fonte de nitrogecircnio como por exemplo nitrato
de potaacutessio e nitrato de soacutedio Ureacuteia (DANESI et al 2002 SOLETTO et al 2005) e
sais de amocircnio (CARVALHO et al 2004 SOLETTO et al 2005) tecircm sido
pesquisadas como fontes alternativas de nitrogecircnio para o cultivo de S platensis
No caso de fontes de nitrogecircnio amoniacais o emprego dos reatores tubulares
pode ser considerado como uma vantagem por favorecer baixa perda de amocircnia
por volatilizaccedilatildeo reduzindo a necessidade de adiccedilatildeo de fonte de nitrogecircnio como
consequumlente reduccedilatildeo do custo de produccedilatildeo Assim pode-se concluir que os
esforccedilos em melhoria de condiccedilotildees de cultivo de A platensis natildeo sejam apenas
utilizando reatores abertos mas tambeacutem reatores fechados dentre os quais os
tubulares
O dioacutexido de carbono e os compostos volaacuteteis orgacircnicos (CVOs) de
fermentaccedilatildeo alcooacutelica podem ser utilizados como fontes de carbono no cultivo de A
platensis Durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica industrial toneladas de CO2 etanol e em
menor quantidade alguns CVOs satildeo liberados para a atmosfera como resiacuteduos No
entanto esses compostos podem ser reaproveitados como uma fonte de nutriente
juntamente como uma fonte de nitrogecircnio de baixo custo (ureacuteia) para o
desenvolvimento da A platensis que por sua vez permite a produccedilatildeo de
componentes com alto valor agregado e com menor custo de produccedilatildeo industrial
22
2 Revisatildeo bibliograacutefica
21 Caracteriacutesticas da A platensis
Arthrospira platensis eacute uma cianobacteacuteria filamentosa fotossintetizante
pertencente da ordem Oscillatoriales famiacutelia Cyanophyceae gecircnero Arthrospira
espeacutecie platensis Satildeo caracterizadas por tricomas ciliacutendricos multicelulares com
formas espiraladas (Figura 1) Estes possuem comprimentos de aproximadamente
500 μm e diacircmetro variando de 6-12 μm mas dependendo das condiccedilotildees de cultivo
podem adquirir morfologias diferentes Os filamentos natildeo possuem ramificaccedilotildees
nem heterocistos (TOMASELLI 1997)
Figura 1 Spirulina platensis (UTEX 1926) Fonte Universidade do Texas 2006
Arthrospira pode controlar sua flutuabilidade com vesiacuteculas gasosas para
receber a incidecircncia luminosa oacutetima para a fotossiacutentese Essas ceacutelulas podem
tambeacutem excretrar polissacariacutedeos extracelulares para formar agregados flutuantes
um fato que facilita sua recuperaccedilatildeo em lagos naturais e culturas outdoors (MATA
2007) Aleacutem disso devido a sua morfologia taxa de crescimento celular
relativamente alta e a caracteriacutestica das ceacutelulas se agregarem o custo operacional
para a recuperaccedilatildeo da biomassa eacute reduzido tornando-a economicamente viaacutevel
para a produccedilatildeo industrial (MATA 2007)
A Arthrospira sp eacute comercializada de forma inadequada com o nome de
Spirulina (GARRITY et al 2001) Atualmente a Arthrospira sp eacute produzida em
diferentes paiacuteses e sua produccedilatildeo mundial pode exceder 3000 toneladas
(SHIMAMATSU 2004) Na Tabela 1 estatildeo descritos algumas induacutestrias produtoras
de Spirulina (Arthrospira) sp e seu respectivo paiacutes
23
Tabela 1 - Produtores representativos de Spirulina
Induacutestria Paiacutesterritoacuterio
Spirulina Mexicana (Sosa Texcoco) SA
Meacutexico a
Siam Algae Co Ltd Thailand
Earthrise Farms USA
Cyanotech Corporation USA
Nan Pao Resins Chemical Co Ltd Taiwan
Far East Microalgae Co Ltd Taiwan
Parry Agro Industries Ltd (Parry Nutraceuticals)
Iacutendia
Yunnan Spirin Co Ltd Mainland China
Fonte Shimamatsu 2004 a Essa induacutestria faliu por volta do ano de 1990 (LEE 1997)
A biomassa da Spirulina sp eacute comercializada principalmente como alimentos
para seres humanos e animais devido a sua composiccedilatildeo quiacutemica A seguranccedila
como alimento tem sido estabelecida por seacuteculos atraveacutes do consumo pelos seres
humanos e pelos nuacutemerosos estudos toxicoloacutegicos (CHAMORRO et al 2002)
Na China em 1997 existiam cerca de 80 produtores de Spirulina com
produccedilatildeo anual variando de 3 a 500 toneladas A maioria dos produtores se
localizava no sul devido agrave vantagem de possuir verotildees longos e clima temperado
(LEE 1997) O maior produtor mundial de Arthrospira eacute Hainan Simai Enterprising
que estaacute localizado na provincia de Hainan na China Essa companhia tem uma
produccedilatildeo anual de 200 toneladas (SPOLAORE et al 2006) No Japatildeo de acordo
com Healfh Industry News a quantidade total de Spirulina comercializada foi de 400
toneladas em 1996 Em Taiwan 5 induacutestrias produzem um total de 480 toneladas
Na Tailacircndia os dois maiores produtores de Spirulina (Siam Algae Co Ltd e
Neotech Food Co Ltd) produzem 150 toneladas e 20 toneladas por ano
respectivamente Nos Estados Unidos a Cyanotech e a Earthrise Farms satildeo os dois
maiores produtores de Spirulina com produccedilatildeo de 380 toneladas e 500 toneladas
respectivamente Aleacutem dessas induacutestrias citadas acima existem outras produtoras
de Spirulina com uma produccedilatildeo anual menor em diversos paiacuteses como Chile Cuba
Filipinas Iacutendia (LEE 1997)
O potencial dessas cianobacteacuterias como um alimento baacutesico na dieta humana
tem sido investigado haacute muitos anos em diversos paiacuteses No Japatildeo a biomassa
24
algal (por exemplo Chlorella e Spirulina) eacute produzida comercialmente sendo
utilizada primeiramente como alimentos nutracecircuticos ou funcionais (OGBONNA
TANAKA 1997 BOROWITZKA 1986) Na China Spirulina and Chlorella satildeo os
dois maiores gecircneros cultivado na forma de biomassa ou extrato para a induacutestria
alimentiacutecia A biomassa eacute usada para produzir uma variedade de produtos
nutracecircuticos ou funcionais como tabletes caacutepsulas poacute ou para extraccedilatildeo de
ingredientes bioativos como β-caroteno e ficocianina A biomassa eacute suplementada
em patildees biscoitos doces sorvetes e o extrato satildeo suplementados em bebidas
como refrigerantes e chaacute principalmente para realccedilar seu valor nutritivo (LIANG et
al 2004)
Uma ampla variedade de pigmentos como clorofila a (Cl a) luteiacutena -caroteno
ficocianina (PC) e aloficocianina (APC) satildeo compostos bioativos na biomassa de S
platensis e tem sido usado como corantes naturais em alimentos em cosmeacuteticos e
como produtos farmacecircuticos no consumo humano e animal (CHEN et al 2006) O
efeito nocivo de corantes sinteacuteticos e a tendecircncia da sociedade utilizar produtos
naturais na alimentaccedilatildeo e cosmeacuteticos tecircm conduzido agrave exploraccedilatildeo das microalgas
como corantes naturais Esses pigmentos tecircm um grande valor comercial como
corantes naturais em induacutestrias nutracecircuticas cosmeacuteticas e farmacecircuticas
(PRASANNA et al 2007)
Recentemente a importacircncia de se estudar esses micro-organismos eacute devido
as suas propriedades terapecircuticas (BELAY et al 1993) e presenccedila de compostos
antioxidantes (ESTRADA et al 2001 MIRANDA et al 1998) Essas propriedades
tecircm sido provadas experimentalmente in vivo e in vitro que satildeo efetivas para o
tratamento de algumas alergias anemia doenccedilas virais e cardiovasculares
hiperglicemia hiperlipidemia processos inflamatoacuterios entre outros (CHAMORRO et
al 2002 BELAY et al 2002)
Essa cianobacteacuteria possui alto teor proteacuteico com importacircncia quantitativa dos
aminoaacutecidos essenciais e outros elementos nutricionais proporcionando seu alto
valor nutricional (MORIST et al 2001) Baixos teores de aacutecidos nucleacuteicos altos
conteuacutedos de vitaminas polissacariacutedeos e aacutecidos graxos essenciais como ocircmega-3
e ocircmega-6 satildeo paracircmetros importantes para avaliar a qualidade da biomassa algal
(OGBONNA TANAKA 1997 BOROWTIZKA 1986) Os polissacariacutedeos que
constituem a parede celular tecircm uma digestibilidade de 86 o que torna a biomassa
facilmente absorvida pelo corpo humano (LI 1997)
25
Haacute relatos tambeacutem do emprego da Arthrospira em cosmeacuteticos um extrato rico
em proteiacutenas feitos a partir da Arthrospira repara sinais de envelhecimento da pele
mais cedo exerce um efeito de firmeza e previne a formaccedilatildeo de estrias (Protulinesreg
Exsymol SAM Monaco) (SPOLAORE et al 2006)
Aleacutem da presenccedila dos compostos citados anteriomente a biomassa de
Spirulina tambeacutem pode ser utilizada no tratamento de aacuteguas residuais renovaccedilatildeo da
aacutegua atraveacutes da desintoxificaccedilatildeo bioloacutegica e remoccedilatildeo de metais pesados Por ser
um micro-organismo fotossintetizante tem a capacidade natildeo apenas de produzir
oxigecircnio mas tambeacutem de remover nutrientes como nitrogecircnio e foacutesforo reduzindo a
eutrofizaccedilatildeo dos efluentes Essa biomassa pode ser recuperada e utilizada para
extrair compostos de interesse industrial como por exemplo pigmentos e o restante
da biomassa pode ainda ser utilizado como combustiacutevel ou para produccedilatildeo de
metano (CIFERRI TIBONI 1985)
O cultivo de microalgas e cianobacteacuterias fornecem excelente perspectivas para
a produccedilatildeo de energia renovaacutevel podendo contribuir substancialmente para uma
reduccedilatildeo de emissotildees do CO2 Essas emissotildees satildeo resultados do processo de
queima dos combustiacuteveis foacutesseis e de praacuteticas agriacutecolas improacuteprias (as queimadas
por exemplo) produzindo elevados rendimentos da biomassa e possibilitando a
produccedilatildeo de compostos com alto valor agregado e biocombustiacutevel (CHISTI 2007
RICHMOND 1990)
As microalgas tecircm sido propostas como mateacuteria-prima para a produccedilatildeo de
biocombustiacuteveis devido ao alto teor de lipiacutedios que algumas espeacutecies podem
alcanccedilar O teor de oacuteleo de 20 a 50 de sua biomassa seca eacute comum entre as
espeacutecies como Nannochloropsis sp Chlorella sp Schizochytrium sp Algumas
microalgas podem exceder a 80 (MIAO 2006 CHISTI 2007 BANERJEE et al
2002) O percentual de lipiacutedios na biomassa de microalgas eacute funccedilatildeo das condiccedilotildees
de cultivo tais como salinidade do meio concentraccedilatildeo de nitrogecircnio natureza da
fonte de carbono assim eacute possiacutevel com certa facilidade e com tempo de resposta
relativamente curto aumentar o teor de oacuteleo nas microalgas de forma a alcanccedilar
valores bastante expressivos (CHISTI 2007)
As principais vantagens para a utilizaccedilatildeo de microalgas como biocombustiacuteveis
satildeo alta eficiecircncia de conversatildeo de foacutetons (como evidenciada pelo aumento do
rendimento da biomasa por hectare) podem ser coletados em lotes durante quase
todo o ano pode utilizar sais e aacutegua residuaacuteria reduzindo extremamente o uso de
26
aacutegua doce produz biocombustiacutevel altamente biodegradaacutevel e natildeo toacutexico podem ser
usado o CO2 liberado pela queima de combustiacuteveis foacutesseis esse CO2 eacute
frequentemente disponiacutevel a baixo custo ou ateacute mesmo sem custo (CHISTI 2007
SAWAYAMA et al 1995 SCHENK et al 2008 YUN et al 1997) As limitaccedilotildees
atuais existentes satildeo principalmente no processo de colheita e na fonte do CO2 para
a maior eficiecircncia de produccedilatildeo (SCHENK et al 2008)
22 Fotobiorreatores
A escolha do biorreator para o cultivo da microalga eacute um importante fator que
influecircncia na produtividade global (WATANABE HALL 1996) Haacute uma grande
variedade de biorreatores utilizados para o cultivo de microalga dentre os quais
alguns satildeo utilizados atualmente para produccedilatildeo industrial (LEE 2001)
Segundo Borowitzka (1999) as microalgas podem ser cultivadas em diversos
sistemas de cultivo com volume variando desde poucos litros ateacute bilhotildees de litros
Em geral os sistemas de produccedilatildeo satildeo pouco sofisticados uma vez que muitas
empresas desenvolvem cultivos a ceacuteu aberto em tanques com fundo de terra e com
baixo ou nenhum controle dos paracircmetros ambientais Nos uacuteltimos 50 anos alguns
cultivos desenvolvidos em fotobiorreatores podem ter os seus paracircmetros
ambientais controlados e isto implica numa elevada produtividade a qual viabiliza a
produccedilatildeo comercial de compostos de elevado valor agregado (KOMMAREDDY
ANDERSON 2005 TREDICI 2004)
Convencionalmente os cultivos de microalgas comerciais satildeo realizados em
reatores abertos por causa de baixa eficiecircncia dos fotobiorreatores fechados em
larga escala (OGBONNA TANAKA 1997) Portanto eacute difiacutecil de obter alta
produtividade em reatores ldquooutdoorsrdquo abertos por causa da dificuldade de controlar
fatores ambientais como temperatura e intensidade luminosa haacute uma grande
evaporaccedilatildeo de aacutegua no meio e aleacutem disso requer uma grande aacuterea superficial
facilitando a contaminaccedilatildeo por outros micro-organismos Esse meacutetodo natildeo deve ser
empregado para produccedilatildeo de componentes quiacutemicos finos e farmacecircuticos uma
vez que o custo de recuperaccedilatildeo desse produto e purificaccedilatildeo podem ser
extremamente altos principalmente devido a baixa concentraccedilatildeo celular e a
contaminaccedilatildeo com impurezas Vaacuterias alternativas tecircm sido propostas para contornar
esse problema como o emprego de fotobiorreatores fechados e processos
heterotroacuteficos (CHEN 1997)
27
Os fotobiorreatores abertos possuem certas desvantagens sobre os
fotobiorreatores fechados dentre elas destacam-se menor eficiecircncia fotossinteacutetica e
menor qualidade do produto da microalga (RICHMOND et al 1990 VONSHAK
RICHOMOND 1988) A menor eficiecircncia fotossinteacutetica eacute principalmente devido ao
efeito de sombreamento quando a densidade celular alcanccedila um determinado valor
a baixa eficiecircncia de utilizaccedilatildeo de CO2 gasoso devido agrave limitaccedilatildeo do suplemento de
CO2 para a microalga uma vez que quando o CO2 natildeo estaacute dissolvido no meio de
cultura este se volatiliza contaminaccedilatildeo do cultivo por bacteacuterias algas protozoaacuterios
e fungos tambeacutem influenciam no crescimento da microalga e na qualidade do
produto Os fotobiorreatores fechados tecircm a vantagem de aumentar a eficiecircncia de
utilizaccedilatildeo de CO2 controlando o pH da cultura e diminuir o niacutevel de contaminantes
(WATANABE HALL 1996) Tambeacutem dependendo da configuraccedilatildeo do reator pode
aumentar a aacuterea iluminada reduzindo o efeito de sombreamento (WATANABE et al
1995)
Fotobiorreatores fechados satildeo usados para cultivos de micro-organismos
fotoautotroacuteficos visando agrave produccedilatildeo de aacutecidos graxos poliinsaturados pigmentos
vitaminas e polissacariacutedeos (MOLINA GRIMA et al 1995 TAKANO et al 1995
MERCHUK et al 1996 MATSUNAGA et al 1996) Para muitas dessas aplicaccedilotildees
eacute essencial o uso desses tipos de fotobiorreatores nos quais as monoculturas
podem ser mantidas por longos periacuteodos preferencialmente se o cultivo for
ldquooutdoorrdquo utilizando luz solar como a uacutenica fonte de energia (JANSSEN et al 2003)
Diversas configuraccedilotildees de fotobiorreatores fechados tecircm sido usadas ou
propostas para o cultivo de Spirulina sp como o tubular horizontal (CONVERTI et
al 2006a) tubular helicoidal (BIOCOIL) (WATANABE et al 1995 NERANTZIS et
al 2002) espiralado vertical (TREDICI ZITTELLI 1998) e laminar inclinado (HU et
al 1996) Quase todas as configuraccedilotildees dos fotobiorreatores usam um recipiente
de degassing para desoxigenar o sistema pois um aumento no niacutevel de oxigecircnio no
meio reduz a produtividade (NERANTZIS et al 2002)
Um fator importante para a configuraccedilatildeo desses fotobiorreatores eacute o
fornecimento de luz eficientemente pela maximizaccedilatildeo da relaccedilatildeo superfiacutecie-volume
iluminada Por isso os tubos satildeo frequentemente estreitos e os ldquopanelsrdquo satildeo finos
No entanto alguns fotobiorreatores bem sucedidos em escala laboratorial podem
natildeo funcionar bem quando se aumenta a escala por causa da reduccedilatildeo da relaccedilatildeo
28
superfiacutecie-volume ocasionando uma pobre distribuiccedilatildeo luminosa dentro do reator
(OGBONNA TANAKA 1997)
Tredici e Zittelli (1998) observaram que cultivos de Arthrospira (Spirulina)
platensis em fotobiorreator tubular obtiveram maiores valores de produtividade
volumeacutetrica eficiecircncia fotossinteacutetica e velocidade especiacutefica de crescimento quando
comparadas com os cultivos em fotobiorreator plano Isso foi devido agrave diferenccedila
entre o fluxo de foacutetons nos cultivos com formas diferentes dos fotobiorreatores Uma
vez que os outros principais paracircmetros que conduzem o crescimento da S
platensis natildeo variaram entre os dois cultivos
Entre os diferentes tipos de fotobiorreatores aqueles do tipo air lift satildeo
particularmente interessantes por apresentarem uma maior transferecircncia de massa
liacutequido-gaacutes com menor gasto de energia podem ter o escoamento do liacutequido
facilmente controlado a circulaccedilatildeo de liacutequidos ocorre sem a remoccedilatildeo de partes do
reator e isto previne a contaminaccedilatildeo no cultivo Estes tipos de reatores satildeo
especialmente recomendados para as culturas de cianobacteacuterias por causa da
sensibilidade destas ao estresse de cisalhamento mecacircnico (CHOI et al 1995
SIEGEL ROBINSON et al 1992 CHISTI 1989 MERCHUK et al 1996
WATANABE et al 1995)
O sistema air lift tambeacutem permite a remoccedilatildeo de oxigecircnio produzido pela
fotossiacutentese (CAMACHO RUBIO et al 1998) A remoccedilatildeo contiacutenua do gaacutes oxigecircnio
em cultivos fotossinteacuteticos eacute essencial por que uma excessiva quantidade de
oxigecircnio dissolvido inibe a fotossiacutentese (MOLINA et al 2001)
O crescimento e a produtividade das ceacutelulas fotossinteacuteticas satildeo afetados por
diversos fatores incluindo composiccedilatildeo do meio de cultura temperatura pH
concentraccedilatildeo de O2 e CO2 no reator e fornecimento de luz sendo este o mais
importante durante o cultivo autotroacutefico de ceacutelulas fotossinteacuteticas (OGBONNA
TANAKA 1997)
Micro-organismos natildeo satildeo expostos a uma densidade de fluxo de foacutetons
constante em fotobiorreatores devido ao sombreamento muacutetuo das ceacutelulas e ao
movimento do liacutequido durante a agitaccedilatildeo Frequumlentemente tem sido sugerido que a
circulaccedilatildeo entre as zonas clara e escura poderia conduzir a uma eficiecircncia
fotossinteacutetica maior que aquela determinada sob iluminaccedilatildeo contiacutenua da densidade
de fluxo de foacutetons (JANSSEN et al 2003)
29
O fornecimento da luz em fotobiorreatores eacute uma variaacutevel importante em
culturas fotoautroacuteficas A alta razatildeo superfiacutecie-volume eacute um preacute-requisito importante
para o suprimento suficiente de luz nos fotobiorreatores Ateacute mesmo sob baixa
intensidade luminosa os organismos fotossintetizantes utilizam a luz exposta na
superfiacutecie dos fotobioreatores A energia de excitaccedilatildeo eacute parcialmente utilizada pelo
aparato fotossinteacutetico e a energia residual eacute perdida na forma teacutermica ou
fluorescecircncia (GRUSZECKI et al 1994) Um excesso da energia de excitaccedilatildeo pode
prejudicar o aparato fotossinteacutetico no processo chamado de fotoinibiccedilatildeo (MELIS
1999)
Dependendo do diacircmetro interno dos tubos (12 a 123 cm) os fotobiorreatores
tubulares fechados podem alcanccedilar valores de concentraccedilatildeo celular maiores que 20
g L-1 e produtividades volumeacutetricas de biomassa de 025 - 364 g L-1d-1 em cultivo
que possuem o ciclo claroescuro A alta turbulecircncia encontrada em reatores
tubulares garante uma oacutetima disponibilidade luminosa para as ceacutelulas e melhor
transferecircncia de massa dos gases (LEE 2001)
Outro fator importante eacute o escoamento turbulento da cultura A velocidade do
escoamento do liacutequido deve ser suficiente para garantir o escoamento turbulento
para evitar que as ceacutelulas fiquem estagnadas no interior escuro dos tubos Portanto
uma turbulecircncia execessiva pode danificar as ceacutelulas e haacute um limite superior para a
velocidade da cultura A turbulecircncia eacute conhecida por aumentar a produtividade da
biomassa quando comparada as condiccedilotildees de escoamento laminar A turbulecircncia
move as ceacutelulas do interior escuro de um tubo para uma zona perifeacuterica iluminada
evitando que as ceacutelulas natildeo recebam luz por longos periacuteodos Adicionalmente o
movimento das ceacutelulas da zona clara para a zona escura pode aumentar a
produtividade desde que a duraccedilatildeo de permanecircncia na zona escura seja curta
Intervalos no escuro na ordem de 1 segundo podem melhorar a conversatildeo da
energia solar em biomassa (LAWS et al 1987 TERRY 1986) Tais intervalos
permitem reaccedilotildees cataliacuteticas da fotossiacutentese no escuro permitindo o
restabelecimento do aparato fotossinteacutetico para sua eficiecircncia no proacuteximo periacuteodo
luminoso (ACIEacuteN FERNAacuteNDEZ et al 2001) Jansen et al (2002) relataram que a
turbulecircncia movimenta as ceacutelulas da zona escura no centro do fotobiorreator para a
zona foacutetica na parte mais externa do cilindro podendo conduzir a maior eficiecircncia do
reator
30
O fluxo laminar pode ser prejudicial agraves altas densidades celulares No entanto
eacute importante por proporcionar uma distribuiccedilatildeo uniforme da luz a todas as ceacutelulas na
cultura reduzir o crescimento da parede do fotobiorreator e diminuir a tensatildeo do
oxigecircnio na cultura (RICHMOND 2000) Carlozzi e Torzillo (1996) obtiveram maior
produtividade da Arthrospira platensis quando a velocidade da cultura densa (10 g L-1)
foi alterada de 018 m s-1 para 075 m s-1 Isto torna evidente a necessidade de se
manter uma velocidade de escoamento que permita um maior nuacutemero de ceacutelulas
captarem luminosidade suficiente e que ao mesmo tempo natildeo aumente a demanda
dos custos de produccedilatildeo
Converti et al (2006) observaram que cultivos de Arthrospira platensis em
fotobiorreator tubular a velocidade da cultura de 016 m s-1 eacute suficiente para garantir
uma boa mistura da cultura evitando danos agraves ceacutelulas Similarmente Tredici (1999)
descreve que cultivos em escala industrial de Arthrospira sp em fotobiorreator com
tubos plaacutesticos alongados sobre a terra com 35 cm de largura e 9 cm de altura a
densidade populacional oacutetima foi de 1 g Lminus1 e a velocidade do fluxo natildeo pode ser
menor que 50 cm sminus1 Baixa velocidade de circulaccedilatildeo 6 a 10 cm sminus1 prejudicou o
cultivo devido a produccedilatildeo O2 que inibiu o crescimento baixas taxas de saiacuteda e a
cultura deteriorou-se rapidamente devido ao seu crescimento na parede do tubo
(biofouling)
Como o crescimento dos micro-organismo fotossintetizantes nos
fotobiorreatores eacute fotossinteacutetico o suplemento de luz e CO2 satildeo provavelmente os
limitantes para o crescimento da microalga Aleacutem desses fatores a concentraccedilatildeo de
nitrogecircnio tambeacutem eacute um fator determinante no cultivo uma vez que este nutriente eacute
utilizado principalmente para constituir proteiacutenas e aacutecidos nucleacuteicos fundamentais
para a manutenccedilatildeo e crescimento celular (WATANABE HALL 1996)
No caso de fontes de nitrogecircnio amocircniacais o emprego dos reatores tubulares
pode ser considerado como uma vantagem por favorecer baixa perda de amocircnia
por volatilizaccedilatildeo reduzindo a necessidade de adiccedilatildeo de fonte de nitrogecircnio como
consequumlente reduccedilatildeo do custo de produccedilatildeo Assim pode-se concluir que os
esforccedilos em melhoria de condiccedilotildees de cultivo de A platensis natildeo sejam apenas
utilizando reatores abertos mas tambeacutem reatores fechados dentre os quais os
tubulares
31
23 Processos de cultivo em fotobiorreatores
S platensis habita naturalmente em lagos africanos e mexicanos (RICHMOND
1990) mas podem crescer artificialmente em meios sinteacuteticos empregando
diferentes tipos de processos de cultivo Estes tecircm sido desenvolvidos com a
finalidade de aumentar a produtividade do material desejado Segundo Sassano
(1999) a forma de adiccedilatildeo do substrato nas dornas pode interferir na qualidade da
biomassa produzida
No processo contiacutenuo eacute realizado por meio de uma alimentaccedilatildeo contiacutenua do
substrato limitante (ou meio de cultura) ao reator a uma determinada vazatildeo
constante e por uma retirada contiacutenua de meio cultivado de forma a se ter o volume
de reaccedilatildeo constante a fim de que o sistema atinja a condiccedilatildeo de estado
estacionaacuterio (steady-state) Esse estado consiste na situaccedilatildeo nas quais todas as
condiccedilotildees no interior do reator permanecem constantes ao longo do tempo
(FACCIOTTI 2001) Esse processo tem sido estudado por diferentes autores
comprovando sua aplicabilidade para no cultivo de Spirulina platensis Hirata et al
(1998) obtiveram concentraccedilotildees de S platensis sob condiccedilotildees fotoautotroacuteficas em
regime permanente nas diferentes intensidades luminosas analisadas 25 a 400 W
m-2 Nerantzis et al (2002) empregou o sistema contiacutenuo no fotobiorreator tubular
helicoidal (HELPBR) no cultivo de S platensis e provou sua flexibilidade ao aumento
de escala bem como sua alta produtividade volumeacutetrica em relaccedilatildeo a outros
fotobiorreatores fechados
Outro tipo de processo que tem sido utilizado no cultivo de S platensis em
fotobiorreatores eacute o semicontiacutenuo Esse processo consiste na alimentaccedilatildeo contiacutenua
do substrato limitante mas a remoccedilatildeo do produto eacute por bateladas (alimentaccedilatildeo
contiacutenua com descarga apoacutes a obtenccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular maacutexima desejada)
(BORZANI 2001) Travieso et al (2001) utilizando fotobiorreator tubular helicoidal
concluiacuteram que eacute possiacutevel empregar satisfatoriamente o sistema semicontiacutenuo no
cultivo de S platensis obtendo uma produtividade da biomassa maior que em
processos descontiacutenuo Isso por que em processo descontiacutenuo a produtividade em
ceacutelulas tende a diminuir quando os nutrientes satildeo totalmente consumidos De acordo
com Reichert et al (2006) a concentraccedilatildeo celular pode atingir valores de duas a
quatro vezes maiores no cultivo semicontiacutenuo de S platensis em relaccedilatildeo ao cultivo
descontiacutenuo utilizando fotobiorreator fechado
32
No processo descontiacutenuo todo o substrato eacute adicionado no iniacutecio do cultivo e
os produtos permanecem ateacute o final do cultivo (CARVALHO SATO 2001) No
processo descontiacutenuo alimentado que eacute uma variaccedilatildeo do processo descontiacutenuo a
alimentaccedilatildeo pode ser de forma intermitente ou contiacutenua O modo de operaccedilatildeo da
alimentaccedilatildeo em bioprocessos permite prevenir o acuacutemulo ou a falta do substrato no
cultivo Em processo microbiano uma apropriada taxa de alimentaccedilatildeo
exponencialmente crescente resulta na manutenccedilatildeo da concentraccedilatildeo do substrato
limitante residual controlando a taxa de formaccedilatildeo do produto (CARVALHO SATO
2001) Esse processo permite que o nutriente seja adicionado em determinados
intervalos de tempo durante todo o processo com isso eacute possiacutevel adicionar
nutrientes potencialmente toacutexicos quando presentes em altas concentraccedilotildees como
por exemplo o iacuteon amocircnio sem prejudicar o crescimento microbiano e prevenindo
seu acuacutemulo (CARVALHO et al 2004) Olguiacuten et al (2001) observaram que no
cultivo descontiacutenuo usando uma concentraccedilatildeo inicial de amocircnia de 1 mM incubada
a 32 ordmC ocorre uma grande perda desse iacuteon para a atmosfera aleacutem de ser
consumida pelo micro-organismo tornando-se deficiente depois de poucos dias
especificamente 12 dias Soletto et al (2005) observaram que o melhor crescimento
cineacutetico da S platensis foi empregando o processo descontiacutenuo alimentado quando
comparada com o processo descontiacutenuo utilizando a ureacuteia com fonte de nitrogecircnio
Comportamento semelhante foi observado por Zhang et al (1998) em cultivos
mixotroacuteficos de S platensis utilizando NaNO3 como fonte de nitrogecircnio
Costa et al (2004) observaram o emprego da aacutegua do lago Mangueira
suplementado com ureacuteia pelo processo descontiacutenuo alimentado no cultivo de S
platensis foi possiacutevel reduzir o custo de produccedilatildeo possibilitando o cultivo em larga
escala
Em casos particulares como por exemplo a necessidade de utilizaccedilatildeo de
nutriente viscoso no cultivo este processo geralmente reduz a viscosidade do meio
e o efeito dos componentes toacutexicos eacute tambeacutem limitado pela diluiccedilatildeo (WARD 1989)
Entre outras vantagens desse processo pode-se encontrar desvio do metabolismo
celular para via de interesse de formaccedilatildeo do produto evita repressatildeo cataboacutelica
evita formaccedilatildeo de produtos toacutexicos no metabolismo microbiano e controla a
velocidade de crescimento microbiano O melhor procedimento operacional para
esse sistema eacute iniciar com pequena quantidade de biomassa e substrato e adicionar
33
mais substrato quando a maior parte do substrato inicial ter sido consumida pelo
micro-organismo (GREGERSEN JORGENSEN 1999)
O processo descontiacutenuo alimentado deve ser usado para melhorar a densidade
celular no crescimento da S platensis desde que a concentraccedilatildeo do substrato
limitante possa ser adicionada ateacute alcanccedilar a produccedilatildeo maacutexima de biomassa sem
resultar na inibiccedilatildeo do crescimento
24 Nutrientes para o crescimento da A platensis
241 Fontes de Nitrogecircnio
O elemento nitrogecircnio constitui aproximadamente de 5 a 10 do peso seco das
cianobacteacuterias (FLORES HERRERO 1994) Diferentes fontes de nitrogecircnio
orgacircnica e inorgacircnica podem ser assimiladas por micro-organismos
fotossintetizantes Dentre as orgacircnicas encontramos aminoaacutecidos purinas ornitina
e as inorgacircnicas encontramos sais de amocircnio e sais de nitrato (BERMAN CHAVA
1999)
As cianobacteacuterias utilizam principalmente fontes de nitrogecircnio inorgacircnico como
nitrato nitrito amocircnia e nitrogecircnio atmosfeacuterico para suprir sua necessidade No
entanto amocircnia eacute a uacutenica fonte inorgacircnica de nitrogecircnio que eacute diretamente
incorporada em compostos orgacircnicos e entatildeo um intermediaacuterio obrigatoacuterio na
utilizaccedilatildeo do outras fontes de nitrogecircnio Essa moleacutecula eacute tambeacutem conhecida como
uma desacopladora na fotossiacutentese causando sob certas circunstacircncias o colapso
do ΔpH requerida pela siacutentese de ATP A amocircnia regula enzimas importantes no
metabolismo de nitrogecircnio tais como nitrato redutase glutamina sintetase e
nitrogenases (BOUSSIBA 1997)
Exceto para o N2 as cianobacteacuterias possuem um sistema de transporte
especiacutefico para as diferentes formas de nitrogecircnio mas a maioria deles pode entrar
na ceacutelula por difusatildeo dependendo de sua concentraccedilatildeo oue do pH do meio de
cultura Nitrato e nitrito satildeo reduzidos pela nitrato redutase e nitrito redutase
respectivamente ambas as enzimas usam ferredoxina como doador de eleacutetrons
(FLORES HERRERO 1994) Ureacuteia eacute convertida a amocircnia pela urease e o
dinitrogecircnio eacute reduzido agrave amocircnia pelo complexo nitrogenase (HERRERO et al
2001) Outras formas de nitrogecircnio como certos aminoaacutecidos requerem sistemas de
34
transporte especiacutefico e posteriormente seratildeo metabolizados para produzir amocircnio
(HERRERO et al 2001 MURO-PASTOR FLORENCO 2003)
Nesses organismos a hierarquia de preferecircncia da assimilaccedilatildeo tem sido
mostrada para esses compostos Quando amocircnio e nitrato estatildeo presentes
simultaneamente no meio externo o sistema para assimilaccedilatildeo de nitrato eacute expresso
somente ao niacutevel basal A inibiccedilatildeo da assimilaccedilatildeo do nitrato exercida pela amocircnia
opera em dois niacuteveis diferentes pelo menos Durante pouco tempo a adiccedilatildeo da
amocircnia interrompe a assimilaccedilatildeo ativa do nitrato pelas ceacutelulas Se as ceacutelulas
continuarem expostas ao amocircnio ateacute mesmo quando o nitrato estaacute
simultaneamente presente a longo prazo o sistema regulatoacuterio atua na repressatildeo
das proteiacutenas envolvendo a assimilaccedilatildeo do nitrato (HERRERO FLORES 1997) A
atividade da nitrato redutase em Spirulina platensis (strain ARM 729) eacute reduzida
mediante a retirada de nitrato do meio e eacute totalmente restaurada apoacutes duas horas
da adiccedilatildeo de nitrato indicando a induccedilatildeo pelo substrato A concentraccedilatildeo oacutetima de
nitrato de soacutedio necessaacuteria para a atividade maacutexima da enzima nitrato redutase eacute de
30 mM Os produtos da assimilaccedilatildeo do nitrato nitrito e amocircnio inibiram
significativamente a atividade da nitrato redutase quando em altas concentraccedilotildees A
acumulaccedilatildeo do nitrito eacute toacutexica para a ceacutelula mas seu niacutevel pode ser controlado tanto
pela inibiccedilatildeo da atividade da nitrato redutase eou transporte do nitrato ou pelo
aumento da atividade da nitrito redutase (JHA et al 2007)
Em cultivos de micro-organismo em larga escala a fonte de nitrogecircnio
preferencial eacute a amocircnia devido ao seu baixo custo e tambeacutem porque ela pode
previnir a contaminaccedilatildeo com zooplancton (BOUSSIBA 1997) A preponderacircncia de
NH3 sobre NH4+ em valores de pH acima de 92 o pKa para amocircnia a 20-30 ordmC
favoreceu a permeabilidade desta pela membrana plasmaacutetica forma natildeo ionizada
que apoacutes difundir pela membrana plasmaacutetica a amocircnia eacute aprisionada dentro da
ceacutelula na forma de iacuteon amocircnio carregado positivamente (BOUSSIBA 1997) O grau
de inibiccedilatildeo parece ser muito reduzido em cepas que crescem restritamente em
condiccedilotildees alcalinas 5 mM de amocircnia inibiu 90 a evoluccedilatildeo de O2 dependente de
luz em micro-organismo neutrofiacutelico Anabaena sp e somente 30 foi observada
em micro-organismo alcalofiacutelico Spirulina platensis no mesmo pH (pH 100) Em
concentraccedilatildeo de 10 mM Spirulina platensis obteve ainda 50 da capacidade
fotossinteacutetica e Anabaena sp natildeo obteve crescimento Essa resistecircncia da Spirulina
agrave amocircnia em pH 10 eacute conferida por um pH intratilacoidal relativamente alto no
35
valor de 65 em relaccedilatildeo ao pH intratilacoidal da Anabaena sp valor de pH de 53
Esta diferenccedila no valor do pH intratilacoidal sugere que menor eacute a ΔpH atraveacutes da
membrana que eacute a razatildeo para a resistecircncia relativa da Spirulina platensis a amocircnia
em pH 100 (BELKIN BOUSSIBA 1991a)
A adiccedilatildeo de 2-3 mM de amocircnia em cultivos de Spirulina mantida geralmente a
pH (95 - 100) causa a deterioraccedilatildeo do contamitante Chlorella no cultivo de
Spirulina A toxidade da amocircnia nas ceacutelulas da Chlorella eacute causada pela grande
entrada dessa moleacutecula devido ao menor pH interno reduzindo a variaccedilatildeo do pH na
membrana tilacoidal requerida para a siacutentese de ATP Logo o uso de amocircnia com
fonte de nitrogecircnio no cultivo de Spirulina pode previnir a proliferaccedilatildeo de outros
micro-organismos (BOUSSIBA 1997)
Ureacuteia e aminoaacutecidos tambeacutem podem ser assimilados pelas cianobacteacuterias A
ureacuteia e fontes de nitrogecircnio orgacircnico satildeo primeiramente metabolizadas para amocircnia
e a partir de entatildeo os aacutetomos de nitrogecircnio seratildeo utilizados como observado na
Figura 2 (FLORES HERRERO 1994)
Figura 2 Principais rotas de assimilaccedilatildeo de nitrogecircnio em cianobacteacuterias cultivas em pH acima de 92
A maioria dos organismos fotossintetizantes a assimilaccedilatildeo da amocircnia ocorre
pela accedilatildeo sequumlencial da glutamina sintetase (GS) e glutamanto sintase (GOGAT)
Ureacuteia
NO3-
aminoaacutecido
NH3
aminoaacutecido
Ureacuteia
NO3-
NH4+
Nucleotiacutedeos
Aminoaacutecidos
Aminoaccediluacutecar
Lipiacutedios
NH4+
Aacutecidos nucleacuteicos
Parede celular
Porfirinas
Proteiacutenas
Intracelular Exracelular
36
Essas reaccedilotildees conhecidas como ciclo GS-GOGAT constituem uma ligaccedilatildeo entre o
metabolismo de nitrogecircnio e de carbono e eacute o metabolismo mais importante para
assimilaccedilatildeo da amocircnia gerada tanto exogenamente como endogenamente
(BOUSSIBA 1997)
As enzimas do ciclo da glutamina sintetase e glutamato sintase satildeo importantes
pela introduccedilatildeo da amocircnia em formas orgacircnicas O glutamato produzido por esta
via aleacutem de ser o principal doador de nitrogecircnio para a siacutentese de outros
metaboacutelitos contendo nitrogecircnio eacute tambeacutem um precursor de alguns aminoaacutecidos e
da 5-aminolevulinato um precursor da biossiacutentese da porfirina ficobilina e clorofila
(FLORES HERRERO 1994)
A parede celular das cianobacteacuterias eacute como as das bacteacuterias gram-negativas
que conteacutem uma camada de peptidoglicano na parte externa da membrana
citoplasmaacutetica Nesta membrana conteacutem tipos de proteiacutenas especiais denominadas
de porinas a qual permite a passagem de pequenas moleacuteculas incluindo
aminoaacutecidos e iacuteons inorgacircnicos Isto eacute essas substacircncias apresentam um sistema
de transporte especializado (FLORES HERRERO 1994) A membrana
citoplasmaacutetica representa a principal barreira de permeabilidade das cianobacteacuterias
Portanto o nitrato provavelmente possui livre acesso ao periplasma das
cianobacteacuterias (HERRERO FLORES 1997)
Algumas cianobacteacuterias como Anabaena Nostoc Fischerella satildeo capazes de
fixar N2 atmosfeacuterico em condiccedilotildees aeroacutebias atraveacutes das nitrogenases (FLORES
HERRERO 1994) No entanto as ceacutelulas de S platensis natildeo podem fixar nitrogecircnio
atmosfeacuterico porque natildeo possuem heterocisto (MATA 2007 VACHHANI VONSHAK
1997) e eacute dentro dos heterocistos onde se encontram as nitrogenases em
cianobacteacuterias (LARA GUERRERO 2007)
O nitrato eacute provavelmente a fonte mais abundante de nitrogecircnio para a nutriccedilatildeo
de cianobacteacuterias A assimilaccedilatildeo do nitrato envolve a incorporaccedilatildeo do nitrato e
reduccedilatildeo do nitrato intracelular para amocircnio na qual eacute a forma de nitrogecircnio
incorporada em compostos orgacircnicos Nitrito na qual pode tambeacutem ser utilizado na
necessidade do nitrogecircnio eacute assimilado pelas ceacutelulas e entatildeo reduzido a amocircnio
(FLORES HERRERO 1994)
A assimilaccedilatildeo do nitrato pelas cianobacteacuterias envolve um sistema de transporte
que eacute carreado por uma proteiacutena e esta possui uma alta afinidade pelo nitrato Esta
alta afinidade permite que as cianobacteacuterias utilizem nitratos mesmo em baixas
37
concentraccedilotildees como eacute encontrado no meio ambiente natural O acuacutemulo intracelular
de nitrato permitiraacute o funcionamento da enzima nitrato redutase (FLORES
HERRERO 1994) Portanto a limitaccedilatildeo do transporte de nitrato pela inativaccedilatildeo de
alguns genes do transporte de nitrato natildeo impede o crescimento dependente de
nitrato quando este eacute suplementado a alta concentraccedilatildeo (20 mM) A entrada do
nitrato nas ceacutelulas nessas condiccedilotildees parece ser por difusatildeo passiva desde que a
concentraccedilatildeo de nitrato seja maior que 1 mM a assimilaccedilatildeo de nitrato aumenta
linearmente com o aumento da sua concentraccedilatildeo (OMATA et al 1989)
O nitrato intracelular eacute reduzido a nitrito em reaccedilatildeo utilizando 2 eleacutetrons
catalizados pela nitrato redutase o nitrito eacute convertido a amocircnio pela nitrito redutase
na reaccedilatildeo utilizando 6 eleacutetrons Ambas as enzimas encontradas nas membranas
tilacoidais utilizam ferrodoxina reduzida como doador de eleacutetrons A presenccedila de
nitrato ou nitrito geralmente tem um efeito positivo nos niacuteveis das enzimas nitrato
redutase e nitrito redutase (FLORES HERRERO 1994) Estas enzimas encontram-
se principalmente no citoplasma das cianobacteacuterias (GUERRERO LARA 1987) A
assimilaccedilatildeo do nitrato envolve a reduccedilatildeo citoplasmaacutetica para nitrito (NO2-)
catalizada pela enzima nitrato redutase (NR) usando NAD(P)H como doador de
eleacutetrons O nitrito eacute rapidamente reduzido a amocircnio (NH4+) pela enzima nitrito
redutase (NiR) que usa a ferrodoxina como doador de eleacutetrons e o amocircnio eacute entatildeo
incorporado a moleacuteculas de nitrogecircnio como aminoaacutecidos purinas pirimidinas e
aminas (LEA LEEGOOD 1993)
Quando somente o CO2 eacute o aceptor de eleacutetrons disponiacutevel e o escoamento de
eleacutetrons pelos fotossistemas natildeo eacute limitado pela luz o que determina a fotossiacutentese
eacute a fixaccedilatildeo de CO2 pelo ciclo das pentoses Quando se adiciona nitrato nessas
mesmas condiccedilotildees este usa os eleacutetrons diretamente da ferrodoxina reduzida
liberando o escoamento dos eleacutetrons natildeo ciacuteclico de sua limitaccedilatildeo e estimulando a
produccedilatildeo de O2 Esse efeito natildeo foi observado quando se adiciona amocircnio Na
intensidade luminosa saturante o nitrato estimula o fluxo de eleacutetrons natildeo ciacuteclico para
gerar um poder redutor utilizado para sua assimilaccedilatildeo No entanto a intensidade de
luz limitante o nitrato reprime a fixaccedilatildeo de CO2 para utilizar o poder redutor gerado
fotossinteticamente na sua reduccedilatildeo a amocircnia (ROMERO LARA 1987)
A nitrato redutase e nitrito redutase presentes na membrana tilacoidal permitem
a fotoreduccedilatildeo do nitrato ou nitrito em uma reaccedilatildeo dependente do fotossistema I na
qual eacute estimulada pela ferrodoxina Nos tilacoacuteides do Synechococcus a fotoreduccedilatildeo
38
do nitrato a amocircnio utiliza aacutegua como fonte de eleacutetrons foi observado na reaccedilatildeo
envolvendo ambos fotossistema I e fotossistema II Em condiccedilotildees heterotroacuteficas a
reduccedilatildeo do nitrato ocorre pela ferrodoxina reduzida produzida a partir do NADPH e
ferrodoxina-NADP oxiredutase NAPDH eacute provavelmente gerado pela glicose-6-
fosfato desidrogenase e 6-fosfogluconato desidrogenase (HERRERO FLORES
1997)
A assimilaccedilatildeo de amocircnio nas cianobacteacuterias pode ser pela difusatildeo de sua
forma gasosa (amocircnia) ou pela accedilatildeo de permeases especiacuteficas e eacute diretamente
incorporado no metabolismo GS-GOGAT (GS glutamina sintetase GOGAT
glutamate sintase) (MURO-PASTOR FLORENCIO 2003)
A ureacuteia eacute uma boa fonte de nitrogecircnio para cianobacteacuterias pertencentes a
diferentes grupos taxonocircmicos Esta parece ser assimilada intacta pelas ceacutelulas
ativas e entatildeo metabolizada intracelularmente (FLORES HERRERO 1994) Embora
o metabolismo assimilatoacuterio do nitrogecircnio tenha sido amplamente investigado
(FLORES HERRERO 1994) informaccedilatildeo sobre a assimilaccedilatildeo da ureacuteia eacute escassa e
a maioria relata sobre o uso da urease (RAI SINGH et al 1987 RAI 1989
PALINSKA et al 2000) A ureacuteia intracelular eacute degradada pela enzima urease
liberando uma moleacutecula de dioacutexido de carbono e duas moleacuteculas de amocircnia
Embora algumas leveduras e algas degradem a ureacuteia pela ureacuteia amidoliase
dependente de ATP e biotina a maioria dos micro-organismos usa a ureacuteia
amidohidrolase dependente de Ni+2 (VALLADARES et al 2002) Essa enzima
possui um Km para ureacuteia geralmente acima de 1 mM (MOBLEY HAUSINGER
1989) Valladares et al (2002) tem demonstrado que algumas cianobacteacuterias como
Synechocystis sp PCC 6803 e Anabaena sp PCC 7120 possuem um transportador
de ureacuteia denominado ABC tipo permease (ABC-type permease) essencial para a
assimilaccedilatildeo da ureacuteia
A atividade da urease em cianobacteacuterias Synechococcus sp eacute geralmente
maior em ceacutelulas rompidas em relaccedilatildeo as ceacutelulas intactas sugerindo que a urease
estaacute localizada intracelularmente no citoplasma (COLLIER et al 1999) A produccedilatildeo
da urease requer Ni+2 no meio de crescimento e tem sido purificada a partir da
Spirulina maxima (CARVAJAL et al 1982)
Em geral haacute dois principais metabolismos para que o amocircnio seja incorporado
em constituintes orgacircnicos nas ceacutelulas O primeiro eacute a incorporaccedilatildeo direta do
amocircnio incorporado do meio para produccedilatildeo do glutamato pela aminaccedilatildeo do 2-
39
oxoglutarato (-cetoglutarato) pela glutamato desidrogenase seguindo pela
aminaccedilatildeo do glutamato pela glutamina sintetase
(1)
No segundo duas moleacuteculas de glutamato satildeo produzidas na reaccedilatildeo de
transaminaccedilatildeo A amocircnia eacute incorporada ao glutamato originando a glutamina na
qual transfere seu grupo amino para 2-oxoglutarato (-cetoglutarato) pela glutamato
sintase ou glutamato-2-oxoglutarato aminotransferase este eacute o ciclo de reaccedilotildees
catalisadas pelo glutamato sintase e glutamina sintetase sendo esta a via mais
comum de assimilaccedilatildeo de amocircnio em cianobacteacuterias independente da fonte de
nitrogecircnio utilizada (FLORES HERRERO 1994)
(2)
Eacute evidente que na assimilaccedilatildeo de algumas formas de nitrogecircnio inorgacircnico
pelas enzimas GSGOGAT um requerimento obrigatoacuterio do esqueleto de carbono
principalmente cetoaacutecidos conduziraacute um desvio do fluxo de carbono da biossiacutentese
de carboidrato para a biossiacutentese de aminoaacutecidos (LARA GUERRERO 1997)
proporcionando um aumento no fluxo de carbono atraveacutes da via glicoliacutetica e dos
aacutecidos tricarboxiacutelicos para a formaccedilatildeo do oxalacetato e do α-cetoglutarato bem
como estimula o turnover de aminoaacutecidos em ceacutelulas de Anacystis nidulans uma
2
+
+
40
vez que um aumento da incorporaccedilatildeo do carbono em aminoaacutecidos induzido pela
assimilaccedilatildeo de nitrogecircnio natildeo foi acompanhado por um aumento no pool de
aminoaacutecidos Esse desvio eacute mais evidente sob altas intensidades luminosas
(CORONIL et al 1993)
Nas ceacutelulas de Phormidium laminosum adaptada ao crescimento com nitrato ou
amocircnia como fonte de nitrogecircnio possuem de 65 a 90 de glutamato em relaccedilatildeo a
quantidade de aminoaacutecidos totais (porccedilatildeo molar) dependendo da fase de
crescimento Essa proporccedilatildeo pode variar se a fonte de nitrogecircnio no cultivo for
alterada Quando o iacuteon amocircnio foi adicionado no cultivo com nitrato o conteuacutedo de
glutamato diminui enquanto que a maioria dos outros aminoaacutecidos aumentou O
niacutevel intracelular da maioria dos aminoaacutecidos (especialmente aspartato e alanina)
aumenta indicando que a siacutentese de aminoaacutecido foi maior que sua incorporaccedilatildeo em
proteiacutenas e outros compostos (OCHOA de ALDA et al 1996)
O meio de cultura convencional para a obtenccedilatildeo da S platensis utiliza sais de
nitrato como fonte de nitrogecircnio como por exemplo nitrato de potaacutessio e nitrato de
soacutedio Fontes alternativas de nitrogecircnio como ureacuteia (DANESI et al 2002 SOLETTO
et al 2005) e sais de amocircnio (CARVALHO et al 2004 SOLETTO et al 2005)
estatildeo sendo pesquisadas com a finalidade de diminuir os custos na produccedilatildeo
industrial Ambos o tipo e a quantidade da fonte de nitrogecircnio no meio de cultura
influenciam no crescimento e composiccedilatildeo da biomassa (STANCA POPOVICI
1996)
Considerando a substituiccedilatildeo de KNO3 por ureacuteia verifica-se que eacute altamente
vantajosa pois o custo desta eacute muito menor que a de KNO3 e aleacutem disso a ureacuteia eacute
facilmente assimilada por S platensis provavelmente devido agrave sua hidroacutelise no meio
de cultivo com formaccedilatildeo de amocircnia seja devido agrave accedilatildeo da urease (CARVAJAL et
al 1982) seja devido agrave alcalinidade do meio de cultivo (DANESI et al 2002
RANGEL-YAGUI et al 2004)
Soletto et al (2005) comparando o crescimento da S platensis no processo
descontiacutenuo observaram que o uso de ureacuteia como fonte de nitrogecircnio proporcionou
uma maior concentraccedilatildeo celular quando comparado com o sulfato de amocircnio Nesse
mesmo trabalho observaram que o melhor crescimento cineacutetico da S platensis foi
utilizando o processo descontiacutenuo alimentado com ureacuteia quando comparada com o
nitrato de soacutedio Portanto o uso de ureacuteia como uma fonte de nitrogecircnio mais
econocircmica pode ser uma alternativa interessante no cultivo de S platensis
41
Bezerra et al (2008) observaram que o emprego do processo descontiacutenuo
alimentado utilizando cloreto de amocircnio como fonte de nitrogecircnio pode ser uma
alternativa viaacutevel para o cultivo de S platensis natildeo influenciam nos teores proteacuteicos
e lipiacutedicos da biomassa final
242 Intensidade luminosa
A intensidade luminosa eacute um importante fator que interfere no crescimento
dos micro-organismos fotossintetizantes A luz absorvida por pigmentos direciona o
transporte de eleacutetrons fotossinteacutetico na qual resulta na reduccedilatildeo do NADP+ e
formaccedilatildeo de ATP (YANG et al 2000)
A soma da luz absorvida pelas ceacutelulas no fotobiorreator depende de muitos
fatores incluindo posiccedilatildeo especiacutefica da ceacutelula num determinado instante densidade
da cultura e pigmentaccedilatildeo das ceacutelulas (RUBIO et al 2003)
Um dos modos de obtenccedilatildeo de energia para o metabolismo da S platensis eacute a
fotossiacutentese e para a sua realizaccedilatildeo eacute necessaacuterio aacutegua dioacutexido de carbono e luz
No processo fotossinteacutetico ocorre o fenocircmeno de captaccedilatildeo de luz e outro conhecido
como oxido-reduccedilatildeo (NELSON YOCUM 2006)
A absorccedilatildeo da luz na faixa de 400-700 nm por pigmentos fotossinteacuteticos
absorve a energia de um foacuteton de dado comprimento de onda e entatildeo utiliza essa
energia para iniciar uma cadeia de eventos da fase fotoquiacutemica da fotossiacutentese
Esses pigmentos tais como clorofila carotenoacuteides e bilinas estatildeo organizados em
complexos fotossinteacuteticos e tecircm a funccedilatildeo de antenas captadoras de luz Centenas
de pigmentos antenas funcionam juntos para direcionar o processo para as etapas
seguintes ou dissipam o excesso de energia para diferentes rotas (ADIR et al
2003)
A faixa do espectro de absorccedilatildeo que eacute utilizada pelos organismos
fotossintetizantes como fonte de energia para as suas atividades metaboacutelicas eacute
comumente chamada de Radiaccedilatildeo Fotossinteticamente Ativa (PAR do inglecircs
Photosynthetically Active Radiation) A Densidade de Fluxo de Foacutetons (PPFD do
inglecircs Photosynthetic Photon Flux Density) cuja unidade eacute micromol de foacutetons m-2 s-1
expressa a irradiacircncia nesta faixa do espectro
A fotossiacutentese oxigecircnica eacute catalizada por quatro complexos proteiacutenas-
membranas formadas pelo fotossistema II (FSII) citocromo bf fotossistema I (FSI) e
42
ATP sintetase Esses complexos estatildeo arranjados nas membranas tilacoacuteidais que
nas cianobacteacuterias distribuem-se de forma concecircntrica ou irregular no citossol
(NELSON YOCUM 2006)
Os fotossistemas satildeo os complexos responsaacuteveis pela conversatildeo da energia
luminosa em energia quiacutemica Nos organismos que realizam fotossiacutentese oxigecircnica
existem dois fotossistemas agindo em seacuterie o fotossistema I (FSI) e o fotossistema II
(FSII) O fotossistema II (FSII) eacute definido como aacutegua-plastoquinona oxidoredutase
pois catalisa a transferecircncia de eleacutetrons entre a aacutegua e a plastoquinona o complexo
citocromo b6f eacute definido como plastoquinonandashplastocianina oxidoredutase
fotossistema I (FSI) como uma plastocianinandashferredoxina oxidoredutase e a ATPase
ou ATP sintetase que funciona como uma forccedila proacuteton motriz que direciona a
siacutentese de ATP (NELSON YOCUM 2006) (Figura 3)
Figura 3 Complexos fotossinteacuteticos em membranas de tilacoacuteides Fonte httpwwwportalsaofranciscocombralfafotossintesehistorico-da-fotossintesephp
Os FSI e FSII contecircm clorofilas e outros pigmentos que absorve a energia
luminosa e as direcionam para o centro de reaccedilatildeo (RC) (Figura 4) O centro de
reaccedilatildeo fotossinteacutetico do FSI possui proteiacutenas com o centro contendo agregados de
Ferro-enxofre (Fe-S) como uacuteltimo aceptor de eleacutetrons e o FSII possui quinona como
uacuteltimo aceptor de eleacutetrons (HEATHCOTE et al 2003) A energia capturada pelo
centro de reaccedilatildeo induz a excitaccedilatildeo de um par especial de clorofila na qual inicia a
translocaccedilatildeo de um eleacutetron atraveacutes da membrana Aacutegua doadora de eleacutetrons para
esse processo eacute oxidada fotoquimicamente a O2 liberando 4 H+ e 4 eleacutetrons pelo
centro fotooxidativo do FSII (P680) Este eacute responsaacutevel pela conversatildeo da energia
luminosa em energia de oxido-reduccedilatildeo (McEVOY et al 2005)
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Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do fotossistema Adaptaccedilatildeo Fontehttpkentsimmonsuwinnipegcacm1504lightreacthtm
Os eleacutetrons extraiacutedos da aacutegua satildeo lanccedilados para quinona (PQ) formando
quinona reduzida (PQH2) (BARBER 2006) A quinona reduzida tambeacutem conhecida
como quinol pode se dissociar do centro de reaccedilatildeo e difundir ateacute o complexo
citocromo b6f O complexo citocromo b6f transfere eleacutetrons da quinona reduzida
(PQH2) ateacute a plastocianina que eacute uma proteiacutena perifeacuterica moacutevel que conteacutem cobre e
que tem como principal funccedilatildeo transferir eleacutetrons do citocromo b6f ateacute o P700 centro
de reaccedilatildeo do Fotossistema I Esse processo permite a transferecircncia de proacutetons da
face externa para a face interna da membrana tilacoidal e a criaccedilatildeo de gradiente
eletroquiacutemico de proacutetons atraveacutes da membrana Energia luminosa absorvida pelo
FSI (P700) induz a transferecircncia de eleacutetrons da plastocianina localizada na face
interna da membrana para a ferredoxina localizada na face externa (NELSON
BEN-SHEM 2002) Outra proteiacutena associada ao Fotossistema I eacute a flavoproteiacutena
ferredoxina-NADP oxidoredutase que reduz o NADP+ a NADPH2 completando a
sequumlecircncia do transporte natildeo-ciacuteclico de eleacutetrons que comeccedila com a oxidaccedilatildeo da
moleacutecula de aacutegua (NELSON YOCUM 2006) A reduccedilatildeo da ferredoxina eacute
subsequentemente usada em numerosas reaccedilotildees de siacutentese e ciclos regulatoacuterios
incluindo assimilaccedilatildeo de nitrato desnaturaccedilatildeo de aacutecido graxo e produccedilatildeo de
NADPH (McCARTY et al 2000 CHITNIS 2001) Essas reaccedilotildees soacute ocorrem na
presenccedila de luz Independentemente da presenccedila de luz a reduccedilatildeo do CO2 a
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carboidratos ciclo de Calvin ocorre devido a presenccedila de ATP e NADPH (NELSON
YOCUM 2006)
A diferenccedila de carga entre FSI e o FSII juntamente com a transferecircncia de
eleacutetrons atraveacutes do complexo citocromo b6f induz a formaccedilatildeo de um potencial
eletroquiacutemico atraveacutes da membrana na qual potencializa a siacutentese de ATP por um
complexo de quatro proteiacutenas denominadas de ATPase (McCARTY et al 2000)
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da fase fotoquiacutemica Adaptado Fonte httpwwwuiceduclassesbiosbios100lecturesf04amlect10htm
O controle metaboacutelico do consumo de energia isto eacute a soma de energia
capturada pelo aparato fotossinteacutetico e estocada na forma de energia quiacutemica a
taxa de fixaccedilatildeo do carbono e a produccedilatildeo de biomassa eacute um processo mediado por
enzimas Isto implica que a taxa maacutexima do consumo de energia depende da
natureza do micro-organismo (RUBIO et al 2003) A reaccedilatildeo de captura de luz eacute
muito mais raacutepida que as reaccedilotildees subsequumlentes mediada por enzimas a taxa
maacutexima da fotossiacutentese deve ser controlada pela concentraccedilatildeo de uma das enzimas
do ciclo de Calvin (SUKENIK et al 1997 RUBIO et al 2003)
Alguns autores como Hirata et al (1998) e Chojnacka Noworyta (2004a)
identificaram regiotildees que correlacionam o crescimento da Arthrospira ssp e a
intensidade luminosa Essas regiotildees satildeo
Regiatildeo limitada por luz baixa intensidade luminosa onde ocorre um aumento
da concentraccedilatildeo celular com um aumento da intensidade luminosa
Regiatildeo saturada por luz alta intensidade luminosa onde o crescimento celular
independe da intensidade luminosa
Regiatildeo inibida por luz a intensidade luminosa eacute muito alta inibindo o
crescimento celular e ateacute mesmo pode provocar a morte celular
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A intensidade luminosa eacute fundamental para que ocorra o metabolismo
fotossinteacutetico mas por outro lado altas intensidades luminosas podem danificar o
complexo fotossinteacutetico levando a morte celular Esse processo eacute denominado de
fotoinibiccedilatildeo (RUBIO et al 2003) O excesso de luz pode danificar o centro de
reaccedilatildeo dos fotossitemas II (SAMUELSSON 1985 LU VONSHAK 1999) eou
fotossistema I (SONOIKE 1996)
A fotoinibiccedilatildeo eacute um estado de estresse fisioloacutegico que ocorre em todos os
organismos fotossintetizantes envolvendo o oxigecircnio causado devido a um excesso
de iluminaccedilatildeo A danificaccedilatildeo ocorre primeiramente no centro de reaccedilatildeo do
fotossistemas II reduzindo abruptamente a eficiecircncia do transporte de eleacutetrons
fotossinteacutetico somente quando a taxa da danificaccedilatildeo excede ao do seu reparo na
qual requer o turnover da siacutentese das proteiacutenas do PSII A inibiccedilatildeo pela luz pode
envolver a participaccedilatildeo de todas as atividades realizadas pelo sistema fotossinteacutetico
tais como degradaccedilatildeo e substituiccedilatildeo dos componentes e organizaccedilatildeo da unidade
funcional (ADIR et al 2003)
A fotoinibiccedilatildeo ocorre quando o sistema antena absorve luz em excesso
danificando o sistema fotossinteacutetico O excesso de excitaccedilatildeo pode ser obtido por um
aumento da intensidade luminosa acima do niacutevel de saturaccedilatildeo da taxa fotossinteacutetica
(CHOJNACKA NOWORYTA 2004a) Portanto isso tambeacutem pode ocorrer em
condiccedilotildees moderadas de intensidade luminosa se as ceacutelulas adaptadas a baixa
intensidade luminosa forem transferidas a maiores intensidade luminosas (RUBIO et
al 2003) ou se taxa fotossinteacutetica estiver limitada por fatores de estresse como
baixas temperaturas (GOMBOS et al 1994) eou excesso de sal no meio (LU
ZHANG 2000) o que pode induzir a fotoinibiccedilatildeo em condiccedilotildees de luz moderada
(SAMUELSSON 1985)
A danificaccedilatildeo do fotossistema II consiste na inativaccedilatildeo dos sistemas que
envolvem oxigecircnio carreadores de eleacutetrons e proteiacutenas D1D2 (RUBIO et al 2003)
No FSI a inibiccedilatildeo eacute iniciada pela inativaccedilatildeo do aceptor de eleacutetrons seguindo com a
destruiccedilatildeo do centro de reaccedilatildeo e degradaccedilatildeo do produto do gen psaB que eacute uma
das duas maiores subunidades peptiacutedicas do complexo do centro de reaccedilatildeo do FSI
Baixas temperaturas e estresse oxidativos satildeo caracteriacutesticas requeridas para a
fotoinibiccedilatildeo do FSI in vivo (SONOIKE 1996)
Adir et al (2003) relataram que a fotoinibiccedilatildeo eacute observada tanto sob altas
intensidades luminosas quando o mecanismo de reparo de proteiacutenas atinge sua
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capacidade maacutexima ou em baixa intensidade luminosa quando fatores externos
adicionais prejudicam seu reparo e a exposiccedilatildeo a alta intensidade luminosa
prolongada induz a um excesso de efeitos secundaacuterios que contribui para uma
reduccedilatildeo na capacidade fotossinteacutetica
Fatores como efeito sombreamento em culturas densas de ceacutelulas a remoccedilatildeo
de O2 e o aumento da concentraccedilatildeo de CO2 podem proteger os micro-organismos
contra o efeito fotooxidativo (ELOFF et al 1976)
Van Eykelenburg (1979) observou que a intensidade luminosa natildeo afeta as
caracteriacutesticas morfoloacutegicas como o tamanho da heacutelice e o diacircmetro da S platensis
e que a concentraccedilatildeo dos gracircnulos de poliglicano diminui com o aumento da
intensidade luminosa
Bezerra et al (2008) observaram que os teores de lipiacutedios e proteiacutenas obtidos
nas biomassas finais foram influenciados pela intensiade luminosa menores
intensidades luminosas conduziram a um aumento no conteuacutedo total de lipiacutedios e de
proteiacutenas
2421 Pigmentos
Para a energia luminosa ser utilizaacutevel pelos organismos fotossinteacuteticos ela
deve inicialmente ser absorvida por pigmentos especiacuteficos tais como clorofila
carotenoacuteides e ficobilinas Esses pigmentos encontram-se associados a proteiacutenas
nas lamelas fotossinteacuteticas formadas por tilacoacuteides Isso permite uma disposiccedilatildeo
espacial que torna muito eficiente a propagaccedilatildeo de energia absorvida (MARZOCCO
TORRES 1999)
Nas cianobacteacuterias tais como A platensis a fotossiacutentese ocorre principalmente
nas membranas tilacoidais onde estatildeo localizados os pigmentos fotossitneacuteticos
clorofila a carotenoacuteides e ficocianina (COGNO et al 2003) As lamelas tilacoidais
satildeo duas linhas paralelas em formato de disco fechado onde estatildeo localizados a
clorofila celular (clorofila a) e os carotenoacuteides (VAN YKELENBURG 1979)
O aparato fotossinteacutetico das cianobacteacuterias consiste principalmente de trecircs
tipos de complexos macromoleculares fotossistema I fotossistema II e os
ficobilissomos O FSI e o FSII satildeo complexos intriacutensecos onde os ficobilissomos
estatildeo sobre a superfiacutecie externa dos tilacoiacutedes na forma de esferas (GANTT 1981
LIU et al 2005) Os ficobilissomos auxiliam na absorccedilatildeo da energia luminosa em
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um intervalo do espectro maior que as clorofilas absorvem (500-680 nm) permitindo
as espeacutecies que possuem essas antenas a utilizar todo o intervalo da luz visiacutevel
emitido pelo sol (KUMAR MURHTY 2007)
Os ficobilissomos estatildeo unidos nas lamelas tilacoiacutedais e funcionam como
antenas captadoras de luz que transferem a energia excitante para o centro de
reaccedilatildeo dos fotossistemas (VAN EYKELENBURG 1979) A maior parte da energia
luminosa eacute absorvida por complexos pigmentos-proteiacutenas chamados de
ficobilissomos Os componentes dos ficobilissomos as ficobiliproteiacutenas satildeo
responsaacuteveis pela pigmentaccedilatildeo verde-azulada da maioria das cianobacteacuterias Os
ficobilissomos satildeo agregados de alto peso molecular compostos por ficocianina
aloficocianina e ficoeritrina (com pico de absorbacircncia de 615 nm 650 nm e 565 nm
respectivamente) Com o aumento da intensidade luminosa os ficobilissomos satildeo
menos abundantes (VAN EYKELENBURG 1979)
As ficobiliproteiacutenas presentes nos gracircnulos de ficobilissomos podem constituir
mais de 60 de proteiacutena soluacutevel em cianobacteacuterias (HOUMARD 1994) Isso eacute o
que caracteriza a Spirulina spp por ser comercializada como um suplemento
alimentar rico em proteiacutenas (TANDEAU de MARSAC HOUMARD 1993) As
ficobiliproteinas purificadas possuem uma variedade de funccedilotildees como substituinte
de corantes sinteacuteticos em alimentos e produtos cosmeacuteticos sondas para meacutetodos de
imunodiagnoacutesticos citometria de fluxo e microscopia de fluorescecircncia (STANIER e
COHEN-BAZIRE 1977 SPOLAORE et al 2006)
As maiores classes da ficobiliproteinas satildeo ficoeritrina (PE) ficoeritrocianina
(PEC) ficocianina (PC) e aloficocianina (APC) (CIFERRI 1983) A absorccedilatildeo
maacutexima satildeo 540ndash570 570ndash590 610ndash620 e 650ndash655 nm para PE PEC PC e APC
respectivamente (STANIER COHEN-BAZIRE 1977 CIFERRI 1983)
Aleacutem das ficobiliproteiacutenas as cianobacteacuterias contecircm as clorofilas e os
carotonoacuteides para absorccedilatildeo de energia luminosa Entre os carotenoacuteides encontram-
se o β-caroteno o mais importante e as xantofilas que satildeo carotenos oxigenados
(MARZZOCO TORRES 1999)
As clorofilas satildeo os pigmentos naturais presentes nas plantas cianobacteacuterias e
algas O nome clorofila foi proposto por Pelletier e Caventou em 1818 para
designar a substacircncia verde que se podia extrair das folhas com o auxiacutelio do aacutelcool
Atualmente os pigmentos clorofilianos satildeo de grande importacircncia comercial
podendo ser utilizados tanto como pigmentos quanto como antioxidantes Os
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pigmentos fotossinteacuteticos presentes e a sua abundacircncia variam de acordo com a
espeacutecie A clorofila a (Chl a) estaacute presente em todos os organismos que realizam
fotossiacutentese oxigecircnica As bacteacuterias fotossintetizantes satildeo desprovidas de clorofila a
e possui em seu lugar a bacterioclorofila como pigmento fotossinteacutetico A Chl a eacute o
pigmento utilizado para realizar a fotoquiacutemica (o primeiro estaacutegio do processo
fotossinteacutetico) enquanto que os demais pigmentos auxiliam na absorccedilatildeo de luz e na
transferecircncia da energia radiante para os centros de reaccedilatildeo sendo assim chamados
de pigmentos acessoacuterios (STREIT et al 2005) As cianobacteacuterias possuem clorofila
a e ficobilinas mas natildeo possuem a clorofila b (GRIFFITHS 2006)
As clorofilas satildeo as moleacuteculas fotorreceptoras mais importantes Satildeo moleacuteculas
formadas por complexos derivados da porfirina tendo como aacutetomo central o Mg
(magneacutesio) (Figura 6) Esse composto eacute uma estrutura macrociacuteclica assimeacutetrica
totalmente insaturada constituiacuteda por quatro aneacuteis de pirrol Esses aneacuteis numeram-
se de 1 a 4 ou de ldquoardquo a ldquodrdquo de acordo com o sistema de numeraccedilatildeo de Fisher
(SCHOEFS 2002) A clorofila a o anel de porfirina conteacutem um grupo metil (-CH3) no
Carbono 3 A estrutura quiacutemica da clorofila estaacute representada na Figura 6
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da moleacutecula da clorofila a Fontehttp1381926868bioCoursesbiochem2PhotosynthesisPhotosynthesis1html
Os pigmentos que absorvem luz fazem parte de complexos proteacuteicos que
atravessam a membrana tilacoidal denominados de fotossistemas Esses satildeo
unidades funcionais das reaccedilotildees da fotossiacutentese Cada fotossistema pode conter
vaacuterias moleacuteculas de clorofila carotenoacuteides e ficobilinas todas capazes de absorver
luz por isso denominada de moleacuteculas-antena Os carotenoacuteides e as ficobilinas
apresentam absorccedilatildeo em regiatildeo do espectro luminoso em que as clorofilas
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absorvem pouco e isso permite a ampliaccedilatildeo do espectro luminoso utilizado na
fotossiacutentese (MARZOCCO TORRES 1999)
A composiccedilatildeo de pigmentos da Spirulina eacute tiacutepica de uma cianobacteacuteria a uacutenica
clorofila presente eacute a clorofila a que tem seu peso variando entre 08 e 15 do
peso seco As proteiacutenas que possuem maior potencial econocircmico satildeo as
biliproteiacutenas Nas Spirulinas existem duas biliproteiacutenas c-ficonianina e a
aloficocianina A fraccedilatildeo proteacuteica pode conter mais de 20 de ficocianina um
pigmento azul soluacutevel em aacutegua (VONSHAK 1997) Entre os carotenoiacutedes 67-79 eacute
constituiacutedo do β-caroteno As maiorias dos carotenoacuteides da Spirulina satildeo β-caroteno
β-cryptoxantina e zeaxantina (LORENZ 1999)
Os carotenoacuteides carotenos e xantofilas aleacutem de sua funccedilatildeo de absorver
energia luminosa satildeo capazes de dissipar a energia de excitaccedilatildeo excedente na
forma de calor evitando danos ao aparato fotossinteacutetico Enquanto que como
transdutores de energia ateacute o centro de reaccedilatildeo natildeo satildeo muito eficiente (30 - 40
de eficiecircncia) como dissipadores de energia absorvida em excesso pela clorofila
satildeo altamente eficientes (MANRIQUE 2003)
A zeaxantina eacute capaz de receber a energia diretamente da clorofila excitada e
dissipa-laacute posteriormente na forma de calor sem emissatildeo de radiaccedilatildeo O processo
se inverte quando a luz desaparece ou vai se tornando menos intensa
progressivamente finalizando o ciclo A dissipaccedilatildeo da energia eacute devido a
zeaxantina (MANRIQUE 2003)
Os pigmentos acessoacuterios satildeo fundamentais para a realizaccedilatildeo da fotossiacutentese
pelos organismos Algas que possuem apenas a clorofila a como Ochromonas
malhamensis e a Nannochloris oculata crescem mais rapidamente em presenccedila de
substrato orgacircnico que em presenccedila apenas da luz como fonte de energia mesmo
sob condiccedilotildees oacutetimas de luz Os pigmentos acessoacuterios atuam somente absorvendo
energia contribuindo para a fotossiacutentese (BRODY BRODY 1962)
No entanto a captaccedilatildeo de energia para a funccedilatildeo fotossinteacutetica natildeo eacute a uacutenica
funccedilatildeo dos pigmentos fotossinteacuteticos estes satildeo sistemas fotoprotetores quando a
intensidade luminosa eacute excessiva Quando nem todos os foacutetons absorvidos pela
clorofila podem ser utilizados no processo fotoquiacutemico eacute desencadeado um
mecanismo para dissipar o excesso de energia e evitar danos as membranas
fotossinteacuteticas e a proacutepria clorofila resultando em um branqueamento das ceacutelulas
com uma consequumlente reduccedilatildeo ou perda da capacidade fotossinteacutetica Na presenccedila
50
de excesso de luz o oxigecircnio reage com a clorofila excitada originando um oxigecircno
singlete que eacute muito mais reativo podendo oxidar as clorofilas (branqueamento) os
aacutecidos graxos polinsaturados que forma peroacutexidos e outros compostos Entatildeo os
carotenoacuteides dissipam o radical peroacutexido e tambeacutem a clorofila excitada adquirindo o
estado triplete que por sua vez se dissipa despreendendo calor para o meio externo
(MANRIQUE 2003)
243 Fontes de carbono
De acordo com Chojnacka e Maacuterquez-Rocha (2004b) a fonte de carbono
empregada e a utilizaccedilatildeo ou natildeo de energia luminosa podem classificar os cultivos
em
Cultivo heterotroacutefico ndash emprego exclusivo de compostos orgacircnicos como fonte
energeacutetica O carbono orgacircnico serve tanto como fonte energeacutetica quanto para a
formaccedilatildeo da biomassa
Cultivo autotroacutefico (ou fotoautotroacutefico) ndash emprego da luz como exclusiva fonte
energeacutetica para a reduccedilatildeo (fixaccedilatildeo) do CO2 (considerado de fonte inorgacircnica)
formando substacircncias orgacircnicas
Cultivo mixotroacutefico ndash utilizaccedilatildeo simultacircnea de uma fonte luminosa e carbono
orgacircnico como fonte de energia
2431 Fonte de carbono orgacircnico (crescimento hetorotroacutefico)
A A platensis cresce principalmente em meios de cultura contendo carbono
inorgacircnico e poucos trabalhos tecircm sido publicados utilizando apenas fonte de
carbono orgacircnico Como fonte orgacircnica de carbono os accediluacutecares satildeo os substratos
mais utilizados para os cultivos heterotroacuteficos e mixotroacuteficos (ZHANG et al 1998
MARQUEZ et al 1993 CHOJNACKA NOWORYTA 2004b MUumlHLING et al 2005
ANDRADE COSTA 2007)
Ogawa and Terui (1970) foram os primeiros a relatar que uma cultura axecircnica
de Spirulina platensis cresce em meio mineral enriquecido com 1 de peptona e
tem uma taxa de crescimento maior que as culturas cultivadas em meio mineral
Marquez et al (1993) relataram que a Spirulina platensis cresce heterotroficamente
sob glicose em condiccedilotildees aeroacutebias no escuro bem como mixotroficamente na
presenccedila de luz Chojnacka e Noworyta (2004a) tambeacutem observaram o crescimento
51
da S platensis em condiccedilotildees heterotroacuteficas utilizando a glicose com fonte de
carbono e energia
S platensis podem utilizar tambeacutem glicerol como a uacutenica fonte de carbono no
entanto as ceacutelulas quando em contato com o glicerol pela primeira vez formam
agregados de ceacutelulas e passam por uma fase lag de adaptaccedilatildeo Apoacutes a sua sub-
cultura as ceacutelulas cresceram utilizando glicerol atingido 1287 mg L-1 e nos cultivos
com apenas bicarbonato como fonte de carbono obteve 1157mg L-1 (NARAYAN et
al 2005)
Por outro lado Soundarapandian e Vasanthi (2008) relataram que diferentes
cepas de S platensis isoladas de solo satildeo incapazes de utilizar apenas fontes de
carbono orgacircnico como D-glucose manitol sacarose e ureacuteia
2432 Fonte de carbono inorgacircnico (Crescimento autotroacutefico)
Microalgas fototroacuteficas requerem CO2 como fonte de carbono e este contribui
para o controle do pH no meio O pH do meio de cultivo eacute um dos fatores mais
importantes no cultivo de algas O pH determina a solubilidade do dioacutexido de
carbono e minerais no meio e influencia direta ou indiretamente o metabolismo das
algas O pH depende de vaacuterios fatores como composiccedilatildeo e capacidade tamponante
do meio quantidade de dioacutexido de carbono dissolvido temperatura (que determina a
solubilidade do CO2) e atividade metaboacutelica das ceacutelulas (BECKER 1995)
A fonte de carbono principal para a A platensis eacute o iacuteon bicarbonato no qual
entra na ceacutelula por transporte ativo O bicarbonato intracelular eacute entatildeo desidratado
via anidrase carbonica para CO2 o qual eacute incorporado no ciclo de Calvin via
ribulose-15-bifosfato carboxilase (RUBISCO) Este carbono eacute usado
simultaneamente para a siacutentese de todas as macromoleacuteculas nas ceacutelulas (proteiacutenas
carboidratos lipiacutedios e aacutecidos nucleacuteicos) a partir do 3-fosfoglicerato como metaboacutelito
intermediaacuterio (COGNE et al 2003)
Durante o cultivo autotroacutefico da Spirulina sp ocorre um raacutepido aumento do pH
no meio de cultura e isso eacute causado pela dissociaccedilatildeo do aacutecido carbocircnico (H2CO3)
em bicarbonato (HCO3-) e OH- (KIM et al 2007) e o bicarbonato eacute dissociado para
produzir CO2 e OH- (RICHMOND GROBBELAAR 1986) O aumento do pH atua
como um autoinibidor do crescimento celular (RICHMOND 2000) e portanto o CO2
pode ser utilizado para a manutenccedilatildeo do pH oacutetimo
52
Em cianobacteacuterias alcalofiacutelicas onde o pH de crescimento tiacutepico eacute 10 a
concentraccedilatildeo de CO2 eacute negligenciada sugerindo que o transporte de CO2 passivo
natildeo poderia contribuir significativamente para carbono inorgacircnico intracelular
Adicionalmente estudos tecircm mostrado que A platensis eacute fortemente dependente do
transporte simporte Na+HCO3- para a assimilaccedilatildeo do carbono inorgacircnico Como eacute
tiacutepico de alcalofiacutelicos a A platensis aparentemente natildeo manteacutem o gradiente de pH
externo positivo na sua membrana plasmaacutetica Consequentemente ocorre uma
extrusatildeo de soacutedio via bomba de soacutedio dependente de ATP em contraste com o
tranporte antiporte Na+H+ na maioria das cianobacteacuterias A Extrusatildeo de soacutedio na
presenccedila de um inibidor do FSII (diuron) indica que uma soma significante de ATP eacute
suplementada pelo transporte de eleacutetrons ciacuteclico em volta do FSI conteuacutedo na qual
em A platensis eacute excepcionalmente alto (BERRY et al 2003)
Anaacutelises quiacutemicas tecircm mostrado que biomassa algal consiste de 40 a 50 de
carbono na qual sugere que 15 a 2 kg de CO2 satildeo necessaacuterios para produzir 1 kg
de biomassa (SOBCZUK et al 2000) Do mesmo modo Chisti (2007) relata que
considerando que a biomassa microalgal possui aproximadamente 50 de carbono
em sua biomassa seca (SAacuteNCHEZ MIROacuteN et al 2003) todo esse carbono eacute
derivado do dioacutexido de carbono A produccedilatildeo de 100 toneladas de biomassa algal fixa
em torno de 183 toneladas de dioacutexido de carbono e este deve ser suplementado
continuamente durante o cultivo iluminado A adiccedilatildeo controlada do CO2 em
respostas aos sinais de sensores de pH minimizam a perda de CO2 e a variaccedilatildeo do
pH (CHISTI 2007)
O sistema de transporte do CO2 inclui a anidrase carbocircnica que converte o CO2
para HCO3- durante a passagem atraveacutes da membrana plasmaacutetica havendo um
acuacutemulo de HCO3- quando o CO2 eacute suplementado A concentraccedilatildeo de CO2
citoplasmaacutetico eacute abaixo do esperado no equiliacutebrio quiacutemico e de acordo com o
modelo proposto pelo mecanismo de concentraccedilatildeo de carbono esse desequiliacutebrio eacute
relatado pelo fato que a anidrase carbocircnica estaacute localizada dentro dos
carboxissomos na membrana plasmaacutetica eou membranas tilacoacuteidais e estaacute ausente
no citoplasma (KAPLAN REINHOLD 1999)
O CO2 entra na ceacutelula pela difusatildeo passiva e a conversatildeo do CO2 para o HCO3-
pela anidrase carbocircnica natildeo permite a sua passagem livremente para fora da ceacutelula
(CARRIERI et al 2007) A concentraccedilatildeo de CO2 nos carboxissomos eacute de 50000
vezes maior que a concentraccedilatildeo extracelular Isso implica em uma resistecircncia a
53
difusatildeo do CO2 pela membrana bioloacutegica extremamente alta apesar do CO2 ser
altamente permeaacutevel agrave membrana bilipiacutedica Geralmente as algas apresentam um
acuacutemulo de carbono inorgacircnico menor que em cianobacteacuterias isso por que a
RubisCO das algas apresentam maior afinidade pelo CO2 (KAPLAN REINHOLD
1999)
O CO2 que entra na ceacutelula por difusatildeo passiva eacute convertido para HCO3- pela
ldquoCA-likerdquo por uma reaccedilatildeo dependente de energia e a assimilaccedilatildeo ativa do HCO3-
que eacute contra seu potencial eletroquiacutemico depende do suplemento da energia
metaboacutelica Essa energia necessaacuteria eacute provavelmente dependente do transporte
ciacuteclico do eleacutetron em torno do FSI e da atividade do FSII (SOBCZUK et al 2000)
Portanto isso ainda natildeo tem sido estabelecido se esta dependecircncia eacute direta ou
indireta (via gradiente de iacuteons) A energia metaboacutelica deveria ser utilizada para
manter o gradiente de iacuteon O antiporte Na+H+ estaacute envolvido na regulaccedilatildeo e
manutenccedilatildeo do pH interno durante a entrada do HCO3- e subsequumlente fixaccedilatildeo do
CO2 (KAPLAN REINHOLD 1999)
As microalgas podem fixar carbono a partir de diferentes fontes tais como CO2
a partir da atmosfera CO2 a partir da exaustatildeo de gases industriais e CO2 na forma
de carbonatos soluacuteveis (eg NaHCO3 e Na2CO3) Tradicionalmente microalgas satildeo
cultivadas em reatores fechados ou abertos na qual satildeo aerados ou expostos ao ar
para permitir que a microalgas capturem o dioacutexido de carbono a partir da atmosfera
para o crescimento celular Como a atmosfera conteacutem somente 003 ndash 006 de
CO2 eacute esperado que a limitaccedilatildeo da transferecircncia de massa possa reduzir a
velocidade do crescimento das microalgas (CHELF et al 1993) Por outro lado
gases da exaustatildeo industrial tais como gases de combustatildeo possuem acima de 15
de CO2 fornecendo uma fonte rica de CO2 para o cultivo de microalgas e um
caminho potencialmente mais eficiente para biofixaccedilatildeo de CO2 Outra alternativa eacute
fixar o CO2 pela reaccedilatildeo quiacutemica para produzir carbonatos (exemplo Na2CO3) e usa-
la mais tarde como fonte de carbono para o cultivo de microalgas (WANG et al
2008)
Estudos sobre a eficiecircncia da utilizaccedilatildeo de CO2 por microalgas tecircm sido feitos
com o objetivo de melhorar a produtividade dos fotobiorreatores Morais e Costa
(2007b) observou que uma concentraccedilatildeo de Spirulina sp foi maior em cultivos
alimentados com 6 e 12 CO2 quando comparado ao cultivo utilizando somente o
ar atmosfeacuterico Watabane e Hall (1996) relataram um aumento na produtividade
54
correspondendo a 159 g de biomassa seca m-2 d-1 no cultivo utilizando o
fotobiorreator com air lift com ar enriquecido de CO2 (4)
Gordillo et al (1999) observaram uma reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo celular
maacutexima de S platensis devido a reduccedilatildeo na quantidade de proteiacutenas soluacuteveis
clorofila a carotenoacuteides totais e ficocianina nos cultivos enriquecido com 1 de CO2
em relaccedilatildeo aos cultivos enriquecidos com CO2 atmosfeacuterico (0035) Portanto altas
concentraccedilatildeo de CO2 podem inibir o crescimento dos micro-organismos
Em cultivo fotoautotroacutefico de Chlorella o conteuacutedo de proteiacutenas e pigmentos
foram maiores quando comparada com o cultivo heterotroacutefico (OGBONNA TANAKA
1997)
2433 Fonte de carbono inorgacircnico e orgacircnico simultaneamente
(crescimento mixotroacuteficos)
A presenccedila do metabolismo fotoautotroacutefico e heterotroacutefico simultacircneo tecircm sido
confirmado para o crescimento de microalgas como por exemplo Chlorella vulgaris
(MAacuteRQUEZ et al 1993) Heamatococcus pluvialis (KOBAYASHI et al 1992
MAacuteRQUEZ et al 1993) Chlorella pyrenoidosa (OGBANNA TANAKA 1996)
Euglena gracilis (OGBONNA et al 1999) Phaeodactylum tricornutum (CEacuteRON
GARCIA et al 2000) e cianobacteacuterias como Spirulina platensis (MARQUEZ et al
1995 CHOJANACKA NOWORYTA 2004 ZHANG et al 1998)
Durante o crescimento mixotroacutefico haacute dois processos metaboacutelicos
independentes dentro das ceacutelulas metabolismo fotossinteacutetico e a respiraccedilatildeo
aeroacutebia Nesse tipo de metabolismo a presenccedila do substrato orgacircnico significa que o
crescimento celular natildeo eacute estritamente dependente da fotossiacutentese e ateacute mesmo a
luz pode deixar de ser um fator indispensaacutevel para o crescimento celular
(CHOJNACKA NOWORYTA 2004a)
Eacute interessante notar que o crescimento especiacutefico de algumas microalgas (ex
Chlorella vulgares Haematococus pluvialis) crescendo mixotroficamente eacute a soma
de suas velocidades especiacuteficas de crescimento em culturas fotossinteacuteticas e
heterotroacuteficas (LEE 2001 OGBONNA et al 2000)
Um possiacutevel modo para obter uma alta concentraccedilatildeo de micro-organismos
fotossinteacuteticos eou produtos desses micro-organismos eacute o uso de cultura
mixotroacutefica onde fontes de carbono orgacircnicas e inorgacircnicas satildeo concomitantemente
fornecidas ao biorreator Sob determinadas condiccedilotildees de cultivo ambas a atividade
55
fotoautotroacutefica e a heterotroacutefica podem ocorrer simultaneamente e
independentemente resultando no aumento da velocidade especiacutefica de
crescimento como jaacute referido anteriormente
Maacuterquez et al (1993) relatam que a Spirulina platensis eacute capaz de crescer em
cultivo heterotroacutefico na presenccedila de glicose bem como mixotroficamente na
presenccedila de luz sugerindo que os crescimentos autotroacutefico e heterotroacutefico
funcionam independentemente no crescimento mixotroacutefico Nieva e Valiente (1996)
portanto observaram uma reduccedilatildeo na taxa de fixaccedilatildeo de CO2 em condiccedilotildees de
crescimento mixotroacutefico da Anabaena variabilis sugerindo que alguns aspectos do
metabolismo do CO2 podem ser modulados pela presenccedila de carbono orgacircnico Do
mesmo modo Kang et al (2004) observou que pode existir alguma interaccedilatildeo entre o
metabolismo de carbono orgacircnico e inorgacircnico uma vez que a presenccedila do carbono
inorgacircnico acelerou a assimilaccedilatildeo do carbono orgacircnico durante o cultivo do
Synechococcus spPCC7002 A intensidade luminosa favoreceu o crescimento
mixotroacutefico do Synechocystis sp PCC 6803 utilizando glicose como fonte de
carbono Este fenocircmeno pode ser explicado pelo efeito positivo da luz sobre o
fotossistema I (WANG et al 2002) A via glicoliacutetica o ciclo dos aacutecidos tricarboxiacutelicos
(TCA) e a fosforilaccedilatildeo oxidativa mitocondrial mantiveram alta atividade nos cultivos
de Chlorella pyrenoidosa durante a iluminaccedilatildeo indicando pouco efeito da luz nessas
vias metaboacutelicas Portanto o fluxo atraveacutes da via das pentoses fosfato durante a
iluminaccedilatildeo foi muito pequena devido a regulaccedilatildeo mediada pela luz (YANG et al
2000)
Adicionalmente Maacuterquez et al (1993) concluiacuteram que a Spirulina platensis tem
a habilidade de realizar a fermentaccedilatildeo embora soacute utilize essa estrateacutegia como um
modo de sobrevivecircncia sob condiccedilotildees anaeroacutebicas e no escuro
Nos cultivos de S platensis suplementados com glicose alcanccedilaram o
crescimento maior que nos cultivos sob condiccedilotildees de crescimento fotoautotroacuteficos
(MARQUEZ et al 1995 1993) Chen et al (2006) observaram que a suplementaccedilatildeo
de acetato como fonte de carbono proporcionou um aumento significante da
concentraccedilatildeo celular e da produccedilatildeo de clorofila a luteiacutena -caroteno ficocianina e
aloficocianina quando comparada ao cultivo fotoautotroacutefico
O melaccedilo subproduto da induacutestria de accediluacutecar que conteacutem mais do que 50 de
accediluacutecar tambeacutem pode ser um substrato suplementado de baixo custo na produccedilatildeo
56
industrial para o crescimento mixotroacutefico de Spirulina platensis (ANDRADE COSTA
2007)
O emprego de cultivos mixotroacuteficos pode levar as ceacutelulas agrave siacutentese de
compostos caracteriacutesticos tanto de cultivos fotoautotroacuteficos quanto heterotroacuteficos
como pode implicar em altas taxas de produccedilatildeo de biomassa (CERON GARCIA et
al 2000) Uma vez que num cultivo mixotroacutefico o CO2 e o carbono orgacircnico satildeo
simultaneamente assimilados este tipo de cultivo pode ser o processo mais eficiente
para a produccedilatildeo de biomassa microalgal visto que implica em uma economia na
energia gasta para a siacutentese de todo o aparato fotossinteacutetico e para a fixaccedilatildeo de
carbono (LEE 2004)
25 Produccedilatildeo de CO2 e VOCs proveniente da fermentaccedilatildeo alcoacuteolica
A revoluccedilatildeo industrial e a intesa utilizaccedilatildeo dos combustiacuteveis foacutesseis (carvatildeo
petroacuteleo e gaacutes natural) estatildeo associadas ao elevado niacutevel de vida das sociedades
ocidentais Contudo as reservas de combustiacuteveis foacutesseis satildeo limitadas e a sua
utilizaccedilatildeo tem impactos ambientais consideraacuteveis como por exemplo o aumento do
efeito estufa e as consequumlentes alteraccedilotildees do clima Neste contexto o etanol surge
como uma alternativa vaacutelida em termos de fonte de energia renovaacutevel e menos
poluente
Nas uacuteltimas deacutecadas o etanol tem ocupado um lugar de destaque e de grande
importacircncia tecnoloacutegica firmando-se como um produto estrateacutegico economicamente
por ser amigaacutevel com o meio ambiente pois eacute um aditivo ao combustiacutevel que reduz
a emissatildeo de monoacutexido de carbono oacutexido de nitrogecircnio e hidrocarbonos (WHEALS
et al 1999) e por ser produzido a partir de biomassa renovaacutevel como accediluacutecar e
amido atualmente e materiais de lignocelulose no futuro (GOLDEMBERG 2009)
Inicialmente o objetivo de utilizar o aacutelcool combustiacutevel era se tornar
independente do mercado do petroacuteleo e reduzir os custos de sua importaccedilatildeo Hoje
em dia a ecircnfase do uso do etanol combustiacutevel estaacute sobre a reduccedilatildeo da poluiccedilatildeo
devido ao protocolo de Quioto para limitar o aquecimento global (WHEALS et al
1999) Na produccedilatildeo e combustatildeo do etanol de milho pode reduzir em ateacute 12 a
emissatildeo de gases causadoras do efeito estufa quando comparado com o uso de
combustiacuteveis foacutesseis (HILL et al 2006) e quando utilizado etanol de cana-de-accediluacutecar
essa reduccedilatildeo pode ser de 66 (ANDREOLI SOUZA 2006)
57
O aacutelcool estaacute em expansatildeo por ser um combustiacutevel de baixo custo renovaacutevel e
cujo emprego como alternativa para a matriz energeacutetica mundial estaacute em fase de
crescimento A tendecircncia de aumento da produccedilatildeo de aacutelcool no Brasil ocorre por
vaacuterios fatores como aumento da frota de carros bi-combustiacutevel (demanda interna)
Protocolo de Quioto (demanda externa) e aumento do preccedilo do petroacuteleo Poliacuteticas
similares tecircm sido adotadas pela Uniatildeo Europeacuteia Japatildeo e Estados Unidos
(GOLDEMBERG et al 2007) Por essas razotildees a demanda por etanol no mercado
internacional tem sido crescente nos uacuteltimos anos O Brasil aleacutem de ser um dos
maiores produtores e consumidores de etanol eacute tambeacutem o maior exportador no
cenaacuterio global Segundo dados da Uniatildeo da Induacutestria de Cana de Accediluacutecar (Unica) ateacute
2016 o Brasil produziraacute 129 bilhotildees de litros de etanol para o mercado externo Na
safra 20082009 o total de etanol produzido foi de 275 bilhotildees de litros (UacuteNICA)
O Brasil e os Estados Unidos satildeo liacutederes mundiais na produccedilatildeo de etanol
utilizando como mateacuteria prima a cana de accediluacutecar e milho respectivamente Os dois
paiacuteses acumulam cerca de 70 da produccedilatildeo mundial (ROMERO 2007) Aleacutem disso
o Brasil lidera a produccedilatildeo mundial de cana-de-accediluacutecar (principal mateacuteria-prima do
etanol) sendo essa uma induacutestria que movimenta vaacuterios bilhotildees de doacutelares por ano
O fato de o etanol ser produzido dentro do Brasil representa uma menor
dependecircncia de petroacuteleo externo diminuindo substancialmente os gastos com
importaccedilotildees
O agronegoacutecio da cana-de-accediluacutecar movimenta R$ 40 bilhotildees por ano no paiacutes A
safra 20072008 ficou entre 547 milhotildees de toneladas de cana-de accediluacutecar 152 a
mais do que a safra anterior Metade dela eacute destinada agrave fabricaccedilatildeo de etanol o que
faz do Brasil o segundo maior produtor de combustiacutevel no mundo O primeiro lugar
cabe aos Estados Unidos que extraem etanol de milho a poder de pesados
subsiacutedios Dois terccedilos da produccedilatildeo nacional estatildeo no estado de Satildeo Paulo Avalia-
se que o Brasil precisaraacute dobrar sua produccedilatildeo num horizonte de 5 a 7 anos se
quiser suprir as demandas locais e internacionais do combustiacutevel Isso exigiraacute a
construccedilatildeo de novas usinas o crescimento das aacutereas plantadas melhorias no
manejo e principalmente ganhos de produtividade (MARQUES 2008)
O cenaacuterio futuro mostra que paiacuteses como Estados Unidos Japatildeo e Europa vatildeo
precisar importar mais de 10 bilhotildees de litros de etanol ateacute 201112 Se uma
tonelada de cana produz 88 litros de etanol precisaria adicionar mais de 110
milhotildees de toneladas de cana para atender o mercado futuro o que acrescentaria
58
mais 12 milhotildees de hectares A UNICA (Uniatildeo da induacutestria de cana-de-accediluacutecar)
prevecirc um crescimento da produccedilatildeo de 6 a 7 anualmente chegando a uma
produccedilatildeo de 560 milhotildees de toneladas de cana em 201011 (ANDREOLI SOUZA
2006)
A quantidade de CO2 liberada diretamente para a atmosfera devido ao aumento
da sua produccedilatildeo mundial pode causar prejuiacutezos ao meio ambiente No Brasil a
produccedilatildeo de etanol por processos fermentativos principalmente pelo processo
descontiacutenuo alimentado ou contiacutenuo utilizando mosto de melaccedilo de cana-de-accediluacutecar
eou caldo de cana-de-acuacutecar tem no cultivo da Saccharomyces cerevisiae um
grande impacto no acircmbito socioeconocircmico Existem cerca de 300 induacutestrias que
utilizam fermentaccedilatildeo alcooacutelica no Brasil que movimentam bilhotildees de doacutelares e
geram 6 dos empregos totais do Paiacutes (Uniatildeo da Agroinduacutestria Canavieira de Satildeo
Paulo 2006)
No Brasil 70 das destilarias de cana-de-accediluacutecar usam o processo
descontiacutenuo com uma capacidade fermentativa acima de 15 milhotildees de litros de
etanol por dia e aproximadamente 350 destilarias usam a fermentaccedilatildeo contiacutenua
(WHEALS et al 1999) Estudos comparativos e avaliaccedilotildees econocircmicas de diversos
processos utilizados na produccedilatildeo de etanol concluiacuteram que fermentaccedilatildeo contiacutenua
apresentava uma reduccedilatildeo de 57 no investimento de capital fixo em destilarias
quando comparado ao daquelas que utilizam processo em batelada Uma reduccedilatildeo
ainda maior de 68 e 71 eacute obtida para os processos que utilizam reciclo de ceacutelulas
e operaccedilatildeo a vaacutecuo respectivamente (CYSEWSKI WILKE 1978)
A fermentaccedilatildeo contiacutenua apresenta menor custo de investimento maior
facilidade para a instalaccedilatildeo de sistemas de automaccedilatildeo e ausecircncia de ldquotempos
mortosrdquo que eacute o tempo em dado momento do ciclo fermentativo natildeo estaacute produzindo
tiacutepico de processos descontiacutenuo Aleacutem disso a fermentaccedilatildeo contiacutenua tende a
consumir menos anti-espumante decorrecircncia da alimentaccedilatildeo mais estaacutevel de
accediluacutecar para o processo e tambeacutem da geometria dos fermentadores Por outro lado
a fermentaccedilatildeo contiacutenua apresenta maiores dificuldades quando temos que lidar com
contaminantes indesejaacuteveis no processo Natildeo eacute possiacutevel promover a assepsia de
fermentadores de bombas e de trocadores com frequumlecircncia como ocorre no sistema
em bateladas Desta maneira a fermentaccedilatildeo contiacutenua tende a consumir mais aacutecido
sulfuacuterico e mais antibioacutetico
59
Segundo Romano et al (2003) as transformaccedilotildees quiacutemicas que ocorrem
durante a fermentaccedilatildeo por leveduras satildeo a conversatildeo dos accediluacutecares em etanol e
CO2 e em menores quantidades a formaccedilatildeo de CVOs Basso et al (1996) relata
que durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica por levedura os produtos da fermentaccedilatildeo satildeo
constituiacutedos de 43 ndash 47 de etanol 41 - 45 de gaacutes carbocircnico e o restante satildeo
formados por outros compostos orgacircnicos tais como glicerol aacutecido succiacutenico aacutecido
aceacutetico entre outros Dentre os volaacuteteis orgacircnicos majoritaacuterios produzidos durante a
fermentaccedilatildeo de mosto de cana-de-accediluacutecar por Saccharomyces cerevisiae
encontram-se o etanol acetaldeiacutedo propanol isobutanol aacutelcool isoamiacutelico acetato
de etila (CACHOT et al 1991) Durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica do mosto de cana-
de-accediluacutecar os principais componentes gasosos satildeo o CO2 e o etanol mas outros
aacutelcoois e aacutecidos tambeacutem satildeo liberados em menores quantidades na forma gasosa
(VENTURINI FILHO e MENDES 2003)
A reaccedilatildeo quiacutemica simplificada da produccedilatildeo de etanol a partir da sacarose da
cana-de-accediluacutecar eacute
C12H22O11 +H2O rarr 4C2H5OH + 4CO2 (3)
Onde 342 g de sacarose produz 184 g de etanol e 176 g de CO2 Com isso
pode-se estimar que cada grama de sacarose produz 0514g de CO2 assumindo
uma recuperaccedilatildeo de CO2 em 100 no caso de induacutestrias dedicadas a produccedilatildeo de
etanol No entanto as induacutestrias de produccedilatildeo de etanol tambeacutem utilizam como
mateacuteria-prima o melaccedilo um sub-produto da produccedilatildeo de accediluacutecar industrial a partir
da cana-de-accediluacutecar que conteacutem cerca de 15 da sacarose inicial (MOLLERSTEN et
al 2003) e represeta mais de 75 do custo total de produccedilatildeo de etanol
(CYSEWSKI WILKE 1978)
Cada litro de etanol produzido pela fermentaccedilatildeo alcooacutelica resulta em
aproximadamente 076 kg de CO2 portanto a capacidade de produccedilatildeo de CO2
durante a fermentaccedilatildeo de etanol combustiacutevel nos EUA e o Brasil eacute de
aproximadamente 84 e 106 toneladas de CO2 por ano respectivamente
(KHESHGI PRICE 2005) No Brasil a produccedilatildeo meacutedia de etanol a partir da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica eacute de 180 milhotildees de litros por ano gerando
consequentemente 014 milhotildees de CO2 por ano (MOLLERTEN et al 2003)
O uso do biocombustiacutevel traz uma seacuterie de benefiacutecios associados agrave reduccedilatildeo
dos gases de efeito estufa e de outros poluentes atmosfeacutericos tais como o enxofre
aleacutem da reduccedilatildeo do consumo de combustiacuteveis foacutesseis Poreacutem no processo de
60
fabricaccedilatildeo uma seacuterie de resiacuteduos e subprodutos industriais eacute gerada os quais
podem quando adequadamente geridos contribuir para a viabilidade econocircmica da
produccedilatildeo de biocombustiacuteveis Esses resiacuteduos possuem potencial para uso na
induacutestria de alimentos e para a nutriccedilatildeo animal bem como na induacutestria quiacutemico-
farmacecircutica mas haacute uma grande carecircncia de estudos de anaacutelises de viabilidade
teacutecnica e financeira que possam apontar as melhores alternativas de custo-
benefiacutecio para o processamento e tratamento desses resiacuteduos os quais podem
agregar valor e reduzir os custos de produccedilatildeo de biocombustiacuteveis com o
aproveitamento e venda destes produtos e seus derivados
Um nuacutemero de subprodutos da induacutestria do etanol combustiacutevel pode ter o
potencial para a aplicaccedilatildeo de nutracecircuticos ou de alimentos funcionais que eacute uma
das aacutereas de grande interesse atualmente e representa um mercado potencial
enorme ainda em seu desenvolvimento inicial Por isso o interesse em utilizar
micro-organismos fotossintetizantes devido a sua capacidade de reduzir a emissatildeo
de CO2 e de CVOs na atmosfera subproduto da induacutestria de etanol produzindo
compostos de alto valor industrial
61
3 Objetivos
Geral
Este trabalho tem como objetivo verificar a influecircncia do efeito da adiccedilatildeo de
CO2 proveniente de cilindro ou da fermentaccedilatildeo alcooacutelica mantendo o pH no valor
oacutetimo igual a 95 no cultivo de A platensis em reatores tubulares utilizando nitrato ou
ureacuteia como fonte de nitrogecircnio em diferentes intensidades luminosas
Especiacuteficos
Avaliar os testes preliminares da fermentaccedilatildeo alcoacuteolica contiacutenua utilizada para
posterior acoplamento dos gases liberados durante a fermentaccedilatildeo com os
cultivos de A platensis
Avaliar os paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima produtividade em ceacutelulas
e fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas usando anaacutelise de variacircncia
multivariaacutevel nos cultivos de A platensis
Determinar a composiccedilatildeo centesimal da A platensis no final dos cultivos teor
de proteiacutenas lipiacutedios cinzas e carboidratos usando a anaacutelise de variacircncia
multivariaacutevel
Estudar os paracircmetros bioenergeacuteticos da A platensis durante os cultivos
utilizando CO2 de cilindro avaliando os andamentos em funccedilatildeo do tempo dos
paracircmetros valor teoacuterico da energia de Gibbs dissipada para o crescimento
(1YGX) das produccedilotildees molares de O2 consumo de H+ e absorccedilatildeo de foacutetons
para produzir 1 C-mol de biomassa
Calcular o rendimento teoacuterico da energia fixada pelo aparato fotossinteacutetico
energia transformada em ATP e a energia liberada como calor calculando-se a
partir da energia molar de Gibbs absorvida da luz pelo aparato fotossinteacutetico
Comparar o comportamento celular em duas diferentes configuraccedilotildees de
fotobiorreatores tubulares um horizontal e outro helicoidal
62
4 Materiais e meacutetodos
41 Fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
O CO2 proveniente da fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua foi utilizado como fonte
de carbono para o cultivo de A platensis O desprendimento desse gaacutes do reator foi
arrastar volaacuteteis orgacircnicos formados na fermentaccedilatildeo cujas interferecircncias nos
cultivos de A platensis foram avaliadas Para os cultivos contiacutenuos de fermentaccedilatildeo
alcooacutelica foi utilizado o mosto de melaccedilo de cana-de-accediluacutecar
411 Testes preliminares para emprego da fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
4111 Teste para avaliar a influecircncia do tratamento do melaccedilo na
determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular
Para a realizaccedilatildeo desse teste foi preparada uma suspensatildeo celular de 300g L-1
de levedura uacutemida em aacutegua destilada a partir dessa suspensatildeo foram retirados sob
agitaccedilatildeo 10 mL e adicionados em dois diferentes frascos um contendo 290 mL de
melaccedilo natildeo clarificado (item 41111) e outro contendo 290 mL de melaccedilo
previamente clarificado (item 41112) de modo que a concentraccedilatildeo celular final de
cada frasco tenha 10g L-1 em 300 mL de mosto A partir dessa suspensatildeo foram
retirados 5 mL para a anaacutelise da concentraccedilatildeo celular como descrito no item 4311
41111 Melaccedilo natildeo tratado
O melaccedilo natildeo tratado consiste apenas na sua diluiccedilatildeo com aacutegua potaacutevel e
preparado como descrito no item 41113
41112 Melaccedilo tratado
O tratamento do melaccedilo consistiu de sua preacutevia clarificaccedilatildeo diluiccedilatildeo e
suplementaccedilatildeo adequadas A clarificaccedilatildeo foi realizada com diluiccedilatildeo do melaccedilo pela
adiccedilatildeo de aacutegua potaacutevel em partes iguais e adiccedilatildeo de 15 g de fosfato de soacutedio
monobaacutesico como agente floculante em cada litro da soluccedilatildeo de melaccedilo diluiacutedo
Posteriormente esse melaccedilo diluiacutedo foi autoclavado a 121 ordmC por 10 minutos Apoacutes
o aquecimento foi mantido em repouso no miacutenimo por 48 horas para a
sedimentaccedilatildeo do material em suspensatildeo O melaccedilo clarificado foi entatildeo sifonado
63
pronto para ser diluiacutedo com aacutegua e preparado como descrito no item 41113 sem
a adiccedilatildeo do antibioacutetico O mosto foi esterilizado em autoclave a 121 ordmC durante 30
minutos (PEREGO JUacuteNIOR 1979)
41113 Preparaccedilatildeo do melaccedilo
O melaccedilo foi diluiacutedo ateacute concentraccedilatildeo 170 g L-1 em accediluacutecares redutores totais
(ART) (GUERREIRO et al 1997) e suplementado com ureacuteia na concentraccedilatildeo de 05
g L-1 suficiente para que a fonte de nitrogecircnio natildeo se torne fator limitante da
atividade da levedura (MAGALHAtildeES 1978 CARVALHO 1994 PEREGO-JUNIOR
1979) O pH do mosto foi ajustado em 45 (JONES et al 1981) pela adiccedilatildeo de aacutecido
sulfuacuterico concentrado ou pela adiccedilatildeo de soluccedilatildeo de hidroacutexido de soacutedio 4N Por fim
adicionou-se penicilina V aacutecida (500 UIL) como antibioacutetico (AQUARONE 1960
CARVALHO et al 2003)
4112 Teste para avaliar a homogeneidade do reator
Para a realizaccedilatildeo do teste de homogeneidade foi preparado 10 litros de uma
suspensatildeo celular de 9 g L-1 de levedura em aacutegua destilada e adicionada ao
fermentador Apoacutes 30 minutos de homogeneizaccedilatildeo mecacircnica do material iniciou
uma contiacutenua adiccedilatildeo de aacutegua destilada e retirada da amostra a uma vazatildeo
especiacutefica de alimentaccedilatildeo calculada (Dc) igual a 0124 h-1 No intervalo de 30
minutos em diferentes regiotildees do reator as amostras foram recolhidas para
determinar a concentraccedilatildeo celular A homogeneidade do reator eacute verificada se a
queda da concentraccedilatildeo celular for uma funccedilatildeo exponencial
4113 Teste para determinar a vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo
Foram realizados 3 experimentos com a fermentaccedilatildeo contiacutenua nas condiccedilotildees
descritas no item 415 Os valores de vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo (D) foram 01
h-1 005 h-1 e 0025 h-1
412 Micro-organismo e condiccedilotildees de manutenccedilatildeo
Saccharomyces cerevisiae CCT7150 uma cepa isolada de planta industrial de
fermentaccedilatildeo alcooacutelica nacional (Usina Nova Ameacuterica) e produtora de altas
concentraccedilotildees de etanol a partir de melaccedilo adquirida da Fundaccedilatildeo Andreacute Tosello
foi utilizada nos cultivos contiacutenuos Sua manutenccedilatildeo em tubo de ensaio foi no meio
Sabourand (Merckreg) A cultura foi armazenada sob refrigeraccedilatildeo a 4 ordmC
64
413 Preparo do inoacuteculo
As ceacutelulas de levedura estocada foram multiplicadas em tubos contendo meio
soacutelido Sabourand e incubadas em estufa a 30 ordmC por 24 h Posteriormente as
culturas foram inoculadas com alccedila de platina sob condiccedilotildees asseacutepticas em tubos
contendo 10 mL do meio Sabourand e incubadas em estufa a 30 ordmC por 24 h Cada
tubo por sua vez inoculou um frasco de Erlenmeyer de 500 mL contendo 90 mL de
mosto de melaccedilo de cana-de-accediluacutecar contendo 5 de ART que foi entatildeo incubado
a 30 ordmC por 12 h em agitador rotativo a 400 rpm Decorrido este tempo o conteuacutedo
de 10 frascos de Erlenmeyer preparados com o preacute-inoacuteculo (1 L) foi adicionado agrave
dorna juntamente com o mosto (9 L) nas condiccedilotildees em que se trabalhou no
processo contiacutenuo resultando em um volume uacutetil do fermentador de 10 litros que
deu iniacutecio a uma fermentaccedilatildeo descontiacutenua (PEREGO JUacuteNIOR 1979)
414 Dispositivo para a cultura
Foi utilizado um fermentador fabricado pela INFORs HT com dornas de vidro
de 10 litros de capacidade nominal com controles de temperatura pH niacutevel de
espuma e frequumlecircncia de agitaccedilatildeo com saiacutedas que foram conectadas a uma bomba
peristaacuteltica para alimentaccedilatildeo do mosto e retirada do material durante a fermentaccedilatildeo
contiacutenua
415 Descriccedilatildeo das condiccedilotildees de fermentaccedilatildeo contiacutenua
O cultivo contiacutenuo teve como iniacutecio o cultivo descontiacutenuo como descrito acima
(item 413) A alimentaccedilatildeo contiacutenua do mosto ocorreu apoacutes um periacuteodo de 6 a 8 h
da inoculaccedilatildeo do S cerevisiae na dorna para garantir que o micro-organismo se
encontre na fase exponencial de crescimento A concentraccedilatildeo de accediluacutecares no mosto
de alimentaccedilatildeo foi de 170 g L-1 (GUERREIRO et al 1997) expressa em ART O
mosto foi suplementado com sulfato de amocircnio na concentraccedilatildeo de 1 g L-1 A
temperatura de fermentaccedilatildeo foi mantida a 30 plusmn 1 ordmC (KOCK et al 2000) com
frequumlecircncia do agitador de 500 rpm A vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo foi
determinada em ensaios preliminares (item 61)
65
42 Cultivo de A platensis
421 Micro-organismo e manutenccedilatildeo
Spirulina (Arthrospira) platensis UTEX (1926) foi mantida em meio liacutequido de
cultivo padratildeo para Arthrospira (item 4221) em tubos hermeticamente fechados
422 Meio de cultivo
Foram utilizados dois tipos de meio Um meio padratildeo para o cultivo de
Arthrospira (SCHLOumlSSER 1982) ndash item 4221 com NaNO3 como fonte de
nitrogecircnio que foi utilizado para duas finalidades manutenccedilatildeo do micro-organismo e
preparo do inoacuteculo um meio modificado (item 4122) onde se utilizou ureacuteia como
fonte de nitrogecircnio
4221 Meio padratildeo para cultivo de A platensis
O meio mineral padratildeo foi o de Schloumlsser (1982) cuja composiccedilatildeo por litro de
aacutegua destilada eacute a seguinte
NaHCO3 1361g
Na2CO3 403g
K2HPO4 050g
NaNO3 250g
K2SO4 100g
NaCl 100g
MgSO47H2O 020g
CaCl22H2O 004g
Soluccedilatildeo de metal PIV 6mL
Soluccedilatildeo de micronutrientes Chu 1mL
Vitamina B12 (15g100mL H2O) 1mL
Soluccedilatildeo de metal PIV (em 1 litro de aacutegua destilada)
Na2EDTA 750 mg
FeCl36H2O 97 mg
MnCl24H2O 41 mg
ZnCl2 5 mg
CoCl26H2O 2 mg
Na2MoO42H2O 4 mg
66
Soluccedilatildeo de micronutrientes Chu (em 1 litro de aacutegua destilada)
Na2EDTA 50 mg
H3BO3 618 mg
CuSO45H2O 196 mg
ZnSO47H2O 44 mg
CoCl26H2O 20 mg
MnCl2middot4H2O 12 mg
Na2MoO4middot2H2O 12 mg
4222 Meio modificado
O meio de Schloumlsser (1982) foi utilizado com substituiccedilatildeo do nitrato de soacutedio
por ureacuteia
A massa diaacuteria de ureacuteia adicionada por unidade de volume foi determinada de
acordo com o experimento padratildeo utilizando nitrato de soacutedio como fonte de
nitrogecircnio (descrito no item 5)
423 Preparo do inoacuteculo
A A platensis foi inoculada em 10 mL de meio liacutequido (em tubo de ensaio) em
condiccedilotildees asseacutepticas Depois de 7 dias esse material foi utilizado para inocular
frascos de Erlenmeyer de 500 mL com 200mL de meio de cultivo padratildeo (item
4121) previamente esterilizado por autoclavaccedilatildeo
Os erlenmeyers apoacutes o repique foram imediatamente levados a agitador
rotativo a 100 min-1 (FERRAZ 1986) temperatura de 30 OC e iluminacircncia de 72
mol de foacutetons m-2 s-1 (CARVALHO et al 2004)
O crescimento celular foi acompanhado sendo utilizada para inoacuteculo uma
suspensatildeo de A platensis apoacutes de 6 a 8 dias de cultivo (PELIZER et al 2003) em
crescimento exponencial isenta de contaminaccedilatildeo Nos cultivos utilizando meio
mineral padratildeo a suspensatildeo foi filtrada lavada e ressuspensa em meio de cultivo
padratildeo Nos cultivos utilizando ureacuteia como fonte alternativa de nitrogecircnio a
suspensatildeo foi filtrada lavada com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada do NaNO3 e
ressuspensa em meio de cultivo padratildeo isento de NaNO3 Estas suspensotildees foram o
inoacuteculo para o cultivo no reator tubular onde foram realizados os estudos
empregando NaNO3 como fonte de nitrogecircnio padratildeo e a ureacuteia como fonte
67
alternativa de nitrogecircnio com o pH do cultivo controlado pela adiccedilatildeo de CO2
proveniente de cilindro ou da fermentaccedilatildeo alcooacutelica
424 Dispositivo para cultura
4241 Fotobiorreator tubular horizontal
O fotobiorreator tubular utilizado eacute apresentado na Figura 7 Este eacute constituiacutedo
por 20 tubos de vidro transparentes (diacircmetro interno de 10 cm) (CARLOZZI
PINZANI 2005) com inclinaccedilatildeo de 2 (115ordm) (TREDICI ZITTELLI 1998) para
facilitar o escoamento do liacutequido interligados com mangueiras de PVC de mesmo
diacircmetro interno de forma que o volume iluminado corresponde a 212 litros
(606) O volume total do sistema foi de 35 litros A recirculaccedilatildeo de liacutequido foi de
26 L h-1 para evitar a sedimentaccedilatildeo da biomassa e melhorar a transferecircncia de
massa
Na parte mais baixa dos tubos do reator tubular haacute um tubo na forma de Y que
recebe ar proveniente de uma bomba deslocando a suspensatildeo celular para um
frasco na parte superior provido de agitaccedilatildeo com um agitador magneacutetico Tambeacutem
na parte inferior do reator haacute uma conexatildeo no qual ocorre entrada de CO2 para
manutenccedilatildeo de pH quando da abertura da vaacutelvula solenoacuteide controlada por um
controlador de pH
Figura 7 Fotobiorreator tubular horizontal utilizado no cultivo de A platensis
68
4242 Fotobiorreator tubular espiralado
O fotobiorreator tubular espiralado utilizado eacute apresentado na Figura 8 Este eacute
constituiacutedo por 5 conjuntos de tubos espiralados de vidro transparentes (diacircmetro
interno de 10 cm) (CARLOZZI PINZANI 2005) interligados com mangueiras de
PVC de mesmo diacircmetro interno Cada conjunto eacute constituiacutedo por 3 tubos
espiralados logo o reator conteacutem no total 15 tubos de vidros espiralados de forma
que o volume iluminado corresponde a 665 ml (606 ) O volume total do sistema
foi de 11 litros A recirculaccedilatildeo de liacutequido foi de 26 L h-1 para evitar a sedimentaccedilatildeo
da biomassa e melhorar a transferecircncia de massa
Na parte mais baixa dos tubos do reator tubular haacute um tubo na forma de Y que
recebe ar proveniente de uma bomba deslocando a suspensatildeo celular para um
frasco na parte superior Tambeacutem na parte inferior do reator haacute uma conexatildeo no
qual ocorre entrada de CO2 para manutenccedilatildeo de pH
Figura 8 Fotobiorreator tubular espiralado utilizado no cultivo de A platensis
425 Descriccedilatildeo de um experimento tiacutepico de cultivo da A platensis
A suspensatildeo de Arthrospira (item 43) foi adicionada ao biorreator tubular na
concentraccedilatildeo inicial de 400 mg L-1 (SOLETTO et al 2008) e o volume de trabalho
foi de 35 L no fotobiorreator tubular horizontal e de 11 L no fotobiorreator tubular
espiralado Devido a evaporaccedilatildeo e a retirada de amostras o meio de cultura isento
da fonte de nitrogecircnio foi adicionado para manter o volume constante
69
Nos experimetos utilizando NaNO3 como fonte de nitrogecircnio a concentraccedilatildeo
inicial deste foi de 25 g L-1 e ocorreram adiccedilotildees do nitrato de soacutedio de modo que sua
concentraccedilatildeo natildeo fosse inferior a 1 g L-1 (FAINTUCH 1989) desta forma evitaria a
limitaccedilatildeo do crescimento celular pela fonte de nitrogecircnio No cultivo utilizando a
fonte de nitrogecircnio alternativa (ureacuteia) a adiccedilatildeo diaacuteria foi efetuada por pulsos (adiccedilatildeo
intermitente) (SAacuteNCHEZ-LUNA et al 2004) As intensidades luminosas foram
medidas com um sensor quantum (model LI-190 SB Li-Cor Lincoln Neb USA) As
diferentes fontes de nitrogecircnio e intensidades luminosas foram preacute-estabelecida de
acordo com o plano de trabalho (Item 5)
O valor de pH nos cultivos foi mantido em 95 plusmn 02 (SANCHEZ-LUNA et al
2007 TREDICI ZITTELLI 1998) com auxiacutelio de um aparelho controlador de pH
METTLER TOLEDO acoplado a uma vaacutelvula solenoacuteide Nos ensaios com CO2 puro
(999) a valvula solenoiacutede estava ligada a um cilindro de CO2 e nos ensaios com
CO2 proveniente de fermentaccedilatildeo alcooacutelica a vaacutelvula solenoacuteide foi ligada agrave tubulaccedilatildeo
proveniente de um reator operando com processo contiacutenuo de fermentaccedilatildeo alcooacutelica
em regime permanente
A temperatura de 29 plusmn 1ordmC (SAacuteNCHEZ-LUNA et al 2007) foi mantida por ar
condicionado que climatizou a temperatura da sala onde estaacute localizada o reator
No final do experimento o reator foi lavado com soluccedilatildeo de hipoclorito de soacutedio
5 por 16 h e com uma soluccedilatildeo de tiosulfato de soacutedio (Na2S2O3) 50 mM para
neutralizar o clorito residual de acordo com De Beer et al (1994)
43 Teacutecnicas Analiacuteticas
Na fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua ateacute o estabelecimento de regime
permanente as determinaccedilotildees de concentraccedilatildeo celular pH ART etanol no caldo
fermentado foram determinados a cada 12 horas Estabelecido o regime
permanente as determinaccedilotildees de concentraccedilatildeo celular pH ART etanol foram
feitas diariamente O efluente gasoso foi analisado qualitativamente para
identificaccedilatildeo dos principais compostos volaacuteteis orgacircnicos
No cultivo de Arthrospira a concentraccedilatildeo celular foi feita diariamente ateacute atingir
concentraccedilatildeo celular maacutexima As medidas de concentraccedilatildeo de nitrato ureacuteia residual
amocircnia e de carbonato total em funccedilatildeo dos relativos grandes volumes necessaacuterios
para a execuccedilatildeo das teacutecnicas foram realizadas a cada dois dias Nos cultivos
utilizando o CO2 proveniente da fermentaccedilatildeo alcooacutelica foram analisados os
70
compostos volaacuteteis orgacircnicos presentes no meio isento de ceacutelulas A concentraccedilatildeo
de clorofila a foi determinada no final de cada experimento bem como a
determinaccedilatildeo de proteiacutenas lipiacutedios totais carboidratos e cinzas
431 Acompanhamento da fermentaccedilatildeo alcooacutelica
4311 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular
A concentraccedilatildeo celular expressa em massa seca foi determinada por filtraccedilatildeo
de acordo com metodologia descrita por Carvalho et al (2003) Um volume de 5 mL
da amostra foi filtrada em membrana millipore 12 microm de porosidade previamente
seca em estufa a 105 ordmC por 4 horas e em dessecador por 1 h e pesada A biomassa
filtrada e lavada com 50 mL de aacutegua destilada foi seca em estufa a 105 ordmC por 4
horas e em dessecador por 1 h e posteriormente pesada A concentraccedilatildeo celular foi
determinada por diferenccedila de massa antes e apoacutes a filtraccedilatildeo
4312 Determinaccedilatildeo do pH
O pH seraacute acompanhado por potenciometria com um aparelho da marca
METTLER TOLEDO
4313 Determinaccedilatildeo de ART
A determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ART foi realizada por espectrofotometria a
540 nm pelo meacutetodo de SOMOGYI-NELSON (1952) precedido da hidroacutelise da
sacarose contida na fase liacutequida do meio de fermentaccedilatildeo realizada pela teacutecnica de
Falcone e Marques (1965)
A hidroacutelise da sacarose foi feita por hidroacutelise aacutecida utilizando 5 mL da amostra
e 25 mL da soluccedilatildeo de aacutecido cloriacutedrico 13 N e deixou-se em banho de aacutegua a 70 ordmC
por 15 minutos Deixou-se esfriar essa soluccedilatildeo ateacute a temperatura ambiente e foi
adicionado NaOH 6N ateacute verificar uma mudanccedila no pH utilizando fenolfitaleiacutena
como indicador Posteriormente completou-se o volume final para 100 mL com aacutegua
destilada diluindo-se assim a amostra 20 vezes A partir dessa soluccedilatildeo jaacute diluiacuteda
fizeram-se novas diluiccedilotildees necessaacuterias para a determinaccedilatildeo do ART pelo meacutetodo de
Somogyi-Nelson (1952)
71
A anaacutelise compreende na adiccedilatildeo de 1 mL da amostra convenientemente diluiacuteda
e 1 mL do reativo de Somogy em tubo de Folin-Wu onde foi fervido durante 10
minutos resfriado em aacutegua com gelo Apoacutes o resfriamento adicionou-se 2 mL do
reativo de Nelson e agitou-se os tubos em agitador ateacute expulsar os gases formados
Completou-se o volume para 25 mL com aacutegua destilada e a soluccedilatildeo foi lida em
espectrofotometro a 520 nm Foi feito um branco substituindo a amostra por aacutegua
destilada
O accediluacutecar aquecido com uma soluccedilatildeo alcalina de tartarato de cobre leva agrave
obtenccedilatildeo de oacutexido cuproso que reagindo com molibdato de arsecircnio possibilita a
produccedilatildeo de um composto de coloraccedilatildeo azul passiacutevel de ser quantificada por
colorimetria a adiccedilatildeo de sulfato de soacutedio a mistura minimiza a entrada de oxigecircnio
na soluccedilatildeo responsaacutevel pela reoxidaccedilatildeo do oacutexido cuproso
4314 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol
A determinaccedilatildeo do etanol foi realizada atraveacutes do meacutetodo de oxidaccedilatildeo por
dicromato de potaacutessio proposto por Joslyn (1907)
O etanol foi determinado mediante a destilaccedilatildeo atraveacutes de um microdestilador
de KJELDHAL e recolhido em 20 mL de uma soluccedilatildeo de dicromato de potaacutessio
fortemente acidulada com aacutecido sulfuacuterico A determinaccedilatildeo consiste na destilaccedilatildeo de
1 mL do meio fermentado isento de ceacutelulas recolhido na soluccedilatildeo de dicromato
contida em erlenmeyer onde o etanol reagiu com os iacuteons dicromato como mostrado
na eq 1 produzindo acetaldeiacutedo e iacuteons Cr(III) Conforme o etanol reage haacute uma
mudanccedila da coloraccedilatildeo laranja caracteriacutestica desta soluccedilatildeo para um tom esverdeado
A reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo do etanol com iacuteons dicromato envolve pelo menos duas
etapas Na primeira etapa o etanol introduzido na soluccedilatildeo reage com os iacuteons
dicromato produzindo um aldeiacutedo que neste caso eacute o acetaldeiacutedo (reaccedilatildeo 4)
Na segunda etapa como o aldeiacutedo produzido tambeacutem eacute susceptiacutevel agrave oxidaccedilatildeo o
acetaldeiacutedo eacute consumido produzindo aacutecido aceacutetico (um aacutecido carboxiacutelico) com a
correspondente reduccedilatildeo dos iacuteons Cr(VI) para iacuteons Cr(III) (reaccedilatildeo 5) A reaccedilatildeo
entre o etanol e os iacuteons dicromato pode ser descrita de forma global como mostrado
na (reaccedilatildeo 6)
3 CH3CH2OH + CrO7-2 rarr 3 CH3COH 2 Cr+3 + 7 H20 (reaccedilatildeo 4)
3 CH3COH + CrO7-2 + 8H+ rarr 3 CH3COOH + 2 Cr+3 + 4 H20 (reaccedilatildeo 5)
72
3 CH3CH2OH + 2 CrO7-2 + 16H+ rarr 4Cr+3 + 3 CH3COOH 11 H2O (reaccedilatildeo 6)
Apoacutes a destilaccedilatildeo o erlenmeyer foi levado a um banho de aacutegua a 70 ordmC
durante 20 minutos para que se complete a oxidaccedilatildeo do etanol Apoacutes esse tempo
deixou-se esfriar ateacute temperatura ambiente e essa soluccedilatildeo foi titulada com soluccedilatildeo
de sulfato ferroso amoniacal Foi feita concomitantemente uma soluccedilatildeo utilizando
aacutegua em vez do destilado para determinar o poder redutor do sulfato ferroso
amoniacal
4315 Determinaccedilatildeo dos componentes volaacuteteis presentes no gaacutes efluente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
Os voltaacuteteis majoritaacuterios liberados durante o regime permanente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica foram determinados pelo Laboratoacuterio de Anaacutelises Quiacutemicas do
Instituto de Pesquisa Tecnoloacutegis (IPT) usando um cromatoacutegrafo a gaacutes (marca
Shimadzu modelo CG-2010) acoplado ao espectrocircmetro de massas (Shimadzu
Modelo GCMS ndash QP5050A)
432 Acompanhamento do cultivo de A platensis
O volume das amostras diaacuterias retiradas para o acompanhamento celular foram
de 50 mL Apoacutes a remoccedilatildeo da amostra igual volume de meio de cultura isento da
fonte de nitrogecircnio foi adicionado para manter o volume constante Similarmente a
evaporaccedilatildeo de aacutegua diaacuteria foi compensada pela adiccedilatildeo do meio de cultura
4321 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular
43211 Densidade oacutetica
O acompanhamento do crescimento celular foi realizado diariamente em
duplicata por turbidimetria a 560 nm (LEDUY THERIEN 1977) Os valores de
transmitacircncia obtidos no espectrofotocircmetro foram convertidas em concentraccedilatildeo
celular atraveacutes de uma curva de calibraccedilatildeo (Item 43212)
43212 Construccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo
A curva de calibraccedilatildeo foi obtida tomando-se um volume de 25 mL de uma
suspensatildeo concentrada de ceacutelulas em fase de crescimento exponencial que foi
73
filtrada e lavada com aacutegua destilada em uma membrana de acetato de celulose de
12 μm previamente seca a 70 ordmC por 12 horas e previamente pesada A amostra
foi levada agrave estufa a 100ndash105 ordmC por um periacuteodo de 5 horas suficiente para que
mantivesse uma massa constante A massa das ceacutelulas foi calculada por diferenccedila
dos valores das massas das membranas antes e depois da filtraccedilatildeo e dividido pelo
volume filtrado para obter-se a concentraccedilatildeo celular na suspensatildeo A partir desta
mesma suspensatildeo foram preparadas diferentes diluiccedilotildees e aliacutequotas dessas
diluiccedilotildees foram levadas ao espectrofotocircmetro para leitura da transmitacircncia a 560 nm
de comprimento de onda e caminho oacuteptico de 1 cm com aacutegua destilada como
branco Dessa forma foi obtida uma curva que relaciona concentraccedilatildeo celular com o
logaritmo da transmitacircncia (Graacutefico 1)
Graacutefico 1 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular de A platensis
4322 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de carbonato total
Embora a concentraccedilatildeo de carbonato total deva se manter constante em
decorrecircncia do fornecimento de CO2 para a manutenccedilatildeo do pH foi acompanhado na
fase liacutequida do meio em cultivo
No meio isento de ceacutelulas o acompanhamento da concentraccedilatildeo de fonte de
carbono na forma de carbonato total foi atraveacutes de titulometria Inicialmente
adiciona-se hidroacutexido de soacutedio na amostra (Reaccedilatildeo 7) e titula-se com HCl
(Reaccedilatildeo 8) na presenccedila do indicador fenolftaleiacutena para a conversatildeo de carbonato
em bicarbonato Posteriormente foi titulada novamente com HCl (Reaccedilatildeo 9) na
74
presenccedila do indicador alaranjado de metila para que todo o bicarbonato transforme-
se em aacutecido carbocircnico por deslocamento de equiliacutebrio O carbonato total foi
quantificado pelos dois intervalos de viragem (PIERCE HAENISCH 1948)
NaOH + NaHCO3 = Na2CO3 + H2O (Reaccedilatildeo 7)
Na2CO3 + HCl = NaHCO3 + NaCl (Reaccedilatildeo 8)
NaHCO3 + 1 HCl = H2CO3 + 1 NaCl (Reaccedilatildeo 9)
4323 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia total
A amocircnia total foi quantificada no meio isento de ceacutelulas de 2 em 2 dias em
potenciocircmetro marca ORION modelo 710-A por meio de um eletrodo seletivo para
amocircnia modelo 95-12 ORION Tendo em vista que o eletrodo soacute eacute sensiacutevel ao iacuteon
amocircnia e que no pH de cultivo existe equiliacutebrio entre os iacuteons amocircnia e amocircnio para
se fazer a leitura foi necessaacuterio corrigir o pH da amostra para 13 pela adiccedilatildeo de
NaOH 15 M antes da leitura no eletrodo de forma que todo iacuteon amocircnio fosse
convertido em amocircnia (LEDUY SAMSON 1982) O volume utilizado foi de 15 mL e
nesse procedimento foi necessaacuteria agrave calibraccedilatildeo do aparelho em todos os dias em
que foram realizadas as determinaccedilotildees Isso foi feito atraveacutes da construccedilatildeo de uma
curva que correlaciona a milivoltagem lida no potenciocircmetro com soluccedilotildees de NH4Cl
em diferentes diluiccedilotildees com concentraccedilotildees conhecidas A partir da equaccedilatildeo dessa
curva com a milivoltagem lida na amostra do cultivo foi calculada a concentraccedilatildeo
de amocircnia total Esta metodologia tambeacutem serviu para auxiliar na determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de ureacuteia conforme se observa no item a seguir
43231 Construccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da amocircnia
A metodologia empregada para a determinaccedilatildeo de amocircnia requer a construccedilatildeo
de uma curva de calibraccedilatildeo para cada dia em que foi analisada a amocircnia Desta
forma no Graacutefico 2 tecircm-se uma das curvas de calibraccedilatildeo utilizada
75
Graacutefico 2 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia
Nesse caso a curva de calibraccedilatildeo corresponde agrave Log [NH3] -00213 x mV ndash
10583 A maior diluiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia foi de 5x10-6 (cujo o valor de
Log eacute -53) que corresponde a um valor de milivoltagem de 182 detectado no
eletrodo de amocircnia
4324 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia
Para a determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia inicialmente foi hidrolisada em
meio aacutecido como segue 10 mL do meio de cultivo isento de ceacutelulas foi submetido a
um tratamento com H2SO4 (1 mL de H2SO4 5 N) a 200 ordmC por 6 horas em bloco
digestor Tecnal modelo TE-106 (CEZARE 1998) Apoacutes esse tempo o conteuacutedo
presente no tubo onde ocorreu a hidroacutelise aacutecida foi quantitativamente transferido
para um balatildeo volumeacutetrico de 50 mL com neutralizaccedilatildeo do pH com NaOH 15 M
utilizando fenolftaleiacutena como indicador e finalmente o volume completado com aacutegua
destilada Desse balatildeo foi retirado um volume de 15 mL para a determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de amocircnia conforme meacutetodo descrito no item anterior Considerando
ainda a diluiccedilatildeo da amostra calcula-se a concentraccedilatildeo de amocircnia global que
representa a amocircnia que jaacute estava presente no meio de cultivo mais a amocircnia
proveniente da hidroacutelise da ureacuteia Assim por diferenccedila eacute possiacutevel calcular a
concentraccedilatildeo de ureacuteia no meio de cultivo
76
4325 Determinaccedilatildeo do pH
O pH foi acompanhado por potenciometria com um aparelho da marca
METTLER TOLEDO
4326 Determinaccedilatildeo de nitrato
A anaacutelise de nitrato foi realizada atraveacutes da adaptaccedilatildeo do meacutetodo descrito por
Vogel (2002) Foram pipetados 10 mL do meio isento de ceacutelulas 10 ml de NaOH
(05 N) e 700 mg de liga de devarda ( 50 de cobre 45 de alumiacutenio 5 zinco) em
balatildeo volumeacutetrico onde foi aquecido em bico de busen durante 1 hora para que todo
o nitrato presente na amostra seja reduzido a amocircnio como descrito na reaccedilatildeo a
seguir
NO3- + 8 Al + 5 OH- + 2 H2O rarr 8 Al2
- + 3 NH3 (Reaccedilatildeo 10)
Durante o aquecimento os iacuteons amocircnio satildeo desprendidos e recolhidos em uma
soluccedilatildeo padronizada de 10 mL de aacutecido cloriacutedrico (01 N) formando o cloreto de
amocircnio Essa soluccedilatildeo foi titulada com NaOH (005 N) padronizada usando vermelho
de metila como indicador e a quantificaccedilatildeo do amocircnio formado foi feita por diferenccedila
entre a quantidade de HCl inicial e final depois da destilaccedilatildeo A conversatildeo de
volume do aacutecido tilulado (mililitros) em massa de iacuteons nitrato (gramas) foi baseada
na informaccedilatildeo de que 1 mL de aacutecido cloriacutedrico 1 N corresponde a 006201g de iacuteons
nitrato (VOGEL 2002)
4327 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol
A determinaccedilatildeo do etanol foi realizada atraveacutes do meacutetodo de oxidaccedilatildeo por
dicromato de potaacutessio proposto por Joslyn (1907) como descrito no item 4314
433 Avaliaccedilatildeo da biomassa de A platensis obtida no final do cultivo
4331 Determinaccedilatildeo de Clorofila a
A anaacutelise de clorofila a foi realizada utilizando uma suspensatildeo celular de 5 mL
correspondente agrave concentraccedilatildeo celular maacutexima obtida Essa suspensatildeo foi filtrada e
a biomassa foi ressuspendida em 5 mL de metanol e incubada em banho maria a
70ordmC por 2 minutos Apoacutes esse tempo a amostra foi filtrada em filtro de
77
politetrafluoretileno 10 microm de diacircmetro (Milliporereg) e o sobrenadante contendo a
clorofila foi determinado espectofotometricamente a 665 nm adotando-se o
procedimento descrito por Vonshak (1997a) A curva de calibraccedilatildeo foi feita
previamente utilizando clorofila areg padratildeo
43311 Curva de calibraccedilatildeo para a determinaccedilatildeo de Clorofila a
A curva de calibraccedilatildeo foi construiacuteda utilizando uma soluccedilatildeo de clorofila a
padratildeo (Sigmareg) obtida comercialmente em metanol A partir dessa soluccedilatildeo foram
realizadas diferentes diluiccedilotildees que resultaram em leituras espectrofotomeacutetricas em
comprimento de onda de 665nm obtendo valores de absorbacircncia entre 0200 e
0800 A relaccedilatildeo entre as diferentes concentraccedilotildees de clorofila em miligrama por
litro com os valores de aborbacircncia obtem-se a equaccedilatildeo como mostrada no graacutefico
3 que foi utilizada para a determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de clorofila nos ensaios
Graacutefico 3 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo de clorofila a
4332 Determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal
Ao final do cultivo o meio contendo a A platensis foi centrifugado com 3
lavagens sucessivas com aacutegua destilada para retirada do sal adsorvido agraves ceacutelulas e
apoacutes secagem com ventilaccedilatildeo a 55 ordmC por 12 horas (PELIZER et al 1999) foi
avaliada a composiccedilatildeo centesimal da biomassa seca
78
43321 Proteiacutenas totais
O teor proteacuteico total na biomassa seca foi determinado pelo claacutessico meacutetodo de
KJELDHAL adotando-se o fator de 625 para a conversatildeo a partir dos teores de
nitrogecircnio total (ASSOCIATION OF OFFICIAL METHODS OF FOOD ANALYSIS
1984) Esse meacutetodo caracteriza-se pela destruiccedilatildeo da mateacuteria orgacircnica com aacutecido
sulfuacuterico concentrado em presenccedila de um catalizador e aquecimento com
formaccedilatildeo de nitrogecircnio inorgacircnico na forma de sulfato de amocircnio A seguir em
aparelho destilador de nitrogecircnio adiciona-se hidroacutexido de soacutedio no tubo
proveniente da digestatildeo para alcalinizaccedilatildeo do meio e desta forma o sal de
amocircnio eacute convertido agrave amocircnia que eacute destilada para uma soluccedilatildeo saturada de aacutecido
boacuterico Posteriormente titula-se essa soluccedilatildeo com HCl 002N fatorada para se
quantificar a concentraccedilatildeo de nitrogecircnio (FERRAZ 1986)
43322 Lipiacutedios totais
A fraccedilatildeo lipiacutedica total foi obtida por extraccedilatildeo com solvente orgacircnico (FERRAZ
1986) A amostra foi triturada em gral e entatildeo transferida para um extrator contiacutenuo
de Soxhlet com refluxo da mistura de solventes clorofoacutermio-metanol (21 vv) ateacute o
liacutequido ficar liacutempido (PIORRECK 1984 OLGUIacuteN et al 2001) A fraccedilatildeo lipiacutedica total
juntamente com os solventes foram tratados em sistema evaporador rotativo a
vaacutecuo O material obtido reuacutene aacutecidos graxos trigliceriacutedeos fosfolipiacutedios
carotenoacuteides pigmentos fotossintetizantes esteroacuteides e hidrocarbonetos sendo
chamados de fraccedilatildeo lipiacutedica total (GIOIELLI 1997)
43323 Cinzas
O teor de cinzas das ceacutelulas secas foi determinado por aquecimento de acordo
com meacutetodo descrito pelo Instituto Adolfo Lutz (1985) 1g da amostra foi pesada em
caacutepsula de porcelana previamente aquecida em mufla a 550 ordmC resfriada em
dessecador ateacute a temperatura ambiente e pesada A amostra foi seca em estufa a
105 ordmC carbonizada e incinerada em mufla a 550 ordmC durante 4 horas tempo
necessaacuterio para obter peso constante Posteriomente resfriou-se a amostra em
dessecador durante 1 hora ateacute atingir a temperatura ambiente e pesada As cinzas
devem ficar brancas ou ligeiramente acinzentadas
79
43324 Carboidratos totais
A porcentagem de carboidratos foi calculada pela diferenccedila entre e as
porcentagens dos demais componentes analisados na biomassa seca
434 Avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo elementar
As determinaccedilotildees de CNHSO foram realizadas pela CE instruments flash
EA1112 series acoplada com um detector de condutividade teacutermica (TCD) Para as
anaacutelises de Carbono Nitrogecircnio Hidrogecircnio e Enxofre foi utilizada a meteonina (C =
4025 N = 939 H = 743 S = 2149) como padratildeo e para a anaacutelise de
oxigecircnio foi utilizado o aacutecido aspaacutertico (C = 3609 N = 1052 H =53 S =
000 O = 4908)
4341 Determinaccedilatildeo de CNHS
Foram determinados pesando aproximadamente 1 a 4 mg da amostra em
recipiente de estanho e adicionar V2O5 (oacutexido de vanaacutedio) para que toda a biomassa
seja carbonizada Utiliza-se gaacutes oxigecircnio (99995) para carregar as amostras e
fazer a combustatildeo a 900degC formando os compostos reduzidos N2 CO2 H20 e SO2
Esses gases vatildeo para a coluna cromatograacutefica onde seratildeo separados e
posteriormente detectados por sinais eleacutetricos no detector de condutividade teacutermica
usando o software EAGER 300 na qual fornece a porcentagem de N C H S
contida na amostra
4342 Determinaccedilatildeo de oxigecircnio
Pesar aproximadamente 1 a 4 mg da amostra em recipiente de prata eleva-se
a temperatura a 1060degC onde ocorre a piroacutelise Durante a piroacutelise satildeo formados N2
CO e H2 estes satildeo filtrados onde os compostos halogenados satildeo retidos
Posteriormente esses gases vatildeo para a coluna cromatograacutefica onde o CO eacute
separado dos outros gases utilizando gaacutes heacutelio como carreador detectados por
sinais eleacutetricos no detector de condutividade teacutermica
44 Caacutelculos
441 Produtividade em etanol no regime permanente
Petanol = DEf (Equaccedilatildeo 1)
80
Onde Petanol = Produtividade em etanol (g L-1 h-1)
D = vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo (h-1)
Ef = concentraccedilatildeo de etanol (g L-1)
442 Rendimento do etanol no regime permanente
η = 1005110
1
ARTi
Ef (Equaccedilatildeo 2)
Onde η = rendimento em etanol ()
Ef = concentraccedilatildeo de etanol (g L-1)
ARTi = Accediluacutecares redutores totais no mosto de entrada no reator (g L-1)
0511 = rendimento teoacuterico (estequiomeacutetrico) da conversatildeo de glicose em
etanol
443 Produtividade em ceacutelulas nos cultivos de A platensis
Tc
XiXmPx
(Equaccedilatildeo 3)
Onde PX = produtividade em ceacutelulas (mg L-1 d -1)
Xm = concentraccedilatildeo celular maacutexima obtida (mg L-1)
Xi = concentraccedilatildeo celular inicial (mg L-1)
Tc = tempo de cultivo (dias)
444 Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas nos cultivos de A
platensis
Nt
VXiXmY NX
(Equaccedilatildeo 4)
81
OndeYXN = Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (mg mg-1)
Xm = concentraccedilatildeo celular maacutexima obtida (mg L-1)
Xi = concentraccedilatildeo celular inicial (mg L-1)
V = volume do meio (L)
Nt = quantidade total de nitrogecircnio adicionado (mg)
445 Coeficientes atocircmicos para 1 C-mol de biomassa
Foram escolhidos os principais aacutetomos (C H 0 N e S) que formam as
macromoleacuteculas proteiacutenas carboidratos lipiacutedios RNA e DNA Um C-mol de
biomassa eacute definida como CX1HX2NX3OX4SX5 e os coeficientes atocircmicos Xi satildeo
calculados a partir da Equaccedilatildeo 5
MMc
fc
MMi
fiXi (Equaccedilatildeo 5)
fi = fraccedilatildeo em massa do aacutetomo i na biomassa seca (g g-1)
MMi = Massa molar do aacutetomo i (g C-mol-1)
fc = fraccedilatildeo em massa do carbono na biomassa seca (g g-1)
MMc = Massa molar do aacutetomo do carbono (g C-mol-1)
Exemplo
Para se calcular o coeficiente atocircmico do hidrogecircnio em 1 C-mol de biomassa
no experimento 1 (Fonte de Carbono cilindro fonte de nitrogecircnio nitrato
intensidade luminosa 60 μmol de foacutetons m-2 s-1)
Teor de hidrogecircnio na biomassa foi de 662 e o teor de carbono foi de 543
o que corresponde a 662 mg de hidrogecircnio e 543 mg de carbono em 1 g da
biomassa Logo substituindo esses valores na Equaccedilatildeo 5 se encontra o coeficiente
atocircmico do hidrogecircnio de 146
12
543
1
66HX
XH = 146
82
446 Grau de reduccedilatildeo da biomassa
O grau de reduccedilatildeo (γ) de um composto orgacircnico eacute definido como o nuacutemero de
eleacutetrons envolvido na sua oxidaccedilatildeo Esse valor eacute a somatoacuteria da multiplicaccedilatildeo entre
os coeficientes atocircmicos e seu respectivo grau de reduccedilatildeo (HEI JNEN 2001)
45 Teoria dos paracircmetros bioenergeacuteticos
A energia de Gibbs dissipada para o crescimento e manutenccedilatildeo celular por
unidade de biomassa (1YGX kJC-mol) foi estimada de acordo com Heijnen (2001)
pela Equaccedilatildeo 6
G
GXGX
m
YY
max
11 (Equaccedilatildeo 6)
max
GXY eacute o rendimento maacuteximo teoacuterico de biomassa sobre a energia de Gibbs que
corresponde a um valor de 986 C-molX kJ-1 em cultivos fotoautotroacutefico com CO2
como fonte de carbono (HEIJNEN 2001)
Nesta equaccedilatildeo a velocidade especiacutefica de crescimento μ foi definida de
acordo com Leduy e Zajic (1973) como
1
ln1
i
i
X
X
t (Equaccedilatildeo 7)
Onde Xi e Xi-1 satildeo as concentraccedilotildees de biomassa no final e iniacutecio do intervalo de
tempo decorrido entre as duas determinaccedilotildees consecutivas (Δt = 1 dia) enquanto
que mG eacute a energia de Gibbs utilizada para a manutenccedilatildeo celular correspondendo a
712 kJ C-molX -1 h-1 a 30degC (HEIJNEN 2001)
A estimativa o nuacutemero de foacutetons (Einsteins) para sustentar o crescimento
autotroacutefico nPh foi necessaacuterio recorrer ao balanccedilo de energia de Gibbs tendo em
conta as contribuiccedilotildees de energia para o crescimento e manutenccedilatildeo 1YGX e a
absorccedilatildeo de 1 Einstein de foacutetons ΔgPh em adiccedilatildeo aqueles de formaccedilatildeo de
substratos e produtos Δgfi como descitos pela equaccedilatildeo
ΔgfHCO3- + ΔgfN + ΔgfH2O + ΔgfH
+ + ΔgfX + 1YGX + nPh ΔgPh = 0 (Equaccedilatildeo 8)
83
O valor de ΔgPh = 2062 kJ mol-1 foi estimado atraveacutes da equaccedilatildeo
A
Ph
hcNg (Equaccedilatildeo 9)
Sendo h = 662610-34 J a constante de Planck c = 299108 m s-1 a velocidade da
luz NA = 6022 x 1023 foacutetons de Einstein -1 o numero de Avogadro e λ = 580 nm o
comprimento de onda do foton absorvido (Li et al 2001)
Calculando os valores de ΔgPh e nPh eacute possiacutevel estimar a energia molar de
Gibbs absorvida pela equaccedilatildeo 10
ΔGa = nPh ΔgPh (Equaccedilatildeo 10)
A energia total de Gibbs absorvida pela fotossiacutentese (ΔGa) foi assumida como a
soma da energia fixada pelo sistema para aumentar o seu proacuteprio conteuacutedo
entaacutelpicos (ΔH) a energia transformada em ATP usada para o crescimento e
manutenccedilao celular (ΔGATP) e a liberada como calor (Q)
ΔGa + ΔGATP + ΔH + Q = 0 (Equaccedilatildeo 11)
Onde ΔGATP e ΔH foram calculados a partir do nPh a energia de Gibbs associada a 1
ATP mol e a media da variaccedilatildeo de potencial entre FSI e FSII (TORRE et al 2003)
A produccedilatildeo molar de O2 (qO2) e o consumo de H+ (qH+) foram calculados de
acordo com Torre et al (2003) multiplicando-se os seus coeficientes
estequiomeacutetricos pela concentraccedilatildeo celular expressa em C-mol L-1 e usando a
composiccedilatildeo elementar da biomassa experimental
84
5 Planejamento experimental
Os experimentos realizados estatildeo descritos na Tabela 2 Os valores de
intensidade luminosa foram escolhidos em funccedilatildeo do trabalho de Watanabe e Hall
(1995) O valor de pH foi fixado em 95 plusmn 02 de acordo com trabalho de Sanchez-
Luna et al (2007) e Tredici e Zittelli (1998) As adiccedilotildees diaacuterias de ureacuteia foram fixadas
com base na necessidade de nitrogecircnio da ceacutelula calculadas a partir dos resultados
das produtividades celulares obtidos nos experimentos padrotildees realizados utilizando
a fonte convencional de nitrogecircnio (NaNO3)
Para a realizaccedilatildeo dos ensaios padrotildees a concentraccedilatildeo de NaNO3
(SCHLOumlSSER 1982) foi mantida acima de 1 g L-1 para evitar a limitaccedilatildeo do
crescimento pela fonte de nitrogecircnio A partir da curva de crescimento experimental
utilizando o nitrato como fonte de nitrogecircnio para cada intensidade luminosa
estudada obteacutem-se uma equaccedilatildeo que representa a curva de crescimento teoacuterica e a
partir desta calcula-se a produtividade celular diaacuteria Considerando que as ceacutelulas
possuem 7 de nitrogecircnio (BEZERRA 2006) calcula-se a quantidade diaacuteria de
nitrogecircnio necessaacuteria para o crescimento celular obtendo-se assim a equaccedilatildeo de
adiccedilatildeo de nitrogecircnio amoniacal Por isso eacute necessaacuterio realizar uma curva de
crescimento padratildeo com NaNO3 para cada condiccedilatildeo analisada (diferentes
intensidades luminosas) A exemplificaccedilatildeo do escrito acima esta representado no
Item 62
Tabela 2 - Planejamento experimental
Experimento
Intensidade luminosa
( mol de foacutetons m-
2 s-1)
Fonte de nitrogecircnio
Controle de pH por CO2 de cilindro
Controle de pH por CO2 de
fermentaccedilatildeo alcooacutelica
1 60 NaNO3 Sim Natildeo
2 60 Ureacuteia Sim Natildeo
3 60 NaNO3 Natildeo Sim
4 60 Ureacuteia Natildeo Sim
5 120 NaNO3 Sim Natildeo
6 120 Ureacuteia Sim Natildeo
7 120 NaNO3 Natildeo Sim
8 120 Ureacuteia Natildeo Sim
9 240 NaNO3 Sim Natildeo
10 24 0 Ureacuteia Sim Natildeo
11 240 NaNO3 Natildeo Sim
12 240 Ureacuteia Natildeo Sim
valor fixado em 95 com uso de CO2
85
6 Resultados e discussatildeo
No item 61 estatildeo descritos os resultados dos testes preliminares da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica e no item 62 estatildeo apresentados os resultados dos
experimentos 1 ao 12 referentes aos acompanhamentos dos cultivos ao longo do
tempo A concentraccedilatildeo celular concentraccedilatildeo de carbonato de nitrato de amocircnia e
ureacuteia foram apresentadas neste item
As determinaccedilotildees da concentraccedilatildeo celular foram feitas diariamente enquanto
que as medidas de concentraccedilatildeo de nitrato amocircnia ureacuteia e de carbonato total no
meio de cultura em funccedilatildeo dos relativos grandes volumes de amostra necessaacuterios
para a execuccedilatildeo das teacutecnicas foram realizadas de dois em dois dias
Os paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima produtividade em ceacutelulas e fator
de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas estatildeo descritos no item 63 As
determinaccedilotildees da concentraccedilatildeo de clorofila foram realizadas no final de cada
experimento e estatildeo descritas no item 64 e a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal
teor de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos e cinzas estatildeo descritos no item 65
As anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas atraveacutes de anaacutelise de multivariacircncia e
diferenccedila entre as meacutedias em niacutevel de 5 de significacircncia visando-se examinar a
influecircncia de cada variaacutevel independente para os paracircmetros cineacuteticos Xm Px e
YXN bem como para o conteuacutedo de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos cinzas e teores
de clorofila a
As anaacutelises dos paracircmetros bioenergeacuteticos dos cultivos de A platensis
utilizando CO2 de cilindro estatildeo descritas no item 66 e a comparaccedilatildeo entre o perfil
de crescimento da A platensis em duas diferentes configuraccedilotildees de fotobioreator
tubular estaacute descrito no item 67
61 Testes preliminares para a realizaccedilatildeo da fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Antes de iniciar os experimentos acoplando a fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
com a produccedilatildeo de A platensis foram realizados testes para avaliar a influecircncia da
clarificaccedilatildeo do melaccedilo na determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular a homogeneidade
do reator as vazotildees especiacuteficas de alimentaccedilatildeo no processo contiacutenuo de modo a
obter regime permanente e produccedilatildeo gases suficiente para a correccedilatildeo do pH
durante o cultivo de A platensis
86
611 Avaliaccedilatildeo da influecircncia da clarificaccedilatildeo do melaccedilo na determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo celular
Inicialmente foi proposto utilizar o melaccedilo de cana-de-accediluacutecar clarificado e
esterilizado no entanto devido as dificuldade operacionais como por exemplo
grandes volumes de melaccedilo que seria utilizado para a manutenccedilatildeo do processo
contiacutenuo optou-se por utilizar o melaccedilo natildeo clarificado e natildeo esterilizado uma vez
que nas usinas brasileiras natildeo eacute empregado atualmente esse preacute-tratamento do
melaccedilo (LIMA et al 2001) Dhamija et al (1982) relata que os custos adicionais
para o preacute-tratamento de melaccedilo e da levedura reciclada pode limitar o uso do
processo Portanto a teacutecnica de reciclo de leveduras por centrifugaccedilatildeo e uso de
melaccedilo natildeo clarificado torna o processo mais econocircmico
O melaccedilo de cana-de-accediluacutecar possui aproximadamente 50 de accediluacutecares
(sacarose 25 a 40 glicose e frutose 12 a 35) aacutegua carboidratos cinzas
metais pesados compostos nitrogenados e em menor quantidade aacutecidos natildeo
nitrogenados (aacutecido ciacutetrico acido maacutelico oxaacutelico glicoacutelico) ceras esteroacuteides e
vitaminas (ROUKAS 1998) Vaacuterios fatores influenciam na composiccedilatildeo do melaccedilo ou
mel final os meacutetodos de fabricaccedilatildeo do accediluacutecar o tempo de armazenamento e as
regiotildees do plantio Este elevado teor de accediluacutecar eacute a razatildeo porque o melaccedilo eacute
largamente utilizado na induacutestria de fermentaccedilatildeo em particular produccedilatildeo de etanol
O emprego do melaccedilo natildeo tratado poderia influenciar a determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo celular por massa seca uma vez que no melaccedilo conteacutem aleacutem da
sacarose diversos outros resiacuteduos que poderiam ficar retidos na membrana de
filtraccedilatildeo dificultando esse processo eou resultando no falso aumento da
concentraccedilatildeo celular Por isso realizou-se um teste para avaliar se o natildeo tratamento
do melaccedilo influenciaria na determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular Os resultados e a
anaacutelise estatiacutestica da diferenccedila entre as meacutedias estatildeo descritos na Tabela 3
Tabela 3 - Valores da concentraccedilatildeo celular meacutedias e desvio padratildeo em massa seca obtidas a partir do melaccedilo natildeo clarificado e do melaccedilo clarificado
Melaccedilo natildeo clarificado (gL-1) Melaccedilo clarificado (gL-1)
1110 1010
1094 1074
1082 1004
Meacutedia = 109 plusmn 014ordf Meacutedia = 103 plusmn 040a
Diferenccedila percentual = 640
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
87
Como se pode observar na Tabela 3 as meacutedias da concentraccedilatildeo celular
determinada por massa seca foram estatisticamente iguais nas duas condiccedilotildees de
melaccedilo avaliadas melaccedilo clarificado e melaccedilo natildeo clarificado Com esses
resultados optou-se utilizar o melaccedilo natildeo clarificado uma vez que no acircmbito
industrial o processo de clarificaccedilatildeo aumenta os custos operacionais resultando em
um aumento dos custos do produto final Por isso estudos sobre os preacute-tratamentos
do melaccedilo de cana-de-accediluacutecar tecircm sido desenvolvidos para que viabilizem natildeo soacute a
obtenccedilatildeo dos produtos mas tambeacutem as etapas de recuperaccedilatildeo e purificaccedilatildeo sem
aumento excessivo no custo do processo (VALDUGA et al 2007)
612 Teste de homogeneidade do reator
O teste de homogeneidade no reator foi realizado com o objetivo de se avaliar
se as amostras retiradas em qualquer lugar do reator podem ser consideradas
equivalentes com um risco de erro estatisticamente determinado neste trabalho em
10 Para isso o teste de homogeneidade foi realizado de acordo com Koshimizu et
al (1983)
Na Tabela 4 estatildeo descritos os valores da concentraccedilatildeo celular e o logaritmo
da concentraccedilatildeo celular em funccedilatildeo do tempo com uma vazatildeo de alimentaccedilatildeo de
0124 h-1 A homogeneidade do reator eacute verificada se a queda da concentraccedilatildeo
celular for uma funccedilatildeo exponencial
Tabela 4 - Variaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de leveduras em funccedilatildeo do tempo
Tempo (horas) [X] (g L-1) Ln X
05 89 094939 10 72 085733 15 62 079379
20 57 075587
25 50 070070 30 46 066651 35 39 059988 40 33 051851 45 30 048287 50 25 039445
Aplicando-se o logaritmo neperiano aos valores do [X] (Tabela 4) e
construindo um graacutefico ln X em funccedilatildeo do tempo obtecircm-se a equaccedilatildeo da reta onde
o coeficiente angular da reta obtida eacute igual agrave vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo do
sistema teoacuterico (Dt)
88
Graacutefico 4 Logariacutetmico da concentraccedilatildeo celular em funccedilatildeo do tempo
O valor de Dt obtido pela reta eacute igual a 0115 h-1 que se comparado ao valor
calculado 0124 h-1 apresenta uma diferenccedila de 78 indicando que o sistema
pode ser considerado homogecircneo (KOSHIMIZU et al 1983)
613 Avaliaccedilatildeo de diferentes vazotildees especiacuteficas de alimentaccedilatildeo (D)
O efeito da vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo (D 01 h-1 005 h-1 e 0025 h-1) na
fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua foi avaliada para a produccedilatildeo de etanol Os
resultados satildeo mostrados nos Graacuteficos de 5 a 7
Graacutefico 5 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) etanol () e
accediluacutecar redutor total (ART) para D = 01 h-1
y = -01151x + 09884 Rsup2 = 09912
0010203040506070809
1
0 1 2 3 4 5 6
Ln
X
Tempo (h)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 20 40 60 80 100 120 140
Co
nc
en
tra
ccedilatilde
o (
g L
-1)
Tempo (horas)
Iniacutecio do regime permanente
89
Graacutefico 6 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) Etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 005 h-1
Graacutefico 7 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) Etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 0025 h-1
Como se pode observar nos Graacuteficos de 5 a 7 foi possiacutevel a obtenccedilatildeo do
regime permanente nos 3 valores de D empregados indicando a adequaccedilatildeo desses
valores e da concentraccedilatildeo de ART agrave velocidade de crescimento do micro-organismo
Nos ensaios de fermentaccedilatildeo contiacutenua a condiccedilatildeo de estado estacionaacuterio foi
obtida apoacutes trecircs tempos de residecircncia sem qualquer tipo de problema operacional
como obstruccedilatildeo do tubo de retirada de caldo crescimento na parede e mistura
imperfeita O Graacutefico 5 mostra um resultado tiacutepico em termos de perfis de
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Co
nc
en
tra
ccedilatilde
o (
g L
-1)
Tempo (horas)
Iniacutecio do regime permanente
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 20 40 60 80 100 120 140
Co
nc
en
tra
ccedilatilde
o (
g L
-1)
Tempo (horas)
Iniacutecio do regime permanente
90
concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de glicose (S) e concentraccedilatildeo de etanol (E)
No estado estacionaacuterio (D = 01 h-1) a concentraccedilatildeo de ART residual na saiacuteda do
reator foi de 9421plusmn449 g L-1 a concentraccedilatildeo celular foi de 547plusmn047 g L-1 e a
concentraccedilatildeo de etanol de 4169plusmn163 g L-1 Com a reduccedilatildeo da vazatildeo especiacutefica de
alimentaccedilatildeo para D = 005 h-1 (Graacutefico 5) a concentraccedilatildeo de glicose residual reduziu
para cerca de 4780plusmn870 g L-1 e as concentraccedilotildees de etanol e celular aumentaram
para 4542plusmn31 g L-1 e 618plusmn077 g L-1 respectivamente devido ao maior tempo de
residecircncia nessa segunda condiccedilatildeo Reduzindo a vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo
para 0025 h-1 (Graacutefico 6) a concentraccedilatildeo de etanol aumentou para 553plusmn757 g L-1
Isso porque menor a vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo maior o tempo de contato
entre as ceacutelulas e o accediluacutecar convertendo-o mais eficientemente no etanol Esse
resultado mostra que a reduccedilatildeo da vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo aumenta a
produtividade em etanol
Similarmente Perego Jr (1979) observaram que a diminuiccedilatildeo da vazatildeo
especiacutefica de 0117 para 0049 h-1 durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
menores foram os valores de ART residual 58 g L-1 e 28 g L-1 respectivamente Por
outro lado a concentraccedilatildeo de etanol aumentou de 496 g L-1 para 68 g L-1 e a
concentraccedilatildeo celular reduziu de 67 g L-1 para 53 g L-1 Esses valores diferiram do
presente trabalho devido agraves diferentes cepas de Saccharomyces cerevisieae bem
como o melaccedilo utilizado O melaccedilo por ser um produto natural varia de composiccedilatildeo
de acordo com o clima solo tempo de colheira
Na Tabela 5 mostra que a reduccedilatildeo da vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo levou a
um aumento no rendimento do processo obtendo maior valor de 636 no emprego
de D igual a 0025 h-1 O aumento na vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo proporciona
um aumento do fluxo de entrada de accediluacutecar provavelmente superior ao aumento da
velocidade de consumo levando a uma diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol
aumento da concentraccedilatildeo de ART residual e consequentemente diminuiccedilatildeo da
eficiecircncia de transformaccedilatildeo O rendimento representa a eficiecircncia da fermentaccedilatildeo
alcooacutelica tomando como base a equaccedilatildeo estequiomeacutetrica de Gay-Lussac onde a
relaccedilatildeo teoacuterica para 100 de eficiecircncia de conversatildeo de hexose em etanol eacute de
0511g de etanol produzido para cada grama de hexose consumida
91
Tabela 5 - Valores de XP ART Etanol e Rendimento do processo no regime
permanente para os diferentes valores de D com ART inicial de 170 gL-1
D (h-1)
XP (gL-1)
ARTf
(gL-1) Ef
(gL-1) η
() Px
(g L-1 h-1) Pe
(g L-1 h-1)
0100 547plusmn047 942plusmn449 417plusmn163 4799 055 417
0050 618plusmn077 478plusmn870 454plusmn310 5229 031 227
0025 609plusmn054 532plusmn567 553plusmn757 6364 015 138
D vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo Xp meacutedia dos valores de concentraccedilatildeo celular ao longo do regime permanente e seus desvios padrotildees ARTf accediluacutecares redutores totais no caldo fermentado Ef oncentraccedilatildeo de etanol no caldo fermentado η Rendimento do processo Px Produtividade em ceacutelulas Pe Produtividade em etanol
Na fermentaccedilatildeo alcooacutelica vaacuterios fatores podem influenciar no rendimento do
processo ou seja a conversatildeo de accediluacutecar em etanol entre eles a concentraccedilatildeo de
accediluacutecar e o fluxo pelo qual ele eacute adicionado e removido do reator (em processos
contiacutenuos) pH concentraccedilatildeo celular presenccedila de bacteacuterias contaminantes e o tipo
de processo adotado Na induacutestria o rendimento do processo eacute calculado baseado
na concentraccedilatildeo de accediluacutecar total que entra no sistema fermentativo sem considerar o
accediluacutecar residual podendo ser maior que 90 a 93 do valor teoacuterico da conversatildeo de
glicose em etanol (INGLEDEW 1999)
O processo de fermentaccedilatildeo mais comumente utilizado nas destilarias do
Brasil eacute utilizando a recuperaccedilatildeo de leveduras atraveacutes da centrifugaccedilatildeo do vinho
Aproximadamente 90 da levedura satildeo reutilizadas de uma fermentaccedilatildeo para a
proacutexima Esta suspensatildeo de fermento diluiacutedo e acidificado conhecido na praacutetica
com o nome de peacute-de-cuba permanece em agitaccedilatildeo de uma a trecircs horas antes de
retornar agrave dorna de fermentaccedilatildeo resultando em altas densidades celulares dentro
do reator (10-17 pv) e contribuindo para um tempo de fermentaccedilatildeo curto Isso
favorece a valores de conversotildees teoacutericos de accediluacutecares em etanol de 90 a 92
(BASSO et al 2008) valores maiores do que os obtidos no presente trabalho
(Tabela 5)
Em termos de produtividades a Tabela 5 mostra que as maacuteximas
produtividades em ceacutelulas (Px) e em etanol (Pe) foram obtidas para um alto valor de
D (01 h-1) de cerca de 055 g L-1 h-1 e 417 g L-1 h-1 respectivamente Por outro
92
lado nessas condiccedilotildees o rendimento em etanol obteve menor valor (48) Quando
a taxa de diluiccedilatildeo eacute alta os accediluacutecares satildeo adicionados a uma velocidade mais raacutepida
do que satildeo consumidos logo a perda de accediluacutecar aumenta e a concentraccedilatildeo de
etanol reduz diminuindo consequentemente a eficiecircncia do processo Como se pode
observar no trabalho de Melzoch et al (1991) a produtividade de etanol maacutexima foi
de 15 g L-1 h-1 no regime permanente com uma concentraccedilatildeo de S cereviseae de 46
g L-1 e concentraccedilatildeo de etanol de 81 g L-1 em bioreator agitado continuamente com
reciclo total de ceacutelulas utilizando a ultrafiltraccedilatildeo
Nas condiccedilotildees adotadas nessa fermentaccedilatildeo com ART de 170gL-1 optou-se
por aplicar D igual a 0025 h-1 por obter um maior valor de rendimento alcooacutelico e
gerar CO2 suficiente a ser incorporado nos cultivos de A platensis em fotobiorreator
tubular
614 Avaliaccedilatildeo dos volaacuteteis orgacircnicos no gaacutes de arraste
De acordo com os resultados obtidos pelo Instituto de Pesquisas Tecnoloacutegicas
foram encontrados nos gaacutes de arraste da fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
predominacircncia de (CO2) pequenas proporccedilotildees de etanol (C2H6O) e elementos
traccedilos de acetaldeiacutedo (C2H4O) Isso estaacute de acordo com Romano et al (2003) que
relataram as transformaccedilotildees quiacutemicas durante a fermentaccedilatildeo por leveduras
produzem principalmente CO2 e etanol e em menores quantidades a formaccedilatildeo de
CVOs Basso et al (1996) relata que durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica por levedura
os produtos da fermentaccedilatildeo satildeo constituiacutedos de 43 ndash 47 de etanol 41 - 45 de
gaacutes carbocircnico e o restante satildeo formados por outros compostos orgacircnicos tais como
glicerol aacutecido succiacutenico aacutecido aceacutetico entre outros Dentre os volaacuteteis orgacircnicos
majoritaacuterios produzidos durante a fermentaccedilatildeo de mosto de cana-de-accediluacutecar por
Saccharomyces cerevisiae encontram-se o etanol acetaldeiacutedo propanol isobutanol
aacutelcool isoamiacutelico acetato de etila (CAEHOT et al 1991)
93
62 Avaliaccedilatildeo do crescimento da A platensis
Experimento 1
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 60 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Cilindro
Tabela 6 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de carbonato
total referentes ao experimento 1
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 405 plusmn 27 1155 plusmn 000
1 590 plusmn 32 -
2 884 plusmn 24 1193 plusmn 027
3 1248 plusmn 202 -
4 1368 plusmn 99 1186 plusmn 026
5 1914 plusmn 19 -
6 2292 plusmn 103 1131 plusmn 021
7 2379 plusmn 46 -
8 2899 plusmn 17 1124 plusmn 021
9 2831 plusmn 22 -
10 2952 plusmn 76 1106 plusmn 064
Graacutefico 8 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 1
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
94
Experimento 2
Fonte de nitrogecircnio = ureacuteia Intensidade luminosa= 60 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = Cilindro
Tabela 7 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 2 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -44554x3 + 54865x2 + 14317x + 400 (60 mol de foacutetons
m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de
nitrogecircnio (mM dia -1)
0 0484
1 0691
2 0832
3 0906
4 0913
5 0853
6 0726
7 0533
8 0277
Graacutefico 9 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 2 (60 mol de foacutetons m-2 s-1)
0
02
04
06
08
1
0 2 4 6 8 10
mM
Ureacute
ia
Tempo (dias)
95
Tabela 8 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 2
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
Amocircnia total (mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 406 plusmn 000 1155 plusmn 000 - -
1 534 plusmn 49 - - -
2 906 plusmn 18 1155 plusmn 027- 132E-05 240E-04
3 1059 plusmn 37 - - -
4 1538 plusmn 137 1290 plusmn 004 136E-05 197E-04
5 2003 plusmn 94 - - -
6 2330 plusmn 28 1154 plusmn 125 135E-05 212E-04
7 2602 plusmn 25 - - -
8 2847 plusmn 0 1002 plusmn 089 338E-06 827E-04
9 2869 plusmn 14 - - -
10 2847 plusmn 56 1078 plusmn 018 681E-04
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 10 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 2
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
96
Experimento 3
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 60 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 9 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de carbonato
total referentes ao experimento 3
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 490plusmn0 1155 plusmn 000
1 591plusmn92 -
2 1193plusmn87 1224 plusmn 05
3 1430plusmn10 -
4 1959plusmn197 1234 plusmn 023
5 2161plusmn171 -
6 2445plusmn48 129 plusmn 005
7 2621plusmn102 -
8 2789plusmn82 1138 plusmn 104
9 2782plusmn125 -
10 2832plusmn89 111 plusmn 104
Graacutefico 11 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 3
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 5 10 15
X (
mg
L
-1)
Tempo (dias)
97
Experimento 4
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa = 60 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 10 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 4 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -20689x3 + 11591x2 + 33292x + 400 (60 mol de foacutetons
m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 086
1 088
2 088
3 084
4 078
5 068
6 055
7 039
8 020
Graacutefico 12 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 4 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
000
020
040
060
080
100
0 2 4 6 8 10
mM
ureacute
ia
Tempo (dias)
98
Tabela 11 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 4
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
Amocircnia total (mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 494plusmn0 1155plusmn000 - 284E-04
1 618plusmn74 - - -
2 1213plusmn59 1139 plusmn 069 218E-04
3 1498plusmn33 - - -
4 1874plusmn76 1095 plusmn 05 324E-05 221E-04
5 2250plusmn44 - - -
6 2516plusmn147 1083 plusmn 139 42E-04 829E-04
7 2694plusmn105 - - -
8 2867plusmn28 1086 plusmn 091 13E-03 308E-05
9 2871plusmn34 - -
10 2860plusmn61 118 plusmn 071 35E-04 202E-03
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 13 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 4
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg
L
-1)
Tempo (dias)
99
Experimento 5
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 120 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Cilindro
Tabela 12 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 5
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 406 plusmn 0 1155 plusmn 000
1 529 plusmn 22 -
2 894 plusmn 4 1155 plusmn 080
3 1401 plusmn 76 -
4 2118 plusmn 82 1191 plusmn 136
5 2584 plusmn 50 -
6 3209 plusmn 110 1134 plusmn 003
7 3262 plusmn 115 -
8 3302 plusmn 100 1212 plusmn 000
Graacutefico 14 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 5
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
100
Experimento 6
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa= 120 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = Cilindro
Tabela 13 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 6 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -13286x3 + 14486x2 + 62226x + 400 (120 mol de
foacutetons m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 0485
1 1010
2 1335
3 1462
4 1389
5 1117
6 0645
Graacutefico 15 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 6 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
0
02
04
06
08
1
12
14
16
0 2 4 6 8
mM
ureacute
ia
Tempo (dias)
101
Tabela 14 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 6
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total
(g L-1)
Amocircnia total
(mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 309 plusmn 00 1155 plusmn 000 - -
1 548 plusmn 10 - - -
2 797 plusmn 7 1117 plusmn 134 214E-05 197E-05
3 1267 plusmn 163 - - -
4 2062 plusmn 92 1101 plusmn 004 291E-06 182E-06
5 2558 plusmn 170 - - -
6 2980 plusmn 103 1253 plusmn 058 119E-06 252E-06
7 3093 plusmn 234 - - -
8 3266 plusmn 50 1033 plusmn 004 275E-06
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 16 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 6
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
102
Experimento 7
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 120 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 15 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 7
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 477 plusmn000 1155 plusmn 000
1 954 plusmn135 -
2 1151 plusmn140 1224 plusmn 080
3 1667 plusmn70 -
4 2165 plusmn256 1233 plusmn 136
5 2516 plusmn147 -
6 2969 plusmn23 1134 plusmn 035
7 2827 plusmn28 -
8 2969 plusmn59 1112 plusmn 114
Graacutefico 17 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 7
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
103
Experimento 8
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa= 120 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 16 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 8 de
acordo com a y = - 58128x3 + 38625x2 + 38606x + 400 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 105
1 115
2 117
3 110
4 095
5 070
6 037
Graacutefico 18 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 8 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
000
020
040
060
080
100
120
140
0 1 2 3 4 5 6 7
mM
ureacute
ia
Tempo (dias)
104
Tabela 17 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 8
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total
(g L-1) Amocircnia total
(mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 445 plusmn0 1155 plusmn 000 - -
1 767 plusmn46 - - -
2 1053 plusmn50 1117 plusmn 134 430E-04 307E-05
3 1554 plusmn31 - - -
4 2158 plusmn143 1101 plusmn 004 477E-04 273E-06
5 2552 plusmn87 - - -
6 2952 plusmn35 1253 plusmn 058 166E-04 54E-06
7 3048 plusmn96 - - -
8 3079 plusmn86 1033 plusmn 004 367E-05 194E-06
Graacutefico 19 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 8
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
105
Experimento 9
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 240 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Cilindro
Tabela 18 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 9
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 410 plusmn 0 1155plusmn000
1 815 plusmn 94 -
2 1297 plusmn 206 1117plusmn027
3 2174 plusmn 90 -
4 2625 plusmn 297 1264plusmn033
5 2994 plusmn 213 -
6 3291 plusmn 207 1246plusmn112
7 3422 plusmn 172 -
8 3299 plusmn 117 1045plusmn064
Graacutefico 20 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 9
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
106
Experimento 10
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa= 240 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = Cilindro
Tabela 19 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 10
de acordo com a equaccedilatildeo y = -12057x3 + 10082x2 + 31899x + 400 (240 mol de
foacutetons m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 101
1 134
2 148
3 145
4 123
5 083
6 025
Graacutefico 21 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 10 (240 mol de foacutetons m-2 s-1)
0
02
04
06
08
1
12
14
16
0 1 2 3 4 5 6 7
mM
Ureacute
ia
Tempo (dias)
107
Tabela 20 - Valores meacutedios de concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 10
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total
(g L-1)
Amocircnia total (mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 402 plusmn 000 1155plusmn000 - -
1 461 plusmn 62 - - -
2 839 plusmn 139 1003 plusmn 080 27994E-05
3 1705 plusmn 89 - - -
4 2663 plusmn 95 1120 plusmn 130 153E-05 65768E-06
5 3015 plusmn 78 - - -
6 3236 plusmn 72 1101 plusmn 058 178E-05 95016E-05
7 3307 plusmn 30 - - -
8 3293 plusmn 113 1200 plusmn 017 232E-06 75662E-05
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 22 concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 10
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10
Xm
(m
gL
-1)
Tempo (dias)
108
Experimento 11
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 240 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 21 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 11
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 358plusmn0 1155plusmn000
1 976plusmn53 -
2 1298plusmn61 1003plusmn27
3 1928plusmn78 -
4 2428plusmn207 1141plusmn014
5 2834plusmn199 -
6 3102plusmn130 1053plusmn161
7 2969plusmn59 -
8 3109plusmn19 965plusmn079
Graacutefico 23 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 11
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
109
Experimento 12
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa= 240 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 22 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 12
de acordo com a equaccedilatildeo y = -82763x3 + 62437x2 + 37265x + 400 (240 mol de
foacutetons m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 107
1 126
2 132
3 126
4 107
5 077
6 033
Graacutefico 24 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 12 (240 mol de foacutetons m-2 s-1)
000
020
040
060
080
100
120
140
0 2 4 6 8
mM
ureacute
ia
Tempo (dias)
110
Tabela 23 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amonia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 12
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total
(g L-1) Amocircnia total
(mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 400plusmn0 1155plusmn000 - -
1 625plusmn228 - - -
2 1095plusmn802 1003 plusmn 080 477E-05
3 1562plusmn357 - -
4 1912plusmn47 1120 plusmn 130 95E-05 110E-04
5 2609plusmn231 - -
6 3071plusmn111 1101 plusmn 058 220E-05 126E-04
7 3180plusmn820 - -
8 3200plusmn734 1200 plusmn 017 25E-06
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 25 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 12
Resultados do processo descontiacutenuo alimentado no cultivo de Arthrospira
(Spirulina) platensis utilizando CO2 proveniente de cilindro ou de fermentaccedilatildeo
alcooacutelica com diferentes fontes de nitrogecircnio (nitrato de soacutedio ou ureacuteia) e intensidade
luminosas (60 120 ou 240 mol de foacutetons m-2 s-1) podem ser observados nos
Graacuteficos 8 10 11 13 14 17 18 20 22 23 e 26
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
X (
mg
L
-1)
Tempo (dias)
111
Os perfis das curvas de crescimento foram semelhantes com ausecircncia da fase
lag no cultivo de A platensis no iniacutecio do cultivo crescendo exponencialmente e
estabilizando na fase estacionaacuteria As diferentes fontes de nitrogecircnio (nitrato e ureacuteia)
utilizadas nas diferentes intensidades luminosas (60 120 e 240 mol de foacutetons m-2 s-1
avaliadas) natildeo influenciaram nos perfis das curvas de crescimento Essa
caracteriacutestica foi observada em trabalhos anteriores de Pelizer et al (2003) e Danesi
et al (2002) Isso se deve a semelhanccedila nas condiccedilotildees de crescimento tais como
composiccedilatildeo quiacutemica do meio de cultura e temperatura de crescimento entre a
preparaccedilatildeo do inoacuteculo e o cultivo Outro fator eacute que as ceacutelulas para a preparaccedilatildeo do
inoacuteculo estavam na fase exponencial de crescimento isto eacute o inoacuteculo era um cultivo
jovem constituiacutedo de ceacutelulas ativas De fato Pelizer et al (2003) que trabalharam
com KNO3 como fonte de nitrogecircnio relataram a influecircncia da idade do inoacuteculo no
crescimento da S platensis comprovando que a utilizaccedilatildeo de inoacuteculo no 6ordm dia de
cultivo proporcionou maiores valores no crescimento celular em cultivos realizados
em minitanques Nessas condiccedilotildees tambeacutem natildeo detectaram fase lag de
crescimento
Autores como Danesi et al (2002) trabalhando com ureacuteia como fonte de
nitrogecircnio tambeacutem natildeo observaram a presenccedila de fase lag no cultivo de S
platensis De fato mesmo em cultivos onde o inoacuteculo foi cultivado em meio com
nitrato como eacute o caso do presente trabalho seria esperado que o uso de fontes de
nitrogecircnio que levem agrave presenccedila de amocircnia no meio de cultivo natildeo apresentasse
fase lag de crescimento celular pois a amocircnia eacute a fonte de nitrogecircnio
preferencialmente utilizada pela S platensis (BOUSSIBA 1989 BELKIN
BOUSSIBA 1991b)
A fonte de nitrogecircnio no meio de cultura eacute nutriente fundamental para o
crescimento de micro-organismos fotossintetizantes (WEN CHEN 2001) Diferentes
fontes de nitrogecircnio inorgacircnico para o cultivo de S platensis tem sido estudados tais
como cloreto de amocircnio (CARVALHO et al 2004) sulfato de amocircnio (SOLETTO et
al 2005) nitrato de amocircnio fosfato de amocircnio (COSTA et al 2001) nitrato de soacutedio
(SCHLOumlSSER 1982) nitrato de potaacutessio (PAOLLETI 1975) e ureacuteia (SAacuteNCHEZ-
LUNA et al 2004)
Comparando-se os cultivos com nitrato (Graacuteficos 8 11 14 17 20 e 23) e os
cultivos com ureacuteia (Graacuteficos 10 13 16 19 22 e 25) para cada intensidade luminosa
e fonte de CO2 estudada observam-se que as curvas de crescimento dos cultivos e
112
as concentraccedilotildees celulares diaacuterias com ureacuteia foram semelhantes as curvas de
crescimentos e as concentraccedilotildees celulares diaacuterias utilizando nitrato Isso mostra que
a equaccedilatildeo de alimentaccedilatildeo com ureacuteia (Graacuteficos 9 12 15 18 21 e 24) obtida em
cada intensidade luminosa e fonte de CO2 reproduziu seu respectivo cultivo
utilizando o nitrato
Como pode ser observado nas Tabelas 8 1114 17 20 e 23 as concentraccedilotildees
de amocircnia e ureacuteia residual durante os cultivos sempre apresentaram concentraccedilotildees
inferiores ou proacuteximas 10-4 molar mostrando que natildeo houve acuacutemulo de amocircnia e
ureacuteia residual nos cultivos e essa concentraccedilatildeo tambeacutem satildeo consideradas natildeo
toacutexicas pois esta concentraccedilatildeo torna-se toacutexica numa concentraccedilatildeo acima de 10 mM
e inibitoacuteria na concentraccedilatildeo de 17 mM a 2 mM (ABELIOVICH AZOV 1976
CARVALHO et al 2004 CONVERTI et al 2006b)
O nitrato eacute fonte de nitrogecircnio convencional nos cultivos de micro-oganismo e eacute
encontrado em abundacircncia em ambientes naturais No entanto o emprego de
nitrato em meio sinteacutetico utilizado na produccedilatildeo comercial de micro-organismos
pode aumentar custo do produto final Por isso fontes de nitrogecircnio alternativas tecircm
sido estudadas visando agrave reduccedilatildeo nos custo de produccedilatildeo
Ureacuteia tem sido considerada uma fonte alternativa de nitrogecircnio no cultivo de S
platensis por proporcionar um aumento da concentraccedilatildeo celular (SASSANO et al
2004 SOLETTO et al 2005 DANESI et al 2004) e por ter alta competitividade
econocircmica Isso decorre do seu baixo custo e alto conteuacutedo de nitrogecircnio tendo
como consequumlecircncia o baixo custo por unidade de nitrogecircnio quando comparada a
outras fontes de nitrogecircnio
A ureacuteia quando hidrolisada origina duas moleacuteculas de amocircnia e uma de
dioacutexido de carbono Essa conversatildeo ocorre primeiramente quando a ureacuteia
(CO(NH2)2) combina com a aacutegua (hidroacutelise) e forma o carbonato de amocircnio
((NH4)2CO3) Esse composto eacute instaacutevel e decompotildee para formar o gaacutes amocircnia (NH3)
e o dioacutexido de carbono (CO2) (DORN 2007) A amocircnia por sua vez eacute uma moleacutecula
pequena e natildeo carregada que se move relativamente livre atraveacutes da bicamada
lipiacutedica Um possiacutevel mecanismo para a assimilaccedilatildeo da amocircnia pode envolver a
simples difusatildeo da amocircnia seguindo pelo seu aprisionamento atraveacutes da
protonaccedilatildeo uma vez que dependendo do pH (pH 8) em que se encontra a amocircnia
reage com a aacutegua formando o iacuteon amocircnio (NH4+) Portanto a membrana eacute
permeaacutevel agrave amocircnia mas impermeaacutevel ao iacuteon amocircnio (BOUSSIBA et al 1984)
113
Costa et al (2001) em estudos comparativos usando diferentes fontes de
nitrogecircnio em processo descontiacutenuo no cultivo de S platensis observaram que
001 M de ureacuteia ou nitrato de amocircnio proporcionaram maiores concentraccedilotildees
celulares de aproximadamente 1g L-1 natildeo diferindo estatisticamente do cultivo com
o nitrato de soacutedio No entanto nos cultivos com maiores concentraccedilotildees dessas
fontes de nitrogecircnio (003 M e 005 M) natildeo houve crescimento celular
Costa et al (2004) avaliaram o crescimento da S platensis na lagoa Mangueira
suplementando ureacuteia por processo descontiacutenuo alimentado e observaram um
aumento de 267 vezes na concentraccedilatildeo da biomassa no cultivo suplementado com
1125 mg L-1 de ureacuteia quando comparada nos cultivos natildeo suplementado com ureacuteia
No entanto nos cultivos com 2250 mg L-1 de ureacuteia houve uma reduccedilatildeo na
concentraccedilatildeo celular Isso sugere que a adiccedilatildeo de ureacuteia na lagoa Mangueira eacute
beneacutefica ao crescimento da S platensis mas se adicionada em altas concentraccedilotildees
podem inibir o crescimento Por outro lado Soletto et al (2005) compararam cultivos
de S platensis utilizando processo descontiacutenuo com a mesma concentraccedilatildeo de
sulfato de amocircnio ou ureacuteia como fonte de nitrogecircnio e observaram que na
concentraccedilatildeo de 17 mM houve um raacutepido crescimento da biomassa quando
utilizado ureacuteia e houve uma inibiccedilatildeo no crescimento quando utilizado o sulfato de
amocircnio Como sugerido em trabalhos preacutevios a accedilatildeo simultacircnea das condiccedilotildees
alcalina (DANESI et al 2002) e a accedilatildeo da urease (CARVAJAL et al 1982
SHIMAMATSU 2004) poderia ter promovido a hidroacutelise da ureacuteia em amocircnia
acoplado com a assimilaccedilatildeo da amocircnia pelas ceacutelulas minimizando portanto a
inibiccedilatildeo pela amocircnia
Sassano et al (2004) observaram que utilizando 500 mg L-1 de massa total de
ureacuteia alimentada durante 12 dias proporcionou aumento na concentraccedilatildeo de S
platensis em minitanques quando comparadas ao emprego do nitrato
Su et al (2007) observaram que o maior desempenho em termos de
rendimento de biomassa e conteuacutedo de lipiacutedios durante o crescimento da Isochrysis
galbana foi no meio contendo ureacuteia como fonte de nitrogecircnio indicando que a ureacuteia
eacute a fonte preferencial de nitrogecircnio em relaccedilatildeo ao (NH4)2SO4 e NH4Cl
O emprego da ureacuteia pode levar a inibiccedilatildeo do crescimento celular Em condiccedilatildeo
alcalina ou a presenccedila de urease no meio de cultivo hidrolisa uma moleacutecula de ureacuteia
em duas moleacuteculas de amocircnia e esta em altas concentraccedilotildees eacute considerada toacutexica
para as ceacutelulas (SASSANO et al 2004) Por outro lado quando em baixas
114
concentraccedilotildees podem limitar o crescimento uma vez que a presenccedila nitrogecircnio eacute
fundamental para o crescimento e manutenccedilatildeo celular Por isso o modo de adiccedilatildeo
de ureacuteia eacute importante para melhorar a produtividade do cultivo
O modo de alimentaccedilatildeo empregado no cultivo de ureacuteia pode prevenir o
acuacutemulo ou a falta desse nutriente no cultivo Sanchez-Luna et al (2004) relataram
que a adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia a uma taxa constante pode ser usada no cultivo de S
platensis implicando em baixo custo na produccedilatildeo da biomassa por natildeo precisar de
bombas para alimentaccedilatildeo
A baixa concentraccedilatildeo de nitrogecircnio no cultivo limita o crescimento celular Por
outro lado a alta concentraccedilatildeo de nitrogecircnio inibe o mesmo Deste modo foram
feitos cultivos de A platensis utilizando a fonte de nitrogecircnio convencional (NaNO3)
para se observar a necessidade diaacuteria de nitrogecircnio consumida pelas ceacutelulas nas
diferentes intensidades luminosas e com base nessas curvas de crescimento
obtidas foram calculadas as quantidades de ureacuteia diaacuteria necessaacuterias visando evitar
a limitaccedilatildeo ou inibiccedilatildeo de crescimento celular pela fonte de nitrogecircnio como pode-se
observar nas Tabelas 7 9 10 13 16 19 e 22 Aleacutem disso foi empregado o
processo descontiacutenuo alimentado que deve ser usado para melhorar a densidade
celular no crescimento da A platensis desde que a concentraccedilatildeo de nitrogecircnio
soluacutevel possa ser adicionada ateacute alcanccedilar a produccedilatildeo maacutexima de biomassa sem
resultar na inibiccedilatildeo do crescimento
Outro fator importante no crescimento celular de micro-organismos
fotossintetizantes eacute a intensidade luminosa Nas culturas fotossinteacuteticas a
quantidade de energia luminosa captadas pelas ceacutelulas tem uma relaccedilatildeo direta com
a capacidade de fixaccedilatildeo do CO2 consequentemente a luz determina a
produtividade e a taxa de crescimento celular As diferentes intensidades luminosas
estudadas influenciaram nas concentraccedilotildees celulares maacuteximas Um aumento da
intensidade luminosa de 60 mol de foacutetons m-2 s-1 para 120 mol de foacutetons m-2 s-1
houve um aumento no valor da concentraccedilatildeo celular maacutexima No entanto um
aumento da intensidade luminosa de 120 mol de foacutetons m-2 s-1 para 240 mol de
foacutetons m-2 s-1 as concentraccedilotildees celulares maacuteximas obtiveram valores proacuteximos
Geralmente a taxa de crescimento das ceacutelulas microalgas aumenta com a
intensidade luminosa e a taxa atinge um valor de saturaccedilatildeo quanto maior for a
intensidade luminosa porque o excesso da energia luminosa natildeo pode ser utilizada
para a fotossiacutentese nas ceacutelulas e quando submetidas a um valor de intensidade
115
luminosa ainda maior o crescimento celular eacute reprimido como relatado por Hirata et
al (1998) e Chojnacka e Noworyta (2004a)
Segundo Hirata et al (1998) e Chojnacka e Noworyta (2004a) existe uma
correlaccedilatildeo entre o crescimento da Arthrospira ssp e a intensidade luminosa que satildeo
definidas por regiotildees denominadas regiatildeo limitada por luz saturada por luz e inibida
por luz A regiatildeo saturada por luz eacute definida como alta intensidade luminosa onde o
crescimento celular independe da intensidade luminosa Essa regiatildeo saturada por
luz pode ser observada no presente trabalho uma vez que o aumento da
intensidade luminosa natildeo interferiu na concentraccedilatildeo celular maacutexima O intervalo da
intensidade luminosa dessas regiotildees depende de vaacuterios fatores como configuraccedilatildeo
do reator micro-organismo condiccedilotildees de cultivo
S platensis cultivada em reator retangular alcanccedilou um aumento no valor da
velocidade especiacutefica de crescimento com o aumentou da intensidade luminosa de 8
a 34 W m-2 mas foi reduzido quando a intensidade luminosa aumentou de 34 W m-2
(156 mol de foacutetons m-2 s-1) para 158 W m-2 (724 mol de foacutetons m-2 s-1) e foi
completamente reprimida a 158 W m-2 (HIRATA et al 1998) Chojnacka e Noworyta
(2004a) avaliando o cultivo fotoautotroacutefico da S platensis em reator retangular
tambeacutem concluiacuteram que a velocidade de crescimento especiacutefica aumenta com o
aumento da intensidade luminosa ateacute um valor de 30 W m-2 Entre os valores de
intensidade luminosa de 30 W m-2 (138 mol de foacutetons m-2 s-1) a 50 W m-2 (229 mol
de foacutetons m-2 s-1) observa-se a regiatildeo de saturaccedilatildeo luminosa e acima desse valor
(50 W m-2) ocorre o fenocircmeno da fotoinibiccedilatildeo
Nos cultivos sob maiores intensidades luminosas (120 e 240 mol de foacutetons m-2
s-1) desenvolveram uma coloraccedilatildeo amarelada no decorrer do cultivo por outro lado
no cultivo a 60 mol de foacutetons m-2 s-1 as ceacutelulas apresentaram uma coloraccedilatildeo mais
verde-azulada claacutessica Como eacute bem conhecido sob condiccedilotildees limitantes de
nitrogecircnio o conteuacutedo de clorofila da S platensis diminui apresentando uma
coloraccedilatildeo verde-amarelada ao contraacuterio da coloraccedilatildeo verde-azulada claacutessica
(CARVALHO et al 2004) No entanto no presente estudo como natildeo houve
limitaccedilatildeo de nitrogecircnio durante os cultivos essa coloraccedilatildeo amarelada pode ser
devido agrave alta intensidade luminosa uma vez que as intensidades luminosas
estudadas atingiram a regiatildeo saturado por luz como definido por Hirata et al (1998)
e Chojnacka e Noworyta (2004a) Do mesmo modo Vonshak et al (1996) relataram
que o crescimento da S platensis torna-se saturado a um intervalo de 150 a 200
116
mol de foacutetons m-2 s-1 e esta faixa da intensidade luminosa corresponde a
aproximadamente de 10-15 da radiaccedilatildeo solar total a 400-700 nm
Geralmente o pH do meio aumenta durante o crescimento celular devido agrave
assimilaccedilatildeo da fonte de carbono o bicarbonato durante a fotossiacutentese (WATANABE
et al 1995 BINAGHI et al 2003) Os iacuteons bicarbonato satildeo transportados
ativamente para o interior celular convertidos a carbonato e gaacutes carbocircnico que eacute
utilizado na fotossiacutentese Para cada moleacutecula de CO2 utilizada pela ceacutelula ocorre a
liberaccedilatildeo de um iacuteon carbonato O pH da cultura foi mantido a 95 02 (SANCHEZ-
LUNA et al 2007 TREDICI ZITTELLI 1998) logo o CO2 consumido pelo micro-
organismo foi reposto por CO2 natildeo havendo modificaccedilotildees severas do pH o que
acarretaria uma reduccedilatildeo no crescimento da S platensis Valores de pH altos por
exemplo acima de 11 pode ser um fator no qual restringe a produtividade no
sistema air-lift usando ar natildeo suplementado com CO2 (WATANABE et al 1995)
Normalmente culturas de microorganismos fotossinteacuteticos usam como fonte
de carbono o bicarbonato eou carbonato Estes nutrientes satildeo adicionados em
grande quantidade no meio Schloumlsser para o cultivo de A platensis (1208 g L-1)
Adicionalmente estes micro-organismos tecircm a capacidade de fixar CO2 como fonte
de carbono na qual eacute liberado pelos efluentes industriais Logo este CO2 pode ser
adicionado ou substituiacutedo no meio de cultura reduzindo os custos da produccedilatildeo de
microorganismos fotossinteacuteticos bem como reduzindo os problemas ambientais
causados por esse gaacutes
O sequestramento de CO2 mostrou ser efetivo nas ceacutelulas de Chlorella
vulgaris e a presenccedila da mistura de CVOs (benzeno tolueno acetona metanol e
naftaleno) presente no efluente natildeo interferiu no uso desse CO2 e adicionalmente
11 dos CVOs foram removidos (KEFFER KLEINHEINZ 2002)
Diferentes autores relataram sobre o crescimento mixotroacutefico da A platensis
na presenccedila de glicose (ZHANG et al 1998 CHOJNACKA NOWORYTA 2004) ou
acetato (CHEN et al 2006) Maacuterquez et al (1993) mostraram que a S platensis eacute
capaz de crescer heterotroficamente ou mixotroficamente na presenccedila de glicose
sugerindo que o crescimento autotroacutefico e heterotroacutefico satildeo independentes Em
cultivos mixotroacuteficos o CO2 e composto orgacircnico satildeo assimilados conjuntamente
podendo ser um processo mais eficiente para a produccedilatildeo de biomassa microalgal
desde que isto implica em uma economia em energia usada para a siacutentese do
aparato fotossinteacutetico e para a fixaccedilatildeo do carbono (LEE 2004) Chen et al (2006)
117
mostraram que o acetato pode ser usado como fonte de carbono em cultivos
mixotroacuteficos de S platensis para a produccedilatildeo de vaacuterios pigmentos fotossinteacuteticos e
obtenccedilatildeo da concentraccedilatildeo de biomassa maacutexima (165 g Lminus1) na qual obtiveram
valores maiores que usando apenas bicarbonato (108 g L-1)
Menzyanova et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de pequenas quantidades
de etanol (01 - 03) aumentou a concentraccedilatildeo de Dunaliella viridis enquanto que
em quantidades maiores que 05 natildeo houve efeito no crescimento A adiccedilatildeo
muacuteltipla e sucessiva de etanol no cultivo favoreceu a um acuacutemulo de etanol no meio
de cultivo o que provocou uma inibiccedilatildeo o crescimento da D viridis quando a
concentraccedilatildeo de etanol foi de 03 e causou a morte celular na concentraccedilatildeo de
etanol de 05
Apesar do etanol ser o CVO predominante no material gasoso sua proporccedilatildeo
em relaccedilatildeo ao CO2 eacute pequena (resultados obtidos pelo instituto de Pesquisa
Tecnoloacutegica) Assim no presente trabalho natildeo se observou um efeito dos volaacuteteis
orgacircnicos (CVOs) liberados da fermentaccedilatildeo alcooacutelica no cultivo de A platensis
Esses CVOs satildeo constituiacutedos a maior parte por 43 ndash 47 de etanol (Basso et al
1996) e em menor quantidade acetaldeiacutedo propanol isobutanol aacutelcool isoamiacutelico e
acetato de etila (CAEHOT et al 1991) Logo A platensis pode ser usada para o
tratamento de efluentes gasosos nas induacutestrias de fermentaccedilatildeo alcooacutelica Logo
observou-se que o efluente gasoso liberado das induacutestrias de fermentaccedilatildeo alcooacutelica
pode ser usado no cultivo de A platensis sem prejudicar o crescimento celular
Similarmente Ferraz et al (1985) observaram que eacute possiacutevel cultivar S
maxima em reatores abertos (open ponds) borbulhando o CO2 proveniente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica de modo descontiacutenuo e usando nitrato com fonte de
nitrogecircnio
A adiccedilatildeo de CO2 no reator aleacutem de controlar o pH fornece a fonte de
carbono para o crescimento celular Como pode ser observado nas Tabelas 6 8 9
11 12 14 15 17 18 20 21 e 23 mesmo ocorrendo o crescimento celular as
concentraccedilotildees de carbonato total sempre apresentaram valores altos de um modo
geral proacuteximos aos 1208 g L-1 iniciais (concentraccedilatildeo indicada em Schloumlsser et al
1982) indicando que os cultivos tambeacutem natildeo foram limitados pela fonte de carbono
Durante a fotossiacutentese oxigecircnica realizada pela S platensis ocorre a
liberaccedilatildeo de O2 no meio de cultura Elevadas concentraccedilotildees de O2 no meio de
cultura pode prejudicar o crescimento celular uma vez que este pode danificar o
118
aparato fotossinteacutetico dificultando a realizaccedilatildeo da fotossiacutentese Por isso a
concentraccedilatildeo de O2 deve ser controlada durante o crescimento celular As
concentraccedilotildees de oxigecircnio foram analisadas diariamente e os valores natildeo atnigiram
niacuteveis inibitoacuterios pois foram sempre menores que 10 mg L-1 (Vonshak 1997)
119
63 Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm)
Produtividade em ceacutelulas (Px) e Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN)
Na Tabela 24 estatildeo descritos os valores da concentraccedilatildeo celular maacutexima
produtividade em ceacutelulas e fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas Nas Tabelas
25 28 e 31 estatildeo descritos a anaacutelise de variacircncia dos paracircmetros cineacuteticos Xm Px
e YXN respectivamente Os valores meacutedios de Xm Px e YXN para cada variaacutevel
independente estatildeo descritos nas Tabelas 26 27 29 30 32 e 33
Tabela 24 - Valores da concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) produtividade em ceacutelulas
(Px) e fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) com diferentes fontes de
CO2 fontes de nitrogecircnio e intensidades luminosas
Experimento Fonte de CO2 Intensidade luminosa (I)
Fonte de nitrogecircnio
Xm
(mg L-1)
Px
(mg L-1 d-1)
YXN
(g g-1)
1 Cilindro 60 NaNO3 2899 plusmn 17 250 plusmn 2 42 plusmn 003
2 Cilindro 60 Ureacuteia 2847plusmn 1 245 plusmn 1 14 plusmn 000
3 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 60 NaNO3 3120plusmn156 299 plusmn10 40 plusmn 014
4 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 60 Ureacuteia 2957 plusmn 99 308 plusmn 4 14 plusmn 017
5 Cilindro 120 NaNO3 3209plusmn109 454 plusmn18 45 plusmn 018
6 Cilindro 120 Ureacuteia 2980plusmn103 408 plusmn17 11 plusmn 050
7 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 120 NaNO3 2728 plusmn 27 428 plusmn 4 43 plusmn 004
8 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 120 Ureacuteia 2855 plusmn 11 425 plusmn 6 15 plusmn 02
9 Cilindro 240 NaNO3 3291plusmn206 482 plusmn 34 54 plusmn 038
10 Cilindro 240 Ureacuteia 3236 plusmn 72 473 plusmn 12 133plusmn034
11 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 240 NaNO3 3102plusmn130 450 plusmn 22 50 plusmn 024
12 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 240 Ureacuteia 3070plusmn112 445 plusmn19 14 plusmn 056
I = mol de foacutetons m-2
s-1
631 Concentraccedilatildeo celular maacutexima
Na Tabela 25 estatildeo apresentados os resultados da anaacutelise de variacircncia da
concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) e nas Tabelas 26 e 27 estatildeo apresentadas as
120
meacutedias do Xm nas variaacuteveis independentes fontes de nitrogecircnio e intensidades
luminosas respectivamente
Tabela 25 - Anaacutelise de variacircncia para a concentraccedilatildeo celular maacutexima
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
13585 1 13585 157 0225
Fonte de Nitrogecircnio
84 1 84 001 0922
Intensidade luminosa
443083 2 221542 2566 0000
Resiacuteduos 164033 19
total 620786 23
Como se observa na Tabela 25 a variaacutevel independente intensidade luminosa
foi estatisticamente significante na determinaccedilatildeo do Xm (p = 0000) enquanto que
as variaacuteveis independentes fontea de CO2 (p = 0225) e fonte de nitrogecircnio (p =
0922) natildeo influenciaram estatisticamente no valor de Xm De fato a similaridade das
fontes de nitrogecircnio jaacute era esperada uma vez que a adiccedilatildeo de ureacuteia nos cultivos para
cada intensidade luminosa foram baseadas em seus respectivos cultivos com nitrato
visando um crescimento celular natildeo limitado e nem inibido pela fonte de nitrogecircnio e
obtendo portanto valores de Xm meacutedios semelhantes Ambas as fontes de nitrogecircnio
utilizadas satildeo facilmente assimiladas pela A platensis os valores de Xm foram
estatisticamente iguais para cada intensidade luminosa avaliada (Tabela 26)
Em relaccedilatildeo agrave fonte de CO2 Isto mostra que o CO2 e os volaacuteteis orgacircnicos
liberados na atmosfera como resiacuteduo podem ser utilizados como fonte de carbono
no cultivo de A platensis sem prejudicar o crescimento celular
Tabela 26 - Meacutedias das concentraccedilotildees celular maacutexima para a variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio
Fonte de nitrogecircnio Xm meacutedia (mgL-1)
Nitrato 3027 plusmn 162ordf
Ureacuteia 3031 plusmn 174ordf
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
121
Comparando-se as meacutedias de Xm entre as diferentes intensidades luminosas
observa-se que o valor meacutedio de Xm na intensidade luminosa de 60 mol de foacutetons
m-2 s-1 foi estatisticamente diferente ao valor meacutedio de Xm quando a intensidade
luminosa foi de 120 mol de foacutetons m-2 s-1 e este foi estatisticamente semelhante ao
valor meacutedio de Xm quando a intensidade luminosa foi de 240 mol de foacutetons m-2 s-1
(Tabela 27) Essas comparaccedilotildees das meacutedias de Xm explicam o valor do niacutevel
descritivo obtido pela anaacutelise de variacircncia para a variaacutevel intensidade luminosa (p
=0000 Tabela 25) mostrando que a esta influencia no valor de Xm Esses
resultados estatildeo de acordo com Chojnacka e Noworyta (2004a) que avaliaram o
cultivo fotoautotroacutefico da S platensis em reator retangular tambeacutem concluiacuteram que a
velocidade de crescimento especiacutefica aumenta com o aumento da intensidade
luminosa ateacute um valor de 30 W m-2 (138 mol de foacutetons m-2 s-1) Entre os valores de
intensidade luminosa de 30 W m-2 (138 mol de foacutetons m-2 s-1) a 50 W m-2 (229 mol
de foacutetons m-2 s-1) observa-se a regiatildeo de saturaccedilatildeo luminosa Acima desse valor (50
W m-2) ocorre o fenocircmeno da fotoinibiccedilatildeo Do mesmo modo no presente trabalho
os valores de Xm foram estatisticamente iguais nas intensidades luminosas de 120
mol de foacutetons m-2 s-1 e 240 mol de foacutetons m-2 s-1 cujas intensidades luminosas satildeo
proacuteximas agraves intensidades luminosas que correspondem agrave regiatildeo de saturaccedilatildeo
luminosa observada por Chojnacka e Noworyta (2004a)
Tabela 27 - Meacutedias das concentraccedilotildees celular maacutexima para a variaacutevel independente
intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(mol de foacutetons m-2 s-1)
Xm meacutedia (mgL-1)
60 2851plusmn54ordf
120 3056plusmn115b
240 3180plusmn96b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
A maior concentraccedilatildeo celular maacutexima encontrada nesse trabalho foi maior do
que a obtida por Binaghi et al (2003) utilizando minitanques no cultivo de S
platensis (15 g L-1) e tambeacutem maior que a obtida por Watanabe e Hall (1996)
utilizando fotobiorreator tubular cocircnico no cultivo de S platensis (13 g L-1)
122
Morais e Costa (2007a) relataram que em cultivo de S platensis em
fotobiorreator tubular vertical obtiveram maiores valores de Xm de 413 g L-1
suplementado com 6 CO2 quando comparadas em cultivos em Erlenmeyer Esses
autores relatam que a S platensis podem crescer com 18 CO2 demonstrando que
estes suportam altas concentraccedilotildees de CO2 podendo ser usado para mitigar o efeito
do CO2 emitido pelos gases efluentes
Olguiacuten et al (2001) avaliando o crescimento da S platensis em meio contendo
aacutegua do mar suplementado com efluentes anaeroacutebicos a partir da digestatildeo de
resiacuteduo da suinocultura e em meio Zarrouk tambeacutem observaram um aumento no
valor de Xm com o aumento da intensidade luminosa de 66 mol de foacutetons m-2 s-1
para 144 mol de foacutetons m-2 s-1
632 Produtividade volumeacutetrica de ceacutelulas
Na Tabela 28 estatildeo apresentados os resultados da anaacutelise de variacircncia da
produtividade em ceacutelulas (Px) e nas Tabelas 29 e 30 estatildeo apresentadas as meacutedias
do Px nas variaacuteveis independentes fontes de nitrogecircnio e intensidades luminosas
respectivamente
Tabela 28 - Anaacutelise de variacircncia para a produtividade em ceacutelulas
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
315 1 315 137 0256
Fonte de Nitrogecircnio
1 1 1 000 0947
Intensidade luminosa
116579 2 58289 25372 0000
Resiacuteduos 4365 19 230
total 121260 23
Avaliando-se os paracircmetros produtividades em ceacutelulas pela anaacutelise de
variacircncia (Tabela 28) pode-se notar que a fonte de CO2 (p=0256) e a de nitrogecircnio
(p=0947) natildeo interferiram nas produtividades em celulares Portanto a intensidade
luminosa mostrou ser estatisticamente significante no valor de Px (p=0000)
123
Tabela 29 - Meacutedias das produtividades em ceacutelulas para a variaacutevel independente
fonte de nitrogecircnio
Fonte de nitrogecircnio Px meacutedio (mgL-1 d-1)
Nitrato 404 plusmn 74ordf
Ureacuteia 405 plusmn 75ordf
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
Como se pode observar na Tabela 29 os valores meacutedios de Px para as
diferentes fontes de nitrogecircnio estudadas natildeo diferiram estatisticamente Do mesmo
modo como ocorreu com o paracircmetro Xm os valores de Px nos cultivos com ureacuteia e
nitrato foram semelhantes para cada intensidade luminosa Isso jaacute era esperado
uma vez que a adiccedilatildeo de ureacuteia nos cultivos para cada intensidade luminosa foram
baseadas em seus respectivos cultivos com nitrato Spirulina platensis cultivadas em
minitanques com 257 mg L-1 de KNO3 ou 500 mg L-1 de ureacuteia obtiveram valores de
Px semelhantes para as intensidades luminosas estudadas 14 klux (168 mol de
foacutetons m-2 s-1) ou 56 klux (672 mol de foacutetons m-2 s-1) (RANGEL-YAGUI et al 2004)
Tabela 30 - Meacutedias das produtividades em ceacutelulas para a variaacutevel independente intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(mol de foacutetons m-2 s-1)
Px meacutedio (mgL-1)
60 306plusmn7a
120 443plusmn19b
240 463plusmn16b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
Os maiores valores de produtividade em ceacutelulas foram encontrados nas
maiores intensidades luminosas obtendo valores meacutedios de 443 plusmn 19 mg L-1 d-1 a
120 μmol de foacutetons m-2 s-1 e 463 plusmn 16 mg L-1 d-1 a 240 μmol de foacutetons m-2 s-1
independente da fonte de nitrogecircnio utilizada (Tabela 30) Durante a fotossiacutentese as
ceacutelulas podem utilizar somente uma soma limitada de energia luminosa por vez
Este fenocircmeno de saturaccedilatildeo luminosa eacute provavelmente resultado de um mecanismo
interno onde as ceacutelulas podem realizar a fotossiacutentese usando somente uma
124
determinada quantidade de luz (CARLOZZI 2003) Isso significa que durante a
saturaccedilatildeo luminosa um aumento da intensidade luminosa natildeo permitiraacute um
aumento da concentraccedilatildeo celular e nem reduziraacute o tempo de cultivo mantendo
proacuteximos os valores de produtividades de ceacutelulas nesse intervalo de saturaccedilatildeo
luminosa
Na menor intensidade luminosa (60 mol de foacutetons m-2 s-1) o valor de Px foi
menor em relaccedilatildeo agraves outras intensidades luminosas obtendo valor meacutedio de 306 plusmn 7
mg L-1 d-1 Do mesmo modo como observado nas outras intensidades luminosas as
fontes de nitrogecircnio estudadas natildeo influenciaram na produtividade celular Essa
diferenccedila nos valores de Px entre as intensidades luminosas foi devido a um maior
tempo de cultivo nos experimentos submetidos agrave intensidade luminosa de 60 mol
de foacutetons m-2 s-1 A produtividade eacute uma razatildeo inversa do tempo de cultivo logo
quanto maior a intensidade luminosa mais raacutepida as ceacutelulas atingem a concentraccedilatildeo
celular maacutexima e consequentemente maior seraacute a produtividade celular diaacuteria
Quanto maior a intensidade luminosa maior eacute a quantidade de foacutetons emitidos e
estes podem ser absorvidos pelas ceacutelulas isto eacute maior eacute a quantidade de energia
luminosa que seraacute convertido em energia quiacutemica que por sua vez as ceacutelulas
utilizam essa energia quiacutemica para a manutenccedilatildeo e o crescimento celular Esse
efeito tambeacutem foi observado por Danesi et al (2004) Rangel-Yagui et al (2004) em
cultivos de S platensis em minitanques utilizando KNO3 ou ureacuteia como fontes de
nitrogecircnio
O maior valor da produtividade encontrada nesse trabalho foi proacuteximo a 510 mg
L-1 d-1 obtido por Watanabe e Hall (1996) investigando o crescimento da S platensis
em fotobiorreator helicoidal cocircnico sob ciclos 12h12h (claroescuro) e uma meacutedia
de fluxo de foacutetons de 546 mol de foacutetons m-2 s-1 Watanabe et al (1995) em
processo descontiacutenuo utilizando a S platensis cultivada em fotobiorreator tubular
helicoidal cocircnico utilizando luz artificial (118 mol de foacutetons m-2 s-1) tambeacutem
obtiveram uma produtividade volumeacutetrica diaacuteria de 051 g L-1d-1 Foram usados dois
sistemas (airlift e bomba) para reciclar a cultura Com o sistema airlift os autores
encontraram a maior concentraccedilatildeo da biomassa de 16 g L-1 apoacutes 5 dias de
crescimento da S platensis e uma menor concentraccedilatildeo da biomassa quando
utilizado o sistema de bomba No fotobiorreator tubular helicoidal cocircnico quando
cultivado em ambiente externo a produtividade foi de 900 mg L-1 d-1 (TREDICI
125
ZITTELLI 1998) Travieso et al (2001) encontrou uma produtividade maacutexima de
040 g Lminus1 dminus1 em fotobiorreator tubular helicoidal operado de modo semicontiacutenuo
No presente trabalho os maiores valores da produtividade em ceacutelulas
encontradas foram maiores do que a relatada por Richmond (1990) em reatores
tubulares em ambiente externo que foi de 370 mg L-1 d-1 e Morais e Costa (2007b)
que obteve Xmax de 022 g Lminus1 dminus1 no cultivo de Spirulina sp na presenccedila de 6 de
dioacutexido de carbono em fotobiorreator tubular com trecircs estaacutegios em seacuterie Por outro
lado autores como Carlozzi e Pinzani (2005) conseguiram uma produtividade em
ceacutelulas maacutexima de 182 g L-1 dminus1 utilizando o processo descontiacutenuo em ambiente
externo Lee (2001) relata que dependendo da configuraccedilatildeo de fotobiorreator tubular
fechado e de placas retangulares a produtividade volumeacutetrica foi de 025 a 364 g L-1
d-1 utilizando o processo descontiacutenuo alimentado
Travieso et al (2001) relataram uma produtividade maacutexima de 04 g L-1 d-1 em
processo semicontiacutenuo de Spirulina utilizando uma diluiccedilatildeo de 15 e taxa de diluiccedilatildeo
de 00078 hminus1 Esses autores utilizaram o fotobiorreator patenteado bdquobdquoBiocoil‟‟ da
Biotechna Grasser UK (European patent EPO239272 March 6 1987)
Vernerey et al (2001) utilizando uma nova configuraccedilatildeo de fotobioretator para o
aumento da escala (72 litros) na produccedilatildeo de S platensis conseguiram uma
produtividade de 138 g L-1 d-1 com intensidade luminosa de 300 W m-2 e pH
controlado a 95 pela adiccedilatildeo de CO2
Cultivos de Arthrospira platensis em fotobiorreator tubular outdoor no periacuteodo
de marccedilo a setembro de 2002 na Repuacuteblica Checa com a maioria dos dias
ensolarados a irradiacircncia do ambiente maacutexima foi entre 15 and 18 mmol de foacutetons
mminus2 sminus1 Nessas condiccedilotildees a produtividade maacutexima atingida foi de 05 g Lminus1 dminus1
correspondendo a um rendimento de aacuterea (baseada na aacuterea superficial) de
aproximadamente 325 g mminus2 dminus1 na qual eacute um valor relativamente alto se considerar
que foi obtida no mecircs de setembro A concentraccedilatildeo celular oacutetima da cultura foi
obtida em um intervalo de 1 a 2 g L-1 demostrando que a faixa da concentraccedilatildeo
celular oacutetima no cultivo de Spirulina natildeo eacute muito restrita (MASOJIDEK et al 2003)
633 Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas
Na Tabela 31 estatildeo os resultados da anaacutelise de variacircncia para o fator de
conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) e nas Tabelas 32 e 33 estatildeo os valores
126
meacutedios do YXN nas variaacuteveis independentes fontes de nitrogecircnio e intensidades
luminosas respectivamente
Tabela 31 - Anaacutelise de variacircncia para fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
054 1 054 091 0351
Fonte de Nitrogecircnio
5078 1 5078 8453 0000
Intensidade luminosa
043 2 022 036 0700
Resiacuteduos 1123 19 059
total 520 23
Como observado na Tabela 24 os maiores valores do fator de conversatildeo (YXN)
foram obtidos nos cultivos utilizando ureacuteia como fonte de nitrogecircnio independente
da fonte de CO2 e da intensidade luminosa utilizada Isso pode ser avaliado pela
anaacutelise de variacircncia (Tabela 31) onde apresenta o niacutevel descritivo para a fonte de
CO2 fonte de nitrogecircnio de p = 0000 e para a intensidade luminosa o p = 0700 A
maior meacutedia dos valores de YXN foi 1380 plusmn 090 g g-1 obtida nos cultivos utilizando
ureacuteia como fonte de nitrogecircnio (Tabela 32) diferindo estatisticamente dos valores
obtidos nos cultivos com nitrato (460 plusmn 055 g g-1) De fato nos cultivo utilizando
ureacuteia a concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente foi calculada com base
na necessidade das ceacutelulas para o crescimento e a manutenccedilatildeo celular natildeo
ocorrendo uma limitaccedilatildeo ou um excesso de nitrogecircnio adicionado durante o cultivo
(item 5) Como mencionado por Rangel-Yagui et al (2004) o excesso de ureacuteia
diminui a eficiecircncia de utilizaccedilatildeo desse nutriente e portanto menor o valor de YXN
Da mesma forma a menor massa total adicionada no cultivo proporcionou maiores
valores de YXN (739 g g-1) no cultivo de S platensis em minitanques utilizando o
cloreto de amocircnio como fonte de nitrogecircnio (Carvalho et al 2004) Por outro lado
nos cultivos com nitrato a concentraccedilatildeo deste foram mantidas acima de 1 g L-1 de
modo a evitar a limitaccedilatildeo do crescimento pela fonte de nitrogecircnio Por isso os
maiores valores de YXN foram obtidos nos cultivos utilizando ureacuteia Resultados
similares foram obtidos por Danesi et al (2003) empregando 25 g de ureacuteia em
127
diferentes protocolos de alimentaccedilatildeo e temperatura em relaccedilatildeo a KNO3 e por Danesi
et al (2004) que tambeacutem observaram um maior fator de conversatildeo utilizando ureacuteia
em relaccedilatildeo a KNO3 independente da intensidade luminosa utilizada (2 e 5 klux)
Rangel-Yagui et al (2004) tambeacutem observaram maiores valores de YXN nos cultivos
utilizando ureacuteia
Tabela 32 - Meacutedias dos fatores de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas para a
variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio
Fonte de nitrogecircnio YXN (mgmg-1)
Nitrato 460 plusmn 055ordf
Ureacuteia 1380 plusmn 090b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
Em relaccedilatildeo agrave variaacutevel independente intensidade luminosa pode-se observar na
Tabela 33 que natildeo diferiram estatisticamente nos valores de YXN Isto eacute
independente da intensidade luminosa utilizada os valores de conversatildeo de
nitrogecircnio em ceacutelulas foram estatisticamente iguais De fato a quantidade de
nitrogecircnio adicionada nos cultivos estaacute relacionada com o crescimento celular
portanto quanto maior o valor de Xm maior foi a quantidade de nitrogecircnio
adicionada nos cultivos independente da fonte nitrogecircnio utilizada (nitrato ou ureacuteia)
Com isso razatildeo entre biomassa formada e nitrogecircnio adicionado foi estatisticamente
igual nas diferentes intensidades luminosas estudas
A Intensidade luminosa influencionou no crescimento celular (Item 62) e a
fonte de nitrogecircnio (nitrato ou ureacuteia) foi adicionada de acordo com a necessidade da
ceacutelula para o crescimento celular (Item 5) Por isso o YXN foi estatisticamente igual
(p = 0245) nas diferentes intensidades luminosas estudadas (Tabela 31)
O fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas eacute definido como a quantidade de
nitrogecircnio utilizada para a formaccedilatildeo de biomassa como no presente trabalho o
nitrogecircnio adicionado foi de acordo com a necessidade diaacuteria das ceacutelulas os valores
meacutedios de YXN para cada intensidade luminosa natildeo poderiam variar como pode ser
observado na Tabela 33
Nos trabalhos apresentados por Bezerra et al (2008) Danesi et al (2004) e
Rangel-Yagui et al (2004) observaram que os valores de Xm e YXN aumentam com
128
o aumento da intensidade luminosa fornecida ao cultivo Maiores energias
fornecidas pelas mais altas luminosidades empregadas nos cultivos permitem as
ceacutelulas de consumirem o nitrogecircnio disponiacutevel levando a maiores valores de Xm e
YXN Isso ocorreu porque a mesma quantidade de nitrogecircnio foi adicionada nos
ensaios com diferentes intensidades luminosas logo o YXN foi uma funccedilatildeo de Xm
Por outro lado no presente trabalho os valores meacutedios YXN natildeo diferiram
estatisticamente com o aumento da intensidade luminosa porque a quantidade total
de nitrogecircnio adicionada variou nos cultivos com as diferentes intensidades
luminosas isto eacute quanto maior a intensidade luminosa maior foi a quantidade de
nitrogecircnio adicionada e consequentemente maior concentraccedilatildeo celular Por isso o
YXN natildeo diferiram nas diferentes intensidades luminosas estudadas (Tabela 26)
Tabela 33 - Meacutedias dos fatores de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas para a
variaacutevel independente intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(mol de foacutetons m-2 s-1)
YXN (mgmg-1)
60 922 plusmn 034ordf
120 902 plusmn 034a
240 935 plusmn 034a
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
Os maiores valores do fator de conversatildeo encontrado nesse trabalho (1327 plusmn
028 mg mg-1) foi maior do que 739 g g-1 (CARVALHO et al 2004) 85 g g-1
(RANGEL-YAGUI et al 2004a) utilizando ureacuteia e 57 plusmn 017 g g-1 utilizando cloreto de
amocircnio como fonte de nitrogecircnio nos cultivos de S platensis em minitaques
(BEZERRA et al 2008) Isso porque no presente trabalho a S platensis foi
cultivada em fotobiorreator tubular fechado o que proporciona menor volatilizaccedilatildeo
da amocircnia e melhor eacute o seu aproveitamento pelas ceacutelulas ocasionando maiores
valores de YXN
129
64 Avaliaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de clorofila a
No final de cada experimento foi realizada a determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de
clorofila a na concentraccedilatildeo celular final e os resultados estatildeo descritos na Tabela
34
Tabela 34 ndash Concentraccedilotildees de clorofila na biomassa final
Experimento Fonte de CO2 Intensidade luminosaa
Fonte de nitrogecircnio
Concentraccedilatildeo de clorofila (mg cl g cel -1)
1 Cilindro 60 NaNO3 521plusmn028
2 Cilindro 60 Ureacuteia 415plusmn020
3 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 60 NaNO3 392plusmn008
4 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 60 Ureacuteia 326plusmn030
5 Cilindro 120 NaNO3 344plusmn010
6 Cilindro 120 Ureacuteia 296plusmn009
7 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 120 NaNO3 294plusmn040
8 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 120 Ureacuteia 210plusmn023
9 Cilindro 240 NaNO3 175plusmn037
10 Cilindro 240 Ureacuteia 181plusmn 015
11 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 240 NaNO3 294plusmn035
12 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 240 Ureacuteia 210plusmn023
a mol de foacutetons m-2 s-1
Dentre os metaboacutelitos microalgais a clorofila foi muito pouco investigada Satildeo
os uacutenicos pigmentos naturais de coloraccedilatildeo verde em abundacircncia mas sua
instabilidade ao isolamento tem restringindo a sua utilizaccedilatildeo como corante natural na
induacutestria de alimentos As clorofilas utilizadas como corantes alimentares provecircm
principalmente de plantas terrestres (HENDRY 1996)
Microalgas fotossinteacuteticas satildeo organismos que capturam energia luminosa
eficiententemente O pigmento fotossinteacutetico clorofila a eacute o principal componente
130
fotoquiacutemico ativo na qual funciona como um receptor de luz para direcionar a
fotossiacutentese O conteuacutedo deste pigmento em microalga eacute portanto relatado para
atividade fotossinteacutetica (MACINTYRE et al 2002) A intensidade de luz captada
pelos pigmentos influencia na produccedilatildeo da biomassa e no acuacutemulo de produtos
alvos na microalga cultivada sob diferentes condiccedilotildees
As clorofilas satildeo pigmentos verdes de alto valor comercial encontradas em
plantas microalgas e cianobacteacuterias como A platensis A concentraccedilatildeo desse
pigmento nas ceacutelulas depende das condiccedilotildees ambientais Devido a sua cor e as
propriedades fiacutesico-quiacutemicas satildeo utilizadas como corantes naturais em produtos
alimentiacutecios
Na Tabela 35 observa-se que ambas as variaacuteveis independentes avaliadas
nesse estudo fonte de nitrogecircnio e intensidade luminosa interferiram na
concentraccedilatildeo de clorofila a na biomassa final Isso foi confirmada pela anaacutelise
estatiacutestica ANOVA onde apresentou um valor de niacutevel descritivo de 0011 para a
variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio e de 0000 para a intensidade luminosa
Tabela 35 - Anaacutelise de variacircncia para a concentraccedilatildeo de clorofila na biomassa final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Meacutedia dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
03725 1 03725 101 0328
Fonte de Nitrogecircnio
29751 1 29751 804 0011
Intensidade luminosa
158306 2 79153 2139 0000
Resiacuteduos 70318 19 01272
Total 26210 23
Avaliando-se as meacutedias da concentraccedilatildeo de clorofila a nas diferentes fontes de
nitrogecircnio (Tabela 34) observa-se que nos cultivos utilizando nitrato obtiveram
maiores concentraccedilotildees de clorofila em relaccedilatildeo aos cultivos com ureacuteia nas
intensidades luminosas de 60 mol de foacutetons m-2 s-1 e 120 mol de foacutetons m-2 s-1
Essa diferenccedila na concentraccedilatildeo de clorofila pode ser explicada pelo fato dos cultivos
com nitrato a concentraccedilatildeo de nitrato no meio de cultura foi mantida sempre
superior a 1 g L-1 enquanto que nos cultivos com ureacuteia a concentraccedilatildeo de ureacuteia no
131
meio cultura foi abaixo de 10-4 M (item 62) Essa concentraccedilatildeo de ureacuteia apesar de
natildeo interferir na concentraccedilatildeo celular pode ter influenciado na concentraccedilatildeo de
clorofila nas ceacutelulas Resultados similares foram observados por Danesi et al (2004)
e Rangel-Yagui et al (2004) em cultivos de S platensis em minitanques
substituindo a fonte de nitrogecircnio KNO3 por ureacuteia
O efeito da limitaccedilatildeo de nitrogecircnio e ferro comprometeu a capacidade
fotossinteacutetica reduziu o conteuacutedo de clorofila celular e diminuiu o rendimento
quacircntico do fotossintema II (YOUNG BEARDALL 2005) Muggli e Harrison (1996)
observaram que a concentraccedilatildeo de clorofila nas ceacutelulas de Emiliania huxleyi
cultivadas com nitrato foi estatisticamente maior que nas celulas cultivadas com
amocircnia sob condiccedilotildees limitadas de ferro e intensidade luminosa abaixo da
saturaccedilatildeo Por outro lado nos cultivos natildeo limitados com ferro as concentraccedilotildees de
clorofilas foram estatisticamente iguais Sob duas diferentes intensidades luminosas
abaixo da regiatildeo de saturaccedilatildeo (45 e 70 mol de foacutetons m-2 s-1) as ceacutelulas cultivadas
em nitrato mantiveram uma maior taxa de clorofila por volume de ceacutelulas que nas
ceacutelulas cultivadas com amocircnio similar ao que aconteceu nas condiccedilotildees limitadas
por ferro
A intensidade luminosa eacute uma importante variaacutevel que interfere na
concentraccedilatildeo de clorofila Como podemos observar na Tabela 34 maiores
concentraccedilotildees de clorofilas meacutedias independente da fonte de nitrogecircnio e de CO2
satildeo encontradas nas menores intensidades luminosas De um modo geral o
aumento da concentraccedilatildeo de clorofila com a reduccedilatildeo da luminosidade aumenta a
capacidade de absorccedilatildeo de luz pois a clorofila eacute quem efetivamente atua nas
reaccedilotildees fotoquiacutemicas da fotossiacutentese e representa um mecanismo de adaptaccedilatildeo agrave
condiccedilatildeo de menor intensidade luminosa A reduccedilatildeo do conteuacutedo de pigmentos a
altas irradiacircncias permite as algas reduzirem a taxa de fornecimento de energia pela
absorccedilatildeo da luz nas ceacutelulas com a finalidade de balancear a energia absorvida e a
energia necessaacuteria para a fixaccedilatildeo do carbono e crescimento celular (GEIDER et al
1997) Geralmente a clorofila e as ficobiliproteiacutenas tendem a aumentar sua
concentraccedilatildeo com a reduccedilatildeo da intensidade luminosa (TOMASELLI et al 1997)
Nas menores intensidades luminosas onde a competiccedilatildeo pelo poder redutor eacute
maior observa-se que as ceacutelulas cultivadas em nitrato mantem maior niacuteveis de
clorofila que nas ceacutelulas cultivadas em amocircnia Portanto as ceacutelulas cultivadas em
nitrato precisam mais do poder redutor para transportar e utilizar sua fonte de
132
nitrogecircnio eles podem requerer mais clorofila que as ceacutelulas cultivadas em amocircnio
para suprir tais necessidades Por outro lado altas intensidades luminosas alteram o
complexo proteacuteico contendo pigmentos captadores de luz como observado por
Smith et al (1990) em ceacutelulas de Dunaliella salina Telfar et al (1990) mostrou que
iluminaccedilatildeo prolongada causa destruiccedilatildeo dos pigmentos da clorofila e conduz a
inibiccedilatildeo fotoquiacutemica do FSII
Cultivos de Spirulina subsalsa exposto agrave alta intensidade luminosa (100 mol
de foacutetons m-2 s-1) mostrou uma reduccedilatildeo no conteuacutedo de pigmentos nas ceacutelulas O
conteuacutedo de carotenoacuteide e clorofila a reduziu com o aumento da intensidade
luminosa de 25 mol de foacutetons m-2 s-1 para 100 mol de foacutetons m-2 s-1 O conteuacutedo
de ficobilissomos obteve uma maior reduccedilatildeo quando comparados com o conteuacutedo
de clorofila a (aproximadamente 70 e 57 respectivamente) Devido a uma
reduccedilatildeo nos carotenoacuteides zeaxantina foi o carotenoacuteide predominante a maior
intensidade luminosa (TOMASELLI et al 1995) Um aumento da intensidade
luminosa de 2 klux (24 mol de foacutetons m-2 s-1 ) para 5 klux (60 mol de foacutetons m-2 s-
1) houve uma reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de clorofila de 14 plusmn 18 mg cl g cel -1 para
80 plusmn 18 mg cl g cel -1 nos cultivos com KNO3 e 142 plusmn 08 mg cl g cel -1 para 72 plusmn
14 mg cl g cel -1 para os cultivos com ureacuteia respectivamente (DANESI et al 2004)
Pode-se observar que a concentraccedilatildeo de clorofila nos cultivos a 5 klux (60 mol de
foacutetons m-2 s-1) foram proacuteximas as concentraccedilotildees obtidas no presente trabalho nos
cultivos a 60 mol de foacutetons m-2 s-1 (NaNO3 = 521 plusmn 03 mg cl g cel -1 Ureacuteia = 415
plusmn 02 mg cl g cel -1 Tabela 34) Essa diferenccedila pode ser devido ao aumento do
efeito sombreamento ser maior em minitanques quando comparada aos
fotobiorreatores tubulares o que favorece a um aumento da concentraccedilatildeo de
clorofila nos cultivos em minitanques Soundarapandian e Vasanthi (2008)
observaram um maior teor de clorofila em diferentes cepas de S platensis cultivadas
a 3 klux (36 mol de foacutetons m-2 s-1) intensidade luminosa com ciclos alternados de 16
horas no claro e 8 horas no escuro
Dados na literatura mostram que na biomassa de A platensis possuem 1 de
clorofila (VONSHAK 1997 COGNO et al 2003) No entanto no presente trabalho a
maior concentraccedilatildeo de clorofila foi de 05 correspondendo ao experimento 1 (60
mol de foacutetons m-2 s-1 NaNO3 Tabela 13) Esse baixo valor de concentraccedilatildeo de
clorofila em relaccedilatildeo aos valores citados na literatura eacute devido agraves altas intensidades
luminosas utilizadas no neste trabalho Soundarapandian e Vasanthi (2008)
133
relataram que a concentraccedilatildeo de clorofila nas S platensis cultivadas a 3 klux pode
variar de 085 (8526 μg mg cel-1) a 097 (9723 μg mg cel-1) dependendo da
cepa utilizada Jimenez et al (2003) em cultivos de S platensis em minitanques
utilizando a energia solar no sul da Espanha obtiveram uma concentraccedilatildeo de
clorofila de 79 g kgminus1 (079)
Carlozzi e Pinzani (2005) observaram uma concentraccedilatildeo maacutexima de clorofila
de 2 em cultivos outdoor de S platensis em fotobiorreator espiralado fechado
Esta concentraccedilatildeo permaneceu constante do 6deg ao 10deg dia de cultivo Tomaselli et
al (1997) tambeacutem observaram um aumento na concentraccedilatildeo de clorofila de 151 μg
mg cel-1 para 263 μg mg cel-1 nos cultivos de A maacutexima em reator de vidro
retangular a intensidade luminosa de 144 mol de foacutetons m-2 s-1 e 25 mol de foacutetons
m-2 s-1 respectivamente Tredici e Zittelli (1998) em cultivos continuos ldquooutdoorsrdquo de
A platensis em fotobiorreator tubular e plano obtiveram a concentraccedilatildeo de clorofila
de 155plusmn002 e 163 plusmn002 na massa seca no iniacutecio do periacuteodo luminoso
De fato a concentraccedilatildeo de clorofila depende das condiccedilotildees ambientais
principalmente da intensidade luminosa No presente estudo nos cultivos
submetidos agrave alta intensidade luminosa favoreceram a uma reduccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de clorofila principalmente nos cultivos a 240 mol de foacutetons m-2 s-1
Do mesmo modo Nakajima e Ueda (1997) observaram um aumento no crescimento
celular de Chlorella pyrenoidosa e uma reduccedilatildeo no conteuacutedo de pigmentos
captadores de luz nas ceacutelulas cultivadas a altas intensidades luminosas (50 μmol de
foacutetons m-2 s-1) Na presenccedila de excesso de luz o oxigecircnio produzido durante a
fotossiacutentese reage com a clorofila excitada originando um oxigecircnio singlete que eacute
muito mais reativo podendo oxidar as clorofilas e ocasionando consequentemente o
fenocircmeno denominado de branqueamento (MARIQUE 2003) As clorofilas tendem a
ser foto-oxidadas a alta irradiaccedilatildeo e devido aos carotenoacuteides poderem prevenir a
foto-oxidaccedilatildeo das clorofilas a relaccedilatildeo entre as clorofilas e carotenoacuteides pode ser
usada como um indicador potencial de perdas foto-oxidativas causadas por fortes
irradiaccedilotildees (HENDRY amp PRICE 1993)
134
65 Avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal
Micro-organismos fotossintetizantes usam fonte de carbono inorgacircnico energia
luminosa e nitrogecircnio para sintetizar compostos orgacircnicos como proteiacutenas
carboidratos vitaminas lipiacutedios pigmentos entre outros Com isso a composiccedilatildeo
centesimal da biomassa pode variar com as condiccedilotildees ambientais (RAFIQUL et al
2005 MOHANTY et al 1997)
Na Tabela 36 estatildeo apresentados os teores de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos
e cinzas das biomassas secas obtidas no final dos experimentos
Tabela 36 - Porcentagem de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos e cinzas na biomassa
seca final
Experimento Intensidade
luminosa (I)
Fonte de CO2
Fonte de nitrogecircnio
Proteiacutenas totais ()
Lipiacutedios totais ()
Cinzas ()
Carboidratos totais ()
1 60 Cilindro NaNO3 319plusmn01 863plusmn03 442plusmn001 5226plusmn358
2 60 Cilindro Ureacuteia 233plusmn07 660plusmn09 442plusmn004 6471plusmn064
3 60 Alcooacutelica NaNO3 324plusmn07 101plusmn08 583plusmn002 5222plusmn341
4 60 Alcooacutelica Ureacuteia 427plusmn23 112plusmn14 508plusmn091 6492plusmn336
5 120 Cilindro NaNO3 281plusmn04 121plusmn06 476plusmn002 5500plusmn-016
6 120 Cilindro Ureacuteia 299plusmn06 730plusmn07 482plusmn018 5794plusmn005
7 120 Alcooacutelica NaNO3 315plusmn18 862plusmn06 497plusmn018 5576plusmn341
8 120 Alcooacutelica Ureacuteia 404plusmn07 953plusmn07 394plusmn063 4642plusmn091
9 240 Cilindro NaNO3 213plusmn01 142plusmn23 428plusmn004 6004plusmn243
10 240 Cilindro Ureacuteia 319plusmn09 129plusmn05 540plusmn050 5079plusmn147
11 240 Alcooacutelica NaNO3 278plusmn04 144plusmn29 579plusmn048 5222plusmn341
12 240 Alcooacutelica Ureacuteia 210plusmn03 117plusmn28 449plusmn004 6492plusmn336
I = Intensidade luminosa (mol de foacutetons m-2 s-1)
A Fotossiacutentese eacute o processo pelo qual a energia luminosa eacute convertida em
energia quiacutemica pelas plantas bacteacuterias fotossinteacuteticas e cianobacteacuterias A energia
luminosa eacute capturada pelos pigmentos fotossinteacuteticos como clorofila carotenoacuteides e
ficocianina na qual satildeo complexados com proteiacutenas que satildeo partes do fotossistema I
e II em cianobacteacuterias O sistema fotossinteacutetico eacute fortemente conectado com outras
135
vias metaboacutelicas como biossiacutentese de proteiacutenas e lipiacutedios nas quais satildeo
necessaacuterias para o crescimento celular (MOHANTY et al 1997)
Os teores de proteiacutena variaram de 21 a 42 Esses valores estatildeo proacuteximos
aos valores encontrados por Cantildeizares-Villanueva et al (1994) cultivando S maxima
em meio de cultura constituiacutedo por resiacuteduo da criaccedilatildeo de porcos (diluiacutedo a 50 em
aacutegua) Embora o teor de proteiacutena seja baixo (36) a biomassa ainda eacute apropriada
para o uso como suplemento aliementar para animais Jimeacutenez et al (2003) tambeacutem
encontraram um baixo teor de proteiacutena de 47 do peso seco em meacutedia na
produccedilatildeo industiral da Spirulina em Malaga no sul da Espanha
A biossiacutentese de proteiacutena depende principalmente da disponibilidade de
nitrogecircnio de carbono para formaccedilatildeo do esqueleto carbocircnico e da intensidade
luminosa na qual fornece energia para fixaccedilatildeo do CO2 Nos cultivos utilizando
nitrato bem como nos cultivos utilizando ureacuteia natildeo houve limitaccedilatildeo do crescimento
pela fonte de nitrogecircnio (Item 611) A fonte de carbono tambeacutem natildeo foi limitada
uma vez que o pH foi mantido durante todo o tempo de cultivo com a adiccedilatildeo de CO2
As intensidades luminosas foram altas pertencendo agrave regiatildeo de saturaccedilatildeo luminosa
(Item 611) Logo mesmo dispondo de nitrogecircnio carbono e energia as ceacutelulas natildeo
converteram o nitrogecircnio disponiacutevel em proteiacutenas SAKAMOTO e BRYAN (1999)
observaram que um aumento da intensidade luminosa de 250 mol de foacutetons m-2 s-1
para 1 mmol foacutetons m-2 s-1 no cultivo de Synechococcus sp PCC 6301 natildeo foi
observado um aumento na absorccedilatildeo de nitrato mostranto que a taxa do consumo
de nitrato foi saturado a intensidade luminosa de 250 mol de foacutetons m-2 s-1
Soundarapandian e Vasanthi (2008) observaram que o conteuacutedo de proteiacutena
nas S platensis cultivadas a 3 klux (36 mol de foacutetons m-2 s-1) com ciclos alternados
de 16 horas no claro e 8 horas no escuro pode variar de 5937 (5937μg mg-1 cel)
a 6421 (6421 μg mg-1 cel) dependendo da cepa utilizada Torzillo et al (1991)
observaram um aumento na siacutentese de carboidrato nas ceacutelulas de S platensis
cultivadas ldquooutdoorsrdquo a altas intensidades luminosas e temperatura de 25ordmC O
execesso do carboidrato sintetizado foi parcialmente utilizado a noite para a siacutentese
de proteiacutena Isso pode ter contribuiacutedo a um baixo teor de proteiacutena no presente
trabalho uma vez que os cultivos foram submetidos sempre a altas intensidades
luminosas natildeo obtendo ciclos claroescuro durante o cultivo
A anaacutelise de variacircncia (Tabela 37) indicou que a fonte de nitrogecircnio e de CO2
natildeo influenciaram na variaacutevel dependente teor de proteiacutena enquanto que a
136
intensidade luminosa influenciou como pode-se obversar na anaacutelise de diferenccedila
entre as meacutedias para essa variaacutevel (Tabela 38)
Tabela 37 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de proteiacutena na biomassa final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
5304 1 5304 235 0142
Fonte de Nitrogecircnio
1134 1 1134 050 0487
Intensidade luminosa
4341 2 2170 963 0001
Resiacuteduos 42833 19 2254
total 9268 23
Tabela 38 - Meacutedias do teor de proteiacutena na biomassa final para a variaacutevel
independente intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(mol foacutetons m-2 s-1)
Proteiacutena ()
60 358plusmn43ordf
120 326plusmn50ordf
240 256plusmn51b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
O modelo da biossiacutentese e metabolismo de lipiacutedios em cianobacteacuterias eou
algas satildeo afetados pelos fatores ambientais dentre esses as condiccedilotildees de
iluminaccedilatildeo (BABADZHANOV et al 2004 KHOTIMCHENKO e YAKOVLEVA 2005)
As ceacutelulas de Tichocarpus crinitus satildeo capazes de mudar o conteuacutedo de
armazenamento e estrutural de lipiacutedios e a composiccedilatildeo de aacutecidos graxos Altas
intensidades luminosas estimulam o acuacutemulo de lipiacutedios de armazenamento
(triacilgliceroacuteis) enquanto a baixas intensidades luminosas induzem a um aumento
nos lipiacutedios estruturais (glicolipiacutedios) Isto indica um alto grau de controle de
estrutura nas membranas das algas porque o grau de insaturaccedilatildeo dos aacutecidos
graxos tem sido considerado um dos fatores mais importantes no controle da fluidez
e funcionalidade da membrana celular Adicionalmente as diferenccedilas na
137
composiccedilatildeo dos lipiacutedios nas T crinitus cultivadas a altas e baixas irradiaccedilotildees solar
podem ser consideradas como uma resposta adaptativa das ceacutelulas algais para as
vaacuterias condiccedilotildees de crescimento Portanto a sobrevivecircncia das ceacutelulas nas
mudanccedilas ambientais pode ser atribuiacuteda agrave funcionalidade das membranas onde o
aparato fotossinteacutetico eacute formado (KHOTIMCHENKO e YAKOVLEVA 2005)
Nos cultivos com disponibilidade de nitrogecircnio carbono e altas intensidades
luminosas as ceacutelulas utilizam a energia e o carbono disponiacutevel para crescimento
manutenccedilatildeo celular e formaccedilatildeo de componentes orgacircnicos tais como proteiacutenas
lipiacutedios e carboidratos Como apresentados na Tabela 41 o teor de lipiacutedio aumenta
com a intensidade luminosa Esse efeito foi observado por Solovchenko et al
(2008) nos cultivos da microalga Parietochloris incisa Isto pode ser consequecircncia da
produccedilatildeo excessiva de aacutecidos graxos entre eles triacilgliceroacuteis provavelmente como
um modo de converter o excesso de luz em energia quiacutemica para evitar o dano
fotooxidativo (ASADA 1994 RABBANI et al 1998 MENDOZA et al 1999 NIYOGI
1999) Kaixian et al (1993) observaram um aumento no teor de lipiacutedios com o
aumento da intensidade luminosa nas ceacutelulas de Phaeodactylum tricornutum
Solovchenko et al (2008) relataram que os triacilgliceroacuteis acumuladas em algas
(Parietochloris incisa) sob condiccedilotildees de stress satildeo frequentemente depositadas em
gloacutebulos de lipiacutedios citoplasmaacutetico referidos como corpos oleosos na qual aumentam
em tamanho e nuacutemero sob deficiecircncia na nutriccedilatildeo mineral especialmente na falta de
nitrogecircnio e altas irradiacircncias
Como observado na Tabela 41 os cultivos a 240 mol de foacutetons m-2 s-1
obtiveram maiores teores de lipiacutedios Steiner et al (1970) observaram que as ceacutelulas
de Chromatium cultivadas a baixas intensidades luminosas (100 ftc = 01 klux = 12
mol de foacutetons m-2 s-1) obteve menor teor de fosfolipiacutedios em relaccedilatildeo aos cultivos a
altas intensidades luminosas (7500 ftc = 8 kux = 96mol de foacutetons m-2 s-1) 1 lux =
0929 foot-candles
Na Tabela 39 estatildeo apresentados os valores da anaacutelise de variacircncia dos teores
de lipiacutedios Como se pode observar apenas a intensidade luminosa influenciou nos
valores de lipiacutedios apresentando um valor de niacutevel descritivo menor que 5
Embora o niacutevel de significacircncia da variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio seja
menor que 5 a anaacutelise estatiacutestica diferenccedila entre as meacutedias mostraram essa
variaacutevel natildeo interfere no teor de lipiacutedio apresenta um valor de niacutevel descritivo maior
que 5 (Tabela 40)
138
Tabela 39 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de lipiacutedios na biomassa seca final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
143 1 143 059 0453
Fonte de Nitrogecircnio
1853 1 1853 762 0012
Intensidade luminosa
141 2 71 29 0000
Resiacuteduos 46 19 244
total 207 23
Tabela 40 - Meacutedias do teor de lipiacutedio na biomassa final para a variaacutevel independente
fonte de nitrogecircnio
Fonte de nitrogecircnio Lipiacutedios ()
Nitrato 109 plusmn 310ordf
Ureacuteia 918 plusmn 275a
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um
intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
Tabela 41 - Meacutedias do teor de lipiacutedio na biomassa final para a variaacutevel independente
intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(μmoles m-2 s-1)
Lipiacutedios ()
60 763 plusmn 11a
120 972 plusmn 19a
240 136 plusmn 21b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
A similaridade entre as fontes de nitrogecircnio (Tabela 40) podem ser explicadas
pelo fato de que nos cultivos com ureacuteia a quantidade de ureacuteia adicionada foi
calculada com base nos seus respectivos cultivos com nitrato nas quais foram
139
cultivos natildeo limitados por nitrogecircnio (concentraccedilatildeo de nitrogecircnio superior a 1 g L-1)
Logo isso favoreceu a semelhanccedila entre os teores de lipiacutedios nos cultivos a
diferentes fontes de nitrogecircnio
Os valores de lipiacutedios encontrados variaram de 66 plusmn 09 a 144 plusmn 29
dependendo das condiccedilotildees de cultivo Esses valores estatildeo de acordo com Cogno et
al (2003) e Vonshak (1997) na qual relataram que o conteuacutedo de lipiacutedios da A
platensis em condiccedilotildees fotoautotroacuteficas podem variar de 8 ndash 12 quando cultivadas
em meio sinteacutetico Tokusoglu e Uumlnal (2003) encontraram um teor de lipiacutedio meacutedio
entre trecircs diferentes cepas de Splatensis de 753 natildeo diferindo estatisticamente
entre si
O teor de lipiacutedio foi de 863 plusmn 03 com NaNO3 e 66 plusmn 09 com ureacuteia na
intensidade luminosa de 60 μmoles de foacutetons m-2 s-1 utilizando CO2 de cilindro
Esses valores foram proacuteximos aos teores de lipiacutedios encontrados por Rafiqul et al
(2005) cultivando S platensis (74) e para S fusiformis (82) a 25 klux (30 μmol
de foacutetons m-2 s-1) Oliveira et al (1999) observaram um teor de lipiacutedios de 696 plusmn
086 nas ceacutelulas de S platensis cultivadas em 4 l Virtis fermenter a 180 μmol de
foacutetons mndash2 sndash1
Olguiacuten et al (2001) observaram uma menor concentraccedilatildeo de lipiacutedios nos
cultivos a maior intensidade luminosa em cultivos de S platensis cultivada tanto em
meio sinteacutetico (meio Zarrouk) como em meio complexo (aacutegua do mar do Golf do
Meacutexico suplementado com 2 de efluente anaeroacutebico da criaccedilatildeo de porcos) A
concentraccedilatildeo de nitrogecircnio no meio complexo possui 10 vezes a menos que o meio
sinteacutetico (25 g L-1 NaNO3) O teor de lipiacutedio de 8 encontrado no meio de cultivo
com 25 g L-1 NaNO3 a 66 μmols de foacutetons m-2 s-1 foi proacuteximo ao encontrado no
presente trabalho 66 plusmn 09 no cultivo natildeo limitado por NaNO3 e 60 μmols de foacutetons
m-2 s-1
Nos cultivos a 60 mol de foacutetons m-2 s-1 mostrou maiores valores de lipiacutedios
quando cultivadas com CO2 proveniente de fermentaccedilatildeo alcooacutelica em relaccedilatildeo aos
cultivos utilizando CO2 de cilindro Sob condiccedilotildees autotroacuteficas a produtividade de
lipiacutedios foram menores quando comparadas com o crescimento heterotroacutefico em
culturas de Chlorella vulgareis (LIANG et al 2009) e crescimento heterotroacutefico e
mixotroacutefico nas ceacutelulas de Chlamydomonas reinhardtii (BOYLE MORGAN 2009)
O teor de carboidrato nas ceacutelulas A platensis natildeo diferiram estatisticamente
pela anaacutelise de variacircncia nas diferentes condiccedilotildees estudadas (Tabela 44) obtendo
140
um niacutevel de significacircncia de 0118 0974 e 0562 para as variaacuteveis independentes
fontes de CO2 fonte de nitrogecircnio e intensidades luminosas respectivamente O
teor de carboidrato encontrado variou de 38 a 51 valores considerados altos No
entanto esses valores foram proacuteximos aos valores obtidos por Cantildeizares-Villanueva
et al (1994) que observaram um teor de carboidrato de 42 e 44 em ceacutelulas de S
maxima cultivadas em meio sinteacutetico (Zarrouk) e meio constituiacutedo por resiacuteduo da
criaccedilatildeo de porcos (diluiacutedo a 50) respectivamente sob intensidade luminosa de 3
klux (36 μmol de foacutetons m-2 s-1) O teor de carboidrato neste trabalho foi um pouco
maior que o observado por Cantildeizares-Villanueva et al (1994) provavelmente devido
a diferenccedila de intensidade luminosa pois maiores teores de carboidratos satildeo
obtidos nos cultivos sob maior intensidade luminosa
Olguiacuten et al (2001) obtiveram um alto teor de polissacariacutedeos de 2841 nas
ceacutelulas de S platensis cultivadas em meio complexo quando exposta a intensidade
luminosa de 144 μmol de foacutetons mminus2 sminus1 Esse alto valor poderia ter sido devido a
dois fatores simultacircneos deficiecircncia de nitrogecircnio e alta intensidade luminosa
Desse modo no presente trabalho natildeo houve deficiecircncia de nitrogecircnio nos cultivos
no entanto a aacuterea iluminada no fotobioreator tubular usado no presente trabalho eacute
maior quando comparada com os cultivos em bench raceway utilizados por Olguiacuten et
al (2001) e esse aumento pode ter favorecido a obtenccedilatildeo dos altos teores de
carboidratos
Tomaselli et al (1997) observaram uma reduccedilatildeo no teor de carboidrato nas
ceacutelulas de A maacutexima de 282 mgg-1 (28) para 180 mgg-1 (18) quando a
intensidade luminosa reduziu de 144 μmol de foacutetons mminus2 sminus1 para 25 μmol de foacutetons
mminus2 sminus1 A capacidade dos microganismos fototroacuteficos em estocar na forma de
carboidratos o excesso do carbono fixado durante a aclimataccedilatildeo a altas intensidades
luminosas e mobilizar esse esqueleto carbocircnico para a siacutentese de proteiacutena
representa um requisito importante para a sobrevivecircncia
141
Tabela 42 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de carboidratos na biomassa seca final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
107 1 107 268 0118
Fonte de Nitrogecircnio
004 1 004 000 0974
Intensiade luminosa
48 2 24 059 0562
Resiacuteduos 763 19 40
total 918 23
A partir dos estudos relatados previamente na literatura mostram que o teor de
carboidrato eacute 12 a 16 nas ceacutelulas de Arthrospira platensis cultivadas em meio
sinteacutetico e em condiccedilotildees fotoautotroacuteficas sem condiccedilotildees de stress como alta
salinidade alta intensidade luminosa deficiecircncia em nitrogecircnio (COGNO et al
2003 VONSHAK 1997) Carlozzi e Pinzani (2005) relataram que as ceacutelulas de
Artrospira platensis foram estimuladas para sintetizar carboidratos durante o dia e
estes foram consumidos para permitir a siacutentese de proteiacutenas durante a noite De
acordo com Ma et al (1997) uma menor taxa na siacutentese de proteiacutena eacute observado a
altas irradiaccedilotildees comparando com a siacutentese de carboidrato Isto pode conduzir a
um acuacutemulo de carboidrato nas ceacutelulas sem um concomitante aumento na siacutentese
de proteiacutena Tem sido sugerido que o carbono a partir dos poliacutemeros de carboidratos
estocados pode ser transferido para formaccedilatildeo de proteiacutenas durante a noite (Ma et
al 1997) No entanto como no presente trabalho natildeo houve fotoperiacuteodo de fase
claroescuro propiciou a um acuacutemulo de carboidrato nas ceacutelulas e a reduziu a
concentraccedilatildeo de proteiacutenas Adicionalmente Torzillo et al (1991) relataram que as
ceacutelulas de Spirulina expostas a altas irradiacircncais direcionam a biomassa a sintetizar
carboidratos na qual pode ser usado como um reservatoacuterio do poder redutor e a
uma reduccedilatildeo na siacutentese de proteiacutenas
Como podemos observar na anaacutelise de variacircncia (Tabela 43) o teor de cinzas
natildeo foi influenciado pelas variaacuteveis estudadas atingindo valores que variaram de
428 plusmn 004 a 583 plusmn 002 Esses valores estatildeo de acordo com os valores obtidos
por Miao (2005) que obtiveram um teor de cinzas de 636 plusmn 005 em cultivos
autotroacuteficos e 593 plusmn 004 em cultivos heterotroacuteficos de Chlorella protothecoides
Similarmente Tokusoglu e Uumlnal (2003) observaram um conteuacutedo de cinzas em trecircs
142
diferentes cepas de Spirulina denominada de 1 2 e 3 foram de 743 751 and
1038 respectivamente A microalga marinha Isochrisis obteve o maior conteuacutedo
de cinzas (1608)
Tabela 43 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de cinzas na biomassa seca final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
068 1 069 18 0192
Fonte de Nitrogecircnio
058 1 058 152 0232
Intensiade luminosa
112 2 056 147 0255
Resiacuteduos 723 19 038
total 962 23
Jimeacutenez et al (2003) encontraram um alto teor de cinzas no cultivo de S
platensis aproximadamente 20 (valores tiacutepicos satildeo de 5ndash7) esse alto valor pode
ser explicado pelo fato de que a alga obtida a partir do filtro foi introduzida
diretamente spray drier sem passar pelo processo de lavagem Como o meio de
crescimento eacute altamente enriquecido com bicarbonato a lavagem eacute necessaacuteria para
eliminaacute-los Esse processo normalmente reduz o conteuacutedo de cinzas
No presente trabalho a composiccedilatildeo do meio de cultura foi mantido em todas as
condiccedilotildees experimentais com modificaccedilatildeo apenas da fonte de nitrogecircnio de nitrato
de soacutedio para ureacuteia em alguns experimentos Adicionalmente a biomassa passou
por um processo de lavagem antes da etapa de secagem que removeu os sais
adsorvidos nas ceacutelulas Portanto isso favoreceu a manutenccedilatildeo no teor de cinzas na
biomassa seca Canizares et al (2004) obtiveram elevados teores de cinzas (14)
na biomassa de Spirulina maacutexima utilizando 50 de efluente suiacuteno no meio de
cultura Isso foi atribuiacutedo ao elevado quantidade de partiacuteculas minerais presente no
meio
143
66 Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros bioenergeacuteticos
Foram avaliados os paracircmetros bioenergeacuteticos da A platensis durante os
cultivos avaliando os andamentos em funccedilatildeo do tempo dos paracircmetros energia de
Gibbs dissipada para o crescimento e manutenccedilatildeo celular (1YGX) das produccedilotildees
molares de O2 consumo de H+ e nuacutemero de foacutetons para sustentar o crescimento
fotoautotroacutefico Foi avaliada a eficiecircncia da fotossiacutentese em A platensis calculando-
se a energia molar de Gibbs absorvida da luz para produzir um C-mol de biomassa
a partir do correspondente nuacutemero de Einsteins absorvidos e da energia meacutedia
molar dos foacutetons
A energia de Gibbs dissipada por unidade da biomassa (1YGX kJ por C-mol X)
foi calculada pela Equaccedilatildeo 6 como descrita no item 45 A equaccedilatildeo mostra que na
dissipaccedilatildeo da energia de Gibbs estatildeo inclusos tanto a manutenccedilatildeo como o
crescimento celular A energia de Gibbs eacute utilizada tambeacutem para a manutenccedilatildeo das
funccedilotildees celulares como reposiccedilatildeo dos gradientes que faltam degradaccedilatildeo proteiacutenas
Esta energia de Gibbs eacute produzida pelo catabolismo de certas quantidades de
doadores de eleacutetrons (substratos)
No Graacutefico 26 ilustra o comportamento da dissipaccedilatildeo da energia de Gibbs para
o crescimento e manutenccedilatildeo celular 1YGX em relaccedilatildeo ao tempo Como regra geral
esse paracircmetro bioenergeacutetico aumentou com o tempo em todas as condiccedilotildees
testadas como resultado do crescente niacutevel de biomassa que foi responsaacutevel por
diminuir a velocidade especiacutefica de crescimento Um aumento na intensidade
luminosa ateacute 120 mol de foacutetons m-2 s-1 favoreceu o crescimento de ceacutelulas por
causa de fotolimitaccedilatildeo com isso as exigecircncias de energia aumentaram
notavelmente no periacuteodo de tempo mais curto Por outro lado nenhum (ureacuteia) ou
muito pouco (nitrato) aumento de 1YGX foram observados na faixa da intensidade
luminosa de 120-240 mol de foacutetons m-2 s-1 por causa da obtenccedilatildeo das condiccedilotildees
de saturaccedilatildeo de luz Esse comportamento tambeacutem eacute consistente com os menores
valores de 1YGX previamente observados em tanques abertos (TORRE et al 2003)
o que permitiu um menor crescimento devido ao efeito de sombreamento (DANESI
et al 2004)
144
Graacutefico 26 Energia de Gibbs de dissipaccedilatildeo durante o cultivo de A platensis
intensidade luminosa (μmol m-2 s-1) () 60 ( ) 120 () 240 Fonte de
nitrogecircnio nitrato (siacutembolo aberto) ureacuteia (siacutembolo fechado)
Com os dados da composiccedilatildeo elementar da biomassa seca obtida no final de
cada experimento foram calculados os coeficientes atocircmicos para os elementos C
N H O S principais elementos que constituem a composiccedilatildeo elementar da
biomassa Determinado o coeficiente atocircmico dos elementos C H O N S (descrito
no item 4653) e conhecendo-se os graus de reduccedilatildeo desses elementos (C = 4 H
=1 O = -2 S = 6 N-NH4+ = -3 ou N-NO3
- = 5) de acordo com os iacuteons nas quais satildeo
inseridos na biomassa (HCO3- H2O H+ O2 NH4
+ e SO4-2) foi possiacutevel calcular o
grau de reduccedilatildeo da biomassa (descrito no item 4654 Tabela 44) bem como os
coeficientes estequiomeacutetricos para balanccedilos de carbono nitrogecircnio oxigecircnio
enxofre carga iocircnica e poder de reduccedilatildeo para a produccedilatildeo fotoautotroacutefica de 1 mol
de carbono (C-mol) de biomassa seca usando NaNO3 e ureacuteia como fonte de
nitrogecircnio de acordo com Heijnen (2001) em cada condiccedilatildeo estudada de acordo
com a aplicaccedilatildeo do princiacutepio de conservaccedilatildeo
O crescimento autotroacutefico pode ser representado por uma equaccedilatildeo de
balanccedilo de massa global onde as fontes de nitrogecircnio (NO3- ou NH4
+) e carbono
(HCO3-) H2O e H+ estatildeo envolvidas para a formaccedilatildeo de 1 C-mol de biomassa
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
0 2 4 6 8 10 12
1Y
GX (
kJ
C-m
ol
DM
-1)
Tempo (dias)
145
a HCO3- + b NO3
- (or NH4+) + c H2O + d O2 + e H+ + f SO4
-2 +
CH1650O0531N0170S00007 = 0 (11)
Para esse propoacutesito foi usada a composiccedilatildeo elementar descrita por Cornet et
al (1992) (Equaccedilatildeo 11) ou a composiccedilatildeo elementar determinada
experimentalmente como descrita no item Materiais e meacutetodos
Os coeficientes estequiomeacutetricos foram estimados atraveacutes dos balanccedilos de
materiais de carbono nitrogecircnio oxigecircnio enxofre carga e grau de reduccedilatildeo da
biomassa usados para a formaccedilatildeo da biomassa Os principais iacuteons envolvidos na
formaccedilatildeo da biomassa e seus respectivos coeficientes estequiomeacutetricos estatildeo
descritos na Tabela 44
Como pode ser observado o grau de reduccedilatildeo da biomassa (γX) calculado no
modelo da composiccedilatildeo da biomassa determinado experimentalmente neste trabalho foi
sempre um pouco maior com o nitrato (489 ndash 519) do que com ureacuteia (399 ndash 432)
como esperado pelo maior nuacutemero de oxidaccedilatildeo do nitrato (HEIJNEN 2001)
Tabela 44 - Coeficientes estequiomeacutetricos estimados atraveacutes dos balanccedilos de materiais de
carbono nitrogecircnio oxigecircnio enxofre carga e grau de reduccedilatildeo da biomassa cultivada em
fotobiorreator tubular horizontal utilizando nitrato ou ureacuteia como fontes de nitrogecircnio
HCO3- NO3
- NH4+ H2O O2 H+ SO4
-2 Biomassa
Δgf‟i
(kJ mol-1) -5872 -1114 -794 -2373 0 -399 -7446 -670
Coeficiente estequiomeacutetrico (mol C-molDM-1)
testes Ia a b b C d e f γX b
1 c 60 -1 -020 - 020 145 -120 - 58
1 d 60 -1 -011 - 032 130 -111 000 519
2 d 60 -1 - -007 024 100 -093 000 399
3 d 120 -1 -011 - 023 122 -111 000 489
4 d 120 -1 - -008 042 103 -092 000 411
5 d 240 -1 -010 - 023 127 -110 000 509
6 d 240 -1 - -008 034 108 -092 000 432 a Intensidade luminosa (μmol m
-2 s
-1)
b Grau de reduccedilao da biomassa
c Composiccedilatildeo elementar da biomassa descrita por Cornet et al (1992)
d Composiccedilatildeo elementar da biomassa determinada experimentalmente
146
Estimando os coeficientes estequiomeacutetricos da reaccedilatildeo 11 e conhecendo a
energia de Gibbs de formaccedilatildeo de produtos e reagentes (Tabela 44) (HEIJNEN
2001) eacute possiacutevel calcular o numero de moles de foacutetons (Einsteins) para sustentar o
crescimento autotroacutefico de 1 C-mol de biomassa (nPh) pela Equaccedilatildeo 8 (item 45)
Embora os valores reais de Δgfi deveriam ter sido utilizados para este caacutelculo
foram utilizados os valores das condiccedilotildees bioloacutegicas padratildeo Torre et al (2003)
demostraram que as diferenccedilas entre a energia de Gibbs de formaccedilatildeo nas
condiccedilotildees reais de cultivo natildeo diferem entre si ou diferem natildeo mais que 3 apartir
de seus respectivos valores estimados com base nas condiccedilotildees bioloacutegicas padratildeo
(T = 2984K C = 10M pH = 70) Por isso foram utilizados os valores de energia de
Gibbs nas condiccedilotildees bioloacutegicas padratildeo
No entanto para o iacuteon H+ a energia de Gibbs de formaccedilatildeo (ΔgfH+) eacute por
definiccedilatildeo uma funccedilatildeo da cultura do pH Assim esse paracircmetro foi recalculado para
as condiccedilotildees reais da equaccedilatildeo de Gibbs
7
pH
ff10
10ln
HH
RTgg (Equaccedilatildeo 12)
Durante as reaccedilotildees luminosas da fotossiacutentese a energia livre carregada
pelos foacutetons eacute capturada por pigmentos (por exemplo a clorofila) organizadas em
grandes complexos de proteiacutenas chamado de centros de reaccedilatildeo A energia de um
foacuteton provoca excitaccedilatildeo eletrocircnica elevando um eleacutetron para um niacutevel maior de
energia exatamente igual agrave energia do foacuteton (hν) Satildeo exigidos um miacutenio de 8 foacutetons
para transferir 4 eleacutetrons de 2 moleacuteculas de H2O para reduzir a 2 moleacuteculas de
NADPH2 de acordo com a equaccedilatildeo
2 H2O + 8 hν +2 NADP+ rarr 2 NADPH + O2 + 2H+ (Reaccedilatildeo 12)
Subsequentemente os eleacutetrons satildeo transferidos do NADPH para o CO2
atraveacutes do ciclo de Calvin para produzir os constituintes da biomassa (RAVEN et al
2000)
Como mostrado na Graacutefico 27 a diminuiccedilatildeo progressiva da velocidade
especiacutefica de crescimento () ao longo do cultivo provocou um aumento (em valor
absoluto) no nuacutemero de Einsteins absorvido para produzir 1 C-mol de biomassa
147
(nPh) Nos maiores valores de quase atingiu o valor teoacuterico de nPh relatado por
Richmond (1983) para sustentar o crescimento sob condiccedilotildees ideais que eacute de 8
Einsteins por C-mol de biomassa
Como jaacute foi observado em trabalho anterior (TORRE et al 2003) a exigecircncia
de energia adicional em relaccedilatildeo agrave situaccedilatildeo ideal de 8 Einsteins C-mol DM-1 foi
insignificante no iniacutecio dos cultivos (alta velocidade especiacutefica de crescimento) e em
seguida aumentou consideravelmente durante a fase estacionaacuteria de cada
experimento sugerindo que em condiccedilotildees provavelmente limitada pelo
sombreamento a biomassa usa a energia preferencialmente para a manutenccedilatildeo
do que para o crescimento Em condiccedilotildees de limitaccedilatildeo de luz (no iniacutecio) ou de
sombreamento (na fase estacionaacuteria) um aumento progressivo da intensidade de
luz natildeo excedeu qualquer influecircncia significativa sobre este paracircmetro
Graacutefico 27 Influecircncia da velocidade especiacutefica de crescimento da A platensis sobre
o nuacutemero de moles de foacutetons absorvido para produzir 1 C-mol de biomassa em
diferentes condiccedilotildees de cultivo () Composiccedilatildeo elementar da biomass descrita por
Cornet et al (1992) PPFD = 60 μmol de foacutetons m-2 s-1 Composiccedilatildeo elementar da
biomass determinada experimentalmente PPFD (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60
() 120 () 240 Fonte de nitrogecircnio nitrato (siacutembolos abertos) ureacuteia
(siacutembolos fechados)
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
000 010 020 030 040 050 060 070 080
nP
h (
Ein
stei
n C
-mol
DM
-1)
(dias -1)
148
Como mostrado no Graacutefico 27 as culturas com nitrato necessitam de maiores
valores de nPh para sustentar o crescimento autotroacutefico em relaccedilatildeo agraves culturas
utilizando ureacuteia Como as concentraccedilotildees celulares dos cultivos utilizando nitrato ou
ureacuteia foram semelhante em todas as intensidades luminosas (Item 61) a exigecircncia
adicional foacuteton nos cultivos com nitrato foi provavelmente utilizado para reduzir o
nitrato a amocircnio (HATORI MYERS 1966) que eacute a forma preferencial de nitrogecircnio
assimilado pela A platensis (BOUSSIBA et al 1984) Este efeito tambeacutem foi
observada por Torre et al (2003) em tanques abertos
Finalmente pode ser observado na mesma figura que o uso do modelo
bioenergeacutetico acima com os coeficientes relatados por Cornet et al (1992) para a
composiccedilatildeo da biomassa de A platensis (CHNOS) levou a resultados praticamente
coincidentes com aqueles obtidos utilizando as experimentais determinadas neste
trabalho Essa constataccedilatildeo demonstra que a composiccedilatildeo da biomassa tem um
impacto pouco significativo sobre os resultados de tal modelo bioenergeacutetico logo
poderia simplesmente ser usado como um instrumento geral assumindo os dados da
literatura sem a necessidade de qualquer determinaccedilatildeo da biomassa
No Graacutefico 28 mostra os comportamentos da produccedilatildeo molar de O2 e do
consumo de H+ durante os cultivos nas diferentes intensidades luminosas Essas
tendecircncias demonstram que as diferentes atividades de consumo e produccedilatildeo
seguem fielmente o crescimento celular O aumento progressivo desses paracircmetros
com a intensidade luminosa confirma que esta foi o fator limitante ao crescimento
nunca atingindo as condiccedilotildees de inibiccedilatildeo da luz Como esperado este
comportamento foi qualitativamente semelhante nas culturas utilizando nitrato como
fonte de nitrogecircnio
149
Graacutefico 28 Produccedilatildeo molar de O2 (siacutembolo fechado) e consumo de H+ (siacutembolo
aberto) em funccedilatildeo do tempo em diferentes condiccedilotildees de cultivo Intensidades
luminosas (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 () 120 () 240 Fonte de
nitrogecircnio nitrato (linha rachurada) ureacuteia (linha contiacutenua)
Como eacute conhecido a energia do fluxo de eleacutetrons entre o FSII e NADPH
direciona proacutetons atraveacutes da membrana plasmaacutetica criando uma forccedila motriz de
proacutetons que fornece energia para a siacutentese de ATP pela ATP sintase (LEHNINGER
2004) Portanto assumiu-se que uma parte da energia molar de Gibbs absorvida
pelos dois fotossistemas foi usada para converter ADP em ATP Como mostrado no
Graacutefico 29 os maiores valores de ΔGa e ΔGATP foram obtidos no final do cultivo
devido a condiccedilotildees ambientais desfavoraacuteveis como a falta de nutrientes ou
liberaccedilatildeo de metaboacutelitos celulares No que se refere agrave intensidade luminosa os
maiores valores de ΔGa e ΔGATP foram observados nas culturas a intensidades
luminosas iguais e maiores que 120 μmol de foacutetons m-2 s-1 que garantiu a maior
concentraccedilatildeo de ceacutelulas (Item 61) Os valores de ΔGa e ΔGATP natildeo aumentaram no
caso dos cultivos utilizando ureacuteia ou aumentou muito pouco no caso dos cultivos
utilizando nitrato na faixa de intensidade luminosa de 120 - 240 μmol de foacutetons m-2
s-1 devido agraves condiccedilotildees de saturaccedilatildeo de luz como mencionado anteriormente
-015
-010
-005
000
005
010
015
020
0 2 4 6 8 10 12
q (
mo
lL
)
Tempo (dias)
150
Graacutefico 29 Energia total de Gibbs absorvida pelo aparato fotossinteacutetico (siacutembolo
fechado) (ΔGa) e energia transformada em ATP (siacutembolo aberto) (ΔGATP) durante o
cultivo da A platensis intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 (
) 120 () 240 Fonte de nitrogecircnio nitrato (linha tracejada) ureacuteia (linha
continua)
No Graacutefico 30 mostra os resultados da energia fixada pela fotossiacutentese (ΔH)
e a liberada como calor (Q) a diferentes condiccedilotildees de intensidades luminosas e
fontes de nitrogecircnio Pode ser visto que no final de cultivos tanto ΔH como Q
aumentaram com a intensidade luminosa Como eacute bem conhecido sob condiccedilotildees de
excesso de luz parte da energia absorvida eacute dissipada termicamente atraveacutes de um
mecanismo natildeo fotoquiacutemico (Non-Photochemical Quenching) (MOZZO et al 2008)
e uma quantidade significativa de energia livre eacute perdida como calor durante as
reaccedilotildees bioquiacutemicas entre a absorccedilatildeo luz e a formaccedilatildeo carboidratos (HAUSKA
ARNALD 2000) Esse resultado foi atribuiacutedo a um mecanismo fisioloacutegico para
proteger o aparelho fotossinteacutetico contra fotodestruiccedilatildeo (KARAPETYAN 2008
HEBER et al 2006) cuja funccedilatildeo eacute desempenhada pelos complexos antena do
aparato fotossinteacutetico que muda forma de captaccedilatildeo de luz para uma forma de
dissipaccedilatildeo teacutermica eficiente (MOZZO et al 2008)
-10000
-8000
-6000
-4000
-2000
0
2000
0 2 4 6 8 10 12
G
AT
P (
kJ
C-m
ol
DM
-1)
Tempo (dias)
151
Graacutefico 30 Energia fixada pelo aparato fotossinteacutetico (siacutembolo fechado) (ΔH) e
energia liberada como calor (siacutembolo aberto) (Q) durante o cultivo de A platensis
intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 ( ) 120 () 240
Fonte de nitrogecircnio nitrato (linha rachurada) ureacuteia (linha contiacutenua)
Como era esperado pelo fato de que tanto a siacutentese de ATP como a formaccedilatildeo
de NADPH satildeo resultantes do mesmo complexo fotossinteacutetico o comportamento do
ΔH foi bastante semelhante ao observado para o ΔGATP
No Graacutefico 31 mostra a distribuiccedilatildeo percentual da energia luminosa absorvida
em funccedilatildeo do tempo nos cultivos a 60 μmol de foacutetons mndash2 sndash1 escolhidos como
exemplo Resultados qualitativamente semelhantes foram observados nos cultivos a
maiores intensidades luminosos (dados natildeo mostrados) Os cultivos com ureacuteia
apresentaram maiores valores de ηATP e ηF e menores valores de ηQ quando
comparado aos cultivos usando nitrato Isso pode ser explicado pelo fato de um
maior requerimento energeacutetico para a reduccedilatildeo de nitrato de amocircnia Aleacutem disso em
todos os experimentos a fraccedilatildeo de energia armazenada como ATP (ηATP) e a fixada
pelos sistemas (ηF) diminuiram ao longo do tempo enquanto que o liberado em
forma de calor (ηQ) aumentou
-2000
0
2000
4000
6000
8000
0 2 4 6 8 10
-H
Q
(k
J C
-mo
l D
M -1
)
Tempo (dias)
152
Graacutefico 31 Porcentagem na distribuiccedilatildeo da energia luminosa absorvida durante o
cultivo de A platensis usando nitrato (siacutembolo fechado) e ureacuteia (siacutembolo aberto)
como fonte de nitrogecircnio Energia fixada pelos fotossistemas () energia
transformada em ATP () energia liberada como calor ( )
Os maiores valores ηATP e ηF foram por volta de 12 e 23-27 nas culturas
com nitrato e 15 e 31-34 em culturas com ureacuteia respectivamente Nos cultivos a
maiores intensidades luminosas (120 e 240 μmol de foacutetons mndash2 sndash1) os valores de ηF
diminuem mais acentuadamente que os cultivos a 60 μmol de foacutetons mndash2 sndash1 devido
agrave maior concentraccedilatildeo de ceacutelulas (item 61) que reduziu a disponibilidade de luz para
a ceacutelula (efeito de sombreamento) A disponibilidade de nutrientes eacute outro importante
fator ambiental influenciando a composiccedilatildeo do aparato fotossinteacutetico de
cianobacteacuterias Murakami et al (1997) tecircm mostrado que as respostas ao CO2 Na+
e estresse pela luz em Synechocystis sp provocam alteraccedilotildees no estado redox de
componentes entre os sistemas de transporte de eleacutetrons Da mesma forma a
diminuiccedilatildeo na disponibilidade de alguns nutrientes no final do cultivo de A platensis
pode ter contribuiacutedo para diminuir os valores de ηF Como esperado ηQ mostraram
um comportamento oposto aumentando progressivamente a partir dos valores
miacutenimos (60-66 com nitrato e 49-54 com ureacuteia) no iniacutecio do cultivo e cerca de
90 no final Isto significa que no final do cultivo da maior parte da energia
absorvida foi liberada como calor
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2 4 6 8 10 12
h (
)
Tempo (dias)
153
67 Comparaccedilatildeo entre os fotobiorreatores de diferentes configuraccedilotildees
Apoacutes a escolha da melhor condiccedilatildeo do cultivo de A platensis em
fotobiorreator tubular horizontal utilizando CO2 de cilindro foram realizados
experimentos nas mesmas condiccedilotildees em fotobiorreator tubular espiralado para
avaliar o comportamento celular em duas diferentes configuraccedilotildees de
fotobiorreatores tubulares Luo et al (2003) tem mostrado que a configuraccedilatildeo de
cada reator eacute um dos principais fatores que controlam a produtividade do cultivo
fotossinteacutetico Por isso foram comparadas as curvas de crescimento A platensis
duas diferentes configuraccedilotildees dos fotobiorreatores tubulares uma horizonal (Figura
7) e outra espiralada (Figura 8)
Como observado no Graacutefico 32 os crescimentos celulares da A platensis nos
diferentes fotobiorreatores foram semelhantes obtendo valores de concentraccedilotildees
celulares diaacuterias proacuteximas Isso pode ser explicado pela semelhanccedila nas condiccedilotildees
fiacutesicas entre os fotobiorreatores tais como diacircmetro interno do tubo velocidade de
escoamento do liacutequido bem como as condiccedilotildees de cultivos como a intensidade
luminosa temperatura meio de cultivo que foram mantidas as mais semelhantes
possiacuteveis
Graacutefico 32 Concentraccedilatildeo celular nas duas diferentes configuraccedilotildees dos
fotobiorreatores tubulares ( ) horizontal e ( loz ) espiralado
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
Tempo (dias)
X (
mg
L-1)
154
7 Conclusotildees
Os paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) e produtividade em ceacutelulas
(Px) foram influenciados pela variaacutevel independente intensidade luminosa (I)
obtendo maiores valores quando submetidos a maiores intensidades luminosas Por
outro lado a variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio (N) natildeo influenciou nesses
paracircmetros mostrando a viabilidade na substituiccedilatildeo do nitrato pela ureacuteia nos cultivos
de Artrhospira platensis
A variaacutevel independente intensidade luminosa natildeo influenciou no paracircmetro
fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) No entanto para variaacutevel
independente fonte de nitrogecircnio os cultivos utilizando ureacuteia apresentaram maiores
valores de YXN quando comparados aos cultivos com nitrato As diferentes fontes de
CO2 natildeo influenciaram nos paracircmetros analisados Xm Px e YXN Logo o CO2
juntamente com os volaacuteteis orgacircnicos liberados durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica
pode ser utilizado para o cultivo da A plantesis sem interferir no crescimento celular
Na composiccedilatildeo centesimal da biomassa pode-se observar que intensidade
luminosa influenciou nos teores de clorofila proteiacutenas e lipiacutedios obtendo maiores
valores de clorofila e proteiacutena nos cultivos a baixa intensidade luminosa enquanto
que nessas condiccedilotildees foram obtidos menores teores de lipiacutedios A fonte de
nitrogecircnio influenciou apenas no teor de clorofila obtendo maiores valores utilizando
nitrato como fonte de nitrogecircnio A fonte de CO2 natildeo influenciou na composiccedilatildeo da
biomassa Nenhuma das variaacuteveis independentes estudadas influenciou nos teores
de cinzas e carboidratos na biomassa final
Os resultados tambeacutem indicaram que todas as variaacuteveis independentes tiveram
uma certa influecircncia nos paracircmetros de bioenergeacutetica A dissipaccedilatildeo de energia de
Gibbs aumento com o tempo em todas as condiccedilotildees analisadas obtendo os maiores
valores em tempos mais curtos nos cultivos a 120-240 μmol de foacutetons m-2 s-1
independentemente da fonte de nitrogecircnio selecionado O nuacutemero de moles de
foacutetons absorvidos pelas ceacutelulas para produzir um C-mol de biomassa foi maior nas
culturas com nitrato independentemente da intensidade luminosa Os maiores
valores de produccedilatildeo molar de O2 e do consumo de H+ foram obtidos com os valores
mais elevados de intensidade luminosa utilizando nitrato As fraccedilotildees da energia
direcionada para a siacutentese de ATP fixada pela ceacutelula foram superiores em culturas
com ureacuteia quando comparadas com as culturas com nitrato que se revelou uma
fonte de nitrogecircnio capaz de sustentar o crescimento energicamente da A platensis
155
As diferentes configuraccedilotildees dos fotobiorreatores tubulares natildeo influenciaram
nas concentraccedilotildees celulares indicando que o formato do tubo que forma o
fotobiorreator seja horizontal ou espiralado natildeo interferem no crescimento da A
platensis
Com isso pode-se concluir que a intensidade luminosa eacute uma importante
variaacutevel que influencia nos paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima produtividade
celular fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas bioenergeacuteticos e na
composiccedilatildeo quiacutemica da A platensis e que o emprego do CO2 proveniente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica juntamente com a ureacuteia como fonte de nitrogecircnio pode ser
uma alternativa viaacutevel para o cultivo de A platensis em escala industrial
proporcionando uma reduccedilatildeo no custo de produccedilatildeo
156
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178
ANEXOS
Artigos publicados submetidos e em fase de redaccedilatildeo para perioacutedicos internacionais
ANEXO 1 - BEZERRA RP MONTOYA EYO SATO S PEREGO P
CARVALHO JCM CONVERTI A Effects of light intensity and dilution rate on the
semicontinuous cultivation of Arthrospira (Spirulina) platensis A kinetic Monod-type
approach Bioresource Technology 102 p3215 - 3219 2011
ANEXO 2 - BEZERRA RP MATSUDO MC SATO S CONVERTI A
CARVALHO JCM Effects of photobioreactor configuration nitrogen source and
light intensity on the fed-batch cultivation of Arthrospira (Spirulina) platensis
Bioenergetic aspects Biomass and Bioenergy
ANEXO 3 - BEZERRA RP MATSUDO MC SATO S CONVERTI A
CARVALHO JCM Carbon dioxide from alcoholic fermentation as a carbon source
for the fed-batch cultivation of Arthrospira platensis Biomass and Bioenergy
BEZERRA RP MATSUDO MC SATO S CONVERTI A CARVALHO JCM
Chemical composition of the A platensis biomass cultivated on CO2 from alcoholic
fermentation Em fase de Redaccedilatildeo
179
ANEXOS
180
Anexo 1
181
182
183
184
185
Anexo 2
Effects of photobioreactor configuration nitrogen source and light intensity
on the fed-batch cultivation of Arthrospira (Spirulina) platensis
Bioenergetic aspects
Raquel Pedrosa Bezerraab
Marcelo Chuei Matsudoa Sunao Sato
a Patrizia Perego
b Attilio
Convertibc
Joatildeo Carlos Monteiro de Carvalhoa
a Department of Biochemical and Pharmaceutical Technology Faculty of Pharmaceutical
Sciences University of Satildeo Paulo Av Prof Lineu Prestes 580 Bl 16 05508-900 Satildeo Paulo-
SP Brazil
b Department of Chemical and Process Engineering ldquoGB Boninordquo University of Genoa via
Opera Pia 15 16145 Genoa Italy
c CAPES Fellowship holder Brazil
_________
Author for correspondence phone +55-11-30913695 fax +55-11-38156386
E-mail jcmdcarvuspbr
186
ABSTRACT
The bioenergetics of the photoautotrophic growth of the cyanobacterium Arthrospira
(Spirulina) platensis was investigated in different bioreactor configurations (tubular
photobioreactor and open ponds) using different nitrogen sources (nitrate and urea) and under
different light intensity conditions Although an increase in the light intensity increased the
Gibbs energy dissipated for cell growth and maintenance in both nitrogen sources it did not
exert any appreciable influence on the moles of photons absorbed by the system to produce
one C-mol biomass On the other hand both bioenergetic parameters were higher in cultures
with nitrate than with urea likely because of the higher energy requirements needed to reduce
the former nitrogen source to ammonia They appreciably increased also when open ponds
were substituted by the tubular photobioreactor where a more efficient light distribution
ensured a remarkably higher cell mass concentration The estimated percentages of the energy
absorbed by the cell showed that compared with nitrate the use of urea as nitrogen source
allowed the system to address higher energy fractions to ATP production and light fixation by
the photosynthetic apparatus as well as a lower fraction released as heat Thanks to this better
bioenergetic situation urea appears to be a quite promising low-cost alternative nitrogen
source for A platensis cultures in photobioreactors
Keywords Arthrospira (Spirulina) platensis bioenergetics nitrogen source light intensity
bioreactor configuration
187
1 Introduction
The production of the cyanobacterium Arthrospira platensis is increasing due to its high
content of highly-valuable proteins fundamental amino acids vitamins β-carotene and other
pigments mineral substances essential fatty acids and polysaccharides which find
application in several industrial productions like those of health foods and therapeutics [1]
Environmental factors such as light intensity and nitrogen source are well known to
influence the growth of photosynthetic microorganism In the absence of any other limiting
factor cell concentration increases with light intensity until reaching maximum biomass
concentration that is denominated ldquosaturation levelrdquo Light intensities higher than the
saturation level provoke damage of cell photosynthetic apparatus due to a phenomenon called
ldquophotooxidationrdquo or ldquophotoinhibitionrdquo
The nitrogen source is an additional environmental factor influencing cell growth
because this element is mainly used to form proteins and nucleic acids Alternative sources of
nitrogen such as urea [23] and ammonium salts [4] have been investigated in substitution of
nitrate to reduce the cost of large-scale A platensis cultivation
Also the reactor configuration can impact on cell growth Appropriately-designed
photobioreactors can in fact reduce the cultivation area by a vertical distribution of the
photosynthetic organism and enlarge the surface exposed to light thus increasing cell
concentration Tubular reactors allow for better light distribution and then higher
photosynthetic efficiency with respect to the conventional mini-ponds [56] where the cells
are subject to full light radiation at the surface and darkness at the bottom [7]
Only a few studies emphasized the bioenergetic aspects of the growth of
photosynthetic microorganisms based on Gibbs energy balances The Gibbs energy
dissipation per C-mol of biomass can be regarded as a simple thermodynamic measure of the
amount of biochemical work required to convert the carbon source into biomass by the
proper irreversible carbon-carbon coupling and oxidationreduction reactions [8] Up to now
188
the bioenergetics of the cyanobacterium A platensis were uninvestigated either in bench-scale
open ponds using urea and KNO3 as nitrogen sources [910] or in rectangular vessel under
different light intensities [11] To shed further light on these aspects in this study we
investigated the bioenergetics of this cyanobacterium when cultivated in tubular
photobioreactor under different light intensities and using different nitrogen sources and
compared these results with those previously obtained in open ponds [9]
2 Material and methods
21 Photobioreactors and culture conditions
Arthrospira (Spirulina) platensis UTEX 1926 was cultivated either in open ponds [9] on the
medium of Paoletti et al [12] or in tubular photobioreactor [13] on the medium of Schloumlsser
[14] both containing nitrate as nitrogen source The initial cell concentration and pH were set
at 400 mg l-1
[15] and 95 [1617] respectively
Open ponds cultivations were carried out elsewhere in the same medium of Paoletti et
al [12] at photosynthetic photon flux density (PPFD) of 72 μmol photons mndash2
sndash1
25 ordmC [9]
On the other hand for tubular photobioreactor cultivations we used the medium of Schloumlsser
[14] as well as medium in which NaNO3 was substituted by urea These runs were carried out
at 60 le PPFD le 240 μmol photons mndash2
sndash1
29 ordmC and the pH was controlled at 95 plusmn 02 by
pure CO2 addition Since the operating conditions at the lowest PPFD values were very
similar any difference in the kinetics and bioenergetics was ascribed to the different
bioreactor configurations The amount of urea to be daily added was estimated by an equation
describing the experimental growth curve obtained under non-limited conditions with NaNO3
as nitrogen source as previously described [13] Under these conditions the bioenergetics of
the system was investigated comparing the different nitrogen sources
189
22 Analytical determinations
The cell concentration of A platensis was determined by measuring the optical density of
cultures at 560 nm using a spectrophotometer model 600 PLUS (FEMTO Satildeo Paulo Brazil)
The optical density data were converted to cell dry weight by a calibration curve The
elemental composition of biomass obtained at the end of each run was determined by an
elemental analyzer Flash EA1112 series (CE Instruments Wigan UK)
Light intensity at the culture surface was measured using a quantum sensor model LI-
190 SB (Li-Cor Inc Lincoln NE USA) connected to a quantumradiometerphotometer
model LI-189 B
23 Theory
The Gibbs energy dissipation for cell growth and maintenance (1YGX) was estimated
according to Heijnen [18] by the equation (1)
G
GXGX
m
YY
max
11
(1)
in which max
GXY is the maximum biomass yield on Gibbs energy that corresponds to 986 C-
molX kJ-1
in photoautotrophic cultivation with CO2 as a carbon source [18]
In this equation the specific growth rate μ was defined according to Leduy and Zajic
[19] as
190
1
ln1
i
i
X
X
t
(2)
where Xi and Xi-1 are the biomass concentrations at the end and the beginning of the time
interval elapsing between two consecutive measurements (Δt = 1 day) while mG is the
biomass specific rate of Gibbs energy dissipation for maintenance corresponding to 45 and
712 kJ C-molX-1
h-1
at 25 and 29 degC respectively [18]
To estimate the moles of photons (Einsteins) to sustain the autotrophic growth nPh it
was necessary to resort to the Gibbs energy balance taking into account the energy
contributions for the growth 1YGX and the absorption of 1 Einstein of photons ΔgPh in
addition to those of formation of substrates and products Δgfi as described by the equation
ΔgfHCO3- +ΔgfN + ΔgfH2O + ΔgfO2
+ ΔgfH+ + ΔgfX + 1YGX + nPh ΔgPh = 0
(3)
The value of ΔgPh = 2062 kJ mol-1
was estimated through the equation
A
Ph
hcNg
(4)
being h = 6626 10
-34 J the Planck constant c = 299
10
8 m s
-1 the light velocity NA = 6022
10
23 photons Einstein
-1 the Avogadro number and λ = 580 nm the wavelength of absorbed
photons [9]
191
According to Torre et al [9] 2 photons at 580 nm are absorbed by the second
photosystem (PSII) and used to transfer 2 electrons to the first one (PSI) releasing two
photons with less energy Therefore knowing nPh we estimated the total molar Gibbs energy
absorbed by the photosynthesis (-ΔGa)
ΔGa = nPh ΔgPh
(5)
According to Torre et al [9] the molar O2 production (qO2) and H
+ consumption
(qH+) were calculated by multiplying their respective stoichiometric coefficients by the cell
concentration expressed in C-mol l-1
using the experimental biomass elemental composition
-ΔGa was assumed to be the sum of the energy fixed by the system to increase its own
enthalpic content (ΔH) that transformed into ATP and used for the growth and maintenance
(ΔGATP) and the released heat (Q)
ΔGa + ΔGATP + ΔH + Q = 0
(6)
where ΔGATP and ΔH were calculated from nPh the Gibbs energy associated to 1 ATP mol
and the average potential variation between PSI and PSII [9]
3 Results and discussion
Fig 1 shows the growth curves of A platensis using nitrate (A) or urea (B) as nitrogen
sources in open ponds [910] or in tubular photobioreactor at different PPFD values A
192
progressive increase in PPFD up to 240 μmol photons m-2
s-1
favored the growth of this
cyanobacterium and a maximum cell concentration of about 3500 mg l-1
was obtained almost
irrespectively of the nitrogen source These results suggest that the light intensity was the
factor limiting the growth under the selected conditions while ongoing experiments (results
not shown) point out that photosaturation takes place at PPFD ge 240 μmol photons m-2
s-1
Such a maximum PPFD threshold is higher than those reported for Erlenmeyer flasks (100-
150 μmol photons m-2
s-1
) [21] rectangular photobioreactor (138 - 229 μmol photons mndash2
sndash1
)
[22] and long open ponds (156 μmol photons mndash2
sndash1
) [23] Moreover even at PPFD of only
60 μmol photons m-2
s-1
(Fig 1) the final cell concentration was more than twice that
previously obtained in open pond under similar experimental conditions (25 degC 72 μmol
photons m-2
s-1
) [10] which suggests a better light distribution in the tubular photobioreactor
Fig 2 illustrates the behavior of Gibbs energy dissipation for cell growth and
maintenance 1YGX versus the time As a general rule this bioenergetic parameter increased
with the time under all the tested conditions as a result of the increasing biomass level that
was responsible for a decrease in the specific growth rate An increase in PPFD up to 120
μmol photons m-2
s-1
favored cell growth because of photolimitation therefore the energy
requirements mainly for maintenance remarkably increased On the contrary none (urea) or
very little (nitrate) increase in 1YGX took place in the PPFD range of 120-240 μmol photons
m-2
s-1
because of the achievement of light saturation conditions This behavior is also
consistent with lower 1YGX values previously observed in open ponds [9] where the well-
known shadowing effect [24] hindered the growth
The photoautotrophic growth can be represented by an overall mass balance equation
where the nitrogen (NO3- or NH4
+) and carbon (HCO3
-) sources H2O O2 SO4
-2 and H
+ are
involved in the formation of 1 C-mol biomass
193
a HCO3- + b NO3
- (or NH4
+) + c H2O + d O2 + e H
+ + f SO4
-2 + CH1650O0531N0170S00007 = 0
(7)
To this purpose we used either the elemental composition of biomass reported by
Cornet et al [25] utilized here as an example or those experimentally determined as
described in Material and methods
To make these redox reactions between electron acceptor and donor possible the
Gibbs energy is used by the cell to enable the construction of the complex biomass molecules
from the inorganic carbon source The respective stoichiometric coefficients estimated
through material balances of carbon nitrogen oxygen sulfur charge and reduction degree are
listed in Table 1 It should be noticed that the reduction degree of biomass (γX) calculated
from biomass composition experimentally determined in this work was always appreciably
higher with nitrate (489-519) than with urea (399-432) as expected by the higher oxidation
number of the former compound [18] In addition both this parameter and the nitrogen
stoichiometric coefficient were appreciably lower when using the elemental composition
experimentally determined in this work (Table 1) because the nitrogen content of biomass
under the selected conditions was always lower than that reported by Cornet et al [25]
The moles of photons (Einsteins) to sustain the autotrophic growth of 1 C-mol
biomass (nPh) were calculated by Eq (3) Although the actual Δgfi values should have been
used for this calculation Torre et al [9] demonstrated that the Gibbs energy of formation
under the actual variable conditions of a cultivation does not differ at all or differs by no more
than 3 from that estimated under standard biological conditions On the contrary ΔgfH+ is
by definition a function of the pH So this parameter was recalculated for the actual
conditions by the well-known equation of Gibbs
194
7
pH
ff10
10ln
HH
RTgg
(8)
As shown in Fig 3 the progressive decrease in the specific growth rate throughout the
cultivations brought about a corresponding increase (in absolute value) in the Einsteins
absorbed to produce one C-mol biomass (nPh) As expected at the highest growth rates this
parameter approached theoretical values very close to that reported by Richmond [26] to
sustain growth under ideal conditions (only 8 effective Einsteins C-molDM-1
)
During the light reactions of photosynthesis the free energy carried by photons is in
fact captured by pigments (ex chlorophyll) held in large protein complexes called ldquoreaction
centersrdquo When a special chlorophyll molecule of PSII absorbs the energy of a photon (hν) an
electron gains higher energy level Because this state of an electron is very unstable it is
transferred from one to another molecule creating a chain of redox reactions referred to as
Electron Transport Chain (ETC) The electron flow goes from PSII to cytochrome b6f of PSI
where the electron gets the energy from another photon The final electron acceptor is
NADP+ which produces NADPH A minimum of 8 photons is then required to transfer 4
electrons from 2 H2O molecules to produce 2 NAPDH molecules according to the equation
2 H2O + 8 hν +2 NADP+ rarr 2 NADPH + O2 + 2 H
+
(9)
Subsequently the electrons are transferred from NAPDH to CO2 through the Calvin cycle to
produce biomass constituents [27]
As already observed in previous work [9] the additional energy requirement with
respect to the ideal situation of 8 effective Einsteins C-molDM-1
is negligible at the beginning
195
of cultivations (high specific growth rates) and then considerably increases during the
stationary phase This suggests that under conditions likely limited by shadowing biomass
uses energy preferentially for maintenance rather than for growth Although the behavior of
nPh was qualitatively similar for cultivations performed in open ponds and in tubular
photobioreactor (Fig 3) the excess light requirements in the latter configuration were
certainly due to the higher levels of biomass ensured by more effective distribution As
expected a progressive increase in the light intensity did not exert any appreciable influence
on this nPh (Einstein C-molDM-1
)
In addition the cultures with nitrate needed highest nPh values to sustain the
autotrophic growth compared to those with urea even though the cell concentration was
similar at all the PPFD values (Fig 1) Thus the additional photon requirement was likely
utilized to reduce nitrate to ammonia [28] which is the preferential nitrogen form assimilated
by A platensis [29] This effect was also observed by Torre et al [9] in open ponds It should
also be noticed that the use in the above bioenergetic model of the coefficients reported by
Cornet et al [25] for A platensis biomass composition (CH1650O0531N0170S00007) led to
results practically coincident to those obtained using the experimental ones determined in this
work (Fig 3) This observation demonstrates that biomass composition has a negligible
impact on the predictions by the model and then it could be used as a general tool to elaborate
data from the literature without any determination of biomass composition
Fig 4 shows the time behaviors of molar development of O2 and consumption of H+
during the cultivations performed either in open pond or in the tubular photobioreactor at
variable PPFD These trends clearly demonstrate that both activities faithfully followed cell
growth being biomass the final product of the photosynthetic metabolism and were lower in
the open pond compared with the tubular photobioreactor consistently with the better light
distribution in the latter reactor configuration Moreover their progressive increase with
PPFD confirms that the light intensity was the factor actually limiting the growth and that the
196
system never reached photoinhibition conditions This behavior was qualitatively similar in
the cultures using nitrate as nitrogen source (data not shown) As expected by the above-
mentioned need of reducing nitrate to ammonia as an obligatory intermediate to utilize any
nitrogen source [30] both parameters were higher using nitrate than urea
As is well known the energy from flow of electrons between PSII and NADPH drives
protons across the plasma membrane creating a proton-motive force that provides the energy
for ATP synthesis by ATP synthase [31] Therefore it was assumed that a portion of molar
Gibbs energy absorbed by the two photosystems was used to convert ADP to ATP As shown
in Fig 5 the highest -ΔGa and ΔGATP values were obtained at end of cultivation due to
unfavorable environmental conditions such as the lack of nutrients or release of cell
metabolites As far as the influence of light intensity is concerned the highest energy
requirements were observed for cultures performed at PPFD up to 120 μmol photons m-2
s-1
which ensured the highest cell concentration (Fig 1) As previously mentioned the -ΔGa and
ΔGATP values did not increase (urea) or increased very little (nitrate) in the PPFD range of 120
ndash 240 μmol photons m-2
s-1
because of light saturation conditions A qualitatively similar
behavior was observed for cultures using nitrate in tubular photobioreactor (results not
shown) Moreover at the lowest PPFD values both parameters showed similar behaviors in
open pond and in tubular photobioreactor which means that the reactor configuration had
negligible influence on them
Fig 6 shows the results of the energy fixed by photosynthesis (-ΔH) and that released
as heat (Q) under different conditions of light intensity nitrogen source and reactor
configuration It can be seen that at the end of cultivations both parameters increased with
light intensity Almost coincident results were also obtained using nitrate as nitrogen source
(results not shown) As is well known under excess light conditions part of the absorbed
energy is thermally dissipated via a mechanism called Non-Photochemical Quenching (NPQ)
[32] and a significant quantity of free energy is lost as heat during the biochemical reactions
197
between light absorption and carbohydrate formation [33] Such a result has been ascribed to
a certain physiological mechanism to protect the photosynthetic apparatus against
photodestruction [3435] where a fundamental role is played by the antenna complexes of
photosynthetic apparatus which would switch from a light harvesting form to an efficient
thermal dissipation form [32]
As expected by the fact that both the ATP synthesis and the formation of NADPH
implied in the biosynthetic pathways are resulting from the activity of the same
photosynthetic apparatus [33] the ΔH behavior was quite similar to that observed for ΔGATP
Fig 7 shows the percentage distribution of the light energy absorbed versus time at the
lowest PPFD chosen as an example but qualitatively similar results were observed at higher
PPFD values As expected by the additional energy requirements of nitrate-to-ammonia
reduction cultures with urea compared with those with nitrate exhibited higher energy
fractions stored as ATP (ηATP) and fixed by the system to increase its enthalpic content (ηF)
and lower fraction released as heat (ηQ) Moreover in all the experiments both ηATP and ηF
decreased along the time whereas ηQ increased
The highest ηATP and ηF values were around 12 and 23ndash27 in cultures with nitrate
and 15 and 31ndash34 in those with urea respectively In cultures performed at the highest
PPFD values (120 and 240 μmol photons mndash2
sndash1
) ηF decreased more sharply than at the
lowest ones (results not shown) because of the highest cell concentrations (Fig 1) that
reduced the light availability to the cell (shading effect) The nutrient availability is another
important environmental factor influencing the composition of cyanobacterial photosynthetic
apparatus Murakami et al [36] have shown that the responses to CO2 Na+
and light stresses
in Synechocystis sp cause alterations in the redox state of intersystem electron transport
components Likewise the decrease in the availability of some nutrient at the end of our A
platensis cultivations may have contributed to lower ηF As expected ηQ showed an opposite
behavior progressively increasing from minimum values at the beginning of cultures (60-
198
66 with nitrate and 49-54 with urea) to around 90 at the end This means that at the end
of any cultivation most of the energy absorbed is released as heat
Similar behaviors were observed using either open ponds with nitrate or the tubular
photobioreactor with both nitrogen sources which means that the energy distribution was not
appreciably influenced by the reactor configuration
4 Conclusions
The results of the current study indicate that the bioenergetic parameters of the blue-green
cyanobacterium Arthrospira (Spirulina) platensis were influenced by bioreactor
configuration nitrogen source and photosynthetic photon flux density (PPFD) In particular
the highest values of the Gibbs energy dissipation for cell growth and maintenance were
obtained at 120-240 μmol photons m-2
s-1
irrespective of the selected nitrogen source while
the number of photons moles absorbed by the cell to produce one C-mol biomass was higher
in the cultures with nitrate irrespective of light intensity The highest values of the molar
production of O2 and consumption of H+ were obtained at the highest PPFD values using
nitrate as a nitrogen source and the tubular photobioreactor Contrarily the bioreactor
configuration did not exert any appreciable influence on the fractions of the absorbed energy
addressed to the synthesis of ATP fixed by the cell and released as heat The first two
fractions were higher in cultures performed with urea which proved a nitrogen source able to
energetically sustain A platensis growth
Acknowledgements
The authors grateful acknowledge the financial support of the Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
Pesquisa do Estado de Satildeo Paulo (FAPESP) Satildeo Paulo Brazil (process no 0654959-3 and
199
0656976-2) of the Coordenaccedilatildeo de Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES)
Brazil (process no 397808-7 and Prof A Converti Fellowship no 0350-112010) of the
Italian Ministry of Education University and Research (MIUR) (PRIN ProtN 200744HMBN
and FIRB Prot N RBIP06993E) and of the Vigoni Program (Deutsch-Italienisches
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204
Caption of Figures
Fig 1 Growth of A platensis using nitrate (A) and urea (B) as nitrogen sources at different
PPFD values (μmol photons m-2
s-1
) Tubular photobioreactor () 60 ( ) 120 and () 240
Open ponds [10] 72 ()
Fig 2 Dependence of Gibbs energy dissipation for A platensis growth and maintenance
(1YGX) on PPFD (μmol photons m-2
s-1
) Tubular photobioreactor () 60 ( ) 120
() 240 Open ponds [10] 72 () Nitrogen source nitrate (open symbols or ) urea
(full symbols)
Fig 3 Influence of A platensis specific growth rate (μ) on the moles of photons absorbed to
produce one C-mol biomass (nPh) under different culture conditions Tubular photobioreactor
() elemental biomass composition reported by Cornet et al [25] PPFD = 60 μmol photons
m-2
s-1
elemental biomass composition experimentally determined in this work PPFD (μmol
photons m-2
s-1
) () 60 () 120 () 240 () Open ponds [10] elemental
biomass composition reported by Cornet et al [25] PPFD = 72 μmol photons m-2
s-1
Nitrogen source nitrate (open symbols or ) urea (full symbols)
Fig 4 Time behaviors of molar development of O2 (full symbols) and consumption of H+
(open symbols) under different culture conditions Tubular photobioreactor PPFD (μmol
photons m-2
s-1
) () 60 () 120 () 240 Open ponds [10] PPFD = 72 μmol
photons m-2
s-1
() Nitrogen source nitrate (dashed line) urea (continuous lines)
Fig 5 Total Gibbs energy absorbed by the photosynthetic apparatus (full symbols) (-ΔGa)
and energy transformed into ATP (open symbols) (ΔGATP) during A platensis cultivations
205
Tubular photobioreactor with urea PPFD (μmol photons m-2
s-1
) () 60 ( ) 120
() 240 Open ponds with nitrate [10] PPFD = 72 μmol photons m-2
s-1
()
Fig 6 Energy fixed by the photosynthetic apparatus (full symbols) (-ΔH) and energy released
as heat (open symbols) (Q) during A platensis cultivations Tubular photobioreactor with
urea PPFD (μmol photons m-2
s-1
) () 60 ( ) 120 () 240 Open ponds with
nitrate [10] PPFD = 72 μmol photons m-2
s-1
()
Fig 7 Percentage distribution of the light energy absorbed during A platensis cultivations
using nitrate (full symbols) and urea (open symbols) as nitrogen sources Tubular
photobioreactor PPFD = 60 μmol photons photons mndash2
sndash1
(continuous lines) Open ponds
[10] PPFD = 72 μmol photons m-2
s-1
(dashed lines) Energy fixed by the photosynthesis
() energy transformed into ATP () energy released as heat ( )
206
Figure 1
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
Bio
ma
ss c
on
cen
tra
tio
n (
mg
l-1
)
Time (d)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
Bio
ma
ss c
on
cen
tra
tio
n (
mg
l-1
)
Time (d)
A
B
207
Figure 2
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
0 2 4 6 8 10 12
1Y
GX (
kJ
C-m
ol
DM
-1)
Time (d)
208
Figure 3
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
000 010 020 030 040 050 060 070 080
nP
h (
Ein
stei
n C
-mo
l D
M-1
)
(d -1)
209
-015
-010
-005
000
005
010
015
020
0 2 4 6 8 10 12
q (
mol
l-1)
Time (d)
210
Figure 4
Figure 5
-9000
-8000
-7000
-6000
-5000
-4000
-3000
-2000
-1000
0
1000
0 2 4 6 8 10 12
G
a
GA
TP (
kJ
C-m
ol
DM
-1)
Time (d)
211
Figure 6
-2000
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
0 2 4 6 8 10 12-H
Q
(k
J C
-mol
DM
-1)
Time (d)
212
Figure 7
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2 4 6 8 10 12
h(
)
Time (d)
213
Table 1 Stoichiometric coefficients estimated through material balances of carbon nitrogen
oxygen sulfur charge and reduction degree for biomass cultivated either in open ponds or in
tubular photobioreactor using nitrate or urea as nitrogen sources
HCO3- NO3
- NH4
+ a H2O O2 H
+ SO4
-2 Biomass
Δgf‟i
(kJ mol-1
)
-5872 -1114 -794 -2373 0 -399 -7446 -670
Stoichiometric coefficients (mol C-molDM-1
)
Run
PPFD
(μmol photons
m-2
s-1
)
a b b c d e f γX b
1 c 72 -1 -020 - 020 145 -120 - 580
2 d 60 -1 -020 - 020 145 -120 - 580
2 e 60 -1 -011 - 032 130 -111 000 519
3 e 60 -1 - -007 024 100 -093 000 399
4 e 120 -1 -011 - 023 122 -111 000 489
5 e 120 -1 - -008 042 103 -092 000 411
6 e 240 -1 -010 - 023 127 -110 000 509
7 e 240 -1 - -008 034 108 -092 000 432
a NH4
+ is the result of urea hydrolysis
b Reduction degree of biomass
c Minipond considering the elemental biomass composition reported by Cornet et al [25]
d Tubular photobioreactor considering the elemental biomass composition reported by Cornet et al
[25]
e Tubular photobioreactor elemental biomass composition experimentally determined
214
Anexo 3
Carbon dioxide from alcoholic fermentation as a carbon source for the
fed-batch cultivation of Arthrospira platensis
Raquel Pedrosa Bezerraab
Marcelo Chuei Matsudoa Sunao Sato
a Attilio Converti
bc Joatildeo
Carlos Monteiro de Carvalhoa
a Department of Biochemical and Pharmaceutical Technology Faculty of Pharmaceutical
Sciences University of Satildeo Paulo Av Prof Lineu Prestes 580 Bl 16 05508-900 Satildeo
Paulo-SP Brazil
b Department of Chemical and Process Engineering ldquoGB Boninordquo University of Genoa via
Opera Pia 15 16145 Genoa Italy
c CAPES Fellowship holder Brazil
_________
Author for correspondence phone +55-11-30913695 fax +55-11-38156386
E-mail jcmdcarvuspbr
215
Abstract
It was evaluated the Arthrospira platensis cultivation using CO2 from alcoholic fermentation
and either urea or nitrate as nitrogen source at different light intensities (60 le I le 240 μmol
photons m-2
s-1
) Whereas the CO2 source (pure CO2 or from alcoholic fermentation) did not
influence the maximum cell concentration (Xm) cell productivity (PX) and nitrogen-to-cell
conversion factor (YXN) the use of urea instead of nitrate led to higher YXN values Xm and PX
increased when I was increased from 60 to 120-240 μmol photons m-2
s-1
Using CO2 from
alcoholic fermentation the best performance (Xm = 2952 plusmn 35 mg L-1
PX = 425 plusmn 59 mg L-1
d-1
and YXN = 15 plusmn 020 mg mg-1
) was obtained at I = 120 μmol photons m-2
s-1
with urea The
results obtained in this work demonstrate that urea and CO2 from alcoholic fermentation could
be simultaneously used in large-scale cultivations to reduce the environmental impact
associated to the release of this greenhouse gas as well as the production cost of
cyanobacteria
Keywords
Arthrospira (Spirulina) platensis CO2 alcoholic fermentation fed-batch cultivation urea
light intensity
1 Introduction
Renewable energy sources such as ethanol have been seen as a promising alternative
to fossil fuel consumption providing environmental benefits by reduction in greenhouse gas
emissions and the national security benefits by less dependency on volatile crude oil imports
(Tyner and Taheripour 2007) Brazil is the worldrsquos largest exporter of bioethanol and second-
largest producer after the United States (Balat and Balat 2009) Considering the increasing
demand for this fuel and the fact that alcoholic fermentation is responsible for a CO2 release
216
on weight basis almost coincident with ethanol production it would be of great concern
developing a process for CO2 fixation able to turn it into a useful product Photosynthetic
microorganisms can fix CO2 efficiently from different sources including the atmosphere
industrial exhaust gases and soluble carbonate salts (Wang et al 2008) Moreover CO2
biofixation by microalgae leads to higher yield of biomass per hectare in comparison with
terrestrial plants (Packer 2009) It has been shown that the cost of CO2 in large-scale algal
cultures is of primary importance to the total economics (Tapie and Bernard 1988) Since 45ndash
50 of the dry algal mass is made up of carbon (Cornet et al 1992) 165ndash 183 g CO2 would
theoretically be needed for the biosynthesis of 1 g (DW) of algal biomass Thus CO2
biofixation by microalgae has the potential not only to offset carbon emissions but also to
reduce the costs of culture media on an industrial scale (Hughes and Benemann 1997)
Combination of CO2 fixation and production of biomass containing high-value bioactive
products may provide a very promising alternative to current CO2 mitigation strategies
Nowadays there are numerous commercial applications of A platensis such as the
enhancement of the nutritional value of foods and animal feed feed in aquaculture
bioremediation use in cosmetics and others applications (Spolaore et al 2006) Besides the
CO2 source the nitrogen source is an additional important factor in the cultivation of
photosynthetic microorganisms since this element is used mainly to provide proteins and
nucleic acids which are essential for cell maintenance and growth (Watanabe and Hall
1996) Salts of nitrate are largely used as nitrogen source for A platensis culture but urea
(Danesi et al 2004) and ammonium salts (Bezerra et al 2008) have recently been proposed
as alternative cheap nitrogen sources
Compared to open ponds appropriately designed closed photobioreactors are able to
minimize the loss of ammonia nitrogen sources by off gassing reducing the amount of this
nutrient necessary in a large-scale process Additionally these reactors can reduce the
217
cultivation area by distributing the photosynthetic organisms vertically and increase the CO2
residence time thereby improving its utilization efficiency (Ono and Cuello 2004)
The aim of this study was to check if the combined use of CO2 released from alcoholic
fermentation and urea in tubular photobioreactor could be a feasible and cheap alternative
way to cultivate A platensis For this purpose fed-batch cultivations were carried out at
variable light intensity using two different sources either of nitrogen (sodium nitrate or urea)
or of carbon (pure CO2 from cylinder or gaseous emissions from alcoholic fermentation) the
latter to simultaneously control the pH and maintain the desired carbon level The results
obtained were finally compared by means of analysis of variance to identify the statistically
significant effects of the above independent variables (light intensity nitrogen source and
carbon source) on the selected responses namely the maximum cell concentration cell
productivity and nitrogen-to-cell conversion factor
2 Materials and methods
21 Microorganism and culture medium
Arthrospira (Spirulina) platensis UTEX 1926 was maintained in the culture medium
of Schloumlsser (1982) having the following composition (per liter) 136 g NaHCO3 403 g
Na2CO3 050 g K2HPO4 250 g NaNO3 100 g K2SO4 100 g NaCl 020 g MgSO4middot7H2O
004 g CaCl2middot2H2O All the nutrients were dissolved in distilled water containing (per liter)
60 mL of metal solution (970 mg FeCl3middot6H2O 410 mg MnCl2middot4H2O 50 mg ZnCl2 20 mg
CoCl2middot6H2O 40 mg Na2MoO4middot2H2O) 10 mL of micronutrient solution (500 mg Na2EDTA
618 mg H3BO3 196 mg CuSO4middot5H2O 440 mg ZnSO4middot7H2O 200 mg CoCl2middot6H2O 126 mg
MnCl2middot4 H2O 126 mg Na2MoO4 middot2H2O) and 10 mL15 g Lminus1
B12 vitamin solution
Fed-batch runs were carried out either using the above medium containing NaNO3 as
the nitrogen source or after substituting in it NaNO3 with urea
218
22 Cultivation
The bench-scale tubular photobioreactor (Fig 1) utilized in this study was developed
at the Fermentation Technology Laboratory of the Department of Biochemical and
Pharmaceutical Technology of Satildeo Paulo University (Ferreira et al 2010) It was made up of
transparent glass tubes (10 m length 10 cm internal diameter 05 cm wall thickness) with
inclination of 2 (115ordm) to make the fluid flow easier PVC tubes were used to connect the
glass tubes The reactor was illuminated by 20 W fluorescent lamps Ambient air was injected
at the bottom of the tubes to drive the liquid from the bottom to the top of the reactor A
degassing bottle provided with magnetic stirrer ensured efficient medium homogeneity The
total and illuminated volumes of the reactor were 350 and 212 L respectively
Cultivations were carried out with initial biomass concentration of 400 mg Lminus1
(Ferreira et al 2010) in tubular photobioreactor (PBR) and temperature of 29 ordmC The pH was
set and maintained at 95 plusmn 02 (Saacutenchez-Luna et al 2007) by addition of pure CO2 from
cylinder or CO2 from continuous alcoholic fermentation under steady-state conditions using a
pH controller (Mettler Toledo Barueri SP Brazil) coupled to a solenoid valve In
experiments with NaNO3 nitrate concentration was maintained above 1 g L-1
(Faintuch
1989) to avoid growth limitation by this nutrient When urea was used as nitrogen source its
amount to be daily added was estimated as suggested by Ferreira et al (2010) Briefly from
the curve of cell concentration versus time of each standard run with nitrate (Fig 2) we
obtained an interpolated curve described by a third order-polynomial equation By derivation
of this equation it was possible to obtain the second order equation of cell productivity and
from that the equation expressing the amount of urea to be daily added to sustain the expected
cell growth taking into account that the dry mass of A platensis contains about 7 of
nitrogen (Bezerra et al 2008) The light intensity expressed as photosynthetic photon flux
density (PPFD) was varied in the range of 60-240 μmol photons mndash2
sndash1
Table 1 show the
219
different conditions adopted in this work for cultivations All experiments were carried out in
duplicate
221 CO2 sources
Pure CO2 of analytical grade (999) was obtained from a cylinder (Oxylumen Satildeo
Paulo SP Brazil)
CO2 from alcoholic fermentation was produced continuously by Saccharomyces
cerevisiae CCT7150 (Fundaccedilatildeo Tropical Andreacute Tosello Culture Collection Campinas SP
Brazil) cultivated in a glass bioreactor (Infors-HT Bottmingen Switzerland) containing 10 L
of diluted sugarcane blackstrap molasses at temperature of 30 plusmn 1 ordmC (Kock et al 2000)
impeller speed of 500 rpm and dilution rate of 0025 h-1
Sugar concentration in the feed
expressed as total reducing sugars (TRS) was 170 g L-1
(Guerreiro et al 1997) Urea (05 g
L-1
) was added to the mash After adjustment of pH at 45-50 by addition of H2SO4 it was
controlled at 45 plusmn 01 (Jones et al 1981) by addition of 15 N NaOH solution Penicillin (500
ui L-1
) was added to prevent contamination (Carvalho et al 2003) Continuous feeding was
started after 12 h of batch fermentation
23 Analytical techniques
231 A platensis cultivation
Cell concentration was determined by optical density (OD) measurements at 560 nm
using a calibration curve (Leduy and Therien 1977) The liquid phase of the medium was
used to determinate the concentrations of total carbonate (Pierce and Haenisch 1948) nitrate
(Vogel 2002) and volatile organic compounds (Joslyn 1970) The concentration of total
ammonia was determined immediately before the daily addition of urea on cell-free medium
samples using a potentiometer and selective ammonia ion electrode model 95-12 (Orion
Cambridge MA USA) (Leduy and Samson 1982) The residual urea level was determined
220
by the same way after previous hydrolysis with H2SO4 at 200 degC (Cezare 1998) Incident
photon flux density of photosynthetically active radiation (400-700 nm) was measured by
means of an integrating quantumradiometerphotometer model LI-190 SB (Li-Cor Lincoln
NE USA) provided with a LI-190 SB quantum sensor cell
232 Alcoholic fermentation
Cell concentration was measured by filtering 50 mL samples through Millipore
membranes with 12 μm pore diameter washing with 50 mL of distilled water and drying at
105-110 degC until constant weigh (Carvalho et al 2003) The total reducing sugars (TRS)
concentration was expressed as glucose and determined according to Somogy (1952) after
acid hydrolysis of samples (Falcone et al 1959)
Ethanol concentration was determined by the micro-dichromate method (Joslyn
1970) The effluent gas was qualitatively analyzed by a gas chromatograph coupled to mass
spectrometer model GCMS-QP5050A (Shimadzu Kyoto Japan) equipped with CP Sil
PONA CB column (100 m x 025 mm x 05 μm) Helium was used as a carrier gas at flow rate
of 1 mL min-1
Samples (1 mL) were injected in the column at a split ratio of 1100 Injector
and detector temperatures were 200 and 250 degC respectively The column temperature was
initially set at 40 degC and then increased at a rate of 2 degC min-1
up to 100 degC and subsequently
at 10 degC min-1
up to 250 degC
24 Calculation of A platensis cultivation parameters
The cell productivity (PX mg L-1
d-1
) was calculated by dividing the difference
between maximum and initial cell concentration (Xm - Xi) by the cultivation time
corresponding to Xm The nitrogen-to-cell conversion factor (YXN mg mg-1
) was calculated as
the mass ratio of dried produced cells and nitrogen added
221
24 Statistical analysis
Maximum cell concentration (Xm mg L-1
) maximum cell productivity (PX mg L-1
d-1
)
and nitrogen-to-cell conversion factor (YXN mg mg-1
) were evaluated by the analysis of
variance (ANOVA General Linear Model) and the Tukey test to compare the mean values at
a significance level of 5 (p lt 005) using the MINITAB 15 statistical software
3 Results and discussion
31 Continuous alcoholic fermentation
The mean results of continuous alcoholic fermentation of blackstrap molasses under
steady state conditions were the following cell concentration of 609 plusmn 054 gDW L-1
(dry
weight) TRS of 532 plusmn 567 g L-1
and ethanol concentration of 553 plusmn 757 g L-1
corresponding to a fermentation yield of 64 Such a process yield was of the same order of
magnitude as those previously obtained with the same carbon source (Carvalho et al 2003)
and ensured the release of a CO2 flux suitable to maintain the pH of A platensis culture at the
desired value (95 plusmn 02)
32 Effects of carbon dioxide and nitrogen sources and light intensity on A platensis
growth
Figs 2 to 4 show that the use of pure CO2 or CO2 from alcoholic fermentation led to
almost coincident cell concentration profiles and Xm values which points out no significant
influence of the CO2 source on A platensis growth These findings which were confirmed by
ANOVA (p 005 Table 2) highlight the feasibility of using such a by-product from
industrial bioethanol production as carbon source for cyanobacteria cultivation
It is well known that when bicarbonate is used for the photosynthetic growth of
microalgae there is a progressive release of OH- in the medium (Goldman et al 1982) thus
222
the pH control is fundamental in processes leading to high cell concentrations As stressed by
Watanabe et al (1995) high alkalinity (pH gt 110) restricts the productivity in the air-lift
photobioreactors using air not supplemented with CO2 In cultivations having high demand of
carbon due to high cell concentrations the addition of CO2 can ensure at the same time
control of pH and suited supply of the carbon source This has been done in the present work
where the culture pH was maintained at 95 plusmn 02 (Saacutenchez-Luna et al 2007) by addition of
CO2 either from a cylinder or from alcoholic fermentation so that the CO2 consumed by the
microorganism was permanently replaced Such a control also allowed maintaining the carbon
source level along the cultivations at a value (around 1208 g L-1
of total carbonate)
practically coincident with that of the medium of Schloumlsser (1982) thus avoiding any carbon
source limitation or accumulation and reducing its cost
In experiments carried out with CO2 from alcoholic fermentation the analysis of
effluent gas by headspace gas chromatography revealed it was mainly made up of CO2 with
only small contents of ethanol and acetaldehyde Despite of this it was not detected any
appreciable concentration of organic volatile compounds in the medium likely because this
microorganism has the enzymes needed to metabolize ethanol or even due to their
condensation in the pipe and consequently no influence of these compounds on A platensis
growth was observed In addition the use of CO2 from alcoholic fermentation did not lead to
any precipitation of salts or flocculation like those observed by Ferraz et al (1985) for A
maxima cultivations in open-ponds using a semi-synthetic medium constituted by malt and
yeast extracts peptone and sucrose
As far as the influence of the nitrogen source on A platensis growth is concerned
urea a classical fertilizer was chosen to substitute the conventional nitrogen sources (KNO3
NaNO3) because of its low cost and because it has been recognized as a promising alternative
nitrogen source in the cultivation of A platensis (Danesi et al 2004 Sassano et al 2007)
223
For a given light intensity and CO2 source no significant difference in growth curves
of cultivations carried out with nitrate (Fig 2) or urea (Figs 3 and 4) as nitrogen source was
observed and the Xm values obtained with both nitrogen sources were statistically coincident
(p 005 Table 2) These results point out the success of the approach of using standard
curves obtained with NaNO3 under non-limited conditions (Fig 2) to foresee the nitrogen
demand of fed-batch A platensis cultivations with urea and confirm the feasibility of using
this cheap nitrogen source
Ammonia and residual urea concentrations during the cultivation (lt 10-4
M) were
always much lower than those considered toxic (10 mM) or even inhibitory for cyanobacteria
growth (17 mM to 2 mM) (Abeliovich and Azov 1976) thereby demonstrating that there
was no accumulation either of ammonia or urea in the medium Since the pH of the culture
(95 plusmn 02) was higher than the pKa of the ammonium (93) this compound was likely
assimilated by simple diffusion and then trapped within the cell cytoplasm by protonation
(Boussiba et al 1984)
Light is the energy source that drives photosynthesis therefore its intensity is an
additional important growth factor which has been often associated with shifts in metabolic
activity (Vonshak et al 2000)
During photoautotrophic growth the amount of light energy received by the
photosynthetic apparatuses determines the amounts of inorganic carbon fixed Xm was
significantly increased (p lt 005 Table 2) by an increase in the light intensity from 60 to 120
micromol photons m-2
s-1
(Figs 2 to 4) whereas it reached a plateau in the range 120-240 micromol
photons m-2
s-1
(Table 3) This result is consistent with the typical behavior of the autotrophic
growth of A platensis (Vonshak et al 2000) which can be depending on I (i) light limited
(ii) light saturated or (iii) light inhibited and whose specific growth rate initially increases
linearly with light intensity then reaches a plateau and finally falls
224
The highest Xm value found in this work was higher than those reported for A
platensis cultivations in minipond (15 g L-1
) (Binaghi et al 2003) and conical tubular
photobioreactor (13 g L-1
) (Watanabe and Hall 1996)
33 Cell productivity
Table 2 shows that cell productivity (PX) was not statistically affected either by the
nitrogen or the CO2 source (p 005) Indeed the almost coincident PX values obtained in
cultures with urea and nitrate were expected by the fact that the amounts employed of the
former nitrogen source under every conditions were always based on the results of the
corresponding runs with nitrate As for Xm also the use of different CO2 sources did not
influence the productivity (p 005 Table 2) as well the cultivation time
On the other hand PX increased by about 45 when increasing the light intensity from
60 to 120 micromol photons m-2
s-1
while Xm increased by only 7 Since the higher the light
intensity the higher the biomass concentration in the middle of runs (Figs 2 to 4) it is likely
that the effect of I is more marked when the overall culture conditions are favorable and there
is some shadowing effect (Vonshak et al 2000) In fact the higher the light intensity the
larger the amount of energy converted into ATP to be utilized for cell growth and
maintenance and then the cells reach more quickly the maximum cell concentration (Vonshak
et al 2000)
This behavior was also observed by Danesi et al (2004) and Rangel-Yagui et al
(2004) in A platensis cultures carried out in miniponds with KNO3 or urea as nitrogen
sources On the other hand the similar PX values obtained at 120 and 240 micromol photons m-2
s-
1 (Table 3) were the likely result of photosaturation or shadowing (Chojnacka and Noworyta
2004 Vonshak et al 2000) as described earlier for Xm
225
Therefore the highest cell productivities were obtained at the highest light intensities
(443 plusmn 20 and 463 plusmn 16 mg L-1
d-1
at I = 120 and 240 micromol photons m-2
s-1
respectively)
irrespective of the nitrogen or CO2 sources used (Table 3) These values are close to that (510
mg L-1
d-1
) obtained by Watanabe et al (1995) who investigated the A platensis growth in
conical helical photobioreactor at 118 μmol photon m-2
s-1
Other studies showed that this parameter reached maximum values of 92 mg L-1
d-1
in
a cylindrical glass tank using urea at 108 μmol photons mndash2
sndash1
(Sassano et al 2007) and 96
mg L-1
d-1
in long minitanks using ammonium chloride at 13 klux (156 μmol photons mndash2
sndash1
)
(Bezerra et al 2008) Since these light intensity thresholds are close to that obtained in this
study the remarkably higher values of PX shown here demonstrate the excellent performance
of the tubular photobioreactor configuration
34 Nitrogen-to-cell conversion factor
The ANOVA statistical analysis indicates a significant effect of the nitrogen source (p
lt 005 Table 2) on the nitrogen-to-cell conversion factor (YXN) whose highest mean values
were achieved in cultures using urea (Table 1) Indeed in these cultures the nitrogen amount
added daily was based on the actual needs for cell growth and maintenance and then its
residual concentration was always lt 10-4
M therefore there was no limitation or excess of
nitrogen during cultivation On the other hand in cultures with nitrate its concentration was
always maintained above 1 g L-1
to avoid any growth limitation (Faintuch 1989) thus
resulting in a YXN decrease
Contrarily no significant effects of CO2 sources and light intensities on YXN (p 005
Table 2) were observed Taking into account that YXN is the ratio between the masses of dry
cell produced and nitrogen added such an observation had to be expected by the fact that the
amount of nitrogen added to the culture is associated to cell growth as stressed above These
results apparently disagree with those obtained by Bezerra et al (2008) and Danesi et al
226
(2004) who observed a YXN increase with light intensity However since those experiments
were carried out using the same amount of nitrogen regardless of the light intensity YXN was
only a function of Xm which was in turn an increasing function of I
The highest YXN value found in this study (138 plusmn 090 mg mg-1
) was remarkably
higher than those reported for urea (74-85 mg mg-1
) (Rangel-Yagui et al 2004) and
ammonium chloride (57 plusmn 017 mg mg-1
) (Bezerra et al 2008) as nitrogen sources in
miniponds because the use in this study of a closed tubular photobioreactor certainly reduced
the nitrogen loss as ammonia by off gassing (Ferreira et al 2010)
4 Conclusions
The results of this work showed that the simultaneous use of two low cost or even no-
cost nutrients (CO2 from alcoholic fermentation and urea) could be an interesting alternative
for A platensis cultivation in tubular photobioreactor The fed-batch cultivation of this
cyanobacterium at 120 μmol photons m-2
s-1
using these nutrients as carbon and nitrogen
sources respectively did in fact provide a maximum cell concentration of 2960 plusmn 35 mg L-1
and a cell productivity of 425 plusmn 59 mg L-1
d-1
The production of A platensis biomass which
is a source of valuable compounds using as carbon source the CO2-rich gaseous emissions
from the alcohol industry may contribute to reduce the release of such a greenhouse gas into
the atmosphere
Acknowledgements
The authors grateful acknowledge the financial support of the Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
Pesquisa do Estado de Satildeo Paulo (FAPESP) Satildeo Paulo Brazil (process no 0654959-3 and
065679-2) and of the Coordenaccedilatildeo de Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior
(CAPES) Brazil (processes n 397808-7 and 0350-112010)
227
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232
Caption of Figures
Figure 1 Scheme of the photobioreactor employed for fed-batch cultivations of A platensis
(1) Degasser (2) Condenser tube (3) Air pump (4) Rotameter (5) Magnetic stirrer (6)
20W Fluorescent lamps (7) Airlift system
Figure 2 Cell concentration (X mg L-1
) versus time during fed-batch A platensis cultivations
carried out using nitrate and A) CO2 from cylinder or B) gaseous emissions from alcoholic
fermentation at different light intensities (μmol photons m-2
s-1
) 60 (diams) 120 (times) and 240 (+)
The estimated curves are drawn as continuous lines
Figure 3 A) Cell concentration (X mg L-1
) (open symbols) and B) daily urea addition (mM
d-1
) (full symbols) versus time during fed-batch A platensis cultivations carried out using CO2
from cylinder at different light intensities (μmol photons m-2
s-1
) Triangle 60 Square 120
Circle 240
Figure 4 A) Cell concentration (X mg L-1
) (open symbols) and B) daily urea addition
(mM d-1
) (full symbols) versus time during fed-batch A platensis cultivations carried out
using CO2 from alcoholic fermentation at different light intensities (μmol photons m-2
s-1
)
Triangle 60 Square 120 Circle 240
233
Figure 1
234
Figure 2
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg L
-1)
Time (days)
A)
B)
235
Figure 3
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg L
-1)
Time (days)
000
020
040
060
080
100
120
140
160
0 2 4 6 8 10
Time (days)
ure
a ad
dit
ion (
mM
d-1
)
236
Table 1 Maximum cell concentration (Xm) cell productivity (PX) and nitrogen-to-cell
conversion factor (YXN) obtained in fed-batch A platensis cultures carried out at different
light intensities and using different CO2 and nitrogen sources
run
I
(mol m-2
s-1
)a
CO2
source
Nitrogen
source
Xm
(mg L-1
) b
PX
(mg L-1
d-1
) b
YXN
(mg mg-1
) b
1 60 C c NaNO3 2899plusmn17 250plusmn17 42plusmn003
2 60 C Urea 2847plusmn10 245plusmn00 14plusmn000
3 60 A d NaNO3 2789plusmn82 299plusmn10 40plusmn014
4 60 A Urea 2867plusmn28 308plusmn35 14plusmn017
5 120 C NaNO3 3209plusmn109 454plusmn18 45plusmn018
6 120 C Urea 2980plusmn103 408plusmn17 11plusmn050
7 120 A NaNO3 2968plusmn24 428plusmn40 43plusmn004
8 120 A Urea 2952plusmn35 425plusmn59 15plusmn020
9 240 C NaNO3 3291plusmn206 482plusmn34 54plusmn038
10 240 C Urea 3236plusmn72 473plusmn12 13plusmn034
11 240 A NaNO3 3102plusmn130 450plusmn22 50plusmn024
12 240 A Urea 3070plusmn112 445plusmn19 14plusmn056
a I = light intensity
b Values represent means of two experiments and its standard error
c C = cylinder
d A = alcoholic fermentation
237
Table 2 Values of the descriptive level (p) for the maximum cell concentration (Xm) cell
productivity (PX) and nitrogen-to-cell conversion factor (YXN) at different light intensities (60
120 or 240 mol photons m-2
s-1
) and using different sources of CO2 (cylinder or alcoholic
fermentation) and nitrogen (nitrate or urea)
Factors Xm PX YXN
CO2 0225 0256 0351
Light intensity 0000 0000 0700
Nitrogen 0922 0947 0000
238
Table 3 Means values of maximum cell concentration (Xm) and cell productivity (PX)
obtained in fed-batch A platensis cultivations carried out at variable light intensity
Light intensity
(mol photons m-2
s-1
)
Xm
(mg L-1
)
PX
(mg L-1
d-1
)
60 2851plusmn54ordf 306plusmn7a
120 3056plusmn115b 443plusmn20
b
240 3180plusmn96b 463plusmn16
b
Values with the same superscript are not significantly different according to the Tukey test
(p gt 005)
4
Agrave minha famiacutelia que eacute a alegria da minha
vida e me incentiva a seguir esse caminho
5
AGRADECIMENTOS
Ao Prof Dr Joatildeo Carlos Monteiro de Carvalho pela orientaccedilatildeo dedicaccedilatildeo
confianccedila amizade incentivo e paciecircncia que recebi durante os 6 anos de
convivecircncia no laboratoacuterio
Ao Prof Dr Attilio Converti pela orientaccedilatildeo apoio e confianccedila principalmente
durante minha estadia na Itaacutelia
Ao Prof Dr Sunao Sato chefe do setor de Tecnologia de Fermentaccedilotildees do
Departamento Bioquiacutemico-Farmacecircutica da Universidade de Satildeo Paulo-Brasil
Ao Prof Dr Adalberto Pessoa Juacutenior Profa Dr Ana Luacutecia Figueiredo Porto e
Prof Dr Adilson de Castro Chaves pela indicaccedilatildeo do laboratoacuterio e confianccedila
depositada em meu trabalho
Agrave FAPESP pelo auxiacutelio financeiro que permitiu a execuccedilatildeo desse trabalho
Agrave CAPES pela oportunidade de realizar o doutorado sanduiche na Itaacutelia
contribuindo para meu desenvolvimento pessoal e cientiacutefico
Aos meus pais Irene V P Bezerra e Adesson P Bezerra a minha irmatilde ao
meu cunhado e ao meu namorado Paulo Claudino Veacuteras pelo incentivo apoio
confianccedila e felicidade durante todo esse tempo
Aos meus amigos pernambucanos Fernanda Borba Eduardo Correia Anne
Priscila Croacutecia e Anabel Helena que mesmo distante sempre me incentivaram e a
minha amiga Ceacutelia Bolognesi pelos conselhos e palavras de conforto nos momentos
difiacuteceis
A todos os amigos Liacutevia Seno Ciacutenthia Hoch Ana Morocho Mayla Rodrigues
pelo apoio e carinho que me proporcionou durante a poacutes-graduaccedilatildeo e em especial a
Marcelo Chuei Matsudo
As secretaacuterias da poacutes-graduaccedilatildeo do Deptordm de Tecnologia Bioquiacutemico-
Farmacecircutico (FCF-USP) pela dedicaccedilatildeo apoio e por estarem sempre disponiacutevel
para ajudar e aos secretaacuterios da poacutes-graduaccedilatildeo Elaine Midori Ychico e Jorge Alves
de Lima
Aos funcionaacuterios da Biblioteca do Conjunto das Quiacutemicas pela atenccedilatildeo e
disponibilidade de ajuda sempre que precisei
6
RESUMO
A cianobacteacuteria fotossintetizante Arthrospira platensis eacute conhecida por apresentar
em sua biomassa altos teores proteacuteicos (50-70) presenccedila do aacutecido graxo essencial -
linolecircnico e diversas outras substacircncias importantes para a alimentaccedilatildeo humana e
animal Esses micro-organismos satildeo capazes de converter o CO2 em biomassa de
grande potencial na aacuterea de alimentos Durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica a produccedilatildeo de
CO2 eacute da mesma ordem de grandeza da produccedilatildeo de etanol e considerando a crescente
demanda interna e externa por esse combustiacutevel seria importante que houvesse um
processo que fixasse esse CO2 transformando-o em um produto que poderia ser uacutetil para
a nossa populaccedilatildeo Adicionalmente o uso de uma fonte de nitrogecircnio de baixo custo
(ureacuteia) em reatores tubulares contribuiria para a reduccedilatildeo do custo de produccedilatildeo da A
platensis O objetivo desse trabalho foi avaliar os paracircmetros cineacuteticos e bioenergeacuteticos
bem como a composiccedilatildeo centesimal da A platensis cultivadas em biorreator tubular
alimentados com CO2 proveniente de fermentaccedilatildeo alcooacutelica ou com utilizaccedilatildeo de CO2 puro
para o controle do pH sob diferentes intensidades luminosas (I) e fontes de nitrogecircnio (N)
adicionadas por meio de processo descontiacutenuo alimentado Os resultados mostraram que
maiores valores de I proporcionaram maiores valores de concentraccedilatildeo celular maacutexima
(Xm) e produtividade em ceacutelulas (Px) mas natildeo influenciaram nos valores do fator de
conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) As diferentes fontes de CO2 natildeo influenciaram
nos valores de Xm Px YXN O uso da ureacuteia aumentou os valores de YXN em relaccedilatildeo aos
cultivos com NO3- Na composiccedilatildeo centesimal pode-se observar que I influenciou nos
teores de clorofila proteiacutenas e lipiacutedios mas natildeo influenciou nos teores de cinzas e
carboidratos na biomassa final Em relaccedilatildeo aos paracircmetros bioenergeacuteticos dos cultivos
com CO2 puro observou-se que os maiores valores de dissipaccedilatildeo de energia de Gibbs
foram obtidos em tempos mais curtos a 120-240 μmol de foacutetons m-2 s-1
independentemente do N selecionado enquanto que o nuacutemero de moles de foacutetons
absorvidos pelas ceacutelulas para produzir um C-mol de biomassa foi maior nas culturas com
NO3- independentemente do I As fraccedilotildees da energia direcionada para a siacutentese de ATP e
fixada pela ceacutelula foram superiores em culturas com ureacuteia quando comparadas com as
culturas com NO3- que se revelou uma fonte de nitrogecircnio capaz de sustentar o
crescimento energicamente da A platensis
Palavras chaves Arthrospira platensis processo descontiacutenuo alimentado ureacuteia
intensidade luminosa dioacutexido de carbono fermentaccedilatildeo alcooacutelica bioenergeacutetica
7
ABSTRACT
Photosynthetic cyanobacterium A platensis contains in its biomass high protein
content (50-70) -linolenic acid and many other substances important for health
human These microorganisms are capable of converting CO2 into biomass of great
potential in the food industry During the alcoholic fermentation the production of
CO2 has the same magnitude of the production of ethanol Considering the
increasingly global demand for this fuel a process to fix this CO2 is of utmost
importance Furthermore the use of low cost nitrogen source (urea) in tubular
reactors would contribute to reducing the production cost of A platensis Therefore
the purpose of this work was to evaluate the kinetic and bioenergetics parameters as
well as the chemical composition of biomass obtained in A platensis cultures in
tubular bioreactor using CO2 from alcoholic fermentation or pure CO2 to control the
pH under different light intensity (I) and nitrogen sources (N) The results showed that
higher I induced higher maximum cell concentration (Xm) and cell productivity (Px)
values but it did not exert any influence on the nitrogen-cell conversion factor (YXN)
Urea increased the YXN values compared to use of NO3- In the centesimal
composition of biomass it can be observed that I influenced the chlorophyll protein
and lipid contents but not influenced the carbohydrate and ash contents For
bioenergetics parameters it was observed that the highest Gibbs energy dissipation
values for cell growth and maintenance were obtained in shorter time at 120-240
micromol photons m-2 s-1 in both nitrogen sources while the moles of photons absorbed
by the system to produce one C-mol biomass was higher in cultures with NO3- The
highest values of the molar production of O2 and consumption of H+ were obtained at
the highest I values using NO3- The estimated percentages of the energy absorbed
by the cell showed that compared with nitrate the use of urea as nitrogen source
allowed the system to address higher fractions to ATP production and light fixation by
the photosynthetic apparatus as well as a lower fraction released as heat Thanks to
this better bioenergetic situation urea appears to be a quite promising low-cost
alternative nitrogen source for A platensis cultures in photobioreactors
Key words Arthrospira platensis fed batch urea light intensity carbon dioxide
alcoholic fermentation bioenergetic
8
RIASSUNTO
Il cianobatterio fotosintetici Arthrospira platensis ha un alto contenuto di proteine (50-
70) presenza di acidi grassi essenziali come l‟acido -linolenico e altre sostanze
importanti per l‟alimentazione umana ed animale Questi microrganismi convertono CO2 in
biomassa di grande potenzialitagrave nellindustria alimentare Durante la fermentazione
alcolica la produzione di CO2 egrave dello stesso ordine di grandezza della produzione di
etanolo e in considerazione alla crescente necessitagrave interna ed europeo per questo
combustibile sarebbe importante lo svilupo di un processo che fissasse questo CO2
transformandolo in un prodotto che potrebbe essere utile per la nostra popolazione
Inoltre luso di una fonte di azoto a basso costo (urea) in reattori tubolari contribuirebbe a
ridurre il costo di produzione di A platensis Lobiettivo di questo studio egrave di valutare i
parametri cinetici bioenergetiche e la composizione della biomassa ottenuta in colture di
A platensis in bioreattori tubolare alimentato con CO2 puro di cilindro o con CO2 della
fermentazione alcolica per il controllo del pH in diverse intensitagrave di luce (I) e fonti di azoto
(N) usando il processo discontinuo alimentato I risultati hanno dimostrato che valori piugrave
alti di I fornire i piugrave alti valori di concentrazione massima delle cellule (Xm) e la produttivitagrave
delle cellule (Px) ma non influenza i valori del fattore di conversione di azoto nelle cellule
(YXN) Luso di urea come fonte di azoto aumentato i valori di YXN rispetto alle culture con
NO3- La composizione chimica di biomassa puograve osservare che I ha influenzato la
percentuale di clorofilla proteine e lipidi ma non ha influenzato la percentuale di
carboidrati e cenere nella biomassa finale In relazioni ai parametri bioenergetici dei cultivi
usando CO2 di cilindri abbiamo osservato che i piugrave alti valori di dissipazione di energia di
Gibbs per la crescita cellulare e la manutenzione sono stati ottenuti in tempo piugrave brevi nel
120-240 μmol di fotoni m-2 s-1 per entrambe le fonti di N mentre il numero di moli di fotoni
assorbiti dalle cellule por produrre una biomassa C-mol era maggiore nelle culture con
NO3- a prescindere dalla I I valori piugrave alti della produzione molare di O2 e il consumo di H+
sono stati ottenuti con valori piugrave alti di I coltivati con NO3- Le frazioni di energia per la
sintese di ATP e fissato per la cellula erano piugrave alti nelle culture con urea che nelle culture
con NO3- che si egrave rivelata una fonte di azoto in grado di sostenere la crescita di A
platensis
Parole chiave Arthrospira platensis processo discontinuo alimentato urea intensitagrave
luminosa anidride carbonica fermentazione alcolica bioenergetica
9
Lista de graacuteficos
Graacutefico 1 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular de A
platensis 73
Graacutefico 2 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia
Graacutefico 3 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo de clorofila a 77
Graacutefico 4 Logariacutetmico da concentraccedilatildeo celular em funccedilatildeo do tempo 88
Graacutefico 5 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 01 h-1 88
Graacutefico 6 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) Etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 005 h-1 89
Graacutefico 7 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) Etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 0025 h-1 89
Graacutefico 8 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 1 93
Graacutefico 9 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 2 (60 mol de foacutetons m-2 s-1) 94
Graacutefico 10 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 2 95
Graacutefico 11 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 3 96
Graacutefico 12 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 4 (120 mol de foacutetons m-2 s-1) 97
Graacutefico 13 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 4 98
Graacutefico 14 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 5 99
Graacutefico 15 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 6 (120 mol de foacutetons m-2 s-1) 100
Graacutefico 16 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 6 101
Graacutefico 17 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 7 102
Graacutefico 18 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 8 (120 mol de foacutetons m-2 s-1) 103
Graacutefico 19 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 8 104
Graacutefico 20 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 9 105
Graacutefico 21 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 10 (240mol de foacutetons m-2 s-1) 106
Graacutefico 22 concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 10 107
10
Graacutefico 23 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 11 108
Graacutefico 24 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 12 (240 mol de foacutetons m-2 s-1) 109
Graacutefico 25 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 12 110
Graacutefico 26 Energia de Gibbs de dissipaccedilatildeo durante o cultivo de A platensis
intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 ( ) 120 () 240
Fonte de nitrogecircnio nitrato (siacutembolo aberto) ureacuteia (siacutembolo fechado) 144
Graacutefico 27 Influecircncia da velocidade especiacutefica de crescimento da A platensis sobre
o nuacutemero de moles de foacutetons absorvido para produzir 1 C-mol de biomassa em
diferentes condiccedilotildees de cultivo () Composiccedilatildeo elementar da biomass descrita por
Cornet et al (1992) PPFD = 60 μmol de foacutetons m-2 s-1 Composiccedilatildeo elementar da
biomass determinada experimentalmente PPFD (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60
() 120 () 240 Fonte de nitrogecircnio nitrato (siacutembolos abertos) ureacuteia
(siacutembolos fechados) 147
Graacutefico 28 Produccedilatildeo molar de O2 (siacutembolo fechado) e consumo de H+ (siacutembolo
aberto) em funccedilatildeo do tempo em diferentes condiccedilotildees de cultivo Intensidades
luminosas (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 () 120 () 240 Fonte de
nitrogecircnio nitrato (linha rachurada) ureacuteia (linha contiacutenua) 149
Graacutefico 29 Energia total de Gibbs absorvida pelo aparato fotossinteacutetico (siacutembolo
fechado) (ΔGa) e energia transformada em ATP (siacutembolo aberto) (ΔGATP) durante o
cultivo da A platensis intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 (
) 120 () 240 Fonte de nitrogecircnio nitrato (linha tracejada) ureacuteia (linha
continua) 150
Graacutefico 30 Energia fixada pelo aparato fotossinteacutetico (siacutembolo fechado) (ΔH) e
energia liberada como calor (siacutembolo aberto) (Q) durante o cultivo de A platensis
intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 ( ) 120 () 240
Fonte de nitrogecircnio nitrato (linha rachurada) ureacuteia (linha contiacutenua) 151
Graacutefico 31 Porcentagem na distribuiccedilatildeo da energia luminosa absorvida durante o
cultivo de A platensis usando nitrato (siacutembolo fechado) e ureacuteia (siacutembolo aberto)
como fonte de nitrogecircnio Energia fixada pelos fotossistemas () energia
transformada em ATP () energia liberada como calor ( ) 152
Graacutefico 32 Concentraccedilatildeo celular nas duas diferentes configuraccedilotildees dos
fotobiorreatores tubulares ( ) horizontal e ( loz ) espiralado 153
11
Lista de Figuras
Figura 1 Spirulina platensis (UTEX 1926) 22
Figura 2 Principais rotas de assimilaccedilatildeo de nitrogecircnio em cianobacteacuterias cultivas em
pH acima de 92 35
Figura 3 Complexos fotossinteacuteticos em membranas tilacoacuteides 42
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do fotossistema 43
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da fase fotoquiacutemica 44
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da moleacutecula da clorofila a 48
Figura 7 Fotobiorreator tubular horizontal utilizado no cultivo de A platensis 67
Figura 8 Fotobiorreator tubular espiralado utilizado no cultivo de A platensis 68
12
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Produtores representativos de Spirulina 23
Tabela 2 - Planejamento experimental 84
Tabela 3 - Valores da concentraccedilatildeo celular meacutedias e desvio padratildeo em massa
seca obtidas a partir do melaccedilo natildeo clarificado e do melaccedilo clarificado 86
Tabela 4 - Variaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de leveduras em funccedilatildeo do tempo 87
Tabela 5 - Valores de XP ART Etanol e Rendimento do processo no regime
permanente para os diferentes valores de D com ART inicial de 170 gL-1 91
Tabela 6 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de carbonato
total referentes ao experimento 1 93
Tabela 7 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 2 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -44554x3 + 54865x2 + 14317x + 400 (60 mol de foacutetons
m-2 s-1) 94
Tabela 8 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 2 95
Tabela 9 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de carbonato
total referentes ao experimento 3 96
Tabela 10 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 4 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -20689x3 + 11591x2 + 33292x + 400 (60 mol de foacutetons
m-2 s-1) 97
Tabela 11 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 4 98
Tabela 12 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 5 99
Tabela 13 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 6 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -13286x3 + 14486x2 + 62226x + 400 (120 mol de
foacutetons m-2 s-1) 100
Tabela 14 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 6 101
Tabela 15 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 7 102
13
Tabela 16 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 8 de
acordo com a y = - 58128x3 + 38625x2 + 38606x + 400 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
103
Tabela 17 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 8 104
Tabela 18 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 9 105
Tabela 19 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 10
de acordo com a equaccedilatildeo y = -12057x3 + 10082x2 + 31899x + 400 (240 mol de
foacutetons m-2 s-1) 106
Tabela 20 - Valores meacutedios de concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 10 107
Tabela 21 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 11 108
Tabela 22 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 12
de acordo com a equaccedilatildeo y = -82763x3 + 62437x2 + 37265x + 400 (240 mol de
foacutetons m-2 s-1) 109
Tabela 23 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amonia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 12 110
Tabela 24 - Valores da concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) produtividade em ceacutelulas
(Px) e fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) com diferentes fontes de
CO2 fontes de nitrogecircnio e intensidades luminosas 119
Tabela 25 - Anaacutelise de variacircncia para a concentraccedilatildeo celular maacutexima 120
Tabela 26 - Meacutedias da concentraccedilatildeo celular maacutexima para a variaacutevel independente
fonte de nitrogecircnio 120
Tabela 27 - Meacutedias da concentraccedilatildeo celular maacutexima para a variaacutevel independente
intensidade luminosa 121
Tabela 28 - Anaacutelise de variacircncia para a produtividade em ceacutelulas 122
Tabela 29 - Meacutedias da produtividade em ceacutelulas para a variaacutevel independente fonte
de nitrogecircnio 123
Tabela 30 - Meacutedias da produtividade em ceacutelulas para a variaacutevel independente
intensidade luminosa 123
Tabela 31 - Anaacutelise de variacircncia para fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas
126
14
Tabela 32 - Meacutedias do fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas para a variaacutevel
independente fonte de nitrogecircnio 127
Tabela 33 - Meacutedias do fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas para a variaacutevel
independente intensidade luminosa 128
Tabela 34 - Concentraccedilatildeo de clorofila na biomassa final obtida nos experimentos
com o pH controlado com CO2 de cilindro 129
Tabela 35 - Anaacutelise de variacircncia para a concentraccedilatildeo de clorofila na biomassa final
130
Tabela 36 - Porcentagem de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos e cinzas na biomassa
seca final 134
Tabela 37 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de proteiacutena na biomassa final 136
Tabela 38 - Meacutedias do teor de proteiacutena na biomassa final para a variaacutevel
independente intensidade luminosa 136
Tabela 39 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de lipiacutedio na biomassa seca final 138
Tabela 40 - Meacutedias do teor de lipiacutedio na biomassa final para a variaacutevel independente
fonte de nitrogecircnio 138
Tabela 41 - Meacutedias do teor de lipiacutedio na biomassa final para a variaacutevel independente
intensidade luminosa 138
Tabela 42 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de carboidratos na biomassa seca final
141
Tabela 43 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de cinzas na biomassa seca final 142
Tabela 44 - Coeficientes estequiomeacutetricos estimados atraveacutes dos balanccedilos de
materiais de carbono nitrogecircnio oxigecircnio enxofre carga e grau de reduccedilatildeo da
biomassa cultivada em fotobiorreator tubular horizontal utilizando nitrato ou ureacuteia
como fontes de nitrogecircnio 145
15
Lista de abreviaturas e siglas
ART Accediluacutecares redutores totais
VOCs Compostos volaacuteteis orgacircnicos
C Carbono
N Nitrogecircnio
S Enxofre
O Oxigecircnio
H Hidrogecircnio
I Intensidade Luminosa
Ef Concentraccedilatildeo de etanol (g L-1)
fc Fraccedilatildeo em massa do carbono na biomassa seca (g g-1)
fi Fraccedilatildeo em massa do aacutetomo i na biomassa seca (g g-1)
Nt quantidade total de nitrogecircnio adicionado (mg)
Petanol Produtividade em etanol (g L h-1)
PX Produtividade em ceacutelulas (mg L-1 d -1)
Tc Tempo de cultivo (dias)
V Volume do meio (L)
Xi Concentraccedilatildeo celular inicial (mg L-1)
Xm Concentraccedilatildeo celular maacutexima obtida (mg L-1)
XP Meacutedias dos valores de concentraccedilotildees celulares ao longo do regime
permanente
YXN Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (mg mg-1)
Cl Clorofila a
GS glutamina sintetase
GOGAT glutamate sintase
FSII Fotossistema II
FSI Fotossistema I
16
Lista de siacutembolos
max
GXY Rendimento maacuteximo teoacuterico de biomassa sobre a energia de Gibbs
Velocidade especiacutefica de crescimento
1YGX Energia de Gibbs para o crescimento e manutenccedilatildeo celular
c Velocidade da luz (299108 m s-1)
D Vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo (h-1)
h Constante de Planck (662610-34 J)
mG Energia de Gibbs dissipada para a manutenccedilatildeo celular
MMc Massa molar do aacutetomo do carbono (g C-mol-1)
MMi Massa molar do aacutetomo i (g C-mol-1)
NA nuacutemero de Avogadro (6022 x 1023 foacutetons de Einstein -1)
nPh nuacutemero de foacutetons
Q Energia de Gibbs liberada como calor
qH+ Consumo molar de H+
qO2 Produccedilatildeo molar de O2
ΔGa Energia total de Gibbs absorvida pela fotossiacutentese
ΔGATP Energia de Gibbs transformada em ATP
ΔgPh Energia de Gibbs contida em 1 Einsten de foacuteton
ΔH Energia fixada pelos fotosistemas
η Rendimento do processo em etanol ()
λ Comprimento de onda
17
Sumaacuterio
1 Introduccedilatildeo 20
2 Revisatildeo bibliograacutefica 22
21 Caracteriacutesticas da A platensis22
22 Fotobiorreatores26
23 Processos de cultivo em fotobiorreatores31
24 Nutrientes para o crescimento da A platensis 33
241 Fontes de Nitrogecircnio33
242 Intensidade luminosa41
2421 Pigmentos 46
243 Fontes de carbono 50
2431 Fonte de carbono orgacircnico (Crescimento hetorotroacutefico) 50
2432 Fonte de carbono inorgacircnico (Crescimento autotroacutefico) 51
2433 Fonte de carbono inorgacircnico e orgacircnico simultaneamente (Crescimento
mixotroacuteficos) 54
3 Objetivos61
4 Materiais e meacutetodos 62
41 Fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua62
411 Testes preliminares para emprego da fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
62
4111 Teste para avaliar a influecircncia do tratamento do melaccedilo na determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo celular62
41111 Melaccedilo natildeo tratado62
41112 Melaccedilo tratado 62
41113 Preparaccedilatildeo do melaccedilo63
4112 Teste para avaliar a homogeneidade do reator 63
4113 Teste para determinar a vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo 63
412 Micro-organismo e condiccedilotildees de manutenccedilatildeo63
413 Preparo do inoacuteculo64
414 Dispositivo para a cultura 64
415 Descriccedilatildeo das condiccedilotildees de fermentaccedilatildeo contiacutenua64
42 Cultivo de A platensis65
421 Micro-organismo e manutenccedilatildeo 65
18
422 Meio de cultivo65
4221 Meio padratildeo para cultivo de A platensis 65
4222 Meio modificado66
423 Preparo do inoacuteculo66
424 Dispositivo da cultura67
4241 Fotobiorreator tubular horizontal67
4242 Fotobiorreator tubular espiralado68
425 Descriccedilatildeo de um experimento tiacutepico de cultivo da A platensis68
43 Teacutecnicas Analiacuteticas69
431 Acompanhamento da fermentaccedilatildeo alcooacutelica70
4311 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular70
4312 Determinaccedilatildeo do pH70
4313 Determinaccedilatildeo de ART70
4314 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol71
4315 Determinaccedilatildeo dos componentes volaacuteteis presentes no gaacutes efluente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua72
432 Acompanhamento do cultivo de A platensis72
4321 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular 72
43211 Densidade oacutetica 72
43212 Construccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo 73
4322 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de carbonato total 73
4323 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia total74
4324 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia75
4325 Determinaccedilatildeo do pH76
4326 Determinaccedilatildeo de nitrato76
4327 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol76
433 Avaliaccedilatildeo da biomassa de A platensis obtida no final do cultivo76
4331 Determinaccedilatildeo de Clorofila a 76
43311 Curva de calibraccedilatildeo para a determinaccedilatildeo de Clorofila a 77
4332 Determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal 77
43321 Proteiacutenas totais78
43322 Lipiacutedios totais78
43323 Cinzas78
43324 Carboidratos totais 79
19
434 Avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo elementar 79
4341 Determinaccedilatildeo de CNHS 79
4342 Determinaccedilatildeo de oxigecircnio 79
44 Caacutelculos 79
441 Produtividade em etanol no regime permanente 79
442 Rendimento do etanol no regime permanente 80
443 Produtividade em ceacutelulas nos cultivos de A platensis 80
444 Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas nos cultivos de A
platensis 80
445 Coeficientes atocircmicos para 1 C-mol de biomassa 81
446 Grau de reduccedilatildeo da biomassa82
45 Teoria dos paracircmetros bioenergeacuteticos 82
5 Planejamento experimental84
6 Resultados e discussotildees85
61 Testes preliminares para a realizaccedilatildeo da fermentaccedilatildeo alcooacutelica 85
611 Avaliaccedilatildeo da influecircncia da clarificaccedilatildeo do melaccedilo na determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo celular 86
612 Teste de homogeneidade do reator87
613 Avaliaccedilatildeo de diferentes vazotildees especiacuteficas de alimentaccedilatildeo (D) 88
614 Avaliaccedilatildeo dos volaacuteteis orgacircnicos no gaacutes de arraste92
62 Avaliaccedilatildeo do crescimento da A platensis 93
63 Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) Produtividade em
ceacutelulas (Px) e Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas
(YXN) 119
631 Concentraccedilatildeo celular maacutexima 119
632 Produtividade volumeacutetrica de ceacutelulas 122
633 Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas 125
64 Avaliaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de clorofila a 129
65 Avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal 134
66 Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros bioenergeacuteticos 143
67 Comparaccedilatildeo entre os fotobiorreatores 153
7 Conclusotildees 154
20
1 Introduccedilatildeo
O interesse na produccedilatildeo comercial da Spirulina sp eacute devido a algumas
propriedades particulares como alta digestibilidade menor concentraccedilatildeo de aacutecidos
nucleacuteicos teores de proteiacutenas elevados (50-70 da massa seca) e importacircncia
quantitativa de aminoaacutecidos essenciais Na sua biomassa encontram-se tambeacutem
pigmentos como a clorofila ficocianina e -caroteno aacutecidos graxos essenciais como
γ-linolecircnico o qual possui efeito terapecircutico em humanos (BELAY OTA 1994)
vitaminas e antioxidantes (PULZ SCHEIBENBOGEN 1998)
Tradicionalmente a Spirulina (Arthrospira) eacute cultivada autotroficamente na
presenccedila de altos niacuteveis de carbonatos e bicarbonatos como fontes de carbono por
serem de baixo custo e proporcionarem pH elevado no meio No entanto Spirulina
ssp tambeacutem podem crescer em condiccedilotildees mixotroacuteficas podendo apresentar uma
produtividade maior quando comparadas a cultivos fotoautotroacuteficos ou heterotroacuteficos
(OGBONNA et al 2000)
Em condiccedilotildees mixotroacuteficas eou fotoautotroacuteficas a intensidade luminosa eacute um
fator importante no crescimento celular da A platensis Baixas intensidades
luminosas podem limitar o crescimento celular Por outro lado altas intensidades
luminosas podem inibir o crescimento celular devido ao fenocircmeno de fotoinibiccedilatildeo
Por isso esse eacute um fator que deve ser controlado em cultivos de micro-organismos
fotossintetizantes
O pH do meio de cultivo eacute um outro fator no cultivo de micro-organismos O pH
determina a solubilidade do dioacutexido de carbono e minerais no meio de cultura e
influencia diretamente ou indiretamente no metabolismo dos micro-organismos
fotossintetizantes Durante o cultivo autotroacutefico da Spirulina sp ocorre um raacutepido
aumento do pH no meio de cultura o que pode atuar como um autoinibidor do
crescimento celular (RICHMOND 2000) e portanto o CO2 pode ser utilizado para a
manutenccedilatildeo do pH oacutetimo
A biofixaccedilatildeo do CO2 pelas microalgas estatildeo entre os meacutetodos bioloacutegicos mais
produtivos no tratamento de emissotildees de resiacuteduos industriais e o rendimento da
biomassa por hectare eacute maior quando comparadas a plantaccedilotildees na agricultura
(LAW BERNING 1991 AKIMOTO et al 1994) O uso direto dos resiacuteduos volaacuteteis
reduz os custos de preacute-tratamento mas a alta concentraccedilatildeo de CO2 pode inibir o
crescimento de cianobacteacuterias e microalgas No entanto alguns autores tecircm
21
recentemente relatado o isolamento de cianobacteacuterias e microalgas tolerantes a
altas concentraccedilotildees de CO2 e capazes de fixar esse gaacutes tais como Chlorella
Spirulina e Scenedesmus (CHANG et al 2003 WATANABE HALL 1995a
HANAGATA et al 1992) Cyanidium cladarium (AKIMOTO et al 1994)
Aleacutem do CO2 a fonte de nitrogecircnio tambeacutem eacute um fator determinante no cultivo
uma vez que este nutriente eacute utilizado principalmente para constituir proteiacutenas e
aacutecidos nucleacuteicos fundamentais para a manutenccedilatildeo e crescimento celular
(WATANABE HALL 1996) O meio de cultura convencional para a obtenccedilatildeo da S
platensis utiliza sais de nitrato como fonte de nitrogecircnio como por exemplo nitrato
de potaacutessio e nitrato de soacutedio Ureacuteia (DANESI et al 2002 SOLETTO et al 2005) e
sais de amocircnio (CARVALHO et al 2004 SOLETTO et al 2005) tecircm sido
pesquisadas como fontes alternativas de nitrogecircnio para o cultivo de S platensis
No caso de fontes de nitrogecircnio amoniacais o emprego dos reatores tubulares
pode ser considerado como uma vantagem por favorecer baixa perda de amocircnia
por volatilizaccedilatildeo reduzindo a necessidade de adiccedilatildeo de fonte de nitrogecircnio como
consequumlente reduccedilatildeo do custo de produccedilatildeo Assim pode-se concluir que os
esforccedilos em melhoria de condiccedilotildees de cultivo de A platensis natildeo sejam apenas
utilizando reatores abertos mas tambeacutem reatores fechados dentre os quais os
tubulares
O dioacutexido de carbono e os compostos volaacuteteis orgacircnicos (CVOs) de
fermentaccedilatildeo alcooacutelica podem ser utilizados como fontes de carbono no cultivo de A
platensis Durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica industrial toneladas de CO2 etanol e em
menor quantidade alguns CVOs satildeo liberados para a atmosfera como resiacuteduos No
entanto esses compostos podem ser reaproveitados como uma fonte de nutriente
juntamente como uma fonte de nitrogecircnio de baixo custo (ureacuteia) para o
desenvolvimento da A platensis que por sua vez permite a produccedilatildeo de
componentes com alto valor agregado e com menor custo de produccedilatildeo industrial
22
2 Revisatildeo bibliograacutefica
21 Caracteriacutesticas da A platensis
Arthrospira platensis eacute uma cianobacteacuteria filamentosa fotossintetizante
pertencente da ordem Oscillatoriales famiacutelia Cyanophyceae gecircnero Arthrospira
espeacutecie platensis Satildeo caracterizadas por tricomas ciliacutendricos multicelulares com
formas espiraladas (Figura 1) Estes possuem comprimentos de aproximadamente
500 μm e diacircmetro variando de 6-12 μm mas dependendo das condiccedilotildees de cultivo
podem adquirir morfologias diferentes Os filamentos natildeo possuem ramificaccedilotildees
nem heterocistos (TOMASELLI 1997)
Figura 1 Spirulina platensis (UTEX 1926) Fonte Universidade do Texas 2006
Arthrospira pode controlar sua flutuabilidade com vesiacuteculas gasosas para
receber a incidecircncia luminosa oacutetima para a fotossiacutentese Essas ceacutelulas podem
tambeacutem excretrar polissacariacutedeos extracelulares para formar agregados flutuantes
um fato que facilita sua recuperaccedilatildeo em lagos naturais e culturas outdoors (MATA
2007) Aleacutem disso devido a sua morfologia taxa de crescimento celular
relativamente alta e a caracteriacutestica das ceacutelulas se agregarem o custo operacional
para a recuperaccedilatildeo da biomassa eacute reduzido tornando-a economicamente viaacutevel
para a produccedilatildeo industrial (MATA 2007)
A Arthrospira sp eacute comercializada de forma inadequada com o nome de
Spirulina (GARRITY et al 2001) Atualmente a Arthrospira sp eacute produzida em
diferentes paiacuteses e sua produccedilatildeo mundial pode exceder 3000 toneladas
(SHIMAMATSU 2004) Na Tabela 1 estatildeo descritos algumas induacutestrias produtoras
de Spirulina (Arthrospira) sp e seu respectivo paiacutes
23
Tabela 1 - Produtores representativos de Spirulina
Induacutestria Paiacutesterritoacuterio
Spirulina Mexicana (Sosa Texcoco) SA
Meacutexico a
Siam Algae Co Ltd Thailand
Earthrise Farms USA
Cyanotech Corporation USA
Nan Pao Resins Chemical Co Ltd Taiwan
Far East Microalgae Co Ltd Taiwan
Parry Agro Industries Ltd (Parry Nutraceuticals)
Iacutendia
Yunnan Spirin Co Ltd Mainland China
Fonte Shimamatsu 2004 a Essa induacutestria faliu por volta do ano de 1990 (LEE 1997)
A biomassa da Spirulina sp eacute comercializada principalmente como alimentos
para seres humanos e animais devido a sua composiccedilatildeo quiacutemica A seguranccedila
como alimento tem sido estabelecida por seacuteculos atraveacutes do consumo pelos seres
humanos e pelos nuacutemerosos estudos toxicoloacutegicos (CHAMORRO et al 2002)
Na China em 1997 existiam cerca de 80 produtores de Spirulina com
produccedilatildeo anual variando de 3 a 500 toneladas A maioria dos produtores se
localizava no sul devido agrave vantagem de possuir verotildees longos e clima temperado
(LEE 1997) O maior produtor mundial de Arthrospira eacute Hainan Simai Enterprising
que estaacute localizado na provincia de Hainan na China Essa companhia tem uma
produccedilatildeo anual de 200 toneladas (SPOLAORE et al 2006) No Japatildeo de acordo
com Healfh Industry News a quantidade total de Spirulina comercializada foi de 400
toneladas em 1996 Em Taiwan 5 induacutestrias produzem um total de 480 toneladas
Na Tailacircndia os dois maiores produtores de Spirulina (Siam Algae Co Ltd e
Neotech Food Co Ltd) produzem 150 toneladas e 20 toneladas por ano
respectivamente Nos Estados Unidos a Cyanotech e a Earthrise Farms satildeo os dois
maiores produtores de Spirulina com produccedilatildeo de 380 toneladas e 500 toneladas
respectivamente Aleacutem dessas induacutestrias citadas acima existem outras produtoras
de Spirulina com uma produccedilatildeo anual menor em diversos paiacuteses como Chile Cuba
Filipinas Iacutendia (LEE 1997)
O potencial dessas cianobacteacuterias como um alimento baacutesico na dieta humana
tem sido investigado haacute muitos anos em diversos paiacuteses No Japatildeo a biomassa
24
algal (por exemplo Chlorella e Spirulina) eacute produzida comercialmente sendo
utilizada primeiramente como alimentos nutracecircuticos ou funcionais (OGBONNA
TANAKA 1997 BOROWITZKA 1986) Na China Spirulina and Chlorella satildeo os
dois maiores gecircneros cultivado na forma de biomassa ou extrato para a induacutestria
alimentiacutecia A biomassa eacute usada para produzir uma variedade de produtos
nutracecircuticos ou funcionais como tabletes caacutepsulas poacute ou para extraccedilatildeo de
ingredientes bioativos como β-caroteno e ficocianina A biomassa eacute suplementada
em patildees biscoitos doces sorvetes e o extrato satildeo suplementados em bebidas
como refrigerantes e chaacute principalmente para realccedilar seu valor nutritivo (LIANG et
al 2004)
Uma ampla variedade de pigmentos como clorofila a (Cl a) luteiacutena -caroteno
ficocianina (PC) e aloficocianina (APC) satildeo compostos bioativos na biomassa de S
platensis e tem sido usado como corantes naturais em alimentos em cosmeacuteticos e
como produtos farmacecircuticos no consumo humano e animal (CHEN et al 2006) O
efeito nocivo de corantes sinteacuteticos e a tendecircncia da sociedade utilizar produtos
naturais na alimentaccedilatildeo e cosmeacuteticos tecircm conduzido agrave exploraccedilatildeo das microalgas
como corantes naturais Esses pigmentos tecircm um grande valor comercial como
corantes naturais em induacutestrias nutracecircuticas cosmeacuteticas e farmacecircuticas
(PRASANNA et al 2007)
Recentemente a importacircncia de se estudar esses micro-organismos eacute devido
as suas propriedades terapecircuticas (BELAY et al 1993) e presenccedila de compostos
antioxidantes (ESTRADA et al 2001 MIRANDA et al 1998) Essas propriedades
tecircm sido provadas experimentalmente in vivo e in vitro que satildeo efetivas para o
tratamento de algumas alergias anemia doenccedilas virais e cardiovasculares
hiperglicemia hiperlipidemia processos inflamatoacuterios entre outros (CHAMORRO et
al 2002 BELAY et al 2002)
Essa cianobacteacuteria possui alto teor proteacuteico com importacircncia quantitativa dos
aminoaacutecidos essenciais e outros elementos nutricionais proporcionando seu alto
valor nutricional (MORIST et al 2001) Baixos teores de aacutecidos nucleacuteicos altos
conteuacutedos de vitaminas polissacariacutedeos e aacutecidos graxos essenciais como ocircmega-3
e ocircmega-6 satildeo paracircmetros importantes para avaliar a qualidade da biomassa algal
(OGBONNA TANAKA 1997 BOROWTIZKA 1986) Os polissacariacutedeos que
constituem a parede celular tecircm uma digestibilidade de 86 o que torna a biomassa
facilmente absorvida pelo corpo humano (LI 1997)
25
Haacute relatos tambeacutem do emprego da Arthrospira em cosmeacuteticos um extrato rico
em proteiacutenas feitos a partir da Arthrospira repara sinais de envelhecimento da pele
mais cedo exerce um efeito de firmeza e previne a formaccedilatildeo de estrias (Protulinesreg
Exsymol SAM Monaco) (SPOLAORE et al 2006)
Aleacutem da presenccedila dos compostos citados anteriomente a biomassa de
Spirulina tambeacutem pode ser utilizada no tratamento de aacuteguas residuais renovaccedilatildeo da
aacutegua atraveacutes da desintoxificaccedilatildeo bioloacutegica e remoccedilatildeo de metais pesados Por ser
um micro-organismo fotossintetizante tem a capacidade natildeo apenas de produzir
oxigecircnio mas tambeacutem de remover nutrientes como nitrogecircnio e foacutesforo reduzindo a
eutrofizaccedilatildeo dos efluentes Essa biomassa pode ser recuperada e utilizada para
extrair compostos de interesse industrial como por exemplo pigmentos e o restante
da biomassa pode ainda ser utilizado como combustiacutevel ou para produccedilatildeo de
metano (CIFERRI TIBONI 1985)
O cultivo de microalgas e cianobacteacuterias fornecem excelente perspectivas para
a produccedilatildeo de energia renovaacutevel podendo contribuir substancialmente para uma
reduccedilatildeo de emissotildees do CO2 Essas emissotildees satildeo resultados do processo de
queima dos combustiacuteveis foacutesseis e de praacuteticas agriacutecolas improacuteprias (as queimadas
por exemplo) produzindo elevados rendimentos da biomassa e possibilitando a
produccedilatildeo de compostos com alto valor agregado e biocombustiacutevel (CHISTI 2007
RICHMOND 1990)
As microalgas tecircm sido propostas como mateacuteria-prima para a produccedilatildeo de
biocombustiacuteveis devido ao alto teor de lipiacutedios que algumas espeacutecies podem
alcanccedilar O teor de oacuteleo de 20 a 50 de sua biomassa seca eacute comum entre as
espeacutecies como Nannochloropsis sp Chlorella sp Schizochytrium sp Algumas
microalgas podem exceder a 80 (MIAO 2006 CHISTI 2007 BANERJEE et al
2002) O percentual de lipiacutedios na biomassa de microalgas eacute funccedilatildeo das condiccedilotildees
de cultivo tais como salinidade do meio concentraccedilatildeo de nitrogecircnio natureza da
fonte de carbono assim eacute possiacutevel com certa facilidade e com tempo de resposta
relativamente curto aumentar o teor de oacuteleo nas microalgas de forma a alcanccedilar
valores bastante expressivos (CHISTI 2007)
As principais vantagens para a utilizaccedilatildeo de microalgas como biocombustiacuteveis
satildeo alta eficiecircncia de conversatildeo de foacutetons (como evidenciada pelo aumento do
rendimento da biomasa por hectare) podem ser coletados em lotes durante quase
todo o ano pode utilizar sais e aacutegua residuaacuteria reduzindo extremamente o uso de
26
aacutegua doce produz biocombustiacutevel altamente biodegradaacutevel e natildeo toacutexico podem ser
usado o CO2 liberado pela queima de combustiacuteveis foacutesseis esse CO2 eacute
frequentemente disponiacutevel a baixo custo ou ateacute mesmo sem custo (CHISTI 2007
SAWAYAMA et al 1995 SCHENK et al 2008 YUN et al 1997) As limitaccedilotildees
atuais existentes satildeo principalmente no processo de colheita e na fonte do CO2 para
a maior eficiecircncia de produccedilatildeo (SCHENK et al 2008)
22 Fotobiorreatores
A escolha do biorreator para o cultivo da microalga eacute um importante fator que
influecircncia na produtividade global (WATANABE HALL 1996) Haacute uma grande
variedade de biorreatores utilizados para o cultivo de microalga dentre os quais
alguns satildeo utilizados atualmente para produccedilatildeo industrial (LEE 2001)
Segundo Borowitzka (1999) as microalgas podem ser cultivadas em diversos
sistemas de cultivo com volume variando desde poucos litros ateacute bilhotildees de litros
Em geral os sistemas de produccedilatildeo satildeo pouco sofisticados uma vez que muitas
empresas desenvolvem cultivos a ceacuteu aberto em tanques com fundo de terra e com
baixo ou nenhum controle dos paracircmetros ambientais Nos uacuteltimos 50 anos alguns
cultivos desenvolvidos em fotobiorreatores podem ter os seus paracircmetros
ambientais controlados e isto implica numa elevada produtividade a qual viabiliza a
produccedilatildeo comercial de compostos de elevado valor agregado (KOMMAREDDY
ANDERSON 2005 TREDICI 2004)
Convencionalmente os cultivos de microalgas comerciais satildeo realizados em
reatores abertos por causa de baixa eficiecircncia dos fotobiorreatores fechados em
larga escala (OGBONNA TANAKA 1997) Portanto eacute difiacutecil de obter alta
produtividade em reatores ldquooutdoorsrdquo abertos por causa da dificuldade de controlar
fatores ambientais como temperatura e intensidade luminosa haacute uma grande
evaporaccedilatildeo de aacutegua no meio e aleacutem disso requer uma grande aacuterea superficial
facilitando a contaminaccedilatildeo por outros micro-organismos Esse meacutetodo natildeo deve ser
empregado para produccedilatildeo de componentes quiacutemicos finos e farmacecircuticos uma
vez que o custo de recuperaccedilatildeo desse produto e purificaccedilatildeo podem ser
extremamente altos principalmente devido a baixa concentraccedilatildeo celular e a
contaminaccedilatildeo com impurezas Vaacuterias alternativas tecircm sido propostas para contornar
esse problema como o emprego de fotobiorreatores fechados e processos
heterotroacuteficos (CHEN 1997)
27
Os fotobiorreatores abertos possuem certas desvantagens sobre os
fotobiorreatores fechados dentre elas destacam-se menor eficiecircncia fotossinteacutetica e
menor qualidade do produto da microalga (RICHMOND et al 1990 VONSHAK
RICHOMOND 1988) A menor eficiecircncia fotossinteacutetica eacute principalmente devido ao
efeito de sombreamento quando a densidade celular alcanccedila um determinado valor
a baixa eficiecircncia de utilizaccedilatildeo de CO2 gasoso devido agrave limitaccedilatildeo do suplemento de
CO2 para a microalga uma vez que quando o CO2 natildeo estaacute dissolvido no meio de
cultura este se volatiliza contaminaccedilatildeo do cultivo por bacteacuterias algas protozoaacuterios
e fungos tambeacutem influenciam no crescimento da microalga e na qualidade do
produto Os fotobiorreatores fechados tecircm a vantagem de aumentar a eficiecircncia de
utilizaccedilatildeo de CO2 controlando o pH da cultura e diminuir o niacutevel de contaminantes
(WATANABE HALL 1996) Tambeacutem dependendo da configuraccedilatildeo do reator pode
aumentar a aacuterea iluminada reduzindo o efeito de sombreamento (WATANABE et al
1995)
Fotobiorreatores fechados satildeo usados para cultivos de micro-organismos
fotoautotroacuteficos visando agrave produccedilatildeo de aacutecidos graxos poliinsaturados pigmentos
vitaminas e polissacariacutedeos (MOLINA GRIMA et al 1995 TAKANO et al 1995
MERCHUK et al 1996 MATSUNAGA et al 1996) Para muitas dessas aplicaccedilotildees
eacute essencial o uso desses tipos de fotobiorreatores nos quais as monoculturas
podem ser mantidas por longos periacuteodos preferencialmente se o cultivo for
ldquooutdoorrdquo utilizando luz solar como a uacutenica fonte de energia (JANSSEN et al 2003)
Diversas configuraccedilotildees de fotobiorreatores fechados tecircm sido usadas ou
propostas para o cultivo de Spirulina sp como o tubular horizontal (CONVERTI et
al 2006a) tubular helicoidal (BIOCOIL) (WATANABE et al 1995 NERANTZIS et
al 2002) espiralado vertical (TREDICI ZITTELLI 1998) e laminar inclinado (HU et
al 1996) Quase todas as configuraccedilotildees dos fotobiorreatores usam um recipiente
de degassing para desoxigenar o sistema pois um aumento no niacutevel de oxigecircnio no
meio reduz a produtividade (NERANTZIS et al 2002)
Um fator importante para a configuraccedilatildeo desses fotobiorreatores eacute o
fornecimento de luz eficientemente pela maximizaccedilatildeo da relaccedilatildeo superfiacutecie-volume
iluminada Por isso os tubos satildeo frequentemente estreitos e os ldquopanelsrdquo satildeo finos
No entanto alguns fotobiorreatores bem sucedidos em escala laboratorial podem
natildeo funcionar bem quando se aumenta a escala por causa da reduccedilatildeo da relaccedilatildeo
28
superfiacutecie-volume ocasionando uma pobre distribuiccedilatildeo luminosa dentro do reator
(OGBONNA TANAKA 1997)
Tredici e Zittelli (1998) observaram que cultivos de Arthrospira (Spirulina)
platensis em fotobiorreator tubular obtiveram maiores valores de produtividade
volumeacutetrica eficiecircncia fotossinteacutetica e velocidade especiacutefica de crescimento quando
comparadas com os cultivos em fotobiorreator plano Isso foi devido agrave diferenccedila
entre o fluxo de foacutetons nos cultivos com formas diferentes dos fotobiorreatores Uma
vez que os outros principais paracircmetros que conduzem o crescimento da S
platensis natildeo variaram entre os dois cultivos
Entre os diferentes tipos de fotobiorreatores aqueles do tipo air lift satildeo
particularmente interessantes por apresentarem uma maior transferecircncia de massa
liacutequido-gaacutes com menor gasto de energia podem ter o escoamento do liacutequido
facilmente controlado a circulaccedilatildeo de liacutequidos ocorre sem a remoccedilatildeo de partes do
reator e isto previne a contaminaccedilatildeo no cultivo Estes tipos de reatores satildeo
especialmente recomendados para as culturas de cianobacteacuterias por causa da
sensibilidade destas ao estresse de cisalhamento mecacircnico (CHOI et al 1995
SIEGEL ROBINSON et al 1992 CHISTI 1989 MERCHUK et al 1996
WATANABE et al 1995)
O sistema air lift tambeacutem permite a remoccedilatildeo de oxigecircnio produzido pela
fotossiacutentese (CAMACHO RUBIO et al 1998) A remoccedilatildeo contiacutenua do gaacutes oxigecircnio
em cultivos fotossinteacuteticos eacute essencial por que uma excessiva quantidade de
oxigecircnio dissolvido inibe a fotossiacutentese (MOLINA et al 2001)
O crescimento e a produtividade das ceacutelulas fotossinteacuteticas satildeo afetados por
diversos fatores incluindo composiccedilatildeo do meio de cultura temperatura pH
concentraccedilatildeo de O2 e CO2 no reator e fornecimento de luz sendo este o mais
importante durante o cultivo autotroacutefico de ceacutelulas fotossinteacuteticas (OGBONNA
TANAKA 1997)
Micro-organismos natildeo satildeo expostos a uma densidade de fluxo de foacutetons
constante em fotobiorreatores devido ao sombreamento muacutetuo das ceacutelulas e ao
movimento do liacutequido durante a agitaccedilatildeo Frequumlentemente tem sido sugerido que a
circulaccedilatildeo entre as zonas clara e escura poderia conduzir a uma eficiecircncia
fotossinteacutetica maior que aquela determinada sob iluminaccedilatildeo contiacutenua da densidade
de fluxo de foacutetons (JANSSEN et al 2003)
29
O fornecimento da luz em fotobiorreatores eacute uma variaacutevel importante em
culturas fotoautroacuteficas A alta razatildeo superfiacutecie-volume eacute um preacute-requisito importante
para o suprimento suficiente de luz nos fotobiorreatores Ateacute mesmo sob baixa
intensidade luminosa os organismos fotossintetizantes utilizam a luz exposta na
superfiacutecie dos fotobioreatores A energia de excitaccedilatildeo eacute parcialmente utilizada pelo
aparato fotossinteacutetico e a energia residual eacute perdida na forma teacutermica ou
fluorescecircncia (GRUSZECKI et al 1994) Um excesso da energia de excitaccedilatildeo pode
prejudicar o aparato fotossinteacutetico no processo chamado de fotoinibiccedilatildeo (MELIS
1999)
Dependendo do diacircmetro interno dos tubos (12 a 123 cm) os fotobiorreatores
tubulares fechados podem alcanccedilar valores de concentraccedilatildeo celular maiores que 20
g L-1 e produtividades volumeacutetricas de biomassa de 025 - 364 g L-1d-1 em cultivo
que possuem o ciclo claroescuro A alta turbulecircncia encontrada em reatores
tubulares garante uma oacutetima disponibilidade luminosa para as ceacutelulas e melhor
transferecircncia de massa dos gases (LEE 2001)
Outro fator importante eacute o escoamento turbulento da cultura A velocidade do
escoamento do liacutequido deve ser suficiente para garantir o escoamento turbulento
para evitar que as ceacutelulas fiquem estagnadas no interior escuro dos tubos Portanto
uma turbulecircncia execessiva pode danificar as ceacutelulas e haacute um limite superior para a
velocidade da cultura A turbulecircncia eacute conhecida por aumentar a produtividade da
biomassa quando comparada as condiccedilotildees de escoamento laminar A turbulecircncia
move as ceacutelulas do interior escuro de um tubo para uma zona perifeacuterica iluminada
evitando que as ceacutelulas natildeo recebam luz por longos periacuteodos Adicionalmente o
movimento das ceacutelulas da zona clara para a zona escura pode aumentar a
produtividade desde que a duraccedilatildeo de permanecircncia na zona escura seja curta
Intervalos no escuro na ordem de 1 segundo podem melhorar a conversatildeo da
energia solar em biomassa (LAWS et al 1987 TERRY 1986) Tais intervalos
permitem reaccedilotildees cataliacuteticas da fotossiacutentese no escuro permitindo o
restabelecimento do aparato fotossinteacutetico para sua eficiecircncia no proacuteximo periacuteodo
luminoso (ACIEacuteN FERNAacuteNDEZ et al 2001) Jansen et al (2002) relataram que a
turbulecircncia movimenta as ceacutelulas da zona escura no centro do fotobiorreator para a
zona foacutetica na parte mais externa do cilindro podendo conduzir a maior eficiecircncia do
reator
30
O fluxo laminar pode ser prejudicial agraves altas densidades celulares No entanto
eacute importante por proporcionar uma distribuiccedilatildeo uniforme da luz a todas as ceacutelulas na
cultura reduzir o crescimento da parede do fotobiorreator e diminuir a tensatildeo do
oxigecircnio na cultura (RICHMOND 2000) Carlozzi e Torzillo (1996) obtiveram maior
produtividade da Arthrospira platensis quando a velocidade da cultura densa (10 g L-1)
foi alterada de 018 m s-1 para 075 m s-1 Isto torna evidente a necessidade de se
manter uma velocidade de escoamento que permita um maior nuacutemero de ceacutelulas
captarem luminosidade suficiente e que ao mesmo tempo natildeo aumente a demanda
dos custos de produccedilatildeo
Converti et al (2006) observaram que cultivos de Arthrospira platensis em
fotobiorreator tubular a velocidade da cultura de 016 m s-1 eacute suficiente para garantir
uma boa mistura da cultura evitando danos agraves ceacutelulas Similarmente Tredici (1999)
descreve que cultivos em escala industrial de Arthrospira sp em fotobiorreator com
tubos plaacutesticos alongados sobre a terra com 35 cm de largura e 9 cm de altura a
densidade populacional oacutetima foi de 1 g Lminus1 e a velocidade do fluxo natildeo pode ser
menor que 50 cm sminus1 Baixa velocidade de circulaccedilatildeo 6 a 10 cm sminus1 prejudicou o
cultivo devido a produccedilatildeo O2 que inibiu o crescimento baixas taxas de saiacuteda e a
cultura deteriorou-se rapidamente devido ao seu crescimento na parede do tubo
(biofouling)
Como o crescimento dos micro-organismo fotossintetizantes nos
fotobiorreatores eacute fotossinteacutetico o suplemento de luz e CO2 satildeo provavelmente os
limitantes para o crescimento da microalga Aleacutem desses fatores a concentraccedilatildeo de
nitrogecircnio tambeacutem eacute um fator determinante no cultivo uma vez que este nutriente eacute
utilizado principalmente para constituir proteiacutenas e aacutecidos nucleacuteicos fundamentais
para a manutenccedilatildeo e crescimento celular (WATANABE HALL 1996)
No caso de fontes de nitrogecircnio amocircniacais o emprego dos reatores tubulares
pode ser considerado como uma vantagem por favorecer baixa perda de amocircnia
por volatilizaccedilatildeo reduzindo a necessidade de adiccedilatildeo de fonte de nitrogecircnio como
consequumlente reduccedilatildeo do custo de produccedilatildeo Assim pode-se concluir que os
esforccedilos em melhoria de condiccedilotildees de cultivo de A platensis natildeo sejam apenas
utilizando reatores abertos mas tambeacutem reatores fechados dentre os quais os
tubulares
31
23 Processos de cultivo em fotobiorreatores
S platensis habita naturalmente em lagos africanos e mexicanos (RICHMOND
1990) mas podem crescer artificialmente em meios sinteacuteticos empregando
diferentes tipos de processos de cultivo Estes tecircm sido desenvolvidos com a
finalidade de aumentar a produtividade do material desejado Segundo Sassano
(1999) a forma de adiccedilatildeo do substrato nas dornas pode interferir na qualidade da
biomassa produzida
No processo contiacutenuo eacute realizado por meio de uma alimentaccedilatildeo contiacutenua do
substrato limitante (ou meio de cultura) ao reator a uma determinada vazatildeo
constante e por uma retirada contiacutenua de meio cultivado de forma a se ter o volume
de reaccedilatildeo constante a fim de que o sistema atinja a condiccedilatildeo de estado
estacionaacuterio (steady-state) Esse estado consiste na situaccedilatildeo nas quais todas as
condiccedilotildees no interior do reator permanecem constantes ao longo do tempo
(FACCIOTTI 2001) Esse processo tem sido estudado por diferentes autores
comprovando sua aplicabilidade para no cultivo de Spirulina platensis Hirata et al
(1998) obtiveram concentraccedilotildees de S platensis sob condiccedilotildees fotoautotroacuteficas em
regime permanente nas diferentes intensidades luminosas analisadas 25 a 400 W
m-2 Nerantzis et al (2002) empregou o sistema contiacutenuo no fotobiorreator tubular
helicoidal (HELPBR) no cultivo de S platensis e provou sua flexibilidade ao aumento
de escala bem como sua alta produtividade volumeacutetrica em relaccedilatildeo a outros
fotobiorreatores fechados
Outro tipo de processo que tem sido utilizado no cultivo de S platensis em
fotobiorreatores eacute o semicontiacutenuo Esse processo consiste na alimentaccedilatildeo contiacutenua
do substrato limitante mas a remoccedilatildeo do produto eacute por bateladas (alimentaccedilatildeo
contiacutenua com descarga apoacutes a obtenccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular maacutexima desejada)
(BORZANI 2001) Travieso et al (2001) utilizando fotobiorreator tubular helicoidal
concluiacuteram que eacute possiacutevel empregar satisfatoriamente o sistema semicontiacutenuo no
cultivo de S platensis obtendo uma produtividade da biomassa maior que em
processos descontiacutenuo Isso por que em processo descontiacutenuo a produtividade em
ceacutelulas tende a diminuir quando os nutrientes satildeo totalmente consumidos De acordo
com Reichert et al (2006) a concentraccedilatildeo celular pode atingir valores de duas a
quatro vezes maiores no cultivo semicontiacutenuo de S platensis em relaccedilatildeo ao cultivo
descontiacutenuo utilizando fotobiorreator fechado
32
No processo descontiacutenuo todo o substrato eacute adicionado no iniacutecio do cultivo e
os produtos permanecem ateacute o final do cultivo (CARVALHO SATO 2001) No
processo descontiacutenuo alimentado que eacute uma variaccedilatildeo do processo descontiacutenuo a
alimentaccedilatildeo pode ser de forma intermitente ou contiacutenua O modo de operaccedilatildeo da
alimentaccedilatildeo em bioprocessos permite prevenir o acuacutemulo ou a falta do substrato no
cultivo Em processo microbiano uma apropriada taxa de alimentaccedilatildeo
exponencialmente crescente resulta na manutenccedilatildeo da concentraccedilatildeo do substrato
limitante residual controlando a taxa de formaccedilatildeo do produto (CARVALHO SATO
2001) Esse processo permite que o nutriente seja adicionado em determinados
intervalos de tempo durante todo o processo com isso eacute possiacutevel adicionar
nutrientes potencialmente toacutexicos quando presentes em altas concentraccedilotildees como
por exemplo o iacuteon amocircnio sem prejudicar o crescimento microbiano e prevenindo
seu acuacutemulo (CARVALHO et al 2004) Olguiacuten et al (2001) observaram que no
cultivo descontiacutenuo usando uma concentraccedilatildeo inicial de amocircnia de 1 mM incubada
a 32 ordmC ocorre uma grande perda desse iacuteon para a atmosfera aleacutem de ser
consumida pelo micro-organismo tornando-se deficiente depois de poucos dias
especificamente 12 dias Soletto et al (2005) observaram que o melhor crescimento
cineacutetico da S platensis foi empregando o processo descontiacutenuo alimentado quando
comparada com o processo descontiacutenuo utilizando a ureacuteia com fonte de nitrogecircnio
Comportamento semelhante foi observado por Zhang et al (1998) em cultivos
mixotroacuteficos de S platensis utilizando NaNO3 como fonte de nitrogecircnio
Costa et al (2004) observaram o emprego da aacutegua do lago Mangueira
suplementado com ureacuteia pelo processo descontiacutenuo alimentado no cultivo de S
platensis foi possiacutevel reduzir o custo de produccedilatildeo possibilitando o cultivo em larga
escala
Em casos particulares como por exemplo a necessidade de utilizaccedilatildeo de
nutriente viscoso no cultivo este processo geralmente reduz a viscosidade do meio
e o efeito dos componentes toacutexicos eacute tambeacutem limitado pela diluiccedilatildeo (WARD 1989)
Entre outras vantagens desse processo pode-se encontrar desvio do metabolismo
celular para via de interesse de formaccedilatildeo do produto evita repressatildeo cataboacutelica
evita formaccedilatildeo de produtos toacutexicos no metabolismo microbiano e controla a
velocidade de crescimento microbiano O melhor procedimento operacional para
esse sistema eacute iniciar com pequena quantidade de biomassa e substrato e adicionar
33
mais substrato quando a maior parte do substrato inicial ter sido consumida pelo
micro-organismo (GREGERSEN JORGENSEN 1999)
O processo descontiacutenuo alimentado deve ser usado para melhorar a densidade
celular no crescimento da S platensis desde que a concentraccedilatildeo do substrato
limitante possa ser adicionada ateacute alcanccedilar a produccedilatildeo maacutexima de biomassa sem
resultar na inibiccedilatildeo do crescimento
24 Nutrientes para o crescimento da A platensis
241 Fontes de Nitrogecircnio
O elemento nitrogecircnio constitui aproximadamente de 5 a 10 do peso seco das
cianobacteacuterias (FLORES HERRERO 1994) Diferentes fontes de nitrogecircnio
orgacircnica e inorgacircnica podem ser assimiladas por micro-organismos
fotossintetizantes Dentre as orgacircnicas encontramos aminoaacutecidos purinas ornitina
e as inorgacircnicas encontramos sais de amocircnio e sais de nitrato (BERMAN CHAVA
1999)
As cianobacteacuterias utilizam principalmente fontes de nitrogecircnio inorgacircnico como
nitrato nitrito amocircnia e nitrogecircnio atmosfeacuterico para suprir sua necessidade No
entanto amocircnia eacute a uacutenica fonte inorgacircnica de nitrogecircnio que eacute diretamente
incorporada em compostos orgacircnicos e entatildeo um intermediaacuterio obrigatoacuterio na
utilizaccedilatildeo do outras fontes de nitrogecircnio Essa moleacutecula eacute tambeacutem conhecida como
uma desacopladora na fotossiacutentese causando sob certas circunstacircncias o colapso
do ΔpH requerida pela siacutentese de ATP A amocircnia regula enzimas importantes no
metabolismo de nitrogecircnio tais como nitrato redutase glutamina sintetase e
nitrogenases (BOUSSIBA 1997)
Exceto para o N2 as cianobacteacuterias possuem um sistema de transporte
especiacutefico para as diferentes formas de nitrogecircnio mas a maioria deles pode entrar
na ceacutelula por difusatildeo dependendo de sua concentraccedilatildeo oue do pH do meio de
cultura Nitrato e nitrito satildeo reduzidos pela nitrato redutase e nitrito redutase
respectivamente ambas as enzimas usam ferredoxina como doador de eleacutetrons
(FLORES HERRERO 1994) Ureacuteia eacute convertida a amocircnia pela urease e o
dinitrogecircnio eacute reduzido agrave amocircnia pelo complexo nitrogenase (HERRERO et al
2001) Outras formas de nitrogecircnio como certos aminoaacutecidos requerem sistemas de
34
transporte especiacutefico e posteriormente seratildeo metabolizados para produzir amocircnio
(HERRERO et al 2001 MURO-PASTOR FLORENCO 2003)
Nesses organismos a hierarquia de preferecircncia da assimilaccedilatildeo tem sido
mostrada para esses compostos Quando amocircnio e nitrato estatildeo presentes
simultaneamente no meio externo o sistema para assimilaccedilatildeo de nitrato eacute expresso
somente ao niacutevel basal A inibiccedilatildeo da assimilaccedilatildeo do nitrato exercida pela amocircnia
opera em dois niacuteveis diferentes pelo menos Durante pouco tempo a adiccedilatildeo da
amocircnia interrompe a assimilaccedilatildeo ativa do nitrato pelas ceacutelulas Se as ceacutelulas
continuarem expostas ao amocircnio ateacute mesmo quando o nitrato estaacute
simultaneamente presente a longo prazo o sistema regulatoacuterio atua na repressatildeo
das proteiacutenas envolvendo a assimilaccedilatildeo do nitrato (HERRERO FLORES 1997) A
atividade da nitrato redutase em Spirulina platensis (strain ARM 729) eacute reduzida
mediante a retirada de nitrato do meio e eacute totalmente restaurada apoacutes duas horas
da adiccedilatildeo de nitrato indicando a induccedilatildeo pelo substrato A concentraccedilatildeo oacutetima de
nitrato de soacutedio necessaacuteria para a atividade maacutexima da enzima nitrato redutase eacute de
30 mM Os produtos da assimilaccedilatildeo do nitrato nitrito e amocircnio inibiram
significativamente a atividade da nitrato redutase quando em altas concentraccedilotildees A
acumulaccedilatildeo do nitrito eacute toacutexica para a ceacutelula mas seu niacutevel pode ser controlado tanto
pela inibiccedilatildeo da atividade da nitrato redutase eou transporte do nitrato ou pelo
aumento da atividade da nitrito redutase (JHA et al 2007)
Em cultivos de micro-organismo em larga escala a fonte de nitrogecircnio
preferencial eacute a amocircnia devido ao seu baixo custo e tambeacutem porque ela pode
previnir a contaminaccedilatildeo com zooplancton (BOUSSIBA 1997) A preponderacircncia de
NH3 sobre NH4+ em valores de pH acima de 92 o pKa para amocircnia a 20-30 ordmC
favoreceu a permeabilidade desta pela membrana plasmaacutetica forma natildeo ionizada
que apoacutes difundir pela membrana plasmaacutetica a amocircnia eacute aprisionada dentro da
ceacutelula na forma de iacuteon amocircnio carregado positivamente (BOUSSIBA 1997) O grau
de inibiccedilatildeo parece ser muito reduzido em cepas que crescem restritamente em
condiccedilotildees alcalinas 5 mM de amocircnia inibiu 90 a evoluccedilatildeo de O2 dependente de
luz em micro-organismo neutrofiacutelico Anabaena sp e somente 30 foi observada
em micro-organismo alcalofiacutelico Spirulina platensis no mesmo pH (pH 100) Em
concentraccedilatildeo de 10 mM Spirulina platensis obteve ainda 50 da capacidade
fotossinteacutetica e Anabaena sp natildeo obteve crescimento Essa resistecircncia da Spirulina
agrave amocircnia em pH 10 eacute conferida por um pH intratilacoidal relativamente alto no
35
valor de 65 em relaccedilatildeo ao pH intratilacoidal da Anabaena sp valor de pH de 53
Esta diferenccedila no valor do pH intratilacoidal sugere que menor eacute a ΔpH atraveacutes da
membrana que eacute a razatildeo para a resistecircncia relativa da Spirulina platensis a amocircnia
em pH 100 (BELKIN BOUSSIBA 1991a)
A adiccedilatildeo de 2-3 mM de amocircnia em cultivos de Spirulina mantida geralmente a
pH (95 - 100) causa a deterioraccedilatildeo do contamitante Chlorella no cultivo de
Spirulina A toxidade da amocircnia nas ceacutelulas da Chlorella eacute causada pela grande
entrada dessa moleacutecula devido ao menor pH interno reduzindo a variaccedilatildeo do pH na
membrana tilacoidal requerida para a siacutentese de ATP Logo o uso de amocircnia com
fonte de nitrogecircnio no cultivo de Spirulina pode previnir a proliferaccedilatildeo de outros
micro-organismos (BOUSSIBA 1997)
Ureacuteia e aminoaacutecidos tambeacutem podem ser assimilados pelas cianobacteacuterias A
ureacuteia e fontes de nitrogecircnio orgacircnico satildeo primeiramente metabolizadas para amocircnia
e a partir de entatildeo os aacutetomos de nitrogecircnio seratildeo utilizados como observado na
Figura 2 (FLORES HERRERO 1994)
Figura 2 Principais rotas de assimilaccedilatildeo de nitrogecircnio em cianobacteacuterias cultivas em pH acima de 92
A maioria dos organismos fotossintetizantes a assimilaccedilatildeo da amocircnia ocorre
pela accedilatildeo sequumlencial da glutamina sintetase (GS) e glutamanto sintase (GOGAT)
Ureacuteia
NO3-
aminoaacutecido
NH3
aminoaacutecido
Ureacuteia
NO3-
NH4+
Nucleotiacutedeos
Aminoaacutecidos
Aminoaccediluacutecar
Lipiacutedios
NH4+
Aacutecidos nucleacuteicos
Parede celular
Porfirinas
Proteiacutenas
Intracelular Exracelular
36
Essas reaccedilotildees conhecidas como ciclo GS-GOGAT constituem uma ligaccedilatildeo entre o
metabolismo de nitrogecircnio e de carbono e eacute o metabolismo mais importante para
assimilaccedilatildeo da amocircnia gerada tanto exogenamente como endogenamente
(BOUSSIBA 1997)
As enzimas do ciclo da glutamina sintetase e glutamato sintase satildeo importantes
pela introduccedilatildeo da amocircnia em formas orgacircnicas O glutamato produzido por esta
via aleacutem de ser o principal doador de nitrogecircnio para a siacutentese de outros
metaboacutelitos contendo nitrogecircnio eacute tambeacutem um precursor de alguns aminoaacutecidos e
da 5-aminolevulinato um precursor da biossiacutentese da porfirina ficobilina e clorofila
(FLORES HERRERO 1994)
A parede celular das cianobacteacuterias eacute como as das bacteacuterias gram-negativas
que conteacutem uma camada de peptidoglicano na parte externa da membrana
citoplasmaacutetica Nesta membrana conteacutem tipos de proteiacutenas especiais denominadas
de porinas a qual permite a passagem de pequenas moleacuteculas incluindo
aminoaacutecidos e iacuteons inorgacircnicos Isto eacute essas substacircncias apresentam um sistema
de transporte especializado (FLORES HERRERO 1994) A membrana
citoplasmaacutetica representa a principal barreira de permeabilidade das cianobacteacuterias
Portanto o nitrato provavelmente possui livre acesso ao periplasma das
cianobacteacuterias (HERRERO FLORES 1997)
Algumas cianobacteacuterias como Anabaena Nostoc Fischerella satildeo capazes de
fixar N2 atmosfeacuterico em condiccedilotildees aeroacutebias atraveacutes das nitrogenases (FLORES
HERRERO 1994) No entanto as ceacutelulas de S platensis natildeo podem fixar nitrogecircnio
atmosfeacuterico porque natildeo possuem heterocisto (MATA 2007 VACHHANI VONSHAK
1997) e eacute dentro dos heterocistos onde se encontram as nitrogenases em
cianobacteacuterias (LARA GUERRERO 2007)
O nitrato eacute provavelmente a fonte mais abundante de nitrogecircnio para a nutriccedilatildeo
de cianobacteacuterias A assimilaccedilatildeo do nitrato envolve a incorporaccedilatildeo do nitrato e
reduccedilatildeo do nitrato intracelular para amocircnio na qual eacute a forma de nitrogecircnio
incorporada em compostos orgacircnicos Nitrito na qual pode tambeacutem ser utilizado na
necessidade do nitrogecircnio eacute assimilado pelas ceacutelulas e entatildeo reduzido a amocircnio
(FLORES HERRERO 1994)
A assimilaccedilatildeo do nitrato pelas cianobacteacuterias envolve um sistema de transporte
que eacute carreado por uma proteiacutena e esta possui uma alta afinidade pelo nitrato Esta
alta afinidade permite que as cianobacteacuterias utilizem nitratos mesmo em baixas
37
concentraccedilotildees como eacute encontrado no meio ambiente natural O acuacutemulo intracelular
de nitrato permitiraacute o funcionamento da enzima nitrato redutase (FLORES
HERRERO 1994) Portanto a limitaccedilatildeo do transporte de nitrato pela inativaccedilatildeo de
alguns genes do transporte de nitrato natildeo impede o crescimento dependente de
nitrato quando este eacute suplementado a alta concentraccedilatildeo (20 mM) A entrada do
nitrato nas ceacutelulas nessas condiccedilotildees parece ser por difusatildeo passiva desde que a
concentraccedilatildeo de nitrato seja maior que 1 mM a assimilaccedilatildeo de nitrato aumenta
linearmente com o aumento da sua concentraccedilatildeo (OMATA et al 1989)
O nitrato intracelular eacute reduzido a nitrito em reaccedilatildeo utilizando 2 eleacutetrons
catalizados pela nitrato redutase o nitrito eacute convertido a amocircnio pela nitrito redutase
na reaccedilatildeo utilizando 6 eleacutetrons Ambas as enzimas encontradas nas membranas
tilacoidais utilizam ferrodoxina reduzida como doador de eleacutetrons A presenccedila de
nitrato ou nitrito geralmente tem um efeito positivo nos niacuteveis das enzimas nitrato
redutase e nitrito redutase (FLORES HERRERO 1994) Estas enzimas encontram-
se principalmente no citoplasma das cianobacteacuterias (GUERRERO LARA 1987) A
assimilaccedilatildeo do nitrato envolve a reduccedilatildeo citoplasmaacutetica para nitrito (NO2-)
catalizada pela enzima nitrato redutase (NR) usando NAD(P)H como doador de
eleacutetrons O nitrito eacute rapidamente reduzido a amocircnio (NH4+) pela enzima nitrito
redutase (NiR) que usa a ferrodoxina como doador de eleacutetrons e o amocircnio eacute entatildeo
incorporado a moleacuteculas de nitrogecircnio como aminoaacutecidos purinas pirimidinas e
aminas (LEA LEEGOOD 1993)
Quando somente o CO2 eacute o aceptor de eleacutetrons disponiacutevel e o escoamento de
eleacutetrons pelos fotossistemas natildeo eacute limitado pela luz o que determina a fotossiacutentese
eacute a fixaccedilatildeo de CO2 pelo ciclo das pentoses Quando se adiciona nitrato nessas
mesmas condiccedilotildees este usa os eleacutetrons diretamente da ferrodoxina reduzida
liberando o escoamento dos eleacutetrons natildeo ciacuteclico de sua limitaccedilatildeo e estimulando a
produccedilatildeo de O2 Esse efeito natildeo foi observado quando se adiciona amocircnio Na
intensidade luminosa saturante o nitrato estimula o fluxo de eleacutetrons natildeo ciacuteclico para
gerar um poder redutor utilizado para sua assimilaccedilatildeo No entanto a intensidade de
luz limitante o nitrato reprime a fixaccedilatildeo de CO2 para utilizar o poder redutor gerado
fotossinteticamente na sua reduccedilatildeo a amocircnia (ROMERO LARA 1987)
A nitrato redutase e nitrito redutase presentes na membrana tilacoidal permitem
a fotoreduccedilatildeo do nitrato ou nitrito em uma reaccedilatildeo dependente do fotossistema I na
qual eacute estimulada pela ferrodoxina Nos tilacoacuteides do Synechococcus a fotoreduccedilatildeo
38
do nitrato a amocircnio utiliza aacutegua como fonte de eleacutetrons foi observado na reaccedilatildeo
envolvendo ambos fotossistema I e fotossistema II Em condiccedilotildees heterotroacuteficas a
reduccedilatildeo do nitrato ocorre pela ferrodoxina reduzida produzida a partir do NADPH e
ferrodoxina-NADP oxiredutase NAPDH eacute provavelmente gerado pela glicose-6-
fosfato desidrogenase e 6-fosfogluconato desidrogenase (HERRERO FLORES
1997)
A assimilaccedilatildeo de amocircnio nas cianobacteacuterias pode ser pela difusatildeo de sua
forma gasosa (amocircnia) ou pela accedilatildeo de permeases especiacuteficas e eacute diretamente
incorporado no metabolismo GS-GOGAT (GS glutamina sintetase GOGAT
glutamate sintase) (MURO-PASTOR FLORENCIO 2003)
A ureacuteia eacute uma boa fonte de nitrogecircnio para cianobacteacuterias pertencentes a
diferentes grupos taxonocircmicos Esta parece ser assimilada intacta pelas ceacutelulas
ativas e entatildeo metabolizada intracelularmente (FLORES HERRERO 1994) Embora
o metabolismo assimilatoacuterio do nitrogecircnio tenha sido amplamente investigado
(FLORES HERRERO 1994) informaccedilatildeo sobre a assimilaccedilatildeo da ureacuteia eacute escassa e
a maioria relata sobre o uso da urease (RAI SINGH et al 1987 RAI 1989
PALINSKA et al 2000) A ureacuteia intracelular eacute degradada pela enzima urease
liberando uma moleacutecula de dioacutexido de carbono e duas moleacuteculas de amocircnia
Embora algumas leveduras e algas degradem a ureacuteia pela ureacuteia amidoliase
dependente de ATP e biotina a maioria dos micro-organismos usa a ureacuteia
amidohidrolase dependente de Ni+2 (VALLADARES et al 2002) Essa enzima
possui um Km para ureacuteia geralmente acima de 1 mM (MOBLEY HAUSINGER
1989) Valladares et al (2002) tem demonstrado que algumas cianobacteacuterias como
Synechocystis sp PCC 6803 e Anabaena sp PCC 7120 possuem um transportador
de ureacuteia denominado ABC tipo permease (ABC-type permease) essencial para a
assimilaccedilatildeo da ureacuteia
A atividade da urease em cianobacteacuterias Synechococcus sp eacute geralmente
maior em ceacutelulas rompidas em relaccedilatildeo as ceacutelulas intactas sugerindo que a urease
estaacute localizada intracelularmente no citoplasma (COLLIER et al 1999) A produccedilatildeo
da urease requer Ni+2 no meio de crescimento e tem sido purificada a partir da
Spirulina maxima (CARVAJAL et al 1982)
Em geral haacute dois principais metabolismos para que o amocircnio seja incorporado
em constituintes orgacircnicos nas ceacutelulas O primeiro eacute a incorporaccedilatildeo direta do
amocircnio incorporado do meio para produccedilatildeo do glutamato pela aminaccedilatildeo do 2-
39
oxoglutarato (-cetoglutarato) pela glutamato desidrogenase seguindo pela
aminaccedilatildeo do glutamato pela glutamina sintetase
(1)
No segundo duas moleacuteculas de glutamato satildeo produzidas na reaccedilatildeo de
transaminaccedilatildeo A amocircnia eacute incorporada ao glutamato originando a glutamina na
qual transfere seu grupo amino para 2-oxoglutarato (-cetoglutarato) pela glutamato
sintase ou glutamato-2-oxoglutarato aminotransferase este eacute o ciclo de reaccedilotildees
catalisadas pelo glutamato sintase e glutamina sintetase sendo esta a via mais
comum de assimilaccedilatildeo de amocircnio em cianobacteacuterias independente da fonte de
nitrogecircnio utilizada (FLORES HERRERO 1994)
(2)
Eacute evidente que na assimilaccedilatildeo de algumas formas de nitrogecircnio inorgacircnico
pelas enzimas GSGOGAT um requerimento obrigatoacuterio do esqueleto de carbono
principalmente cetoaacutecidos conduziraacute um desvio do fluxo de carbono da biossiacutentese
de carboidrato para a biossiacutentese de aminoaacutecidos (LARA GUERRERO 1997)
proporcionando um aumento no fluxo de carbono atraveacutes da via glicoliacutetica e dos
aacutecidos tricarboxiacutelicos para a formaccedilatildeo do oxalacetato e do α-cetoglutarato bem
como estimula o turnover de aminoaacutecidos em ceacutelulas de Anacystis nidulans uma
2
+
+
40
vez que um aumento da incorporaccedilatildeo do carbono em aminoaacutecidos induzido pela
assimilaccedilatildeo de nitrogecircnio natildeo foi acompanhado por um aumento no pool de
aminoaacutecidos Esse desvio eacute mais evidente sob altas intensidades luminosas
(CORONIL et al 1993)
Nas ceacutelulas de Phormidium laminosum adaptada ao crescimento com nitrato ou
amocircnia como fonte de nitrogecircnio possuem de 65 a 90 de glutamato em relaccedilatildeo a
quantidade de aminoaacutecidos totais (porccedilatildeo molar) dependendo da fase de
crescimento Essa proporccedilatildeo pode variar se a fonte de nitrogecircnio no cultivo for
alterada Quando o iacuteon amocircnio foi adicionado no cultivo com nitrato o conteuacutedo de
glutamato diminui enquanto que a maioria dos outros aminoaacutecidos aumentou O
niacutevel intracelular da maioria dos aminoaacutecidos (especialmente aspartato e alanina)
aumenta indicando que a siacutentese de aminoaacutecido foi maior que sua incorporaccedilatildeo em
proteiacutenas e outros compostos (OCHOA de ALDA et al 1996)
O meio de cultura convencional para a obtenccedilatildeo da S platensis utiliza sais de
nitrato como fonte de nitrogecircnio como por exemplo nitrato de potaacutessio e nitrato de
soacutedio Fontes alternativas de nitrogecircnio como ureacuteia (DANESI et al 2002 SOLETTO
et al 2005) e sais de amocircnio (CARVALHO et al 2004 SOLETTO et al 2005)
estatildeo sendo pesquisadas com a finalidade de diminuir os custos na produccedilatildeo
industrial Ambos o tipo e a quantidade da fonte de nitrogecircnio no meio de cultura
influenciam no crescimento e composiccedilatildeo da biomassa (STANCA POPOVICI
1996)
Considerando a substituiccedilatildeo de KNO3 por ureacuteia verifica-se que eacute altamente
vantajosa pois o custo desta eacute muito menor que a de KNO3 e aleacutem disso a ureacuteia eacute
facilmente assimilada por S platensis provavelmente devido agrave sua hidroacutelise no meio
de cultivo com formaccedilatildeo de amocircnia seja devido agrave accedilatildeo da urease (CARVAJAL et
al 1982) seja devido agrave alcalinidade do meio de cultivo (DANESI et al 2002
RANGEL-YAGUI et al 2004)
Soletto et al (2005) comparando o crescimento da S platensis no processo
descontiacutenuo observaram que o uso de ureacuteia como fonte de nitrogecircnio proporcionou
uma maior concentraccedilatildeo celular quando comparado com o sulfato de amocircnio Nesse
mesmo trabalho observaram que o melhor crescimento cineacutetico da S platensis foi
utilizando o processo descontiacutenuo alimentado com ureacuteia quando comparada com o
nitrato de soacutedio Portanto o uso de ureacuteia como uma fonte de nitrogecircnio mais
econocircmica pode ser uma alternativa interessante no cultivo de S platensis
41
Bezerra et al (2008) observaram que o emprego do processo descontiacutenuo
alimentado utilizando cloreto de amocircnio como fonte de nitrogecircnio pode ser uma
alternativa viaacutevel para o cultivo de S platensis natildeo influenciam nos teores proteacuteicos
e lipiacutedicos da biomassa final
242 Intensidade luminosa
A intensidade luminosa eacute um importante fator que interfere no crescimento
dos micro-organismos fotossintetizantes A luz absorvida por pigmentos direciona o
transporte de eleacutetrons fotossinteacutetico na qual resulta na reduccedilatildeo do NADP+ e
formaccedilatildeo de ATP (YANG et al 2000)
A soma da luz absorvida pelas ceacutelulas no fotobiorreator depende de muitos
fatores incluindo posiccedilatildeo especiacutefica da ceacutelula num determinado instante densidade
da cultura e pigmentaccedilatildeo das ceacutelulas (RUBIO et al 2003)
Um dos modos de obtenccedilatildeo de energia para o metabolismo da S platensis eacute a
fotossiacutentese e para a sua realizaccedilatildeo eacute necessaacuterio aacutegua dioacutexido de carbono e luz
No processo fotossinteacutetico ocorre o fenocircmeno de captaccedilatildeo de luz e outro conhecido
como oxido-reduccedilatildeo (NELSON YOCUM 2006)
A absorccedilatildeo da luz na faixa de 400-700 nm por pigmentos fotossinteacuteticos
absorve a energia de um foacuteton de dado comprimento de onda e entatildeo utiliza essa
energia para iniciar uma cadeia de eventos da fase fotoquiacutemica da fotossiacutentese
Esses pigmentos tais como clorofila carotenoacuteides e bilinas estatildeo organizados em
complexos fotossinteacuteticos e tecircm a funccedilatildeo de antenas captadoras de luz Centenas
de pigmentos antenas funcionam juntos para direcionar o processo para as etapas
seguintes ou dissipam o excesso de energia para diferentes rotas (ADIR et al
2003)
A faixa do espectro de absorccedilatildeo que eacute utilizada pelos organismos
fotossintetizantes como fonte de energia para as suas atividades metaboacutelicas eacute
comumente chamada de Radiaccedilatildeo Fotossinteticamente Ativa (PAR do inglecircs
Photosynthetically Active Radiation) A Densidade de Fluxo de Foacutetons (PPFD do
inglecircs Photosynthetic Photon Flux Density) cuja unidade eacute micromol de foacutetons m-2 s-1
expressa a irradiacircncia nesta faixa do espectro
A fotossiacutentese oxigecircnica eacute catalizada por quatro complexos proteiacutenas-
membranas formadas pelo fotossistema II (FSII) citocromo bf fotossistema I (FSI) e
42
ATP sintetase Esses complexos estatildeo arranjados nas membranas tilacoacuteidais que
nas cianobacteacuterias distribuem-se de forma concecircntrica ou irregular no citossol
(NELSON YOCUM 2006)
Os fotossistemas satildeo os complexos responsaacuteveis pela conversatildeo da energia
luminosa em energia quiacutemica Nos organismos que realizam fotossiacutentese oxigecircnica
existem dois fotossistemas agindo em seacuterie o fotossistema I (FSI) e o fotossistema II
(FSII) O fotossistema II (FSII) eacute definido como aacutegua-plastoquinona oxidoredutase
pois catalisa a transferecircncia de eleacutetrons entre a aacutegua e a plastoquinona o complexo
citocromo b6f eacute definido como plastoquinonandashplastocianina oxidoredutase
fotossistema I (FSI) como uma plastocianinandashferredoxina oxidoredutase e a ATPase
ou ATP sintetase que funciona como uma forccedila proacuteton motriz que direciona a
siacutentese de ATP (NELSON YOCUM 2006) (Figura 3)
Figura 3 Complexos fotossinteacuteticos em membranas de tilacoacuteides Fonte httpwwwportalsaofranciscocombralfafotossintesehistorico-da-fotossintesephp
Os FSI e FSII contecircm clorofilas e outros pigmentos que absorve a energia
luminosa e as direcionam para o centro de reaccedilatildeo (RC) (Figura 4) O centro de
reaccedilatildeo fotossinteacutetico do FSI possui proteiacutenas com o centro contendo agregados de
Ferro-enxofre (Fe-S) como uacuteltimo aceptor de eleacutetrons e o FSII possui quinona como
uacuteltimo aceptor de eleacutetrons (HEATHCOTE et al 2003) A energia capturada pelo
centro de reaccedilatildeo induz a excitaccedilatildeo de um par especial de clorofila na qual inicia a
translocaccedilatildeo de um eleacutetron atraveacutes da membrana Aacutegua doadora de eleacutetrons para
esse processo eacute oxidada fotoquimicamente a O2 liberando 4 H+ e 4 eleacutetrons pelo
centro fotooxidativo do FSII (P680) Este eacute responsaacutevel pela conversatildeo da energia
luminosa em energia de oxido-reduccedilatildeo (McEVOY et al 2005)
43
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do fotossistema Adaptaccedilatildeo Fontehttpkentsimmonsuwinnipegcacm1504lightreacthtm
Os eleacutetrons extraiacutedos da aacutegua satildeo lanccedilados para quinona (PQ) formando
quinona reduzida (PQH2) (BARBER 2006) A quinona reduzida tambeacutem conhecida
como quinol pode se dissociar do centro de reaccedilatildeo e difundir ateacute o complexo
citocromo b6f O complexo citocromo b6f transfere eleacutetrons da quinona reduzida
(PQH2) ateacute a plastocianina que eacute uma proteiacutena perifeacuterica moacutevel que conteacutem cobre e
que tem como principal funccedilatildeo transferir eleacutetrons do citocromo b6f ateacute o P700 centro
de reaccedilatildeo do Fotossistema I Esse processo permite a transferecircncia de proacutetons da
face externa para a face interna da membrana tilacoidal e a criaccedilatildeo de gradiente
eletroquiacutemico de proacutetons atraveacutes da membrana Energia luminosa absorvida pelo
FSI (P700) induz a transferecircncia de eleacutetrons da plastocianina localizada na face
interna da membrana para a ferredoxina localizada na face externa (NELSON
BEN-SHEM 2002) Outra proteiacutena associada ao Fotossistema I eacute a flavoproteiacutena
ferredoxina-NADP oxidoredutase que reduz o NADP+ a NADPH2 completando a
sequumlecircncia do transporte natildeo-ciacuteclico de eleacutetrons que comeccedila com a oxidaccedilatildeo da
moleacutecula de aacutegua (NELSON YOCUM 2006) A reduccedilatildeo da ferredoxina eacute
subsequentemente usada em numerosas reaccedilotildees de siacutentese e ciclos regulatoacuterios
incluindo assimilaccedilatildeo de nitrato desnaturaccedilatildeo de aacutecido graxo e produccedilatildeo de
NADPH (McCARTY et al 2000 CHITNIS 2001) Essas reaccedilotildees soacute ocorrem na
presenccedila de luz Independentemente da presenccedila de luz a reduccedilatildeo do CO2 a
44
carboidratos ciclo de Calvin ocorre devido a presenccedila de ATP e NADPH (NELSON
YOCUM 2006)
A diferenccedila de carga entre FSI e o FSII juntamente com a transferecircncia de
eleacutetrons atraveacutes do complexo citocromo b6f induz a formaccedilatildeo de um potencial
eletroquiacutemico atraveacutes da membrana na qual potencializa a siacutentese de ATP por um
complexo de quatro proteiacutenas denominadas de ATPase (McCARTY et al 2000)
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da fase fotoquiacutemica Adaptado Fonte httpwwwuiceduclassesbiosbios100lecturesf04amlect10htm
O controle metaboacutelico do consumo de energia isto eacute a soma de energia
capturada pelo aparato fotossinteacutetico e estocada na forma de energia quiacutemica a
taxa de fixaccedilatildeo do carbono e a produccedilatildeo de biomassa eacute um processo mediado por
enzimas Isto implica que a taxa maacutexima do consumo de energia depende da
natureza do micro-organismo (RUBIO et al 2003) A reaccedilatildeo de captura de luz eacute
muito mais raacutepida que as reaccedilotildees subsequumlentes mediada por enzimas a taxa
maacutexima da fotossiacutentese deve ser controlada pela concentraccedilatildeo de uma das enzimas
do ciclo de Calvin (SUKENIK et al 1997 RUBIO et al 2003)
Alguns autores como Hirata et al (1998) e Chojnacka Noworyta (2004a)
identificaram regiotildees que correlacionam o crescimento da Arthrospira ssp e a
intensidade luminosa Essas regiotildees satildeo
Regiatildeo limitada por luz baixa intensidade luminosa onde ocorre um aumento
da concentraccedilatildeo celular com um aumento da intensidade luminosa
Regiatildeo saturada por luz alta intensidade luminosa onde o crescimento celular
independe da intensidade luminosa
Regiatildeo inibida por luz a intensidade luminosa eacute muito alta inibindo o
crescimento celular e ateacute mesmo pode provocar a morte celular
45
A intensidade luminosa eacute fundamental para que ocorra o metabolismo
fotossinteacutetico mas por outro lado altas intensidades luminosas podem danificar o
complexo fotossinteacutetico levando a morte celular Esse processo eacute denominado de
fotoinibiccedilatildeo (RUBIO et al 2003) O excesso de luz pode danificar o centro de
reaccedilatildeo dos fotossitemas II (SAMUELSSON 1985 LU VONSHAK 1999) eou
fotossistema I (SONOIKE 1996)
A fotoinibiccedilatildeo eacute um estado de estresse fisioloacutegico que ocorre em todos os
organismos fotossintetizantes envolvendo o oxigecircnio causado devido a um excesso
de iluminaccedilatildeo A danificaccedilatildeo ocorre primeiramente no centro de reaccedilatildeo do
fotossistemas II reduzindo abruptamente a eficiecircncia do transporte de eleacutetrons
fotossinteacutetico somente quando a taxa da danificaccedilatildeo excede ao do seu reparo na
qual requer o turnover da siacutentese das proteiacutenas do PSII A inibiccedilatildeo pela luz pode
envolver a participaccedilatildeo de todas as atividades realizadas pelo sistema fotossinteacutetico
tais como degradaccedilatildeo e substituiccedilatildeo dos componentes e organizaccedilatildeo da unidade
funcional (ADIR et al 2003)
A fotoinibiccedilatildeo ocorre quando o sistema antena absorve luz em excesso
danificando o sistema fotossinteacutetico O excesso de excitaccedilatildeo pode ser obtido por um
aumento da intensidade luminosa acima do niacutevel de saturaccedilatildeo da taxa fotossinteacutetica
(CHOJNACKA NOWORYTA 2004a) Portanto isso tambeacutem pode ocorrer em
condiccedilotildees moderadas de intensidade luminosa se as ceacutelulas adaptadas a baixa
intensidade luminosa forem transferidas a maiores intensidade luminosas (RUBIO et
al 2003) ou se taxa fotossinteacutetica estiver limitada por fatores de estresse como
baixas temperaturas (GOMBOS et al 1994) eou excesso de sal no meio (LU
ZHANG 2000) o que pode induzir a fotoinibiccedilatildeo em condiccedilotildees de luz moderada
(SAMUELSSON 1985)
A danificaccedilatildeo do fotossistema II consiste na inativaccedilatildeo dos sistemas que
envolvem oxigecircnio carreadores de eleacutetrons e proteiacutenas D1D2 (RUBIO et al 2003)
No FSI a inibiccedilatildeo eacute iniciada pela inativaccedilatildeo do aceptor de eleacutetrons seguindo com a
destruiccedilatildeo do centro de reaccedilatildeo e degradaccedilatildeo do produto do gen psaB que eacute uma
das duas maiores subunidades peptiacutedicas do complexo do centro de reaccedilatildeo do FSI
Baixas temperaturas e estresse oxidativos satildeo caracteriacutesticas requeridas para a
fotoinibiccedilatildeo do FSI in vivo (SONOIKE 1996)
Adir et al (2003) relataram que a fotoinibiccedilatildeo eacute observada tanto sob altas
intensidades luminosas quando o mecanismo de reparo de proteiacutenas atinge sua
46
capacidade maacutexima ou em baixa intensidade luminosa quando fatores externos
adicionais prejudicam seu reparo e a exposiccedilatildeo a alta intensidade luminosa
prolongada induz a um excesso de efeitos secundaacuterios que contribui para uma
reduccedilatildeo na capacidade fotossinteacutetica
Fatores como efeito sombreamento em culturas densas de ceacutelulas a remoccedilatildeo
de O2 e o aumento da concentraccedilatildeo de CO2 podem proteger os micro-organismos
contra o efeito fotooxidativo (ELOFF et al 1976)
Van Eykelenburg (1979) observou que a intensidade luminosa natildeo afeta as
caracteriacutesticas morfoloacutegicas como o tamanho da heacutelice e o diacircmetro da S platensis
e que a concentraccedilatildeo dos gracircnulos de poliglicano diminui com o aumento da
intensidade luminosa
Bezerra et al (2008) observaram que os teores de lipiacutedios e proteiacutenas obtidos
nas biomassas finais foram influenciados pela intensiade luminosa menores
intensidades luminosas conduziram a um aumento no conteuacutedo total de lipiacutedios e de
proteiacutenas
2421 Pigmentos
Para a energia luminosa ser utilizaacutevel pelos organismos fotossinteacuteticos ela
deve inicialmente ser absorvida por pigmentos especiacuteficos tais como clorofila
carotenoacuteides e ficobilinas Esses pigmentos encontram-se associados a proteiacutenas
nas lamelas fotossinteacuteticas formadas por tilacoacuteides Isso permite uma disposiccedilatildeo
espacial que torna muito eficiente a propagaccedilatildeo de energia absorvida (MARZOCCO
TORRES 1999)
Nas cianobacteacuterias tais como A platensis a fotossiacutentese ocorre principalmente
nas membranas tilacoidais onde estatildeo localizados os pigmentos fotossitneacuteticos
clorofila a carotenoacuteides e ficocianina (COGNO et al 2003) As lamelas tilacoidais
satildeo duas linhas paralelas em formato de disco fechado onde estatildeo localizados a
clorofila celular (clorofila a) e os carotenoacuteides (VAN YKELENBURG 1979)
O aparato fotossinteacutetico das cianobacteacuterias consiste principalmente de trecircs
tipos de complexos macromoleculares fotossistema I fotossistema II e os
ficobilissomos O FSI e o FSII satildeo complexos intriacutensecos onde os ficobilissomos
estatildeo sobre a superfiacutecie externa dos tilacoiacutedes na forma de esferas (GANTT 1981
LIU et al 2005) Os ficobilissomos auxiliam na absorccedilatildeo da energia luminosa em
47
um intervalo do espectro maior que as clorofilas absorvem (500-680 nm) permitindo
as espeacutecies que possuem essas antenas a utilizar todo o intervalo da luz visiacutevel
emitido pelo sol (KUMAR MURHTY 2007)
Os ficobilissomos estatildeo unidos nas lamelas tilacoiacutedais e funcionam como
antenas captadoras de luz que transferem a energia excitante para o centro de
reaccedilatildeo dos fotossistemas (VAN EYKELENBURG 1979) A maior parte da energia
luminosa eacute absorvida por complexos pigmentos-proteiacutenas chamados de
ficobilissomos Os componentes dos ficobilissomos as ficobiliproteiacutenas satildeo
responsaacuteveis pela pigmentaccedilatildeo verde-azulada da maioria das cianobacteacuterias Os
ficobilissomos satildeo agregados de alto peso molecular compostos por ficocianina
aloficocianina e ficoeritrina (com pico de absorbacircncia de 615 nm 650 nm e 565 nm
respectivamente) Com o aumento da intensidade luminosa os ficobilissomos satildeo
menos abundantes (VAN EYKELENBURG 1979)
As ficobiliproteiacutenas presentes nos gracircnulos de ficobilissomos podem constituir
mais de 60 de proteiacutena soluacutevel em cianobacteacuterias (HOUMARD 1994) Isso eacute o
que caracteriza a Spirulina spp por ser comercializada como um suplemento
alimentar rico em proteiacutenas (TANDEAU de MARSAC HOUMARD 1993) As
ficobiliproteinas purificadas possuem uma variedade de funccedilotildees como substituinte
de corantes sinteacuteticos em alimentos e produtos cosmeacuteticos sondas para meacutetodos de
imunodiagnoacutesticos citometria de fluxo e microscopia de fluorescecircncia (STANIER e
COHEN-BAZIRE 1977 SPOLAORE et al 2006)
As maiores classes da ficobiliproteinas satildeo ficoeritrina (PE) ficoeritrocianina
(PEC) ficocianina (PC) e aloficocianina (APC) (CIFERRI 1983) A absorccedilatildeo
maacutexima satildeo 540ndash570 570ndash590 610ndash620 e 650ndash655 nm para PE PEC PC e APC
respectivamente (STANIER COHEN-BAZIRE 1977 CIFERRI 1983)
Aleacutem das ficobiliproteiacutenas as cianobacteacuterias contecircm as clorofilas e os
carotonoacuteides para absorccedilatildeo de energia luminosa Entre os carotenoacuteides encontram-
se o β-caroteno o mais importante e as xantofilas que satildeo carotenos oxigenados
(MARZZOCO TORRES 1999)
As clorofilas satildeo os pigmentos naturais presentes nas plantas cianobacteacuterias e
algas O nome clorofila foi proposto por Pelletier e Caventou em 1818 para
designar a substacircncia verde que se podia extrair das folhas com o auxiacutelio do aacutelcool
Atualmente os pigmentos clorofilianos satildeo de grande importacircncia comercial
podendo ser utilizados tanto como pigmentos quanto como antioxidantes Os
48
pigmentos fotossinteacuteticos presentes e a sua abundacircncia variam de acordo com a
espeacutecie A clorofila a (Chl a) estaacute presente em todos os organismos que realizam
fotossiacutentese oxigecircnica As bacteacuterias fotossintetizantes satildeo desprovidas de clorofila a
e possui em seu lugar a bacterioclorofila como pigmento fotossinteacutetico A Chl a eacute o
pigmento utilizado para realizar a fotoquiacutemica (o primeiro estaacutegio do processo
fotossinteacutetico) enquanto que os demais pigmentos auxiliam na absorccedilatildeo de luz e na
transferecircncia da energia radiante para os centros de reaccedilatildeo sendo assim chamados
de pigmentos acessoacuterios (STREIT et al 2005) As cianobacteacuterias possuem clorofila
a e ficobilinas mas natildeo possuem a clorofila b (GRIFFITHS 2006)
As clorofilas satildeo as moleacuteculas fotorreceptoras mais importantes Satildeo moleacuteculas
formadas por complexos derivados da porfirina tendo como aacutetomo central o Mg
(magneacutesio) (Figura 6) Esse composto eacute uma estrutura macrociacuteclica assimeacutetrica
totalmente insaturada constituiacuteda por quatro aneacuteis de pirrol Esses aneacuteis numeram-
se de 1 a 4 ou de ldquoardquo a ldquodrdquo de acordo com o sistema de numeraccedilatildeo de Fisher
(SCHOEFS 2002) A clorofila a o anel de porfirina conteacutem um grupo metil (-CH3) no
Carbono 3 A estrutura quiacutemica da clorofila estaacute representada na Figura 6
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da moleacutecula da clorofila a Fontehttp1381926868bioCoursesbiochem2PhotosynthesisPhotosynthesis1html
Os pigmentos que absorvem luz fazem parte de complexos proteacuteicos que
atravessam a membrana tilacoidal denominados de fotossistemas Esses satildeo
unidades funcionais das reaccedilotildees da fotossiacutentese Cada fotossistema pode conter
vaacuterias moleacuteculas de clorofila carotenoacuteides e ficobilinas todas capazes de absorver
luz por isso denominada de moleacuteculas-antena Os carotenoacuteides e as ficobilinas
apresentam absorccedilatildeo em regiatildeo do espectro luminoso em que as clorofilas
49
absorvem pouco e isso permite a ampliaccedilatildeo do espectro luminoso utilizado na
fotossiacutentese (MARZOCCO TORRES 1999)
A composiccedilatildeo de pigmentos da Spirulina eacute tiacutepica de uma cianobacteacuteria a uacutenica
clorofila presente eacute a clorofila a que tem seu peso variando entre 08 e 15 do
peso seco As proteiacutenas que possuem maior potencial econocircmico satildeo as
biliproteiacutenas Nas Spirulinas existem duas biliproteiacutenas c-ficonianina e a
aloficocianina A fraccedilatildeo proteacuteica pode conter mais de 20 de ficocianina um
pigmento azul soluacutevel em aacutegua (VONSHAK 1997) Entre os carotenoiacutedes 67-79 eacute
constituiacutedo do β-caroteno As maiorias dos carotenoacuteides da Spirulina satildeo β-caroteno
β-cryptoxantina e zeaxantina (LORENZ 1999)
Os carotenoacuteides carotenos e xantofilas aleacutem de sua funccedilatildeo de absorver
energia luminosa satildeo capazes de dissipar a energia de excitaccedilatildeo excedente na
forma de calor evitando danos ao aparato fotossinteacutetico Enquanto que como
transdutores de energia ateacute o centro de reaccedilatildeo natildeo satildeo muito eficiente (30 - 40
de eficiecircncia) como dissipadores de energia absorvida em excesso pela clorofila
satildeo altamente eficientes (MANRIQUE 2003)
A zeaxantina eacute capaz de receber a energia diretamente da clorofila excitada e
dissipa-laacute posteriormente na forma de calor sem emissatildeo de radiaccedilatildeo O processo
se inverte quando a luz desaparece ou vai se tornando menos intensa
progressivamente finalizando o ciclo A dissipaccedilatildeo da energia eacute devido a
zeaxantina (MANRIQUE 2003)
Os pigmentos acessoacuterios satildeo fundamentais para a realizaccedilatildeo da fotossiacutentese
pelos organismos Algas que possuem apenas a clorofila a como Ochromonas
malhamensis e a Nannochloris oculata crescem mais rapidamente em presenccedila de
substrato orgacircnico que em presenccedila apenas da luz como fonte de energia mesmo
sob condiccedilotildees oacutetimas de luz Os pigmentos acessoacuterios atuam somente absorvendo
energia contribuindo para a fotossiacutentese (BRODY BRODY 1962)
No entanto a captaccedilatildeo de energia para a funccedilatildeo fotossinteacutetica natildeo eacute a uacutenica
funccedilatildeo dos pigmentos fotossinteacuteticos estes satildeo sistemas fotoprotetores quando a
intensidade luminosa eacute excessiva Quando nem todos os foacutetons absorvidos pela
clorofila podem ser utilizados no processo fotoquiacutemico eacute desencadeado um
mecanismo para dissipar o excesso de energia e evitar danos as membranas
fotossinteacuteticas e a proacutepria clorofila resultando em um branqueamento das ceacutelulas
com uma consequumlente reduccedilatildeo ou perda da capacidade fotossinteacutetica Na presenccedila
50
de excesso de luz o oxigecircnio reage com a clorofila excitada originando um oxigecircno
singlete que eacute muito mais reativo podendo oxidar as clorofilas (branqueamento) os
aacutecidos graxos polinsaturados que forma peroacutexidos e outros compostos Entatildeo os
carotenoacuteides dissipam o radical peroacutexido e tambeacutem a clorofila excitada adquirindo o
estado triplete que por sua vez se dissipa despreendendo calor para o meio externo
(MANRIQUE 2003)
243 Fontes de carbono
De acordo com Chojnacka e Maacuterquez-Rocha (2004b) a fonte de carbono
empregada e a utilizaccedilatildeo ou natildeo de energia luminosa podem classificar os cultivos
em
Cultivo heterotroacutefico ndash emprego exclusivo de compostos orgacircnicos como fonte
energeacutetica O carbono orgacircnico serve tanto como fonte energeacutetica quanto para a
formaccedilatildeo da biomassa
Cultivo autotroacutefico (ou fotoautotroacutefico) ndash emprego da luz como exclusiva fonte
energeacutetica para a reduccedilatildeo (fixaccedilatildeo) do CO2 (considerado de fonte inorgacircnica)
formando substacircncias orgacircnicas
Cultivo mixotroacutefico ndash utilizaccedilatildeo simultacircnea de uma fonte luminosa e carbono
orgacircnico como fonte de energia
2431 Fonte de carbono orgacircnico (crescimento hetorotroacutefico)
A A platensis cresce principalmente em meios de cultura contendo carbono
inorgacircnico e poucos trabalhos tecircm sido publicados utilizando apenas fonte de
carbono orgacircnico Como fonte orgacircnica de carbono os accediluacutecares satildeo os substratos
mais utilizados para os cultivos heterotroacuteficos e mixotroacuteficos (ZHANG et al 1998
MARQUEZ et al 1993 CHOJNACKA NOWORYTA 2004b MUumlHLING et al 2005
ANDRADE COSTA 2007)
Ogawa and Terui (1970) foram os primeiros a relatar que uma cultura axecircnica
de Spirulina platensis cresce em meio mineral enriquecido com 1 de peptona e
tem uma taxa de crescimento maior que as culturas cultivadas em meio mineral
Marquez et al (1993) relataram que a Spirulina platensis cresce heterotroficamente
sob glicose em condiccedilotildees aeroacutebias no escuro bem como mixotroficamente na
presenccedila de luz Chojnacka e Noworyta (2004a) tambeacutem observaram o crescimento
51
da S platensis em condiccedilotildees heterotroacuteficas utilizando a glicose com fonte de
carbono e energia
S platensis podem utilizar tambeacutem glicerol como a uacutenica fonte de carbono no
entanto as ceacutelulas quando em contato com o glicerol pela primeira vez formam
agregados de ceacutelulas e passam por uma fase lag de adaptaccedilatildeo Apoacutes a sua sub-
cultura as ceacutelulas cresceram utilizando glicerol atingido 1287 mg L-1 e nos cultivos
com apenas bicarbonato como fonte de carbono obteve 1157mg L-1 (NARAYAN et
al 2005)
Por outro lado Soundarapandian e Vasanthi (2008) relataram que diferentes
cepas de S platensis isoladas de solo satildeo incapazes de utilizar apenas fontes de
carbono orgacircnico como D-glucose manitol sacarose e ureacuteia
2432 Fonte de carbono inorgacircnico (Crescimento autotroacutefico)
Microalgas fototroacuteficas requerem CO2 como fonte de carbono e este contribui
para o controle do pH no meio O pH do meio de cultivo eacute um dos fatores mais
importantes no cultivo de algas O pH determina a solubilidade do dioacutexido de
carbono e minerais no meio e influencia direta ou indiretamente o metabolismo das
algas O pH depende de vaacuterios fatores como composiccedilatildeo e capacidade tamponante
do meio quantidade de dioacutexido de carbono dissolvido temperatura (que determina a
solubilidade do CO2) e atividade metaboacutelica das ceacutelulas (BECKER 1995)
A fonte de carbono principal para a A platensis eacute o iacuteon bicarbonato no qual
entra na ceacutelula por transporte ativo O bicarbonato intracelular eacute entatildeo desidratado
via anidrase carbonica para CO2 o qual eacute incorporado no ciclo de Calvin via
ribulose-15-bifosfato carboxilase (RUBISCO) Este carbono eacute usado
simultaneamente para a siacutentese de todas as macromoleacuteculas nas ceacutelulas (proteiacutenas
carboidratos lipiacutedios e aacutecidos nucleacuteicos) a partir do 3-fosfoglicerato como metaboacutelito
intermediaacuterio (COGNE et al 2003)
Durante o cultivo autotroacutefico da Spirulina sp ocorre um raacutepido aumento do pH
no meio de cultura e isso eacute causado pela dissociaccedilatildeo do aacutecido carbocircnico (H2CO3)
em bicarbonato (HCO3-) e OH- (KIM et al 2007) e o bicarbonato eacute dissociado para
produzir CO2 e OH- (RICHMOND GROBBELAAR 1986) O aumento do pH atua
como um autoinibidor do crescimento celular (RICHMOND 2000) e portanto o CO2
pode ser utilizado para a manutenccedilatildeo do pH oacutetimo
52
Em cianobacteacuterias alcalofiacutelicas onde o pH de crescimento tiacutepico eacute 10 a
concentraccedilatildeo de CO2 eacute negligenciada sugerindo que o transporte de CO2 passivo
natildeo poderia contribuir significativamente para carbono inorgacircnico intracelular
Adicionalmente estudos tecircm mostrado que A platensis eacute fortemente dependente do
transporte simporte Na+HCO3- para a assimilaccedilatildeo do carbono inorgacircnico Como eacute
tiacutepico de alcalofiacutelicos a A platensis aparentemente natildeo manteacutem o gradiente de pH
externo positivo na sua membrana plasmaacutetica Consequentemente ocorre uma
extrusatildeo de soacutedio via bomba de soacutedio dependente de ATP em contraste com o
tranporte antiporte Na+H+ na maioria das cianobacteacuterias A Extrusatildeo de soacutedio na
presenccedila de um inibidor do FSII (diuron) indica que uma soma significante de ATP eacute
suplementada pelo transporte de eleacutetrons ciacuteclico em volta do FSI conteuacutedo na qual
em A platensis eacute excepcionalmente alto (BERRY et al 2003)
Anaacutelises quiacutemicas tecircm mostrado que biomassa algal consiste de 40 a 50 de
carbono na qual sugere que 15 a 2 kg de CO2 satildeo necessaacuterios para produzir 1 kg
de biomassa (SOBCZUK et al 2000) Do mesmo modo Chisti (2007) relata que
considerando que a biomassa microalgal possui aproximadamente 50 de carbono
em sua biomassa seca (SAacuteNCHEZ MIROacuteN et al 2003) todo esse carbono eacute
derivado do dioacutexido de carbono A produccedilatildeo de 100 toneladas de biomassa algal fixa
em torno de 183 toneladas de dioacutexido de carbono e este deve ser suplementado
continuamente durante o cultivo iluminado A adiccedilatildeo controlada do CO2 em
respostas aos sinais de sensores de pH minimizam a perda de CO2 e a variaccedilatildeo do
pH (CHISTI 2007)
O sistema de transporte do CO2 inclui a anidrase carbocircnica que converte o CO2
para HCO3- durante a passagem atraveacutes da membrana plasmaacutetica havendo um
acuacutemulo de HCO3- quando o CO2 eacute suplementado A concentraccedilatildeo de CO2
citoplasmaacutetico eacute abaixo do esperado no equiliacutebrio quiacutemico e de acordo com o
modelo proposto pelo mecanismo de concentraccedilatildeo de carbono esse desequiliacutebrio eacute
relatado pelo fato que a anidrase carbocircnica estaacute localizada dentro dos
carboxissomos na membrana plasmaacutetica eou membranas tilacoacuteidais e estaacute ausente
no citoplasma (KAPLAN REINHOLD 1999)
O CO2 entra na ceacutelula pela difusatildeo passiva e a conversatildeo do CO2 para o HCO3-
pela anidrase carbocircnica natildeo permite a sua passagem livremente para fora da ceacutelula
(CARRIERI et al 2007) A concentraccedilatildeo de CO2 nos carboxissomos eacute de 50000
vezes maior que a concentraccedilatildeo extracelular Isso implica em uma resistecircncia a
53
difusatildeo do CO2 pela membrana bioloacutegica extremamente alta apesar do CO2 ser
altamente permeaacutevel agrave membrana bilipiacutedica Geralmente as algas apresentam um
acuacutemulo de carbono inorgacircnico menor que em cianobacteacuterias isso por que a
RubisCO das algas apresentam maior afinidade pelo CO2 (KAPLAN REINHOLD
1999)
O CO2 que entra na ceacutelula por difusatildeo passiva eacute convertido para HCO3- pela
ldquoCA-likerdquo por uma reaccedilatildeo dependente de energia e a assimilaccedilatildeo ativa do HCO3-
que eacute contra seu potencial eletroquiacutemico depende do suplemento da energia
metaboacutelica Essa energia necessaacuteria eacute provavelmente dependente do transporte
ciacuteclico do eleacutetron em torno do FSI e da atividade do FSII (SOBCZUK et al 2000)
Portanto isso ainda natildeo tem sido estabelecido se esta dependecircncia eacute direta ou
indireta (via gradiente de iacuteons) A energia metaboacutelica deveria ser utilizada para
manter o gradiente de iacuteon O antiporte Na+H+ estaacute envolvido na regulaccedilatildeo e
manutenccedilatildeo do pH interno durante a entrada do HCO3- e subsequumlente fixaccedilatildeo do
CO2 (KAPLAN REINHOLD 1999)
As microalgas podem fixar carbono a partir de diferentes fontes tais como CO2
a partir da atmosfera CO2 a partir da exaustatildeo de gases industriais e CO2 na forma
de carbonatos soluacuteveis (eg NaHCO3 e Na2CO3) Tradicionalmente microalgas satildeo
cultivadas em reatores fechados ou abertos na qual satildeo aerados ou expostos ao ar
para permitir que a microalgas capturem o dioacutexido de carbono a partir da atmosfera
para o crescimento celular Como a atmosfera conteacutem somente 003 ndash 006 de
CO2 eacute esperado que a limitaccedilatildeo da transferecircncia de massa possa reduzir a
velocidade do crescimento das microalgas (CHELF et al 1993) Por outro lado
gases da exaustatildeo industrial tais como gases de combustatildeo possuem acima de 15
de CO2 fornecendo uma fonte rica de CO2 para o cultivo de microalgas e um
caminho potencialmente mais eficiente para biofixaccedilatildeo de CO2 Outra alternativa eacute
fixar o CO2 pela reaccedilatildeo quiacutemica para produzir carbonatos (exemplo Na2CO3) e usa-
la mais tarde como fonte de carbono para o cultivo de microalgas (WANG et al
2008)
Estudos sobre a eficiecircncia da utilizaccedilatildeo de CO2 por microalgas tecircm sido feitos
com o objetivo de melhorar a produtividade dos fotobiorreatores Morais e Costa
(2007b) observou que uma concentraccedilatildeo de Spirulina sp foi maior em cultivos
alimentados com 6 e 12 CO2 quando comparado ao cultivo utilizando somente o
ar atmosfeacuterico Watabane e Hall (1996) relataram um aumento na produtividade
54
correspondendo a 159 g de biomassa seca m-2 d-1 no cultivo utilizando o
fotobiorreator com air lift com ar enriquecido de CO2 (4)
Gordillo et al (1999) observaram uma reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo celular
maacutexima de S platensis devido a reduccedilatildeo na quantidade de proteiacutenas soluacuteveis
clorofila a carotenoacuteides totais e ficocianina nos cultivos enriquecido com 1 de CO2
em relaccedilatildeo aos cultivos enriquecidos com CO2 atmosfeacuterico (0035) Portanto altas
concentraccedilatildeo de CO2 podem inibir o crescimento dos micro-organismos
Em cultivo fotoautotroacutefico de Chlorella o conteuacutedo de proteiacutenas e pigmentos
foram maiores quando comparada com o cultivo heterotroacutefico (OGBONNA TANAKA
1997)
2433 Fonte de carbono inorgacircnico e orgacircnico simultaneamente
(crescimento mixotroacuteficos)
A presenccedila do metabolismo fotoautotroacutefico e heterotroacutefico simultacircneo tecircm sido
confirmado para o crescimento de microalgas como por exemplo Chlorella vulgaris
(MAacuteRQUEZ et al 1993) Heamatococcus pluvialis (KOBAYASHI et al 1992
MAacuteRQUEZ et al 1993) Chlorella pyrenoidosa (OGBANNA TANAKA 1996)
Euglena gracilis (OGBONNA et al 1999) Phaeodactylum tricornutum (CEacuteRON
GARCIA et al 2000) e cianobacteacuterias como Spirulina platensis (MARQUEZ et al
1995 CHOJANACKA NOWORYTA 2004 ZHANG et al 1998)
Durante o crescimento mixotroacutefico haacute dois processos metaboacutelicos
independentes dentro das ceacutelulas metabolismo fotossinteacutetico e a respiraccedilatildeo
aeroacutebia Nesse tipo de metabolismo a presenccedila do substrato orgacircnico significa que o
crescimento celular natildeo eacute estritamente dependente da fotossiacutentese e ateacute mesmo a
luz pode deixar de ser um fator indispensaacutevel para o crescimento celular
(CHOJNACKA NOWORYTA 2004a)
Eacute interessante notar que o crescimento especiacutefico de algumas microalgas (ex
Chlorella vulgares Haematococus pluvialis) crescendo mixotroficamente eacute a soma
de suas velocidades especiacuteficas de crescimento em culturas fotossinteacuteticas e
heterotroacuteficas (LEE 2001 OGBONNA et al 2000)
Um possiacutevel modo para obter uma alta concentraccedilatildeo de micro-organismos
fotossinteacuteticos eou produtos desses micro-organismos eacute o uso de cultura
mixotroacutefica onde fontes de carbono orgacircnicas e inorgacircnicas satildeo concomitantemente
fornecidas ao biorreator Sob determinadas condiccedilotildees de cultivo ambas a atividade
55
fotoautotroacutefica e a heterotroacutefica podem ocorrer simultaneamente e
independentemente resultando no aumento da velocidade especiacutefica de
crescimento como jaacute referido anteriormente
Maacuterquez et al (1993) relatam que a Spirulina platensis eacute capaz de crescer em
cultivo heterotroacutefico na presenccedila de glicose bem como mixotroficamente na
presenccedila de luz sugerindo que os crescimentos autotroacutefico e heterotroacutefico
funcionam independentemente no crescimento mixotroacutefico Nieva e Valiente (1996)
portanto observaram uma reduccedilatildeo na taxa de fixaccedilatildeo de CO2 em condiccedilotildees de
crescimento mixotroacutefico da Anabaena variabilis sugerindo que alguns aspectos do
metabolismo do CO2 podem ser modulados pela presenccedila de carbono orgacircnico Do
mesmo modo Kang et al (2004) observou que pode existir alguma interaccedilatildeo entre o
metabolismo de carbono orgacircnico e inorgacircnico uma vez que a presenccedila do carbono
inorgacircnico acelerou a assimilaccedilatildeo do carbono orgacircnico durante o cultivo do
Synechococcus spPCC7002 A intensidade luminosa favoreceu o crescimento
mixotroacutefico do Synechocystis sp PCC 6803 utilizando glicose como fonte de
carbono Este fenocircmeno pode ser explicado pelo efeito positivo da luz sobre o
fotossistema I (WANG et al 2002) A via glicoliacutetica o ciclo dos aacutecidos tricarboxiacutelicos
(TCA) e a fosforilaccedilatildeo oxidativa mitocondrial mantiveram alta atividade nos cultivos
de Chlorella pyrenoidosa durante a iluminaccedilatildeo indicando pouco efeito da luz nessas
vias metaboacutelicas Portanto o fluxo atraveacutes da via das pentoses fosfato durante a
iluminaccedilatildeo foi muito pequena devido a regulaccedilatildeo mediada pela luz (YANG et al
2000)
Adicionalmente Maacuterquez et al (1993) concluiacuteram que a Spirulina platensis tem
a habilidade de realizar a fermentaccedilatildeo embora soacute utilize essa estrateacutegia como um
modo de sobrevivecircncia sob condiccedilotildees anaeroacutebicas e no escuro
Nos cultivos de S platensis suplementados com glicose alcanccedilaram o
crescimento maior que nos cultivos sob condiccedilotildees de crescimento fotoautotroacuteficos
(MARQUEZ et al 1995 1993) Chen et al (2006) observaram que a suplementaccedilatildeo
de acetato como fonte de carbono proporcionou um aumento significante da
concentraccedilatildeo celular e da produccedilatildeo de clorofila a luteiacutena -caroteno ficocianina e
aloficocianina quando comparada ao cultivo fotoautotroacutefico
O melaccedilo subproduto da induacutestria de accediluacutecar que conteacutem mais do que 50 de
accediluacutecar tambeacutem pode ser um substrato suplementado de baixo custo na produccedilatildeo
56
industrial para o crescimento mixotroacutefico de Spirulina platensis (ANDRADE COSTA
2007)
O emprego de cultivos mixotroacuteficos pode levar as ceacutelulas agrave siacutentese de
compostos caracteriacutesticos tanto de cultivos fotoautotroacuteficos quanto heterotroacuteficos
como pode implicar em altas taxas de produccedilatildeo de biomassa (CERON GARCIA et
al 2000) Uma vez que num cultivo mixotroacutefico o CO2 e o carbono orgacircnico satildeo
simultaneamente assimilados este tipo de cultivo pode ser o processo mais eficiente
para a produccedilatildeo de biomassa microalgal visto que implica em uma economia na
energia gasta para a siacutentese de todo o aparato fotossinteacutetico e para a fixaccedilatildeo de
carbono (LEE 2004)
25 Produccedilatildeo de CO2 e VOCs proveniente da fermentaccedilatildeo alcoacuteolica
A revoluccedilatildeo industrial e a intesa utilizaccedilatildeo dos combustiacuteveis foacutesseis (carvatildeo
petroacuteleo e gaacutes natural) estatildeo associadas ao elevado niacutevel de vida das sociedades
ocidentais Contudo as reservas de combustiacuteveis foacutesseis satildeo limitadas e a sua
utilizaccedilatildeo tem impactos ambientais consideraacuteveis como por exemplo o aumento do
efeito estufa e as consequumlentes alteraccedilotildees do clima Neste contexto o etanol surge
como uma alternativa vaacutelida em termos de fonte de energia renovaacutevel e menos
poluente
Nas uacuteltimas deacutecadas o etanol tem ocupado um lugar de destaque e de grande
importacircncia tecnoloacutegica firmando-se como um produto estrateacutegico economicamente
por ser amigaacutevel com o meio ambiente pois eacute um aditivo ao combustiacutevel que reduz
a emissatildeo de monoacutexido de carbono oacutexido de nitrogecircnio e hidrocarbonos (WHEALS
et al 1999) e por ser produzido a partir de biomassa renovaacutevel como accediluacutecar e
amido atualmente e materiais de lignocelulose no futuro (GOLDEMBERG 2009)
Inicialmente o objetivo de utilizar o aacutelcool combustiacutevel era se tornar
independente do mercado do petroacuteleo e reduzir os custos de sua importaccedilatildeo Hoje
em dia a ecircnfase do uso do etanol combustiacutevel estaacute sobre a reduccedilatildeo da poluiccedilatildeo
devido ao protocolo de Quioto para limitar o aquecimento global (WHEALS et al
1999) Na produccedilatildeo e combustatildeo do etanol de milho pode reduzir em ateacute 12 a
emissatildeo de gases causadoras do efeito estufa quando comparado com o uso de
combustiacuteveis foacutesseis (HILL et al 2006) e quando utilizado etanol de cana-de-accediluacutecar
essa reduccedilatildeo pode ser de 66 (ANDREOLI SOUZA 2006)
57
O aacutelcool estaacute em expansatildeo por ser um combustiacutevel de baixo custo renovaacutevel e
cujo emprego como alternativa para a matriz energeacutetica mundial estaacute em fase de
crescimento A tendecircncia de aumento da produccedilatildeo de aacutelcool no Brasil ocorre por
vaacuterios fatores como aumento da frota de carros bi-combustiacutevel (demanda interna)
Protocolo de Quioto (demanda externa) e aumento do preccedilo do petroacuteleo Poliacuteticas
similares tecircm sido adotadas pela Uniatildeo Europeacuteia Japatildeo e Estados Unidos
(GOLDEMBERG et al 2007) Por essas razotildees a demanda por etanol no mercado
internacional tem sido crescente nos uacuteltimos anos O Brasil aleacutem de ser um dos
maiores produtores e consumidores de etanol eacute tambeacutem o maior exportador no
cenaacuterio global Segundo dados da Uniatildeo da Induacutestria de Cana de Accediluacutecar (Unica) ateacute
2016 o Brasil produziraacute 129 bilhotildees de litros de etanol para o mercado externo Na
safra 20082009 o total de etanol produzido foi de 275 bilhotildees de litros (UacuteNICA)
O Brasil e os Estados Unidos satildeo liacutederes mundiais na produccedilatildeo de etanol
utilizando como mateacuteria prima a cana de accediluacutecar e milho respectivamente Os dois
paiacuteses acumulam cerca de 70 da produccedilatildeo mundial (ROMERO 2007) Aleacutem disso
o Brasil lidera a produccedilatildeo mundial de cana-de-accediluacutecar (principal mateacuteria-prima do
etanol) sendo essa uma induacutestria que movimenta vaacuterios bilhotildees de doacutelares por ano
O fato de o etanol ser produzido dentro do Brasil representa uma menor
dependecircncia de petroacuteleo externo diminuindo substancialmente os gastos com
importaccedilotildees
O agronegoacutecio da cana-de-accediluacutecar movimenta R$ 40 bilhotildees por ano no paiacutes A
safra 20072008 ficou entre 547 milhotildees de toneladas de cana-de accediluacutecar 152 a
mais do que a safra anterior Metade dela eacute destinada agrave fabricaccedilatildeo de etanol o que
faz do Brasil o segundo maior produtor de combustiacutevel no mundo O primeiro lugar
cabe aos Estados Unidos que extraem etanol de milho a poder de pesados
subsiacutedios Dois terccedilos da produccedilatildeo nacional estatildeo no estado de Satildeo Paulo Avalia-
se que o Brasil precisaraacute dobrar sua produccedilatildeo num horizonte de 5 a 7 anos se
quiser suprir as demandas locais e internacionais do combustiacutevel Isso exigiraacute a
construccedilatildeo de novas usinas o crescimento das aacutereas plantadas melhorias no
manejo e principalmente ganhos de produtividade (MARQUES 2008)
O cenaacuterio futuro mostra que paiacuteses como Estados Unidos Japatildeo e Europa vatildeo
precisar importar mais de 10 bilhotildees de litros de etanol ateacute 201112 Se uma
tonelada de cana produz 88 litros de etanol precisaria adicionar mais de 110
milhotildees de toneladas de cana para atender o mercado futuro o que acrescentaria
58
mais 12 milhotildees de hectares A UNICA (Uniatildeo da induacutestria de cana-de-accediluacutecar)
prevecirc um crescimento da produccedilatildeo de 6 a 7 anualmente chegando a uma
produccedilatildeo de 560 milhotildees de toneladas de cana em 201011 (ANDREOLI SOUZA
2006)
A quantidade de CO2 liberada diretamente para a atmosfera devido ao aumento
da sua produccedilatildeo mundial pode causar prejuiacutezos ao meio ambiente No Brasil a
produccedilatildeo de etanol por processos fermentativos principalmente pelo processo
descontiacutenuo alimentado ou contiacutenuo utilizando mosto de melaccedilo de cana-de-accediluacutecar
eou caldo de cana-de-acuacutecar tem no cultivo da Saccharomyces cerevisiae um
grande impacto no acircmbito socioeconocircmico Existem cerca de 300 induacutestrias que
utilizam fermentaccedilatildeo alcooacutelica no Brasil que movimentam bilhotildees de doacutelares e
geram 6 dos empregos totais do Paiacutes (Uniatildeo da Agroinduacutestria Canavieira de Satildeo
Paulo 2006)
No Brasil 70 das destilarias de cana-de-accediluacutecar usam o processo
descontiacutenuo com uma capacidade fermentativa acima de 15 milhotildees de litros de
etanol por dia e aproximadamente 350 destilarias usam a fermentaccedilatildeo contiacutenua
(WHEALS et al 1999) Estudos comparativos e avaliaccedilotildees econocircmicas de diversos
processos utilizados na produccedilatildeo de etanol concluiacuteram que fermentaccedilatildeo contiacutenua
apresentava uma reduccedilatildeo de 57 no investimento de capital fixo em destilarias
quando comparado ao daquelas que utilizam processo em batelada Uma reduccedilatildeo
ainda maior de 68 e 71 eacute obtida para os processos que utilizam reciclo de ceacutelulas
e operaccedilatildeo a vaacutecuo respectivamente (CYSEWSKI WILKE 1978)
A fermentaccedilatildeo contiacutenua apresenta menor custo de investimento maior
facilidade para a instalaccedilatildeo de sistemas de automaccedilatildeo e ausecircncia de ldquotempos
mortosrdquo que eacute o tempo em dado momento do ciclo fermentativo natildeo estaacute produzindo
tiacutepico de processos descontiacutenuo Aleacutem disso a fermentaccedilatildeo contiacutenua tende a
consumir menos anti-espumante decorrecircncia da alimentaccedilatildeo mais estaacutevel de
accediluacutecar para o processo e tambeacutem da geometria dos fermentadores Por outro lado
a fermentaccedilatildeo contiacutenua apresenta maiores dificuldades quando temos que lidar com
contaminantes indesejaacuteveis no processo Natildeo eacute possiacutevel promover a assepsia de
fermentadores de bombas e de trocadores com frequumlecircncia como ocorre no sistema
em bateladas Desta maneira a fermentaccedilatildeo contiacutenua tende a consumir mais aacutecido
sulfuacuterico e mais antibioacutetico
59
Segundo Romano et al (2003) as transformaccedilotildees quiacutemicas que ocorrem
durante a fermentaccedilatildeo por leveduras satildeo a conversatildeo dos accediluacutecares em etanol e
CO2 e em menores quantidades a formaccedilatildeo de CVOs Basso et al (1996) relata
que durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica por levedura os produtos da fermentaccedilatildeo satildeo
constituiacutedos de 43 ndash 47 de etanol 41 - 45 de gaacutes carbocircnico e o restante satildeo
formados por outros compostos orgacircnicos tais como glicerol aacutecido succiacutenico aacutecido
aceacutetico entre outros Dentre os volaacuteteis orgacircnicos majoritaacuterios produzidos durante a
fermentaccedilatildeo de mosto de cana-de-accediluacutecar por Saccharomyces cerevisiae
encontram-se o etanol acetaldeiacutedo propanol isobutanol aacutelcool isoamiacutelico acetato
de etila (CACHOT et al 1991) Durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica do mosto de cana-
de-accediluacutecar os principais componentes gasosos satildeo o CO2 e o etanol mas outros
aacutelcoois e aacutecidos tambeacutem satildeo liberados em menores quantidades na forma gasosa
(VENTURINI FILHO e MENDES 2003)
A reaccedilatildeo quiacutemica simplificada da produccedilatildeo de etanol a partir da sacarose da
cana-de-accediluacutecar eacute
C12H22O11 +H2O rarr 4C2H5OH + 4CO2 (3)
Onde 342 g de sacarose produz 184 g de etanol e 176 g de CO2 Com isso
pode-se estimar que cada grama de sacarose produz 0514g de CO2 assumindo
uma recuperaccedilatildeo de CO2 em 100 no caso de induacutestrias dedicadas a produccedilatildeo de
etanol No entanto as induacutestrias de produccedilatildeo de etanol tambeacutem utilizam como
mateacuteria-prima o melaccedilo um sub-produto da produccedilatildeo de accediluacutecar industrial a partir
da cana-de-accediluacutecar que conteacutem cerca de 15 da sacarose inicial (MOLLERSTEN et
al 2003) e represeta mais de 75 do custo total de produccedilatildeo de etanol
(CYSEWSKI WILKE 1978)
Cada litro de etanol produzido pela fermentaccedilatildeo alcooacutelica resulta em
aproximadamente 076 kg de CO2 portanto a capacidade de produccedilatildeo de CO2
durante a fermentaccedilatildeo de etanol combustiacutevel nos EUA e o Brasil eacute de
aproximadamente 84 e 106 toneladas de CO2 por ano respectivamente
(KHESHGI PRICE 2005) No Brasil a produccedilatildeo meacutedia de etanol a partir da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica eacute de 180 milhotildees de litros por ano gerando
consequentemente 014 milhotildees de CO2 por ano (MOLLERTEN et al 2003)
O uso do biocombustiacutevel traz uma seacuterie de benefiacutecios associados agrave reduccedilatildeo
dos gases de efeito estufa e de outros poluentes atmosfeacutericos tais como o enxofre
aleacutem da reduccedilatildeo do consumo de combustiacuteveis foacutesseis Poreacutem no processo de
60
fabricaccedilatildeo uma seacuterie de resiacuteduos e subprodutos industriais eacute gerada os quais
podem quando adequadamente geridos contribuir para a viabilidade econocircmica da
produccedilatildeo de biocombustiacuteveis Esses resiacuteduos possuem potencial para uso na
induacutestria de alimentos e para a nutriccedilatildeo animal bem como na induacutestria quiacutemico-
farmacecircutica mas haacute uma grande carecircncia de estudos de anaacutelises de viabilidade
teacutecnica e financeira que possam apontar as melhores alternativas de custo-
benefiacutecio para o processamento e tratamento desses resiacuteduos os quais podem
agregar valor e reduzir os custos de produccedilatildeo de biocombustiacuteveis com o
aproveitamento e venda destes produtos e seus derivados
Um nuacutemero de subprodutos da induacutestria do etanol combustiacutevel pode ter o
potencial para a aplicaccedilatildeo de nutracecircuticos ou de alimentos funcionais que eacute uma
das aacutereas de grande interesse atualmente e representa um mercado potencial
enorme ainda em seu desenvolvimento inicial Por isso o interesse em utilizar
micro-organismos fotossintetizantes devido a sua capacidade de reduzir a emissatildeo
de CO2 e de CVOs na atmosfera subproduto da induacutestria de etanol produzindo
compostos de alto valor industrial
61
3 Objetivos
Geral
Este trabalho tem como objetivo verificar a influecircncia do efeito da adiccedilatildeo de
CO2 proveniente de cilindro ou da fermentaccedilatildeo alcooacutelica mantendo o pH no valor
oacutetimo igual a 95 no cultivo de A platensis em reatores tubulares utilizando nitrato ou
ureacuteia como fonte de nitrogecircnio em diferentes intensidades luminosas
Especiacuteficos
Avaliar os testes preliminares da fermentaccedilatildeo alcoacuteolica contiacutenua utilizada para
posterior acoplamento dos gases liberados durante a fermentaccedilatildeo com os
cultivos de A platensis
Avaliar os paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima produtividade em ceacutelulas
e fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas usando anaacutelise de variacircncia
multivariaacutevel nos cultivos de A platensis
Determinar a composiccedilatildeo centesimal da A platensis no final dos cultivos teor
de proteiacutenas lipiacutedios cinzas e carboidratos usando a anaacutelise de variacircncia
multivariaacutevel
Estudar os paracircmetros bioenergeacuteticos da A platensis durante os cultivos
utilizando CO2 de cilindro avaliando os andamentos em funccedilatildeo do tempo dos
paracircmetros valor teoacuterico da energia de Gibbs dissipada para o crescimento
(1YGX) das produccedilotildees molares de O2 consumo de H+ e absorccedilatildeo de foacutetons
para produzir 1 C-mol de biomassa
Calcular o rendimento teoacuterico da energia fixada pelo aparato fotossinteacutetico
energia transformada em ATP e a energia liberada como calor calculando-se a
partir da energia molar de Gibbs absorvida da luz pelo aparato fotossinteacutetico
Comparar o comportamento celular em duas diferentes configuraccedilotildees de
fotobiorreatores tubulares um horizontal e outro helicoidal
62
4 Materiais e meacutetodos
41 Fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
O CO2 proveniente da fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua foi utilizado como fonte
de carbono para o cultivo de A platensis O desprendimento desse gaacutes do reator foi
arrastar volaacuteteis orgacircnicos formados na fermentaccedilatildeo cujas interferecircncias nos
cultivos de A platensis foram avaliadas Para os cultivos contiacutenuos de fermentaccedilatildeo
alcooacutelica foi utilizado o mosto de melaccedilo de cana-de-accediluacutecar
411 Testes preliminares para emprego da fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
4111 Teste para avaliar a influecircncia do tratamento do melaccedilo na
determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular
Para a realizaccedilatildeo desse teste foi preparada uma suspensatildeo celular de 300g L-1
de levedura uacutemida em aacutegua destilada a partir dessa suspensatildeo foram retirados sob
agitaccedilatildeo 10 mL e adicionados em dois diferentes frascos um contendo 290 mL de
melaccedilo natildeo clarificado (item 41111) e outro contendo 290 mL de melaccedilo
previamente clarificado (item 41112) de modo que a concentraccedilatildeo celular final de
cada frasco tenha 10g L-1 em 300 mL de mosto A partir dessa suspensatildeo foram
retirados 5 mL para a anaacutelise da concentraccedilatildeo celular como descrito no item 4311
41111 Melaccedilo natildeo tratado
O melaccedilo natildeo tratado consiste apenas na sua diluiccedilatildeo com aacutegua potaacutevel e
preparado como descrito no item 41113
41112 Melaccedilo tratado
O tratamento do melaccedilo consistiu de sua preacutevia clarificaccedilatildeo diluiccedilatildeo e
suplementaccedilatildeo adequadas A clarificaccedilatildeo foi realizada com diluiccedilatildeo do melaccedilo pela
adiccedilatildeo de aacutegua potaacutevel em partes iguais e adiccedilatildeo de 15 g de fosfato de soacutedio
monobaacutesico como agente floculante em cada litro da soluccedilatildeo de melaccedilo diluiacutedo
Posteriormente esse melaccedilo diluiacutedo foi autoclavado a 121 ordmC por 10 minutos Apoacutes
o aquecimento foi mantido em repouso no miacutenimo por 48 horas para a
sedimentaccedilatildeo do material em suspensatildeo O melaccedilo clarificado foi entatildeo sifonado
63
pronto para ser diluiacutedo com aacutegua e preparado como descrito no item 41113 sem
a adiccedilatildeo do antibioacutetico O mosto foi esterilizado em autoclave a 121 ordmC durante 30
minutos (PEREGO JUacuteNIOR 1979)
41113 Preparaccedilatildeo do melaccedilo
O melaccedilo foi diluiacutedo ateacute concentraccedilatildeo 170 g L-1 em accediluacutecares redutores totais
(ART) (GUERREIRO et al 1997) e suplementado com ureacuteia na concentraccedilatildeo de 05
g L-1 suficiente para que a fonte de nitrogecircnio natildeo se torne fator limitante da
atividade da levedura (MAGALHAtildeES 1978 CARVALHO 1994 PEREGO-JUNIOR
1979) O pH do mosto foi ajustado em 45 (JONES et al 1981) pela adiccedilatildeo de aacutecido
sulfuacuterico concentrado ou pela adiccedilatildeo de soluccedilatildeo de hidroacutexido de soacutedio 4N Por fim
adicionou-se penicilina V aacutecida (500 UIL) como antibioacutetico (AQUARONE 1960
CARVALHO et al 2003)
4112 Teste para avaliar a homogeneidade do reator
Para a realizaccedilatildeo do teste de homogeneidade foi preparado 10 litros de uma
suspensatildeo celular de 9 g L-1 de levedura em aacutegua destilada e adicionada ao
fermentador Apoacutes 30 minutos de homogeneizaccedilatildeo mecacircnica do material iniciou
uma contiacutenua adiccedilatildeo de aacutegua destilada e retirada da amostra a uma vazatildeo
especiacutefica de alimentaccedilatildeo calculada (Dc) igual a 0124 h-1 No intervalo de 30
minutos em diferentes regiotildees do reator as amostras foram recolhidas para
determinar a concentraccedilatildeo celular A homogeneidade do reator eacute verificada se a
queda da concentraccedilatildeo celular for uma funccedilatildeo exponencial
4113 Teste para determinar a vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo
Foram realizados 3 experimentos com a fermentaccedilatildeo contiacutenua nas condiccedilotildees
descritas no item 415 Os valores de vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo (D) foram 01
h-1 005 h-1 e 0025 h-1
412 Micro-organismo e condiccedilotildees de manutenccedilatildeo
Saccharomyces cerevisiae CCT7150 uma cepa isolada de planta industrial de
fermentaccedilatildeo alcooacutelica nacional (Usina Nova Ameacuterica) e produtora de altas
concentraccedilotildees de etanol a partir de melaccedilo adquirida da Fundaccedilatildeo Andreacute Tosello
foi utilizada nos cultivos contiacutenuos Sua manutenccedilatildeo em tubo de ensaio foi no meio
Sabourand (Merckreg) A cultura foi armazenada sob refrigeraccedilatildeo a 4 ordmC
64
413 Preparo do inoacuteculo
As ceacutelulas de levedura estocada foram multiplicadas em tubos contendo meio
soacutelido Sabourand e incubadas em estufa a 30 ordmC por 24 h Posteriormente as
culturas foram inoculadas com alccedila de platina sob condiccedilotildees asseacutepticas em tubos
contendo 10 mL do meio Sabourand e incubadas em estufa a 30 ordmC por 24 h Cada
tubo por sua vez inoculou um frasco de Erlenmeyer de 500 mL contendo 90 mL de
mosto de melaccedilo de cana-de-accediluacutecar contendo 5 de ART que foi entatildeo incubado
a 30 ordmC por 12 h em agitador rotativo a 400 rpm Decorrido este tempo o conteuacutedo
de 10 frascos de Erlenmeyer preparados com o preacute-inoacuteculo (1 L) foi adicionado agrave
dorna juntamente com o mosto (9 L) nas condiccedilotildees em que se trabalhou no
processo contiacutenuo resultando em um volume uacutetil do fermentador de 10 litros que
deu iniacutecio a uma fermentaccedilatildeo descontiacutenua (PEREGO JUacuteNIOR 1979)
414 Dispositivo para a cultura
Foi utilizado um fermentador fabricado pela INFORs HT com dornas de vidro
de 10 litros de capacidade nominal com controles de temperatura pH niacutevel de
espuma e frequumlecircncia de agitaccedilatildeo com saiacutedas que foram conectadas a uma bomba
peristaacuteltica para alimentaccedilatildeo do mosto e retirada do material durante a fermentaccedilatildeo
contiacutenua
415 Descriccedilatildeo das condiccedilotildees de fermentaccedilatildeo contiacutenua
O cultivo contiacutenuo teve como iniacutecio o cultivo descontiacutenuo como descrito acima
(item 413) A alimentaccedilatildeo contiacutenua do mosto ocorreu apoacutes um periacuteodo de 6 a 8 h
da inoculaccedilatildeo do S cerevisiae na dorna para garantir que o micro-organismo se
encontre na fase exponencial de crescimento A concentraccedilatildeo de accediluacutecares no mosto
de alimentaccedilatildeo foi de 170 g L-1 (GUERREIRO et al 1997) expressa em ART O
mosto foi suplementado com sulfato de amocircnio na concentraccedilatildeo de 1 g L-1 A
temperatura de fermentaccedilatildeo foi mantida a 30 plusmn 1 ordmC (KOCK et al 2000) com
frequumlecircncia do agitador de 500 rpm A vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo foi
determinada em ensaios preliminares (item 61)
65
42 Cultivo de A platensis
421 Micro-organismo e manutenccedilatildeo
Spirulina (Arthrospira) platensis UTEX (1926) foi mantida em meio liacutequido de
cultivo padratildeo para Arthrospira (item 4221) em tubos hermeticamente fechados
422 Meio de cultivo
Foram utilizados dois tipos de meio Um meio padratildeo para o cultivo de
Arthrospira (SCHLOumlSSER 1982) ndash item 4221 com NaNO3 como fonte de
nitrogecircnio que foi utilizado para duas finalidades manutenccedilatildeo do micro-organismo e
preparo do inoacuteculo um meio modificado (item 4122) onde se utilizou ureacuteia como
fonte de nitrogecircnio
4221 Meio padratildeo para cultivo de A platensis
O meio mineral padratildeo foi o de Schloumlsser (1982) cuja composiccedilatildeo por litro de
aacutegua destilada eacute a seguinte
NaHCO3 1361g
Na2CO3 403g
K2HPO4 050g
NaNO3 250g
K2SO4 100g
NaCl 100g
MgSO47H2O 020g
CaCl22H2O 004g
Soluccedilatildeo de metal PIV 6mL
Soluccedilatildeo de micronutrientes Chu 1mL
Vitamina B12 (15g100mL H2O) 1mL
Soluccedilatildeo de metal PIV (em 1 litro de aacutegua destilada)
Na2EDTA 750 mg
FeCl36H2O 97 mg
MnCl24H2O 41 mg
ZnCl2 5 mg
CoCl26H2O 2 mg
Na2MoO42H2O 4 mg
66
Soluccedilatildeo de micronutrientes Chu (em 1 litro de aacutegua destilada)
Na2EDTA 50 mg
H3BO3 618 mg
CuSO45H2O 196 mg
ZnSO47H2O 44 mg
CoCl26H2O 20 mg
MnCl2middot4H2O 12 mg
Na2MoO4middot2H2O 12 mg
4222 Meio modificado
O meio de Schloumlsser (1982) foi utilizado com substituiccedilatildeo do nitrato de soacutedio
por ureacuteia
A massa diaacuteria de ureacuteia adicionada por unidade de volume foi determinada de
acordo com o experimento padratildeo utilizando nitrato de soacutedio como fonte de
nitrogecircnio (descrito no item 5)
423 Preparo do inoacuteculo
A A platensis foi inoculada em 10 mL de meio liacutequido (em tubo de ensaio) em
condiccedilotildees asseacutepticas Depois de 7 dias esse material foi utilizado para inocular
frascos de Erlenmeyer de 500 mL com 200mL de meio de cultivo padratildeo (item
4121) previamente esterilizado por autoclavaccedilatildeo
Os erlenmeyers apoacutes o repique foram imediatamente levados a agitador
rotativo a 100 min-1 (FERRAZ 1986) temperatura de 30 OC e iluminacircncia de 72
mol de foacutetons m-2 s-1 (CARVALHO et al 2004)
O crescimento celular foi acompanhado sendo utilizada para inoacuteculo uma
suspensatildeo de A platensis apoacutes de 6 a 8 dias de cultivo (PELIZER et al 2003) em
crescimento exponencial isenta de contaminaccedilatildeo Nos cultivos utilizando meio
mineral padratildeo a suspensatildeo foi filtrada lavada e ressuspensa em meio de cultivo
padratildeo Nos cultivos utilizando ureacuteia como fonte alternativa de nitrogecircnio a
suspensatildeo foi filtrada lavada com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada do NaNO3 e
ressuspensa em meio de cultivo padratildeo isento de NaNO3 Estas suspensotildees foram o
inoacuteculo para o cultivo no reator tubular onde foram realizados os estudos
empregando NaNO3 como fonte de nitrogecircnio padratildeo e a ureacuteia como fonte
67
alternativa de nitrogecircnio com o pH do cultivo controlado pela adiccedilatildeo de CO2
proveniente de cilindro ou da fermentaccedilatildeo alcooacutelica
424 Dispositivo para cultura
4241 Fotobiorreator tubular horizontal
O fotobiorreator tubular utilizado eacute apresentado na Figura 7 Este eacute constituiacutedo
por 20 tubos de vidro transparentes (diacircmetro interno de 10 cm) (CARLOZZI
PINZANI 2005) com inclinaccedilatildeo de 2 (115ordm) (TREDICI ZITTELLI 1998) para
facilitar o escoamento do liacutequido interligados com mangueiras de PVC de mesmo
diacircmetro interno de forma que o volume iluminado corresponde a 212 litros
(606) O volume total do sistema foi de 35 litros A recirculaccedilatildeo de liacutequido foi de
26 L h-1 para evitar a sedimentaccedilatildeo da biomassa e melhorar a transferecircncia de
massa
Na parte mais baixa dos tubos do reator tubular haacute um tubo na forma de Y que
recebe ar proveniente de uma bomba deslocando a suspensatildeo celular para um
frasco na parte superior provido de agitaccedilatildeo com um agitador magneacutetico Tambeacutem
na parte inferior do reator haacute uma conexatildeo no qual ocorre entrada de CO2 para
manutenccedilatildeo de pH quando da abertura da vaacutelvula solenoacuteide controlada por um
controlador de pH
Figura 7 Fotobiorreator tubular horizontal utilizado no cultivo de A platensis
68
4242 Fotobiorreator tubular espiralado
O fotobiorreator tubular espiralado utilizado eacute apresentado na Figura 8 Este eacute
constituiacutedo por 5 conjuntos de tubos espiralados de vidro transparentes (diacircmetro
interno de 10 cm) (CARLOZZI PINZANI 2005) interligados com mangueiras de
PVC de mesmo diacircmetro interno Cada conjunto eacute constituiacutedo por 3 tubos
espiralados logo o reator conteacutem no total 15 tubos de vidros espiralados de forma
que o volume iluminado corresponde a 665 ml (606 ) O volume total do sistema
foi de 11 litros A recirculaccedilatildeo de liacutequido foi de 26 L h-1 para evitar a sedimentaccedilatildeo
da biomassa e melhorar a transferecircncia de massa
Na parte mais baixa dos tubos do reator tubular haacute um tubo na forma de Y que
recebe ar proveniente de uma bomba deslocando a suspensatildeo celular para um
frasco na parte superior Tambeacutem na parte inferior do reator haacute uma conexatildeo no
qual ocorre entrada de CO2 para manutenccedilatildeo de pH
Figura 8 Fotobiorreator tubular espiralado utilizado no cultivo de A platensis
425 Descriccedilatildeo de um experimento tiacutepico de cultivo da A platensis
A suspensatildeo de Arthrospira (item 43) foi adicionada ao biorreator tubular na
concentraccedilatildeo inicial de 400 mg L-1 (SOLETTO et al 2008) e o volume de trabalho
foi de 35 L no fotobiorreator tubular horizontal e de 11 L no fotobiorreator tubular
espiralado Devido a evaporaccedilatildeo e a retirada de amostras o meio de cultura isento
da fonte de nitrogecircnio foi adicionado para manter o volume constante
69
Nos experimetos utilizando NaNO3 como fonte de nitrogecircnio a concentraccedilatildeo
inicial deste foi de 25 g L-1 e ocorreram adiccedilotildees do nitrato de soacutedio de modo que sua
concentraccedilatildeo natildeo fosse inferior a 1 g L-1 (FAINTUCH 1989) desta forma evitaria a
limitaccedilatildeo do crescimento celular pela fonte de nitrogecircnio No cultivo utilizando a
fonte de nitrogecircnio alternativa (ureacuteia) a adiccedilatildeo diaacuteria foi efetuada por pulsos (adiccedilatildeo
intermitente) (SAacuteNCHEZ-LUNA et al 2004) As intensidades luminosas foram
medidas com um sensor quantum (model LI-190 SB Li-Cor Lincoln Neb USA) As
diferentes fontes de nitrogecircnio e intensidades luminosas foram preacute-estabelecida de
acordo com o plano de trabalho (Item 5)
O valor de pH nos cultivos foi mantido em 95 plusmn 02 (SANCHEZ-LUNA et al
2007 TREDICI ZITTELLI 1998) com auxiacutelio de um aparelho controlador de pH
METTLER TOLEDO acoplado a uma vaacutelvula solenoacuteide Nos ensaios com CO2 puro
(999) a valvula solenoiacutede estava ligada a um cilindro de CO2 e nos ensaios com
CO2 proveniente de fermentaccedilatildeo alcooacutelica a vaacutelvula solenoacuteide foi ligada agrave tubulaccedilatildeo
proveniente de um reator operando com processo contiacutenuo de fermentaccedilatildeo alcooacutelica
em regime permanente
A temperatura de 29 plusmn 1ordmC (SAacuteNCHEZ-LUNA et al 2007) foi mantida por ar
condicionado que climatizou a temperatura da sala onde estaacute localizada o reator
No final do experimento o reator foi lavado com soluccedilatildeo de hipoclorito de soacutedio
5 por 16 h e com uma soluccedilatildeo de tiosulfato de soacutedio (Na2S2O3) 50 mM para
neutralizar o clorito residual de acordo com De Beer et al (1994)
43 Teacutecnicas Analiacuteticas
Na fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua ateacute o estabelecimento de regime
permanente as determinaccedilotildees de concentraccedilatildeo celular pH ART etanol no caldo
fermentado foram determinados a cada 12 horas Estabelecido o regime
permanente as determinaccedilotildees de concentraccedilatildeo celular pH ART etanol foram
feitas diariamente O efluente gasoso foi analisado qualitativamente para
identificaccedilatildeo dos principais compostos volaacuteteis orgacircnicos
No cultivo de Arthrospira a concentraccedilatildeo celular foi feita diariamente ateacute atingir
concentraccedilatildeo celular maacutexima As medidas de concentraccedilatildeo de nitrato ureacuteia residual
amocircnia e de carbonato total em funccedilatildeo dos relativos grandes volumes necessaacuterios
para a execuccedilatildeo das teacutecnicas foram realizadas a cada dois dias Nos cultivos
utilizando o CO2 proveniente da fermentaccedilatildeo alcooacutelica foram analisados os
70
compostos volaacuteteis orgacircnicos presentes no meio isento de ceacutelulas A concentraccedilatildeo
de clorofila a foi determinada no final de cada experimento bem como a
determinaccedilatildeo de proteiacutenas lipiacutedios totais carboidratos e cinzas
431 Acompanhamento da fermentaccedilatildeo alcooacutelica
4311 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular
A concentraccedilatildeo celular expressa em massa seca foi determinada por filtraccedilatildeo
de acordo com metodologia descrita por Carvalho et al (2003) Um volume de 5 mL
da amostra foi filtrada em membrana millipore 12 microm de porosidade previamente
seca em estufa a 105 ordmC por 4 horas e em dessecador por 1 h e pesada A biomassa
filtrada e lavada com 50 mL de aacutegua destilada foi seca em estufa a 105 ordmC por 4
horas e em dessecador por 1 h e posteriormente pesada A concentraccedilatildeo celular foi
determinada por diferenccedila de massa antes e apoacutes a filtraccedilatildeo
4312 Determinaccedilatildeo do pH
O pH seraacute acompanhado por potenciometria com um aparelho da marca
METTLER TOLEDO
4313 Determinaccedilatildeo de ART
A determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ART foi realizada por espectrofotometria a
540 nm pelo meacutetodo de SOMOGYI-NELSON (1952) precedido da hidroacutelise da
sacarose contida na fase liacutequida do meio de fermentaccedilatildeo realizada pela teacutecnica de
Falcone e Marques (1965)
A hidroacutelise da sacarose foi feita por hidroacutelise aacutecida utilizando 5 mL da amostra
e 25 mL da soluccedilatildeo de aacutecido cloriacutedrico 13 N e deixou-se em banho de aacutegua a 70 ordmC
por 15 minutos Deixou-se esfriar essa soluccedilatildeo ateacute a temperatura ambiente e foi
adicionado NaOH 6N ateacute verificar uma mudanccedila no pH utilizando fenolfitaleiacutena
como indicador Posteriormente completou-se o volume final para 100 mL com aacutegua
destilada diluindo-se assim a amostra 20 vezes A partir dessa soluccedilatildeo jaacute diluiacuteda
fizeram-se novas diluiccedilotildees necessaacuterias para a determinaccedilatildeo do ART pelo meacutetodo de
Somogyi-Nelson (1952)
71
A anaacutelise compreende na adiccedilatildeo de 1 mL da amostra convenientemente diluiacuteda
e 1 mL do reativo de Somogy em tubo de Folin-Wu onde foi fervido durante 10
minutos resfriado em aacutegua com gelo Apoacutes o resfriamento adicionou-se 2 mL do
reativo de Nelson e agitou-se os tubos em agitador ateacute expulsar os gases formados
Completou-se o volume para 25 mL com aacutegua destilada e a soluccedilatildeo foi lida em
espectrofotometro a 520 nm Foi feito um branco substituindo a amostra por aacutegua
destilada
O accediluacutecar aquecido com uma soluccedilatildeo alcalina de tartarato de cobre leva agrave
obtenccedilatildeo de oacutexido cuproso que reagindo com molibdato de arsecircnio possibilita a
produccedilatildeo de um composto de coloraccedilatildeo azul passiacutevel de ser quantificada por
colorimetria a adiccedilatildeo de sulfato de soacutedio a mistura minimiza a entrada de oxigecircnio
na soluccedilatildeo responsaacutevel pela reoxidaccedilatildeo do oacutexido cuproso
4314 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol
A determinaccedilatildeo do etanol foi realizada atraveacutes do meacutetodo de oxidaccedilatildeo por
dicromato de potaacutessio proposto por Joslyn (1907)
O etanol foi determinado mediante a destilaccedilatildeo atraveacutes de um microdestilador
de KJELDHAL e recolhido em 20 mL de uma soluccedilatildeo de dicromato de potaacutessio
fortemente acidulada com aacutecido sulfuacuterico A determinaccedilatildeo consiste na destilaccedilatildeo de
1 mL do meio fermentado isento de ceacutelulas recolhido na soluccedilatildeo de dicromato
contida em erlenmeyer onde o etanol reagiu com os iacuteons dicromato como mostrado
na eq 1 produzindo acetaldeiacutedo e iacuteons Cr(III) Conforme o etanol reage haacute uma
mudanccedila da coloraccedilatildeo laranja caracteriacutestica desta soluccedilatildeo para um tom esverdeado
A reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo do etanol com iacuteons dicromato envolve pelo menos duas
etapas Na primeira etapa o etanol introduzido na soluccedilatildeo reage com os iacuteons
dicromato produzindo um aldeiacutedo que neste caso eacute o acetaldeiacutedo (reaccedilatildeo 4)
Na segunda etapa como o aldeiacutedo produzido tambeacutem eacute susceptiacutevel agrave oxidaccedilatildeo o
acetaldeiacutedo eacute consumido produzindo aacutecido aceacutetico (um aacutecido carboxiacutelico) com a
correspondente reduccedilatildeo dos iacuteons Cr(VI) para iacuteons Cr(III) (reaccedilatildeo 5) A reaccedilatildeo
entre o etanol e os iacuteons dicromato pode ser descrita de forma global como mostrado
na (reaccedilatildeo 6)
3 CH3CH2OH + CrO7-2 rarr 3 CH3COH 2 Cr+3 + 7 H20 (reaccedilatildeo 4)
3 CH3COH + CrO7-2 + 8H+ rarr 3 CH3COOH + 2 Cr+3 + 4 H20 (reaccedilatildeo 5)
72
3 CH3CH2OH + 2 CrO7-2 + 16H+ rarr 4Cr+3 + 3 CH3COOH 11 H2O (reaccedilatildeo 6)
Apoacutes a destilaccedilatildeo o erlenmeyer foi levado a um banho de aacutegua a 70 ordmC
durante 20 minutos para que se complete a oxidaccedilatildeo do etanol Apoacutes esse tempo
deixou-se esfriar ateacute temperatura ambiente e essa soluccedilatildeo foi titulada com soluccedilatildeo
de sulfato ferroso amoniacal Foi feita concomitantemente uma soluccedilatildeo utilizando
aacutegua em vez do destilado para determinar o poder redutor do sulfato ferroso
amoniacal
4315 Determinaccedilatildeo dos componentes volaacuteteis presentes no gaacutes efluente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
Os voltaacuteteis majoritaacuterios liberados durante o regime permanente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica foram determinados pelo Laboratoacuterio de Anaacutelises Quiacutemicas do
Instituto de Pesquisa Tecnoloacutegis (IPT) usando um cromatoacutegrafo a gaacutes (marca
Shimadzu modelo CG-2010) acoplado ao espectrocircmetro de massas (Shimadzu
Modelo GCMS ndash QP5050A)
432 Acompanhamento do cultivo de A platensis
O volume das amostras diaacuterias retiradas para o acompanhamento celular foram
de 50 mL Apoacutes a remoccedilatildeo da amostra igual volume de meio de cultura isento da
fonte de nitrogecircnio foi adicionado para manter o volume constante Similarmente a
evaporaccedilatildeo de aacutegua diaacuteria foi compensada pela adiccedilatildeo do meio de cultura
4321 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular
43211 Densidade oacutetica
O acompanhamento do crescimento celular foi realizado diariamente em
duplicata por turbidimetria a 560 nm (LEDUY THERIEN 1977) Os valores de
transmitacircncia obtidos no espectrofotocircmetro foram convertidas em concentraccedilatildeo
celular atraveacutes de uma curva de calibraccedilatildeo (Item 43212)
43212 Construccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo
A curva de calibraccedilatildeo foi obtida tomando-se um volume de 25 mL de uma
suspensatildeo concentrada de ceacutelulas em fase de crescimento exponencial que foi
73
filtrada e lavada com aacutegua destilada em uma membrana de acetato de celulose de
12 μm previamente seca a 70 ordmC por 12 horas e previamente pesada A amostra
foi levada agrave estufa a 100ndash105 ordmC por um periacuteodo de 5 horas suficiente para que
mantivesse uma massa constante A massa das ceacutelulas foi calculada por diferenccedila
dos valores das massas das membranas antes e depois da filtraccedilatildeo e dividido pelo
volume filtrado para obter-se a concentraccedilatildeo celular na suspensatildeo A partir desta
mesma suspensatildeo foram preparadas diferentes diluiccedilotildees e aliacutequotas dessas
diluiccedilotildees foram levadas ao espectrofotocircmetro para leitura da transmitacircncia a 560 nm
de comprimento de onda e caminho oacuteptico de 1 cm com aacutegua destilada como
branco Dessa forma foi obtida uma curva que relaciona concentraccedilatildeo celular com o
logaritmo da transmitacircncia (Graacutefico 1)
Graacutefico 1 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular de A platensis
4322 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de carbonato total
Embora a concentraccedilatildeo de carbonato total deva se manter constante em
decorrecircncia do fornecimento de CO2 para a manutenccedilatildeo do pH foi acompanhado na
fase liacutequida do meio em cultivo
No meio isento de ceacutelulas o acompanhamento da concentraccedilatildeo de fonte de
carbono na forma de carbonato total foi atraveacutes de titulometria Inicialmente
adiciona-se hidroacutexido de soacutedio na amostra (Reaccedilatildeo 7) e titula-se com HCl
(Reaccedilatildeo 8) na presenccedila do indicador fenolftaleiacutena para a conversatildeo de carbonato
em bicarbonato Posteriormente foi titulada novamente com HCl (Reaccedilatildeo 9) na
74
presenccedila do indicador alaranjado de metila para que todo o bicarbonato transforme-
se em aacutecido carbocircnico por deslocamento de equiliacutebrio O carbonato total foi
quantificado pelos dois intervalos de viragem (PIERCE HAENISCH 1948)
NaOH + NaHCO3 = Na2CO3 + H2O (Reaccedilatildeo 7)
Na2CO3 + HCl = NaHCO3 + NaCl (Reaccedilatildeo 8)
NaHCO3 + 1 HCl = H2CO3 + 1 NaCl (Reaccedilatildeo 9)
4323 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia total
A amocircnia total foi quantificada no meio isento de ceacutelulas de 2 em 2 dias em
potenciocircmetro marca ORION modelo 710-A por meio de um eletrodo seletivo para
amocircnia modelo 95-12 ORION Tendo em vista que o eletrodo soacute eacute sensiacutevel ao iacuteon
amocircnia e que no pH de cultivo existe equiliacutebrio entre os iacuteons amocircnia e amocircnio para
se fazer a leitura foi necessaacuterio corrigir o pH da amostra para 13 pela adiccedilatildeo de
NaOH 15 M antes da leitura no eletrodo de forma que todo iacuteon amocircnio fosse
convertido em amocircnia (LEDUY SAMSON 1982) O volume utilizado foi de 15 mL e
nesse procedimento foi necessaacuteria agrave calibraccedilatildeo do aparelho em todos os dias em
que foram realizadas as determinaccedilotildees Isso foi feito atraveacutes da construccedilatildeo de uma
curva que correlaciona a milivoltagem lida no potenciocircmetro com soluccedilotildees de NH4Cl
em diferentes diluiccedilotildees com concentraccedilotildees conhecidas A partir da equaccedilatildeo dessa
curva com a milivoltagem lida na amostra do cultivo foi calculada a concentraccedilatildeo
de amocircnia total Esta metodologia tambeacutem serviu para auxiliar na determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de ureacuteia conforme se observa no item a seguir
43231 Construccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da amocircnia
A metodologia empregada para a determinaccedilatildeo de amocircnia requer a construccedilatildeo
de uma curva de calibraccedilatildeo para cada dia em que foi analisada a amocircnia Desta
forma no Graacutefico 2 tecircm-se uma das curvas de calibraccedilatildeo utilizada
75
Graacutefico 2 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia
Nesse caso a curva de calibraccedilatildeo corresponde agrave Log [NH3] -00213 x mV ndash
10583 A maior diluiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia foi de 5x10-6 (cujo o valor de
Log eacute -53) que corresponde a um valor de milivoltagem de 182 detectado no
eletrodo de amocircnia
4324 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia
Para a determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia inicialmente foi hidrolisada em
meio aacutecido como segue 10 mL do meio de cultivo isento de ceacutelulas foi submetido a
um tratamento com H2SO4 (1 mL de H2SO4 5 N) a 200 ordmC por 6 horas em bloco
digestor Tecnal modelo TE-106 (CEZARE 1998) Apoacutes esse tempo o conteuacutedo
presente no tubo onde ocorreu a hidroacutelise aacutecida foi quantitativamente transferido
para um balatildeo volumeacutetrico de 50 mL com neutralizaccedilatildeo do pH com NaOH 15 M
utilizando fenolftaleiacutena como indicador e finalmente o volume completado com aacutegua
destilada Desse balatildeo foi retirado um volume de 15 mL para a determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de amocircnia conforme meacutetodo descrito no item anterior Considerando
ainda a diluiccedilatildeo da amostra calcula-se a concentraccedilatildeo de amocircnia global que
representa a amocircnia que jaacute estava presente no meio de cultivo mais a amocircnia
proveniente da hidroacutelise da ureacuteia Assim por diferenccedila eacute possiacutevel calcular a
concentraccedilatildeo de ureacuteia no meio de cultivo
76
4325 Determinaccedilatildeo do pH
O pH foi acompanhado por potenciometria com um aparelho da marca
METTLER TOLEDO
4326 Determinaccedilatildeo de nitrato
A anaacutelise de nitrato foi realizada atraveacutes da adaptaccedilatildeo do meacutetodo descrito por
Vogel (2002) Foram pipetados 10 mL do meio isento de ceacutelulas 10 ml de NaOH
(05 N) e 700 mg de liga de devarda ( 50 de cobre 45 de alumiacutenio 5 zinco) em
balatildeo volumeacutetrico onde foi aquecido em bico de busen durante 1 hora para que todo
o nitrato presente na amostra seja reduzido a amocircnio como descrito na reaccedilatildeo a
seguir
NO3- + 8 Al + 5 OH- + 2 H2O rarr 8 Al2
- + 3 NH3 (Reaccedilatildeo 10)
Durante o aquecimento os iacuteons amocircnio satildeo desprendidos e recolhidos em uma
soluccedilatildeo padronizada de 10 mL de aacutecido cloriacutedrico (01 N) formando o cloreto de
amocircnio Essa soluccedilatildeo foi titulada com NaOH (005 N) padronizada usando vermelho
de metila como indicador e a quantificaccedilatildeo do amocircnio formado foi feita por diferenccedila
entre a quantidade de HCl inicial e final depois da destilaccedilatildeo A conversatildeo de
volume do aacutecido tilulado (mililitros) em massa de iacuteons nitrato (gramas) foi baseada
na informaccedilatildeo de que 1 mL de aacutecido cloriacutedrico 1 N corresponde a 006201g de iacuteons
nitrato (VOGEL 2002)
4327 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol
A determinaccedilatildeo do etanol foi realizada atraveacutes do meacutetodo de oxidaccedilatildeo por
dicromato de potaacutessio proposto por Joslyn (1907) como descrito no item 4314
433 Avaliaccedilatildeo da biomassa de A platensis obtida no final do cultivo
4331 Determinaccedilatildeo de Clorofila a
A anaacutelise de clorofila a foi realizada utilizando uma suspensatildeo celular de 5 mL
correspondente agrave concentraccedilatildeo celular maacutexima obtida Essa suspensatildeo foi filtrada e
a biomassa foi ressuspendida em 5 mL de metanol e incubada em banho maria a
70ordmC por 2 minutos Apoacutes esse tempo a amostra foi filtrada em filtro de
77
politetrafluoretileno 10 microm de diacircmetro (Milliporereg) e o sobrenadante contendo a
clorofila foi determinado espectofotometricamente a 665 nm adotando-se o
procedimento descrito por Vonshak (1997a) A curva de calibraccedilatildeo foi feita
previamente utilizando clorofila areg padratildeo
43311 Curva de calibraccedilatildeo para a determinaccedilatildeo de Clorofila a
A curva de calibraccedilatildeo foi construiacuteda utilizando uma soluccedilatildeo de clorofila a
padratildeo (Sigmareg) obtida comercialmente em metanol A partir dessa soluccedilatildeo foram
realizadas diferentes diluiccedilotildees que resultaram em leituras espectrofotomeacutetricas em
comprimento de onda de 665nm obtendo valores de absorbacircncia entre 0200 e
0800 A relaccedilatildeo entre as diferentes concentraccedilotildees de clorofila em miligrama por
litro com os valores de aborbacircncia obtem-se a equaccedilatildeo como mostrada no graacutefico
3 que foi utilizada para a determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de clorofila nos ensaios
Graacutefico 3 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo de clorofila a
4332 Determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal
Ao final do cultivo o meio contendo a A platensis foi centrifugado com 3
lavagens sucessivas com aacutegua destilada para retirada do sal adsorvido agraves ceacutelulas e
apoacutes secagem com ventilaccedilatildeo a 55 ordmC por 12 horas (PELIZER et al 1999) foi
avaliada a composiccedilatildeo centesimal da biomassa seca
78
43321 Proteiacutenas totais
O teor proteacuteico total na biomassa seca foi determinado pelo claacutessico meacutetodo de
KJELDHAL adotando-se o fator de 625 para a conversatildeo a partir dos teores de
nitrogecircnio total (ASSOCIATION OF OFFICIAL METHODS OF FOOD ANALYSIS
1984) Esse meacutetodo caracteriza-se pela destruiccedilatildeo da mateacuteria orgacircnica com aacutecido
sulfuacuterico concentrado em presenccedila de um catalizador e aquecimento com
formaccedilatildeo de nitrogecircnio inorgacircnico na forma de sulfato de amocircnio A seguir em
aparelho destilador de nitrogecircnio adiciona-se hidroacutexido de soacutedio no tubo
proveniente da digestatildeo para alcalinizaccedilatildeo do meio e desta forma o sal de
amocircnio eacute convertido agrave amocircnia que eacute destilada para uma soluccedilatildeo saturada de aacutecido
boacuterico Posteriormente titula-se essa soluccedilatildeo com HCl 002N fatorada para se
quantificar a concentraccedilatildeo de nitrogecircnio (FERRAZ 1986)
43322 Lipiacutedios totais
A fraccedilatildeo lipiacutedica total foi obtida por extraccedilatildeo com solvente orgacircnico (FERRAZ
1986) A amostra foi triturada em gral e entatildeo transferida para um extrator contiacutenuo
de Soxhlet com refluxo da mistura de solventes clorofoacutermio-metanol (21 vv) ateacute o
liacutequido ficar liacutempido (PIORRECK 1984 OLGUIacuteN et al 2001) A fraccedilatildeo lipiacutedica total
juntamente com os solventes foram tratados em sistema evaporador rotativo a
vaacutecuo O material obtido reuacutene aacutecidos graxos trigliceriacutedeos fosfolipiacutedios
carotenoacuteides pigmentos fotossintetizantes esteroacuteides e hidrocarbonetos sendo
chamados de fraccedilatildeo lipiacutedica total (GIOIELLI 1997)
43323 Cinzas
O teor de cinzas das ceacutelulas secas foi determinado por aquecimento de acordo
com meacutetodo descrito pelo Instituto Adolfo Lutz (1985) 1g da amostra foi pesada em
caacutepsula de porcelana previamente aquecida em mufla a 550 ordmC resfriada em
dessecador ateacute a temperatura ambiente e pesada A amostra foi seca em estufa a
105 ordmC carbonizada e incinerada em mufla a 550 ordmC durante 4 horas tempo
necessaacuterio para obter peso constante Posteriomente resfriou-se a amostra em
dessecador durante 1 hora ateacute atingir a temperatura ambiente e pesada As cinzas
devem ficar brancas ou ligeiramente acinzentadas
79
43324 Carboidratos totais
A porcentagem de carboidratos foi calculada pela diferenccedila entre e as
porcentagens dos demais componentes analisados na biomassa seca
434 Avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo elementar
As determinaccedilotildees de CNHSO foram realizadas pela CE instruments flash
EA1112 series acoplada com um detector de condutividade teacutermica (TCD) Para as
anaacutelises de Carbono Nitrogecircnio Hidrogecircnio e Enxofre foi utilizada a meteonina (C =
4025 N = 939 H = 743 S = 2149) como padratildeo e para a anaacutelise de
oxigecircnio foi utilizado o aacutecido aspaacutertico (C = 3609 N = 1052 H =53 S =
000 O = 4908)
4341 Determinaccedilatildeo de CNHS
Foram determinados pesando aproximadamente 1 a 4 mg da amostra em
recipiente de estanho e adicionar V2O5 (oacutexido de vanaacutedio) para que toda a biomassa
seja carbonizada Utiliza-se gaacutes oxigecircnio (99995) para carregar as amostras e
fazer a combustatildeo a 900degC formando os compostos reduzidos N2 CO2 H20 e SO2
Esses gases vatildeo para a coluna cromatograacutefica onde seratildeo separados e
posteriormente detectados por sinais eleacutetricos no detector de condutividade teacutermica
usando o software EAGER 300 na qual fornece a porcentagem de N C H S
contida na amostra
4342 Determinaccedilatildeo de oxigecircnio
Pesar aproximadamente 1 a 4 mg da amostra em recipiente de prata eleva-se
a temperatura a 1060degC onde ocorre a piroacutelise Durante a piroacutelise satildeo formados N2
CO e H2 estes satildeo filtrados onde os compostos halogenados satildeo retidos
Posteriormente esses gases vatildeo para a coluna cromatograacutefica onde o CO eacute
separado dos outros gases utilizando gaacutes heacutelio como carreador detectados por
sinais eleacutetricos no detector de condutividade teacutermica
44 Caacutelculos
441 Produtividade em etanol no regime permanente
Petanol = DEf (Equaccedilatildeo 1)
80
Onde Petanol = Produtividade em etanol (g L-1 h-1)
D = vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo (h-1)
Ef = concentraccedilatildeo de etanol (g L-1)
442 Rendimento do etanol no regime permanente
η = 1005110
1
ARTi
Ef (Equaccedilatildeo 2)
Onde η = rendimento em etanol ()
Ef = concentraccedilatildeo de etanol (g L-1)
ARTi = Accediluacutecares redutores totais no mosto de entrada no reator (g L-1)
0511 = rendimento teoacuterico (estequiomeacutetrico) da conversatildeo de glicose em
etanol
443 Produtividade em ceacutelulas nos cultivos de A platensis
Tc
XiXmPx
(Equaccedilatildeo 3)
Onde PX = produtividade em ceacutelulas (mg L-1 d -1)
Xm = concentraccedilatildeo celular maacutexima obtida (mg L-1)
Xi = concentraccedilatildeo celular inicial (mg L-1)
Tc = tempo de cultivo (dias)
444 Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas nos cultivos de A
platensis
Nt
VXiXmY NX
(Equaccedilatildeo 4)
81
OndeYXN = Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (mg mg-1)
Xm = concentraccedilatildeo celular maacutexima obtida (mg L-1)
Xi = concentraccedilatildeo celular inicial (mg L-1)
V = volume do meio (L)
Nt = quantidade total de nitrogecircnio adicionado (mg)
445 Coeficientes atocircmicos para 1 C-mol de biomassa
Foram escolhidos os principais aacutetomos (C H 0 N e S) que formam as
macromoleacuteculas proteiacutenas carboidratos lipiacutedios RNA e DNA Um C-mol de
biomassa eacute definida como CX1HX2NX3OX4SX5 e os coeficientes atocircmicos Xi satildeo
calculados a partir da Equaccedilatildeo 5
MMc
fc
MMi
fiXi (Equaccedilatildeo 5)
fi = fraccedilatildeo em massa do aacutetomo i na biomassa seca (g g-1)
MMi = Massa molar do aacutetomo i (g C-mol-1)
fc = fraccedilatildeo em massa do carbono na biomassa seca (g g-1)
MMc = Massa molar do aacutetomo do carbono (g C-mol-1)
Exemplo
Para se calcular o coeficiente atocircmico do hidrogecircnio em 1 C-mol de biomassa
no experimento 1 (Fonte de Carbono cilindro fonte de nitrogecircnio nitrato
intensidade luminosa 60 μmol de foacutetons m-2 s-1)
Teor de hidrogecircnio na biomassa foi de 662 e o teor de carbono foi de 543
o que corresponde a 662 mg de hidrogecircnio e 543 mg de carbono em 1 g da
biomassa Logo substituindo esses valores na Equaccedilatildeo 5 se encontra o coeficiente
atocircmico do hidrogecircnio de 146
12
543
1
66HX
XH = 146
82
446 Grau de reduccedilatildeo da biomassa
O grau de reduccedilatildeo (γ) de um composto orgacircnico eacute definido como o nuacutemero de
eleacutetrons envolvido na sua oxidaccedilatildeo Esse valor eacute a somatoacuteria da multiplicaccedilatildeo entre
os coeficientes atocircmicos e seu respectivo grau de reduccedilatildeo (HEI JNEN 2001)
45 Teoria dos paracircmetros bioenergeacuteticos
A energia de Gibbs dissipada para o crescimento e manutenccedilatildeo celular por
unidade de biomassa (1YGX kJC-mol) foi estimada de acordo com Heijnen (2001)
pela Equaccedilatildeo 6
G
GXGX
m
YY
max
11 (Equaccedilatildeo 6)
max
GXY eacute o rendimento maacuteximo teoacuterico de biomassa sobre a energia de Gibbs que
corresponde a um valor de 986 C-molX kJ-1 em cultivos fotoautotroacutefico com CO2
como fonte de carbono (HEIJNEN 2001)
Nesta equaccedilatildeo a velocidade especiacutefica de crescimento μ foi definida de
acordo com Leduy e Zajic (1973) como
1
ln1
i
i
X
X
t (Equaccedilatildeo 7)
Onde Xi e Xi-1 satildeo as concentraccedilotildees de biomassa no final e iniacutecio do intervalo de
tempo decorrido entre as duas determinaccedilotildees consecutivas (Δt = 1 dia) enquanto
que mG eacute a energia de Gibbs utilizada para a manutenccedilatildeo celular correspondendo a
712 kJ C-molX -1 h-1 a 30degC (HEIJNEN 2001)
A estimativa o nuacutemero de foacutetons (Einsteins) para sustentar o crescimento
autotroacutefico nPh foi necessaacuterio recorrer ao balanccedilo de energia de Gibbs tendo em
conta as contribuiccedilotildees de energia para o crescimento e manutenccedilatildeo 1YGX e a
absorccedilatildeo de 1 Einstein de foacutetons ΔgPh em adiccedilatildeo aqueles de formaccedilatildeo de
substratos e produtos Δgfi como descitos pela equaccedilatildeo
ΔgfHCO3- + ΔgfN + ΔgfH2O + ΔgfH
+ + ΔgfX + 1YGX + nPh ΔgPh = 0 (Equaccedilatildeo 8)
83
O valor de ΔgPh = 2062 kJ mol-1 foi estimado atraveacutes da equaccedilatildeo
A
Ph
hcNg (Equaccedilatildeo 9)
Sendo h = 662610-34 J a constante de Planck c = 299108 m s-1 a velocidade da
luz NA = 6022 x 1023 foacutetons de Einstein -1 o numero de Avogadro e λ = 580 nm o
comprimento de onda do foton absorvido (Li et al 2001)
Calculando os valores de ΔgPh e nPh eacute possiacutevel estimar a energia molar de
Gibbs absorvida pela equaccedilatildeo 10
ΔGa = nPh ΔgPh (Equaccedilatildeo 10)
A energia total de Gibbs absorvida pela fotossiacutentese (ΔGa) foi assumida como a
soma da energia fixada pelo sistema para aumentar o seu proacuteprio conteuacutedo
entaacutelpicos (ΔH) a energia transformada em ATP usada para o crescimento e
manutenccedilao celular (ΔGATP) e a liberada como calor (Q)
ΔGa + ΔGATP + ΔH + Q = 0 (Equaccedilatildeo 11)
Onde ΔGATP e ΔH foram calculados a partir do nPh a energia de Gibbs associada a 1
ATP mol e a media da variaccedilatildeo de potencial entre FSI e FSII (TORRE et al 2003)
A produccedilatildeo molar de O2 (qO2) e o consumo de H+ (qH+) foram calculados de
acordo com Torre et al (2003) multiplicando-se os seus coeficientes
estequiomeacutetricos pela concentraccedilatildeo celular expressa em C-mol L-1 e usando a
composiccedilatildeo elementar da biomassa experimental
84
5 Planejamento experimental
Os experimentos realizados estatildeo descritos na Tabela 2 Os valores de
intensidade luminosa foram escolhidos em funccedilatildeo do trabalho de Watanabe e Hall
(1995) O valor de pH foi fixado em 95 plusmn 02 de acordo com trabalho de Sanchez-
Luna et al (2007) e Tredici e Zittelli (1998) As adiccedilotildees diaacuterias de ureacuteia foram fixadas
com base na necessidade de nitrogecircnio da ceacutelula calculadas a partir dos resultados
das produtividades celulares obtidos nos experimentos padrotildees realizados utilizando
a fonte convencional de nitrogecircnio (NaNO3)
Para a realizaccedilatildeo dos ensaios padrotildees a concentraccedilatildeo de NaNO3
(SCHLOumlSSER 1982) foi mantida acima de 1 g L-1 para evitar a limitaccedilatildeo do
crescimento pela fonte de nitrogecircnio A partir da curva de crescimento experimental
utilizando o nitrato como fonte de nitrogecircnio para cada intensidade luminosa
estudada obteacutem-se uma equaccedilatildeo que representa a curva de crescimento teoacuterica e a
partir desta calcula-se a produtividade celular diaacuteria Considerando que as ceacutelulas
possuem 7 de nitrogecircnio (BEZERRA 2006) calcula-se a quantidade diaacuteria de
nitrogecircnio necessaacuteria para o crescimento celular obtendo-se assim a equaccedilatildeo de
adiccedilatildeo de nitrogecircnio amoniacal Por isso eacute necessaacuterio realizar uma curva de
crescimento padratildeo com NaNO3 para cada condiccedilatildeo analisada (diferentes
intensidades luminosas) A exemplificaccedilatildeo do escrito acima esta representado no
Item 62
Tabela 2 - Planejamento experimental
Experimento
Intensidade luminosa
( mol de foacutetons m-
2 s-1)
Fonte de nitrogecircnio
Controle de pH por CO2 de cilindro
Controle de pH por CO2 de
fermentaccedilatildeo alcooacutelica
1 60 NaNO3 Sim Natildeo
2 60 Ureacuteia Sim Natildeo
3 60 NaNO3 Natildeo Sim
4 60 Ureacuteia Natildeo Sim
5 120 NaNO3 Sim Natildeo
6 120 Ureacuteia Sim Natildeo
7 120 NaNO3 Natildeo Sim
8 120 Ureacuteia Natildeo Sim
9 240 NaNO3 Sim Natildeo
10 24 0 Ureacuteia Sim Natildeo
11 240 NaNO3 Natildeo Sim
12 240 Ureacuteia Natildeo Sim
valor fixado em 95 com uso de CO2
85
6 Resultados e discussatildeo
No item 61 estatildeo descritos os resultados dos testes preliminares da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica e no item 62 estatildeo apresentados os resultados dos
experimentos 1 ao 12 referentes aos acompanhamentos dos cultivos ao longo do
tempo A concentraccedilatildeo celular concentraccedilatildeo de carbonato de nitrato de amocircnia e
ureacuteia foram apresentadas neste item
As determinaccedilotildees da concentraccedilatildeo celular foram feitas diariamente enquanto
que as medidas de concentraccedilatildeo de nitrato amocircnia ureacuteia e de carbonato total no
meio de cultura em funccedilatildeo dos relativos grandes volumes de amostra necessaacuterios
para a execuccedilatildeo das teacutecnicas foram realizadas de dois em dois dias
Os paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima produtividade em ceacutelulas e fator
de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas estatildeo descritos no item 63 As
determinaccedilotildees da concentraccedilatildeo de clorofila foram realizadas no final de cada
experimento e estatildeo descritas no item 64 e a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal
teor de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos e cinzas estatildeo descritos no item 65
As anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas atraveacutes de anaacutelise de multivariacircncia e
diferenccedila entre as meacutedias em niacutevel de 5 de significacircncia visando-se examinar a
influecircncia de cada variaacutevel independente para os paracircmetros cineacuteticos Xm Px e
YXN bem como para o conteuacutedo de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos cinzas e teores
de clorofila a
As anaacutelises dos paracircmetros bioenergeacuteticos dos cultivos de A platensis
utilizando CO2 de cilindro estatildeo descritas no item 66 e a comparaccedilatildeo entre o perfil
de crescimento da A platensis em duas diferentes configuraccedilotildees de fotobioreator
tubular estaacute descrito no item 67
61 Testes preliminares para a realizaccedilatildeo da fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Antes de iniciar os experimentos acoplando a fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
com a produccedilatildeo de A platensis foram realizados testes para avaliar a influecircncia da
clarificaccedilatildeo do melaccedilo na determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular a homogeneidade
do reator as vazotildees especiacuteficas de alimentaccedilatildeo no processo contiacutenuo de modo a
obter regime permanente e produccedilatildeo gases suficiente para a correccedilatildeo do pH
durante o cultivo de A platensis
86
611 Avaliaccedilatildeo da influecircncia da clarificaccedilatildeo do melaccedilo na determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo celular
Inicialmente foi proposto utilizar o melaccedilo de cana-de-accediluacutecar clarificado e
esterilizado no entanto devido as dificuldade operacionais como por exemplo
grandes volumes de melaccedilo que seria utilizado para a manutenccedilatildeo do processo
contiacutenuo optou-se por utilizar o melaccedilo natildeo clarificado e natildeo esterilizado uma vez
que nas usinas brasileiras natildeo eacute empregado atualmente esse preacute-tratamento do
melaccedilo (LIMA et al 2001) Dhamija et al (1982) relata que os custos adicionais
para o preacute-tratamento de melaccedilo e da levedura reciclada pode limitar o uso do
processo Portanto a teacutecnica de reciclo de leveduras por centrifugaccedilatildeo e uso de
melaccedilo natildeo clarificado torna o processo mais econocircmico
O melaccedilo de cana-de-accediluacutecar possui aproximadamente 50 de accediluacutecares
(sacarose 25 a 40 glicose e frutose 12 a 35) aacutegua carboidratos cinzas
metais pesados compostos nitrogenados e em menor quantidade aacutecidos natildeo
nitrogenados (aacutecido ciacutetrico acido maacutelico oxaacutelico glicoacutelico) ceras esteroacuteides e
vitaminas (ROUKAS 1998) Vaacuterios fatores influenciam na composiccedilatildeo do melaccedilo ou
mel final os meacutetodos de fabricaccedilatildeo do accediluacutecar o tempo de armazenamento e as
regiotildees do plantio Este elevado teor de accediluacutecar eacute a razatildeo porque o melaccedilo eacute
largamente utilizado na induacutestria de fermentaccedilatildeo em particular produccedilatildeo de etanol
O emprego do melaccedilo natildeo tratado poderia influenciar a determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo celular por massa seca uma vez que no melaccedilo conteacutem aleacutem da
sacarose diversos outros resiacuteduos que poderiam ficar retidos na membrana de
filtraccedilatildeo dificultando esse processo eou resultando no falso aumento da
concentraccedilatildeo celular Por isso realizou-se um teste para avaliar se o natildeo tratamento
do melaccedilo influenciaria na determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular Os resultados e a
anaacutelise estatiacutestica da diferenccedila entre as meacutedias estatildeo descritos na Tabela 3
Tabela 3 - Valores da concentraccedilatildeo celular meacutedias e desvio padratildeo em massa seca obtidas a partir do melaccedilo natildeo clarificado e do melaccedilo clarificado
Melaccedilo natildeo clarificado (gL-1) Melaccedilo clarificado (gL-1)
1110 1010
1094 1074
1082 1004
Meacutedia = 109 plusmn 014ordf Meacutedia = 103 plusmn 040a
Diferenccedila percentual = 640
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
87
Como se pode observar na Tabela 3 as meacutedias da concentraccedilatildeo celular
determinada por massa seca foram estatisticamente iguais nas duas condiccedilotildees de
melaccedilo avaliadas melaccedilo clarificado e melaccedilo natildeo clarificado Com esses
resultados optou-se utilizar o melaccedilo natildeo clarificado uma vez que no acircmbito
industrial o processo de clarificaccedilatildeo aumenta os custos operacionais resultando em
um aumento dos custos do produto final Por isso estudos sobre os preacute-tratamentos
do melaccedilo de cana-de-accediluacutecar tecircm sido desenvolvidos para que viabilizem natildeo soacute a
obtenccedilatildeo dos produtos mas tambeacutem as etapas de recuperaccedilatildeo e purificaccedilatildeo sem
aumento excessivo no custo do processo (VALDUGA et al 2007)
612 Teste de homogeneidade do reator
O teste de homogeneidade no reator foi realizado com o objetivo de se avaliar
se as amostras retiradas em qualquer lugar do reator podem ser consideradas
equivalentes com um risco de erro estatisticamente determinado neste trabalho em
10 Para isso o teste de homogeneidade foi realizado de acordo com Koshimizu et
al (1983)
Na Tabela 4 estatildeo descritos os valores da concentraccedilatildeo celular e o logaritmo
da concentraccedilatildeo celular em funccedilatildeo do tempo com uma vazatildeo de alimentaccedilatildeo de
0124 h-1 A homogeneidade do reator eacute verificada se a queda da concentraccedilatildeo
celular for uma funccedilatildeo exponencial
Tabela 4 - Variaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de leveduras em funccedilatildeo do tempo
Tempo (horas) [X] (g L-1) Ln X
05 89 094939 10 72 085733 15 62 079379
20 57 075587
25 50 070070 30 46 066651 35 39 059988 40 33 051851 45 30 048287 50 25 039445
Aplicando-se o logaritmo neperiano aos valores do [X] (Tabela 4) e
construindo um graacutefico ln X em funccedilatildeo do tempo obtecircm-se a equaccedilatildeo da reta onde
o coeficiente angular da reta obtida eacute igual agrave vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo do
sistema teoacuterico (Dt)
88
Graacutefico 4 Logariacutetmico da concentraccedilatildeo celular em funccedilatildeo do tempo
O valor de Dt obtido pela reta eacute igual a 0115 h-1 que se comparado ao valor
calculado 0124 h-1 apresenta uma diferenccedila de 78 indicando que o sistema
pode ser considerado homogecircneo (KOSHIMIZU et al 1983)
613 Avaliaccedilatildeo de diferentes vazotildees especiacuteficas de alimentaccedilatildeo (D)
O efeito da vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo (D 01 h-1 005 h-1 e 0025 h-1) na
fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua foi avaliada para a produccedilatildeo de etanol Os
resultados satildeo mostrados nos Graacuteficos de 5 a 7
Graacutefico 5 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) etanol () e
accediluacutecar redutor total (ART) para D = 01 h-1
y = -01151x + 09884 Rsup2 = 09912
0010203040506070809
1
0 1 2 3 4 5 6
Ln
X
Tempo (h)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 20 40 60 80 100 120 140
Co
nc
en
tra
ccedilatilde
o (
g L
-1)
Tempo (horas)
Iniacutecio do regime permanente
89
Graacutefico 6 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) Etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 005 h-1
Graacutefico 7 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) Etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 0025 h-1
Como se pode observar nos Graacuteficos de 5 a 7 foi possiacutevel a obtenccedilatildeo do
regime permanente nos 3 valores de D empregados indicando a adequaccedilatildeo desses
valores e da concentraccedilatildeo de ART agrave velocidade de crescimento do micro-organismo
Nos ensaios de fermentaccedilatildeo contiacutenua a condiccedilatildeo de estado estacionaacuterio foi
obtida apoacutes trecircs tempos de residecircncia sem qualquer tipo de problema operacional
como obstruccedilatildeo do tubo de retirada de caldo crescimento na parede e mistura
imperfeita O Graacutefico 5 mostra um resultado tiacutepico em termos de perfis de
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Co
nc
en
tra
ccedilatilde
o (
g L
-1)
Tempo (horas)
Iniacutecio do regime permanente
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 20 40 60 80 100 120 140
Co
nc
en
tra
ccedilatilde
o (
g L
-1)
Tempo (horas)
Iniacutecio do regime permanente
90
concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de glicose (S) e concentraccedilatildeo de etanol (E)
No estado estacionaacuterio (D = 01 h-1) a concentraccedilatildeo de ART residual na saiacuteda do
reator foi de 9421plusmn449 g L-1 a concentraccedilatildeo celular foi de 547plusmn047 g L-1 e a
concentraccedilatildeo de etanol de 4169plusmn163 g L-1 Com a reduccedilatildeo da vazatildeo especiacutefica de
alimentaccedilatildeo para D = 005 h-1 (Graacutefico 5) a concentraccedilatildeo de glicose residual reduziu
para cerca de 4780plusmn870 g L-1 e as concentraccedilotildees de etanol e celular aumentaram
para 4542plusmn31 g L-1 e 618plusmn077 g L-1 respectivamente devido ao maior tempo de
residecircncia nessa segunda condiccedilatildeo Reduzindo a vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo
para 0025 h-1 (Graacutefico 6) a concentraccedilatildeo de etanol aumentou para 553plusmn757 g L-1
Isso porque menor a vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo maior o tempo de contato
entre as ceacutelulas e o accediluacutecar convertendo-o mais eficientemente no etanol Esse
resultado mostra que a reduccedilatildeo da vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo aumenta a
produtividade em etanol
Similarmente Perego Jr (1979) observaram que a diminuiccedilatildeo da vazatildeo
especiacutefica de 0117 para 0049 h-1 durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
menores foram os valores de ART residual 58 g L-1 e 28 g L-1 respectivamente Por
outro lado a concentraccedilatildeo de etanol aumentou de 496 g L-1 para 68 g L-1 e a
concentraccedilatildeo celular reduziu de 67 g L-1 para 53 g L-1 Esses valores diferiram do
presente trabalho devido agraves diferentes cepas de Saccharomyces cerevisieae bem
como o melaccedilo utilizado O melaccedilo por ser um produto natural varia de composiccedilatildeo
de acordo com o clima solo tempo de colheira
Na Tabela 5 mostra que a reduccedilatildeo da vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo levou a
um aumento no rendimento do processo obtendo maior valor de 636 no emprego
de D igual a 0025 h-1 O aumento na vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo proporciona
um aumento do fluxo de entrada de accediluacutecar provavelmente superior ao aumento da
velocidade de consumo levando a uma diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol
aumento da concentraccedilatildeo de ART residual e consequentemente diminuiccedilatildeo da
eficiecircncia de transformaccedilatildeo O rendimento representa a eficiecircncia da fermentaccedilatildeo
alcooacutelica tomando como base a equaccedilatildeo estequiomeacutetrica de Gay-Lussac onde a
relaccedilatildeo teoacuterica para 100 de eficiecircncia de conversatildeo de hexose em etanol eacute de
0511g de etanol produzido para cada grama de hexose consumida
91
Tabela 5 - Valores de XP ART Etanol e Rendimento do processo no regime
permanente para os diferentes valores de D com ART inicial de 170 gL-1
D (h-1)
XP (gL-1)
ARTf
(gL-1) Ef
(gL-1) η
() Px
(g L-1 h-1) Pe
(g L-1 h-1)
0100 547plusmn047 942plusmn449 417plusmn163 4799 055 417
0050 618plusmn077 478plusmn870 454plusmn310 5229 031 227
0025 609plusmn054 532plusmn567 553plusmn757 6364 015 138
D vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo Xp meacutedia dos valores de concentraccedilatildeo celular ao longo do regime permanente e seus desvios padrotildees ARTf accediluacutecares redutores totais no caldo fermentado Ef oncentraccedilatildeo de etanol no caldo fermentado η Rendimento do processo Px Produtividade em ceacutelulas Pe Produtividade em etanol
Na fermentaccedilatildeo alcooacutelica vaacuterios fatores podem influenciar no rendimento do
processo ou seja a conversatildeo de accediluacutecar em etanol entre eles a concentraccedilatildeo de
accediluacutecar e o fluxo pelo qual ele eacute adicionado e removido do reator (em processos
contiacutenuos) pH concentraccedilatildeo celular presenccedila de bacteacuterias contaminantes e o tipo
de processo adotado Na induacutestria o rendimento do processo eacute calculado baseado
na concentraccedilatildeo de accediluacutecar total que entra no sistema fermentativo sem considerar o
accediluacutecar residual podendo ser maior que 90 a 93 do valor teoacuterico da conversatildeo de
glicose em etanol (INGLEDEW 1999)
O processo de fermentaccedilatildeo mais comumente utilizado nas destilarias do
Brasil eacute utilizando a recuperaccedilatildeo de leveduras atraveacutes da centrifugaccedilatildeo do vinho
Aproximadamente 90 da levedura satildeo reutilizadas de uma fermentaccedilatildeo para a
proacutexima Esta suspensatildeo de fermento diluiacutedo e acidificado conhecido na praacutetica
com o nome de peacute-de-cuba permanece em agitaccedilatildeo de uma a trecircs horas antes de
retornar agrave dorna de fermentaccedilatildeo resultando em altas densidades celulares dentro
do reator (10-17 pv) e contribuindo para um tempo de fermentaccedilatildeo curto Isso
favorece a valores de conversotildees teoacutericos de accediluacutecares em etanol de 90 a 92
(BASSO et al 2008) valores maiores do que os obtidos no presente trabalho
(Tabela 5)
Em termos de produtividades a Tabela 5 mostra que as maacuteximas
produtividades em ceacutelulas (Px) e em etanol (Pe) foram obtidas para um alto valor de
D (01 h-1) de cerca de 055 g L-1 h-1 e 417 g L-1 h-1 respectivamente Por outro
92
lado nessas condiccedilotildees o rendimento em etanol obteve menor valor (48) Quando
a taxa de diluiccedilatildeo eacute alta os accediluacutecares satildeo adicionados a uma velocidade mais raacutepida
do que satildeo consumidos logo a perda de accediluacutecar aumenta e a concentraccedilatildeo de
etanol reduz diminuindo consequentemente a eficiecircncia do processo Como se pode
observar no trabalho de Melzoch et al (1991) a produtividade de etanol maacutexima foi
de 15 g L-1 h-1 no regime permanente com uma concentraccedilatildeo de S cereviseae de 46
g L-1 e concentraccedilatildeo de etanol de 81 g L-1 em bioreator agitado continuamente com
reciclo total de ceacutelulas utilizando a ultrafiltraccedilatildeo
Nas condiccedilotildees adotadas nessa fermentaccedilatildeo com ART de 170gL-1 optou-se
por aplicar D igual a 0025 h-1 por obter um maior valor de rendimento alcooacutelico e
gerar CO2 suficiente a ser incorporado nos cultivos de A platensis em fotobiorreator
tubular
614 Avaliaccedilatildeo dos volaacuteteis orgacircnicos no gaacutes de arraste
De acordo com os resultados obtidos pelo Instituto de Pesquisas Tecnoloacutegicas
foram encontrados nos gaacutes de arraste da fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
predominacircncia de (CO2) pequenas proporccedilotildees de etanol (C2H6O) e elementos
traccedilos de acetaldeiacutedo (C2H4O) Isso estaacute de acordo com Romano et al (2003) que
relataram as transformaccedilotildees quiacutemicas durante a fermentaccedilatildeo por leveduras
produzem principalmente CO2 e etanol e em menores quantidades a formaccedilatildeo de
CVOs Basso et al (1996) relata que durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica por levedura
os produtos da fermentaccedilatildeo satildeo constituiacutedos de 43 ndash 47 de etanol 41 - 45 de
gaacutes carbocircnico e o restante satildeo formados por outros compostos orgacircnicos tais como
glicerol aacutecido succiacutenico aacutecido aceacutetico entre outros Dentre os volaacuteteis orgacircnicos
majoritaacuterios produzidos durante a fermentaccedilatildeo de mosto de cana-de-accediluacutecar por
Saccharomyces cerevisiae encontram-se o etanol acetaldeiacutedo propanol isobutanol
aacutelcool isoamiacutelico acetato de etila (CAEHOT et al 1991)
93
62 Avaliaccedilatildeo do crescimento da A platensis
Experimento 1
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 60 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Cilindro
Tabela 6 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de carbonato
total referentes ao experimento 1
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 405 plusmn 27 1155 plusmn 000
1 590 plusmn 32 -
2 884 plusmn 24 1193 plusmn 027
3 1248 plusmn 202 -
4 1368 plusmn 99 1186 plusmn 026
5 1914 plusmn 19 -
6 2292 plusmn 103 1131 plusmn 021
7 2379 plusmn 46 -
8 2899 plusmn 17 1124 plusmn 021
9 2831 plusmn 22 -
10 2952 plusmn 76 1106 plusmn 064
Graacutefico 8 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 1
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
94
Experimento 2
Fonte de nitrogecircnio = ureacuteia Intensidade luminosa= 60 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = Cilindro
Tabela 7 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 2 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -44554x3 + 54865x2 + 14317x + 400 (60 mol de foacutetons
m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de
nitrogecircnio (mM dia -1)
0 0484
1 0691
2 0832
3 0906
4 0913
5 0853
6 0726
7 0533
8 0277
Graacutefico 9 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 2 (60 mol de foacutetons m-2 s-1)
0
02
04
06
08
1
0 2 4 6 8 10
mM
Ureacute
ia
Tempo (dias)
95
Tabela 8 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 2
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
Amocircnia total (mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 406 plusmn 000 1155 plusmn 000 - -
1 534 plusmn 49 - - -
2 906 plusmn 18 1155 plusmn 027- 132E-05 240E-04
3 1059 plusmn 37 - - -
4 1538 plusmn 137 1290 plusmn 004 136E-05 197E-04
5 2003 plusmn 94 - - -
6 2330 plusmn 28 1154 plusmn 125 135E-05 212E-04
7 2602 plusmn 25 - - -
8 2847 plusmn 0 1002 plusmn 089 338E-06 827E-04
9 2869 plusmn 14 - - -
10 2847 plusmn 56 1078 plusmn 018 681E-04
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 10 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 2
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
96
Experimento 3
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 60 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 9 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de carbonato
total referentes ao experimento 3
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 490plusmn0 1155 plusmn 000
1 591plusmn92 -
2 1193plusmn87 1224 plusmn 05
3 1430plusmn10 -
4 1959plusmn197 1234 plusmn 023
5 2161plusmn171 -
6 2445plusmn48 129 plusmn 005
7 2621plusmn102 -
8 2789plusmn82 1138 plusmn 104
9 2782plusmn125 -
10 2832plusmn89 111 plusmn 104
Graacutefico 11 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 3
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 5 10 15
X (
mg
L
-1)
Tempo (dias)
97
Experimento 4
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa = 60 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 10 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 4 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -20689x3 + 11591x2 + 33292x + 400 (60 mol de foacutetons
m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 086
1 088
2 088
3 084
4 078
5 068
6 055
7 039
8 020
Graacutefico 12 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 4 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
000
020
040
060
080
100
0 2 4 6 8 10
mM
ureacute
ia
Tempo (dias)
98
Tabela 11 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 4
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
Amocircnia total (mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 494plusmn0 1155plusmn000 - 284E-04
1 618plusmn74 - - -
2 1213plusmn59 1139 plusmn 069 218E-04
3 1498plusmn33 - - -
4 1874plusmn76 1095 plusmn 05 324E-05 221E-04
5 2250plusmn44 - - -
6 2516plusmn147 1083 plusmn 139 42E-04 829E-04
7 2694plusmn105 - - -
8 2867plusmn28 1086 plusmn 091 13E-03 308E-05
9 2871plusmn34 - -
10 2860plusmn61 118 plusmn 071 35E-04 202E-03
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 13 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 4
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg
L
-1)
Tempo (dias)
99
Experimento 5
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 120 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Cilindro
Tabela 12 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 5
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 406 plusmn 0 1155 plusmn 000
1 529 plusmn 22 -
2 894 plusmn 4 1155 plusmn 080
3 1401 plusmn 76 -
4 2118 plusmn 82 1191 plusmn 136
5 2584 plusmn 50 -
6 3209 plusmn 110 1134 plusmn 003
7 3262 plusmn 115 -
8 3302 plusmn 100 1212 plusmn 000
Graacutefico 14 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 5
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
100
Experimento 6
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa= 120 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = Cilindro
Tabela 13 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 6 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -13286x3 + 14486x2 + 62226x + 400 (120 mol de
foacutetons m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 0485
1 1010
2 1335
3 1462
4 1389
5 1117
6 0645
Graacutefico 15 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 6 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
0
02
04
06
08
1
12
14
16
0 2 4 6 8
mM
ureacute
ia
Tempo (dias)
101
Tabela 14 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 6
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total
(g L-1)
Amocircnia total
(mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 309 plusmn 00 1155 plusmn 000 - -
1 548 plusmn 10 - - -
2 797 plusmn 7 1117 plusmn 134 214E-05 197E-05
3 1267 plusmn 163 - - -
4 2062 plusmn 92 1101 plusmn 004 291E-06 182E-06
5 2558 plusmn 170 - - -
6 2980 plusmn 103 1253 plusmn 058 119E-06 252E-06
7 3093 plusmn 234 - - -
8 3266 plusmn 50 1033 plusmn 004 275E-06
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 16 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 6
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
102
Experimento 7
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 120 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 15 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 7
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 477 plusmn000 1155 plusmn 000
1 954 plusmn135 -
2 1151 plusmn140 1224 plusmn 080
3 1667 plusmn70 -
4 2165 plusmn256 1233 plusmn 136
5 2516 plusmn147 -
6 2969 plusmn23 1134 plusmn 035
7 2827 plusmn28 -
8 2969 plusmn59 1112 plusmn 114
Graacutefico 17 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 7
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
103
Experimento 8
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa= 120 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 16 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 8 de
acordo com a y = - 58128x3 + 38625x2 + 38606x + 400 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 105
1 115
2 117
3 110
4 095
5 070
6 037
Graacutefico 18 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 8 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
000
020
040
060
080
100
120
140
0 1 2 3 4 5 6 7
mM
ureacute
ia
Tempo (dias)
104
Tabela 17 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 8
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total
(g L-1) Amocircnia total
(mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 445 plusmn0 1155 plusmn 000 - -
1 767 plusmn46 - - -
2 1053 plusmn50 1117 plusmn 134 430E-04 307E-05
3 1554 plusmn31 - - -
4 2158 plusmn143 1101 plusmn 004 477E-04 273E-06
5 2552 plusmn87 - - -
6 2952 plusmn35 1253 plusmn 058 166E-04 54E-06
7 3048 plusmn96 - - -
8 3079 plusmn86 1033 plusmn 004 367E-05 194E-06
Graacutefico 19 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 8
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
105
Experimento 9
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 240 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Cilindro
Tabela 18 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 9
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 410 plusmn 0 1155plusmn000
1 815 plusmn 94 -
2 1297 plusmn 206 1117plusmn027
3 2174 plusmn 90 -
4 2625 plusmn 297 1264plusmn033
5 2994 plusmn 213 -
6 3291 plusmn 207 1246plusmn112
7 3422 plusmn 172 -
8 3299 plusmn 117 1045plusmn064
Graacutefico 20 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 9
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
106
Experimento 10
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa= 240 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = Cilindro
Tabela 19 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 10
de acordo com a equaccedilatildeo y = -12057x3 + 10082x2 + 31899x + 400 (240 mol de
foacutetons m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 101
1 134
2 148
3 145
4 123
5 083
6 025
Graacutefico 21 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 10 (240 mol de foacutetons m-2 s-1)
0
02
04
06
08
1
12
14
16
0 1 2 3 4 5 6 7
mM
Ureacute
ia
Tempo (dias)
107
Tabela 20 - Valores meacutedios de concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 10
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total
(g L-1)
Amocircnia total (mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 402 plusmn 000 1155plusmn000 - -
1 461 plusmn 62 - - -
2 839 plusmn 139 1003 plusmn 080 27994E-05
3 1705 plusmn 89 - - -
4 2663 plusmn 95 1120 plusmn 130 153E-05 65768E-06
5 3015 plusmn 78 - - -
6 3236 plusmn 72 1101 plusmn 058 178E-05 95016E-05
7 3307 plusmn 30 - - -
8 3293 plusmn 113 1200 plusmn 017 232E-06 75662E-05
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 22 concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 10
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10
Xm
(m
gL
-1)
Tempo (dias)
108
Experimento 11
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 240 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 21 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 11
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 358plusmn0 1155plusmn000
1 976plusmn53 -
2 1298plusmn61 1003plusmn27
3 1928plusmn78 -
4 2428plusmn207 1141plusmn014
5 2834plusmn199 -
6 3102plusmn130 1053plusmn161
7 2969plusmn59 -
8 3109plusmn19 965plusmn079
Graacutefico 23 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 11
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
109
Experimento 12
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa= 240 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 22 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 12
de acordo com a equaccedilatildeo y = -82763x3 + 62437x2 + 37265x + 400 (240 mol de
foacutetons m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 107
1 126
2 132
3 126
4 107
5 077
6 033
Graacutefico 24 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 12 (240 mol de foacutetons m-2 s-1)
000
020
040
060
080
100
120
140
0 2 4 6 8
mM
ureacute
ia
Tempo (dias)
110
Tabela 23 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amonia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 12
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total
(g L-1) Amocircnia total
(mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 400plusmn0 1155plusmn000 - -
1 625plusmn228 - - -
2 1095plusmn802 1003 plusmn 080 477E-05
3 1562plusmn357 - -
4 1912plusmn47 1120 plusmn 130 95E-05 110E-04
5 2609plusmn231 - -
6 3071plusmn111 1101 plusmn 058 220E-05 126E-04
7 3180plusmn820 - -
8 3200plusmn734 1200 plusmn 017 25E-06
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 25 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 12
Resultados do processo descontiacutenuo alimentado no cultivo de Arthrospira
(Spirulina) platensis utilizando CO2 proveniente de cilindro ou de fermentaccedilatildeo
alcooacutelica com diferentes fontes de nitrogecircnio (nitrato de soacutedio ou ureacuteia) e intensidade
luminosas (60 120 ou 240 mol de foacutetons m-2 s-1) podem ser observados nos
Graacuteficos 8 10 11 13 14 17 18 20 22 23 e 26
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
X (
mg
L
-1)
Tempo (dias)
111
Os perfis das curvas de crescimento foram semelhantes com ausecircncia da fase
lag no cultivo de A platensis no iniacutecio do cultivo crescendo exponencialmente e
estabilizando na fase estacionaacuteria As diferentes fontes de nitrogecircnio (nitrato e ureacuteia)
utilizadas nas diferentes intensidades luminosas (60 120 e 240 mol de foacutetons m-2 s-1
avaliadas) natildeo influenciaram nos perfis das curvas de crescimento Essa
caracteriacutestica foi observada em trabalhos anteriores de Pelizer et al (2003) e Danesi
et al (2002) Isso se deve a semelhanccedila nas condiccedilotildees de crescimento tais como
composiccedilatildeo quiacutemica do meio de cultura e temperatura de crescimento entre a
preparaccedilatildeo do inoacuteculo e o cultivo Outro fator eacute que as ceacutelulas para a preparaccedilatildeo do
inoacuteculo estavam na fase exponencial de crescimento isto eacute o inoacuteculo era um cultivo
jovem constituiacutedo de ceacutelulas ativas De fato Pelizer et al (2003) que trabalharam
com KNO3 como fonte de nitrogecircnio relataram a influecircncia da idade do inoacuteculo no
crescimento da S platensis comprovando que a utilizaccedilatildeo de inoacuteculo no 6ordm dia de
cultivo proporcionou maiores valores no crescimento celular em cultivos realizados
em minitanques Nessas condiccedilotildees tambeacutem natildeo detectaram fase lag de
crescimento
Autores como Danesi et al (2002) trabalhando com ureacuteia como fonte de
nitrogecircnio tambeacutem natildeo observaram a presenccedila de fase lag no cultivo de S
platensis De fato mesmo em cultivos onde o inoacuteculo foi cultivado em meio com
nitrato como eacute o caso do presente trabalho seria esperado que o uso de fontes de
nitrogecircnio que levem agrave presenccedila de amocircnia no meio de cultivo natildeo apresentasse
fase lag de crescimento celular pois a amocircnia eacute a fonte de nitrogecircnio
preferencialmente utilizada pela S platensis (BOUSSIBA 1989 BELKIN
BOUSSIBA 1991b)
A fonte de nitrogecircnio no meio de cultura eacute nutriente fundamental para o
crescimento de micro-organismos fotossintetizantes (WEN CHEN 2001) Diferentes
fontes de nitrogecircnio inorgacircnico para o cultivo de S platensis tem sido estudados tais
como cloreto de amocircnio (CARVALHO et al 2004) sulfato de amocircnio (SOLETTO et
al 2005) nitrato de amocircnio fosfato de amocircnio (COSTA et al 2001) nitrato de soacutedio
(SCHLOumlSSER 1982) nitrato de potaacutessio (PAOLLETI 1975) e ureacuteia (SAacuteNCHEZ-
LUNA et al 2004)
Comparando-se os cultivos com nitrato (Graacuteficos 8 11 14 17 20 e 23) e os
cultivos com ureacuteia (Graacuteficos 10 13 16 19 22 e 25) para cada intensidade luminosa
e fonte de CO2 estudada observam-se que as curvas de crescimento dos cultivos e
112
as concentraccedilotildees celulares diaacuterias com ureacuteia foram semelhantes as curvas de
crescimentos e as concentraccedilotildees celulares diaacuterias utilizando nitrato Isso mostra que
a equaccedilatildeo de alimentaccedilatildeo com ureacuteia (Graacuteficos 9 12 15 18 21 e 24) obtida em
cada intensidade luminosa e fonte de CO2 reproduziu seu respectivo cultivo
utilizando o nitrato
Como pode ser observado nas Tabelas 8 1114 17 20 e 23 as concentraccedilotildees
de amocircnia e ureacuteia residual durante os cultivos sempre apresentaram concentraccedilotildees
inferiores ou proacuteximas 10-4 molar mostrando que natildeo houve acuacutemulo de amocircnia e
ureacuteia residual nos cultivos e essa concentraccedilatildeo tambeacutem satildeo consideradas natildeo
toacutexicas pois esta concentraccedilatildeo torna-se toacutexica numa concentraccedilatildeo acima de 10 mM
e inibitoacuteria na concentraccedilatildeo de 17 mM a 2 mM (ABELIOVICH AZOV 1976
CARVALHO et al 2004 CONVERTI et al 2006b)
O nitrato eacute fonte de nitrogecircnio convencional nos cultivos de micro-oganismo e eacute
encontrado em abundacircncia em ambientes naturais No entanto o emprego de
nitrato em meio sinteacutetico utilizado na produccedilatildeo comercial de micro-organismos
pode aumentar custo do produto final Por isso fontes de nitrogecircnio alternativas tecircm
sido estudadas visando agrave reduccedilatildeo nos custo de produccedilatildeo
Ureacuteia tem sido considerada uma fonte alternativa de nitrogecircnio no cultivo de S
platensis por proporcionar um aumento da concentraccedilatildeo celular (SASSANO et al
2004 SOLETTO et al 2005 DANESI et al 2004) e por ter alta competitividade
econocircmica Isso decorre do seu baixo custo e alto conteuacutedo de nitrogecircnio tendo
como consequumlecircncia o baixo custo por unidade de nitrogecircnio quando comparada a
outras fontes de nitrogecircnio
A ureacuteia quando hidrolisada origina duas moleacuteculas de amocircnia e uma de
dioacutexido de carbono Essa conversatildeo ocorre primeiramente quando a ureacuteia
(CO(NH2)2) combina com a aacutegua (hidroacutelise) e forma o carbonato de amocircnio
((NH4)2CO3) Esse composto eacute instaacutevel e decompotildee para formar o gaacutes amocircnia (NH3)
e o dioacutexido de carbono (CO2) (DORN 2007) A amocircnia por sua vez eacute uma moleacutecula
pequena e natildeo carregada que se move relativamente livre atraveacutes da bicamada
lipiacutedica Um possiacutevel mecanismo para a assimilaccedilatildeo da amocircnia pode envolver a
simples difusatildeo da amocircnia seguindo pelo seu aprisionamento atraveacutes da
protonaccedilatildeo uma vez que dependendo do pH (pH 8) em que se encontra a amocircnia
reage com a aacutegua formando o iacuteon amocircnio (NH4+) Portanto a membrana eacute
permeaacutevel agrave amocircnia mas impermeaacutevel ao iacuteon amocircnio (BOUSSIBA et al 1984)
113
Costa et al (2001) em estudos comparativos usando diferentes fontes de
nitrogecircnio em processo descontiacutenuo no cultivo de S platensis observaram que
001 M de ureacuteia ou nitrato de amocircnio proporcionaram maiores concentraccedilotildees
celulares de aproximadamente 1g L-1 natildeo diferindo estatisticamente do cultivo com
o nitrato de soacutedio No entanto nos cultivos com maiores concentraccedilotildees dessas
fontes de nitrogecircnio (003 M e 005 M) natildeo houve crescimento celular
Costa et al (2004) avaliaram o crescimento da S platensis na lagoa Mangueira
suplementando ureacuteia por processo descontiacutenuo alimentado e observaram um
aumento de 267 vezes na concentraccedilatildeo da biomassa no cultivo suplementado com
1125 mg L-1 de ureacuteia quando comparada nos cultivos natildeo suplementado com ureacuteia
No entanto nos cultivos com 2250 mg L-1 de ureacuteia houve uma reduccedilatildeo na
concentraccedilatildeo celular Isso sugere que a adiccedilatildeo de ureacuteia na lagoa Mangueira eacute
beneacutefica ao crescimento da S platensis mas se adicionada em altas concentraccedilotildees
podem inibir o crescimento Por outro lado Soletto et al (2005) compararam cultivos
de S platensis utilizando processo descontiacutenuo com a mesma concentraccedilatildeo de
sulfato de amocircnio ou ureacuteia como fonte de nitrogecircnio e observaram que na
concentraccedilatildeo de 17 mM houve um raacutepido crescimento da biomassa quando
utilizado ureacuteia e houve uma inibiccedilatildeo no crescimento quando utilizado o sulfato de
amocircnio Como sugerido em trabalhos preacutevios a accedilatildeo simultacircnea das condiccedilotildees
alcalina (DANESI et al 2002) e a accedilatildeo da urease (CARVAJAL et al 1982
SHIMAMATSU 2004) poderia ter promovido a hidroacutelise da ureacuteia em amocircnia
acoplado com a assimilaccedilatildeo da amocircnia pelas ceacutelulas minimizando portanto a
inibiccedilatildeo pela amocircnia
Sassano et al (2004) observaram que utilizando 500 mg L-1 de massa total de
ureacuteia alimentada durante 12 dias proporcionou aumento na concentraccedilatildeo de S
platensis em minitanques quando comparadas ao emprego do nitrato
Su et al (2007) observaram que o maior desempenho em termos de
rendimento de biomassa e conteuacutedo de lipiacutedios durante o crescimento da Isochrysis
galbana foi no meio contendo ureacuteia como fonte de nitrogecircnio indicando que a ureacuteia
eacute a fonte preferencial de nitrogecircnio em relaccedilatildeo ao (NH4)2SO4 e NH4Cl
O emprego da ureacuteia pode levar a inibiccedilatildeo do crescimento celular Em condiccedilatildeo
alcalina ou a presenccedila de urease no meio de cultivo hidrolisa uma moleacutecula de ureacuteia
em duas moleacuteculas de amocircnia e esta em altas concentraccedilotildees eacute considerada toacutexica
para as ceacutelulas (SASSANO et al 2004) Por outro lado quando em baixas
114
concentraccedilotildees podem limitar o crescimento uma vez que a presenccedila nitrogecircnio eacute
fundamental para o crescimento e manutenccedilatildeo celular Por isso o modo de adiccedilatildeo
de ureacuteia eacute importante para melhorar a produtividade do cultivo
O modo de alimentaccedilatildeo empregado no cultivo de ureacuteia pode prevenir o
acuacutemulo ou a falta desse nutriente no cultivo Sanchez-Luna et al (2004) relataram
que a adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia a uma taxa constante pode ser usada no cultivo de S
platensis implicando em baixo custo na produccedilatildeo da biomassa por natildeo precisar de
bombas para alimentaccedilatildeo
A baixa concentraccedilatildeo de nitrogecircnio no cultivo limita o crescimento celular Por
outro lado a alta concentraccedilatildeo de nitrogecircnio inibe o mesmo Deste modo foram
feitos cultivos de A platensis utilizando a fonte de nitrogecircnio convencional (NaNO3)
para se observar a necessidade diaacuteria de nitrogecircnio consumida pelas ceacutelulas nas
diferentes intensidades luminosas e com base nessas curvas de crescimento
obtidas foram calculadas as quantidades de ureacuteia diaacuteria necessaacuterias visando evitar
a limitaccedilatildeo ou inibiccedilatildeo de crescimento celular pela fonte de nitrogecircnio como pode-se
observar nas Tabelas 7 9 10 13 16 19 e 22 Aleacutem disso foi empregado o
processo descontiacutenuo alimentado que deve ser usado para melhorar a densidade
celular no crescimento da A platensis desde que a concentraccedilatildeo de nitrogecircnio
soluacutevel possa ser adicionada ateacute alcanccedilar a produccedilatildeo maacutexima de biomassa sem
resultar na inibiccedilatildeo do crescimento
Outro fator importante no crescimento celular de micro-organismos
fotossintetizantes eacute a intensidade luminosa Nas culturas fotossinteacuteticas a
quantidade de energia luminosa captadas pelas ceacutelulas tem uma relaccedilatildeo direta com
a capacidade de fixaccedilatildeo do CO2 consequentemente a luz determina a
produtividade e a taxa de crescimento celular As diferentes intensidades luminosas
estudadas influenciaram nas concentraccedilotildees celulares maacuteximas Um aumento da
intensidade luminosa de 60 mol de foacutetons m-2 s-1 para 120 mol de foacutetons m-2 s-1
houve um aumento no valor da concentraccedilatildeo celular maacutexima No entanto um
aumento da intensidade luminosa de 120 mol de foacutetons m-2 s-1 para 240 mol de
foacutetons m-2 s-1 as concentraccedilotildees celulares maacuteximas obtiveram valores proacuteximos
Geralmente a taxa de crescimento das ceacutelulas microalgas aumenta com a
intensidade luminosa e a taxa atinge um valor de saturaccedilatildeo quanto maior for a
intensidade luminosa porque o excesso da energia luminosa natildeo pode ser utilizada
para a fotossiacutentese nas ceacutelulas e quando submetidas a um valor de intensidade
115
luminosa ainda maior o crescimento celular eacute reprimido como relatado por Hirata et
al (1998) e Chojnacka e Noworyta (2004a)
Segundo Hirata et al (1998) e Chojnacka e Noworyta (2004a) existe uma
correlaccedilatildeo entre o crescimento da Arthrospira ssp e a intensidade luminosa que satildeo
definidas por regiotildees denominadas regiatildeo limitada por luz saturada por luz e inibida
por luz A regiatildeo saturada por luz eacute definida como alta intensidade luminosa onde o
crescimento celular independe da intensidade luminosa Essa regiatildeo saturada por
luz pode ser observada no presente trabalho uma vez que o aumento da
intensidade luminosa natildeo interferiu na concentraccedilatildeo celular maacutexima O intervalo da
intensidade luminosa dessas regiotildees depende de vaacuterios fatores como configuraccedilatildeo
do reator micro-organismo condiccedilotildees de cultivo
S platensis cultivada em reator retangular alcanccedilou um aumento no valor da
velocidade especiacutefica de crescimento com o aumentou da intensidade luminosa de 8
a 34 W m-2 mas foi reduzido quando a intensidade luminosa aumentou de 34 W m-2
(156 mol de foacutetons m-2 s-1) para 158 W m-2 (724 mol de foacutetons m-2 s-1) e foi
completamente reprimida a 158 W m-2 (HIRATA et al 1998) Chojnacka e Noworyta
(2004a) avaliando o cultivo fotoautotroacutefico da S platensis em reator retangular
tambeacutem concluiacuteram que a velocidade de crescimento especiacutefica aumenta com o
aumento da intensidade luminosa ateacute um valor de 30 W m-2 Entre os valores de
intensidade luminosa de 30 W m-2 (138 mol de foacutetons m-2 s-1) a 50 W m-2 (229 mol
de foacutetons m-2 s-1) observa-se a regiatildeo de saturaccedilatildeo luminosa e acima desse valor
(50 W m-2) ocorre o fenocircmeno da fotoinibiccedilatildeo
Nos cultivos sob maiores intensidades luminosas (120 e 240 mol de foacutetons m-2
s-1) desenvolveram uma coloraccedilatildeo amarelada no decorrer do cultivo por outro lado
no cultivo a 60 mol de foacutetons m-2 s-1 as ceacutelulas apresentaram uma coloraccedilatildeo mais
verde-azulada claacutessica Como eacute bem conhecido sob condiccedilotildees limitantes de
nitrogecircnio o conteuacutedo de clorofila da S platensis diminui apresentando uma
coloraccedilatildeo verde-amarelada ao contraacuterio da coloraccedilatildeo verde-azulada claacutessica
(CARVALHO et al 2004) No entanto no presente estudo como natildeo houve
limitaccedilatildeo de nitrogecircnio durante os cultivos essa coloraccedilatildeo amarelada pode ser
devido agrave alta intensidade luminosa uma vez que as intensidades luminosas
estudadas atingiram a regiatildeo saturado por luz como definido por Hirata et al (1998)
e Chojnacka e Noworyta (2004a) Do mesmo modo Vonshak et al (1996) relataram
que o crescimento da S platensis torna-se saturado a um intervalo de 150 a 200
116
mol de foacutetons m-2 s-1 e esta faixa da intensidade luminosa corresponde a
aproximadamente de 10-15 da radiaccedilatildeo solar total a 400-700 nm
Geralmente o pH do meio aumenta durante o crescimento celular devido agrave
assimilaccedilatildeo da fonte de carbono o bicarbonato durante a fotossiacutentese (WATANABE
et al 1995 BINAGHI et al 2003) Os iacuteons bicarbonato satildeo transportados
ativamente para o interior celular convertidos a carbonato e gaacutes carbocircnico que eacute
utilizado na fotossiacutentese Para cada moleacutecula de CO2 utilizada pela ceacutelula ocorre a
liberaccedilatildeo de um iacuteon carbonato O pH da cultura foi mantido a 95 02 (SANCHEZ-
LUNA et al 2007 TREDICI ZITTELLI 1998) logo o CO2 consumido pelo micro-
organismo foi reposto por CO2 natildeo havendo modificaccedilotildees severas do pH o que
acarretaria uma reduccedilatildeo no crescimento da S platensis Valores de pH altos por
exemplo acima de 11 pode ser um fator no qual restringe a produtividade no
sistema air-lift usando ar natildeo suplementado com CO2 (WATANABE et al 1995)
Normalmente culturas de microorganismos fotossinteacuteticos usam como fonte
de carbono o bicarbonato eou carbonato Estes nutrientes satildeo adicionados em
grande quantidade no meio Schloumlsser para o cultivo de A platensis (1208 g L-1)
Adicionalmente estes micro-organismos tecircm a capacidade de fixar CO2 como fonte
de carbono na qual eacute liberado pelos efluentes industriais Logo este CO2 pode ser
adicionado ou substituiacutedo no meio de cultura reduzindo os custos da produccedilatildeo de
microorganismos fotossinteacuteticos bem como reduzindo os problemas ambientais
causados por esse gaacutes
O sequestramento de CO2 mostrou ser efetivo nas ceacutelulas de Chlorella
vulgaris e a presenccedila da mistura de CVOs (benzeno tolueno acetona metanol e
naftaleno) presente no efluente natildeo interferiu no uso desse CO2 e adicionalmente
11 dos CVOs foram removidos (KEFFER KLEINHEINZ 2002)
Diferentes autores relataram sobre o crescimento mixotroacutefico da A platensis
na presenccedila de glicose (ZHANG et al 1998 CHOJNACKA NOWORYTA 2004) ou
acetato (CHEN et al 2006) Maacuterquez et al (1993) mostraram que a S platensis eacute
capaz de crescer heterotroficamente ou mixotroficamente na presenccedila de glicose
sugerindo que o crescimento autotroacutefico e heterotroacutefico satildeo independentes Em
cultivos mixotroacuteficos o CO2 e composto orgacircnico satildeo assimilados conjuntamente
podendo ser um processo mais eficiente para a produccedilatildeo de biomassa microalgal
desde que isto implica em uma economia em energia usada para a siacutentese do
aparato fotossinteacutetico e para a fixaccedilatildeo do carbono (LEE 2004) Chen et al (2006)
117
mostraram que o acetato pode ser usado como fonte de carbono em cultivos
mixotroacuteficos de S platensis para a produccedilatildeo de vaacuterios pigmentos fotossinteacuteticos e
obtenccedilatildeo da concentraccedilatildeo de biomassa maacutexima (165 g Lminus1) na qual obtiveram
valores maiores que usando apenas bicarbonato (108 g L-1)
Menzyanova et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de pequenas quantidades
de etanol (01 - 03) aumentou a concentraccedilatildeo de Dunaliella viridis enquanto que
em quantidades maiores que 05 natildeo houve efeito no crescimento A adiccedilatildeo
muacuteltipla e sucessiva de etanol no cultivo favoreceu a um acuacutemulo de etanol no meio
de cultivo o que provocou uma inibiccedilatildeo o crescimento da D viridis quando a
concentraccedilatildeo de etanol foi de 03 e causou a morte celular na concentraccedilatildeo de
etanol de 05
Apesar do etanol ser o CVO predominante no material gasoso sua proporccedilatildeo
em relaccedilatildeo ao CO2 eacute pequena (resultados obtidos pelo instituto de Pesquisa
Tecnoloacutegica) Assim no presente trabalho natildeo se observou um efeito dos volaacuteteis
orgacircnicos (CVOs) liberados da fermentaccedilatildeo alcooacutelica no cultivo de A platensis
Esses CVOs satildeo constituiacutedos a maior parte por 43 ndash 47 de etanol (Basso et al
1996) e em menor quantidade acetaldeiacutedo propanol isobutanol aacutelcool isoamiacutelico e
acetato de etila (CAEHOT et al 1991) Logo A platensis pode ser usada para o
tratamento de efluentes gasosos nas induacutestrias de fermentaccedilatildeo alcooacutelica Logo
observou-se que o efluente gasoso liberado das induacutestrias de fermentaccedilatildeo alcooacutelica
pode ser usado no cultivo de A platensis sem prejudicar o crescimento celular
Similarmente Ferraz et al (1985) observaram que eacute possiacutevel cultivar S
maxima em reatores abertos (open ponds) borbulhando o CO2 proveniente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica de modo descontiacutenuo e usando nitrato com fonte de
nitrogecircnio
A adiccedilatildeo de CO2 no reator aleacutem de controlar o pH fornece a fonte de
carbono para o crescimento celular Como pode ser observado nas Tabelas 6 8 9
11 12 14 15 17 18 20 21 e 23 mesmo ocorrendo o crescimento celular as
concentraccedilotildees de carbonato total sempre apresentaram valores altos de um modo
geral proacuteximos aos 1208 g L-1 iniciais (concentraccedilatildeo indicada em Schloumlsser et al
1982) indicando que os cultivos tambeacutem natildeo foram limitados pela fonte de carbono
Durante a fotossiacutentese oxigecircnica realizada pela S platensis ocorre a
liberaccedilatildeo de O2 no meio de cultura Elevadas concentraccedilotildees de O2 no meio de
cultura pode prejudicar o crescimento celular uma vez que este pode danificar o
118
aparato fotossinteacutetico dificultando a realizaccedilatildeo da fotossiacutentese Por isso a
concentraccedilatildeo de O2 deve ser controlada durante o crescimento celular As
concentraccedilotildees de oxigecircnio foram analisadas diariamente e os valores natildeo atnigiram
niacuteveis inibitoacuterios pois foram sempre menores que 10 mg L-1 (Vonshak 1997)
119
63 Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm)
Produtividade em ceacutelulas (Px) e Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN)
Na Tabela 24 estatildeo descritos os valores da concentraccedilatildeo celular maacutexima
produtividade em ceacutelulas e fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas Nas Tabelas
25 28 e 31 estatildeo descritos a anaacutelise de variacircncia dos paracircmetros cineacuteticos Xm Px
e YXN respectivamente Os valores meacutedios de Xm Px e YXN para cada variaacutevel
independente estatildeo descritos nas Tabelas 26 27 29 30 32 e 33
Tabela 24 - Valores da concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) produtividade em ceacutelulas
(Px) e fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) com diferentes fontes de
CO2 fontes de nitrogecircnio e intensidades luminosas
Experimento Fonte de CO2 Intensidade luminosa (I)
Fonte de nitrogecircnio
Xm
(mg L-1)
Px
(mg L-1 d-1)
YXN
(g g-1)
1 Cilindro 60 NaNO3 2899 plusmn 17 250 plusmn 2 42 plusmn 003
2 Cilindro 60 Ureacuteia 2847plusmn 1 245 plusmn 1 14 plusmn 000
3 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 60 NaNO3 3120plusmn156 299 plusmn10 40 plusmn 014
4 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 60 Ureacuteia 2957 plusmn 99 308 plusmn 4 14 plusmn 017
5 Cilindro 120 NaNO3 3209plusmn109 454 plusmn18 45 plusmn 018
6 Cilindro 120 Ureacuteia 2980plusmn103 408 plusmn17 11 plusmn 050
7 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 120 NaNO3 2728 plusmn 27 428 plusmn 4 43 plusmn 004
8 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 120 Ureacuteia 2855 plusmn 11 425 plusmn 6 15 plusmn 02
9 Cilindro 240 NaNO3 3291plusmn206 482 plusmn 34 54 plusmn 038
10 Cilindro 240 Ureacuteia 3236 plusmn 72 473 plusmn 12 133plusmn034
11 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 240 NaNO3 3102plusmn130 450 plusmn 22 50 plusmn 024
12 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 240 Ureacuteia 3070plusmn112 445 plusmn19 14 plusmn 056
I = mol de foacutetons m-2
s-1
631 Concentraccedilatildeo celular maacutexima
Na Tabela 25 estatildeo apresentados os resultados da anaacutelise de variacircncia da
concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) e nas Tabelas 26 e 27 estatildeo apresentadas as
120
meacutedias do Xm nas variaacuteveis independentes fontes de nitrogecircnio e intensidades
luminosas respectivamente
Tabela 25 - Anaacutelise de variacircncia para a concentraccedilatildeo celular maacutexima
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
13585 1 13585 157 0225
Fonte de Nitrogecircnio
84 1 84 001 0922
Intensidade luminosa
443083 2 221542 2566 0000
Resiacuteduos 164033 19
total 620786 23
Como se observa na Tabela 25 a variaacutevel independente intensidade luminosa
foi estatisticamente significante na determinaccedilatildeo do Xm (p = 0000) enquanto que
as variaacuteveis independentes fontea de CO2 (p = 0225) e fonte de nitrogecircnio (p =
0922) natildeo influenciaram estatisticamente no valor de Xm De fato a similaridade das
fontes de nitrogecircnio jaacute era esperada uma vez que a adiccedilatildeo de ureacuteia nos cultivos para
cada intensidade luminosa foram baseadas em seus respectivos cultivos com nitrato
visando um crescimento celular natildeo limitado e nem inibido pela fonte de nitrogecircnio e
obtendo portanto valores de Xm meacutedios semelhantes Ambas as fontes de nitrogecircnio
utilizadas satildeo facilmente assimiladas pela A platensis os valores de Xm foram
estatisticamente iguais para cada intensidade luminosa avaliada (Tabela 26)
Em relaccedilatildeo agrave fonte de CO2 Isto mostra que o CO2 e os volaacuteteis orgacircnicos
liberados na atmosfera como resiacuteduo podem ser utilizados como fonte de carbono
no cultivo de A platensis sem prejudicar o crescimento celular
Tabela 26 - Meacutedias das concentraccedilotildees celular maacutexima para a variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio
Fonte de nitrogecircnio Xm meacutedia (mgL-1)
Nitrato 3027 plusmn 162ordf
Ureacuteia 3031 plusmn 174ordf
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
121
Comparando-se as meacutedias de Xm entre as diferentes intensidades luminosas
observa-se que o valor meacutedio de Xm na intensidade luminosa de 60 mol de foacutetons
m-2 s-1 foi estatisticamente diferente ao valor meacutedio de Xm quando a intensidade
luminosa foi de 120 mol de foacutetons m-2 s-1 e este foi estatisticamente semelhante ao
valor meacutedio de Xm quando a intensidade luminosa foi de 240 mol de foacutetons m-2 s-1
(Tabela 27) Essas comparaccedilotildees das meacutedias de Xm explicam o valor do niacutevel
descritivo obtido pela anaacutelise de variacircncia para a variaacutevel intensidade luminosa (p
=0000 Tabela 25) mostrando que a esta influencia no valor de Xm Esses
resultados estatildeo de acordo com Chojnacka e Noworyta (2004a) que avaliaram o
cultivo fotoautotroacutefico da S platensis em reator retangular tambeacutem concluiacuteram que a
velocidade de crescimento especiacutefica aumenta com o aumento da intensidade
luminosa ateacute um valor de 30 W m-2 (138 mol de foacutetons m-2 s-1) Entre os valores de
intensidade luminosa de 30 W m-2 (138 mol de foacutetons m-2 s-1) a 50 W m-2 (229 mol
de foacutetons m-2 s-1) observa-se a regiatildeo de saturaccedilatildeo luminosa Acima desse valor (50
W m-2) ocorre o fenocircmeno da fotoinibiccedilatildeo Do mesmo modo no presente trabalho
os valores de Xm foram estatisticamente iguais nas intensidades luminosas de 120
mol de foacutetons m-2 s-1 e 240 mol de foacutetons m-2 s-1 cujas intensidades luminosas satildeo
proacuteximas agraves intensidades luminosas que correspondem agrave regiatildeo de saturaccedilatildeo
luminosa observada por Chojnacka e Noworyta (2004a)
Tabela 27 - Meacutedias das concentraccedilotildees celular maacutexima para a variaacutevel independente
intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(mol de foacutetons m-2 s-1)
Xm meacutedia (mgL-1)
60 2851plusmn54ordf
120 3056plusmn115b
240 3180plusmn96b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
A maior concentraccedilatildeo celular maacutexima encontrada nesse trabalho foi maior do
que a obtida por Binaghi et al (2003) utilizando minitanques no cultivo de S
platensis (15 g L-1) e tambeacutem maior que a obtida por Watanabe e Hall (1996)
utilizando fotobiorreator tubular cocircnico no cultivo de S platensis (13 g L-1)
122
Morais e Costa (2007a) relataram que em cultivo de S platensis em
fotobiorreator tubular vertical obtiveram maiores valores de Xm de 413 g L-1
suplementado com 6 CO2 quando comparadas em cultivos em Erlenmeyer Esses
autores relatam que a S platensis podem crescer com 18 CO2 demonstrando que
estes suportam altas concentraccedilotildees de CO2 podendo ser usado para mitigar o efeito
do CO2 emitido pelos gases efluentes
Olguiacuten et al (2001) avaliando o crescimento da S platensis em meio contendo
aacutegua do mar suplementado com efluentes anaeroacutebicos a partir da digestatildeo de
resiacuteduo da suinocultura e em meio Zarrouk tambeacutem observaram um aumento no
valor de Xm com o aumento da intensidade luminosa de 66 mol de foacutetons m-2 s-1
para 144 mol de foacutetons m-2 s-1
632 Produtividade volumeacutetrica de ceacutelulas
Na Tabela 28 estatildeo apresentados os resultados da anaacutelise de variacircncia da
produtividade em ceacutelulas (Px) e nas Tabelas 29 e 30 estatildeo apresentadas as meacutedias
do Px nas variaacuteveis independentes fontes de nitrogecircnio e intensidades luminosas
respectivamente
Tabela 28 - Anaacutelise de variacircncia para a produtividade em ceacutelulas
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
315 1 315 137 0256
Fonte de Nitrogecircnio
1 1 1 000 0947
Intensidade luminosa
116579 2 58289 25372 0000
Resiacuteduos 4365 19 230
total 121260 23
Avaliando-se os paracircmetros produtividades em ceacutelulas pela anaacutelise de
variacircncia (Tabela 28) pode-se notar que a fonte de CO2 (p=0256) e a de nitrogecircnio
(p=0947) natildeo interferiram nas produtividades em celulares Portanto a intensidade
luminosa mostrou ser estatisticamente significante no valor de Px (p=0000)
123
Tabela 29 - Meacutedias das produtividades em ceacutelulas para a variaacutevel independente
fonte de nitrogecircnio
Fonte de nitrogecircnio Px meacutedio (mgL-1 d-1)
Nitrato 404 plusmn 74ordf
Ureacuteia 405 plusmn 75ordf
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
Como se pode observar na Tabela 29 os valores meacutedios de Px para as
diferentes fontes de nitrogecircnio estudadas natildeo diferiram estatisticamente Do mesmo
modo como ocorreu com o paracircmetro Xm os valores de Px nos cultivos com ureacuteia e
nitrato foram semelhantes para cada intensidade luminosa Isso jaacute era esperado
uma vez que a adiccedilatildeo de ureacuteia nos cultivos para cada intensidade luminosa foram
baseadas em seus respectivos cultivos com nitrato Spirulina platensis cultivadas em
minitanques com 257 mg L-1 de KNO3 ou 500 mg L-1 de ureacuteia obtiveram valores de
Px semelhantes para as intensidades luminosas estudadas 14 klux (168 mol de
foacutetons m-2 s-1) ou 56 klux (672 mol de foacutetons m-2 s-1) (RANGEL-YAGUI et al 2004)
Tabela 30 - Meacutedias das produtividades em ceacutelulas para a variaacutevel independente intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(mol de foacutetons m-2 s-1)
Px meacutedio (mgL-1)
60 306plusmn7a
120 443plusmn19b
240 463plusmn16b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
Os maiores valores de produtividade em ceacutelulas foram encontrados nas
maiores intensidades luminosas obtendo valores meacutedios de 443 plusmn 19 mg L-1 d-1 a
120 μmol de foacutetons m-2 s-1 e 463 plusmn 16 mg L-1 d-1 a 240 μmol de foacutetons m-2 s-1
independente da fonte de nitrogecircnio utilizada (Tabela 30) Durante a fotossiacutentese as
ceacutelulas podem utilizar somente uma soma limitada de energia luminosa por vez
Este fenocircmeno de saturaccedilatildeo luminosa eacute provavelmente resultado de um mecanismo
interno onde as ceacutelulas podem realizar a fotossiacutentese usando somente uma
124
determinada quantidade de luz (CARLOZZI 2003) Isso significa que durante a
saturaccedilatildeo luminosa um aumento da intensidade luminosa natildeo permitiraacute um
aumento da concentraccedilatildeo celular e nem reduziraacute o tempo de cultivo mantendo
proacuteximos os valores de produtividades de ceacutelulas nesse intervalo de saturaccedilatildeo
luminosa
Na menor intensidade luminosa (60 mol de foacutetons m-2 s-1) o valor de Px foi
menor em relaccedilatildeo agraves outras intensidades luminosas obtendo valor meacutedio de 306 plusmn 7
mg L-1 d-1 Do mesmo modo como observado nas outras intensidades luminosas as
fontes de nitrogecircnio estudadas natildeo influenciaram na produtividade celular Essa
diferenccedila nos valores de Px entre as intensidades luminosas foi devido a um maior
tempo de cultivo nos experimentos submetidos agrave intensidade luminosa de 60 mol
de foacutetons m-2 s-1 A produtividade eacute uma razatildeo inversa do tempo de cultivo logo
quanto maior a intensidade luminosa mais raacutepida as ceacutelulas atingem a concentraccedilatildeo
celular maacutexima e consequentemente maior seraacute a produtividade celular diaacuteria
Quanto maior a intensidade luminosa maior eacute a quantidade de foacutetons emitidos e
estes podem ser absorvidos pelas ceacutelulas isto eacute maior eacute a quantidade de energia
luminosa que seraacute convertido em energia quiacutemica que por sua vez as ceacutelulas
utilizam essa energia quiacutemica para a manutenccedilatildeo e o crescimento celular Esse
efeito tambeacutem foi observado por Danesi et al (2004) Rangel-Yagui et al (2004) em
cultivos de S platensis em minitanques utilizando KNO3 ou ureacuteia como fontes de
nitrogecircnio
O maior valor da produtividade encontrada nesse trabalho foi proacuteximo a 510 mg
L-1 d-1 obtido por Watanabe e Hall (1996) investigando o crescimento da S platensis
em fotobiorreator helicoidal cocircnico sob ciclos 12h12h (claroescuro) e uma meacutedia
de fluxo de foacutetons de 546 mol de foacutetons m-2 s-1 Watanabe et al (1995) em
processo descontiacutenuo utilizando a S platensis cultivada em fotobiorreator tubular
helicoidal cocircnico utilizando luz artificial (118 mol de foacutetons m-2 s-1) tambeacutem
obtiveram uma produtividade volumeacutetrica diaacuteria de 051 g L-1d-1 Foram usados dois
sistemas (airlift e bomba) para reciclar a cultura Com o sistema airlift os autores
encontraram a maior concentraccedilatildeo da biomassa de 16 g L-1 apoacutes 5 dias de
crescimento da S platensis e uma menor concentraccedilatildeo da biomassa quando
utilizado o sistema de bomba No fotobiorreator tubular helicoidal cocircnico quando
cultivado em ambiente externo a produtividade foi de 900 mg L-1 d-1 (TREDICI
125
ZITTELLI 1998) Travieso et al (2001) encontrou uma produtividade maacutexima de
040 g Lminus1 dminus1 em fotobiorreator tubular helicoidal operado de modo semicontiacutenuo
No presente trabalho os maiores valores da produtividade em ceacutelulas
encontradas foram maiores do que a relatada por Richmond (1990) em reatores
tubulares em ambiente externo que foi de 370 mg L-1 d-1 e Morais e Costa (2007b)
que obteve Xmax de 022 g Lminus1 dminus1 no cultivo de Spirulina sp na presenccedila de 6 de
dioacutexido de carbono em fotobiorreator tubular com trecircs estaacutegios em seacuterie Por outro
lado autores como Carlozzi e Pinzani (2005) conseguiram uma produtividade em
ceacutelulas maacutexima de 182 g L-1 dminus1 utilizando o processo descontiacutenuo em ambiente
externo Lee (2001) relata que dependendo da configuraccedilatildeo de fotobiorreator tubular
fechado e de placas retangulares a produtividade volumeacutetrica foi de 025 a 364 g L-1
d-1 utilizando o processo descontiacutenuo alimentado
Travieso et al (2001) relataram uma produtividade maacutexima de 04 g L-1 d-1 em
processo semicontiacutenuo de Spirulina utilizando uma diluiccedilatildeo de 15 e taxa de diluiccedilatildeo
de 00078 hminus1 Esses autores utilizaram o fotobiorreator patenteado bdquobdquoBiocoil‟‟ da
Biotechna Grasser UK (European patent EPO239272 March 6 1987)
Vernerey et al (2001) utilizando uma nova configuraccedilatildeo de fotobioretator para o
aumento da escala (72 litros) na produccedilatildeo de S platensis conseguiram uma
produtividade de 138 g L-1 d-1 com intensidade luminosa de 300 W m-2 e pH
controlado a 95 pela adiccedilatildeo de CO2
Cultivos de Arthrospira platensis em fotobiorreator tubular outdoor no periacuteodo
de marccedilo a setembro de 2002 na Repuacuteblica Checa com a maioria dos dias
ensolarados a irradiacircncia do ambiente maacutexima foi entre 15 and 18 mmol de foacutetons
mminus2 sminus1 Nessas condiccedilotildees a produtividade maacutexima atingida foi de 05 g Lminus1 dminus1
correspondendo a um rendimento de aacuterea (baseada na aacuterea superficial) de
aproximadamente 325 g mminus2 dminus1 na qual eacute um valor relativamente alto se considerar
que foi obtida no mecircs de setembro A concentraccedilatildeo celular oacutetima da cultura foi
obtida em um intervalo de 1 a 2 g L-1 demostrando que a faixa da concentraccedilatildeo
celular oacutetima no cultivo de Spirulina natildeo eacute muito restrita (MASOJIDEK et al 2003)
633 Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas
Na Tabela 31 estatildeo os resultados da anaacutelise de variacircncia para o fator de
conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) e nas Tabelas 32 e 33 estatildeo os valores
126
meacutedios do YXN nas variaacuteveis independentes fontes de nitrogecircnio e intensidades
luminosas respectivamente
Tabela 31 - Anaacutelise de variacircncia para fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
054 1 054 091 0351
Fonte de Nitrogecircnio
5078 1 5078 8453 0000
Intensidade luminosa
043 2 022 036 0700
Resiacuteduos 1123 19 059
total 520 23
Como observado na Tabela 24 os maiores valores do fator de conversatildeo (YXN)
foram obtidos nos cultivos utilizando ureacuteia como fonte de nitrogecircnio independente
da fonte de CO2 e da intensidade luminosa utilizada Isso pode ser avaliado pela
anaacutelise de variacircncia (Tabela 31) onde apresenta o niacutevel descritivo para a fonte de
CO2 fonte de nitrogecircnio de p = 0000 e para a intensidade luminosa o p = 0700 A
maior meacutedia dos valores de YXN foi 1380 plusmn 090 g g-1 obtida nos cultivos utilizando
ureacuteia como fonte de nitrogecircnio (Tabela 32) diferindo estatisticamente dos valores
obtidos nos cultivos com nitrato (460 plusmn 055 g g-1) De fato nos cultivo utilizando
ureacuteia a concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente foi calculada com base
na necessidade das ceacutelulas para o crescimento e a manutenccedilatildeo celular natildeo
ocorrendo uma limitaccedilatildeo ou um excesso de nitrogecircnio adicionado durante o cultivo
(item 5) Como mencionado por Rangel-Yagui et al (2004) o excesso de ureacuteia
diminui a eficiecircncia de utilizaccedilatildeo desse nutriente e portanto menor o valor de YXN
Da mesma forma a menor massa total adicionada no cultivo proporcionou maiores
valores de YXN (739 g g-1) no cultivo de S platensis em minitanques utilizando o
cloreto de amocircnio como fonte de nitrogecircnio (Carvalho et al 2004) Por outro lado
nos cultivos com nitrato a concentraccedilatildeo deste foram mantidas acima de 1 g L-1 de
modo a evitar a limitaccedilatildeo do crescimento pela fonte de nitrogecircnio Por isso os
maiores valores de YXN foram obtidos nos cultivos utilizando ureacuteia Resultados
similares foram obtidos por Danesi et al (2003) empregando 25 g de ureacuteia em
127
diferentes protocolos de alimentaccedilatildeo e temperatura em relaccedilatildeo a KNO3 e por Danesi
et al (2004) que tambeacutem observaram um maior fator de conversatildeo utilizando ureacuteia
em relaccedilatildeo a KNO3 independente da intensidade luminosa utilizada (2 e 5 klux)
Rangel-Yagui et al (2004) tambeacutem observaram maiores valores de YXN nos cultivos
utilizando ureacuteia
Tabela 32 - Meacutedias dos fatores de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas para a
variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio
Fonte de nitrogecircnio YXN (mgmg-1)
Nitrato 460 plusmn 055ordf
Ureacuteia 1380 plusmn 090b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
Em relaccedilatildeo agrave variaacutevel independente intensidade luminosa pode-se observar na
Tabela 33 que natildeo diferiram estatisticamente nos valores de YXN Isto eacute
independente da intensidade luminosa utilizada os valores de conversatildeo de
nitrogecircnio em ceacutelulas foram estatisticamente iguais De fato a quantidade de
nitrogecircnio adicionada nos cultivos estaacute relacionada com o crescimento celular
portanto quanto maior o valor de Xm maior foi a quantidade de nitrogecircnio
adicionada nos cultivos independente da fonte nitrogecircnio utilizada (nitrato ou ureacuteia)
Com isso razatildeo entre biomassa formada e nitrogecircnio adicionado foi estatisticamente
igual nas diferentes intensidades luminosas estudas
A Intensidade luminosa influencionou no crescimento celular (Item 62) e a
fonte de nitrogecircnio (nitrato ou ureacuteia) foi adicionada de acordo com a necessidade da
ceacutelula para o crescimento celular (Item 5) Por isso o YXN foi estatisticamente igual
(p = 0245) nas diferentes intensidades luminosas estudadas (Tabela 31)
O fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas eacute definido como a quantidade de
nitrogecircnio utilizada para a formaccedilatildeo de biomassa como no presente trabalho o
nitrogecircnio adicionado foi de acordo com a necessidade diaacuteria das ceacutelulas os valores
meacutedios de YXN para cada intensidade luminosa natildeo poderiam variar como pode ser
observado na Tabela 33
Nos trabalhos apresentados por Bezerra et al (2008) Danesi et al (2004) e
Rangel-Yagui et al (2004) observaram que os valores de Xm e YXN aumentam com
128
o aumento da intensidade luminosa fornecida ao cultivo Maiores energias
fornecidas pelas mais altas luminosidades empregadas nos cultivos permitem as
ceacutelulas de consumirem o nitrogecircnio disponiacutevel levando a maiores valores de Xm e
YXN Isso ocorreu porque a mesma quantidade de nitrogecircnio foi adicionada nos
ensaios com diferentes intensidades luminosas logo o YXN foi uma funccedilatildeo de Xm
Por outro lado no presente trabalho os valores meacutedios YXN natildeo diferiram
estatisticamente com o aumento da intensidade luminosa porque a quantidade total
de nitrogecircnio adicionada variou nos cultivos com as diferentes intensidades
luminosas isto eacute quanto maior a intensidade luminosa maior foi a quantidade de
nitrogecircnio adicionada e consequentemente maior concentraccedilatildeo celular Por isso o
YXN natildeo diferiram nas diferentes intensidades luminosas estudadas (Tabela 26)
Tabela 33 - Meacutedias dos fatores de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas para a
variaacutevel independente intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(mol de foacutetons m-2 s-1)
YXN (mgmg-1)
60 922 plusmn 034ordf
120 902 plusmn 034a
240 935 plusmn 034a
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
Os maiores valores do fator de conversatildeo encontrado nesse trabalho (1327 plusmn
028 mg mg-1) foi maior do que 739 g g-1 (CARVALHO et al 2004) 85 g g-1
(RANGEL-YAGUI et al 2004a) utilizando ureacuteia e 57 plusmn 017 g g-1 utilizando cloreto de
amocircnio como fonte de nitrogecircnio nos cultivos de S platensis em minitaques
(BEZERRA et al 2008) Isso porque no presente trabalho a S platensis foi
cultivada em fotobiorreator tubular fechado o que proporciona menor volatilizaccedilatildeo
da amocircnia e melhor eacute o seu aproveitamento pelas ceacutelulas ocasionando maiores
valores de YXN
129
64 Avaliaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de clorofila a
No final de cada experimento foi realizada a determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de
clorofila a na concentraccedilatildeo celular final e os resultados estatildeo descritos na Tabela
34
Tabela 34 ndash Concentraccedilotildees de clorofila na biomassa final
Experimento Fonte de CO2 Intensidade luminosaa
Fonte de nitrogecircnio
Concentraccedilatildeo de clorofila (mg cl g cel -1)
1 Cilindro 60 NaNO3 521plusmn028
2 Cilindro 60 Ureacuteia 415plusmn020
3 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 60 NaNO3 392plusmn008
4 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 60 Ureacuteia 326plusmn030
5 Cilindro 120 NaNO3 344plusmn010
6 Cilindro 120 Ureacuteia 296plusmn009
7 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 120 NaNO3 294plusmn040
8 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 120 Ureacuteia 210plusmn023
9 Cilindro 240 NaNO3 175plusmn037
10 Cilindro 240 Ureacuteia 181plusmn 015
11 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 240 NaNO3 294plusmn035
12 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 240 Ureacuteia 210plusmn023
a mol de foacutetons m-2 s-1
Dentre os metaboacutelitos microalgais a clorofila foi muito pouco investigada Satildeo
os uacutenicos pigmentos naturais de coloraccedilatildeo verde em abundacircncia mas sua
instabilidade ao isolamento tem restringindo a sua utilizaccedilatildeo como corante natural na
induacutestria de alimentos As clorofilas utilizadas como corantes alimentares provecircm
principalmente de plantas terrestres (HENDRY 1996)
Microalgas fotossinteacuteticas satildeo organismos que capturam energia luminosa
eficiententemente O pigmento fotossinteacutetico clorofila a eacute o principal componente
130
fotoquiacutemico ativo na qual funciona como um receptor de luz para direcionar a
fotossiacutentese O conteuacutedo deste pigmento em microalga eacute portanto relatado para
atividade fotossinteacutetica (MACINTYRE et al 2002) A intensidade de luz captada
pelos pigmentos influencia na produccedilatildeo da biomassa e no acuacutemulo de produtos
alvos na microalga cultivada sob diferentes condiccedilotildees
As clorofilas satildeo pigmentos verdes de alto valor comercial encontradas em
plantas microalgas e cianobacteacuterias como A platensis A concentraccedilatildeo desse
pigmento nas ceacutelulas depende das condiccedilotildees ambientais Devido a sua cor e as
propriedades fiacutesico-quiacutemicas satildeo utilizadas como corantes naturais em produtos
alimentiacutecios
Na Tabela 35 observa-se que ambas as variaacuteveis independentes avaliadas
nesse estudo fonte de nitrogecircnio e intensidade luminosa interferiram na
concentraccedilatildeo de clorofila a na biomassa final Isso foi confirmada pela anaacutelise
estatiacutestica ANOVA onde apresentou um valor de niacutevel descritivo de 0011 para a
variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio e de 0000 para a intensidade luminosa
Tabela 35 - Anaacutelise de variacircncia para a concentraccedilatildeo de clorofila na biomassa final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Meacutedia dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
03725 1 03725 101 0328
Fonte de Nitrogecircnio
29751 1 29751 804 0011
Intensidade luminosa
158306 2 79153 2139 0000
Resiacuteduos 70318 19 01272
Total 26210 23
Avaliando-se as meacutedias da concentraccedilatildeo de clorofila a nas diferentes fontes de
nitrogecircnio (Tabela 34) observa-se que nos cultivos utilizando nitrato obtiveram
maiores concentraccedilotildees de clorofila em relaccedilatildeo aos cultivos com ureacuteia nas
intensidades luminosas de 60 mol de foacutetons m-2 s-1 e 120 mol de foacutetons m-2 s-1
Essa diferenccedila na concentraccedilatildeo de clorofila pode ser explicada pelo fato dos cultivos
com nitrato a concentraccedilatildeo de nitrato no meio de cultura foi mantida sempre
superior a 1 g L-1 enquanto que nos cultivos com ureacuteia a concentraccedilatildeo de ureacuteia no
131
meio cultura foi abaixo de 10-4 M (item 62) Essa concentraccedilatildeo de ureacuteia apesar de
natildeo interferir na concentraccedilatildeo celular pode ter influenciado na concentraccedilatildeo de
clorofila nas ceacutelulas Resultados similares foram observados por Danesi et al (2004)
e Rangel-Yagui et al (2004) em cultivos de S platensis em minitanques
substituindo a fonte de nitrogecircnio KNO3 por ureacuteia
O efeito da limitaccedilatildeo de nitrogecircnio e ferro comprometeu a capacidade
fotossinteacutetica reduziu o conteuacutedo de clorofila celular e diminuiu o rendimento
quacircntico do fotossintema II (YOUNG BEARDALL 2005) Muggli e Harrison (1996)
observaram que a concentraccedilatildeo de clorofila nas ceacutelulas de Emiliania huxleyi
cultivadas com nitrato foi estatisticamente maior que nas celulas cultivadas com
amocircnia sob condiccedilotildees limitadas de ferro e intensidade luminosa abaixo da
saturaccedilatildeo Por outro lado nos cultivos natildeo limitados com ferro as concentraccedilotildees de
clorofilas foram estatisticamente iguais Sob duas diferentes intensidades luminosas
abaixo da regiatildeo de saturaccedilatildeo (45 e 70 mol de foacutetons m-2 s-1) as ceacutelulas cultivadas
em nitrato mantiveram uma maior taxa de clorofila por volume de ceacutelulas que nas
ceacutelulas cultivadas com amocircnio similar ao que aconteceu nas condiccedilotildees limitadas
por ferro
A intensidade luminosa eacute uma importante variaacutevel que interfere na
concentraccedilatildeo de clorofila Como podemos observar na Tabela 34 maiores
concentraccedilotildees de clorofilas meacutedias independente da fonte de nitrogecircnio e de CO2
satildeo encontradas nas menores intensidades luminosas De um modo geral o
aumento da concentraccedilatildeo de clorofila com a reduccedilatildeo da luminosidade aumenta a
capacidade de absorccedilatildeo de luz pois a clorofila eacute quem efetivamente atua nas
reaccedilotildees fotoquiacutemicas da fotossiacutentese e representa um mecanismo de adaptaccedilatildeo agrave
condiccedilatildeo de menor intensidade luminosa A reduccedilatildeo do conteuacutedo de pigmentos a
altas irradiacircncias permite as algas reduzirem a taxa de fornecimento de energia pela
absorccedilatildeo da luz nas ceacutelulas com a finalidade de balancear a energia absorvida e a
energia necessaacuteria para a fixaccedilatildeo do carbono e crescimento celular (GEIDER et al
1997) Geralmente a clorofila e as ficobiliproteiacutenas tendem a aumentar sua
concentraccedilatildeo com a reduccedilatildeo da intensidade luminosa (TOMASELLI et al 1997)
Nas menores intensidades luminosas onde a competiccedilatildeo pelo poder redutor eacute
maior observa-se que as ceacutelulas cultivadas em nitrato mantem maior niacuteveis de
clorofila que nas ceacutelulas cultivadas em amocircnia Portanto as ceacutelulas cultivadas em
nitrato precisam mais do poder redutor para transportar e utilizar sua fonte de
132
nitrogecircnio eles podem requerer mais clorofila que as ceacutelulas cultivadas em amocircnio
para suprir tais necessidades Por outro lado altas intensidades luminosas alteram o
complexo proteacuteico contendo pigmentos captadores de luz como observado por
Smith et al (1990) em ceacutelulas de Dunaliella salina Telfar et al (1990) mostrou que
iluminaccedilatildeo prolongada causa destruiccedilatildeo dos pigmentos da clorofila e conduz a
inibiccedilatildeo fotoquiacutemica do FSII
Cultivos de Spirulina subsalsa exposto agrave alta intensidade luminosa (100 mol
de foacutetons m-2 s-1) mostrou uma reduccedilatildeo no conteuacutedo de pigmentos nas ceacutelulas O
conteuacutedo de carotenoacuteide e clorofila a reduziu com o aumento da intensidade
luminosa de 25 mol de foacutetons m-2 s-1 para 100 mol de foacutetons m-2 s-1 O conteuacutedo
de ficobilissomos obteve uma maior reduccedilatildeo quando comparados com o conteuacutedo
de clorofila a (aproximadamente 70 e 57 respectivamente) Devido a uma
reduccedilatildeo nos carotenoacuteides zeaxantina foi o carotenoacuteide predominante a maior
intensidade luminosa (TOMASELLI et al 1995) Um aumento da intensidade
luminosa de 2 klux (24 mol de foacutetons m-2 s-1 ) para 5 klux (60 mol de foacutetons m-2 s-
1) houve uma reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de clorofila de 14 plusmn 18 mg cl g cel -1 para
80 plusmn 18 mg cl g cel -1 nos cultivos com KNO3 e 142 plusmn 08 mg cl g cel -1 para 72 plusmn
14 mg cl g cel -1 para os cultivos com ureacuteia respectivamente (DANESI et al 2004)
Pode-se observar que a concentraccedilatildeo de clorofila nos cultivos a 5 klux (60 mol de
foacutetons m-2 s-1) foram proacuteximas as concentraccedilotildees obtidas no presente trabalho nos
cultivos a 60 mol de foacutetons m-2 s-1 (NaNO3 = 521 plusmn 03 mg cl g cel -1 Ureacuteia = 415
plusmn 02 mg cl g cel -1 Tabela 34) Essa diferenccedila pode ser devido ao aumento do
efeito sombreamento ser maior em minitanques quando comparada aos
fotobiorreatores tubulares o que favorece a um aumento da concentraccedilatildeo de
clorofila nos cultivos em minitanques Soundarapandian e Vasanthi (2008)
observaram um maior teor de clorofila em diferentes cepas de S platensis cultivadas
a 3 klux (36 mol de foacutetons m-2 s-1) intensidade luminosa com ciclos alternados de 16
horas no claro e 8 horas no escuro
Dados na literatura mostram que na biomassa de A platensis possuem 1 de
clorofila (VONSHAK 1997 COGNO et al 2003) No entanto no presente trabalho a
maior concentraccedilatildeo de clorofila foi de 05 correspondendo ao experimento 1 (60
mol de foacutetons m-2 s-1 NaNO3 Tabela 13) Esse baixo valor de concentraccedilatildeo de
clorofila em relaccedilatildeo aos valores citados na literatura eacute devido agraves altas intensidades
luminosas utilizadas no neste trabalho Soundarapandian e Vasanthi (2008)
133
relataram que a concentraccedilatildeo de clorofila nas S platensis cultivadas a 3 klux pode
variar de 085 (8526 μg mg cel-1) a 097 (9723 μg mg cel-1) dependendo da
cepa utilizada Jimenez et al (2003) em cultivos de S platensis em minitanques
utilizando a energia solar no sul da Espanha obtiveram uma concentraccedilatildeo de
clorofila de 79 g kgminus1 (079)
Carlozzi e Pinzani (2005) observaram uma concentraccedilatildeo maacutexima de clorofila
de 2 em cultivos outdoor de S platensis em fotobiorreator espiralado fechado
Esta concentraccedilatildeo permaneceu constante do 6deg ao 10deg dia de cultivo Tomaselli et
al (1997) tambeacutem observaram um aumento na concentraccedilatildeo de clorofila de 151 μg
mg cel-1 para 263 μg mg cel-1 nos cultivos de A maacutexima em reator de vidro
retangular a intensidade luminosa de 144 mol de foacutetons m-2 s-1 e 25 mol de foacutetons
m-2 s-1 respectivamente Tredici e Zittelli (1998) em cultivos continuos ldquooutdoorsrdquo de
A platensis em fotobiorreator tubular e plano obtiveram a concentraccedilatildeo de clorofila
de 155plusmn002 e 163 plusmn002 na massa seca no iniacutecio do periacuteodo luminoso
De fato a concentraccedilatildeo de clorofila depende das condiccedilotildees ambientais
principalmente da intensidade luminosa No presente estudo nos cultivos
submetidos agrave alta intensidade luminosa favoreceram a uma reduccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de clorofila principalmente nos cultivos a 240 mol de foacutetons m-2 s-1
Do mesmo modo Nakajima e Ueda (1997) observaram um aumento no crescimento
celular de Chlorella pyrenoidosa e uma reduccedilatildeo no conteuacutedo de pigmentos
captadores de luz nas ceacutelulas cultivadas a altas intensidades luminosas (50 μmol de
foacutetons m-2 s-1) Na presenccedila de excesso de luz o oxigecircnio produzido durante a
fotossiacutentese reage com a clorofila excitada originando um oxigecircnio singlete que eacute
muito mais reativo podendo oxidar as clorofilas e ocasionando consequentemente o
fenocircmeno denominado de branqueamento (MARIQUE 2003) As clorofilas tendem a
ser foto-oxidadas a alta irradiaccedilatildeo e devido aos carotenoacuteides poderem prevenir a
foto-oxidaccedilatildeo das clorofilas a relaccedilatildeo entre as clorofilas e carotenoacuteides pode ser
usada como um indicador potencial de perdas foto-oxidativas causadas por fortes
irradiaccedilotildees (HENDRY amp PRICE 1993)
134
65 Avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal
Micro-organismos fotossintetizantes usam fonte de carbono inorgacircnico energia
luminosa e nitrogecircnio para sintetizar compostos orgacircnicos como proteiacutenas
carboidratos vitaminas lipiacutedios pigmentos entre outros Com isso a composiccedilatildeo
centesimal da biomassa pode variar com as condiccedilotildees ambientais (RAFIQUL et al
2005 MOHANTY et al 1997)
Na Tabela 36 estatildeo apresentados os teores de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos
e cinzas das biomassas secas obtidas no final dos experimentos
Tabela 36 - Porcentagem de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos e cinzas na biomassa
seca final
Experimento Intensidade
luminosa (I)
Fonte de CO2
Fonte de nitrogecircnio
Proteiacutenas totais ()
Lipiacutedios totais ()
Cinzas ()
Carboidratos totais ()
1 60 Cilindro NaNO3 319plusmn01 863plusmn03 442plusmn001 5226plusmn358
2 60 Cilindro Ureacuteia 233plusmn07 660plusmn09 442plusmn004 6471plusmn064
3 60 Alcooacutelica NaNO3 324plusmn07 101plusmn08 583plusmn002 5222plusmn341
4 60 Alcooacutelica Ureacuteia 427plusmn23 112plusmn14 508plusmn091 6492plusmn336
5 120 Cilindro NaNO3 281plusmn04 121plusmn06 476plusmn002 5500plusmn-016
6 120 Cilindro Ureacuteia 299plusmn06 730plusmn07 482plusmn018 5794plusmn005
7 120 Alcooacutelica NaNO3 315plusmn18 862plusmn06 497plusmn018 5576plusmn341
8 120 Alcooacutelica Ureacuteia 404plusmn07 953plusmn07 394plusmn063 4642plusmn091
9 240 Cilindro NaNO3 213plusmn01 142plusmn23 428plusmn004 6004plusmn243
10 240 Cilindro Ureacuteia 319plusmn09 129plusmn05 540plusmn050 5079plusmn147
11 240 Alcooacutelica NaNO3 278plusmn04 144plusmn29 579plusmn048 5222plusmn341
12 240 Alcooacutelica Ureacuteia 210plusmn03 117plusmn28 449plusmn004 6492plusmn336
I = Intensidade luminosa (mol de foacutetons m-2 s-1)
A Fotossiacutentese eacute o processo pelo qual a energia luminosa eacute convertida em
energia quiacutemica pelas plantas bacteacuterias fotossinteacuteticas e cianobacteacuterias A energia
luminosa eacute capturada pelos pigmentos fotossinteacuteticos como clorofila carotenoacuteides e
ficocianina na qual satildeo complexados com proteiacutenas que satildeo partes do fotossistema I
e II em cianobacteacuterias O sistema fotossinteacutetico eacute fortemente conectado com outras
135
vias metaboacutelicas como biossiacutentese de proteiacutenas e lipiacutedios nas quais satildeo
necessaacuterias para o crescimento celular (MOHANTY et al 1997)
Os teores de proteiacutena variaram de 21 a 42 Esses valores estatildeo proacuteximos
aos valores encontrados por Cantildeizares-Villanueva et al (1994) cultivando S maxima
em meio de cultura constituiacutedo por resiacuteduo da criaccedilatildeo de porcos (diluiacutedo a 50 em
aacutegua) Embora o teor de proteiacutena seja baixo (36) a biomassa ainda eacute apropriada
para o uso como suplemento aliementar para animais Jimeacutenez et al (2003) tambeacutem
encontraram um baixo teor de proteiacutena de 47 do peso seco em meacutedia na
produccedilatildeo industiral da Spirulina em Malaga no sul da Espanha
A biossiacutentese de proteiacutena depende principalmente da disponibilidade de
nitrogecircnio de carbono para formaccedilatildeo do esqueleto carbocircnico e da intensidade
luminosa na qual fornece energia para fixaccedilatildeo do CO2 Nos cultivos utilizando
nitrato bem como nos cultivos utilizando ureacuteia natildeo houve limitaccedilatildeo do crescimento
pela fonte de nitrogecircnio (Item 611) A fonte de carbono tambeacutem natildeo foi limitada
uma vez que o pH foi mantido durante todo o tempo de cultivo com a adiccedilatildeo de CO2
As intensidades luminosas foram altas pertencendo agrave regiatildeo de saturaccedilatildeo luminosa
(Item 611) Logo mesmo dispondo de nitrogecircnio carbono e energia as ceacutelulas natildeo
converteram o nitrogecircnio disponiacutevel em proteiacutenas SAKAMOTO e BRYAN (1999)
observaram que um aumento da intensidade luminosa de 250 mol de foacutetons m-2 s-1
para 1 mmol foacutetons m-2 s-1 no cultivo de Synechococcus sp PCC 6301 natildeo foi
observado um aumento na absorccedilatildeo de nitrato mostranto que a taxa do consumo
de nitrato foi saturado a intensidade luminosa de 250 mol de foacutetons m-2 s-1
Soundarapandian e Vasanthi (2008) observaram que o conteuacutedo de proteiacutena
nas S platensis cultivadas a 3 klux (36 mol de foacutetons m-2 s-1) com ciclos alternados
de 16 horas no claro e 8 horas no escuro pode variar de 5937 (5937μg mg-1 cel)
a 6421 (6421 μg mg-1 cel) dependendo da cepa utilizada Torzillo et al (1991)
observaram um aumento na siacutentese de carboidrato nas ceacutelulas de S platensis
cultivadas ldquooutdoorsrdquo a altas intensidades luminosas e temperatura de 25ordmC O
execesso do carboidrato sintetizado foi parcialmente utilizado a noite para a siacutentese
de proteiacutena Isso pode ter contribuiacutedo a um baixo teor de proteiacutena no presente
trabalho uma vez que os cultivos foram submetidos sempre a altas intensidades
luminosas natildeo obtendo ciclos claroescuro durante o cultivo
A anaacutelise de variacircncia (Tabela 37) indicou que a fonte de nitrogecircnio e de CO2
natildeo influenciaram na variaacutevel dependente teor de proteiacutena enquanto que a
136
intensidade luminosa influenciou como pode-se obversar na anaacutelise de diferenccedila
entre as meacutedias para essa variaacutevel (Tabela 38)
Tabela 37 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de proteiacutena na biomassa final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
5304 1 5304 235 0142
Fonte de Nitrogecircnio
1134 1 1134 050 0487
Intensidade luminosa
4341 2 2170 963 0001
Resiacuteduos 42833 19 2254
total 9268 23
Tabela 38 - Meacutedias do teor de proteiacutena na biomassa final para a variaacutevel
independente intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(mol foacutetons m-2 s-1)
Proteiacutena ()
60 358plusmn43ordf
120 326plusmn50ordf
240 256plusmn51b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
O modelo da biossiacutentese e metabolismo de lipiacutedios em cianobacteacuterias eou
algas satildeo afetados pelos fatores ambientais dentre esses as condiccedilotildees de
iluminaccedilatildeo (BABADZHANOV et al 2004 KHOTIMCHENKO e YAKOVLEVA 2005)
As ceacutelulas de Tichocarpus crinitus satildeo capazes de mudar o conteuacutedo de
armazenamento e estrutural de lipiacutedios e a composiccedilatildeo de aacutecidos graxos Altas
intensidades luminosas estimulam o acuacutemulo de lipiacutedios de armazenamento
(triacilgliceroacuteis) enquanto a baixas intensidades luminosas induzem a um aumento
nos lipiacutedios estruturais (glicolipiacutedios) Isto indica um alto grau de controle de
estrutura nas membranas das algas porque o grau de insaturaccedilatildeo dos aacutecidos
graxos tem sido considerado um dos fatores mais importantes no controle da fluidez
e funcionalidade da membrana celular Adicionalmente as diferenccedilas na
137
composiccedilatildeo dos lipiacutedios nas T crinitus cultivadas a altas e baixas irradiaccedilotildees solar
podem ser consideradas como uma resposta adaptativa das ceacutelulas algais para as
vaacuterias condiccedilotildees de crescimento Portanto a sobrevivecircncia das ceacutelulas nas
mudanccedilas ambientais pode ser atribuiacuteda agrave funcionalidade das membranas onde o
aparato fotossinteacutetico eacute formado (KHOTIMCHENKO e YAKOVLEVA 2005)
Nos cultivos com disponibilidade de nitrogecircnio carbono e altas intensidades
luminosas as ceacutelulas utilizam a energia e o carbono disponiacutevel para crescimento
manutenccedilatildeo celular e formaccedilatildeo de componentes orgacircnicos tais como proteiacutenas
lipiacutedios e carboidratos Como apresentados na Tabela 41 o teor de lipiacutedio aumenta
com a intensidade luminosa Esse efeito foi observado por Solovchenko et al
(2008) nos cultivos da microalga Parietochloris incisa Isto pode ser consequecircncia da
produccedilatildeo excessiva de aacutecidos graxos entre eles triacilgliceroacuteis provavelmente como
um modo de converter o excesso de luz em energia quiacutemica para evitar o dano
fotooxidativo (ASADA 1994 RABBANI et al 1998 MENDOZA et al 1999 NIYOGI
1999) Kaixian et al (1993) observaram um aumento no teor de lipiacutedios com o
aumento da intensidade luminosa nas ceacutelulas de Phaeodactylum tricornutum
Solovchenko et al (2008) relataram que os triacilgliceroacuteis acumuladas em algas
(Parietochloris incisa) sob condiccedilotildees de stress satildeo frequentemente depositadas em
gloacutebulos de lipiacutedios citoplasmaacutetico referidos como corpos oleosos na qual aumentam
em tamanho e nuacutemero sob deficiecircncia na nutriccedilatildeo mineral especialmente na falta de
nitrogecircnio e altas irradiacircncias
Como observado na Tabela 41 os cultivos a 240 mol de foacutetons m-2 s-1
obtiveram maiores teores de lipiacutedios Steiner et al (1970) observaram que as ceacutelulas
de Chromatium cultivadas a baixas intensidades luminosas (100 ftc = 01 klux = 12
mol de foacutetons m-2 s-1) obteve menor teor de fosfolipiacutedios em relaccedilatildeo aos cultivos a
altas intensidades luminosas (7500 ftc = 8 kux = 96mol de foacutetons m-2 s-1) 1 lux =
0929 foot-candles
Na Tabela 39 estatildeo apresentados os valores da anaacutelise de variacircncia dos teores
de lipiacutedios Como se pode observar apenas a intensidade luminosa influenciou nos
valores de lipiacutedios apresentando um valor de niacutevel descritivo menor que 5
Embora o niacutevel de significacircncia da variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio seja
menor que 5 a anaacutelise estatiacutestica diferenccedila entre as meacutedias mostraram essa
variaacutevel natildeo interfere no teor de lipiacutedio apresenta um valor de niacutevel descritivo maior
que 5 (Tabela 40)
138
Tabela 39 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de lipiacutedios na biomassa seca final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
143 1 143 059 0453
Fonte de Nitrogecircnio
1853 1 1853 762 0012
Intensidade luminosa
141 2 71 29 0000
Resiacuteduos 46 19 244
total 207 23
Tabela 40 - Meacutedias do teor de lipiacutedio na biomassa final para a variaacutevel independente
fonte de nitrogecircnio
Fonte de nitrogecircnio Lipiacutedios ()
Nitrato 109 plusmn 310ordf
Ureacuteia 918 plusmn 275a
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um
intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
Tabela 41 - Meacutedias do teor de lipiacutedio na biomassa final para a variaacutevel independente
intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(μmoles m-2 s-1)
Lipiacutedios ()
60 763 plusmn 11a
120 972 plusmn 19a
240 136 plusmn 21b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
A similaridade entre as fontes de nitrogecircnio (Tabela 40) podem ser explicadas
pelo fato de que nos cultivos com ureacuteia a quantidade de ureacuteia adicionada foi
calculada com base nos seus respectivos cultivos com nitrato nas quais foram
139
cultivos natildeo limitados por nitrogecircnio (concentraccedilatildeo de nitrogecircnio superior a 1 g L-1)
Logo isso favoreceu a semelhanccedila entre os teores de lipiacutedios nos cultivos a
diferentes fontes de nitrogecircnio
Os valores de lipiacutedios encontrados variaram de 66 plusmn 09 a 144 plusmn 29
dependendo das condiccedilotildees de cultivo Esses valores estatildeo de acordo com Cogno et
al (2003) e Vonshak (1997) na qual relataram que o conteuacutedo de lipiacutedios da A
platensis em condiccedilotildees fotoautotroacuteficas podem variar de 8 ndash 12 quando cultivadas
em meio sinteacutetico Tokusoglu e Uumlnal (2003) encontraram um teor de lipiacutedio meacutedio
entre trecircs diferentes cepas de Splatensis de 753 natildeo diferindo estatisticamente
entre si
O teor de lipiacutedio foi de 863 plusmn 03 com NaNO3 e 66 plusmn 09 com ureacuteia na
intensidade luminosa de 60 μmoles de foacutetons m-2 s-1 utilizando CO2 de cilindro
Esses valores foram proacuteximos aos teores de lipiacutedios encontrados por Rafiqul et al
(2005) cultivando S platensis (74) e para S fusiformis (82) a 25 klux (30 μmol
de foacutetons m-2 s-1) Oliveira et al (1999) observaram um teor de lipiacutedios de 696 plusmn
086 nas ceacutelulas de S platensis cultivadas em 4 l Virtis fermenter a 180 μmol de
foacutetons mndash2 sndash1
Olguiacuten et al (2001) observaram uma menor concentraccedilatildeo de lipiacutedios nos
cultivos a maior intensidade luminosa em cultivos de S platensis cultivada tanto em
meio sinteacutetico (meio Zarrouk) como em meio complexo (aacutegua do mar do Golf do
Meacutexico suplementado com 2 de efluente anaeroacutebico da criaccedilatildeo de porcos) A
concentraccedilatildeo de nitrogecircnio no meio complexo possui 10 vezes a menos que o meio
sinteacutetico (25 g L-1 NaNO3) O teor de lipiacutedio de 8 encontrado no meio de cultivo
com 25 g L-1 NaNO3 a 66 μmols de foacutetons m-2 s-1 foi proacuteximo ao encontrado no
presente trabalho 66 plusmn 09 no cultivo natildeo limitado por NaNO3 e 60 μmols de foacutetons
m-2 s-1
Nos cultivos a 60 mol de foacutetons m-2 s-1 mostrou maiores valores de lipiacutedios
quando cultivadas com CO2 proveniente de fermentaccedilatildeo alcooacutelica em relaccedilatildeo aos
cultivos utilizando CO2 de cilindro Sob condiccedilotildees autotroacuteficas a produtividade de
lipiacutedios foram menores quando comparadas com o crescimento heterotroacutefico em
culturas de Chlorella vulgareis (LIANG et al 2009) e crescimento heterotroacutefico e
mixotroacutefico nas ceacutelulas de Chlamydomonas reinhardtii (BOYLE MORGAN 2009)
O teor de carboidrato nas ceacutelulas A platensis natildeo diferiram estatisticamente
pela anaacutelise de variacircncia nas diferentes condiccedilotildees estudadas (Tabela 44) obtendo
140
um niacutevel de significacircncia de 0118 0974 e 0562 para as variaacuteveis independentes
fontes de CO2 fonte de nitrogecircnio e intensidades luminosas respectivamente O
teor de carboidrato encontrado variou de 38 a 51 valores considerados altos No
entanto esses valores foram proacuteximos aos valores obtidos por Cantildeizares-Villanueva
et al (1994) que observaram um teor de carboidrato de 42 e 44 em ceacutelulas de S
maxima cultivadas em meio sinteacutetico (Zarrouk) e meio constituiacutedo por resiacuteduo da
criaccedilatildeo de porcos (diluiacutedo a 50) respectivamente sob intensidade luminosa de 3
klux (36 μmol de foacutetons m-2 s-1) O teor de carboidrato neste trabalho foi um pouco
maior que o observado por Cantildeizares-Villanueva et al (1994) provavelmente devido
a diferenccedila de intensidade luminosa pois maiores teores de carboidratos satildeo
obtidos nos cultivos sob maior intensidade luminosa
Olguiacuten et al (2001) obtiveram um alto teor de polissacariacutedeos de 2841 nas
ceacutelulas de S platensis cultivadas em meio complexo quando exposta a intensidade
luminosa de 144 μmol de foacutetons mminus2 sminus1 Esse alto valor poderia ter sido devido a
dois fatores simultacircneos deficiecircncia de nitrogecircnio e alta intensidade luminosa
Desse modo no presente trabalho natildeo houve deficiecircncia de nitrogecircnio nos cultivos
no entanto a aacuterea iluminada no fotobioreator tubular usado no presente trabalho eacute
maior quando comparada com os cultivos em bench raceway utilizados por Olguiacuten et
al (2001) e esse aumento pode ter favorecido a obtenccedilatildeo dos altos teores de
carboidratos
Tomaselli et al (1997) observaram uma reduccedilatildeo no teor de carboidrato nas
ceacutelulas de A maacutexima de 282 mgg-1 (28) para 180 mgg-1 (18) quando a
intensidade luminosa reduziu de 144 μmol de foacutetons mminus2 sminus1 para 25 μmol de foacutetons
mminus2 sminus1 A capacidade dos microganismos fototroacuteficos em estocar na forma de
carboidratos o excesso do carbono fixado durante a aclimataccedilatildeo a altas intensidades
luminosas e mobilizar esse esqueleto carbocircnico para a siacutentese de proteiacutena
representa um requisito importante para a sobrevivecircncia
141
Tabela 42 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de carboidratos na biomassa seca final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
107 1 107 268 0118
Fonte de Nitrogecircnio
004 1 004 000 0974
Intensiade luminosa
48 2 24 059 0562
Resiacuteduos 763 19 40
total 918 23
A partir dos estudos relatados previamente na literatura mostram que o teor de
carboidrato eacute 12 a 16 nas ceacutelulas de Arthrospira platensis cultivadas em meio
sinteacutetico e em condiccedilotildees fotoautotroacuteficas sem condiccedilotildees de stress como alta
salinidade alta intensidade luminosa deficiecircncia em nitrogecircnio (COGNO et al
2003 VONSHAK 1997) Carlozzi e Pinzani (2005) relataram que as ceacutelulas de
Artrospira platensis foram estimuladas para sintetizar carboidratos durante o dia e
estes foram consumidos para permitir a siacutentese de proteiacutenas durante a noite De
acordo com Ma et al (1997) uma menor taxa na siacutentese de proteiacutena eacute observado a
altas irradiaccedilotildees comparando com a siacutentese de carboidrato Isto pode conduzir a
um acuacutemulo de carboidrato nas ceacutelulas sem um concomitante aumento na siacutentese
de proteiacutena Tem sido sugerido que o carbono a partir dos poliacutemeros de carboidratos
estocados pode ser transferido para formaccedilatildeo de proteiacutenas durante a noite (Ma et
al 1997) No entanto como no presente trabalho natildeo houve fotoperiacuteodo de fase
claroescuro propiciou a um acuacutemulo de carboidrato nas ceacutelulas e a reduziu a
concentraccedilatildeo de proteiacutenas Adicionalmente Torzillo et al (1991) relataram que as
ceacutelulas de Spirulina expostas a altas irradiacircncais direcionam a biomassa a sintetizar
carboidratos na qual pode ser usado como um reservatoacuterio do poder redutor e a
uma reduccedilatildeo na siacutentese de proteiacutenas
Como podemos observar na anaacutelise de variacircncia (Tabela 43) o teor de cinzas
natildeo foi influenciado pelas variaacuteveis estudadas atingindo valores que variaram de
428 plusmn 004 a 583 plusmn 002 Esses valores estatildeo de acordo com os valores obtidos
por Miao (2005) que obtiveram um teor de cinzas de 636 plusmn 005 em cultivos
autotroacuteficos e 593 plusmn 004 em cultivos heterotroacuteficos de Chlorella protothecoides
Similarmente Tokusoglu e Uumlnal (2003) observaram um conteuacutedo de cinzas em trecircs
142
diferentes cepas de Spirulina denominada de 1 2 e 3 foram de 743 751 and
1038 respectivamente A microalga marinha Isochrisis obteve o maior conteuacutedo
de cinzas (1608)
Tabela 43 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de cinzas na biomassa seca final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
068 1 069 18 0192
Fonte de Nitrogecircnio
058 1 058 152 0232
Intensiade luminosa
112 2 056 147 0255
Resiacuteduos 723 19 038
total 962 23
Jimeacutenez et al (2003) encontraram um alto teor de cinzas no cultivo de S
platensis aproximadamente 20 (valores tiacutepicos satildeo de 5ndash7) esse alto valor pode
ser explicado pelo fato de que a alga obtida a partir do filtro foi introduzida
diretamente spray drier sem passar pelo processo de lavagem Como o meio de
crescimento eacute altamente enriquecido com bicarbonato a lavagem eacute necessaacuteria para
eliminaacute-los Esse processo normalmente reduz o conteuacutedo de cinzas
No presente trabalho a composiccedilatildeo do meio de cultura foi mantido em todas as
condiccedilotildees experimentais com modificaccedilatildeo apenas da fonte de nitrogecircnio de nitrato
de soacutedio para ureacuteia em alguns experimentos Adicionalmente a biomassa passou
por um processo de lavagem antes da etapa de secagem que removeu os sais
adsorvidos nas ceacutelulas Portanto isso favoreceu a manutenccedilatildeo no teor de cinzas na
biomassa seca Canizares et al (2004) obtiveram elevados teores de cinzas (14)
na biomassa de Spirulina maacutexima utilizando 50 de efluente suiacuteno no meio de
cultura Isso foi atribuiacutedo ao elevado quantidade de partiacuteculas minerais presente no
meio
143
66 Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros bioenergeacuteticos
Foram avaliados os paracircmetros bioenergeacuteticos da A platensis durante os
cultivos avaliando os andamentos em funccedilatildeo do tempo dos paracircmetros energia de
Gibbs dissipada para o crescimento e manutenccedilatildeo celular (1YGX) das produccedilotildees
molares de O2 consumo de H+ e nuacutemero de foacutetons para sustentar o crescimento
fotoautotroacutefico Foi avaliada a eficiecircncia da fotossiacutentese em A platensis calculando-
se a energia molar de Gibbs absorvida da luz para produzir um C-mol de biomassa
a partir do correspondente nuacutemero de Einsteins absorvidos e da energia meacutedia
molar dos foacutetons
A energia de Gibbs dissipada por unidade da biomassa (1YGX kJ por C-mol X)
foi calculada pela Equaccedilatildeo 6 como descrita no item 45 A equaccedilatildeo mostra que na
dissipaccedilatildeo da energia de Gibbs estatildeo inclusos tanto a manutenccedilatildeo como o
crescimento celular A energia de Gibbs eacute utilizada tambeacutem para a manutenccedilatildeo das
funccedilotildees celulares como reposiccedilatildeo dos gradientes que faltam degradaccedilatildeo proteiacutenas
Esta energia de Gibbs eacute produzida pelo catabolismo de certas quantidades de
doadores de eleacutetrons (substratos)
No Graacutefico 26 ilustra o comportamento da dissipaccedilatildeo da energia de Gibbs para
o crescimento e manutenccedilatildeo celular 1YGX em relaccedilatildeo ao tempo Como regra geral
esse paracircmetro bioenergeacutetico aumentou com o tempo em todas as condiccedilotildees
testadas como resultado do crescente niacutevel de biomassa que foi responsaacutevel por
diminuir a velocidade especiacutefica de crescimento Um aumento na intensidade
luminosa ateacute 120 mol de foacutetons m-2 s-1 favoreceu o crescimento de ceacutelulas por
causa de fotolimitaccedilatildeo com isso as exigecircncias de energia aumentaram
notavelmente no periacuteodo de tempo mais curto Por outro lado nenhum (ureacuteia) ou
muito pouco (nitrato) aumento de 1YGX foram observados na faixa da intensidade
luminosa de 120-240 mol de foacutetons m-2 s-1 por causa da obtenccedilatildeo das condiccedilotildees
de saturaccedilatildeo de luz Esse comportamento tambeacutem eacute consistente com os menores
valores de 1YGX previamente observados em tanques abertos (TORRE et al 2003)
o que permitiu um menor crescimento devido ao efeito de sombreamento (DANESI
et al 2004)
144
Graacutefico 26 Energia de Gibbs de dissipaccedilatildeo durante o cultivo de A platensis
intensidade luminosa (μmol m-2 s-1) () 60 ( ) 120 () 240 Fonte de
nitrogecircnio nitrato (siacutembolo aberto) ureacuteia (siacutembolo fechado)
Com os dados da composiccedilatildeo elementar da biomassa seca obtida no final de
cada experimento foram calculados os coeficientes atocircmicos para os elementos C
N H O S principais elementos que constituem a composiccedilatildeo elementar da
biomassa Determinado o coeficiente atocircmico dos elementos C H O N S (descrito
no item 4653) e conhecendo-se os graus de reduccedilatildeo desses elementos (C = 4 H
=1 O = -2 S = 6 N-NH4+ = -3 ou N-NO3
- = 5) de acordo com os iacuteons nas quais satildeo
inseridos na biomassa (HCO3- H2O H+ O2 NH4
+ e SO4-2) foi possiacutevel calcular o
grau de reduccedilatildeo da biomassa (descrito no item 4654 Tabela 44) bem como os
coeficientes estequiomeacutetricos para balanccedilos de carbono nitrogecircnio oxigecircnio
enxofre carga iocircnica e poder de reduccedilatildeo para a produccedilatildeo fotoautotroacutefica de 1 mol
de carbono (C-mol) de biomassa seca usando NaNO3 e ureacuteia como fonte de
nitrogecircnio de acordo com Heijnen (2001) em cada condiccedilatildeo estudada de acordo
com a aplicaccedilatildeo do princiacutepio de conservaccedilatildeo
O crescimento autotroacutefico pode ser representado por uma equaccedilatildeo de
balanccedilo de massa global onde as fontes de nitrogecircnio (NO3- ou NH4
+) e carbono
(HCO3-) H2O e H+ estatildeo envolvidas para a formaccedilatildeo de 1 C-mol de biomassa
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
0 2 4 6 8 10 12
1Y
GX (
kJ
C-m
ol
DM
-1)
Tempo (dias)
145
a HCO3- + b NO3
- (or NH4+) + c H2O + d O2 + e H+ + f SO4
-2 +
CH1650O0531N0170S00007 = 0 (11)
Para esse propoacutesito foi usada a composiccedilatildeo elementar descrita por Cornet et
al (1992) (Equaccedilatildeo 11) ou a composiccedilatildeo elementar determinada
experimentalmente como descrita no item Materiais e meacutetodos
Os coeficientes estequiomeacutetricos foram estimados atraveacutes dos balanccedilos de
materiais de carbono nitrogecircnio oxigecircnio enxofre carga e grau de reduccedilatildeo da
biomassa usados para a formaccedilatildeo da biomassa Os principais iacuteons envolvidos na
formaccedilatildeo da biomassa e seus respectivos coeficientes estequiomeacutetricos estatildeo
descritos na Tabela 44
Como pode ser observado o grau de reduccedilatildeo da biomassa (γX) calculado no
modelo da composiccedilatildeo da biomassa determinado experimentalmente neste trabalho foi
sempre um pouco maior com o nitrato (489 ndash 519) do que com ureacuteia (399 ndash 432)
como esperado pelo maior nuacutemero de oxidaccedilatildeo do nitrato (HEIJNEN 2001)
Tabela 44 - Coeficientes estequiomeacutetricos estimados atraveacutes dos balanccedilos de materiais de
carbono nitrogecircnio oxigecircnio enxofre carga e grau de reduccedilatildeo da biomassa cultivada em
fotobiorreator tubular horizontal utilizando nitrato ou ureacuteia como fontes de nitrogecircnio
HCO3- NO3
- NH4+ H2O O2 H+ SO4
-2 Biomassa
Δgf‟i
(kJ mol-1) -5872 -1114 -794 -2373 0 -399 -7446 -670
Coeficiente estequiomeacutetrico (mol C-molDM-1)
testes Ia a b b C d e f γX b
1 c 60 -1 -020 - 020 145 -120 - 58
1 d 60 -1 -011 - 032 130 -111 000 519
2 d 60 -1 - -007 024 100 -093 000 399
3 d 120 -1 -011 - 023 122 -111 000 489
4 d 120 -1 - -008 042 103 -092 000 411
5 d 240 -1 -010 - 023 127 -110 000 509
6 d 240 -1 - -008 034 108 -092 000 432 a Intensidade luminosa (μmol m
-2 s
-1)
b Grau de reduccedilao da biomassa
c Composiccedilatildeo elementar da biomassa descrita por Cornet et al (1992)
d Composiccedilatildeo elementar da biomassa determinada experimentalmente
146
Estimando os coeficientes estequiomeacutetricos da reaccedilatildeo 11 e conhecendo a
energia de Gibbs de formaccedilatildeo de produtos e reagentes (Tabela 44) (HEIJNEN
2001) eacute possiacutevel calcular o numero de moles de foacutetons (Einsteins) para sustentar o
crescimento autotroacutefico de 1 C-mol de biomassa (nPh) pela Equaccedilatildeo 8 (item 45)
Embora os valores reais de Δgfi deveriam ter sido utilizados para este caacutelculo
foram utilizados os valores das condiccedilotildees bioloacutegicas padratildeo Torre et al (2003)
demostraram que as diferenccedilas entre a energia de Gibbs de formaccedilatildeo nas
condiccedilotildees reais de cultivo natildeo diferem entre si ou diferem natildeo mais que 3 apartir
de seus respectivos valores estimados com base nas condiccedilotildees bioloacutegicas padratildeo
(T = 2984K C = 10M pH = 70) Por isso foram utilizados os valores de energia de
Gibbs nas condiccedilotildees bioloacutegicas padratildeo
No entanto para o iacuteon H+ a energia de Gibbs de formaccedilatildeo (ΔgfH+) eacute por
definiccedilatildeo uma funccedilatildeo da cultura do pH Assim esse paracircmetro foi recalculado para
as condiccedilotildees reais da equaccedilatildeo de Gibbs
7
pH
ff10
10ln
HH
RTgg (Equaccedilatildeo 12)
Durante as reaccedilotildees luminosas da fotossiacutentese a energia livre carregada
pelos foacutetons eacute capturada por pigmentos (por exemplo a clorofila) organizadas em
grandes complexos de proteiacutenas chamado de centros de reaccedilatildeo A energia de um
foacuteton provoca excitaccedilatildeo eletrocircnica elevando um eleacutetron para um niacutevel maior de
energia exatamente igual agrave energia do foacuteton (hν) Satildeo exigidos um miacutenio de 8 foacutetons
para transferir 4 eleacutetrons de 2 moleacuteculas de H2O para reduzir a 2 moleacuteculas de
NADPH2 de acordo com a equaccedilatildeo
2 H2O + 8 hν +2 NADP+ rarr 2 NADPH + O2 + 2H+ (Reaccedilatildeo 12)
Subsequentemente os eleacutetrons satildeo transferidos do NADPH para o CO2
atraveacutes do ciclo de Calvin para produzir os constituintes da biomassa (RAVEN et al
2000)
Como mostrado na Graacutefico 27 a diminuiccedilatildeo progressiva da velocidade
especiacutefica de crescimento () ao longo do cultivo provocou um aumento (em valor
absoluto) no nuacutemero de Einsteins absorvido para produzir 1 C-mol de biomassa
147
(nPh) Nos maiores valores de quase atingiu o valor teoacuterico de nPh relatado por
Richmond (1983) para sustentar o crescimento sob condiccedilotildees ideais que eacute de 8
Einsteins por C-mol de biomassa
Como jaacute foi observado em trabalho anterior (TORRE et al 2003) a exigecircncia
de energia adicional em relaccedilatildeo agrave situaccedilatildeo ideal de 8 Einsteins C-mol DM-1 foi
insignificante no iniacutecio dos cultivos (alta velocidade especiacutefica de crescimento) e em
seguida aumentou consideravelmente durante a fase estacionaacuteria de cada
experimento sugerindo que em condiccedilotildees provavelmente limitada pelo
sombreamento a biomassa usa a energia preferencialmente para a manutenccedilatildeo
do que para o crescimento Em condiccedilotildees de limitaccedilatildeo de luz (no iniacutecio) ou de
sombreamento (na fase estacionaacuteria) um aumento progressivo da intensidade de
luz natildeo excedeu qualquer influecircncia significativa sobre este paracircmetro
Graacutefico 27 Influecircncia da velocidade especiacutefica de crescimento da A platensis sobre
o nuacutemero de moles de foacutetons absorvido para produzir 1 C-mol de biomassa em
diferentes condiccedilotildees de cultivo () Composiccedilatildeo elementar da biomass descrita por
Cornet et al (1992) PPFD = 60 μmol de foacutetons m-2 s-1 Composiccedilatildeo elementar da
biomass determinada experimentalmente PPFD (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60
() 120 () 240 Fonte de nitrogecircnio nitrato (siacutembolos abertos) ureacuteia
(siacutembolos fechados)
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
000 010 020 030 040 050 060 070 080
nP
h (
Ein
stei
n C
-mol
DM
-1)
(dias -1)
148
Como mostrado no Graacutefico 27 as culturas com nitrato necessitam de maiores
valores de nPh para sustentar o crescimento autotroacutefico em relaccedilatildeo agraves culturas
utilizando ureacuteia Como as concentraccedilotildees celulares dos cultivos utilizando nitrato ou
ureacuteia foram semelhante em todas as intensidades luminosas (Item 61) a exigecircncia
adicional foacuteton nos cultivos com nitrato foi provavelmente utilizado para reduzir o
nitrato a amocircnio (HATORI MYERS 1966) que eacute a forma preferencial de nitrogecircnio
assimilado pela A platensis (BOUSSIBA et al 1984) Este efeito tambeacutem foi
observada por Torre et al (2003) em tanques abertos
Finalmente pode ser observado na mesma figura que o uso do modelo
bioenergeacutetico acima com os coeficientes relatados por Cornet et al (1992) para a
composiccedilatildeo da biomassa de A platensis (CHNOS) levou a resultados praticamente
coincidentes com aqueles obtidos utilizando as experimentais determinadas neste
trabalho Essa constataccedilatildeo demonstra que a composiccedilatildeo da biomassa tem um
impacto pouco significativo sobre os resultados de tal modelo bioenergeacutetico logo
poderia simplesmente ser usado como um instrumento geral assumindo os dados da
literatura sem a necessidade de qualquer determinaccedilatildeo da biomassa
No Graacutefico 28 mostra os comportamentos da produccedilatildeo molar de O2 e do
consumo de H+ durante os cultivos nas diferentes intensidades luminosas Essas
tendecircncias demonstram que as diferentes atividades de consumo e produccedilatildeo
seguem fielmente o crescimento celular O aumento progressivo desses paracircmetros
com a intensidade luminosa confirma que esta foi o fator limitante ao crescimento
nunca atingindo as condiccedilotildees de inibiccedilatildeo da luz Como esperado este
comportamento foi qualitativamente semelhante nas culturas utilizando nitrato como
fonte de nitrogecircnio
149
Graacutefico 28 Produccedilatildeo molar de O2 (siacutembolo fechado) e consumo de H+ (siacutembolo
aberto) em funccedilatildeo do tempo em diferentes condiccedilotildees de cultivo Intensidades
luminosas (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 () 120 () 240 Fonte de
nitrogecircnio nitrato (linha rachurada) ureacuteia (linha contiacutenua)
Como eacute conhecido a energia do fluxo de eleacutetrons entre o FSII e NADPH
direciona proacutetons atraveacutes da membrana plasmaacutetica criando uma forccedila motriz de
proacutetons que fornece energia para a siacutentese de ATP pela ATP sintase (LEHNINGER
2004) Portanto assumiu-se que uma parte da energia molar de Gibbs absorvida
pelos dois fotossistemas foi usada para converter ADP em ATP Como mostrado no
Graacutefico 29 os maiores valores de ΔGa e ΔGATP foram obtidos no final do cultivo
devido a condiccedilotildees ambientais desfavoraacuteveis como a falta de nutrientes ou
liberaccedilatildeo de metaboacutelitos celulares No que se refere agrave intensidade luminosa os
maiores valores de ΔGa e ΔGATP foram observados nas culturas a intensidades
luminosas iguais e maiores que 120 μmol de foacutetons m-2 s-1 que garantiu a maior
concentraccedilatildeo de ceacutelulas (Item 61) Os valores de ΔGa e ΔGATP natildeo aumentaram no
caso dos cultivos utilizando ureacuteia ou aumentou muito pouco no caso dos cultivos
utilizando nitrato na faixa de intensidade luminosa de 120 - 240 μmol de foacutetons m-2
s-1 devido agraves condiccedilotildees de saturaccedilatildeo de luz como mencionado anteriormente
-015
-010
-005
000
005
010
015
020
0 2 4 6 8 10 12
q (
mo
lL
)
Tempo (dias)
150
Graacutefico 29 Energia total de Gibbs absorvida pelo aparato fotossinteacutetico (siacutembolo
fechado) (ΔGa) e energia transformada em ATP (siacutembolo aberto) (ΔGATP) durante o
cultivo da A platensis intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 (
) 120 () 240 Fonte de nitrogecircnio nitrato (linha tracejada) ureacuteia (linha
continua)
No Graacutefico 30 mostra os resultados da energia fixada pela fotossiacutentese (ΔH)
e a liberada como calor (Q) a diferentes condiccedilotildees de intensidades luminosas e
fontes de nitrogecircnio Pode ser visto que no final de cultivos tanto ΔH como Q
aumentaram com a intensidade luminosa Como eacute bem conhecido sob condiccedilotildees de
excesso de luz parte da energia absorvida eacute dissipada termicamente atraveacutes de um
mecanismo natildeo fotoquiacutemico (Non-Photochemical Quenching) (MOZZO et al 2008)
e uma quantidade significativa de energia livre eacute perdida como calor durante as
reaccedilotildees bioquiacutemicas entre a absorccedilatildeo luz e a formaccedilatildeo carboidratos (HAUSKA
ARNALD 2000) Esse resultado foi atribuiacutedo a um mecanismo fisioloacutegico para
proteger o aparelho fotossinteacutetico contra fotodestruiccedilatildeo (KARAPETYAN 2008
HEBER et al 2006) cuja funccedilatildeo eacute desempenhada pelos complexos antena do
aparato fotossinteacutetico que muda forma de captaccedilatildeo de luz para uma forma de
dissipaccedilatildeo teacutermica eficiente (MOZZO et al 2008)
-10000
-8000
-6000
-4000
-2000
0
2000
0 2 4 6 8 10 12
G
AT
P (
kJ
C-m
ol
DM
-1)
Tempo (dias)
151
Graacutefico 30 Energia fixada pelo aparato fotossinteacutetico (siacutembolo fechado) (ΔH) e
energia liberada como calor (siacutembolo aberto) (Q) durante o cultivo de A platensis
intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 ( ) 120 () 240
Fonte de nitrogecircnio nitrato (linha rachurada) ureacuteia (linha contiacutenua)
Como era esperado pelo fato de que tanto a siacutentese de ATP como a formaccedilatildeo
de NADPH satildeo resultantes do mesmo complexo fotossinteacutetico o comportamento do
ΔH foi bastante semelhante ao observado para o ΔGATP
No Graacutefico 31 mostra a distribuiccedilatildeo percentual da energia luminosa absorvida
em funccedilatildeo do tempo nos cultivos a 60 μmol de foacutetons mndash2 sndash1 escolhidos como
exemplo Resultados qualitativamente semelhantes foram observados nos cultivos a
maiores intensidades luminosos (dados natildeo mostrados) Os cultivos com ureacuteia
apresentaram maiores valores de ηATP e ηF e menores valores de ηQ quando
comparado aos cultivos usando nitrato Isso pode ser explicado pelo fato de um
maior requerimento energeacutetico para a reduccedilatildeo de nitrato de amocircnia Aleacutem disso em
todos os experimentos a fraccedilatildeo de energia armazenada como ATP (ηATP) e a fixada
pelos sistemas (ηF) diminuiram ao longo do tempo enquanto que o liberado em
forma de calor (ηQ) aumentou
-2000
0
2000
4000
6000
8000
0 2 4 6 8 10
-H
Q
(k
J C
-mo
l D
M -1
)
Tempo (dias)
152
Graacutefico 31 Porcentagem na distribuiccedilatildeo da energia luminosa absorvida durante o
cultivo de A platensis usando nitrato (siacutembolo fechado) e ureacuteia (siacutembolo aberto)
como fonte de nitrogecircnio Energia fixada pelos fotossistemas () energia
transformada em ATP () energia liberada como calor ( )
Os maiores valores ηATP e ηF foram por volta de 12 e 23-27 nas culturas
com nitrato e 15 e 31-34 em culturas com ureacuteia respectivamente Nos cultivos a
maiores intensidades luminosas (120 e 240 μmol de foacutetons mndash2 sndash1) os valores de ηF
diminuem mais acentuadamente que os cultivos a 60 μmol de foacutetons mndash2 sndash1 devido
agrave maior concentraccedilatildeo de ceacutelulas (item 61) que reduziu a disponibilidade de luz para
a ceacutelula (efeito de sombreamento) A disponibilidade de nutrientes eacute outro importante
fator ambiental influenciando a composiccedilatildeo do aparato fotossinteacutetico de
cianobacteacuterias Murakami et al (1997) tecircm mostrado que as respostas ao CO2 Na+
e estresse pela luz em Synechocystis sp provocam alteraccedilotildees no estado redox de
componentes entre os sistemas de transporte de eleacutetrons Da mesma forma a
diminuiccedilatildeo na disponibilidade de alguns nutrientes no final do cultivo de A platensis
pode ter contribuiacutedo para diminuir os valores de ηF Como esperado ηQ mostraram
um comportamento oposto aumentando progressivamente a partir dos valores
miacutenimos (60-66 com nitrato e 49-54 com ureacuteia) no iniacutecio do cultivo e cerca de
90 no final Isto significa que no final do cultivo da maior parte da energia
absorvida foi liberada como calor
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2 4 6 8 10 12
h (
)
Tempo (dias)
153
67 Comparaccedilatildeo entre os fotobiorreatores de diferentes configuraccedilotildees
Apoacutes a escolha da melhor condiccedilatildeo do cultivo de A platensis em
fotobiorreator tubular horizontal utilizando CO2 de cilindro foram realizados
experimentos nas mesmas condiccedilotildees em fotobiorreator tubular espiralado para
avaliar o comportamento celular em duas diferentes configuraccedilotildees de
fotobiorreatores tubulares Luo et al (2003) tem mostrado que a configuraccedilatildeo de
cada reator eacute um dos principais fatores que controlam a produtividade do cultivo
fotossinteacutetico Por isso foram comparadas as curvas de crescimento A platensis
duas diferentes configuraccedilotildees dos fotobiorreatores tubulares uma horizonal (Figura
7) e outra espiralada (Figura 8)
Como observado no Graacutefico 32 os crescimentos celulares da A platensis nos
diferentes fotobiorreatores foram semelhantes obtendo valores de concentraccedilotildees
celulares diaacuterias proacuteximas Isso pode ser explicado pela semelhanccedila nas condiccedilotildees
fiacutesicas entre os fotobiorreatores tais como diacircmetro interno do tubo velocidade de
escoamento do liacutequido bem como as condiccedilotildees de cultivos como a intensidade
luminosa temperatura meio de cultivo que foram mantidas as mais semelhantes
possiacuteveis
Graacutefico 32 Concentraccedilatildeo celular nas duas diferentes configuraccedilotildees dos
fotobiorreatores tubulares ( ) horizontal e ( loz ) espiralado
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
Tempo (dias)
X (
mg
L-1)
154
7 Conclusotildees
Os paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) e produtividade em ceacutelulas
(Px) foram influenciados pela variaacutevel independente intensidade luminosa (I)
obtendo maiores valores quando submetidos a maiores intensidades luminosas Por
outro lado a variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio (N) natildeo influenciou nesses
paracircmetros mostrando a viabilidade na substituiccedilatildeo do nitrato pela ureacuteia nos cultivos
de Artrhospira platensis
A variaacutevel independente intensidade luminosa natildeo influenciou no paracircmetro
fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) No entanto para variaacutevel
independente fonte de nitrogecircnio os cultivos utilizando ureacuteia apresentaram maiores
valores de YXN quando comparados aos cultivos com nitrato As diferentes fontes de
CO2 natildeo influenciaram nos paracircmetros analisados Xm Px e YXN Logo o CO2
juntamente com os volaacuteteis orgacircnicos liberados durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica
pode ser utilizado para o cultivo da A plantesis sem interferir no crescimento celular
Na composiccedilatildeo centesimal da biomassa pode-se observar que intensidade
luminosa influenciou nos teores de clorofila proteiacutenas e lipiacutedios obtendo maiores
valores de clorofila e proteiacutena nos cultivos a baixa intensidade luminosa enquanto
que nessas condiccedilotildees foram obtidos menores teores de lipiacutedios A fonte de
nitrogecircnio influenciou apenas no teor de clorofila obtendo maiores valores utilizando
nitrato como fonte de nitrogecircnio A fonte de CO2 natildeo influenciou na composiccedilatildeo da
biomassa Nenhuma das variaacuteveis independentes estudadas influenciou nos teores
de cinzas e carboidratos na biomassa final
Os resultados tambeacutem indicaram que todas as variaacuteveis independentes tiveram
uma certa influecircncia nos paracircmetros de bioenergeacutetica A dissipaccedilatildeo de energia de
Gibbs aumento com o tempo em todas as condiccedilotildees analisadas obtendo os maiores
valores em tempos mais curtos nos cultivos a 120-240 μmol de foacutetons m-2 s-1
independentemente da fonte de nitrogecircnio selecionado O nuacutemero de moles de
foacutetons absorvidos pelas ceacutelulas para produzir um C-mol de biomassa foi maior nas
culturas com nitrato independentemente da intensidade luminosa Os maiores
valores de produccedilatildeo molar de O2 e do consumo de H+ foram obtidos com os valores
mais elevados de intensidade luminosa utilizando nitrato As fraccedilotildees da energia
direcionada para a siacutentese de ATP fixada pela ceacutelula foram superiores em culturas
com ureacuteia quando comparadas com as culturas com nitrato que se revelou uma
fonte de nitrogecircnio capaz de sustentar o crescimento energicamente da A platensis
155
As diferentes configuraccedilotildees dos fotobiorreatores tubulares natildeo influenciaram
nas concentraccedilotildees celulares indicando que o formato do tubo que forma o
fotobiorreator seja horizontal ou espiralado natildeo interferem no crescimento da A
platensis
Com isso pode-se concluir que a intensidade luminosa eacute uma importante
variaacutevel que influencia nos paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima produtividade
celular fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas bioenergeacuteticos e na
composiccedilatildeo quiacutemica da A platensis e que o emprego do CO2 proveniente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica juntamente com a ureacuteia como fonte de nitrogecircnio pode ser
uma alternativa viaacutevel para o cultivo de A platensis em escala industrial
proporcionando uma reduccedilatildeo no custo de produccedilatildeo
156
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178
ANEXOS
Artigos publicados submetidos e em fase de redaccedilatildeo para perioacutedicos internacionais
ANEXO 1 - BEZERRA RP MONTOYA EYO SATO S PEREGO P
CARVALHO JCM CONVERTI A Effects of light intensity and dilution rate on the
semicontinuous cultivation of Arthrospira (Spirulina) platensis A kinetic Monod-type
approach Bioresource Technology 102 p3215 - 3219 2011
ANEXO 2 - BEZERRA RP MATSUDO MC SATO S CONVERTI A
CARVALHO JCM Effects of photobioreactor configuration nitrogen source and
light intensity on the fed-batch cultivation of Arthrospira (Spirulina) platensis
Bioenergetic aspects Biomass and Bioenergy
ANEXO 3 - BEZERRA RP MATSUDO MC SATO S CONVERTI A
CARVALHO JCM Carbon dioxide from alcoholic fermentation as a carbon source
for the fed-batch cultivation of Arthrospira platensis Biomass and Bioenergy
BEZERRA RP MATSUDO MC SATO S CONVERTI A CARVALHO JCM
Chemical composition of the A platensis biomass cultivated on CO2 from alcoholic
fermentation Em fase de Redaccedilatildeo
179
ANEXOS
180
Anexo 1
181
182
183
184
185
Anexo 2
Effects of photobioreactor configuration nitrogen source and light intensity
on the fed-batch cultivation of Arthrospira (Spirulina) platensis
Bioenergetic aspects
Raquel Pedrosa Bezerraab
Marcelo Chuei Matsudoa Sunao Sato
a Patrizia Perego
b Attilio
Convertibc
Joatildeo Carlos Monteiro de Carvalhoa
a Department of Biochemical and Pharmaceutical Technology Faculty of Pharmaceutical
Sciences University of Satildeo Paulo Av Prof Lineu Prestes 580 Bl 16 05508-900 Satildeo Paulo-
SP Brazil
b Department of Chemical and Process Engineering ldquoGB Boninordquo University of Genoa via
Opera Pia 15 16145 Genoa Italy
c CAPES Fellowship holder Brazil
_________
Author for correspondence phone +55-11-30913695 fax +55-11-38156386
E-mail jcmdcarvuspbr
186
ABSTRACT
The bioenergetics of the photoautotrophic growth of the cyanobacterium Arthrospira
(Spirulina) platensis was investigated in different bioreactor configurations (tubular
photobioreactor and open ponds) using different nitrogen sources (nitrate and urea) and under
different light intensity conditions Although an increase in the light intensity increased the
Gibbs energy dissipated for cell growth and maintenance in both nitrogen sources it did not
exert any appreciable influence on the moles of photons absorbed by the system to produce
one C-mol biomass On the other hand both bioenergetic parameters were higher in cultures
with nitrate than with urea likely because of the higher energy requirements needed to reduce
the former nitrogen source to ammonia They appreciably increased also when open ponds
were substituted by the tubular photobioreactor where a more efficient light distribution
ensured a remarkably higher cell mass concentration The estimated percentages of the energy
absorbed by the cell showed that compared with nitrate the use of urea as nitrogen source
allowed the system to address higher energy fractions to ATP production and light fixation by
the photosynthetic apparatus as well as a lower fraction released as heat Thanks to this better
bioenergetic situation urea appears to be a quite promising low-cost alternative nitrogen
source for A platensis cultures in photobioreactors
Keywords Arthrospira (Spirulina) platensis bioenergetics nitrogen source light intensity
bioreactor configuration
187
1 Introduction
The production of the cyanobacterium Arthrospira platensis is increasing due to its high
content of highly-valuable proteins fundamental amino acids vitamins β-carotene and other
pigments mineral substances essential fatty acids and polysaccharides which find
application in several industrial productions like those of health foods and therapeutics [1]
Environmental factors such as light intensity and nitrogen source are well known to
influence the growth of photosynthetic microorganism In the absence of any other limiting
factor cell concentration increases with light intensity until reaching maximum biomass
concentration that is denominated ldquosaturation levelrdquo Light intensities higher than the
saturation level provoke damage of cell photosynthetic apparatus due to a phenomenon called
ldquophotooxidationrdquo or ldquophotoinhibitionrdquo
The nitrogen source is an additional environmental factor influencing cell growth
because this element is mainly used to form proteins and nucleic acids Alternative sources of
nitrogen such as urea [23] and ammonium salts [4] have been investigated in substitution of
nitrate to reduce the cost of large-scale A platensis cultivation
Also the reactor configuration can impact on cell growth Appropriately-designed
photobioreactors can in fact reduce the cultivation area by a vertical distribution of the
photosynthetic organism and enlarge the surface exposed to light thus increasing cell
concentration Tubular reactors allow for better light distribution and then higher
photosynthetic efficiency with respect to the conventional mini-ponds [56] where the cells
are subject to full light radiation at the surface and darkness at the bottom [7]
Only a few studies emphasized the bioenergetic aspects of the growth of
photosynthetic microorganisms based on Gibbs energy balances The Gibbs energy
dissipation per C-mol of biomass can be regarded as a simple thermodynamic measure of the
amount of biochemical work required to convert the carbon source into biomass by the
proper irreversible carbon-carbon coupling and oxidationreduction reactions [8] Up to now
188
the bioenergetics of the cyanobacterium A platensis were uninvestigated either in bench-scale
open ponds using urea and KNO3 as nitrogen sources [910] or in rectangular vessel under
different light intensities [11] To shed further light on these aspects in this study we
investigated the bioenergetics of this cyanobacterium when cultivated in tubular
photobioreactor under different light intensities and using different nitrogen sources and
compared these results with those previously obtained in open ponds [9]
2 Material and methods
21 Photobioreactors and culture conditions
Arthrospira (Spirulina) platensis UTEX 1926 was cultivated either in open ponds [9] on the
medium of Paoletti et al [12] or in tubular photobioreactor [13] on the medium of Schloumlsser
[14] both containing nitrate as nitrogen source The initial cell concentration and pH were set
at 400 mg l-1
[15] and 95 [1617] respectively
Open ponds cultivations were carried out elsewhere in the same medium of Paoletti et
al [12] at photosynthetic photon flux density (PPFD) of 72 μmol photons mndash2
sndash1
25 ordmC [9]
On the other hand for tubular photobioreactor cultivations we used the medium of Schloumlsser
[14] as well as medium in which NaNO3 was substituted by urea These runs were carried out
at 60 le PPFD le 240 μmol photons mndash2
sndash1
29 ordmC and the pH was controlled at 95 plusmn 02 by
pure CO2 addition Since the operating conditions at the lowest PPFD values were very
similar any difference in the kinetics and bioenergetics was ascribed to the different
bioreactor configurations The amount of urea to be daily added was estimated by an equation
describing the experimental growth curve obtained under non-limited conditions with NaNO3
as nitrogen source as previously described [13] Under these conditions the bioenergetics of
the system was investigated comparing the different nitrogen sources
189
22 Analytical determinations
The cell concentration of A platensis was determined by measuring the optical density of
cultures at 560 nm using a spectrophotometer model 600 PLUS (FEMTO Satildeo Paulo Brazil)
The optical density data were converted to cell dry weight by a calibration curve The
elemental composition of biomass obtained at the end of each run was determined by an
elemental analyzer Flash EA1112 series (CE Instruments Wigan UK)
Light intensity at the culture surface was measured using a quantum sensor model LI-
190 SB (Li-Cor Inc Lincoln NE USA) connected to a quantumradiometerphotometer
model LI-189 B
23 Theory
The Gibbs energy dissipation for cell growth and maintenance (1YGX) was estimated
according to Heijnen [18] by the equation (1)
G
GXGX
m
YY
max
11
(1)
in which max
GXY is the maximum biomass yield on Gibbs energy that corresponds to 986 C-
molX kJ-1
in photoautotrophic cultivation with CO2 as a carbon source [18]
In this equation the specific growth rate μ was defined according to Leduy and Zajic
[19] as
190
1
ln1
i
i
X
X
t
(2)
where Xi and Xi-1 are the biomass concentrations at the end and the beginning of the time
interval elapsing between two consecutive measurements (Δt = 1 day) while mG is the
biomass specific rate of Gibbs energy dissipation for maintenance corresponding to 45 and
712 kJ C-molX-1
h-1
at 25 and 29 degC respectively [18]
To estimate the moles of photons (Einsteins) to sustain the autotrophic growth nPh it
was necessary to resort to the Gibbs energy balance taking into account the energy
contributions for the growth 1YGX and the absorption of 1 Einstein of photons ΔgPh in
addition to those of formation of substrates and products Δgfi as described by the equation
ΔgfHCO3- +ΔgfN + ΔgfH2O + ΔgfO2
+ ΔgfH+ + ΔgfX + 1YGX + nPh ΔgPh = 0
(3)
The value of ΔgPh = 2062 kJ mol-1
was estimated through the equation
A
Ph
hcNg
(4)
being h = 6626 10
-34 J the Planck constant c = 299
10
8 m s
-1 the light velocity NA = 6022
10
23 photons Einstein
-1 the Avogadro number and λ = 580 nm the wavelength of absorbed
photons [9]
191
According to Torre et al [9] 2 photons at 580 nm are absorbed by the second
photosystem (PSII) and used to transfer 2 electrons to the first one (PSI) releasing two
photons with less energy Therefore knowing nPh we estimated the total molar Gibbs energy
absorbed by the photosynthesis (-ΔGa)
ΔGa = nPh ΔgPh
(5)
According to Torre et al [9] the molar O2 production (qO2) and H
+ consumption
(qH+) were calculated by multiplying their respective stoichiometric coefficients by the cell
concentration expressed in C-mol l-1
using the experimental biomass elemental composition
-ΔGa was assumed to be the sum of the energy fixed by the system to increase its own
enthalpic content (ΔH) that transformed into ATP and used for the growth and maintenance
(ΔGATP) and the released heat (Q)
ΔGa + ΔGATP + ΔH + Q = 0
(6)
where ΔGATP and ΔH were calculated from nPh the Gibbs energy associated to 1 ATP mol
and the average potential variation between PSI and PSII [9]
3 Results and discussion
Fig 1 shows the growth curves of A platensis using nitrate (A) or urea (B) as nitrogen
sources in open ponds [910] or in tubular photobioreactor at different PPFD values A
192
progressive increase in PPFD up to 240 μmol photons m-2
s-1
favored the growth of this
cyanobacterium and a maximum cell concentration of about 3500 mg l-1
was obtained almost
irrespectively of the nitrogen source These results suggest that the light intensity was the
factor limiting the growth under the selected conditions while ongoing experiments (results
not shown) point out that photosaturation takes place at PPFD ge 240 μmol photons m-2
s-1
Such a maximum PPFD threshold is higher than those reported for Erlenmeyer flasks (100-
150 μmol photons m-2
s-1
) [21] rectangular photobioreactor (138 - 229 μmol photons mndash2
sndash1
)
[22] and long open ponds (156 μmol photons mndash2
sndash1
) [23] Moreover even at PPFD of only
60 μmol photons m-2
s-1
(Fig 1) the final cell concentration was more than twice that
previously obtained in open pond under similar experimental conditions (25 degC 72 μmol
photons m-2
s-1
) [10] which suggests a better light distribution in the tubular photobioreactor
Fig 2 illustrates the behavior of Gibbs energy dissipation for cell growth and
maintenance 1YGX versus the time As a general rule this bioenergetic parameter increased
with the time under all the tested conditions as a result of the increasing biomass level that
was responsible for a decrease in the specific growth rate An increase in PPFD up to 120
μmol photons m-2
s-1
favored cell growth because of photolimitation therefore the energy
requirements mainly for maintenance remarkably increased On the contrary none (urea) or
very little (nitrate) increase in 1YGX took place in the PPFD range of 120-240 μmol photons
m-2
s-1
because of the achievement of light saturation conditions This behavior is also
consistent with lower 1YGX values previously observed in open ponds [9] where the well-
known shadowing effect [24] hindered the growth
The photoautotrophic growth can be represented by an overall mass balance equation
where the nitrogen (NO3- or NH4
+) and carbon (HCO3
-) sources H2O O2 SO4
-2 and H
+ are
involved in the formation of 1 C-mol biomass
193
a HCO3- + b NO3
- (or NH4
+) + c H2O + d O2 + e H
+ + f SO4
-2 + CH1650O0531N0170S00007 = 0
(7)
To this purpose we used either the elemental composition of biomass reported by
Cornet et al [25] utilized here as an example or those experimentally determined as
described in Material and methods
To make these redox reactions between electron acceptor and donor possible the
Gibbs energy is used by the cell to enable the construction of the complex biomass molecules
from the inorganic carbon source The respective stoichiometric coefficients estimated
through material balances of carbon nitrogen oxygen sulfur charge and reduction degree are
listed in Table 1 It should be noticed that the reduction degree of biomass (γX) calculated
from biomass composition experimentally determined in this work was always appreciably
higher with nitrate (489-519) than with urea (399-432) as expected by the higher oxidation
number of the former compound [18] In addition both this parameter and the nitrogen
stoichiometric coefficient were appreciably lower when using the elemental composition
experimentally determined in this work (Table 1) because the nitrogen content of biomass
under the selected conditions was always lower than that reported by Cornet et al [25]
The moles of photons (Einsteins) to sustain the autotrophic growth of 1 C-mol
biomass (nPh) were calculated by Eq (3) Although the actual Δgfi values should have been
used for this calculation Torre et al [9] demonstrated that the Gibbs energy of formation
under the actual variable conditions of a cultivation does not differ at all or differs by no more
than 3 from that estimated under standard biological conditions On the contrary ΔgfH+ is
by definition a function of the pH So this parameter was recalculated for the actual
conditions by the well-known equation of Gibbs
194
7
pH
ff10
10ln
HH
RTgg
(8)
As shown in Fig 3 the progressive decrease in the specific growth rate throughout the
cultivations brought about a corresponding increase (in absolute value) in the Einsteins
absorbed to produce one C-mol biomass (nPh) As expected at the highest growth rates this
parameter approached theoretical values very close to that reported by Richmond [26] to
sustain growth under ideal conditions (only 8 effective Einsteins C-molDM-1
)
During the light reactions of photosynthesis the free energy carried by photons is in
fact captured by pigments (ex chlorophyll) held in large protein complexes called ldquoreaction
centersrdquo When a special chlorophyll molecule of PSII absorbs the energy of a photon (hν) an
electron gains higher energy level Because this state of an electron is very unstable it is
transferred from one to another molecule creating a chain of redox reactions referred to as
Electron Transport Chain (ETC) The electron flow goes from PSII to cytochrome b6f of PSI
where the electron gets the energy from another photon The final electron acceptor is
NADP+ which produces NADPH A minimum of 8 photons is then required to transfer 4
electrons from 2 H2O molecules to produce 2 NAPDH molecules according to the equation
2 H2O + 8 hν +2 NADP+ rarr 2 NADPH + O2 + 2 H
+
(9)
Subsequently the electrons are transferred from NAPDH to CO2 through the Calvin cycle to
produce biomass constituents [27]
As already observed in previous work [9] the additional energy requirement with
respect to the ideal situation of 8 effective Einsteins C-molDM-1
is negligible at the beginning
195
of cultivations (high specific growth rates) and then considerably increases during the
stationary phase This suggests that under conditions likely limited by shadowing biomass
uses energy preferentially for maintenance rather than for growth Although the behavior of
nPh was qualitatively similar for cultivations performed in open ponds and in tubular
photobioreactor (Fig 3) the excess light requirements in the latter configuration were
certainly due to the higher levels of biomass ensured by more effective distribution As
expected a progressive increase in the light intensity did not exert any appreciable influence
on this nPh (Einstein C-molDM-1
)
In addition the cultures with nitrate needed highest nPh values to sustain the
autotrophic growth compared to those with urea even though the cell concentration was
similar at all the PPFD values (Fig 1) Thus the additional photon requirement was likely
utilized to reduce nitrate to ammonia [28] which is the preferential nitrogen form assimilated
by A platensis [29] This effect was also observed by Torre et al [9] in open ponds It should
also be noticed that the use in the above bioenergetic model of the coefficients reported by
Cornet et al [25] for A platensis biomass composition (CH1650O0531N0170S00007) led to
results practically coincident to those obtained using the experimental ones determined in this
work (Fig 3) This observation demonstrates that biomass composition has a negligible
impact on the predictions by the model and then it could be used as a general tool to elaborate
data from the literature without any determination of biomass composition
Fig 4 shows the time behaviors of molar development of O2 and consumption of H+
during the cultivations performed either in open pond or in the tubular photobioreactor at
variable PPFD These trends clearly demonstrate that both activities faithfully followed cell
growth being biomass the final product of the photosynthetic metabolism and were lower in
the open pond compared with the tubular photobioreactor consistently with the better light
distribution in the latter reactor configuration Moreover their progressive increase with
PPFD confirms that the light intensity was the factor actually limiting the growth and that the
196
system never reached photoinhibition conditions This behavior was qualitatively similar in
the cultures using nitrate as nitrogen source (data not shown) As expected by the above-
mentioned need of reducing nitrate to ammonia as an obligatory intermediate to utilize any
nitrogen source [30] both parameters were higher using nitrate than urea
As is well known the energy from flow of electrons between PSII and NADPH drives
protons across the plasma membrane creating a proton-motive force that provides the energy
for ATP synthesis by ATP synthase [31] Therefore it was assumed that a portion of molar
Gibbs energy absorbed by the two photosystems was used to convert ADP to ATP As shown
in Fig 5 the highest -ΔGa and ΔGATP values were obtained at end of cultivation due to
unfavorable environmental conditions such as the lack of nutrients or release of cell
metabolites As far as the influence of light intensity is concerned the highest energy
requirements were observed for cultures performed at PPFD up to 120 μmol photons m-2
s-1
which ensured the highest cell concentration (Fig 1) As previously mentioned the -ΔGa and
ΔGATP values did not increase (urea) or increased very little (nitrate) in the PPFD range of 120
ndash 240 μmol photons m-2
s-1
because of light saturation conditions A qualitatively similar
behavior was observed for cultures using nitrate in tubular photobioreactor (results not
shown) Moreover at the lowest PPFD values both parameters showed similar behaviors in
open pond and in tubular photobioreactor which means that the reactor configuration had
negligible influence on them
Fig 6 shows the results of the energy fixed by photosynthesis (-ΔH) and that released
as heat (Q) under different conditions of light intensity nitrogen source and reactor
configuration It can be seen that at the end of cultivations both parameters increased with
light intensity Almost coincident results were also obtained using nitrate as nitrogen source
(results not shown) As is well known under excess light conditions part of the absorbed
energy is thermally dissipated via a mechanism called Non-Photochemical Quenching (NPQ)
[32] and a significant quantity of free energy is lost as heat during the biochemical reactions
197
between light absorption and carbohydrate formation [33] Such a result has been ascribed to
a certain physiological mechanism to protect the photosynthetic apparatus against
photodestruction [3435] where a fundamental role is played by the antenna complexes of
photosynthetic apparatus which would switch from a light harvesting form to an efficient
thermal dissipation form [32]
As expected by the fact that both the ATP synthesis and the formation of NADPH
implied in the biosynthetic pathways are resulting from the activity of the same
photosynthetic apparatus [33] the ΔH behavior was quite similar to that observed for ΔGATP
Fig 7 shows the percentage distribution of the light energy absorbed versus time at the
lowest PPFD chosen as an example but qualitatively similar results were observed at higher
PPFD values As expected by the additional energy requirements of nitrate-to-ammonia
reduction cultures with urea compared with those with nitrate exhibited higher energy
fractions stored as ATP (ηATP) and fixed by the system to increase its enthalpic content (ηF)
and lower fraction released as heat (ηQ) Moreover in all the experiments both ηATP and ηF
decreased along the time whereas ηQ increased
The highest ηATP and ηF values were around 12 and 23ndash27 in cultures with nitrate
and 15 and 31ndash34 in those with urea respectively In cultures performed at the highest
PPFD values (120 and 240 μmol photons mndash2
sndash1
) ηF decreased more sharply than at the
lowest ones (results not shown) because of the highest cell concentrations (Fig 1) that
reduced the light availability to the cell (shading effect) The nutrient availability is another
important environmental factor influencing the composition of cyanobacterial photosynthetic
apparatus Murakami et al [36] have shown that the responses to CO2 Na+
and light stresses
in Synechocystis sp cause alterations in the redox state of intersystem electron transport
components Likewise the decrease in the availability of some nutrient at the end of our A
platensis cultivations may have contributed to lower ηF As expected ηQ showed an opposite
behavior progressively increasing from minimum values at the beginning of cultures (60-
198
66 with nitrate and 49-54 with urea) to around 90 at the end This means that at the end
of any cultivation most of the energy absorbed is released as heat
Similar behaviors were observed using either open ponds with nitrate or the tubular
photobioreactor with both nitrogen sources which means that the energy distribution was not
appreciably influenced by the reactor configuration
4 Conclusions
The results of the current study indicate that the bioenergetic parameters of the blue-green
cyanobacterium Arthrospira (Spirulina) platensis were influenced by bioreactor
configuration nitrogen source and photosynthetic photon flux density (PPFD) In particular
the highest values of the Gibbs energy dissipation for cell growth and maintenance were
obtained at 120-240 μmol photons m-2
s-1
irrespective of the selected nitrogen source while
the number of photons moles absorbed by the cell to produce one C-mol biomass was higher
in the cultures with nitrate irrespective of light intensity The highest values of the molar
production of O2 and consumption of H+ were obtained at the highest PPFD values using
nitrate as a nitrogen source and the tubular photobioreactor Contrarily the bioreactor
configuration did not exert any appreciable influence on the fractions of the absorbed energy
addressed to the synthesis of ATP fixed by the cell and released as heat The first two
fractions were higher in cultures performed with urea which proved a nitrogen source able to
energetically sustain A platensis growth
Acknowledgements
The authors grateful acknowledge the financial support of the Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
Pesquisa do Estado de Satildeo Paulo (FAPESP) Satildeo Paulo Brazil (process no 0654959-3 and
199
0656976-2) of the Coordenaccedilatildeo de Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES)
Brazil (process no 397808-7 and Prof A Converti Fellowship no 0350-112010) of the
Italian Ministry of Education University and Research (MIUR) (PRIN ProtN 200744HMBN
and FIRB Prot N RBIP06993E) and of the Vigoni Program (Deutsch-Italienisches
Hochschulzentrum)
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204
Caption of Figures
Fig 1 Growth of A platensis using nitrate (A) and urea (B) as nitrogen sources at different
PPFD values (μmol photons m-2
s-1
) Tubular photobioreactor () 60 ( ) 120 and () 240
Open ponds [10] 72 ()
Fig 2 Dependence of Gibbs energy dissipation for A platensis growth and maintenance
(1YGX) on PPFD (μmol photons m-2
s-1
) Tubular photobioreactor () 60 ( ) 120
() 240 Open ponds [10] 72 () Nitrogen source nitrate (open symbols or ) urea
(full symbols)
Fig 3 Influence of A platensis specific growth rate (μ) on the moles of photons absorbed to
produce one C-mol biomass (nPh) under different culture conditions Tubular photobioreactor
() elemental biomass composition reported by Cornet et al [25] PPFD = 60 μmol photons
m-2
s-1
elemental biomass composition experimentally determined in this work PPFD (μmol
photons m-2
s-1
) () 60 () 120 () 240 () Open ponds [10] elemental
biomass composition reported by Cornet et al [25] PPFD = 72 μmol photons m-2
s-1
Nitrogen source nitrate (open symbols or ) urea (full symbols)
Fig 4 Time behaviors of molar development of O2 (full symbols) and consumption of H+
(open symbols) under different culture conditions Tubular photobioreactor PPFD (μmol
photons m-2
s-1
) () 60 () 120 () 240 Open ponds [10] PPFD = 72 μmol
photons m-2
s-1
() Nitrogen source nitrate (dashed line) urea (continuous lines)
Fig 5 Total Gibbs energy absorbed by the photosynthetic apparatus (full symbols) (-ΔGa)
and energy transformed into ATP (open symbols) (ΔGATP) during A platensis cultivations
205
Tubular photobioreactor with urea PPFD (μmol photons m-2
s-1
) () 60 ( ) 120
() 240 Open ponds with nitrate [10] PPFD = 72 μmol photons m-2
s-1
()
Fig 6 Energy fixed by the photosynthetic apparatus (full symbols) (-ΔH) and energy released
as heat (open symbols) (Q) during A platensis cultivations Tubular photobioreactor with
urea PPFD (μmol photons m-2
s-1
) () 60 ( ) 120 () 240 Open ponds with
nitrate [10] PPFD = 72 μmol photons m-2
s-1
()
Fig 7 Percentage distribution of the light energy absorbed during A platensis cultivations
using nitrate (full symbols) and urea (open symbols) as nitrogen sources Tubular
photobioreactor PPFD = 60 μmol photons photons mndash2
sndash1
(continuous lines) Open ponds
[10] PPFD = 72 μmol photons m-2
s-1
(dashed lines) Energy fixed by the photosynthesis
() energy transformed into ATP () energy released as heat ( )
206
Figure 1
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
Bio
ma
ss c
on
cen
tra
tio
n (
mg
l-1
)
Time (d)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
Bio
ma
ss c
on
cen
tra
tio
n (
mg
l-1
)
Time (d)
A
B
207
Figure 2
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
0 2 4 6 8 10 12
1Y
GX (
kJ
C-m
ol
DM
-1)
Time (d)
208
Figure 3
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
000 010 020 030 040 050 060 070 080
nP
h (
Ein
stei
n C
-mo
l D
M-1
)
(d -1)
209
-015
-010
-005
000
005
010
015
020
0 2 4 6 8 10 12
q (
mol
l-1)
Time (d)
210
Figure 4
Figure 5
-9000
-8000
-7000
-6000
-5000
-4000
-3000
-2000
-1000
0
1000
0 2 4 6 8 10 12
G
a
GA
TP (
kJ
C-m
ol
DM
-1)
Time (d)
211
Figure 6
-2000
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
0 2 4 6 8 10 12-H
Q
(k
J C
-mol
DM
-1)
Time (d)
212
Figure 7
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2 4 6 8 10 12
h(
)
Time (d)
213
Table 1 Stoichiometric coefficients estimated through material balances of carbon nitrogen
oxygen sulfur charge and reduction degree for biomass cultivated either in open ponds or in
tubular photobioreactor using nitrate or urea as nitrogen sources
HCO3- NO3
- NH4
+ a H2O O2 H
+ SO4
-2 Biomass
Δgf‟i
(kJ mol-1
)
-5872 -1114 -794 -2373 0 -399 -7446 -670
Stoichiometric coefficients (mol C-molDM-1
)
Run
PPFD
(μmol photons
m-2
s-1
)
a b b c d e f γX b
1 c 72 -1 -020 - 020 145 -120 - 580
2 d 60 -1 -020 - 020 145 -120 - 580
2 e 60 -1 -011 - 032 130 -111 000 519
3 e 60 -1 - -007 024 100 -093 000 399
4 e 120 -1 -011 - 023 122 -111 000 489
5 e 120 -1 - -008 042 103 -092 000 411
6 e 240 -1 -010 - 023 127 -110 000 509
7 e 240 -1 - -008 034 108 -092 000 432
a NH4
+ is the result of urea hydrolysis
b Reduction degree of biomass
c Minipond considering the elemental biomass composition reported by Cornet et al [25]
d Tubular photobioreactor considering the elemental biomass composition reported by Cornet et al
[25]
e Tubular photobioreactor elemental biomass composition experimentally determined
214
Anexo 3
Carbon dioxide from alcoholic fermentation as a carbon source for the
fed-batch cultivation of Arthrospira platensis
Raquel Pedrosa Bezerraab
Marcelo Chuei Matsudoa Sunao Sato
a Attilio Converti
bc Joatildeo
Carlos Monteiro de Carvalhoa
a Department of Biochemical and Pharmaceutical Technology Faculty of Pharmaceutical
Sciences University of Satildeo Paulo Av Prof Lineu Prestes 580 Bl 16 05508-900 Satildeo
Paulo-SP Brazil
b Department of Chemical and Process Engineering ldquoGB Boninordquo University of Genoa via
Opera Pia 15 16145 Genoa Italy
c CAPES Fellowship holder Brazil
_________
Author for correspondence phone +55-11-30913695 fax +55-11-38156386
E-mail jcmdcarvuspbr
215
Abstract
It was evaluated the Arthrospira platensis cultivation using CO2 from alcoholic fermentation
and either urea or nitrate as nitrogen source at different light intensities (60 le I le 240 μmol
photons m-2
s-1
) Whereas the CO2 source (pure CO2 or from alcoholic fermentation) did not
influence the maximum cell concentration (Xm) cell productivity (PX) and nitrogen-to-cell
conversion factor (YXN) the use of urea instead of nitrate led to higher YXN values Xm and PX
increased when I was increased from 60 to 120-240 μmol photons m-2
s-1
Using CO2 from
alcoholic fermentation the best performance (Xm = 2952 plusmn 35 mg L-1
PX = 425 plusmn 59 mg L-1
d-1
and YXN = 15 plusmn 020 mg mg-1
) was obtained at I = 120 μmol photons m-2
s-1
with urea The
results obtained in this work demonstrate that urea and CO2 from alcoholic fermentation could
be simultaneously used in large-scale cultivations to reduce the environmental impact
associated to the release of this greenhouse gas as well as the production cost of
cyanobacteria
Keywords
Arthrospira (Spirulina) platensis CO2 alcoholic fermentation fed-batch cultivation urea
light intensity
1 Introduction
Renewable energy sources such as ethanol have been seen as a promising alternative
to fossil fuel consumption providing environmental benefits by reduction in greenhouse gas
emissions and the national security benefits by less dependency on volatile crude oil imports
(Tyner and Taheripour 2007) Brazil is the worldrsquos largest exporter of bioethanol and second-
largest producer after the United States (Balat and Balat 2009) Considering the increasing
demand for this fuel and the fact that alcoholic fermentation is responsible for a CO2 release
216
on weight basis almost coincident with ethanol production it would be of great concern
developing a process for CO2 fixation able to turn it into a useful product Photosynthetic
microorganisms can fix CO2 efficiently from different sources including the atmosphere
industrial exhaust gases and soluble carbonate salts (Wang et al 2008) Moreover CO2
biofixation by microalgae leads to higher yield of biomass per hectare in comparison with
terrestrial plants (Packer 2009) It has been shown that the cost of CO2 in large-scale algal
cultures is of primary importance to the total economics (Tapie and Bernard 1988) Since 45ndash
50 of the dry algal mass is made up of carbon (Cornet et al 1992) 165ndash 183 g CO2 would
theoretically be needed for the biosynthesis of 1 g (DW) of algal biomass Thus CO2
biofixation by microalgae has the potential not only to offset carbon emissions but also to
reduce the costs of culture media on an industrial scale (Hughes and Benemann 1997)
Combination of CO2 fixation and production of biomass containing high-value bioactive
products may provide a very promising alternative to current CO2 mitigation strategies
Nowadays there are numerous commercial applications of A platensis such as the
enhancement of the nutritional value of foods and animal feed feed in aquaculture
bioremediation use in cosmetics and others applications (Spolaore et al 2006) Besides the
CO2 source the nitrogen source is an additional important factor in the cultivation of
photosynthetic microorganisms since this element is used mainly to provide proteins and
nucleic acids which are essential for cell maintenance and growth (Watanabe and Hall
1996) Salts of nitrate are largely used as nitrogen source for A platensis culture but urea
(Danesi et al 2004) and ammonium salts (Bezerra et al 2008) have recently been proposed
as alternative cheap nitrogen sources
Compared to open ponds appropriately designed closed photobioreactors are able to
minimize the loss of ammonia nitrogen sources by off gassing reducing the amount of this
nutrient necessary in a large-scale process Additionally these reactors can reduce the
217
cultivation area by distributing the photosynthetic organisms vertically and increase the CO2
residence time thereby improving its utilization efficiency (Ono and Cuello 2004)
The aim of this study was to check if the combined use of CO2 released from alcoholic
fermentation and urea in tubular photobioreactor could be a feasible and cheap alternative
way to cultivate A platensis For this purpose fed-batch cultivations were carried out at
variable light intensity using two different sources either of nitrogen (sodium nitrate or urea)
or of carbon (pure CO2 from cylinder or gaseous emissions from alcoholic fermentation) the
latter to simultaneously control the pH and maintain the desired carbon level The results
obtained were finally compared by means of analysis of variance to identify the statistically
significant effects of the above independent variables (light intensity nitrogen source and
carbon source) on the selected responses namely the maximum cell concentration cell
productivity and nitrogen-to-cell conversion factor
2 Materials and methods
21 Microorganism and culture medium
Arthrospira (Spirulina) platensis UTEX 1926 was maintained in the culture medium
of Schloumlsser (1982) having the following composition (per liter) 136 g NaHCO3 403 g
Na2CO3 050 g K2HPO4 250 g NaNO3 100 g K2SO4 100 g NaCl 020 g MgSO4middot7H2O
004 g CaCl2middot2H2O All the nutrients were dissolved in distilled water containing (per liter)
60 mL of metal solution (970 mg FeCl3middot6H2O 410 mg MnCl2middot4H2O 50 mg ZnCl2 20 mg
CoCl2middot6H2O 40 mg Na2MoO4middot2H2O) 10 mL of micronutrient solution (500 mg Na2EDTA
618 mg H3BO3 196 mg CuSO4middot5H2O 440 mg ZnSO4middot7H2O 200 mg CoCl2middot6H2O 126 mg
MnCl2middot4 H2O 126 mg Na2MoO4 middot2H2O) and 10 mL15 g Lminus1
B12 vitamin solution
Fed-batch runs were carried out either using the above medium containing NaNO3 as
the nitrogen source or after substituting in it NaNO3 with urea
218
22 Cultivation
The bench-scale tubular photobioreactor (Fig 1) utilized in this study was developed
at the Fermentation Technology Laboratory of the Department of Biochemical and
Pharmaceutical Technology of Satildeo Paulo University (Ferreira et al 2010) It was made up of
transparent glass tubes (10 m length 10 cm internal diameter 05 cm wall thickness) with
inclination of 2 (115ordm) to make the fluid flow easier PVC tubes were used to connect the
glass tubes The reactor was illuminated by 20 W fluorescent lamps Ambient air was injected
at the bottom of the tubes to drive the liquid from the bottom to the top of the reactor A
degassing bottle provided with magnetic stirrer ensured efficient medium homogeneity The
total and illuminated volumes of the reactor were 350 and 212 L respectively
Cultivations were carried out with initial biomass concentration of 400 mg Lminus1
(Ferreira et al 2010) in tubular photobioreactor (PBR) and temperature of 29 ordmC The pH was
set and maintained at 95 plusmn 02 (Saacutenchez-Luna et al 2007) by addition of pure CO2 from
cylinder or CO2 from continuous alcoholic fermentation under steady-state conditions using a
pH controller (Mettler Toledo Barueri SP Brazil) coupled to a solenoid valve In
experiments with NaNO3 nitrate concentration was maintained above 1 g L-1
(Faintuch
1989) to avoid growth limitation by this nutrient When urea was used as nitrogen source its
amount to be daily added was estimated as suggested by Ferreira et al (2010) Briefly from
the curve of cell concentration versus time of each standard run with nitrate (Fig 2) we
obtained an interpolated curve described by a third order-polynomial equation By derivation
of this equation it was possible to obtain the second order equation of cell productivity and
from that the equation expressing the amount of urea to be daily added to sustain the expected
cell growth taking into account that the dry mass of A platensis contains about 7 of
nitrogen (Bezerra et al 2008) The light intensity expressed as photosynthetic photon flux
density (PPFD) was varied in the range of 60-240 μmol photons mndash2
sndash1
Table 1 show the
219
different conditions adopted in this work for cultivations All experiments were carried out in
duplicate
221 CO2 sources
Pure CO2 of analytical grade (999) was obtained from a cylinder (Oxylumen Satildeo
Paulo SP Brazil)
CO2 from alcoholic fermentation was produced continuously by Saccharomyces
cerevisiae CCT7150 (Fundaccedilatildeo Tropical Andreacute Tosello Culture Collection Campinas SP
Brazil) cultivated in a glass bioreactor (Infors-HT Bottmingen Switzerland) containing 10 L
of diluted sugarcane blackstrap molasses at temperature of 30 plusmn 1 ordmC (Kock et al 2000)
impeller speed of 500 rpm and dilution rate of 0025 h-1
Sugar concentration in the feed
expressed as total reducing sugars (TRS) was 170 g L-1
(Guerreiro et al 1997) Urea (05 g
L-1
) was added to the mash After adjustment of pH at 45-50 by addition of H2SO4 it was
controlled at 45 plusmn 01 (Jones et al 1981) by addition of 15 N NaOH solution Penicillin (500
ui L-1
) was added to prevent contamination (Carvalho et al 2003) Continuous feeding was
started after 12 h of batch fermentation
23 Analytical techniques
231 A platensis cultivation
Cell concentration was determined by optical density (OD) measurements at 560 nm
using a calibration curve (Leduy and Therien 1977) The liquid phase of the medium was
used to determinate the concentrations of total carbonate (Pierce and Haenisch 1948) nitrate
(Vogel 2002) and volatile organic compounds (Joslyn 1970) The concentration of total
ammonia was determined immediately before the daily addition of urea on cell-free medium
samples using a potentiometer and selective ammonia ion electrode model 95-12 (Orion
Cambridge MA USA) (Leduy and Samson 1982) The residual urea level was determined
220
by the same way after previous hydrolysis with H2SO4 at 200 degC (Cezare 1998) Incident
photon flux density of photosynthetically active radiation (400-700 nm) was measured by
means of an integrating quantumradiometerphotometer model LI-190 SB (Li-Cor Lincoln
NE USA) provided with a LI-190 SB quantum sensor cell
232 Alcoholic fermentation
Cell concentration was measured by filtering 50 mL samples through Millipore
membranes with 12 μm pore diameter washing with 50 mL of distilled water and drying at
105-110 degC until constant weigh (Carvalho et al 2003) The total reducing sugars (TRS)
concentration was expressed as glucose and determined according to Somogy (1952) after
acid hydrolysis of samples (Falcone et al 1959)
Ethanol concentration was determined by the micro-dichromate method (Joslyn
1970) The effluent gas was qualitatively analyzed by a gas chromatograph coupled to mass
spectrometer model GCMS-QP5050A (Shimadzu Kyoto Japan) equipped with CP Sil
PONA CB column (100 m x 025 mm x 05 μm) Helium was used as a carrier gas at flow rate
of 1 mL min-1
Samples (1 mL) were injected in the column at a split ratio of 1100 Injector
and detector temperatures were 200 and 250 degC respectively The column temperature was
initially set at 40 degC and then increased at a rate of 2 degC min-1
up to 100 degC and subsequently
at 10 degC min-1
up to 250 degC
24 Calculation of A platensis cultivation parameters
The cell productivity (PX mg L-1
d-1
) was calculated by dividing the difference
between maximum and initial cell concentration (Xm - Xi) by the cultivation time
corresponding to Xm The nitrogen-to-cell conversion factor (YXN mg mg-1
) was calculated as
the mass ratio of dried produced cells and nitrogen added
221
24 Statistical analysis
Maximum cell concentration (Xm mg L-1
) maximum cell productivity (PX mg L-1
d-1
)
and nitrogen-to-cell conversion factor (YXN mg mg-1
) were evaluated by the analysis of
variance (ANOVA General Linear Model) and the Tukey test to compare the mean values at
a significance level of 5 (p lt 005) using the MINITAB 15 statistical software
3 Results and discussion
31 Continuous alcoholic fermentation
The mean results of continuous alcoholic fermentation of blackstrap molasses under
steady state conditions were the following cell concentration of 609 plusmn 054 gDW L-1
(dry
weight) TRS of 532 plusmn 567 g L-1
and ethanol concentration of 553 plusmn 757 g L-1
corresponding to a fermentation yield of 64 Such a process yield was of the same order of
magnitude as those previously obtained with the same carbon source (Carvalho et al 2003)
and ensured the release of a CO2 flux suitable to maintain the pH of A platensis culture at the
desired value (95 plusmn 02)
32 Effects of carbon dioxide and nitrogen sources and light intensity on A platensis
growth
Figs 2 to 4 show that the use of pure CO2 or CO2 from alcoholic fermentation led to
almost coincident cell concentration profiles and Xm values which points out no significant
influence of the CO2 source on A platensis growth These findings which were confirmed by
ANOVA (p 005 Table 2) highlight the feasibility of using such a by-product from
industrial bioethanol production as carbon source for cyanobacteria cultivation
It is well known that when bicarbonate is used for the photosynthetic growth of
microalgae there is a progressive release of OH- in the medium (Goldman et al 1982) thus
222
the pH control is fundamental in processes leading to high cell concentrations As stressed by
Watanabe et al (1995) high alkalinity (pH gt 110) restricts the productivity in the air-lift
photobioreactors using air not supplemented with CO2 In cultivations having high demand of
carbon due to high cell concentrations the addition of CO2 can ensure at the same time
control of pH and suited supply of the carbon source This has been done in the present work
where the culture pH was maintained at 95 plusmn 02 (Saacutenchez-Luna et al 2007) by addition of
CO2 either from a cylinder or from alcoholic fermentation so that the CO2 consumed by the
microorganism was permanently replaced Such a control also allowed maintaining the carbon
source level along the cultivations at a value (around 1208 g L-1
of total carbonate)
practically coincident with that of the medium of Schloumlsser (1982) thus avoiding any carbon
source limitation or accumulation and reducing its cost
In experiments carried out with CO2 from alcoholic fermentation the analysis of
effluent gas by headspace gas chromatography revealed it was mainly made up of CO2 with
only small contents of ethanol and acetaldehyde Despite of this it was not detected any
appreciable concentration of organic volatile compounds in the medium likely because this
microorganism has the enzymes needed to metabolize ethanol or even due to their
condensation in the pipe and consequently no influence of these compounds on A platensis
growth was observed In addition the use of CO2 from alcoholic fermentation did not lead to
any precipitation of salts or flocculation like those observed by Ferraz et al (1985) for A
maxima cultivations in open-ponds using a semi-synthetic medium constituted by malt and
yeast extracts peptone and sucrose
As far as the influence of the nitrogen source on A platensis growth is concerned
urea a classical fertilizer was chosen to substitute the conventional nitrogen sources (KNO3
NaNO3) because of its low cost and because it has been recognized as a promising alternative
nitrogen source in the cultivation of A platensis (Danesi et al 2004 Sassano et al 2007)
223
For a given light intensity and CO2 source no significant difference in growth curves
of cultivations carried out with nitrate (Fig 2) or urea (Figs 3 and 4) as nitrogen source was
observed and the Xm values obtained with both nitrogen sources were statistically coincident
(p 005 Table 2) These results point out the success of the approach of using standard
curves obtained with NaNO3 under non-limited conditions (Fig 2) to foresee the nitrogen
demand of fed-batch A platensis cultivations with urea and confirm the feasibility of using
this cheap nitrogen source
Ammonia and residual urea concentrations during the cultivation (lt 10-4
M) were
always much lower than those considered toxic (10 mM) or even inhibitory for cyanobacteria
growth (17 mM to 2 mM) (Abeliovich and Azov 1976) thereby demonstrating that there
was no accumulation either of ammonia or urea in the medium Since the pH of the culture
(95 plusmn 02) was higher than the pKa of the ammonium (93) this compound was likely
assimilated by simple diffusion and then trapped within the cell cytoplasm by protonation
(Boussiba et al 1984)
Light is the energy source that drives photosynthesis therefore its intensity is an
additional important growth factor which has been often associated with shifts in metabolic
activity (Vonshak et al 2000)
During photoautotrophic growth the amount of light energy received by the
photosynthetic apparatuses determines the amounts of inorganic carbon fixed Xm was
significantly increased (p lt 005 Table 2) by an increase in the light intensity from 60 to 120
micromol photons m-2
s-1
(Figs 2 to 4) whereas it reached a plateau in the range 120-240 micromol
photons m-2
s-1
(Table 3) This result is consistent with the typical behavior of the autotrophic
growth of A platensis (Vonshak et al 2000) which can be depending on I (i) light limited
(ii) light saturated or (iii) light inhibited and whose specific growth rate initially increases
linearly with light intensity then reaches a plateau and finally falls
224
The highest Xm value found in this work was higher than those reported for A
platensis cultivations in minipond (15 g L-1
) (Binaghi et al 2003) and conical tubular
photobioreactor (13 g L-1
) (Watanabe and Hall 1996)
33 Cell productivity
Table 2 shows that cell productivity (PX) was not statistically affected either by the
nitrogen or the CO2 source (p 005) Indeed the almost coincident PX values obtained in
cultures with urea and nitrate were expected by the fact that the amounts employed of the
former nitrogen source under every conditions were always based on the results of the
corresponding runs with nitrate As for Xm also the use of different CO2 sources did not
influence the productivity (p 005 Table 2) as well the cultivation time
On the other hand PX increased by about 45 when increasing the light intensity from
60 to 120 micromol photons m-2
s-1
while Xm increased by only 7 Since the higher the light
intensity the higher the biomass concentration in the middle of runs (Figs 2 to 4) it is likely
that the effect of I is more marked when the overall culture conditions are favorable and there
is some shadowing effect (Vonshak et al 2000) In fact the higher the light intensity the
larger the amount of energy converted into ATP to be utilized for cell growth and
maintenance and then the cells reach more quickly the maximum cell concentration (Vonshak
et al 2000)
This behavior was also observed by Danesi et al (2004) and Rangel-Yagui et al
(2004) in A platensis cultures carried out in miniponds with KNO3 or urea as nitrogen
sources On the other hand the similar PX values obtained at 120 and 240 micromol photons m-2
s-
1 (Table 3) were the likely result of photosaturation or shadowing (Chojnacka and Noworyta
2004 Vonshak et al 2000) as described earlier for Xm
225
Therefore the highest cell productivities were obtained at the highest light intensities
(443 plusmn 20 and 463 plusmn 16 mg L-1
d-1
at I = 120 and 240 micromol photons m-2
s-1
respectively)
irrespective of the nitrogen or CO2 sources used (Table 3) These values are close to that (510
mg L-1
d-1
) obtained by Watanabe et al (1995) who investigated the A platensis growth in
conical helical photobioreactor at 118 μmol photon m-2
s-1
Other studies showed that this parameter reached maximum values of 92 mg L-1
d-1
in
a cylindrical glass tank using urea at 108 μmol photons mndash2
sndash1
(Sassano et al 2007) and 96
mg L-1
d-1
in long minitanks using ammonium chloride at 13 klux (156 μmol photons mndash2
sndash1
)
(Bezerra et al 2008) Since these light intensity thresholds are close to that obtained in this
study the remarkably higher values of PX shown here demonstrate the excellent performance
of the tubular photobioreactor configuration
34 Nitrogen-to-cell conversion factor
The ANOVA statistical analysis indicates a significant effect of the nitrogen source (p
lt 005 Table 2) on the nitrogen-to-cell conversion factor (YXN) whose highest mean values
were achieved in cultures using urea (Table 1) Indeed in these cultures the nitrogen amount
added daily was based on the actual needs for cell growth and maintenance and then its
residual concentration was always lt 10-4
M therefore there was no limitation or excess of
nitrogen during cultivation On the other hand in cultures with nitrate its concentration was
always maintained above 1 g L-1
to avoid any growth limitation (Faintuch 1989) thus
resulting in a YXN decrease
Contrarily no significant effects of CO2 sources and light intensities on YXN (p 005
Table 2) were observed Taking into account that YXN is the ratio between the masses of dry
cell produced and nitrogen added such an observation had to be expected by the fact that the
amount of nitrogen added to the culture is associated to cell growth as stressed above These
results apparently disagree with those obtained by Bezerra et al (2008) and Danesi et al
226
(2004) who observed a YXN increase with light intensity However since those experiments
were carried out using the same amount of nitrogen regardless of the light intensity YXN was
only a function of Xm which was in turn an increasing function of I
The highest YXN value found in this study (138 plusmn 090 mg mg-1
) was remarkably
higher than those reported for urea (74-85 mg mg-1
) (Rangel-Yagui et al 2004) and
ammonium chloride (57 plusmn 017 mg mg-1
) (Bezerra et al 2008) as nitrogen sources in
miniponds because the use in this study of a closed tubular photobioreactor certainly reduced
the nitrogen loss as ammonia by off gassing (Ferreira et al 2010)
4 Conclusions
The results of this work showed that the simultaneous use of two low cost or even no-
cost nutrients (CO2 from alcoholic fermentation and urea) could be an interesting alternative
for A platensis cultivation in tubular photobioreactor The fed-batch cultivation of this
cyanobacterium at 120 μmol photons m-2
s-1
using these nutrients as carbon and nitrogen
sources respectively did in fact provide a maximum cell concentration of 2960 plusmn 35 mg L-1
and a cell productivity of 425 plusmn 59 mg L-1
d-1
The production of A platensis biomass which
is a source of valuable compounds using as carbon source the CO2-rich gaseous emissions
from the alcohol industry may contribute to reduce the release of such a greenhouse gas into
the atmosphere
Acknowledgements
The authors grateful acknowledge the financial support of the Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
Pesquisa do Estado de Satildeo Paulo (FAPESP) Satildeo Paulo Brazil (process no 0654959-3 and
065679-2) and of the Coordenaccedilatildeo de Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior
(CAPES) Brazil (processes n 397808-7 and 0350-112010)
227
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Caption of Figures
Figure 1 Scheme of the photobioreactor employed for fed-batch cultivations of A platensis
(1) Degasser (2) Condenser tube (3) Air pump (4) Rotameter (5) Magnetic stirrer (6)
20W Fluorescent lamps (7) Airlift system
Figure 2 Cell concentration (X mg L-1
) versus time during fed-batch A platensis cultivations
carried out using nitrate and A) CO2 from cylinder or B) gaseous emissions from alcoholic
fermentation at different light intensities (μmol photons m-2
s-1
) 60 (diams) 120 (times) and 240 (+)
The estimated curves are drawn as continuous lines
Figure 3 A) Cell concentration (X mg L-1
) (open symbols) and B) daily urea addition (mM
d-1
) (full symbols) versus time during fed-batch A platensis cultivations carried out using CO2
from cylinder at different light intensities (μmol photons m-2
s-1
) Triangle 60 Square 120
Circle 240
Figure 4 A) Cell concentration (X mg L-1
) (open symbols) and B) daily urea addition
(mM d-1
) (full symbols) versus time during fed-batch A platensis cultivations carried out
using CO2 from alcoholic fermentation at different light intensities (μmol photons m-2
s-1
)
Triangle 60 Square 120 Circle 240
233
Figure 1
234
Figure 2
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg L
-1)
Time (days)
A)
B)
235
Figure 3
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg L
-1)
Time (days)
000
020
040
060
080
100
120
140
160
0 2 4 6 8 10
Time (days)
ure
a ad
dit
ion (
mM
d-1
)
236
Table 1 Maximum cell concentration (Xm) cell productivity (PX) and nitrogen-to-cell
conversion factor (YXN) obtained in fed-batch A platensis cultures carried out at different
light intensities and using different CO2 and nitrogen sources
run
I
(mol m-2
s-1
)a
CO2
source
Nitrogen
source
Xm
(mg L-1
) b
PX
(mg L-1
d-1
) b
YXN
(mg mg-1
) b
1 60 C c NaNO3 2899plusmn17 250plusmn17 42plusmn003
2 60 C Urea 2847plusmn10 245plusmn00 14plusmn000
3 60 A d NaNO3 2789plusmn82 299plusmn10 40plusmn014
4 60 A Urea 2867plusmn28 308plusmn35 14plusmn017
5 120 C NaNO3 3209plusmn109 454plusmn18 45plusmn018
6 120 C Urea 2980plusmn103 408plusmn17 11plusmn050
7 120 A NaNO3 2968plusmn24 428plusmn40 43plusmn004
8 120 A Urea 2952plusmn35 425plusmn59 15plusmn020
9 240 C NaNO3 3291plusmn206 482plusmn34 54plusmn038
10 240 C Urea 3236plusmn72 473plusmn12 13plusmn034
11 240 A NaNO3 3102plusmn130 450plusmn22 50plusmn024
12 240 A Urea 3070plusmn112 445plusmn19 14plusmn056
a I = light intensity
b Values represent means of two experiments and its standard error
c C = cylinder
d A = alcoholic fermentation
237
Table 2 Values of the descriptive level (p) for the maximum cell concentration (Xm) cell
productivity (PX) and nitrogen-to-cell conversion factor (YXN) at different light intensities (60
120 or 240 mol photons m-2
s-1
) and using different sources of CO2 (cylinder or alcoholic
fermentation) and nitrogen (nitrate or urea)
Factors Xm PX YXN
CO2 0225 0256 0351
Light intensity 0000 0000 0700
Nitrogen 0922 0947 0000
238
Table 3 Means values of maximum cell concentration (Xm) and cell productivity (PX)
obtained in fed-batch A platensis cultivations carried out at variable light intensity
Light intensity
(mol photons m-2
s-1
)
Xm
(mg L-1
)
PX
(mg L-1
d-1
)
60 2851plusmn54ordf 306plusmn7a
120 3056plusmn115b 443plusmn20
b
240 3180plusmn96b 463plusmn16
b
Values with the same superscript are not significantly different according to the Tukey test
(p gt 005)
5
AGRADECIMENTOS
Ao Prof Dr Joatildeo Carlos Monteiro de Carvalho pela orientaccedilatildeo dedicaccedilatildeo
confianccedila amizade incentivo e paciecircncia que recebi durante os 6 anos de
convivecircncia no laboratoacuterio
Ao Prof Dr Attilio Converti pela orientaccedilatildeo apoio e confianccedila principalmente
durante minha estadia na Itaacutelia
Ao Prof Dr Sunao Sato chefe do setor de Tecnologia de Fermentaccedilotildees do
Departamento Bioquiacutemico-Farmacecircutica da Universidade de Satildeo Paulo-Brasil
Ao Prof Dr Adalberto Pessoa Juacutenior Profa Dr Ana Luacutecia Figueiredo Porto e
Prof Dr Adilson de Castro Chaves pela indicaccedilatildeo do laboratoacuterio e confianccedila
depositada em meu trabalho
Agrave FAPESP pelo auxiacutelio financeiro que permitiu a execuccedilatildeo desse trabalho
Agrave CAPES pela oportunidade de realizar o doutorado sanduiche na Itaacutelia
contribuindo para meu desenvolvimento pessoal e cientiacutefico
Aos meus pais Irene V P Bezerra e Adesson P Bezerra a minha irmatilde ao
meu cunhado e ao meu namorado Paulo Claudino Veacuteras pelo incentivo apoio
confianccedila e felicidade durante todo esse tempo
Aos meus amigos pernambucanos Fernanda Borba Eduardo Correia Anne
Priscila Croacutecia e Anabel Helena que mesmo distante sempre me incentivaram e a
minha amiga Ceacutelia Bolognesi pelos conselhos e palavras de conforto nos momentos
difiacuteceis
A todos os amigos Liacutevia Seno Ciacutenthia Hoch Ana Morocho Mayla Rodrigues
pelo apoio e carinho que me proporcionou durante a poacutes-graduaccedilatildeo e em especial a
Marcelo Chuei Matsudo
As secretaacuterias da poacutes-graduaccedilatildeo do Deptordm de Tecnologia Bioquiacutemico-
Farmacecircutico (FCF-USP) pela dedicaccedilatildeo apoio e por estarem sempre disponiacutevel
para ajudar e aos secretaacuterios da poacutes-graduaccedilatildeo Elaine Midori Ychico e Jorge Alves
de Lima
Aos funcionaacuterios da Biblioteca do Conjunto das Quiacutemicas pela atenccedilatildeo e
disponibilidade de ajuda sempre que precisei
6
RESUMO
A cianobacteacuteria fotossintetizante Arthrospira platensis eacute conhecida por apresentar
em sua biomassa altos teores proteacuteicos (50-70) presenccedila do aacutecido graxo essencial -
linolecircnico e diversas outras substacircncias importantes para a alimentaccedilatildeo humana e
animal Esses micro-organismos satildeo capazes de converter o CO2 em biomassa de
grande potencial na aacuterea de alimentos Durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica a produccedilatildeo de
CO2 eacute da mesma ordem de grandeza da produccedilatildeo de etanol e considerando a crescente
demanda interna e externa por esse combustiacutevel seria importante que houvesse um
processo que fixasse esse CO2 transformando-o em um produto que poderia ser uacutetil para
a nossa populaccedilatildeo Adicionalmente o uso de uma fonte de nitrogecircnio de baixo custo
(ureacuteia) em reatores tubulares contribuiria para a reduccedilatildeo do custo de produccedilatildeo da A
platensis O objetivo desse trabalho foi avaliar os paracircmetros cineacuteticos e bioenergeacuteticos
bem como a composiccedilatildeo centesimal da A platensis cultivadas em biorreator tubular
alimentados com CO2 proveniente de fermentaccedilatildeo alcooacutelica ou com utilizaccedilatildeo de CO2 puro
para o controle do pH sob diferentes intensidades luminosas (I) e fontes de nitrogecircnio (N)
adicionadas por meio de processo descontiacutenuo alimentado Os resultados mostraram que
maiores valores de I proporcionaram maiores valores de concentraccedilatildeo celular maacutexima
(Xm) e produtividade em ceacutelulas (Px) mas natildeo influenciaram nos valores do fator de
conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) As diferentes fontes de CO2 natildeo influenciaram
nos valores de Xm Px YXN O uso da ureacuteia aumentou os valores de YXN em relaccedilatildeo aos
cultivos com NO3- Na composiccedilatildeo centesimal pode-se observar que I influenciou nos
teores de clorofila proteiacutenas e lipiacutedios mas natildeo influenciou nos teores de cinzas e
carboidratos na biomassa final Em relaccedilatildeo aos paracircmetros bioenergeacuteticos dos cultivos
com CO2 puro observou-se que os maiores valores de dissipaccedilatildeo de energia de Gibbs
foram obtidos em tempos mais curtos a 120-240 μmol de foacutetons m-2 s-1
independentemente do N selecionado enquanto que o nuacutemero de moles de foacutetons
absorvidos pelas ceacutelulas para produzir um C-mol de biomassa foi maior nas culturas com
NO3- independentemente do I As fraccedilotildees da energia direcionada para a siacutentese de ATP e
fixada pela ceacutelula foram superiores em culturas com ureacuteia quando comparadas com as
culturas com NO3- que se revelou uma fonte de nitrogecircnio capaz de sustentar o
crescimento energicamente da A platensis
Palavras chaves Arthrospira platensis processo descontiacutenuo alimentado ureacuteia
intensidade luminosa dioacutexido de carbono fermentaccedilatildeo alcooacutelica bioenergeacutetica
7
ABSTRACT
Photosynthetic cyanobacterium A platensis contains in its biomass high protein
content (50-70) -linolenic acid and many other substances important for health
human These microorganisms are capable of converting CO2 into biomass of great
potential in the food industry During the alcoholic fermentation the production of
CO2 has the same magnitude of the production of ethanol Considering the
increasingly global demand for this fuel a process to fix this CO2 is of utmost
importance Furthermore the use of low cost nitrogen source (urea) in tubular
reactors would contribute to reducing the production cost of A platensis Therefore
the purpose of this work was to evaluate the kinetic and bioenergetics parameters as
well as the chemical composition of biomass obtained in A platensis cultures in
tubular bioreactor using CO2 from alcoholic fermentation or pure CO2 to control the
pH under different light intensity (I) and nitrogen sources (N) The results showed that
higher I induced higher maximum cell concentration (Xm) and cell productivity (Px)
values but it did not exert any influence on the nitrogen-cell conversion factor (YXN)
Urea increased the YXN values compared to use of NO3- In the centesimal
composition of biomass it can be observed that I influenced the chlorophyll protein
and lipid contents but not influenced the carbohydrate and ash contents For
bioenergetics parameters it was observed that the highest Gibbs energy dissipation
values for cell growth and maintenance were obtained in shorter time at 120-240
micromol photons m-2 s-1 in both nitrogen sources while the moles of photons absorbed
by the system to produce one C-mol biomass was higher in cultures with NO3- The
highest values of the molar production of O2 and consumption of H+ were obtained at
the highest I values using NO3- The estimated percentages of the energy absorbed
by the cell showed that compared with nitrate the use of urea as nitrogen source
allowed the system to address higher fractions to ATP production and light fixation by
the photosynthetic apparatus as well as a lower fraction released as heat Thanks to
this better bioenergetic situation urea appears to be a quite promising low-cost
alternative nitrogen source for A platensis cultures in photobioreactors
Key words Arthrospira platensis fed batch urea light intensity carbon dioxide
alcoholic fermentation bioenergetic
8
RIASSUNTO
Il cianobatterio fotosintetici Arthrospira platensis ha un alto contenuto di proteine (50-
70) presenza di acidi grassi essenziali come l‟acido -linolenico e altre sostanze
importanti per l‟alimentazione umana ed animale Questi microrganismi convertono CO2 in
biomassa di grande potenzialitagrave nellindustria alimentare Durante la fermentazione
alcolica la produzione di CO2 egrave dello stesso ordine di grandezza della produzione di
etanolo e in considerazione alla crescente necessitagrave interna ed europeo per questo
combustibile sarebbe importante lo svilupo di un processo che fissasse questo CO2
transformandolo in un prodotto che potrebbe essere utile per la nostra popolazione
Inoltre luso di una fonte di azoto a basso costo (urea) in reattori tubolari contribuirebbe a
ridurre il costo di produzione di A platensis Lobiettivo di questo studio egrave di valutare i
parametri cinetici bioenergetiche e la composizione della biomassa ottenuta in colture di
A platensis in bioreattori tubolare alimentato con CO2 puro di cilindro o con CO2 della
fermentazione alcolica per il controllo del pH in diverse intensitagrave di luce (I) e fonti di azoto
(N) usando il processo discontinuo alimentato I risultati hanno dimostrato che valori piugrave
alti di I fornire i piugrave alti valori di concentrazione massima delle cellule (Xm) e la produttivitagrave
delle cellule (Px) ma non influenza i valori del fattore di conversione di azoto nelle cellule
(YXN) Luso di urea come fonte di azoto aumentato i valori di YXN rispetto alle culture con
NO3- La composizione chimica di biomassa puograve osservare che I ha influenzato la
percentuale di clorofilla proteine e lipidi ma non ha influenzato la percentuale di
carboidrati e cenere nella biomassa finale In relazioni ai parametri bioenergetici dei cultivi
usando CO2 di cilindri abbiamo osservato che i piugrave alti valori di dissipazione di energia di
Gibbs per la crescita cellulare e la manutenzione sono stati ottenuti in tempo piugrave brevi nel
120-240 μmol di fotoni m-2 s-1 per entrambe le fonti di N mentre il numero di moli di fotoni
assorbiti dalle cellule por produrre una biomassa C-mol era maggiore nelle culture con
NO3- a prescindere dalla I I valori piugrave alti della produzione molare di O2 e il consumo di H+
sono stati ottenuti con valori piugrave alti di I coltivati con NO3- Le frazioni di energia per la
sintese di ATP e fissato per la cellula erano piugrave alti nelle culture con urea che nelle culture
con NO3- che si egrave rivelata una fonte di azoto in grado di sostenere la crescita di A
platensis
Parole chiave Arthrospira platensis processo discontinuo alimentato urea intensitagrave
luminosa anidride carbonica fermentazione alcolica bioenergetica
9
Lista de graacuteficos
Graacutefico 1 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular de A
platensis 73
Graacutefico 2 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia
Graacutefico 3 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo de clorofila a 77
Graacutefico 4 Logariacutetmico da concentraccedilatildeo celular em funccedilatildeo do tempo 88
Graacutefico 5 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 01 h-1 88
Graacutefico 6 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) Etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 005 h-1 89
Graacutefico 7 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) Etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 0025 h-1 89
Graacutefico 8 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 1 93
Graacutefico 9 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 2 (60 mol de foacutetons m-2 s-1) 94
Graacutefico 10 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 2 95
Graacutefico 11 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 3 96
Graacutefico 12 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 4 (120 mol de foacutetons m-2 s-1) 97
Graacutefico 13 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 4 98
Graacutefico 14 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 5 99
Graacutefico 15 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 6 (120 mol de foacutetons m-2 s-1) 100
Graacutefico 16 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 6 101
Graacutefico 17 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 7 102
Graacutefico 18 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 8 (120 mol de foacutetons m-2 s-1) 103
Graacutefico 19 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 8 104
Graacutefico 20 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 9 105
Graacutefico 21 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 10 (240mol de foacutetons m-2 s-1) 106
Graacutefico 22 concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 10 107
10
Graacutefico 23 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 11 108
Graacutefico 24 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 12 (240 mol de foacutetons m-2 s-1) 109
Graacutefico 25 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 12 110
Graacutefico 26 Energia de Gibbs de dissipaccedilatildeo durante o cultivo de A platensis
intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 ( ) 120 () 240
Fonte de nitrogecircnio nitrato (siacutembolo aberto) ureacuteia (siacutembolo fechado) 144
Graacutefico 27 Influecircncia da velocidade especiacutefica de crescimento da A platensis sobre
o nuacutemero de moles de foacutetons absorvido para produzir 1 C-mol de biomassa em
diferentes condiccedilotildees de cultivo () Composiccedilatildeo elementar da biomass descrita por
Cornet et al (1992) PPFD = 60 μmol de foacutetons m-2 s-1 Composiccedilatildeo elementar da
biomass determinada experimentalmente PPFD (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60
() 120 () 240 Fonte de nitrogecircnio nitrato (siacutembolos abertos) ureacuteia
(siacutembolos fechados) 147
Graacutefico 28 Produccedilatildeo molar de O2 (siacutembolo fechado) e consumo de H+ (siacutembolo
aberto) em funccedilatildeo do tempo em diferentes condiccedilotildees de cultivo Intensidades
luminosas (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 () 120 () 240 Fonte de
nitrogecircnio nitrato (linha rachurada) ureacuteia (linha contiacutenua) 149
Graacutefico 29 Energia total de Gibbs absorvida pelo aparato fotossinteacutetico (siacutembolo
fechado) (ΔGa) e energia transformada em ATP (siacutembolo aberto) (ΔGATP) durante o
cultivo da A platensis intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 (
) 120 () 240 Fonte de nitrogecircnio nitrato (linha tracejada) ureacuteia (linha
continua) 150
Graacutefico 30 Energia fixada pelo aparato fotossinteacutetico (siacutembolo fechado) (ΔH) e
energia liberada como calor (siacutembolo aberto) (Q) durante o cultivo de A platensis
intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 ( ) 120 () 240
Fonte de nitrogecircnio nitrato (linha rachurada) ureacuteia (linha contiacutenua) 151
Graacutefico 31 Porcentagem na distribuiccedilatildeo da energia luminosa absorvida durante o
cultivo de A platensis usando nitrato (siacutembolo fechado) e ureacuteia (siacutembolo aberto)
como fonte de nitrogecircnio Energia fixada pelos fotossistemas () energia
transformada em ATP () energia liberada como calor ( ) 152
Graacutefico 32 Concentraccedilatildeo celular nas duas diferentes configuraccedilotildees dos
fotobiorreatores tubulares ( ) horizontal e ( loz ) espiralado 153
11
Lista de Figuras
Figura 1 Spirulina platensis (UTEX 1926) 22
Figura 2 Principais rotas de assimilaccedilatildeo de nitrogecircnio em cianobacteacuterias cultivas em
pH acima de 92 35
Figura 3 Complexos fotossinteacuteticos em membranas tilacoacuteides 42
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do fotossistema 43
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da fase fotoquiacutemica 44
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da moleacutecula da clorofila a 48
Figura 7 Fotobiorreator tubular horizontal utilizado no cultivo de A platensis 67
Figura 8 Fotobiorreator tubular espiralado utilizado no cultivo de A platensis 68
12
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Produtores representativos de Spirulina 23
Tabela 2 - Planejamento experimental 84
Tabela 3 - Valores da concentraccedilatildeo celular meacutedias e desvio padratildeo em massa
seca obtidas a partir do melaccedilo natildeo clarificado e do melaccedilo clarificado 86
Tabela 4 - Variaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de leveduras em funccedilatildeo do tempo 87
Tabela 5 - Valores de XP ART Etanol e Rendimento do processo no regime
permanente para os diferentes valores de D com ART inicial de 170 gL-1 91
Tabela 6 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de carbonato
total referentes ao experimento 1 93
Tabela 7 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 2 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -44554x3 + 54865x2 + 14317x + 400 (60 mol de foacutetons
m-2 s-1) 94
Tabela 8 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 2 95
Tabela 9 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de carbonato
total referentes ao experimento 3 96
Tabela 10 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 4 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -20689x3 + 11591x2 + 33292x + 400 (60 mol de foacutetons
m-2 s-1) 97
Tabela 11 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 4 98
Tabela 12 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 5 99
Tabela 13 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 6 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -13286x3 + 14486x2 + 62226x + 400 (120 mol de
foacutetons m-2 s-1) 100
Tabela 14 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 6 101
Tabela 15 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 7 102
13
Tabela 16 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 8 de
acordo com a y = - 58128x3 + 38625x2 + 38606x + 400 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
103
Tabela 17 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 8 104
Tabela 18 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 9 105
Tabela 19 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 10
de acordo com a equaccedilatildeo y = -12057x3 + 10082x2 + 31899x + 400 (240 mol de
foacutetons m-2 s-1) 106
Tabela 20 - Valores meacutedios de concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 10 107
Tabela 21 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 11 108
Tabela 22 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 12
de acordo com a equaccedilatildeo y = -82763x3 + 62437x2 + 37265x + 400 (240 mol de
foacutetons m-2 s-1) 109
Tabela 23 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amonia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 12 110
Tabela 24 - Valores da concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) produtividade em ceacutelulas
(Px) e fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) com diferentes fontes de
CO2 fontes de nitrogecircnio e intensidades luminosas 119
Tabela 25 - Anaacutelise de variacircncia para a concentraccedilatildeo celular maacutexima 120
Tabela 26 - Meacutedias da concentraccedilatildeo celular maacutexima para a variaacutevel independente
fonte de nitrogecircnio 120
Tabela 27 - Meacutedias da concentraccedilatildeo celular maacutexima para a variaacutevel independente
intensidade luminosa 121
Tabela 28 - Anaacutelise de variacircncia para a produtividade em ceacutelulas 122
Tabela 29 - Meacutedias da produtividade em ceacutelulas para a variaacutevel independente fonte
de nitrogecircnio 123
Tabela 30 - Meacutedias da produtividade em ceacutelulas para a variaacutevel independente
intensidade luminosa 123
Tabela 31 - Anaacutelise de variacircncia para fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas
126
14
Tabela 32 - Meacutedias do fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas para a variaacutevel
independente fonte de nitrogecircnio 127
Tabela 33 - Meacutedias do fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas para a variaacutevel
independente intensidade luminosa 128
Tabela 34 - Concentraccedilatildeo de clorofila na biomassa final obtida nos experimentos
com o pH controlado com CO2 de cilindro 129
Tabela 35 - Anaacutelise de variacircncia para a concentraccedilatildeo de clorofila na biomassa final
130
Tabela 36 - Porcentagem de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos e cinzas na biomassa
seca final 134
Tabela 37 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de proteiacutena na biomassa final 136
Tabela 38 - Meacutedias do teor de proteiacutena na biomassa final para a variaacutevel
independente intensidade luminosa 136
Tabela 39 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de lipiacutedio na biomassa seca final 138
Tabela 40 - Meacutedias do teor de lipiacutedio na biomassa final para a variaacutevel independente
fonte de nitrogecircnio 138
Tabela 41 - Meacutedias do teor de lipiacutedio na biomassa final para a variaacutevel independente
intensidade luminosa 138
Tabela 42 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de carboidratos na biomassa seca final
141
Tabela 43 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de cinzas na biomassa seca final 142
Tabela 44 - Coeficientes estequiomeacutetricos estimados atraveacutes dos balanccedilos de
materiais de carbono nitrogecircnio oxigecircnio enxofre carga e grau de reduccedilatildeo da
biomassa cultivada em fotobiorreator tubular horizontal utilizando nitrato ou ureacuteia
como fontes de nitrogecircnio 145
15
Lista de abreviaturas e siglas
ART Accediluacutecares redutores totais
VOCs Compostos volaacuteteis orgacircnicos
C Carbono
N Nitrogecircnio
S Enxofre
O Oxigecircnio
H Hidrogecircnio
I Intensidade Luminosa
Ef Concentraccedilatildeo de etanol (g L-1)
fc Fraccedilatildeo em massa do carbono na biomassa seca (g g-1)
fi Fraccedilatildeo em massa do aacutetomo i na biomassa seca (g g-1)
Nt quantidade total de nitrogecircnio adicionado (mg)
Petanol Produtividade em etanol (g L h-1)
PX Produtividade em ceacutelulas (mg L-1 d -1)
Tc Tempo de cultivo (dias)
V Volume do meio (L)
Xi Concentraccedilatildeo celular inicial (mg L-1)
Xm Concentraccedilatildeo celular maacutexima obtida (mg L-1)
XP Meacutedias dos valores de concentraccedilotildees celulares ao longo do regime
permanente
YXN Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (mg mg-1)
Cl Clorofila a
GS glutamina sintetase
GOGAT glutamate sintase
FSII Fotossistema II
FSI Fotossistema I
16
Lista de siacutembolos
max
GXY Rendimento maacuteximo teoacuterico de biomassa sobre a energia de Gibbs
Velocidade especiacutefica de crescimento
1YGX Energia de Gibbs para o crescimento e manutenccedilatildeo celular
c Velocidade da luz (299108 m s-1)
D Vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo (h-1)
h Constante de Planck (662610-34 J)
mG Energia de Gibbs dissipada para a manutenccedilatildeo celular
MMc Massa molar do aacutetomo do carbono (g C-mol-1)
MMi Massa molar do aacutetomo i (g C-mol-1)
NA nuacutemero de Avogadro (6022 x 1023 foacutetons de Einstein -1)
nPh nuacutemero de foacutetons
Q Energia de Gibbs liberada como calor
qH+ Consumo molar de H+
qO2 Produccedilatildeo molar de O2
ΔGa Energia total de Gibbs absorvida pela fotossiacutentese
ΔGATP Energia de Gibbs transformada em ATP
ΔgPh Energia de Gibbs contida em 1 Einsten de foacuteton
ΔH Energia fixada pelos fotosistemas
η Rendimento do processo em etanol ()
λ Comprimento de onda
17
Sumaacuterio
1 Introduccedilatildeo 20
2 Revisatildeo bibliograacutefica 22
21 Caracteriacutesticas da A platensis22
22 Fotobiorreatores26
23 Processos de cultivo em fotobiorreatores31
24 Nutrientes para o crescimento da A platensis 33
241 Fontes de Nitrogecircnio33
242 Intensidade luminosa41
2421 Pigmentos 46
243 Fontes de carbono 50
2431 Fonte de carbono orgacircnico (Crescimento hetorotroacutefico) 50
2432 Fonte de carbono inorgacircnico (Crescimento autotroacutefico) 51
2433 Fonte de carbono inorgacircnico e orgacircnico simultaneamente (Crescimento
mixotroacuteficos) 54
3 Objetivos61
4 Materiais e meacutetodos 62
41 Fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua62
411 Testes preliminares para emprego da fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
62
4111 Teste para avaliar a influecircncia do tratamento do melaccedilo na determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo celular62
41111 Melaccedilo natildeo tratado62
41112 Melaccedilo tratado 62
41113 Preparaccedilatildeo do melaccedilo63
4112 Teste para avaliar a homogeneidade do reator 63
4113 Teste para determinar a vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo 63
412 Micro-organismo e condiccedilotildees de manutenccedilatildeo63
413 Preparo do inoacuteculo64
414 Dispositivo para a cultura 64
415 Descriccedilatildeo das condiccedilotildees de fermentaccedilatildeo contiacutenua64
42 Cultivo de A platensis65
421 Micro-organismo e manutenccedilatildeo 65
18
422 Meio de cultivo65
4221 Meio padratildeo para cultivo de A platensis 65
4222 Meio modificado66
423 Preparo do inoacuteculo66
424 Dispositivo da cultura67
4241 Fotobiorreator tubular horizontal67
4242 Fotobiorreator tubular espiralado68
425 Descriccedilatildeo de um experimento tiacutepico de cultivo da A platensis68
43 Teacutecnicas Analiacuteticas69
431 Acompanhamento da fermentaccedilatildeo alcooacutelica70
4311 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular70
4312 Determinaccedilatildeo do pH70
4313 Determinaccedilatildeo de ART70
4314 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol71
4315 Determinaccedilatildeo dos componentes volaacuteteis presentes no gaacutes efluente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua72
432 Acompanhamento do cultivo de A platensis72
4321 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular 72
43211 Densidade oacutetica 72
43212 Construccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo 73
4322 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de carbonato total 73
4323 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia total74
4324 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia75
4325 Determinaccedilatildeo do pH76
4326 Determinaccedilatildeo de nitrato76
4327 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol76
433 Avaliaccedilatildeo da biomassa de A platensis obtida no final do cultivo76
4331 Determinaccedilatildeo de Clorofila a 76
43311 Curva de calibraccedilatildeo para a determinaccedilatildeo de Clorofila a 77
4332 Determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal 77
43321 Proteiacutenas totais78
43322 Lipiacutedios totais78
43323 Cinzas78
43324 Carboidratos totais 79
19
434 Avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo elementar 79
4341 Determinaccedilatildeo de CNHS 79
4342 Determinaccedilatildeo de oxigecircnio 79
44 Caacutelculos 79
441 Produtividade em etanol no regime permanente 79
442 Rendimento do etanol no regime permanente 80
443 Produtividade em ceacutelulas nos cultivos de A platensis 80
444 Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas nos cultivos de A
platensis 80
445 Coeficientes atocircmicos para 1 C-mol de biomassa 81
446 Grau de reduccedilatildeo da biomassa82
45 Teoria dos paracircmetros bioenergeacuteticos 82
5 Planejamento experimental84
6 Resultados e discussotildees85
61 Testes preliminares para a realizaccedilatildeo da fermentaccedilatildeo alcooacutelica 85
611 Avaliaccedilatildeo da influecircncia da clarificaccedilatildeo do melaccedilo na determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo celular 86
612 Teste de homogeneidade do reator87
613 Avaliaccedilatildeo de diferentes vazotildees especiacuteficas de alimentaccedilatildeo (D) 88
614 Avaliaccedilatildeo dos volaacuteteis orgacircnicos no gaacutes de arraste92
62 Avaliaccedilatildeo do crescimento da A platensis 93
63 Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) Produtividade em
ceacutelulas (Px) e Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas
(YXN) 119
631 Concentraccedilatildeo celular maacutexima 119
632 Produtividade volumeacutetrica de ceacutelulas 122
633 Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas 125
64 Avaliaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de clorofila a 129
65 Avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal 134
66 Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros bioenergeacuteticos 143
67 Comparaccedilatildeo entre os fotobiorreatores 153
7 Conclusotildees 154
20
1 Introduccedilatildeo
O interesse na produccedilatildeo comercial da Spirulina sp eacute devido a algumas
propriedades particulares como alta digestibilidade menor concentraccedilatildeo de aacutecidos
nucleacuteicos teores de proteiacutenas elevados (50-70 da massa seca) e importacircncia
quantitativa de aminoaacutecidos essenciais Na sua biomassa encontram-se tambeacutem
pigmentos como a clorofila ficocianina e -caroteno aacutecidos graxos essenciais como
γ-linolecircnico o qual possui efeito terapecircutico em humanos (BELAY OTA 1994)
vitaminas e antioxidantes (PULZ SCHEIBENBOGEN 1998)
Tradicionalmente a Spirulina (Arthrospira) eacute cultivada autotroficamente na
presenccedila de altos niacuteveis de carbonatos e bicarbonatos como fontes de carbono por
serem de baixo custo e proporcionarem pH elevado no meio No entanto Spirulina
ssp tambeacutem podem crescer em condiccedilotildees mixotroacuteficas podendo apresentar uma
produtividade maior quando comparadas a cultivos fotoautotroacuteficos ou heterotroacuteficos
(OGBONNA et al 2000)
Em condiccedilotildees mixotroacuteficas eou fotoautotroacuteficas a intensidade luminosa eacute um
fator importante no crescimento celular da A platensis Baixas intensidades
luminosas podem limitar o crescimento celular Por outro lado altas intensidades
luminosas podem inibir o crescimento celular devido ao fenocircmeno de fotoinibiccedilatildeo
Por isso esse eacute um fator que deve ser controlado em cultivos de micro-organismos
fotossintetizantes
O pH do meio de cultivo eacute um outro fator no cultivo de micro-organismos O pH
determina a solubilidade do dioacutexido de carbono e minerais no meio de cultura e
influencia diretamente ou indiretamente no metabolismo dos micro-organismos
fotossintetizantes Durante o cultivo autotroacutefico da Spirulina sp ocorre um raacutepido
aumento do pH no meio de cultura o que pode atuar como um autoinibidor do
crescimento celular (RICHMOND 2000) e portanto o CO2 pode ser utilizado para a
manutenccedilatildeo do pH oacutetimo
A biofixaccedilatildeo do CO2 pelas microalgas estatildeo entre os meacutetodos bioloacutegicos mais
produtivos no tratamento de emissotildees de resiacuteduos industriais e o rendimento da
biomassa por hectare eacute maior quando comparadas a plantaccedilotildees na agricultura
(LAW BERNING 1991 AKIMOTO et al 1994) O uso direto dos resiacuteduos volaacuteteis
reduz os custos de preacute-tratamento mas a alta concentraccedilatildeo de CO2 pode inibir o
crescimento de cianobacteacuterias e microalgas No entanto alguns autores tecircm
21
recentemente relatado o isolamento de cianobacteacuterias e microalgas tolerantes a
altas concentraccedilotildees de CO2 e capazes de fixar esse gaacutes tais como Chlorella
Spirulina e Scenedesmus (CHANG et al 2003 WATANABE HALL 1995a
HANAGATA et al 1992) Cyanidium cladarium (AKIMOTO et al 1994)
Aleacutem do CO2 a fonte de nitrogecircnio tambeacutem eacute um fator determinante no cultivo
uma vez que este nutriente eacute utilizado principalmente para constituir proteiacutenas e
aacutecidos nucleacuteicos fundamentais para a manutenccedilatildeo e crescimento celular
(WATANABE HALL 1996) O meio de cultura convencional para a obtenccedilatildeo da S
platensis utiliza sais de nitrato como fonte de nitrogecircnio como por exemplo nitrato
de potaacutessio e nitrato de soacutedio Ureacuteia (DANESI et al 2002 SOLETTO et al 2005) e
sais de amocircnio (CARVALHO et al 2004 SOLETTO et al 2005) tecircm sido
pesquisadas como fontes alternativas de nitrogecircnio para o cultivo de S platensis
No caso de fontes de nitrogecircnio amoniacais o emprego dos reatores tubulares
pode ser considerado como uma vantagem por favorecer baixa perda de amocircnia
por volatilizaccedilatildeo reduzindo a necessidade de adiccedilatildeo de fonte de nitrogecircnio como
consequumlente reduccedilatildeo do custo de produccedilatildeo Assim pode-se concluir que os
esforccedilos em melhoria de condiccedilotildees de cultivo de A platensis natildeo sejam apenas
utilizando reatores abertos mas tambeacutem reatores fechados dentre os quais os
tubulares
O dioacutexido de carbono e os compostos volaacuteteis orgacircnicos (CVOs) de
fermentaccedilatildeo alcooacutelica podem ser utilizados como fontes de carbono no cultivo de A
platensis Durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica industrial toneladas de CO2 etanol e em
menor quantidade alguns CVOs satildeo liberados para a atmosfera como resiacuteduos No
entanto esses compostos podem ser reaproveitados como uma fonte de nutriente
juntamente como uma fonte de nitrogecircnio de baixo custo (ureacuteia) para o
desenvolvimento da A platensis que por sua vez permite a produccedilatildeo de
componentes com alto valor agregado e com menor custo de produccedilatildeo industrial
22
2 Revisatildeo bibliograacutefica
21 Caracteriacutesticas da A platensis
Arthrospira platensis eacute uma cianobacteacuteria filamentosa fotossintetizante
pertencente da ordem Oscillatoriales famiacutelia Cyanophyceae gecircnero Arthrospira
espeacutecie platensis Satildeo caracterizadas por tricomas ciliacutendricos multicelulares com
formas espiraladas (Figura 1) Estes possuem comprimentos de aproximadamente
500 μm e diacircmetro variando de 6-12 μm mas dependendo das condiccedilotildees de cultivo
podem adquirir morfologias diferentes Os filamentos natildeo possuem ramificaccedilotildees
nem heterocistos (TOMASELLI 1997)
Figura 1 Spirulina platensis (UTEX 1926) Fonte Universidade do Texas 2006
Arthrospira pode controlar sua flutuabilidade com vesiacuteculas gasosas para
receber a incidecircncia luminosa oacutetima para a fotossiacutentese Essas ceacutelulas podem
tambeacutem excretrar polissacariacutedeos extracelulares para formar agregados flutuantes
um fato que facilita sua recuperaccedilatildeo em lagos naturais e culturas outdoors (MATA
2007) Aleacutem disso devido a sua morfologia taxa de crescimento celular
relativamente alta e a caracteriacutestica das ceacutelulas se agregarem o custo operacional
para a recuperaccedilatildeo da biomassa eacute reduzido tornando-a economicamente viaacutevel
para a produccedilatildeo industrial (MATA 2007)
A Arthrospira sp eacute comercializada de forma inadequada com o nome de
Spirulina (GARRITY et al 2001) Atualmente a Arthrospira sp eacute produzida em
diferentes paiacuteses e sua produccedilatildeo mundial pode exceder 3000 toneladas
(SHIMAMATSU 2004) Na Tabela 1 estatildeo descritos algumas induacutestrias produtoras
de Spirulina (Arthrospira) sp e seu respectivo paiacutes
23
Tabela 1 - Produtores representativos de Spirulina
Induacutestria Paiacutesterritoacuterio
Spirulina Mexicana (Sosa Texcoco) SA
Meacutexico a
Siam Algae Co Ltd Thailand
Earthrise Farms USA
Cyanotech Corporation USA
Nan Pao Resins Chemical Co Ltd Taiwan
Far East Microalgae Co Ltd Taiwan
Parry Agro Industries Ltd (Parry Nutraceuticals)
Iacutendia
Yunnan Spirin Co Ltd Mainland China
Fonte Shimamatsu 2004 a Essa induacutestria faliu por volta do ano de 1990 (LEE 1997)
A biomassa da Spirulina sp eacute comercializada principalmente como alimentos
para seres humanos e animais devido a sua composiccedilatildeo quiacutemica A seguranccedila
como alimento tem sido estabelecida por seacuteculos atraveacutes do consumo pelos seres
humanos e pelos nuacutemerosos estudos toxicoloacutegicos (CHAMORRO et al 2002)
Na China em 1997 existiam cerca de 80 produtores de Spirulina com
produccedilatildeo anual variando de 3 a 500 toneladas A maioria dos produtores se
localizava no sul devido agrave vantagem de possuir verotildees longos e clima temperado
(LEE 1997) O maior produtor mundial de Arthrospira eacute Hainan Simai Enterprising
que estaacute localizado na provincia de Hainan na China Essa companhia tem uma
produccedilatildeo anual de 200 toneladas (SPOLAORE et al 2006) No Japatildeo de acordo
com Healfh Industry News a quantidade total de Spirulina comercializada foi de 400
toneladas em 1996 Em Taiwan 5 induacutestrias produzem um total de 480 toneladas
Na Tailacircndia os dois maiores produtores de Spirulina (Siam Algae Co Ltd e
Neotech Food Co Ltd) produzem 150 toneladas e 20 toneladas por ano
respectivamente Nos Estados Unidos a Cyanotech e a Earthrise Farms satildeo os dois
maiores produtores de Spirulina com produccedilatildeo de 380 toneladas e 500 toneladas
respectivamente Aleacutem dessas induacutestrias citadas acima existem outras produtoras
de Spirulina com uma produccedilatildeo anual menor em diversos paiacuteses como Chile Cuba
Filipinas Iacutendia (LEE 1997)
O potencial dessas cianobacteacuterias como um alimento baacutesico na dieta humana
tem sido investigado haacute muitos anos em diversos paiacuteses No Japatildeo a biomassa
24
algal (por exemplo Chlorella e Spirulina) eacute produzida comercialmente sendo
utilizada primeiramente como alimentos nutracecircuticos ou funcionais (OGBONNA
TANAKA 1997 BOROWITZKA 1986) Na China Spirulina and Chlorella satildeo os
dois maiores gecircneros cultivado na forma de biomassa ou extrato para a induacutestria
alimentiacutecia A biomassa eacute usada para produzir uma variedade de produtos
nutracecircuticos ou funcionais como tabletes caacutepsulas poacute ou para extraccedilatildeo de
ingredientes bioativos como β-caroteno e ficocianina A biomassa eacute suplementada
em patildees biscoitos doces sorvetes e o extrato satildeo suplementados em bebidas
como refrigerantes e chaacute principalmente para realccedilar seu valor nutritivo (LIANG et
al 2004)
Uma ampla variedade de pigmentos como clorofila a (Cl a) luteiacutena -caroteno
ficocianina (PC) e aloficocianina (APC) satildeo compostos bioativos na biomassa de S
platensis e tem sido usado como corantes naturais em alimentos em cosmeacuteticos e
como produtos farmacecircuticos no consumo humano e animal (CHEN et al 2006) O
efeito nocivo de corantes sinteacuteticos e a tendecircncia da sociedade utilizar produtos
naturais na alimentaccedilatildeo e cosmeacuteticos tecircm conduzido agrave exploraccedilatildeo das microalgas
como corantes naturais Esses pigmentos tecircm um grande valor comercial como
corantes naturais em induacutestrias nutracecircuticas cosmeacuteticas e farmacecircuticas
(PRASANNA et al 2007)
Recentemente a importacircncia de se estudar esses micro-organismos eacute devido
as suas propriedades terapecircuticas (BELAY et al 1993) e presenccedila de compostos
antioxidantes (ESTRADA et al 2001 MIRANDA et al 1998) Essas propriedades
tecircm sido provadas experimentalmente in vivo e in vitro que satildeo efetivas para o
tratamento de algumas alergias anemia doenccedilas virais e cardiovasculares
hiperglicemia hiperlipidemia processos inflamatoacuterios entre outros (CHAMORRO et
al 2002 BELAY et al 2002)
Essa cianobacteacuteria possui alto teor proteacuteico com importacircncia quantitativa dos
aminoaacutecidos essenciais e outros elementos nutricionais proporcionando seu alto
valor nutricional (MORIST et al 2001) Baixos teores de aacutecidos nucleacuteicos altos
conteuacutedos de vitaminas polissacariacutedeos e aacutecidos graxos essenciais como ocircmega-3
e ocircmega-6 satildeo paracircmetros importantes para avaliar a qualidade da biomassa algal
(OGBONNA TANAKA 1997 BOROWTIZKA 1986) Os polissacariacutedeos que
constituem a parede celular tecircm uma digestibilidade de 86 o que torna a biomassa
facilmente absorvida pelo corpo humano (LI 1997)
25
Haacute relatos tambeacutem do emprego da Arthrospira em cosmeacuteticos um extrato rico
em proteiacutenas feitos a partir da Arthrospira repara sinais de envelhecimento da pele
mais cedo exerce um efeito de firmeza e previne a formaccedilatildeo de estrias (Protulinesreg
Exsymol SAM Monaco) (SPOLAORE et al 2006)
Aleacutem da presenccedila dos compostos citados anteriomente a biomassa de
Spirulina tambeacutem pode ser utilizada no tratamento de aacuteguas residuais renovaccedilatildeo da
aacutegua atraveacutes da desintoxificaccedilatildeo bioloacutegica e remoccedilatildeo de metais pesados Por ser
um micro-organismo fotossintetizante tem a capacidade natildeo apenas de produzir
oxigecircnio mas tambeacutem de remover nutrientes como nitrogecircnio e foacutesforo reduzindo a
eutrofizaccedilatildeo dos efluentes Essa biomassa pode ser recuperada e utilizada para
extrair compostos de interesse industrial como por exemplo pigmentos e o restante
da biomassa pode ainda ser utilizado como combustiacutevel ou para produccedilatildeo de
metano (CIFERRI TIBONI 1985)
O cultivo de microalgas e cianobacteacuterias fornecem excelente perspectivas para
a produccedilatildeo de energia renovaacutevel podendo contribuir substancialmente para uma
reduccedilatildeo de emissotildees do CO2 Essas emissotildees satildeo resultados do processo de
queima dos combustiacuteveis foacutesseis e de praacuteticas agriacutecolas improacuteprias (as queimadas
por exemplo) produzindo elevados rendimentos da biomassa e possibilitando a
produccedilatildeo de compostos com alto valor agregado e biocombustiacutevel (CHISTI 2007
RICHMOND 1990)
As microalgas tecircm sido propostas como mateacuteria-prima para a produccedilatildeo de
biocombustiacuteveis devido ao alto teor de lipiacutedios que algumas espeacutecies podem
alcanccedilar O teor de oacuteleo de 20 a 50 de sua biomassa seca eacute comum entre as
espeacutecies como Nannochloropsis sp Chlorella sp Schizochytrium sp Algumas
microalgas podem exceder a 80 (MIAO 2006 CHISTI 2007 BANERJEE et al
2002) O percentual de lipiacutedios na biomassa de microalgas eacute funccedilatildeo das condiccedilotildees
de cultivo tais como salinidade do meio concentraccedilatildeo de nitrogecircnio natureza da
fonte de carbono assim eacute possiacutevel com certa facilidade e com tempo de resposta
relativamente curto aumentar o teor de oacuteleo nas microalgas de forma a alcanccedilar
valores bastante expressivos (CHISTI 2007)
As principais vantagens para a utilizaccedilatildeo de microalgas como biocombustiacuteveis
satildeo alta eficiecircncia de conversatildeo de foacutetons (como evidenciada pelo aumento do
rendimento da biomasa por hectare) podem ser coletados em lotes durante quase
todo o ano pode utilizar sais e aacutegua residuaacuteria reduzindo extremamente o uso de
26
aacutegua doce produz biocombustiacutevel altamente biodegradaacutevel e natildeo toacutexico podem ser
usado o CO2 liberado pela queima de combustiacuteveis foacutesseis esse CO2 eacute
frequentemente disponiacutevel a baixo custo ou ateacute mesmo sem custo (CHISTI 2007
SAWAYAMA et al 1995 SCHENK et al 2008 YUN et al 1997) As limitaccedilotildees
atuais existentes satildeo principalmente no processo de colheita e na fonte do CO2 para
a maior eficiecircncia de produccedilatildeo (SCHENK et al 2008)
22 Fotobiorreatores
A escolha do biorreator para o cultivo da microalga eacute um importante fator que
influecircncia na produtividade global (WATANABE HALL 1996) Haacute uma grande
variedade de biorreatores utilizados para o cultivo de microalga dentre os quais
alguns satildeo utilizados atualmente para produccedilatildeo industrial (LEE 2001)
Segundo Borowitzka (1999) as microalgas podem ser cultivadas em diversos
sistemas de cultivo com volume variando desde poucos litros ateacute bilhotildees de litros
Em geral os sistemas de produccedilatildeo satildeo pouco sofisticados uma vez que muitas
empresas desenvolvem cultivos a ceacuteu aberto em tanques com fundo de terra e com
baixo ou nenhum controle dos paracircmetros ambientais Nos uacuteltimos 50 anos alguns
cultivos desenvolvidos em fotobiorreatores podem ter os seus paracircmetros
ambientais controlados e isto implica numa elevada produtividade a qual viabiliza a
produccedilatildeo comercial de compostos de elevado valor agregado (KOMMAREDDY
ANDERSON 2005 TREDICI 2004)
Convencionalmente os cultivos de microalgas comerciais satildeo realizados em
reatores abertos por causa de baixa eficiecircncia dos fotobiorreatores fechados em
larga escala (OGBONNA TANAKA 1997) Portanto eacute difiacutecil de obter alta
produtividade em reatores ldquooutdoorsrdquo abertos por causa da dificuldade de controlar
fatores ambientais como temperatura e intensidade luminosa haacute uma grande
evaporaccedilatildeo de aacutegua no meio e aleacutem disso requer uma grande aacuterea superficial
facilitando a contaminaccedilatildeo por outros micro-organismos Esse meacutetodo natildeo deve ser
empregado para produccedilatildeo de componentes quiacutemicos finos e farmacecircuticos uma
vez que o custo de recuperaccedilatildeo desse produto e purificaccedilatildeo podem ser
extremamente altos principalmente devido a baixa concentraccedilatildeo celular e a
contaminaccedilatildeo com impurezas Vaacuterias alternativas tecircm sido propostas para contornar
esse problema como o emprego de fotobiorreatores fechados e processos
heterotroacuteficos (CHEN 1997)
27
Os fotobiorreatores abertos possuem certas desvantagens sobre os
fotobiorreatores fechados dentre elas destacam-se menor eficiecircncia fotossinteacutetica e
menor qualidade do produto da microalga (RICHMOND et al 1990 VONSHAK
RICHOMOND 1988) A menor eficiecircncia fotossinteacutetica eacute principalmente devido ao
efeito de sombreamento quando a densidade celular alcanccedila um determinado valor
a baixa eficiecircncia de utilizaccedilatildeo de CO2 gasoso devido agrave limitaccedilatildeo do suplemento de
CO2 para a microalga uma vez que quando o CO2 natildeo estaacute dissolvido no meio de
cultura este se volatiliza contaminaccedilatildeo do cultivo por bacteacuterias algas protozoaacuterios
e fungos tambeacutem influenciam no crescimento da microalga e na qualidade do
produto Os fotobiorreatores fechados tecircm a vantagem de aumentar a eficiecircncia de
utilizaccedilatildeo de CO2 controlando o pH da cultura e diminuir o niacutevel de contaminantes
(WATANABE HALL 1996) Tambeacutem dependendo da configuraccedilatildeo do reator pode
aumentar a aacuterea iluminada reduzindo o efeito de sombreamento (WATANABE et al
1995)
Fotobiorreatores fechados satildeo usados para cultivos de micro-organismos
fotoautotroacuteficos visando agrave produccedilatildeo de aacutecidos graxos poliinsaturados pigmentos
vitaminas e polissacariacutedeos (MOLINA GRIMA et al 1995 TAKANO et al 1995
MERCHUK et al 1996 MATSUNAGA et al 1996) Para muitas dessas aplicaccedilotildees
eacute essencial o uso desses tipos de fotobiorreatores nos quais as monoculturas
podem ser mantidas por longos periacuteodos preferencialmente se o cultivo for
ldquooutdoorrdquo utilizando luz solar como a uacutenica fonte de energia (JANSSEN et al 2003)
Diversas configuraccedilotildees de fotobiorreatores fechados tecircm sido usadas ou
propostas para o cultivo de Spirulina sp como o tubular horizontal (CONVERTI et
al 2006a) tubular helicoidal (BIOCOIL) (WATANABE et al 1995 NERANTZIS et
al 2002) espiralado vertical (TREDICI ZITTELLI 1998) e laminar inclinado (HU et
al 1996) Quase todas as configuraccedilotildees dos fotobiorreatores usam um recipiente
de degassing para desoxigenar o sistema pois um aumento no niacutevel de oxigecircnio no
meio reduz a produtividade (NERANTZIS et al 2002)
Um fator importante para a configuraccedilatildeo desses fotobiorreatores eacute o
fornecimento de luz eficientemente pela maximizaccedilatildeo da relaccedilatildeo superfiacutecie-volume
iluminada Por isso os tubos satildeo frequentemente estreitos e os ldquopanelsrdquo satildeo finos
No entanto alguns fotobiorreatores bem sucedidos em escala laboratorial podem
natildeo funcionar bem quando se aumenta a escala por causa da reduccedilatildeo da relaccedilatildeo
28
superfiacutecie-volume ocasionando uma pobre distribuiccedilatildeo luminosa dentro do reator
(OGBONNA TANAKA 1997)
Tredici e Zittelli (1998) observaram que cultivos de Arthrospira (Spirulina)
platensis em fotobiorreator tubular obtiveram maiores valores de produtividade
volumeacutetrica eficiecircncia fotossinteacutetica e velocidade especiacutefica de crescimento quando
comparadas com os cultivos em fotobiorreator plano Isso foi devido agrave diferenccedila
entre o fluxo de foacutetons nos cultivos com formas diferentes dos fotobiorreatores Uma
vez que os outros principais paracircmetros que conduzem o crescimento da S
platensis natildeo variaram entre os dois cultivos
Entre os diferentes tipos de fotobiorreatores aqueles do tipo air lift satildeo
particularmente interessantes por apresentarem uma maior transferecircncia de massa
liacutequido-gaacutes com menor gasto de energia podem ter o escoamento do liacutequido
facilmente controlado a circulaccedilatildeo de liacutequidos ocorre sem a remoccedilatildeo de partes do
reator e isto previne a contaminaccedilatildeo no cultivo Estes tipos de reatores satildeo
especialmente recomendados para as culturas de cianobacteacuterias por causa da
sensibilidade destas ao estresse de cisalhamento mecacircnico (CHOI et al 1995
SIEGEL ROBINSON et al 1992 CHISTI 1989 MERCHUK et al 1996
WATANABE et al 1995)
O sistema air lift tambeacutem permite a remoccedilatildeo de oxigecircnio produzido pela
fotossiacutentese (CAMACHO RUBIO et al 1998) A remoccedilatildeo contiacutenua do gaacutes oxigecircnio
em cultivos fotossinteacuteticos eacute essencial por que uma excessiva quantidade de
oxigecircnio dissolvido inibe a fotossiacutentese (MOLINA et al 2001)
O crescimento e a produtividade das ceacutelulas fotossinteacuteticas satildeo afetados por
diversos fatores incluindo composiccedilatildeo do meio de cultura temperatura pH
concentraccedilatildeo de O2 e CO2 no reator e fornecimento de luz sendo este o mais
importante durante o cultivo autotroacutefico de ceacutelulas fotossinteacuteticas (OGBONNA
TANAKA 1997)
Micro-organismos natildeo satildeo expostos a uma densidade de fluxo de foacutetons
constante em fotobiorreatores devido ao sombreamento muacutetuo das ceacutelulas e ao
movimento do liacutequido durante a agitaccedilatildeo Frequumlentemente tem sido sugerido que a
circulaccedilatildeo entre as zonas clara e escura poderia conduzir a uma eficiecircncia
fotossinteacutetica maior que aquela determinada sob iluminaccedilatildeo contiacutenua da densidade
de fluxo de foacutetons (JANSSEN et al 2003)
29
O fornecimento da luz em fotobiorreatores eacute uma variaacutevel importante em
culturas fotoautroacuteficas A alta razatildeo superfiacutecie-volume eacute um preacute-requisito importante
para o suprimento suficiente de luz nos fotobiorreatores Ateacute mesmo sob baixa
intensidade luminosa os organismos fotossintetizantes utilizam a luz exposta na
superfiacutecie dos fotobioreatores A energia de excitaccedilatildeo eacute parcialmente utilizada pelo
aparato fotossinteacutetico e a energia residual eacute perdida na forma teacutermica ou
fluorescecircncia (GRUSZECKI et al 1994) Um excesso da energia de excitaccedilatildeo pode
prejudicar o aparato fotossinteacutetico no processo chamado de fotoinibiccedilatildeo (MELIS
1999)
Dependendo do diacircmetro interno dos tubos (12 a 123 cm) os fotobiorreatores
tubulares fechados podem alcanccedilar valores de concentraccedilatildeo celular maiores que 20
g L-1 e produtividades volumeacutetricas de biomassa de 025 - 364 g L-1d-1 em cultivo
que possuem o ciclo claroescuro A alta turbulecircncia encontrada em reatores
tubulares garante uma oacutetima disponibilidade luminosa para as ceacutelulas e melhor
transferecircncia de massa dos gases (LEE 2001)
Outro fator importante eacute o escoamento turbulento da cultura A velocidade do
escoamento do liacutequido deve ser suficiente para garantir o escoamento turbulento
para evitar que as ceacutelulas fiquem estagnadas no interior escuro dos tubos Portanto
uma turbulecircncia execessiva pode danificar as ceacutelulas e haacute um limite superior para a
velocidade da cultura A turbulecircncia eacute conhecida por aumentar a produtividade da
biomassa quando comparada as condiccedilotildees de escoamento laminar A turbulecircncia
move as ceacutelulas do interior escuro de um tubo para uma zona perifeacuterica iluminada
evitando que as ceacutelulas natildeo recebam luz por longos periacuteodos Adicionalmente o
movimento das ceacutelulas da zona clara para a zona escura pode aumentar a
produtividade desde que a duraccedilatildeo de permanecircncia na zona escura seja curta
Intervalos no escuro na ordem de 1 segundo podem melhorar a conversatildeo da
energia solar em biomassa (LAWS et al 1987 TERRY 1986) Tais intervalos
permitem reaccedilotildees cataliacuteticas da fotossiacutentese no escuro permitindo o
restabelecimento do aparato fotossinteacutetico para sua eficiecircncia no proacuteximo periacuteodo
luminoso (ACIEacuteN FERNAacuteNDEZ et al 2001) Jansen et al (2002) relataram que a
turbulecircncia movimenta as ceacutelulas da zona escura no centro do fotobiorreator para a
zona foacutetica na parte mais externa do cilindro podendo conduzir a maior eficiecircncia do
reator
30
O fluxo laminar pode ser prejudicial agraves altas densidades celulares No entanto
eacute importante por proporcionar uma distribuiccedilatildeo uniforme da luz a todas as ceacutelulas na
cultura reduzir o crescimento da parede do fotobiorreator e diminuir a tensatildeo do
oxigecircnio na cultura (RICHMOND 2000) Carlozzi e Torzillo (1996) obtiveram maior
produtividade da Arthrospira platensis quando a velocidade da cultura densa (10 g L-1)
foi alterada de 018 m s-1 para 075 m s-1 Isto torna evidente a necessidade de se
manter uma velocidade de escoamento que permita um maior nuacutemero de ceacutelulas
captarem luminosidade suficiente e que ao mesmo tempo natildeo aumente a demanda
dos custos de produccedilatildeo
Converti et al (2006) observaram que cultivos de Arthrospira platensis em
fotobiorreator tubular a velocidade da cultura de 016 m s-1 eacute suficiente para garantir
uma boa mistura da cultura evitando danos agraves ceacutelulas Similarmente Tredici (1999)
descreve que cultivos em escala industrial de Arthrospira sp em fotobiorreator com
tubos plaacutesticos alongados sobre a terra com 35 cm de largura e 9 cm de altura a
densidade populacional oacutetima foi de 1 g Lminus1 e a velocidade do fluxo natildeo pode ser
menor que 50 cm sminus1 Baixa velocidade de circulaccedilatildeo 6 a 10 cm sminus1 prejudicou o
cultivo devido a produccedilatildeo O2 que inibiu o crescimento baixas taxas de saiacuteda e a
cultura deteriorou-se rapidamente devido ao seu crescimento na parede do tubo
(biofouling)
Como o crescimento dos micro-organismo fotossintetizantes nos
fotobiorreatores eacute fotossinteacutetico o suplemento de luz e CO2 satildeo provavelmente os
limitantes para o crescimento da microalga Aleacutem desses fatores a concentraccedilatildeo de
nitrogecircnio tambeacutem eacute um fator determinante no cultivo uma vez que este nutriente eacute
utilizado principalmente para constituir proteiacutenas e aacutecidos nucleacuteicos fundamentais
para a manutenccedilatildeo e crescimento celular (WATANABE HALL 1996)
No caso de fontes de nitrogecircnio amocircniacais o emprego dos reatores tubulares
pode ser considerado como uma vantagem por favorecer baixa perda de amocircnia
por volatilizaccedilatildeo reduzindo a necessidade de adiccedilatildeo de fonte de nitrogecircnio como
consequumlente reduccedilatildeo do custo de produccedilatildeo Assim pode-se concluir que os
esforccedilos em melhoria de condiccedilotildees de cultivo de A platensis natildeo sejam apenas
utilizando reatores abertos mas tambeacutem reatores fechados dentre os quais os
tubulares
31
23 Processos de cultivo em fotobiorreatores
S platensis habita naturalmente em lagos africanos e mexicanos (RICHMOND
1990) mas podem crescer artificialmente em meios sinteacuteticos empregando
diferentes tipos de processos de cultivo Estes tecircm sido desenvolvidos com a
finalidade de aumentar a produtividade do material desejado Segundo Sassano
(1999) a forma de adiccedilatildeo do substrato nas dornas pode interferir na qualidade da
biomassa produzida
No processo contiacutenuo eacute realizado por meio de uma alimentaccedilatildeo contiacutenua do
substrato limitante (ou meio de cultura) ao reator a uma determinada vazatildeo
constante e por uma retirada contiacutenua de meio cultivado de forma a se ter o volume
de reaccedilatildeo constante a fim de que o sistema atinja a condiccedilatildeo de estado
estacionaacuterio (steady-state) Esse estado consiste na situaccedilatildeo nas quais todas as
condiccedilotildees no interior do reator permanecem constantes ao longo do tempo
(FACCIOTTI 2001) Esse processo tem sido estudado por diferentes autores
comprovando sua aplicabilidade para no cultivo de Spirulina platensis Hirata et al
(1998) obtiveram concentraccedilotildees de S platensis sob condiccedilotildees fotoautotroacuteficas em
regime permanente nas diferentes intensidades luminosas analisadas 25 a 400 W
m-2 Nerantzis et al (2002) empregou o sistema contiacutenuo no fotobiorreator tubular
helicoidal (HELPBR) no cultivo de S platensis e provou sua flexibilidade ao aumento
de escala bem como sua alta produtividade volumeacutetrica em relaccedilatildeo a outros
fotobiorreatores fechados
Outro tipo de processo que tem sido utilizado no cultivo de S platensis em
fotobiorreatores eacute o semicontiacutenuo Esse processo consiste na alimentaccedilatildeo contiacutenua
do substrato limitante mas a remoccedilatildeo do produto eacute por bateladas (alimentaccedilatildeo
contiacutenua com descarga apoacutes a obtenccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular maacutexima desejada)
(BORZANI 2001) Travieso et al (2001) utilizando fotobiorreator tubular helicoidal
concluiacuteram que eacute possiacutevel empregar satisfatoriamente o sistema semicontiacutenuo no
cultivo de S platensis obtendo uma produtividade da biomassa maior que em
processos descontiacutenuo Isso por que em processo descontiacutenuo a produtividade em
ceacutelulas tende a diminuir quando os nutrientes satildeo totalmente consumidos De acordo
com Reichert et al (2006) a concentraccedilatildeo celular pode atingir valores de duas a
quatro vezes maiores no cultivo semicontiacutenuo de S platensis em relaccedilatildeo ao cultivo
descontiacutenuo utilizando fotobiorreator fechado
32
No processo descontiacutenuo todo o substrato eacute adicionado no iniacutecio do cultivo e
os produtos permanecem ateacute o final do cultivo (CARVALHO SATO 2001) No
processo descontiacutenuo alimentado que eacute uma variaccedilatildeo do processo descontiacutenuo a
alimentaccedilatildeo pode ser de forma intermitente ou contiacutenua O modo de operaccedilatildeo da
alimentaccedilatildeo em bioprocessos permite prevenir o acuacutemulo ou a falta do substrato no
cultivo Em processo microbiano uma apropriada taxa de alimentaccedilatildeo
exponencialmente crescente resulta na manutenccedilatildeo da concentraccedilatildeo do substrato
limitante residual controlando a taxa de formaccedilatildeo do produto (CARVALHO SATO
2001) Esse processo permite que o nutriente seja adicionado em determinados
intervalos de tempo durante todo o processo com isso eacute possiacutevel adicionar
nutrientes potencialmente toacutexicos quando presentes em altas concentraccedilotildees como
por exemplo o iacuteon amocircnio sem prejudicar o crescimento microbiano e prevenindo
seu acuacutemulo (CARVALHO et al 2004) Olguiacuten et al (2001) observaram que no
cultivo descontiacutenuo usando uma concentraccedilatildeo inicial de amocircnia de 1 mM incubada
a 32 ordmC ocorre uma grande perda desse iacuteon para a atmosfera aleacutem de ser
consumida pelo micro-organismo tornando-se deficiente depois de poucos dias
especificamente 12 dias Soletto et al (2005) observaram que o melhor crescimento
cineacutetico da S platensis foi empregando o processo descontiacutenuo alimentado quando
comparada com o processo descontiacutenuo utilizando a ureacuteia com fonte de nitrogecircnio
Comportamento semelhante foi observado por Zhang et al (1998) em cultivos
mixotroacuteficos de S platensis utilizando NaNO3 como fonte de nitrogecircnio
Costa et al (2004) observaram o emprego da aacutegua do lago Mangueira
suplementado com ureacuteia pelo processo descontiacutenuo alimentado no cultivo de S
platensis foi possiacutevel reduzir o custo de produccedilatildeo possibilitando o cultivo em larga
escala
Em casos particulares como por exemplo a necessidade de utilizaccedilatildeo de
nutriente viscoso no cultivo este processo geralmente reduz a viscosidade do meio
e o efeito dos componentes toacutexicos eacute tambeacutem limitado pela diluiccedilatildeo (WARD 1989)
Entre outras vantagens desse processo pode-se encontrar desvio do metabolismo
celular para via de interesse de formaccedilatildeo do produto evita repressatildeo cataboacutelica
evita formaccedilatildeo de produtos toacutexicos no metabolismo microbiano e controla a
velocidade de crescimento microbiano O melhor procedimento operacional para
esse sistema eacute iniciar com pequena quantidade de biomassa e substrato e adicionar
33
mais substrato quando a maior parte do substrato inicial ter sido consumida pelo
micro-organismo (GREGERSEN JORGENSEN 1999)
O processo descontiacutenuo alimentado deve ser usado para melhorar a densidade
celular no crescimento da S platensis desde que a concentraccedilatildeo do substrato
limitante possa ser adicionada ateacute alcanccedilar a produccedilatildeo maacutexima de biomassa sem
resultar na inibiccedilatildeo do crescimento
24 Nutrientes para o crescimento da A platensis
241 Fontes de Nitrogecircnio
O elemento nitrogecircnio constitui aproximadamente de 5 a 10 do peso seco das
cianobacteacuterias (FLORES HERRERO 1994) Diferentes fontes de nitrogecircnio
orgacircnica e inorgacircnica podem ser assimiladas por micro-organismos
fotossintetizantes Dentre as orgacircnicas encontramos aminoaacutecidos purinas ornitina
e as inorgacircnicas encontramos sais de amocircnio e sais de nitrato (BERMAN CHAVA
1999)
As cianobacteacuterias utilizam principalmente fontes de nitrogecircnio inorgacircnico como
nitrato nitrito amocircnia e nitrogecircnio atmosfeacuterico para suprir sua necessidade No
entanto amocircnia eacute a uacutenica fonte inorgacircnica de nitrogecircnio que eacute diretamente
incorporada em compostos orgacircnicos e entatildeo um intermediaacuterio obrigatoacuterio na
utilizaccedilatildeo do outras fontes de nitrogecircnio Essa moleacutecula eacute tambeacutem conhecida como
uma desacopladora na fotossiacutentese causando sob certas circunstacircncias o colapso
do ΔpH requerida pela siacutentese de ATP A amocircnia regula enzimas importantes no
metabolismo de nitrogecircnio tais como nitrato redutase glutamina sintetase e
nitrogenases (BOUSSIBA 1997)
Exceto para o N2 as cianobacteacuterias possuem um sistema de transporte
especiacutefico para as diferentes formas de nitrogecircnio mas a maioria deles pode entrar
na ceacutelula por difusatildeo dependendo de sua concentraccedilatildeo oue do pH do meio de
cultura Nitrato e nitrito satildeo reduzidos pela nitrato redutase e nitrito redutase
respectivamente ambas as enzimas usam ferredoxina como doador de eleacutetrons
(FLORES HERRERO 1994) Ureacuteia eacute convertida a amocircnia pela urease e o
dinitrogecircnio eacute reduzido agrave amocircnia pelo complexo nitrogenase (HERRERO et al
2001) Outras formas de nitrogecircnio como certos aminoaacutecidos requerem sistemas de
34
transporte especiacutefico e posteriormente seratildeo metabolizados para produzir amocircnio
(HERRERO et al 2001 MURO-PASTOR FLORENCO 2003)
Nesses organismos a hierarquia de preferecircncia da assimilaccedilatildeo tem sido
mostrada para esses compostos Quando amocircnio e nitrato estatildeo presentes
simultaneamente no meio externo o sistema para assimilaccedilatildeo de nitrato eacute expresso
somente ao niacutevel basal A inibiccedilatildeo da assimilaccedilatildeo do nitrato exercida pela amocircnia
opera em dois niacuteveis diferentes pelo menos Durante pouco tempo a adiccedilatildeo da
amocircnia interrompe a assimilaccedilatildeo ativa do nitrato pelas ceacutelulas Se as ceacutelulas
continuarem expostas ao amocircnio ateacute mesmo quando o nitrato estaacute
simultaneamente presente a longo prazo o sistema regulatoacuterio atua na repressatildeo
das proteiacutenas envolvendo a assimilaccedilatildeo do nitrato (HERRERO FLORES 1997) A
atividade da nitrato redutase em Spirulina platensis (strain ARM 729) eacute reduzida
mediante a retirada de nitrato do meio e eacute totalmente restaurada apoacutes duas horas
da adiccedilatildeo de nitrato indicando a induccedilatildeo pelo substrato A concentraccedilatildeo oacutetima de
nitrato de soacutedio necessaacuteria para a atividade maacutexima da enzima nitrato redutase eacute de
30 mM Os produtos da assimilaccedilatildeo do nitrato nitrito e amocircnio inibiram
significativamente a atividade da nitrato redutase quando em altas concentraccedilotildees A
acumulaccedilatildeo do nitrito eacute toacutexica para a ceacutelula mas seu niacutevel pode ser controlado tanto
pela inibiccedilatildeo da atividade da nitrato redutase eou transporte do nitrato ou pelo
aumento da atividade da nitrito redutase (JHA et al 2007)
Em cultivos de micro-organismo em larga escala a fonte de nitrogecircnio
preferencial eacute a amocircnia devido ao seu baixo custo e tambeacutem porque ela pode
previnir a contaminaccedilatildeo com zooplancton (BOUSSIBA 1997) A preponderacircncia de
NH3 sobre NH4+ em valores de pH acima de 92 o pKa para amocircnia a 20-30 ordmC
favoreceu a permeabilidade desta pela membrana plasmaacutetica forma natildeo ionizada
que apoacutes difundir pela membrana plasmaacutetica a amocircnia eacute aprisionada dentro da
ceacutelula na forma de iacuteon amocircnio carregado positivamente (BOUSSIBA 1997) O grau
de inibiccedilatildeo parece ser muito reduzido em cepas que crescem restritamente em
condiccedilotildees alcalinas 5 mM de amocircnia inibiu 90 a evoluccedilatildeo de O2 dependente de
luz em micro-organismo neutrofiacutelico Anabaena sp e somente 30 foi observada
em micro-organismo alcalofiacutelico Spirulina platensis no mesmo pH (pH 100) Em
concentraccedilatildeo de 10 mM Spirulina platensis obteve ainda 50 da capacidade
fotossinteacutetica e Anabaena sp natildeo obteve crescimento Essa resistecircncia da Spirulina
agrave amocircnia em pH 10 eacute conferida por um pH intratilacoidal relativamente alto no
35
valor de 65 em relaccedilatildeo ao pH intratilacoidal da Anabaena sp valor de pH de 53
Esta diferenccedila no valor do pH intratilacoidal sugere que menor eacute a ΔpH atraveacutes da
membrana que eacute a razatildeo para a resistecircncia relativa da Spirulina platensis a amocircnia
em pH 100 (BELKIN BOUSSIBA 1991a)
A adiccedilatildeo de 2-3 mM de amocircnia em cultivos de Spirulina mantida geralmente a
pH (95 - 100) causa a deterioraccedilatildeo do contamitante Chlorella no cultivo de
Spirulina A toxidade da amocircnia nas ceacutelulas da Chlorella eacute causada pela grande
entrada dessa moleacutecula devido ao menor pH interno reduzindo a variaccedilatildeo do pH na
membrana tilacoidal requerida para a siacutentese de ATP Logo o uso de amocircnia com
fonte de nitrogecircnio no cultivo de Spirulina pode previnir a proliferaccedilatildeo de outros
micro-organismos (BOUSSIBA 1997)
Ureacuteia e aminoaacutecidos tambeacutem podem ser assimilados pelas cianobacteacuterias A
ureacuteia e fontes de nitrogecircnio orgacircnico satildeo primeiramente metabolizadas para amocircnia
e a partir de entatildeo os aacutetomos de nitrogecircnio seratildeo utilizados como observado na
Figura 2 (FLORES HERRERO 1994)
Figura 2 Principais rotas de assimilaccedilatildeo de nitrogecircnio em cianobacteacuterias cultivas em pH acima de 92
A maioria dos organismos fotossintetizantes a assimilaccedilatildeo da amocircnia ocorre
pela accedilatildeo sequumlencial da glutamina sintetase (GS) e glutamanto sintase (GOGAT)
Ureacuteia
NO3-
aminoaacutecido
NH3
aminoaacutecido
Ureacuteia
NO3-
NH4+
Nucleotiacutedeos
Aminoaacutecidos
Aminoaccediluacutecar
Lipiacutedios
NH4+
Aacutecidos nucleacuteicos
Parede celular
Porfirinas
Proteiacutenas
Intracelular Exracelular
36
Essas reaccedilotildees conhecidas como ciclo GS-GOGAT constituem uma ligaccedilatildeo entre o
metabolismo de nitrogecircnio e de carbono e eacute o metabolismo mais importante para
assimilaccedilatildeo da amocircnia gerada tanto exogenamente como endogenamente
(BOUSSIBA 1997)
As enzimas do ciclo da glutamina sintetase e glutamato sintase satildeo importantes
pela introduccedilatildeo da amocircnia em formas orgacircnicas O glutamato produzido por esta
via aleacutem de ser o principal doador de nitrogecircnio para a siacutentese de outros
metaboacutelitos contendo nitrogecircnio eacute tambeacutem um precursor de alguns aminoaacutecidos e
da 5-aminolevulinato um precursor da biossiacutentese da porfirina ficobilina e clorofila
(FLORES HERRERO 1994)
A parede celular das cianobacteacuterias eacute como as das bacteacuterias gram-negativas
que conteacutem uma camada de peptidoglicano na parte externa da membrana
citoplasmaacutetica Nesta membrana conteacutem tipos de proteiacutenas especiais denominadas
de porinas a qual permite a passagem de pequenas moleacuteculas incluindo
aminoaacutecidos e iacuteons inorgacircnicos Isto eacute essas substacircncias apresentam um sistema
de transporte especializado (FLORES HERRERO 1994) A membrana
citoplasmaacutetica representa a principal barreira de permeabilidade das cianobacteacuterias
Portanto o nitrato provavelmente possui livre acesso ao periplasma das
cianobacteacuterias (HERRERO FLORES 1997)
Algumas cianobacteacuterias como Anabaena Nostoc Fischerella satildeo capazes de
fixar N2 atmosfeacuterico em condiccedilotildees aeroacutebias atraveacutes das nitrogenases (FLORES
HERRERO 1994) No entanto as ceacutelulas de S platensis natildeo podem fixar nitrogecircnio
atmosfeacuterico porque natildeo possuem heterocisto (MATA 2007 VACHHANI VONSHAK
1997) e eacute dentro dos heterocistos onde se encontram as nitrogenases em
cianobacteacuterias (LARA GUERRERO 2007)
O nitrato eacute provavelmente a fonte mais abundante de nitrogecircnio para a nutriccedilatildeo
de cianobacteacuterias A assimilaccedilatildeo do nitrato envolve a incorporaccedilatildeo do nitrato e
reduccedilatildeo do nitrato intracelular para amocircnio na qual eacute a forma de nitrogecircnio
incorporada em compostos orgacircnicos Nitrito na qual pode tambeacutem ser utilizado na
necessidade do nitrogecircnio eacute assimilado pelas ceacutelulas e entatildeo reduzido a amocircnio
(FLORES HERRERO 1994)
A assimilaccedilatildeo do nitrato pelas cianobacteacuterias envolve um sistema de transporte
que eacute carreado por uma proteiacutena e esta possui uma alta afinidade pelo nitrato Esta
alta afinidade permite que as cianobacteacuterias utilizem nitratos mesmo em baixas
37
concentraccedilotildees como eacute encontrado no meio ambiente natural O acuacutemulo intracelular
de nitrato permitiraacute o funcionamento da enzima nitrato redutase (FLORES
HERRERO 1994) Portanto a limitaccedilatildeo do transporte de nitrato pela inativaccedilatildeo de
alguns genes do transporte de nitrato natildeo impede o crescimento dependente de
nitrato quando este eacute suplementado a alta concentraccedilatildeo (20 mM) A entrada do
nitrato nas ceacutelulas nessas condiccedilotildees parece ser por difusatildeo passiva desde que a
concentraccedilatildeo de nitrato seja maior que 1 mM a assimilaccedilatildeo de nitrato aumenta
linearmente com o aumento da sua concentraccedilatildeo (OMATA et al 1989)
O nitrato intracelular eacute reduzido a nitrito em reaccedilatildeo utilizando 2 eleacutetrons
catalizados pela nitrato redutase o nitrito eacute convertido a amocircnio pela nitrito redutase
na reaccedilatildeo utilizando 6 eleacutetrons Ambas as enzimas encontradas nas membranas
tilacoidais utilizam ferrodoxina reduzida como doador de eleacutetrons A presenccedila de
nitrato ou nitrito geralmente tem um efeito positivo nos niacuteveis das enzimas nitrato
redutase e nitrito redutase (FLORES HERRERO 1994) Estas enzimas encontram-
se principalmente no citoplasma das cianobacteacuterias (GUERRERO LARA 1987) A
assimilaccedilatildeo do nitrato envolve a reduccedilatildeo citoplasmaacutetica para nitrito (NO2-)
catalizada pela enzima nitrato redutase (NR) usando NAD(P)H como doador de
eleacutetrons O nitrito eacute rapidamente reduzido a amocircnio (NH4+) pela enzima nitrito
redutase (NiR) que usa a ferrodoxina como doador de eleacutetrons e o amocircnio eacute entatildeo
incorporado a moleacuteculas de nitrogecircnio como aminoaacutecidos purinas pirimidinas e
aminas (LEA LEEGOOD 1993)
Quando somente o CO2 eacute o aceptor de eleacutetrons disponiacutevel e o escoamento de
eleacutetrons pelos fotossistemas natildeo eacute limitado pela luz o que determina a fotossiacutentese
eacute a fixaccedilatildeo de CO2 pelo ciclo das pentoses Quando se adiciona nitrato nessas
mesmas condiccedilotildees este usa os eleacutetrons diretamente da ferrodoxina reduzida
liberando o escoamento dos eleacutetrons natildeo ciacuteclico de sua limitaccedilatildeo e estimulando a
produccedilatildeo de O2 Esse efeito natildeo foi observado quando se adiciona amocircnio Na
intensidade luminosa saturante o nitrato estimula o fluxo de eleacutetrons natildeo ciacuteclico para
gerar um poder redutor utilizado para sua assimilaccedilatildeo No entanto a intensidade de
luz limitante o nitrato reprime a fixaccedilatildeo de CO2 para utilizar o poder redutor gerado
fotossinteticamente na sua reduccedilatildeo a amocircnia (ROMERO LARA 1987)
A nitrato redutase e nitrito redutase presentes na membrana tilacoidal permitem
a fotoreduccedilatildeo do nitrato ou nitrito em uma reaccedilatildeo dependente do fotossistema I na
qual eacute estimulada pela ferrodoxina Nos tilacoacuteides do Synechococcus a fotoreduccedilatildeo
38
do nitrato a amocircnio utiliza aacutegua como fonte de eleacutetrons foi observado na reaccedilatildeo
envolvendo ambos fotossistema I e fotossistema II Em condiccedilotildees heterotroacuteficas a
reduccedilatildeo do nitrato ocorre pela ferrodoxina reduzida produzida a partir do NADPH e
ferrodoxina-NADP oxiredutase NAPDH eacute provavelmente gerado pela glicose-6-
fosfato desidrogenase e 6-fosfogluconato desidrogenase (HERRERO FLORES
1997)
A assimilaccedilatildeo de amocircnio nas cianobacteacuterias pode ser pela difusatildeo de sua
forma gasosa (amocircnia) ou pela accedilatildeo de permeases especiacuteficas e eacute diretamente
incorporado no metabolismo GS-GOGAT (GS glutamina sintetase GOGAT
glutamate sintase) (MURO-PASTOR FLORENCIO 2003)
A ureacuteia eacute uma boa fonte de nitrogecircnio para cianobacteacuterias pertencentes a
diferentes grupos taxonocircmicos Esta parece ser assimilada intacta pelas ceacutelulas
ativas e entatildeo metabolizada intracelularmente (FLORES HERRERO 1994) Embora
o metabolismo assimilatoacuterio do nitrogecircnio tenha sido amplamente investigado
(FLORES HERRERO 1994) informaccedilatildeo sobre a assimilaccedilatildeo da ureacuteia eacute escassa e
a maioria relata sobre o uso da urease (RAI SINGH et al 1987 RAI 1989
PALINSKA et al 2000) A ureacuteia intracelular eacute degradada pela enzima urease
liberando uma moleacutecula de dioacutexido de carbono e duas moleacuteculas de amocircnia
Embora algumas leveduras e algas degradem a ureacuteia pela ureacuteia amidoliase
dependente de ATP e biotina a maioria dos micro-organismos usa a ureacuteia
amidohidrolase dependente de Ni+2 (VALLADARES et al 2002) Essa enzima
possui um Km para ureacuteia geralmente acima de 1 mM (MOBLEY HAUSINGER
1989) Valladares et al (2002) tem demonstrado que algumas cianobacteacuterias como
Synechocystis sp PCC 6803 e Anabaena sp PCC 7120 possuem um transportador
de ureacuteia denominado ABC tipo permease (ABC-type permease) essencial para a
assimilaccedilatildeo da ureacuteia
A atividade da urease em cianobacteacuterias Synechococcus sp eacute geralmente
maior em ceacutelulas rompidas em relaccedilatildeo as ceacutelulas intactas sugerindo que a urease
estaacute localizada intracelularmente no citoplasma (COLLIER et al 1999) A produccedilatildeo
da urease requer Ni+2 no meio de crescimento e tem sido purificada a partir da
Spirulina maxima (CARVAJAL et al 1982)
Em geral haacute dois principais metabolismos para que o amocircnio seja incorporado
em constituintes orgacircnicos nas ceacutelulas O primeiro eacute a incorporaccedilatildeo direta do
amocircnio incorporado do meio para produccedilatildeo do glutamato pela aminaccedilatildeo do 2-
39
oxoglutarato (-cetoglutarato) pela glutamato desidrogenase seguindo pela
aminaccedilatildeo do glutamato pela glutamina sintetase
(1)
No segundo duas moleacuteculas de glutamato satildeo produzidas na reaccedilatildeo de
transaminaccedilatildeo A amocircnia eacute incorporada ao glutamato originando a glutamina na
qual transfere seu grupo amino para 2-oxoglutarato (-cetoglutarato) pela glutamato
sintase ou glutamato-2-oxoglutarato aminotransferase este eacute o ciclo de reaccedilotildees
catalisadas pelo glutamato sintase e glutamina sintetase sendo esta a via mais
comum de assimilaccedilatildeo de amocircnio em cianobacteacuterias independente da fonte de
nitrogecircnio utilizada (FLORES HERRERO 1994)
(2)
Eacute evidente que na assimilaccedilatildeo de algumas formas de nitrogecircnio inorgacircnico
pelas enzimas GSGOGAT um requerimento obrigatoacuterio do esqueleto de carbono
principalmente cetoaacutecidos conduziraacute um desvio do fluxo de carbono da biossiacutentese
de carboidrato para a biossiacutentese de aminoaacutecidos (LARA GUERRERO 1997)
proporcionando um aumento no fluxo de carbono atraveacutes da via glicoliacutetica e dos
aacutecidos tricarboxiacutelicos para a formaccedilatildeo do oxalacetato e do α-cetoglutarato bem
como estimula o turnover de aminoaacutecidos em ceacutelulas de Anacystis nidulans uma
2
+
+
40
vez que um aumento da incorporaccedilatildeo do carbono em aminoaacutecidos induzido pela
assimilaccedilatildeo de nitrogecircnio natildeo foi acompanhado por um aumento no pool de
aminoaacutecidos Esse desvio eacute mais evidente sob altas intensidades luminosas
(CORONIL et al 1993)
Nas ceacutelulas de Phormidium laminosum adaptada ao crescimento com nitrato ou
amocircnia como fonte de nitrogecircnio possuem de 65 a 90 de glutamato em relaccedilatildeo a
quantidade de aminoaacutecidos totais (porccedilatildeo molar) dependendo da fase de
crescimento Essa proporccedilatildeo pode variar se a fonte de nitrogecircnio no cultivo for
alterada Quando o iacuteon amocircnio foi adicionado no cultivo com nitrato o conteuacutedo de
glutamato diminui enquanto que a maioria dos outros aminoaacutecidos aumentou O
niacutevel intracelular da maioria dos aminoaacutecidos (especialmente aspartato e alanina)
aumenta indicando que a siacutentese de aminoaacutecido foi maior que sua incorporaccedilatildeo em
proteiacutenas e outros compostos (OCHOA de ALDA et al 1996)
O meio de cultura convencional para a obtenccedilatildeo da S platensis utiliza sais de
nitrato como fonte de nitrogecircnio como por exemplo nitrato de potaacutessio e nitrato de
soacutedio Fontes alternativas de nitrogecircnio como ureacuteia (DANESI et al 2002 SOLETTO
et al 2005) e sais de amocircnio (CARVALHO et al 2004 SOLETTO et al 2005)
estatildeo sendo pesquisadas com a finalidade de diminuir os custos na produccedilatildeo
industrial Ambos o tipo e a quantidade da fonte de nitrogecircnio no meio de cultura
influenciam no crescimento e composiccedilatildeo da biomassa (STANCA POPOVICI
1996)
Considerando a substituiccedilatildeo de KNO3 por ureacuteia verifica-se que eacute altamente
vantajosa pois o custo desta eacute muito menor que a de KNO3 e aleacutem disso a ureacuteia eacute
facilmente assimilada por S platensis provavelmente devido agrave sua hidroacutelise no meio
de cultivo com formaccedilatildeo de amocircnia seja devido agrave accedilatildeo da urease (CARVAJAL et
al 1982) seja devido agrave alcalinidade do meio de cultivo (DANESI et al 2002
RANGEL-YAGUI et al 2004)
Soletto et al (2005) comparando o crescimento da S platensis no processo
descontiacutenuo observaram que o uso de ureacuteia como fonte de nitrogecircnio proporcionou
uma maior concentraccedilatildeo celular quando comparado com o sulfato de amocircnio Nesse
mesmo trabalho observaram que o melhor crescimento cineacutetico da S platensis foi
utilizando o processo descontiacutenuo alimentado com ureacuteia quando comparada com o
nitrato de soacutedio Portanto o uso de ureacuteia como uma fonte de nitrogecircnio mais
econocircmica pode ser uma alternativa interessante no cultivo de S platensis
41
Bezerra et al (2008) observaram que o emprego do processo descontiacutenuo
alimentado utilizando cloreto de amocircnio como fonte de nitrogecircnio pode ser uma
alternativa viaacutevel para o cultivo de S platensis natildeo influenciam nos teores proteacuteicos
e lipiacutedicos da biomassa final
242 Intensidade luminosa
A intensidade luminosa eacute um importante fator que interfere no crescimento
dos micro-organismos fotossintetizantes A luz absorvida por pigmentos direciona o
transporte de eleacutetrons fotossinteacutetico na qual resulta na reduccedilatildeo do NADP+ e
formaccedilatildeo de ATP (YANG et al 2000)
A soma da luz absorvida pelas ceacutelulas no fotobiorreator depende de muitos
fatores incluindo posiccedilatildeo especiacutefica da ceacutelula num determinado instante densidade
da cultura e pigmentaccedilatildeo das ceacutelulas (RUBIO et al 2003)
Um dos modos de obtenccedilatildeo de energia para o metabolismo da S platensis eacute a
fotossiacutentese e para a sua realizaccedilatildeo eacute necessaacuterio aacutegua dioacutexido de carbono e luz
No processo fotossinteacutetico ocorre o fenocircmeno de captaccedilatildeo de luz e outro conhecido
como oxido-reduccedilatildeo (NELSON YOCUM 2006)
A absorccedilatildeo da luz na faixa de 400-700 nm por pigmentos fotossinteacuteticos
absorve a energia de um foacuteton de dado comprimento de onda e entatildeo utiliza essa
energia para iniciar uma cadeia de eventos da fase fotoquiacutemica da fotossiacutentese
Esses pigmentos tais como clorofila carotenoacuteides e bilinas estatildeo organizados em
complexos fotossinteacuteticos e tecircm a funccedilatildeo de antenas captadoras de luz Centenas
de pigmentos antenas funcionam juntos para direcionar o processo para as etapas
seguintes ou dissipam o excesso de energia para diferentes rotas (ADIR et al
2003)
A faixa do espectro de absorccedilatildeo que eacute utilizada pelos organismos
fotossintetizantes como fonte de energia para as suas atividades metaboacutelicas eacute
comumente chamada de Radiaccedilatildeo Fotossinteticamente Ativa (PAR do inglecircs
Photosynthetically Active Radiation) A Densidade de Fluxo de Foacutetons (PPFD do
inglecircs Photosynthetic Photon Flux Density) cuja unidade eacute micromol de foacutetons m-2 s-1
expressa a irradiacircncia nesta faixa do espectro
A fotossiacutentese oxigecircnica eacute catalizada por quatro complexos proteiacutenas-
membranas formadas pelo fotossistema II (FSII) citocromo bf fotossistema I (FSI) e
42
ATP sintetase Esses complexos estatildeo arranjados nas membranas tilacoacuteidais que
nas cianobacteacuterias distribuem-se de forma concecircntrica ou irregular no citossol
(NELSON YOCUM 2006)
Os fotossistemas satildeo os complexos responsaacuteveis pela conversatildeo da energia
luminosa em energia quiacutemica Nos organismos que realizam fotossiacutentese oxigecircnica
existem dois fotossistemas agindo em seacuterie o fotossistema I (FSI) e o fotossistema II
(FSII) O fotossistema II (FSII) eacute definido como aacutegua-plastoquinona oxidoredutase
pois catalisa a transferecircncia de eleacutetrons entre a aacutegua e a plastoquinona o complexo
citocromo b6f eacute definido como plastoquinonandashplastocianina oxidoredutase
fotossistema I (FSI) como uma plastocianinandashferredoxina oxidoredutase e a ATPase
ou ATP sintetase que funciona como uma forccedila proacuteton motriz que direciona a
siacutentese de ATP (NELSON YOCUM 2006) (Figura 3)
Figura 3 Complexos fotossinteacuteticos em membranas de tilacoacuteides Fonte httpwwwportalsaofranciscocombralfafotossintesehistorico-da-fotossintesephp
Os FSI e FSII contecircm clorofilas e outros pigmentos que absorve a energia
luminosa e as direcionam para o centro de reaccedilatildeo (RC) (Figura 4) O centro de
reaccedilatildeo fotossinteacutetico do FSI possui proteiacutenas com o centro contendo agregados de
Ferro-enxofre (Fe-S) como uacuteltimo aceptor de eleacutetrons e o FSII possui quinona como
uacuteltimo aceptor de eleacutetrons (HEATHCOTE et al 2003) A energia capturada pelo
centro de reaccedilatildeo induz a excitaccedilatildeo de um par especial de clorofila na qual inicia a
translocaccedilatildeo de um eleacutetron atraveacutes da membrana Aacutegua doadora de eleacutetrons para
esse processo eacute oxidada fotoquimicamente a O2 liberando 4 H+ e 4 eleacutetrons pelo
centro fotooxidativo do FSII (P680) Este eacute responsaacutevel pela conversatildeo da energia
luminosa em energia de oxido-reduccedilatildeo (McEVOY et al 2005)
43
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do fotossistema Adaptaccedilatildeo Fontehttpkentsimmonsuwinnipegcacm1504lightreacthtm
Os eleacutetrons extraiacutedos da aacutegua satildeo lanccedilados para quinona (PQ) formando
quinona reduzida (PQH2) (BARBER 2006) A quinona reduzida tambeacutem conhecida
como quinol pode se dissociar do centro de reaccedilatildeo e difundir ateacute o complexo
citocromo b6f O complexo citocromo b6f transfere eleacutetrons da quinona reduzida
(PQH2) ateacute a plastocianina que eacute uma proteiacutena perifeacuterica moacutevel que conteacutem cobre e
que tem como principal funccedilatildeo transferir eleacutetrons do citocromo b6f ateacute o P700 centro
de reaccedilatildeo do Fotossistema I Esse processo permite a transferecircncia de proacutetons da
face externa para a face interna da membrana tilacoidal e a criaccedilatildeo de gradiente
eletroquiacutemico de proacutetons atraveacutes da membrana Energia luminosa absorvida pelo
FSI (P700) induz a transferecircncia de eleacutetrons da plastocianina localizada na face
interna da membrana para a ferredoxina localizada na face externa (NELSON
BEN-SHEM 2002) Outra proteiacutena associada ao Fotossistema I eacute a flavoproteiacutena
ferredoxina-NADP oxidoredutase que reduz o NADP+ a NADPH2 completando a
sequumlecircncia do transporte natildeo-ciacuteclico de eleacutetrons que comeccedila com a oxidaccedilatildeo da
moleacutecula de aacutegua (NELSON YOCUM 2006) A reduccedilatildeo da ferredoxina eacute
subsequentemente usada em numerosas reaccedilotildees de siacutentese e ciclos regulatoacuterios
incluindo assimilaccedilatildeo de nitrato desnaturaccedilatildeo de aacutecido graxo e produccedilatildeo de
NADPH (McCARTY et al 2000 CHITNIS 2001) Essas reaccedilotildees soacute ocorrem na
presenccedila de luz Independentemente da presenccedila de luz a reduccedilatildeo do CO2 a
44
carboidratos ciclo de Calvin ocorre devido a presenccedila de ATP e NADPH (NELSON
YOCUM 2006)
A diferenccedila de carga entre FSI e o FSII juntamente com a transferecircncia de
eleacutetrons atraveacutes do complexo citocromo b6f induz a formaccedilatildeo de um potencial
eletroquiacutemico atraveacutes da membrana na qual potencializa a siacutentese de ATP por um
complexo de quatro proteiacutenas denominadas de ATPase (McCARTY et al 2000)
Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da fase fotoquiacutemica Adaptado Fonte httpwwwuiceduclassesbiosbios100lecturesf04amlect10htm
O controle metaboacutelico do consumo de energia isto eacute a soma de energia
capturada pelo aparato fotossinteacutetico e estocada na forma de energia quiacutemica a
taxa de fixaccedilatildeo do carbono e a produccedilatildeo de biomassa eacute um processo mediado por
enzimas Isto implica que a taxa maacutexima do consumo de energia depende da
natureza do micro-organismo (RUBIO et al 2003) A reaccedilatildeo de captura de luz eacute
muito mais raacutepida que as reaccedilotildees subsequumlentes mediada por enzimas a taxa
maacutexima da fotossiacutentese deve ser controlada pela concentraccedilatildeo de uma das enzimas
do ciclo de Calvin (SUKENIK et al 1997 RUBIO et al 2003)
Alguns autores como Hirata et al (1998) e Chojnacka Noworyta (2004a)
identificaram regiotildees que correlacionam o crescimento da Arthrospira ssp e a
intensidade luminosa Essas regiotildees satildeo
Regiatildeo limitada por luz baixa intensidade luminosa onde ocorre um aumento
da concentraccedilatildeo celular com um aumento da intensidade luminosa
Regiatildeo saturada por luz alta intensidade luminosa onde o crescimento celular
independe da intensidade luminosa
Regiatildeo inibida por luz a intensidade luminosa eacute muito alta inibindo o
crescimento celular e ateacute mesmo pode provocar a morte celular
45
A intensidade luminosa eacute fundamental para que ocorra o metabolismo
fotossinteacutetico mas por outro lado altas intensidades luminosas podem danificar o
complexo fotossinteacutetico levando a morte celular Esse processo eacute denominado de
fotoinibiccedilatildeo (RUBIO et al 2003) O excesso de luz pode danificar o centro de
reaccedilatildeo dos fotossitemas II (SAMUELSSON 1985 LU VONSHAK 1999) eou
fotossistema I (SONOIKE 1996)
A fotoinibiccedilatildeo eacute um estado de estresse fisioloacutegico que ocorre em todos os
organismos fotossintetizantes envolvendo o oxigecircnio causado devido a um excesso
de iluminaccedilatildeo A danificaccedilatildeo ocorre primeiramente no centro de reaccedilatildeo do
fotossistemas II reduzindo abruptamente a eficiecircncia do transporte de eleacutetrons
fotossinteacutetico somente quando a taxa da danificaccedilatildeo excede ao do seu reparo na
qual requer o turnover da siacutentese das proteiacutenas do PSII A inibiccedilatildeo pela luz pode
envolver a participaccedilatildeo de todas as atividades realizadas pelo sistema fotossinteacutetico
tais como degradaccedilatildeo e substituiccedilatildeo dos componentes e organizaccedilatildeo da unidade
funcional (ADIR et al 2003)
A fotoinibiccedilatildeo ocorre quando o sistema antena absorve luz em excesso
danificando o sistema fotossinteacutetico O excesso de excitaccedilatildeo pode ser obtido por um
aumento da intensidade luminosa acima do niacutevel de saturaccedilatildeo da taxa fotossinteacutetica
(CHOJNACKA NOWORYTA 2004a) Portanto isso tambeacutem pode ocorrer em
condiccedilotildees moderadas de intensidade luminosa se as ceacutelulas adaptadas a baixa
intensidade luminosa forem transferidas a maiores intensidade luminosas (RUBIO et
al 2003) ou se taxa fotossinteacutetica estiver limitada por fatores de estresse como
baixas temperaturas (GOMBOS et al 1994) eou excesso de sal no meio (LU
ZHANG 2000) o que pode induzir a fotoinibiccedilatildeo em condiccedilotildees de luz moderada
(SAMUELSSON 1985)
A danificaccedilatildeo do fotossistema II consiste na inativaccedilatildeo dos sistemas que
envolvem oxigecircnio carreadores de eleacutetrons e proteiacutenas D1D2 (RUBIO et al 2003)
No FSI a inibiccedilatildeo eacute iniciada pela inativaccedilatildeo do aceptor de eleacutetrons seguindo com a
destruiccedilatildeo do centro de reaccedilatildeo e degradaccedilatildeo do produto do gen psaB que eacute uma
das duas maiores subunidades peptiacutedicas do complexo do centro de reaccedilatildeo do FSI
Baixas temperaturas e estresse oxidativos satildeo caracteriacutesticas requeridas para a
fotoinibiccedilatildeo do FSI in vivo (SONOIKE 1996)
Adir et al (2003) relataram que a fotoinibiccedilatildeo eacute observada tanto sob altas
intensidades luminosas quando o mecanismo de reparo de proteiacutenas atinge sua
46
capacidade maacutexima ou em baixa intensidade luminosa quando fatores externos
adicionais prejudicam seu reparo e a exposiccedilatildeo a alta intensidade luminosa
prolongada induz a um excesso de efeitos secundaacuterios que contribui para uma
reduccedilatildeo na capacidade fotossinteacutetica
Fatores como efeito sombreamento em culturas densas de ceacutelulas a remoccedilatildeo
de O2 e o aumento da concentraccedilatildeo de CO2 podem proteger os micro-organismos
contra o efeito fotooxidativo (ELOFF et al 1976)
Van Eykelenburg (1979) observou que a intensidade luminosa natildeo afeta as
caracteriacutesticas morfoloacutegicas como o tamanho da heacutelice e o diacircmetro da S platensis
e que a concentraccedilatildeo dos gracircnulos de poliglicano diminui com o aumento da
intensidade luminosa
Bezerra et al (2008) observaram que os teores de lipiacutedios e proteiacutenas obtidos
nas biomassas finais foram influenciados pela intensiade luminosa menores
intensidades luminosas conduziram a um aumento no conteuacutedo total de lipiacutedios e de
proteiacutenas
2421 Pigmentos
Para a energia luminosa ser utilizaacutevel pelos organismos fotossinteacuteticos ela
deve inicialmente ser absorvida por pigmentos especiacuteficos tais como clorofila
carotenoacuteides e ficobilinas Esses pigmentos encontram-se associados a proteiacutenas
nas lamelas fotossinteacuteticas formadas por tilacoacuteides Isso permite uma disposiccedilatildeo
espacial que torna muito eficiente a propagaccedilatildeo de energia absorvida (MARZOCCO
TORRES 1999)
Nas cianobacteacuterias tais como A platensis a fotossiacutentese ocorre principalmente
nas membranas tilacoidais onde estatildeo localizados os pigmentos fotossitneacuteticos
clorofila a carotenoacuteides e ficocianina (COGNO et al 2003) As lamelas tilacoidais
satildeo duas linhas paralelas em formato de disco fechado onde estatildeo localizados a
clorofila celular (clorofila a) e os carotenoacuteides (VAN YKELENBURG 1979)
O aparato fotossinteacutetico das cianobacteacuterias consiste principalmente de trecircs
tipos de complexos macromoleculares fotossistema I fotossistema II e os
ficobilissomos O FSI e o FSII satildeo complexos intriacutensecos onde os ficobilissomos
estatildeo sobre a superfiacutecie externa dos tilacoiacutedes na forma de esferas (GANTT 1981
LIU et al 2005) Os ficobilissomos auxiliam na absorccedilatildeo da energia luminosa em
47
um intervalo do espectro maior que as clorofilas absorvem (500-680 nm) permitindo
as espeacutecies que possuem essas antenas a utilizar todo o intervalo da luz visiacutevel
emitido pelo sol (KUMAR MURHTY 2007)
Os ficobilissomos estatildeo unidos nas lamelas tilacoiacutedais e funcionam como
antenas captadoras de luz que transferem a energia excitante para o centro de
reaccedilatildeo dos fotossistemas (VAN EYKELENBURG 1979) A maior parte da energia
luminosa eacute absorvida por complexos pigmentos-proteiacutenas chamados de
ficobilissomos Os componentes dos ficobilissomos as ficobiliproteiacutenas satildeo
responsaacuteveis pela pigmentaccedilatildeo verde-azulada da maioria das cianobacteacuterias Os
ficobilissomos satildeo agregados de alto peso molecular compostos por ficocianina
aloficocianina e ficoeritrina (com pico de absorbacircncia de 615 nm 650 nm e 565 nm
respectivamente) Com o aumento da intensidade luminosa os ficobilissomos satildeo
menos abundantes (VAN EYKELENBURG 1979)
As ficobiliproteiacutenas presentes nos gracircnulos de ficobilissomos podem constituir
mais de 60 de proteiacutena soluacutevel em cianobacteacuterias (HOUMARD 1994) Isso eacute o
que caracteriza a Spirulina spp por ser comercializada como um suplemento
alimentar rico em proteiacutenas (TANDEAU de MARSAC HOUMARD 1993) As
ficobiliproteinas purificadas possuem uma variedade de funccedilotildees como substituinte
de corantes sinteacuteticos em alimentos e produtos cosmeacuteticos sondas para meacutetodos de
imunodiagnoacutesticos citometria de fluxo e microscopia de fluorescecircncia (STANIER e
COHEN-BAZIRE 1977 SPOLAORE et al 2006)
As maiores classes da ficobiliproteinas satildeo ficoeritrina (PE) ficoeritrocianina
(PEC) ficocianina (PC) e aloficocianina (APC) (CIFERRI 1983) A absorccedilatildeo
maacutexima satildeo 540ndash570 570ndash590 610ndash620 e 650ndash655 nm para PE PEC PC e APC
respectivamente (STANIER COHEN-BAZIRE 1977 CIFERRI 1983)
Aleacutem das ficobiliproteiacutenas as cianobacteacuterias contecircm as clorofilas e os
carotonoacuteides para absorccedilatildeo de energia luminosa Entre os carotenoacuteides encontram-
se o β-caroteno o mais importante e as xantofilas que satildeo carotenos oxigenados
(MARZZOCO TORRES 1999)
As clorofilas satildeo os pigmentos naturais presentes nas plantas cianobacteacuterias e
algas O nome clorofila foi proposto por Pelletier e Caventou em 1818 para
designar a substacircncia verde que se podia extrair das folhas com o auxiacutelio do aacutelcool
Atualmente os pigmentos clorofilianos satildeo de grande importacircncia comercial
podendo ser utilizados tanto como pigmentos quanto como antioxidantes Os
48
pigmentos fotossinteacuteticos presentes e a sua abundacircncia variam de acordo com a
espeacutecie A clorofila a (Chl a) estaacute presente em todos os organismos que realizam
fotossiacutentese oxigecircnica As bacteacuterias fotossintetizantes satildeo desprovidas de clorofila a
e possui em seu lugar a bacterioclorofila como pigmento fotossinteacutetico A Chl a eacute o
pigmento utilizado para realizar a fotoquiacutemica (o primeiro estaacutegio do processo
fotossinteacutetico) enquanto que os demais pigmentos auxiliam na absorccedilatildeo de luz e na
transferecircncia da energia radiante para os centros de reaccedilatildeo sendo assim chamados
de pigmentos acessoacuterios (STREIT et al 2005) As cianobacteacuterias possuem clorofila
a e ficobilinas mas natildeo possuem a clorofila b (GRIFFITHS 2006)
As clorofilas satildeo as moleacuteculas fotorreceptoras mais importantes Satildeo moleacuteculas
formadas por complexos derivados da porfirina tendo como aacutetomo central o Mg
(magneacutesio) (Figura 6) Esse composto eacute uma estrutura macrociacuteclica assimeacutetrica
totalmente insaturada constituiacuteda por quatro aneacuteis de pirrol Esses aneacuteis numeram-
se de 1 a 4 ou de ldquoardquo a ldquodrdquo de acordo com o sistema de numeraccedilatildeo de Fisher
(SCHOEFS 2002) A clorofila a o anel de porfirina conteacutem um grupo metil (-CH3) no
Carbono 3 A estrutura quiacutemica da clorofila estaacute representada na Figura 6
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da moleacutecula da clorofila a Fontehttp1381926868bioCoursesbiochem2PhotosynthesisPhotosynthesis1html
Os pigmentos que absorvem luz fazem parte de complexos proteacuteicos que
atravessam a membrana tilacoidal denominados de fotossistemas Esses satildeo
unidades funcionais das reaccedilotildees da fotossiacutentese Cada fotossistema pode conter
vaacuterias moleacuteculas de clorofila carotenoacuteides e ficobilinas todas capazes de absorver
luz por isso denominada de moleacuteculas-antena Os carotenoacuteides e as ficobilinas
apresentam absorccedilatildeo em regiatildeo do espectro luminoso em que as clorofilas
49
absorvem pouco e isso permite a ampliaccedilatildeo do espectro luminoso utilizado na
fotossiacutentese (MARZOCCO TORRES 1999)
A composiccedilatildeo de pigmentos da Spirulina eacute tiacutepica de uma cianobacteacuteria a uacutenica
clorofila presente eacute a clorofila a que tem seu peso variando entre 08 e 15 do
peso seco As proteiacutenas que possuem maior potencial econocircmico satildeo as
biliproteiacutenas Nas Spirulinas existem duas biliproteiacutenas c-ficonianina e a
aloficocianina A fraccedilatildeo proteacuteica pode conter mais de 20 de ficocianina um
pigmento azul soluacutevel em aacutegua (VONSHAK 1997) Entre os carotenoiacutedes 67-79 eacute
constituiacutedo do β-caroteno As maiorias dos carotenoacuteides da Spirulina satildeo β-caroteno
β-cryptoxantina e zeaxantina (LORENZ 1999)
Os carotenoacuteides carotenos e xantofilas aleacutem de sua funccedilatildeo de absorver
energia luminosa satildeo capazes de dissipar a energia de excitaccedilatildeo excedente na
forma de calor evitando danos ao aparato fotossinteacutetico Enquanto que como
transdutores de energia ateacute o centro de reaccedilatildeo natildeo satildeo muito eficiente (30 - 40
de eficiecircncia) como dissipadores de energia absorvida em excesso pela clorofila
satildeo altamente eficientes (MANRIQUE 2003)
A zeaxantina eacute capaz de receber a energia diretamente da clorofila excitada e
dissipa-laacute posteriormente na forma de calor sem emissatildeo de radiaccedilatildeo O processo
se inverte quando a luz desaparece ou vai se tornando menos intensa
progressivamente finalizando o ciclo A dissipaccedilatildeo da energia eacute devido a
zeaxantina (MANRIQUE 2003)
Os pigmentos acessoacuterios satildeo fundamentais para a realizaccedilatildeo da fotossiacutentese
pelos organismos Algas que possuem apenas a clorofila a como Ochromonas
malhamensis e a Nannochloris oculata crescem mais rapidamente em presenccedila de
substrato orgacircnico que em presenccedila apenas da luz como fonte de energia mesmo
sob condiccedilotildees oacutetimas de luz Os pigmentos acessoacuterios atuam somente absorvendo
energia contribuindo para a fotossiacutentese (BRODY BRODY 1962)
No entanto a captaccedilatildeo de energia para a funccedilatildeo fotossinteacutetica natildeo eacute a uacutenica
funccedilatildeo dos pigmentos fotossinteacuteticos estes satildeo sistemas fotoprotetores quando a
intensidade luminosa eacute excessiva Quando nem todos os foacutetons absorvidos pela
clorofila podem ser utilizados no processo fotoquiacutemico eacute desencadeado um
mecanismo para dissipar o excesso de energia e evitar danos as membranas
fotossinteacuteticas e a proacutepria clorofila resultando em um branqueamento das ceacutelulas
com uma consequumlente reduccedilatildeo ou perda da capacidade fotossinteacutetica Na presenccedila
50
de excesso de luz o oxigecircnio reage com a clorofila excitada originando um oxigecircno
singlete que eacute muito mais reativo podendo oxidar as clorofilas (branqueamento) os
aacutecidos graxos polinsaturados que forma peroacutexidos e outros compostos Entatildeo os
carotenoacuteides dissipam o radical peroacutexido e tambeacutem a clorofila excitada adquirindo o
estado triplete que por sua vez se dissipa despreendendo calor para o meio externo
(MANRIQUE 2003)
243 Fontes de carbono
De acordo com Chojnacka e Maacuterquez-Rocha (2004b) a fonte de carbono
empregada e a utilizaccedilatildeo ou natildeo de energia luminosa podem classificar os cultivos
em
Cultivo heterotroacutefico ndash emprego exclusivo de compostos orgacircnicos como fonte
energeacutetica O carbono orgacircnico serve tanto como fonte energeacutetica quanto para a
formaccedilatildeo da biomassa
Cultivo autotroacutefico (ou fotoautotroacutefico) ndash emprego da luz como exclusiva fonte
energeacutetica para a reduccedilatildeo (fixaccedilatildeo) do CO2 (considerado de fonte inorgacircnica)
formando substacircncias orgacircnicas
Cultivo mixotroacutefico ndash utilizaccedilatildeo simultacircnea de uma fonte luminosa e carbono
orgacircnico como fonte de energia
2431 Fonte de carbono orgacircnico (crescimento hetorotroacutefico)
A A platensis cresce principalmente em meios de cultura contendo carbono
inorgacircnico e poucos trabalhos tecircm sido publicados utilizando apenas fonte de
carbono orgacircnico Como fonte orgacircnica de carbono os accediluacutecares satildeo os substratos
mais utilizados para os cultivos heterotroacuteficos e mixotroacuteficos (ZHANG et al 1998
MARQUEZ et al 1993 CHOJNACKA NOWORYTA 2004b MUumlHLING et al 2005
ANDRADE COSTA 2007)
Ogawa and Terui (1970) foram os primeiros a relatar que uma cultura axecircnica
de Spirulina platensis cresce em meio mineral enriquecido com 1 de peptona e
tem uma taxa de crescimento maior que as culturas cultivadas em meio mineral
Marquez et al (1993) relataram que a Spirulina platensis cresce heterotroficamente
sob glicose em condiccedilotildees aeroacutebias no escuro bem como mixotroficamente na
presenccedila de luz Chojnacka e Noworyta (2004a) tambeacutem observaram o crescimento
51
da S platensis em condiccedilotildees heterotroacuteficas utilizando a glicose com fonte de
carbono e energia
S platensis podem utilizar tambeacutem glicerol como a uacutenica fonte de carbono no
entanto as ceacutelulas quando em contato com o glicerol pela primeira vez formam
agregados de ceacutelulas e passam por uma fase lag de adaptaccedilatildeo Apoacutes a sua sub-
cultura as ceacutelulas cresceram utilizando glicerol atingido 1287 mg L-1 e nos cultivos
com apenas bicarbonato como fonte de carbono obteve 1157mg L-1 (NARAYAN et
al 2005)
Por outro lado Soundarapandian e Vasanthi (2008) relataram que diferentes
cepas de S platensis isoladas de solo satildeo incapazes de utilizar apenas fontes de
carbono orgacircnico como D-glucose manitol sacarose e ureacuteia
2432 Fonte de carbono inorgacircnico (Crescimento autotroacutefico)
Microalgas fototroacuteficas requerem CO2 como fonte de carbono e este contribui
para o controle do pH no meio O pH do meio de cultivo eacute um dos fatores mais
importantes no cultivo de algas O pH determina a solubilidade do dioacutexido de
carbono e minerais no meio e influencia direta ou indiretamente o metabolismo das
algas O pH depende de vaacuterios fatores como composiccedilatildeo e capacidade tamponante
do meio quantidade de dioacutexido de carbono dissolvido temperatura (que determina a
solubilidade do CO2) e atividade metaboacutelica das ceacutelulas (BECKER 1995)
A fonte de carbono principal para a A platensis eacute o iacuteon bicarbonato no qual
entra na ceacutelula por transporte ativo O bicarbonato intracelular eacute entatildeo desidratado
via anidrase carbonica para CO2 o qual eacute incorporado no ciclo de Calvin via
ribulose-15-bifosfato carboxilase (RUBISCO) Este carbono eacute usado
simultaneamente para a siacutentese de todas as macromoleacuteculas nas ceacutelulas (proteiacutenas
carboidratos lipiacutedios e aacutecidos nucleacuteicos) a partir do 3-fosfoglicerato como metaboacutelito
intermediaacuterio (COGNE et al 2003)
Durante o cultivo autotroacutefico da Spirulina sp ocorre um raacutepido aumento do pH
no meio de cultura e isso eacute causado pela dissociaccedilatildeo do aacutecido carbocircnico (H2CO3)
em bicarbonato (HCO3-) e OH- (KIM et al 2007) e o bicarbonato eacute dissociado para
produzir CO2 e OH- (RICHMOND GROBBELAAR 1986) O aumento do pH atua
como um autoinibidor do crescimento celular (RICHMOND 2000) e portanto o CO2
pode ser utilizado para a manutenccedilatildeo do pH oacutetimo
52
Em cianobacteacuterias alcalofiacutelicas onde o pH de crescimento tiacutepico eacute 10 a
concentraccedilatildeo de CO2 eacute negligenciada sugerindo que o transporte de CO2 passivo
natildeo poderia contribuir significativamente para carbono inorgacircnico intracelular
Adicionalmente estudos tecircm mostrado que A platensis eacute fortemente dependente do
transporte simporte Na+HCO3- para a assimilaccedilatildeo do carbono inorgacircnico Como eacute
tiacutepico de alcalofiacutelicos a A platensis aparentemente natildeo manteacutem o gradiente de pH
externo positivo na sua membrana plasmaacutetica Consequentemente ocorre uma
extrusatildeo de soacutedio via bomba de soacutedio dependente de ATP em contraste com o
tranporte antiporte Na+H+ na maioria das cianobacteacuterias A Extrusatildeo de soacutedio na
presenccedila de um inibidor do FSII (diuron) indica que uma soma significante de ATP eacute
suplementada pelo transporte de eleacutetrons ciacuteclico em volta do FSI conteuacutedo na qual
em A platensis eacute excepcionalmente alto (BERRY et al 2003)
Anaacutelises quiacutemicas tecircm mostrado que biomassa algal consiste de 40 a 50 de
carbono na qual sugere que 15 a 2 kg de CO2 satildeo necessaacuterios para produzir 1 kg
de biomassa (SOBCZUK et al 2000) Do mesmo modo Chisti (2007) relata que
considerando que a biomassa microalgal possui aproximadamente 50 de carbono
em sua biomassa seca (SAacuteNCHEZ MIROacuteN et al 2003) todo esse carbono eacute
derivado do dioacutexido de carbono A produccedilatildeo de 100 toneladas de biomassa algal fixa
em torno de 183 toneladas de dioacutexido de carbono e este deve ser suplementado
continuamente durante o cultivo iluminado A adiccedilatildeo controlada do CO2 em
respostas aos sinais de sensores de pH minimizam a perda de CO2 e a variaccedilatildeo do
pH (CHISTI 2007)
O sistema de transporte do CO2 inclui a anidrase carbocircnica que converte o CO2
para HCO3- durante a passagem atraveacutes da membrana plasmaacutetica havendo um
acuacutemulo de HCO3- quando o CO2 eacute suplementado A concentraccedilatildeo de CO2
citoplasmaacutetico eacute abaixo do esperado no equiliacutebrio quiacutemico e de acordo com o
modelo proposto pelo mecanismo de concentraccedilatildeo de carbono esse desequiliacutebrio eacute
relatado pelo fato que a anidrase carbocircnica estaacute localizada dentro dos
carboxissomos na membrana plasmaacutetica eou membranas tilacoacuteidais e estaacute ausente
no citoplasma (KAPLAN REINHOLD 1999)
O CO2 entra na ceacutelula pela difusatildeo passiva e a conversatildeo do CO2 para o HCO3-
pela anidrase carbocircnica natildeo permite a sua passagem livremente para fora da ceacutelula
(CARRIERI et al 2007) A concentraccedilatildeo de CO2 nos carboxissomos eacute de 50000
vezes maior que a concentraccedilatildeo extracelular Isso implica em uma resistecircncia a
53
difusatildeo do CO2 pela membrana bioloacutegica extremamente alta apesar do CO2 ser
altamente permeaacutevel agrave membrana bilipiacutedica Geralmente as algas apresentam um
acuacutemulo de carbono inorgacircnico menor que em cianobacteacuterias isso por que a
RubisCO das algas apresentam maior afinidade pelo CO2 (KAPLAN REINHOLD
1999)
O CO2 que entra na ceacutelula por difusatildeo passiva eacute convertido para HCO3- pela
ldquoCA-likerdquo por uma reaccedilatildeo dependente de energia e a assimilaccedilatildeo ativa do HCO3-
que eacute contra seu potencial eletroquiacutemico depende do suplemento da energia
metaboacutelica Essa energia necessaacuteria eacute provavelmente dependente do transporte
ciacuteclico do eleacutetron em torno do FSI e da atividade do FSII (SOBCZUK et al 2000)
Portanto isso ainda natildeo tem sido estabelecido se esta dependecircncia eacute direta ou
indireta (via gradiente de iacuteons) A energia metaboacutelica deveria ser utilizada para
manter o gradiente de iacuteon O antiporte Na+H+ estaacute envolvido na regulaccedilatildeo e
manutenccedilatildeo do pH interno durante a entrada do HCO3- e subsequumlente fixaccedilatildeo do
CO2 (KAPLAN REINHOLD 1999)
As microalgas podem fixar carbono a partir de diferentes fontes tais como CO2
a partir da atmosfera CO2 a partir da exaustatildeo de gases industriais e CO2 na forma
de carbonatos soluacuteveis (eg NaHCO3 e Na2CO3) Tradicionalmente microalgas satildeo
cultivadas em reatores fechados ou abertos na qual satildeo aerados ou expostos ao ar
para permitir que a microalgas capturem o dioacutexido de carbono a partir da atmosfera
para o crescimento celular Como a atmosfera conteacutem somente 003 ndash 006 de
CO2 eacute esperado que a limitaccedilatildeo da transferecircncia de massa possa reduzir a
velocidade do crescimento das microalgas (CHELF et al 1993) Por outro lado
gases da exaustatildeo industrial tais como gases de combustatildeo possuem acima de 15
de CO2 fornecendo uma fonte rica de CO2 para o cultivo de microalgas e um
caminho potencialmente mais eficiente para biofixaccedilatildeo de CO2 Outra alternativa eacute
fixar o CO2 pela reaccedilatildeo quiacutemica para produzir carbonatos (exemplo Na2CO3) e usa-
la mais tarde como fonte de carbono para o cultivo de microalgas (WANG et al
2008)
Estudos sobre a eficiecircncia da utilizaccedilatildeo de CO2 por microalgas tecircm sido feitos
com o objetivo de melhorar a produtividade dos fotobiorreatores Morais e Costa
(2007b) observou que uma concentraccedilatildeo de Spirulina sp foi maior em cultivos
alimentados com 6 e 12 CO2 quando comparado ao cultivo utilizando somente o
ar atmosfeacuterico Watabane e Hall (1996) relataram um aumento na produtividade
54
correspondendo a 159 g de biomassa seca m-2 d-1 no cultivo utilizando o
fotobiorreator com air lift com ar enriquecido de CO2 (4)
Gordillo et al (1999) observaram uma reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo celular
maacutexima de S platensis devido a reduccedilatildeo na quantidade de proteiacutenas soluacuteveis
clorofila a carotenoacuteides totais e ficocianina nos cultivos enriquecido com 1 de CO2
em relaccedilatildeo aos cultivos enriquecidos com CO2 atmosfeacuterico (0035) Portanto altas
concentraccedilatildeo de CO2 podem inibir o crescimento dos micro-organismos
Em cultivo fotoautotroacutefico de Chlorella o conteuacutedo de proteiacutenas e pigmentos
foram maiores quando comparada com o cultivo heterotroacutefico (OGBONNA TANAKA
1997)
2433 Fonte de carbono inorgacircnico e orgacircnico simultaneamente
(crescimento mixotroacuteficos)
A presenccedila do metabolismo fotoautotroacutefico e heterotroacutefico simultacircneo tecircm sido
confirmado para o crescimento de microalgas como por exemplo Chlorella vulgaris
(MAacuteRQUEZ et al 1993) Heamatococcus pluvialis (KOBAYASHI et al 1992
MAacuteRQUEZ et al 1993) Chlorella pyrenoidosa (OGBANNA TANAKA 1996)
Euglena gracilis (OGBONNA et al 1999) Phaeodactylum tricornutum (CEacuteRON
GARCIA et al 2000) e cianobacteacuterias como Spirulina platensis (MARQUEZ et al
1995 CHOJANACKA NOWORYTA 2004 ZHANG et al 1998)
Durante o crescimento mixotroacutefico haacute dois processos metaboacutelicos
independentes dentro das ceacutelulas metabolismo fotossinteacutetico e a respiraccedilatildeo
aeroacutebia Nesse tipo de metabolismo a presenccedila do substrato orgacircnico significa que o
crescimento celular natildeo eacute estritamente dependente da fotossiacutentese e ateacute mesmo a
luz pode deixar de ser um fator indispensaacutevel para o crescimento celular
(CHOJNACKA NOWORYTA 2004a)
Eacute interessante notar que o crescimento especiacutefico de algumas microalgas (ex
Chlorella vulgares Haematococus pluvialis) crescendo mixotroficamente eacute a soma
de suas velocidades especiacuteficas de crescimento em culturas fotossinteacuteticas e
heterotroacuteficas (LEE 2001 OGBONNA et al 2000)
Um possiacutevel modo para obter uma alta concentraccedilatildeo de micro-organismos
fotossinteacuteticos eou produtos desses micro-organismos eacute o uso de cultura
mixotroacutefica onde fontes de carbono orgacircnicas e inorgacircnicas satildeo concomitantemente
fornecidas ao biorreator Sob determinadas condiccedilotildees de cultivo ambas a atividade
55
fotoautotroacutefica e a heterotroacutefica podem ocorrer simultaneamente e
independentemente resultando no aumento da velocidade especiacutefica de
crescimento como jaacute referido anteriormente
Maacuterquez et al (1993) relatam que a Spirulina platensis eacute capaz de crescer em
cultivo heterotroacutefico na presenccedila de glicose bem como mixotroficamente na
presenccedila de luz sugerindo que os crescimentos autotroacutefico e heterotroacutefico
funcionam independentemente no crescimento mixotroacutefico Nieva e Valiente (1996)
portanto observaram uma reduccedilatildeo na taxa de fixaccedilatildeo de CO2 em condiccedilotildees de
crescimento mixotroacutefico da Anabaena variabilis sugerindo que alguns aspectos do
metabolismo do CO2 podem ser modulados pela presenccedila de carbono orgacircnico Do
mesmo modo Kang et al (2004) observou que pode existir alguma interaccedilatildeo entre o
metabolismo de carbono orgacircnico e inorgacircnico uma vez que a presenccedila do carbono
inorgacircnico acelerou a assimilaccedilatildeo do carbono orgacircnico durante o cultivo do
Synechococcus spPCC7002 A intensidade luminosa favoreceu o crescimento
mixotroacutefico do Synechocystis sp PCC 6803 utilizando glicose como fonte de
carbono Este fenocircmeno pode ser explicado pelo efeito positivo da luz sobre o
fotossistema I (WANG et al 2002) A via glicoliacutetica o ciclo dos aacutecidos tricarboxiacutelicos
(TCA) e a fosforilaccedilatildeo oxidativa mitocondrial mantiveram alta atividade nos cultivos
de Chlorella pyrenoidosa durante a iluminaccedilatildeo indicando pouco efeito da luz nessas
vias metaboacutelicas Portanto o fluxo atraveacutes da via das pentoses fosfato durante a
iluminaccedilatildeo foi muito pequena devido a regulaccedilatildeo mediada pela luz (YANG et al
2000)
Adicionalmente Maacuterquez et al (1993) concluiacuteram que a Spirulina platensis tem
a habilidade de realizar a fermentaccedilatildeo embora soacute utilize essa estrateacutegia como um
modo de sobrevivecircncia sob condiccedilotildees anaeroacutebicas e no escuro
Nos cultivos de S platensis suplementados com glicose alcanccedilaram o
crescimento maior que nos cultivos sob condiccedilotildees de crescimento fotoautotroacuteficos
(MARQUEZ et al 1995 1993) Chen et al (2006) observaram que a suplementaccedilatildeo
de acetato como fonte de carbono proporcionou um aumento significante da
concentraccedilatildeo celular e da produccedilatildeo de clorofila a luteiacutena -caroteno ficocianina e
aloficocianina quando comparada ao cultivo fotoautotroacutefico
O melaccedilo subproduto da induacutestria de accediluacutecar que conteacutem mais do que 50 de
accediluacutecar tambeacutem pode ser um substrato suplementado de baixo custo na produccedilatildeo
56
industrial para o crescimento mixotroacutefico de Spirulina platensis (ANDRADE COSTA
2007)
O emprego de cultivos mixotroacuteficos pode levar as ceacutelulas agrave siacutentese de
compostos caracteriacutesticos tanto de cultivos fotoautotroacuteficos quanto heterotroacuteficos
como pode implicar em altas taxas de produccedilatildeo de biomassa (CERON GARCIA et
al 2000) Uma vez que num cultivo mixotroacutefico o CO2 e o carbono orgacircnico satildeo
simultaneamente assimilados este tipo de cultivo pode ser o processo mais eficiente
para a produccedilatildeo de biomassa microalgal visto que implica em uma economia na
energia gasta para a siacutentese de todo o aparato fotossinteacutetico e para a fixaccedilatildeo de
carbono (LEE 2004)
25 Produccedilatildeo de CO2 e VOCs proveniente da fermentaccedilatildeo alcoacuteolica
A revoluccedilatildeo industrial e a intesa utilizaccedilatildeo dos combustiacuteveis foacutesseis (carvatildeo
petroacuteleo e gaacutes natural) estatildeo associadas ao elevado niacutevel de vida das sociedades
ocidentais Contudo as reservas de combustiacuteveis foacutesseis satildeo limitadas e a sua
utilizaccedilatildeo tem impactos ambientais consideraacuteveis como por exemplo o aumento do
efeito estufa e as consequumlentes alteraccedilotildees do clima Neste contexto o etanol surge
como uma alternativa vaacutelida em termos de fonte de energia renovaacutevel e menos
poluente
Nas uacuteltimas deacutecadas o etanol tem ocupado um lugar de destaque e de grande
importacircncia tecnoloacutegica firmando-se como um produto estrateacutegico economicamente
por ser amigaacutevel com o meio ambiente pois eacute um aditivo ao combustiacutevel que reduz
a emissatildeo de monoacutexido de carbono oacutexido de nitrogecircnio e hidrocarbonos (WHEALS
et al 1999) e por ser produzido a partir de biomassa renovaacutevel como accediluacutecar e
amido atualmente e materiais de lignocelulose no futuro (GOLDEMBERG 2009)
Inicialmente o objetivo de utilizar o aacutelcool combustiacutevel era se tornar
independente do mercado do petroacuteleo e reduzir os custos de sua importaccedilatildeo Hoje
em dia a ecircnfase do uso do etanol combustiacutevel estaacute sobre a reduccedilatildeo da poluiccedilatildeo
devido ao protocolo de Quioto para limitar o aquecimento global (WHEALS et al
1999) Na produccedilatildeo e combustatildeo do etanol de milho pode reduzir em ateacute 12 a
emissatildeo de gases causadoras do efeito estufa quando comparado com o uso de
combustiacuteveis foacutesseis (HILL et al 2006) e quando utilizado etanol de cana-de-accediluacutecar
essa reduccedilatildeo pode ser de 66 (ANDREOLI SOUZA 2006)
57
O aacutelcool estaacute em expansatildeo por ser um combustiacutevel de baixo custo renovaacutevel e
cujo emprego como alternativa para a matriz energeacutetica mundial estaacute em fase de
crescimento A tendecircncia de aumento da produccedilatildeo de aacutelcool no Brasil ocorre por
vaacuterios fatores como aumento da frota de carros bi-combustiacutevel (demanda interna)
Protocolo de Quioto (demanda externa) e aumento do preccedilo do petroacuteleo Poliacuteticas
similares tecircm sido adotadas pela Uniatildeo Europeacuteia Japatildeo e Estados Unidos
(GOLDEMBERG et al 2007) Por essas razotildees a demanda por etanol no mercado
internacional tem sido crescente nos uacuteltimos anos O Brasil aleacutem de ser um dos
maiores produtores e consumidores de etanol eacute tambeacutem o maior exportador no
cenaacuterio global Segundo dados da Uniatildeo da Induacutestria de Cana de Accediluacutecar (Unica) ateacute
2016 o Brasil produziraacute 129 bilhotildees de litros de etanol para o mercado externo Na
safra 20082009 o total de etanol produzido foi de 275 bilhotildees de litros (UacuteNICA)
O Brasil e os Estados Unidos satildeo liacutederes mundiais na produccedilatildeo de etanol
utilizando como mateacuteria prima a cana de accediluacutecar e milho respectivamente Os dois
paiacuteses acumulam cerca de 70 da produccedilatildeo mundial (ROMERO 2007) Aleacutem disso
o Brasil lidera a produccedilatildeo mundial de cana-de-accediluacutecar (principal mateacuteria-prima do
etanol) sendo essa uma induacutestria que movimenta vaacuterios bilhotildees de doacutelares por ano
O fato de o etanol ser produzido dentro do Brasil representa uma menor
dependecircncia de petroacuteleo externo diminuindo substancialmente os gastos com
importaccedilotildees
O agronegoacutecio da cana-de-accediluacutecar movimenta R$ 40 bilhotildees por ano no paiacutes A
safra 20072008 ficou entre 547 milhotildees de toneladas de cana-de accediluacutecar 152 a
mais do que a safra anterior Metade dela eacute destinada agrave fabricaccedilatildeo de etanol o que
faz do Brasil o segundo maior produtor de combustiacutevel no mundo O primeiro lugar
cabe aos Estados Unidos que extraem etanol de milho a poder de pesados
subsiacutedios Dois terccedilos da produccedilatildeo nacional estatildeo no estado de Satildeo Paulo Avalia-
se que o Brasil precisaraacute dobrar sua produccedilatildeo num horizonte de 5 a 7 anos se
quiser suprir as demandas locais e internacionais do combustiacutevel Isso exigiraacute a
construccedilatildeo de novas usinas o crescimento das aacutereas plantadas melhorias no
manejo e principalmente ganhos de produtividade (MARQUES 2008)
O cenaacuterio futuro mostra que paiacuteses como Estados Unidos Japatildeo e Europa vatildeo
precisar importar mais de 10 bilhotildees de litros de etanol ateacute 201112 Se uma
tonelada de cana produz 88 litros de etanol precisaria adicionar mais de 110
milhotildees de toneladas de cana para atender o mercado futuro o que acrescentaria
58
mais 12 milhotildees de hectares A UNICA (Uniatildeo da induacutestria de cana-de-accediluacutecar)
prevecirc um crescimento da produccedilatildeo de 6 a 7 anualmente chegando a uma
produccedilatildeo de 560 milhotildees de toneladas de cana em 201011 (ANDREOLI SOUZA
2006)
A quantidade de CO2 liberada diretamente para a atmosfera devido ao aumento
da sua produccedilatildeo mundial pode causar prejuiacutezos ao meio ambiente No Brasil a
produccedilatildeo de etanol por processos fermentativos principalmente pelo processo
descontiacutenuo alimentado ou contiacutenuo utilizando mosto de melaccedilo de cana-de-accediluacutecar
eou caldo de cana-de-acuacutecar tem no cultivo da Saccharomyces cerevisiae um
grande impacto no acircmbito socioeconocircmico Existem cerca de 300 induacutestrias que
utilizam fermentaccedilatildeo alcooacutelica no Brasil que movimentam bilhotildees de doacutelares e
geram 6 dos empregos totais do Paiacutes (Uniatildeo da Agroinduacutestria Canavieira de Satildeo
Paulo 2006)
No Brasil 70 das destilarias de cana-de-accediluacutecar usam o processo
descontiacutenuo com uma capacidade fermentativa acima de 15 milhotildees de litros de
etanol por dia e aproximadamente 350 destilarias usam a fermentaccedilatildeo contiacutenua
(WHEALS et al 1999) Estudos comparativos e avaliaccedilotildees econocircmicas de diversos
processos utilizados na produccedilatildeo de etanol concluiacuteram que fermentaccedilatildeo contiacutenua
apresentava uma reduccedilatildeo de 57 no investimento de capital fixo em destilarias
quando comparado ao daquelas que utilizam processo em batelada Uma reduccedilatildeo
ainda maior de 68 e 71 eacute obtida para os processos que utilizam reciclo de ceacutelulas
e operaccedilatildeo a vaacutecuo respectivamente (CYSEWSKI WILKE 1978)
A fermentaccedilatildeo contiacutenua apresenta menor custo de investimento maior
facilidade para a instalaccedilatildeo de sistemas de automaccedilatildeo e ausecircncia de ldquotempos
mortosrdquo que eacute o tempo em dado momento do ciclo fermentativo natildeo estaacute produzindo
tiacutepico de processos descontiacutenuo Aleacutem disso a fermentaccedilatildeo contiacutenua tende a
consumir menos anti-espumante decorrecircncia da alimentaccedilatildeo mais estaacutevel de
accediluacutecar para o processo e tambeacutem da geometria dos fermentadores Por outro lado
a fermentaccedilatildeo contiacutenua apresenta maiores dificuldades quando temos que lidar com
contaminantes indesejaacuteveis no processo Natildeo eacute possiacutevel promover a assepsia de
fermentadores de bombas e de trocadores com frequumlecircncia como ocorre no sistema
em bateladas Desta maneira a fermentaccedilatildeo contiacutenua tende a consumir mais aacutecido
sulfuacuterico e mais antibioacutetico
59
Segundo Romano et al (2003) as transformaccedilotildees quiacutemicas que ocorrem
durante a fermentaccedilatildeo por leveduras satildeo a conversatildeo dos accediluacutecares em etanol e
CO2 e em menores quantidades a formaccedilatildeo de CVOs Basso et al (1996) relata
que durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica por levedura os produtos da fermentaccedilatildeo satildeo
constituiacutedos de 43 ndash 47 de etanol 41 - 45 de gaacutes carbocircnico e o restante satildeo
formados por outros compostos orgacircnicos tais como glicerol aacutecido succiacutenico aacutecido
aceacutetico entre outros Dentre os volaacuteteis orgacircnicos majoritaacuterios produzidos durante a
fermentaccedilatildeo de mosto de cana-de-accediluacutecar por Saccharomyces cerevisiae
encontram-se o etanol acetaldeiacutedo propanol isobutanol aacutelcool isoamiacutelico acetato
de etila (CACHOT et al 1991) Durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica do mosto de cana-
de-accediluacutecar os principais componentes gasosos satildeo o CO2 e o etanol mas outros
aacutelcoois e aacutecidos tambeacutem satildeo liberados em menores quantidades na forma gasosa
(VENTURINI FILHO e MENDES 2003)
A reaccedilatildeo quiacutemica simplificada da produccedilatildeo de etanol a partir da sacarose da
cana-de-accediluacutecar eacute
C12H22O11 +H2O rarr 4C2H5OH + 4CO2 (3)
Onde 342 g de sacarose produz 184 g de etanol e 176 g de CO2 Com isso
pode-se estimar que cada grama de sacarose produz 0514g de CO2 assumindo
uma recuperaccedilatildeo de CO2 em 100 no caso de induacutestrias dedicadas a produccedilatildeo de
etanol No entanto as induacutestrias de produccedilatildeo de etanol tambeacutem utilizam como
mateacuteria-prima o melaccedilo um sub-produto da produccedilatildeo de accediluacutecar industrial a partir
da cana-de-accediluacutecar que conteacutem cerca de 15 da sacarose inicial (MOLLERSTEN et
al 2003) e represeta mais de 75 do custo total de produccedilatildeo de etanol
(CYSEWSKI WILKE 1978)
Cada litro de etanol produzido pela fermentaccedilatildeo alcooacutelica resulta em
aproximadamente 076 kg de CO2 portanto a capacidade de produccedilatildeo de CO2
durante a fermentaccedilatildeo de etanol combustiacutevel nos EUA e o Brasil eacute de
aproximadamente 84 e 106 toneladas de CO2 por ano respectivamente
(KHESHGI PRICE 2005) No Brasil a produccedilatildeo meacutedia de etanol a partir da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica eacute de 180 milhotildees de litros por ano gerando
consequentemente 014 milhotildees de CO2 por ano (MOLLERTEN et al 2003)
O uso do biocombustiacutevel traz uma seacuterie de benefiacutecios associados agrave reduccedilatildeo
dos gases de efeito estufa e de outros poluentes atmosfeacutericos tais como o enxofre
aleacutem da reduccedilatildeo do consumo de combustiacuteveis foacutesseis Poreacutem no processo de
60
fabricaccedilatildeo uma seacuterie de resiacuteduos e subprodutos industriais eacute gerada os quais
podem quando adequadamente geridos contribuir para a viabilidade econocircmica da
produccedilatildeo de biocombustiacuteveis Esses resiacuteduos possuem potencial para uso na
induacutestria de alimentos e para a nutriccedilatildeo animal bem como na induacutestria quiacutemico-
farmacecircutica mas haacute uma grande carecircncia de estudos de anaacutelises de viabilidade
teacutecnica e financeira que possam apontar as melhores alternativas de custo-
benefiacutecio para o processamento e tratamento desses resiacuteduos os quais podem
agregar valor e reduzir os custos de produccedilatildeo de biocombustiacuteveis com o
aproveitamento e venda destes produtos e seus derivados
Um nuacutemero de subprodutos da induacutestria do etanol combustiacutevel pode ter o
potencial para a aplicaccedilatildeo de nutracecircuticos ou de alimentos funcionais que eacute uma
das aacutereas de grande interesse atualmente e representa um mercado potencial
enorme ainda em seu desenvolvimento inicial Por isso o interesse em utilizar
micro-organismos fotossintetizantes devido a sua capacidade de reduzir a emissatildeo
de CO2 e de CVOs na atmosfera subproduto da induacutestria de etanol produzindo
compostos de alto valor industrial
61
3 Objetivos
Geral
Este trabalho tem como objetivo verificar a influecircncia do efeito da adiccedilatildeo de
CO2 proveniente de cilindro ou da fermentaccedilatildeo alcooacutelica mantendo o pH no valor
oacutetimo igual a 95 no cultivo de A platensis em reatores tubulares utilizando nitrato ou
ureacuteia como fonte de nitrogecircnio em diferentes intensidades luminosas
Especiacuteficos
Avaliar os testes preliminares da fermentaccedilatildeo alcoacuteolica contiacutenua utilizada para
posterior acoplamento dos gases liberados durante a fermentaccedilatildeo com os
cultivos de A platensis
Avaliar os paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima produtividade em ceacutelulas
e fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas usando anaacutelise de variacircncia
multivariaacutevel nos cultivos de A platensis
Determinar a composiccedilatildeo centesimal da A platensis no final dos cultivos teor
de proteiacutenas lipiacutedios cinzas e carboidratos usando a anaacutelise de variacircncia
multivariaacutevel
Estudar os paracircmetros bioenergeacuteticos da A platensis durante os cultivos
utilizando CO2 de cilindro avaliando os andamentos em funccedilatildeo do tempo dos
paracircmetros valor teoacuterico da energia de Gibbs dissipada para o crescimento
(1YGX) das produccedilotildees molares de O2 consumo de H+ e absorccedilatildeo de foacutetons
para produzir 1 C-mol de biomassa
Calcular o rendimento teoacuterico da energia fixada pelo aparato fotossinteacutetico
energia transformada em ATP e a energia liberada como calor calculando-se a
partir da energia molar de Gibbs absorvida da luz pelo aparato fotossinteacutetico
Comparar o comportamento celular em duas diferentes configuraccedilotildees de
fotobiorreatores tubulares um horizontal e outro helicoidal
62
4 Materiais e meacutetodos
41 Fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
O CO2 proveniente da fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua foi utilizado como fonte
de carbono para o cultivo de A platensis O desprendimento desse gaacutes do reator foi
arrastar volaacuteteis orgacircnicos formados na fermentaccedilatildeo cujas interferecircncias nos
cultivos de A platensis foram avaliadas Para os cultivos contiacutenuos de fermentaccedilatildeo
alcooacutelica foi utilizado o mosto de melaccedilo de cana-de-accediluacutecar
411 Testes preliminares para emprego da fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
4111 Teste para avaliar a influecircncia do tratamento do melaccedilo na
determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular
Para a realizaccedilatildeo desse teste foi preparada uma suspensatildeo celular de 300g L-1
de levedura uacutemida em aacutegua destilada a partir dessa suspensatildeo foram retirados sob
agitaccedilatildeo 10 mL e adicionados em dois diferentes frascos um contendo 290 mL de
melaccedilo natildeo clarificado (item 41111) e outro contendo 290 mL de melaccedilo
previamente clarificado (item 41112) de modo que a concentraccedilatildeo celular final de
cada frasco tenha 10g L-1 em 300 mL de mosto A partir dessa suspensatildeo foram
retirados 5 mL para a anaacutelise da concentraccedilatildeo celular como descrito no item 4311
41111 Melaccedilo natildeo tratado
O melaccedilo natildeo tratado consiste apenas na sua diluiccedilatildeo com aacutegua potaacutevel e
preparado como descrito no item 41113
41112 Melaccedilo tratado
O tratamento do melaccedilo consistiu de sua preacutevia clarificaccedilatildeo diluiccedilatildeo e
suplementaccedilatildeo adequadas A clarificaccedilatildeo foi realizada com diluiccedilatildeo do melaccedilo pela
adiccedilatildeo de aacutegua potaacutevel em partes iguais e adiccedilatildeo de 15 g de fosfato de soacutedio
monobaacutesico como agente floculante em cada litro da soluccedilatildeo de melaccedilo diluiacutedo
Posteriormente esse melaccedilo diluiacutedo foi autoclavado a 121 ordmC por 10 minutos Apoacutes
o aquecimento foi mantido em repouso no miacutenimo por 48 horas para a
sedimentaccedilatildeo do material em suspensatildeo O melaccedilo clarificado foi entatildeo sifonado
63
pronto para ser diluiacutedo com aacutegua e preparado como descrito no item 41113 sem
a adiccedilatildeo do antibioacutetico O mosto foi esterilizado em autoclave a 121 ordmC durante 30
minutos (PEREGO JUacuteNIOR 1979)
41113 Preparaccedilatildeo do melaccedilo
O melaccedilo foi diluiacutedo ateacute concentraccedilatildeo 170 g L-1 em accediluacutecares redutores totais
(ART) (GUERREIRO et al 1997) e suplementado com ureacuteia na concentraccedilatildeo de 05
g L-1 suficiente para que a fonte de nitrogecircnio natildeo se torne fator limitante da
atividade da levedura (MAGALHAtildeES 1978 CARVALHO 1994 PEREGO-JUNIOR
1979) O pH do mosto foi ajustado em 45 (JONES et al 1981) pela adiccedilatildeo de aacutecido
sulfuacuterico concentrado ou pela adiccedilatildeo de soluccedilatildeo de hidroacutexido de soacutedio 4N Por fim
adicionou-se penicilina V aacutecida (500 UIL) como antibioacutetico (AQUARONE 1960
CARVALHO et al 2003)
4112 Teste para avaliar a homogeneidade do reator
Para a realizaccedilatildeo do teste de homogeneidade foi preparado 10 litros de uma
suspensatildeo celular de 9 g L-1 de levedura em aacutegua destilada e adicionada ao
fermentador Apoacutes 30 minutos de homogeneizaccedilatildeo mecacircnica do material iniciou
uma contiacutenua adiccedilatildeo de aacutegua destilada e retirada da amostra a uma vazatildeo
especiacutefica de alimentaccedilatildeo calculada (Dc) igual a 0124 h-1 No intervalo de 30
minutos em diferentes regiotildees do reator as amostras foram recolhidas para
determinar a concentraccedilatildeo celular A homogeneidade do reator eacute verificada se a
queda da concentraccedilatildeo celular for uma funccedilatildeo exponencial
4113 Teste para determinar a vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo
Foram realizados 3 experimentos com a fermentaccedilatildeo contiacutenua nas condiccedilotildees
descritas no item 415 Os valores de vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo (D) foram 01
h-1 005 h-1 e 0025 h-1
412 Micro-organismo e condiccedilotildees de manutenccedilatildeo
Saccharomyces cerevisiae CCT7150 uma cepa isolada de planta industrial de
fermentaccedilatildeo alcooacutelica nacional (Usina Nova Ameacuterica) e produtora de altas
concentraccedilotildees de etanol a partir de melaccedilo adquirida da Fundaccedilatildeo Andreacute Tosello
foi utilizada nos cultivos contiacutenuos Sua manutenccedilatildeo em tubo de ensaio foi no meio
Sabourand (Merckreg) A cultura foi armazenada sob refrigeraccedilatildeo a 4 ordmC
64
413 Preparo do inoacuteculo
As ceacutelulas de levedura estocada foram multiplicadas em tubos contendo meio
soacutelido Sabourand e incubadas em estufa a 30 ordmC por 24 h Posteriormente as
culturas foram inoculadas com alccedila de platina sob condiccedilotildees asseacutepticas em tubos
contendo 10 mL do meio Sabourand e incubadas em estufa a 30 ordmC por 24 h Cada
tubo por sua vez inoculou um frasco de Erlenmeyer de 500 mL contendo 90 mL de
mosto de melaccedilo de cana-de-accediluacutecar contendo 5 de ART que foi entatildeo incubado
a 30 ordmC por 12 h em agitador rotativo a 400 rpm Decorrido este tempo o conteuacutedo
de 10 frascos de Erlenmeyer preparados com o preacute-inoacuteculo (1 L) foi adicionado agrave
dorna juntamente com o mosto (9 L) nas condiccedilotildees em que se trabalhou no
processo contiacutenuo resultando em um volume uacutetil do fermentador de 10 litros que
deu iniacutecio a uma fermentaccedilatildeo descontiacutenua (PEREGO JUacuteNIOR 1979)
414 Dispositivo para a cultura
Foi utilizado um fermentador fabricado pela INFORs HT com dornas de vidro
de 10 litros de capacidade nominal com controles de temperatura pH niacutevel de
espuma e frequumlecircncia de agitaccedilatildeo com saiacutedas que foram conectadas a uma bomba
peristaacuteltica para alimentaccedilatildeo do mosto e retirada do material durante a fermentaccedilatildeo
contiacutenua
415 Descriccedilatildeo das condiccedilotildees de fermentaccedilatildeo contiacutenua
O cultivo contiacutenuo teve como iniacutecio o cultivo descontiacutenuo como descrito acima
(item 413) A alimentaccedilatildeo contiacutenua do mosto ocorreu apoacutes um periacuteodo de 6 a 8 h
da inoculaccedilatildeo do S cerevisiae na dorna para garantir que o micro-organismo se
encontre na fase exponencial de crescimento A concentraccedilatildeo de accediluacutecares no mosto
de alimentaccedilatildeo foi de 170 g L-1 (GUERREIRO et al 1997) expressa em ART O
mosto foi suplementado com sulfato de amocircnio na concentraccedilatildeo de 1 g L-1 A
temperatura de fermentaccedilatildeo foi mantida a 30 plusmn 1 ordmC (KOCK et al 2000) com
frequumlecircncia do agitador de 500 rpm A vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo foi
determinada em ensaios preliminares (item 61)
65
42 Cultivo de A platensis
421 Micro-organismo e manutenccedilatildeo
Spirulina (Arthrospira) platensis UTEX (1926) foi mantida em meio liacutequido de
cultivo padratildeo para Arthrospira (item 4221) em tubos hermeticamente fechados
422 Meio de cultivo
Foram utilizados dois tipos de meio Um meio padratildeo para o cultivo de
Arthrospira (SCHLOumlSSER 1982) ndash item 4221 com NaNO3 como fonte de
nitrogecircnio que foi utilizado para duas finalidades manutenccedilatildeo do micro-organismo e
preparo do inoacuteculo um meio modificado (item 4122) onde se utilizou ureacuteia como
fonte de nitrogecircnio
4221 Meio padratildeo para cultivo de A platensis
O meio mineral padratildeo foi o de Schloumlsser (1982) cuja composiccedilatildeo por litro de
aacutegua destilada eacute a seguinte
NaHCO3 1361g
Na2CO3 403g
K2HPO4 050g
NaNO3 250g
K2SO4 100g
NaCl 100g
MgSO47H2O 020g
CaCl22H2O 004g
Soluccedilatildeo de metal PIV 6mL
Soluccedilatildeo de micronutrientes Chu 1mL
Vitamina B12 (15g100mL H2O) 1mL
Soluccedilatildeo de metal PIV (em 1 litro de aacutegua destilada)
Na2EDTA 750 mg
FeCl36H2O 97 mg
MnCl24H2O 41 mg
ZnCl2 5 mg
CoCl26H2O 2 mg
Na2MoO42H2O 4 mg
66
Soluccedilatildeo de micronutrientes Chu (em 1 litro de aacutegua destilada)
Na2EDTA 50 mg
H3BO3 618 mg
CuSO45H2O 196 mg
ZnSO47H2O 44 mg
CoCl26H2O 20 mg
MnCl2middot4H2O 12 mg
Na2MoO4middot2H2O 12 mg
4222 Meio modificado
O meio de Schloumlsser (1982) foi utilizado com substituiccedilatildeo do nitrato de soacutedio
por ureacuteia
A massa diaacuteria de ureacuteia adicionada por unidade de volume foi determinada de
acordo com o experimento padratildeo utilizando nitrato de soacutedio como fonte de
nitrogecircnio (descrito no item 5)
423 Preparo do inoacuteculo
A A platensis foi inoculada em 10 mL de meio liacutequido (em tubo de ensaio) em
condiccedilotildees asseacutepticas Depois de 7 dias esse material foi utilizado para inocular
frascos de Erlenmeyer de 500 mL com 200mL de meio de cultivo padratildeo (item
4121) previamente esterilizado por autoclavaccedilatildeo
Os erlenmeyers apoacutes o repique foram imediatamente levados a agitador
rotativo a 100 min-1 (FERRAZ 1986) temperatura de 30 OC e iluminacircncia de 72
mol de foacutetons m-2 s-1 (CARVALHO et al 2004)
O crescimento celular foi acompanhado sendo utilizada para inoacuteculo uma
suspensatildeo de A platensis apoacutes de 6 a 8 dias de cultivo (PELIZER et al 2003) em
crescimento exponencial isenta de contaminaccedilatildeo Nos cultivos utilizando meio
mineral padratildeo a suspensatildeo foi filtrada lavada e ressuspensa em meio de cultivo
padratildeo Nos cultivos utilizando ureacuteia como fonte alternativa de nitrogecircnio a
suspensatildeo foi filtrada lavada com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada do NaNO3 e
ressuspensa em meio de cultivo padratildeo isento de NaNO3 Estas suspensotildees foram o
inoacuteculo para o cultivo no reator tubular onde foram realizados os estudos
empregando NaNO3 como fonte de nitrogecircnio padratildeo e a ureacuteia como fonte
67
alternativa de nitrogecircnio com o pH do cultivo controlado pela adiccedilatildeo de CO2
proveniente de cilindro ou da fermentaccedilatildeo alcooacutelica
424 Dispositivo para cultura
4241 Fotobiorreator tubular horizontal
O fotobiorreator tubular utilizado eacute apresentado na Figura 7 Este eacute constituiacutedo
por 20 tubos de vidro transparentes (diacircmetro interno de 10 cm) (CARLOZZI
PINZANI 2005) com inclinaccedilatildeo de 2 (115ordm) (TREDICI ZITTELLI 1998) para
facilitar o escoamento do liacutequido interligados com mangueiras de PVC de mesmo
diacircmetro interno de forma que o volume iluminado corresponde a 212 litros
(606) O volume total do sistema foi de 35 litros A recirculaccedilatildeo de liacutequido foi de
26 L h-1 para evitar a sedimentaccedilatildeo da biomassa e melhorar a transferecircncia de
massa
Na parte mais baixa dos tubos do reator tubular haacute um tubo na forma de Y que
recebe ar proveniente de uma bomba deslocando a suspensatildeo celular para um
frasco na parte superior provido de agitaccedilatildeo com um agitador magneacutetico Tambeacutem
na parte inferior do reator haacute uma conexatildeo no qual ocorre entrada de CO2 para
manutenccedilatildeo de pH quando da abertura da vaacutelvula solenoacuteide controlada por um
controlador de pH
Figura 7 Fotobiorreator tubular horizontal utilizado no cultivo de A platensis
68
4242 Fotobiorreator tubular espiralado
O fotobiorreator tubular espiralado utilizado eacute apresentado na Figura 8 Este eacute
constituiacutedo por 5 conjuntos de tubos espiralados de vidro transparentes (diacircmetro
interno de 10 cm) (CARLOZZI PINZANI 2005) interligados com mangueiras de
PVC de mesmo diacircmetro interno Cada conjunto eacute constituiacutedo por 3 tubos
espiralados logo o reator conteacutem no total 15 tubos de vidros espiralados de forma
que o volume iluminado corresponde a 665 ml (606 ) O volume total do sistema
foi de 11 litros A recirculaccedilatildeo de liacutequido foi de 26 L h-1 para evitar a sedimentaccedilatildeo
da biomassa e melhorar a transferecircncia de massa
Na parte mais baixa dos tubos do reator tubular haacute um tubo na forma de Y que
recebe ar proveniente de uma bomba deslocando a suspensatildeo celular para um
frasco na parte superior Tambeacutem na parte inferior do reator haacute uma conexatildeo no
qual ocorre entrada de CO2 para manutenccedilatildeo de pH
Figura 8 Fotobiorreator tubular espiralado utilizado no cultivo de A platensis
425 Descriccedilatildeo de um experimento tiacutepico de cultivo da A platensis
A suspensatildeo de Arthrospira (item 43) foi adicionada ao biorreator tubular na
concentraccedilatildeo inicial de 400 mg L-1 (SOLETTO et al 2008) e o volume de trabalho
foi de 35 L no fotobiorreator tubular horizontal e de 11 L no fotobiorreator tubular
espiralado Devido a evaporaccedilatildeo e a retirada de amostras o meio de cultura isento
da fonte de nitrogecircnio foi adicionado para manter o volume constante
69
Nos experimetos utilizando NaNO3 como fonte de nitrogecircnio a concentraccedilatildeo
inicial deste foi de 25 g L-1 e ocorreram adiccedilotildees do nitrato de soacutedio de modo que sua
concentraccedilatildeo natildeo fosse inferior a 1 g L-1 (FAINTUCH 1989) desta forma evitaria a
limitaccedilatildeo do crescimento celular pela fonte de nitrogecircnio No cultivo utilizando a
fonte de nitrogecircnio alternativa (ureacuteia) a adiccedilatildeo diaacuteria foi efetuada por pulsos (adiccedilatildeo
intermitente) (SAacuteNCHEZ-LUNA et al 2004) As intensidades luminosas foram
medidas com um sensor quantum (model LI-190 SB Li-Cor Lincoln Neb USA) As
diferentes fontes de nitrogecircnio e intensidades luminosas foram preacute-estabelecida de
acordo com o plano de trabalho (Item 5)
O valor de pH nos cultivos foi mantido em 95 plusmn 02 (SANCHEZ-LUNA et al
2007 TREDICI ZITTELLI 1998) com auxiacutelio de um aparelho controlador de pH
METTLER TOLEDO acoplado a uma vaacutelvula solenoacuteide Nos ensaios com CO2 puro
(999) a valvula solenoiacutede estava ligada a um cilindro de CO2 e nos ensaios com
CO2 proveniente de fermentaccedilatildeo alcooacutelica a vaacutelvula solenoacuteide foi ligada agrave tubulaccedilatildeo
proveniente de um reator operando com processo contiacutenuo de fermentaccedilatildeo alcooacutelica
em regime permanente
A temperatura de 29 plusmn 1ordmC (SAacuteNCHEZ-LUNA et al 2007) foi mantida por ar
condicionado que climatizou a temperatura da sala onde estaacute localizada o reator
No final do experimento o reator foi lavado com soluccedilatildeo de hipoclorito de soacutedio
5 por 16 h e com uma soluccedilatildeo de tiosulfato de soacutedio (Na2S2O3) 50 mM para
neutralizar o clorito residual de acordo com De Beer et al (1994)
43 Teacutecnicas Analiacuteticas
Na fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua ateacute o estabelecimento de regime
permanente as determinaccedilotildees de concentraccedilatildeo celular pH ART etanol no caldo
fermentado foram determinados a cada 12 horas Estabelecido o regime
permanente as determinaccedilotildees de concentraccedilatildeo celular pH ART etanol foram
feitas diariamente O efluente gasoso foi analisado qualitativamente para
identificaccedilatildeo dos principais compostos volaacuteteis orgacircnicos
No cultivo de Arthrospira a concentraccedilatildeo celular foi feita diariamente ateacute atingir
concentraccedilatildeo celular maacutexima As medidas de concentraccedilatildeo de nitrato ureacuteia residual
amocircnia e de carbonato total em funccedilatildeo dos relativos grandes volumes necessaacuterios
para a execuccedilatildeo das teacutecnicas foram realizadas a cada dois dias Nos cultivos
utilizando o CO2 proveniente da fermentaccedilatildeo alcooacutelica foram analisados os
70
compostos volaacuteteis orgacircnicos presentes no meio isento de ceacutelulas A concentraccedilatildeo
de clorofila a foi determinada no final de cada experimento bem como a
determinaccedilatildeo de proteiacutenas lipiacutedios totais carboidratos e cinzas
431 Acompanhamento da fermentaccedilatildeo alcooacutelica
4311 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular
A concentraccedilatildeo celular expressa em massa seca foi determinada por filtraccedilatildeo
de acordo com metodologia descrita por Carvalho et al (2003) Um volume de 5 mL
da amostra foi filtrada em membrana millipore 12 microm de porosidade previamente
seca em estufa a 105 ordmC por 4 horas e em dessecador por 1 h e pesada A biomassa
filtrada e lavada com 50 mL de aacutegua destilada foi seca em estufa a 105 ordmC por 4
horas e em dessecador por 1 h e posteriormente pesada A concentraccedilatildeo celular foi
determinada por diferenccedila de massa antes e apoacutes a filtraccedilatildeo
4312 Determinaccedilatildeo do pH
O pH seraacute acompanhado por potenciometria com um aparelho da marca
METTLER TOLEDO
4313 Determinaccedilatildeo de ART
A determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ART foi realizada por espectrofotometria a
540 nm pelo meacutetodo de SOMOGYI-NELSON (1952) precedido da hidroacutelise da
sacarose contida na fase liacutequida do meio de fermentaccedilatildeo realizada pela teacutecnica de
Falcone e Marques (1965)
A hidroacutelise da sacarose foi feita por hidroacutelise aacutecida utilizando 5 mL da amostra
e 25 mL da soluccedilatildeo de aacutecido cloriacutedrico 13 N e deixou-se em banho de aacutegua a 70 ordmC
por 15 minutos Deixou-se esfriar essa soluccedilatildeo ateacute a temperatura ambiente e foi
adicionado NaOH 6N ateacute verificar uma mudanccedila no pH utilizando fenolfitaleiacutena
como indicador Posteriormente completou-se o volume final para 100 mL com aacutegua
destilada diluindo-se assim a amostra 20 vezes A partir dessa soluccedilatildeo jaacute diluiacuteda
fizeram-se novas diluiccedilotildees necessaacuterias para a determinaccedilatildeo do ART pelo meacutetodo de
Somogyi-Nelson (1952)
71
A anaacutelise compreende na adiccedilatildeo de 1 mL da amostra convenientemente diluiacuteda
e 1 mL do reativo de Somogy em tubo de Folin-Wu onde foi fervido durante 10
minutos resfriado em aacutegua com gelo Apoacutes o resfriamento adicionou-se 2 mL do
reativo de Nelson e agitou-se os tubos em agitador ateacute expulsar os gases formados
Completou-se o volume para 25 mL com aacutegua destilada e a soluccedilatildeo foi lida em
espectrofotometro a 520 nm Foi feito um branco substituindo a amostra por aacutegua
destilada
O accediluacutecar aquecido com uma soluccedilatildeo alcalina de tartarato de cobre leva agrave
obtenccedilatildeo de oacutexido cuproso que reagindo com molibdato de arsecircnio possibilita a
produccedilatildeo de um composto de coloraccedilatildeo azul passiacutevel de ser quantificada por
colorimetria a adiccedilatildeo de sulfato de soacutedio a mistura minimiza a entrada de oxigecircnio
na soluccedilatildeo responsaacutevel pela reoxidaccedilatildeo do oacutexido cuproso
4314 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol
A determinaccedilatildeo do etanol foi realizada atraveacutes do meacutetodo de oxidaccedilatildeo por
dicromato de potaacutessio proposto por Joslyn (1907)
O etanol foi determinado mediante a destilaccedilatildeo atraveacutes de um microdestilador
de KJELDHAL e recolhido em 20 mL de uma soluccedilatildeo de dicromato de potaacutessio
fortemente acidulada com aacutecido sulfuacuterico A determinaccedilatildeo consiste na destilaccedilatildeo de
1 mL do meio fermentado isento de ceacutelulas recolhido na soluccedilatildeo de dicromato
contida em erlenmeyer onde o etanol reagiu com os iacuteons dicromato como mostrado
na eq 1 produzindo acetaldeiacutedo e iacuteons Cr(III) Conforme o etanol reage haacute uma
mudanccedila da coloraccedilatildeo laranja caracteriacutestica desta soluccedilatildeo para um tom esverdeado
A reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo do etanol com iacuteons dicromato envolve pelo menos duas
etapas Na primeira etapa o etanol introduzido na soluccedilatildeo reage com os iacuteons
dicromato produzindo um aldeiacutedo que neste caso eacute o acetaldeiacutedo (reaccedilatildeo 4)
Na segunda etapa como o aldeiacutedo produzido tambeacutem eacute susceptiacutevel agrave oxidaccedilatildeo o
acetaldeiacutedo eacute consumido produzindo aacutecido aceacutetico (um aacutecido carboxiacutelico) com a
correspondente reduccedilatildeo dos iacuteons Cr(VI) para iacuteons Cr(III) (reaccedilatildeo 5) A reaccedilatildeo
entre o etanol e os iacuteons dicromato pode ser descrita de forma global como mostrado
na (reaccedilatildeo 6)
3 CH3CH2OH + CrO7-2 rarr 3 CH3COH 2 Cr+3 + 7 H20 (reaccedilatildeo 4)
3 CH3COH + CrO7-2 + 8H+ rarr 3 CH3COOH + 2 Cr+3 + 4 H20 (reaccedilatildeo 5)
72
3 CH3CH2OH + 2 CrO7-2 + 16H+ rarr 4Cr+3 + 3 CH3COOH 11 H2O (reaccedilatildeo 6)
Apoacutes a destilaccedilatildeo o erlenmeyer foi levado a um banho de aacutegua a 70 ordmC
durante 20 minutos para que se complete a oxidaccedilatildeo do etanol Apoacutes esse tempo
deixou-se esfriar ateacute temperatura ambiente e essa soluccedilatildeo foi titulada com soluccedilatildeo
de sulfato ferroso amoniacal Foi feita concomitantemente uma soluccedilatildeo utilizando
aacutegua em vez do destilado para determinar o poder redutor do sulfato ferroso
amoniacal
4315 Determinaccedilatildeo dos componentes volaacuteteis presentes no gaacutes efluente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
Os voltaacuteteis majoritaacuterios liberados durante o regime permanente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica foram determinados pelo Laboratoacuterio de Anaacutelises Quiacutemicas do
Instituto de Pesquisa Tecnoloacutegis (IPT) usando um cromatoacutegrafo a gaacutes (marca
Shimadzu modelo CG-2010) acoplado ao espectrocircmetro de massas (Shimadzu
Modelo GCMS ndash QP5050A)
432 Acompanhamento do cultivo de A platensis
O volume das amostras diaacuterias retiradas para o acompanhamento celular foram
de 50 mL Apoacutes a remoccedilatildeo da amostra igual volume de meio de cultura isento da
fonte de nitrogecircnio foi adicionado para manter o volume constante Similarmente a
evaporaccedilatildeo de aacutegua diaacuteria foi compensada pela adiccedilatildeo do meio de cultura
4321 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular
43211 Densidade oacutetica
O acompanhamento do crescimento celular foi realizado diariamente em
duplicata por turbidimetria a 560 nm (LEDUY THERIEN 1977) Os valores de
transmitacircncia obtidos no espectrofotocircmetro foram convertidas em concentraccedilatildeo
celular atraveacutes de uma curva de calibraccedilatildeo (Item 43212)
43212 Construccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo
A curva de calibraccedilatildeo foi obtida tomando-se um volume de 25 mL de uma
suspensatildeo concentrada de ceacutelulas em fase de crescimento exponencial que foi
73
filtrada e lavada com aacutegua destilada em uma membrana de acetato de celulose de
12 μm previamente seca a 70 ordmC por 12 horas e previamente pesada A amostra
foi levada agrave estufa a 100ndash105 ordmC por um periacuteodo de 5 horas suficiente para que
mantivesse uma massa constante A massa das ceacutelulas foi calculada por diferenccedila
dos valores das massas das membranas antes e depois da filtraccedilatildeo e dividido pelo
volume filtrado para obter-se a concentraccedilatildeo celular na suspensatildeo A partir desta
mesma suspensatildeo foram preparadas diferentes diluiccedilotildees e aliacutequotas dessas
diluiccedilotildees foram levadas ao espectrofotocircmetro para leitura da transmitacircncia a 560 nm
de comprimento de onda e caminho oacuteptico de 1 cm com aacutegua destilada como
branco Dessa forma foi obtida uma curva que relaciona concentraccedilatildeo celular com o
logaritmo da transmitacircncia (Graacutefico 1)
Graacutefico 1 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular de A platensis
4322 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de carbonato total
Embora a concentraccedilatildeo de carbonato total deva se manter constante em
decorrecircncia do fornecimento de CO2 para a manutenccedilatildeo do pH foi acompanhado na
fase liacutequida do meio em cultivo
No meio isento de ceacutelulas o acompanhamento da concentraccedilatildeo de fonte de
carbono na forma de carbonato total foi atraveacutes de titulometria Inicialmente
adiciona-se hidroacutexido de soacutedio na amostra (Reaccedilatildeo 7) e titula-se com HCl
(Reaccedilatildeo 8) na presenccedila do indicador fenolftaleiacutena para a conversatildeo de carbonato
em bicarbonato Posteriormente foi titulada novamente com HCl (Reaccedilatildeo 9) na
74
presenccedila do indicador alaranjado de metila para que todo o bicarbonato transforme-
se em aacutecido carbocircnico por deslocamento de equiliacutebrio O carbonato total foi
quantificado pelos dois intervalos de viragem (PIERCE HAENISCH 1948)
NaOH + NaHCO3 = Na2CO3 + H2O (Reaccedilatildeo 7)
Na2CO3 + HCl = NaHCO3 + NaCl (Reaccedilatildeo 8)
NaHCO3 + 1 HCl = H2CO3 + 1 NaCl (Reaccedilatildeo 9)
4323 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia total
A amocircnia total foi quantificada no meio isento de ceacutelulas de 2 em 2 dias em
potenciocircmetro marca ORION modelo 710-A por meio de um eletrodo seletivo para
amocircnia modelo 95-12 ORION Tendo em vista que o eletrodo soacute eacute sensiacutevel ao iacuteon
amocircnia e que no pH de cultivo existe equiliacutebrio entre os iacuteons amocircnia e amocircnio para
se fazer a leitura foi necessaacuterio corrigir o pH da amostra para 13 pela adiccedilatildeo de
NaOH 15 M antes da leitura no eletrodo de forma que todo iacuteon amocircnio fosse
convertido em amocircnia (LEDUY SAMSON 1982) O volume utilizado foi de 15 mL e
nesse procedimento foi necessaacuteria agrave calibraccedilatildeo do aparelho em todos os dias em
que foram realizadas as determinaccedilotildees Isso foi feito atraveacutes da construccedilatildeo de uma
curva que correlaciona a milivoltagem lida no potenciocircmetro com soluccedilotildees de NH4Cl
em diferentes diluiccedilotildees com concentraccedilotildees conhecidas A partir da equaccedilatildeo dessa
curva com a milivoltagem lida na amostra do cultivo foi calculada a concentraccedilatildeo
de amocircnia total Esta metodologia tambeacutem serviu para auxiliar na determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de ureacuteia conforme se observa no item a seguir
43231 Construccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da amocircnia
A metodologia empregada para a determinaccedilatildeo de amocircnia requer a construccedilatildeo
de uma curva de calibraccedilatildeo para cada dia em que foi analisada a amocircnia Desta
forma no Graacutefico 2 tecircm-se uma das curvas de calibraccedilatildeo utilizada
75
Graacutefico 2 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia
Nesse caso a curva de calibraccedilatildeo corresponde agrave Log [NH3] -00213 x mV ndash
10583 A maior diluiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de amocircnia foi de 5x10-6 (cujo o valor de
Log eacute -53) que corresponde a um valor de milivoltagem de 182 detectado no
eletrodo de amocircnia
4324 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia
Para a determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia inicialmente foi hidrolisada em
meio aacutecido como segue 10 mL do meio de cultivo isento de ceacutelulas foi submetido a
um tratamento com H2SO4 (1 mL de H2SO4 5 N) a 200 ordmC por 6 horas em bloco
digestor Tecnal modelo TE-106 (CEZARE 1998) Apoacutes esse tempo o conteuacutedo
presente no tubo onde ocorreu a hidroacutelise aacutecida foi quantitativamente transferido
para um balatildeo volumeacutetrico de 50 mL com neutralizaccedilatildeo do pH com NaOH 15 M
utilizando fenolftaleiacutena como indicador e finalmente o volume completado com aacutegua
destilada Desse balatildeo foi retirado um volume de 15 mL para a determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de amocircnia conforme meacutetodo descrito no item anterior Considerando
ainda a diluiccedilatildeo da amostra calcula-se a concentraccedilatildeo de amocircnia global que
representa a amocircnia que jaacute estava presente no meio de cultivo mais a amocircnia
proveniente da hidroacutelise da ureacuteia Assim por diferenccedila eacute possiacutevel calcular a
concentraccedilatildeo de ureacuteia no meio de cultivo
76
4325 Determinaccedilatildeo do pH
O pH foi acompanhado por potenciometria com um aparelho da marca
METTLER TOLEDO
4326 Determinaccedilatildeo de nitrato
A anaacutelise de nitrato foi realizada atraveacutes da adaptaccedilatildeo do meacutetodo descrito por
Vogel (2002) Foram pipetados 10 mL do meio isento de ceacutelulas 10 ml de NaOH
(05 N) e 700 mg de liga de devarda ( 50 de cobre 45 de alumiacutenio 5 zinco) em
balatildeo volumeacutetrico onde foi aquecido em bico de busen durante 1 hora para que todo
o nitrato presente na amostra seja reduzido a amocircnio como descrito na reaccedilatildeo a
seguir
NO3- + 8 Al + 5 OH- + 2 H2O rarr 8 Al2
- + 3 NH3 (Reaccedilatildeo 10)
Durante o aquecimento os iacuteons amocircnio satildeo desprendidos e recolhidos em uma
soluccedilatildeo padronizada de 10 mL de aacutecido cloriacutedrico (01 N) formando o cloreto de
amocircnio Essa soluccedilatildeo foi titulada com NaOH (005 N) padronizada usando vermelho
de metila como indicador e a quantificaccedilatildeo do amocircnio formado foi feita por diferenccedila
entre a quantidade de HCl inicial e final depois da destilaccedilatildeo A conversatildeo de
volume do aacutecido tilulado (mililitros) em massa de iacuteons nitrato (gramas) foi baseada
na informaccedilatildeo de que 1 mL de aacutecido cloriacutedrico 1 N corresponde a 006201g de iacuteons
nitrato (VOGEL 2002)
4327 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol
A determinaccedilatildeo do etanol foi realizada atraveacutes do meacutetodo de oxidaccedilatildeo por
dicromato de potaacutessio proposto por Joslyn (1907) como descrito no item 4314
433 Avaliaccedilatildeo da biomassa de A platensis obtida no final do cultivo
4331 Determinaccedilatildeo de Clorofila a
A anaacutelise de clorofila a foi realizada utilizando uma suspensatildeo celular de 5 mL
correspondente agrave concentraccedilatildeo celular maacutexima obtida Essa suspensatildeo foi filtrada e
a biomassa foi ressuspendida em 5 mL de metanol e incubada em banho maria a
70ordmC por 2 minutos Apoacutes esse tempo a amostra foi filtrada em filtro de
77
politetrafluoretileno 10 microm de diacircmetro (Milliporereg) e o sobrenadante contendo a
clorofila foi determinado espectofotometricamente a 665 nm adotando-se o
procedimento descrito por Vonshak (1997a) A curva de calibraccedilatildeo foi feita
previamente utilizando clorofila areg padratildeo
43311 Curva de calibraccedilatildeo para a determinaccedilatildeo de Clorofila a
A curva de calibraccedilatildeo foi construiacuteda utilizando uma soluccedilatildeo de clorofila a
padratildeo (Sigmareg) obtida comercialmente em metanol A partir dessa soluccedilatildeo foram
realizadas diferentes diluiccedilotildees que resultaram em leituras espectrofotomeacutetricas em
comprimento de onda de 665nm obtendo valores de absorbacircncia entre 0200 e
0800 A relaccedilatildeo entre as diferentes concentraccedilotildees de clorofila em miligrama por
litro com os valores de aborbacircncia obtem-se a equaccedilatildeo como mostrada no graacutefico
3 que foi utilizada para a determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de clorofila nos ensaios
Graacutefico 3 Curva de calibraccedilatildeo para determinaccedilatildeo de clorofila a
4332 Determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal
Ao final do cultivo o meio contendo a A platensis foi centrifugado com 3
lavagens sucessivas com aacutegua destilada para retirada do sal adsorvido agraves ceacutelulas e
apoacutes secagem com ventilaccedilatildeo a 55 ordmC por 12 horas (PELIZER et al 1999) foi
avaliada a composiccedilatildeo centesimal da biomassa seca
78
43321 Proteiacutenas totais
O teor proteacuteico total na biomassa seca foi determinado pelo claacutessico meacutetodo de
KJELDHAL adotando-se o fator de 625 para a conversatildeo a partir dos teores de
nitrogecircnio total (ASSOCIATION OF OFFICIAL METHODS OF FOOD ANALYSIS
1984) Esse meacutetodo caracteriza-se pela destruiccedilatildeo da mateacuteria orgacircnica com aacutecido
sulfuacuterico concentrado em presenccedila de um catalizador e aquecimento com
formaccedilatildeo de nitrogecircnio inorgacircnico na forma de sulfato de amocircnio A seguir em
aparelho destilador de nitrogecircnio adiciona-se hidroacutexido de soacutedio no tubo
proveniente da digestatildeo para alcalinizaccedilatildeo do meio e desta forma o sal de
amocircnio eacute convertido agrave amocircnia que eacute destilada para uma soluccedilatildeo saturada de aacutecido
boacuterico Posteriormente titula-se essa soluccedilatildeo com HCl 002N fatorada para se
quantificar a concentraccedilatildeo de nitrogecircnio (FERRAZ 1986)
43322 Lipiacutedios totais
A fraccedilatildeo lipiacutedica total foi obtida por extraccedilatildeo com solvente orgacircnico (FERRAZ
1986) A amostra foi triturada em gral e entatildeo transferida para um extrator contiacutenuo
de Soxhlet com refluxo da mistura de solventes clorofoacutermio-metanol (21 vv) ateacute o
liacutequido ficar liacutempido (PIORRECK 1984 OLGUIacuteN et al 2001) A fraccedilatildeo lipiacutedica total
juntamente com os solventes foram tratados em sistema evaporador rotativo a
vaacutecuo O material obtido reuacutene aacutecidos graxos trigliceriacutedeos fosfolipiacutedios
carotenoacuteides pigmentos fotossintetizantes esteroacuteides e hidrocarbonetos sendo
chamados de fraccedilatildeo lipiacutedica total (GIOIELLI 1997)
43323 Cinzas
O teor de cinzas das ceacutelulas secas foi determinado por aquecimento de acordo
com meacutetodo descrito pelo Instituto Adolfo Lutz (1985) 1g da amostra foi pesada em
caacutepsula de porcelana previamente aquecida em mufla a 550 ordmC resfriada em
dessecador ateacute a temperatura ambiente e pesada A amostra foi seca em estufa a
105 ordmC carbonizada e incinerada em mufla a 550 ordmC durante 4 horas tempo
necessaacuterio para obter peso constante Posteriomente resfriou-se a amostra em
dessecador durante 1 hora ateacute atingir a temperatura ambiente e pesada As cinzas
devem ficar brancas ou ligeiramente acinzentadas
79
43324 Carboidratos totais
A porcentagem de carboidratos foi calculada pela diferenccedila entre e as
porcentagens dos demais componentes analisados na biomassa seca
434 Avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo elementar
As determinaccedilotildees de CNHSO foram realizadas pela CE instruments flash
EA1112 series acoplada com um detector de condutividade teacutermica (TCD) Para as
anaacutelises de Carbono Nitrogecircnio Hidrogecircnio e Enxofre foi utilizada a meteonina (C =
4025 N = 939 H = 743 S = 2149) como padratildeo e para a anaacutelise de
oxigecircnio foi utilizado o aacutecido aspaacutertico (C = 3609 N = 1052 H =53 S =
000 O = 4908)
4341 Determinaccedilatildeo de CNHS
Foram determinados pesando aproximadamente 1 a 4 mg da amostra em
recipiente de estanho e adicionar V2O5 (oacutexido de vanaacutedio) para que toda a biomassa
seja carbonizada Utiliza-se gaacutes oxigecircnio (99995) para carregar as amostras e
fazer a combustatildeo a 900degC formando os compostos reduzidos N2 CO2 H20 e SO2
Esses gases vatildeo para a coluna cromatograacutefica onde seratildeo separados e
posteriormente detectados por sinais eleacutetricos no detector de condutividade teacutermica
usando o software EAGER 300 na qual fornece a porcentagem de N C H S
contida na amostra
4342 Determinaccedilatildeo de oxigecircnio
Pesar aproximadamente 1 a 4 mg da amostra em recipiente de prata eleva-se
a temperatura a 1060degC onde ocorre a piroacutelise Durante a piroacutelise satildeo formados N2
CO e H2 estes satildeo filtrados onde os compostos halogenados satildeo retidos
Posteriormente esses gases vatildeo para a coluna cromatograacutefica onde o CO eacute
separado dos outros gases utilizando gaacutes heacutelio como carreador detectados por
sinais eleacutetricos no detector de condutividade teacutermica
44 Caacutelculos
441 Produtividade em etanol no regime permanente
Petanol = DEf (Equaccedilatildeo 1)
80
Onde Petanol = Produtividade em etanol (g L-1 h-1)
D = vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo (h-1)
Ef = concentraccedilatildeo de etanol (g L-1)
442 Rendimento do etanol no regime permanente
η = 1005110
1
ARTi
Ef (Equaccedilatildeo 2)
Onde η = rendimento em etanol ()
Ef = concentraccedilatildeo de etanol (g L-1)
ARTi = Accediluacutecares redutores totais no mosto de entrada no reator (g L-1)
0511 = rendimento teoacuterico (estequiomeacutetrico) da conversatildeo de glicose em
etanol
443 Produtividade em ceacutelulas nos cultivos de A platensis
Tc
XiXmPx
(Equaccedilatildeo 3)
Onde PX = produtividade em ceacutelulas (mg L-1 d -1)
Xm = concentraccedilatildeo celular maacutexima obtida (mg L-1)
Xi = concentraccedilatildeo celular inicial (mg L-1)
Tc = tempo de cultivo (dias)
444 Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas nos cultivos de A
platensis
Nt
VXiXmY NX
(Equaccedilatildeo 4)
81
OndeYXN = Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (mg mg-1)
Xm = concentraccedilatildeo celular maacutexima obtida (mg L-1)
Xi = concentraccedilatildeo celular inicial (mg L-1)
V = volume do meio (L)
Nt = quantidade total de nitrogecircnio adicionado (mg)
445 Coeficientes atocircmicos para 1 C-mol de biomassa
Foram escolhidos os principais aacutetomos (C H 0 N e S) que formam as
macromoleacuteculas proteiacutenas carboidratos lipiacutedios RNA e DNA Um C-mol de
biomassa eacute definida como CX1HX2NX3OX4SX5 e os coeficientes atocircmicos Xi satildeo
calculados a partir da Equaccedilatildeo 5
MMc
fc
MMi
fiXi (Equaccedilatildeo 5)
fi = fraccedilatildeo em massa do aacutetomo i na biomassa seca (g g-1)
MMi = Massa molar do aacutetomo i (g C-mol-1)
fc = fraccedilatildeo em massa do carbono na biomassa seca (g g-1)
MMc = Massa molar do aacutetomo do carbono (g C-mol-1)
Exemplo
Para se calcular o coeficiente atocircmico do hidrogecircnio em 1 C-mol de biomassa
no experimento 1 (Fonte de Carbono cilindro fonte de nitrogecircnio nitrato
intensidade luminosa 60 μmol de foacutetons m-2 s-1)
Teor de hidrogecircnio na biomassa foi de 662 e o teor de carbono foi de 543
o que corresponde a 662 mg de hidrogecircnio e 543 mg de carbono em 1 g da
biomassa Logo substituindo esses valores na Equaccedilatildeo 5 se encontra o coeficiente
atocircmico do hidrogecircnio de 146
12
543
1
66HX
XH = 146
82
446 Grau de reduccedilatildeo da biomassa
O grau de reduccedilatildeo (γ) de um composto orgacircnico eacute definido como o nuacutemero de
eleacutetrons envolvido na sua oxidaccedilatildeo Esse valor eacute a somatoacuteria da multiplicaccedilatildeo entre
os coeficientes atocircmicos e seu respectivo grau de reduccedilatildeo (HEI JNEN 2001)
45 Teoria dos paracircmetros bioenergeacuteticos
A energia de Gibbs dissipada para o crescimento e manutenccedilatildeo celular por
unidade de biomassa (1YGX kJC-mol) foi estimada de acordo com Heijnen (2001)
pela Equaccedilatildeo 6
G
GXGX
m
YY
max
11 (Equaccedilatildeo 6)
max
GXY eacute o rendimento maacuteximo teoacuterico de biomassa sobre a energia de Gibbs que
corresponde a um valor de 986 C-molX kJ-1 em cultivos fotoautotroacutefico com CO2
como fonte de carbono (HEIJNEN 2001)
Nesta equaccedilatildeo a velocidade especiacutefica de crescimento μ foi definida de
acordo com Leduy e Zajic (1973) como
1
ln1
i
i
X
X
t (Equaccedilatildeo 7)
Onde Xi e Xi-1 satildeo as concentraccedilotildees de biomassa no final e iniacutecio do intervalo de
tempo decorrido entre as duas determinaccedilotildees consecutivas (Δt = 1 dia) enquanto
que mG eacute a energia de Gibbs utilizada para a manutenccedilatildeo celular correspondendo a
712 kJ C-molX -1 h-1 a 30degC (HEIJNEN 2001)
A estimativa o nuacutemero de foacutetons (Einsteins) para sustentar o crescimento
autotroacutefico nPh foi necessaacuterio recorrer ao balanccedilo de energia de Gibbs tendo em
conta as contribuiccedilotildees de energia para o crescimento e manutenccedilatildeo 1YGX e a
absorccedilatildeo de 1 Einstein de foacutetons ΔgPh em adiccedilatildeo aqueles de formaccedilatildeo de
substratos e produtos Δgfi como descitos pela equaccedilatildeo
ΔgfHCO3- + ΔgfN + ΔgfH2O + ΔgfH
+ + ΔgfX + 1YGX + nPh ΔgPh = 0 (Equaccedilatildeo 8)
83
O valor de ΔgPh = 2062 kJ mol-1 foi estimado atraveacutes da equaccedilatildeo
A
Ph
hcNg (Equaccedilatildeo 9)
Sendo h = 662610-34 J a constante de Planck c = 299108 m s-1 a velocidade da
luz NA = 6022 x 1023 foacutetons de Einstein -1 o numero de Avogadro e λ = 580 nm o
comprimento de onda do foton absorvido (Li et al 2001)
Calculando os valores de ΔgPh e nPh eacute possiacutevel estimar a energia molar de
Gibbs absorvida pela equaccedilatildeo 10
ΔGa = nPh ΔgPh (Equaccedilatildeo 10)
A energia total de Gibbs absorvida pela fotossiacutentese (ΔGa) foi assumida como a
soma da energia fixada pelo sistema para aumentar o seu proacuteprio conteuacutedo
entaacutelpicos (ΔH) a energia transformada em ATP usada para o crescimento e
manutenccedilao celular (ΔGATP) e a liberada como calor (Q)
ΔGa + ΔGATP + ΔH + Q = 0 (Equaccedilatildeo 11)
Onde ΔGATP e ΔH foram calculados a partir do nPh a energia de Gibbs associada a 1
ATP mol e a media da variaccedilatildeo de potencial entre FSI e FSII (TORRE et al 2003)
A produccedilatildeo molar de O2 (qO2) e o consumo de H+ (qH+) foram calculados de
acordo com Torre et al (2003) multiplicando-se os seus coeficientes
estequiomeacutetricos pela concentraccedilatildeo celular expressa em C-mol L-1 e usando a
composiccedilatildeo elementar da biomassa experimental
84
5 Planejamento experimental
Os experimentos realizados estatildeo descritos na Tabela 2 Os valores de
intensidade luminosa foram escolhidos em funccedilatildeo do trabalho de Watanabe e Hall
(1995) O valor de pH foi fixado em 95 plusmn 02 de acordo com trabalho de Sanchez-
Luna et al (2007) e Tredici e Zittelli (1998) As adiccedilotildees diaacuterias de ureacuteia foram fixadas
com base na necessidade de nitrogecircnio da ceacutelula calculadas a partir dos resultados
das produtividades celulares obtidos nos experimentos padrotildees realizados utilizando
a fonte convencional de nitrogecircnio (NaNO3)
Para a realizaccedilatildeo dos ensaios padrotildees a concentraccedilatildeo de NaNO3
(SCHLOumlSSER 1982) foi mantida acima de 1 g L-1 para evitar a limitaccedilatildeo do
crescimento pela fonte de nitrogecircnio A partir da curva de crescimento experimental
utilizando o nitrato como fonte de nitrogecircnio para cada intensidade luminosa
estudada obteacutem-se uma equaccedilatildeo que representa a curva de crescimento teoacuterica e a
partir desta calcula-se a produtividade celular diaacuteria Considerando que as ceacutelulas
possuem 7 de nitrogecircnio (BEZERRA 2006) calcula-se a quantidade diaacuteria de
nitrogecircnio necessaacuteria para o crescimento celular obtendo-se assim a equaccedilatildeo de
adiccedilatildeo de nitrogecircnio amoniacal Por isso eacute necessaacuterio realizar uma curva de
crescimento padratildeo com NaNO3 para cada condiccedilatildeo analisada (diferentes
intensidades luminosas) A exemplificaccedilatildeo do escrito acima esta representado no
Item 62
Tabela 2 - Planejamento experimental
Experimento
Intensidade luminosa
( mol de foacutetons m-
2 s-1)
Fonte de nitrogecircnio
Controle de pH por CO2 de cilindro
Controle de pH por CO2 de
fermentaccedilatildeo alcooacutelica
1 60 NaNO3 Sim Natildeo
2 60 Ureacuteia Sim Natildeo
3 60 NaNO3 Natildeo Sim
4 60 Ureacuteia Natildeo Sim
5 120 NaNO3 Sim Natildeo
6 120 Ureacuteia Sim Natildeo
7 120 NaNO3 Natildeo Sim
8 120 Ureacuteia Natildeo Sim
9 240 NaNO3 Sim Natildeo
10 24 0 Ureacuteia Sim Natildeo
11 240 NaNO3 Natildeo Sim
12 240 Ureacuteia Natildeo Sim
valor fixado em 95 com uso de CO2
85
6 Resultados e discussatildeo
No item 61 estatildeo descritos os resultados dos testes preliminares da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica e no item 62 estatildeo apresentados os resultados dos
experimentos 1 ao 12 referentes aos acompanhamentos dos cultivos ao longo do
tempo A concentraccedilatildeo celular concentraccedilatildeo de carbonato de nitrato de amocircnia e
ureacuteia foram apresentadas neste item
As determinaccedilotildees da concentraccedilatildeo celular foram feitas diariamente enquanto
que as medidas de concentraccedilatildeo de nitrato amocircnia ureacuteia e de carbonato total no
meio de cultura em funccedilatildeo dos relativos grandes volumes de amostra necessaacuterios
para a execuccedilatildeo das teacutecnicas foram realizadas de dois em dois dias
Os paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima produtividade em ceacutelulas e fator
de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas estatildeo descritos no item 63 As
determinaccedilotildees da concentraccedilatildeo de clorofila foram realizadas no final de cada
experimento e estatildeo descritas no item 64 e a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal
teor de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos e cinzas estatildeo descritos no item 65
As anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas atraveacutes de anaacutelise de multivariacircncia e
diferenccedila entre as meacutedias em niacutevel de 5 de significacircncia visando-se examinar a
influecircncia de cada variaacutevel independente para os paracircmetros cineacuteticos Xm Px e
YXN bem como para o conteuacutedo de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos cinzas e teores
de clorofila a
As anaacutelises dos paracircmetros bioenergeacuteticos dos cultivos de A platensis
utilizando CO2 de cilindro estatildeo descritas no item 66 e a comparaccedilatildeo entre o perfil
de crescimento da A platensis em duas diferentes configuraccedilotildees de fotobioreator
tubular estaacute descrito no item 67
61 Testes preliminares para a realizaccedilatildeo da fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Antes de iniciar os experimentos acoplando a fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
com a produccedilatildeo de A platensis foram realizados testes para avaliar a influecircncia da
clarificaccedilatildeo do melaccedilo na determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular a homogeneidade
do reator as vazotildees especiacuteficas de alimentaccedilatildeo no processo contiacutenuo de modo a
obter regime permanente e produccedilatildeo gases suficiente para a correccedilatildeo do pH
durante o cultivo de A platensis
86
611 Avaliaccedilatildeo da influecircncia da clarificaccedilatildeo do melaccedilo na determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo celular
Inicialmente foi proposto utilizar o melaccedilo de cana-de-accediluacutecar clarificado e
esterilizado no entanto devido as dificuldade operacionais como por exemplo
grandes volumes de melaccedilo que seria utilizado para a manutenccedilatildeo do processo
contiacutenuo optou-se por utilizar o melaccedilo natildeo clarificado e natildeo esterilizado uma vez
que nas usinas brasileiras natildeo eacute empregado atualmente esse preacute-tratamento do
melaccedilo (LIMA et al 2001) Dhamija et al (1982) relata que os custos adicionais
para o preacute-tratamento de melaccedilo e da levedura reciclada pode limitar o uso do
processo Portanto a teacutecnica de reciclo de leveduras por centrifugaccedilatildeo e uso de
melaccedilo natildeo clarificado torna o processo mais econocircmico
O melaccedilo de cana-de-accediluacutecar possui aproximadamente 50 de accediluacutecares
(sacarose 25 a 40 glicose e frutose 12 a 35) aacutegua carboidratos cinzas
metais pesados compostos nitrogenados e em menor quantidade aacutecidos natildeo
nitrogenados (aacutecido ciacutetrico acido maacutelico oxaacutelico glicoacutelico) ceras esteroacuteides e
vitaminas (ROUKAS 1998) Vaacuterios fatores influenciam na composiccedilatildeo do melaccedilo ou
mel final os meacutetodos de fabricaccedilatildeo do accediluacutecar o tempo de armazenamento e as
regiotildees do plantio Este elevado teor de accediluacutecar eacute a razatildeo porque o melaccedilo eacute
largamente utilizado na induacutestria de fermentaccedilatildeo em particular produccedilatildeo de etanol
O emprego do melaccedilo natildeo tratado poderia influenciar a determinaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo celular por massa seca uma vez que no melaccedilo conteacutem aleacutem da
sacarose diversos outros resiacuteduos que poderiam ficar retidos na membrana de
filtraccedilatildeo dificultando esse processo eou resultando no falso aumento da
concentraccedilatildeo celular Por isso realizou-se um teste para avaliar se o natildeo tratamento
do melaccedilo influenciaria na determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo celular Os resultados e a
anaacutelise estatiacutestica da diferenccedila entre as meacutedias estatildeo descritos na Tabela 3
Tabela 3 - Valores da concentraccedilatildeo celular meacutedias e desvio padratildeo em massa seca obtidas a partir do melaccedilo natildeo clarificado e do melaccedilo clarificado
Melaccedilo natildeo clarificado (gL-1) Melaccedilo clarificado (gL-1)
1110 1010
1094 1074
1082 1004
Meacutedia = 109 plusmn 014ordf Meacutedia = 103 plusmn 040a
Diferenccedila percentual = 640
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
87
Como se pode observar na Tabela 3 as meacutedias da concentraccedilatildeo celular
determinada por massa seca foram estatisticamente iguais nas duas condiccedilotildees de
melaccedilo avaliadas melaccedilo clarificado e melaccedilo natildeo clarificado Com esses
resultados optou-se utilizar o melaccedilo natildeo clarificado uma vez que no acircmbito
industrial o processo de clarificaccedilatildeo aumenta os custos operacionais resultando em
um aumento dos custos do produto final Por isso estudos sobre os preacute-tratamentos
do melaccedilo de cana-de-accediluacutecar tecircm sido desenvolvidos para que viabilizem natildeo soacute a
obtenccedilatildeo dos produtos mas tambeacutem as etapas de recuperaccedilatildeo e purificaccedilatildeo sem
aumento excessivo no custo do processo (VALDUGA et al 2007)
612 Teste de homogeneidade do reator
O teste de homogeneidade no reator foi realizado com o objetivo de se avaliar
se as amostras retiradas em qualquer lugar do reator podem ser consideradas
equivalentes com um risco de erro estatisticamente determinado neste trabalho em
10 Para isso o teste de homogeneidade foi realizado de acordo com Koshimizu et
al (1983)
Na Tabela 4 estatildeo descritos os valores da concentraccedilatildeo celular e o logaritmo
da concentraccedilatildeo celular em funccedilatildeo do tempo com uma vazatildeo de alimentaccedilatildeo de
0124 h-1 A homogeneidade do reator eacute verificada se a queda da concentraccedilatildeo
celular for uma funccedilatildeo exponencial
Tabela 4 - Variaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de leveduras em funccedilatildeo do tempo
Tempo (horas) [X] (g L-1) Ln X
05 89 094939 10 72 085733 15 62 079379
20 57 075587
25 50 070070 30 46 066651 35 39 059988 40 33 051851 45 30 048287 50 25 039445
Aplicando-se o logaritmo neperiano aos valores do [X] (Tabela 4) e
construindo um graacutefico ln X em funccedilatildeo do tempo obtecircm-se a equaccedilatildeo da reta onde
o coeficiente angular da reta obtida eacute igual agrave vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo do
sistema teoacuterico (Dt)
88
Graacutefico 4 Logariacutetmico da concentraccedilatildeo celular em funccedilatildeo do tempo
O valor de Dt obtido pela reta eacute igual a 0115 h-1 que se comparado ao valor
calculado 0124 h-1 apresenta uma diferenccedila de 78 indicando que o sistema
pode ser considerado homogecircneo (KOSHIMIZU et al 1983)
613 Avaliaccedilatildeo de diferentes vazotildees especiacuteficas de alimentaccedilatildeo (D)
O efeito da vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo (D 01 h-1 005 h-1 e 0025 h-1) na
fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua foi avaliada para a produccedilatildeo de etanol Os
resultados satildeo mostrados nos Graacuteficos de 5 a 7
Graacutefico 5 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) etanol () e
accediluacutecar redutor total (ART) para D = 01 h-1
y = -01151x + 09884 Rsup2 = 09912
0010203040506070809
1
0 1 2 3 4 5 6
Ln
X
Tempo (h)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 20 40 60 80 100 120 140
Co
nc
en
tra
ccedilatilde
o (
g L
-1)
Tempo (horas)
Iniacutecio do regime permanente
89
Graacutefico 6 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) Etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 005 h-1
Graacutefico 7 Concentraccedilatildeo celular no regime permanente (XP) Etanol () e accediluacutecar
redutor total (ART) para D = 0025 h-1
Como se pode observar nos Graacuteficos de 5 a 7 foi possiacutevel a obtenccedilatildeo do
regime permanente nos 3 valores de D empregados indicando a adequaccedilatildeo desses
valores e da concentraccedilatildeo de ART agrave velocidade de crescimento do micro-organismo
Nos ensaios de fermentaccedilatildeo contiacutenua a condiccedilatildeo de estado estacionaacuterio foi
obtida apoacutes trecircs tempos de residecircncia sem qualquer tipo de problema operacional
como obstruccedilatildeo do tubo de retirada de caldo crescimento na parede e mistura
imperfeita O Graacutefico 5 mostra um resultado tiacutepico em termos de perfis de
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Co
nc
en
tra
ccedilatilde
o (
g L
-1)
Tempo (horas)
Iniacutecio do regime permanente
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 20 40 60 80 100 120 140
Co
nc
en
tra
ccedilatilde
o (
g L
-1)
Tempo (horas)
Iniacutecio do regime permanente
90
concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de glicose (S) e concentraccedilatildeo de etanol (E)
No estado estacionaacuterio (D = 01 h-1) a concentraccedilatildeo de ART residual na saiacuteda do
reator foi de 9421plusmn449 g L-1 a concentraccedilatildeo celular foi de 547plusmn047 g L-1 e a
concentraccedilatildeo de etanol de 4169plusmn163 g L-1 Com a reduccedilatildeo da vazatildeo especiacutefica de
alimentaccedilatildeo para D = 005 h-1 (Graacutefico 5) a concentraccedilatildeo de glicose residual reduziu
para cerca de 4780plusmn870 g L-1 e as concentraccedilotildees de etanol e celular aumentaram
para 4542plusmn31 g L-1 e 618plusmn077 g L-1 respectivamente devido ao maior tempo de
residecircncia nessa segunda condiccedilatildeo Reduzindo a vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo
para 0025 h-1 (Graacutefico 6) a concentraccedilatildeo de etanol aumentou para 553plusmn757 g L-1
Isso porque menor a vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo maior o tempo de contato
entre as ceacutelulas e o accediluacutecar convertendo-o mais eficientemente no etanol Esse
resultado mostra que a reduccedilatildeo da vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo aumenta a
produtividade em etanol
Similarmente Perego Jr (1979) observaram que a diminuiccedilatildeo da vazatildeo
especiacutefica de 0117 para 0049 h-1 durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
menores foram os valores de ART residual 58 g L-1 e 28 g L-1 respectivamente Por
outro lado a concentraccedilatildeo de etanol aumentou de 496 g L-1 para 68 g L-1 e a
concentraccedilatildeo celular reduziu de 67 g L-1 para 53 g L-1 Esses valores diferiram do
presente trabalho devido agraves diferentes cepas de Saccharomyces cerevisieae bem
como o melaccedilo utilizado O melaccedilo por ser um produto natural varia de composiccedilatildeo
de acordo com o clima solo tempo de colheira
Na Tabela 5 mostra que a reduccedilatildeo da vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo levou a
um aumento no rendimento do processo obtendo maior valor de 636 no emprego
de D igual a 0025 h-1 O aumento na vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo proporciona
um aumento do fluxo de entrada de accediluacutecar provavelmente superior ao aumento da
velocidade de consumo levando a uma diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de etanol
aumento da concentraccedilatildeo de ART residual e consequentemente diminuiccedilatildeo da
eficiecircncia de transformaccedilatildeo O rendimento representa a eficiecircncia da fermentaccedilatildeo
alcooacutelica tomando como base a equaccedilatildeo estequiomeacutetrica de Gay-Lussac onde a
relaccedilatildeo teoacuterica para 100 de eficiecircncia de conversatildeo de hexose em etanol eacute de
0511g de etanol produzido para cada grama de hexose consumida
91
Tabela 5 - Valores de XP ART Etanol e Rendimento do processo no regime
permanente para os diferentes valores de D com ART inicial de 170 gL-1
D (h-1)
XP (gL-1)
ARTf
(gL-1) Ef
(gL-1) η
() Px
(g L-1 h-1) Pe
(g L-1 h-1)
0100 547plusmn047 942plusmn449 417plusmn163 4799 055 417
0050 618plusmn077 478plusmn870 454plusmn310 5229 031 227
0025 609plusmn054 532plusmn567 553plusmn757 6364 015 138
D vazatildeo especiacutefica de alimentaccedilatildeo Xp meacutedia dos valores de concentraccedilatildeo celular ao longo do regime permanente e seus desvios padrotildees ARTf accediluacutecares redutores totais no caldo fermentado Ef oncentraccedilatildeo de etanol no caldo fermentado η Rendimento do processo Px Produtividade em ceacutelulas Pe Produtividade em etanol
Na fermentaccedilatildeo alcooacutelica vaacuterios fatores podem influenciar no rendimento do
processo ou seja a conversatildeo de accediluacutecar em etanol entre eles a concentraccedilatildeo de
accediluacutecar e o fluxo pelo qual ele eacute adicionado e removido do reator (em processos
contiacutenuos) pH concentraccedilatildeo celular presenccedila de bacteacuterias contaminantes e o tipo
de processo adotado Na induacutestria o rendimento do processo eacute calculado baseado
na concentraccedilatildeo de accediluacutecar total que entra no sistema fermentativo sem considerar o
accediluacutecar residual podendo ser maior que 90 a 93 do valor teoacuterico da conversatildeo de
glicose em etanol (INGLEDEW 1999)
O processo de fermentaccedilatildeo mais comumente utilizado nas destilarias do
Brasil eacute utilizando a recuperaccedilatildeo de leveduras atraveacutes da centrifugaccedilatildeo do vinho
Aproximadamente 90 da levedura satildeo reutilizadas de uma fermentaccedilatildeo para a
proacutexima Esta suspensatildeo de fermento diluiacutedo e acidificado conhecido na praacutetica
com o nome de peacute-de-cuba permanece em agitaccedilatildeo de uma a trecircs horas antes de
retornar agrave dorna de fermentaccedilatildeo resultando em altas densidades celulares dentro
do reator (10-17 pv) e contribuindo para um tempo de fermentaccedilatildeo curto Isso
favorece a valores de conversotildees teoacutericos de accediluacutecares em etanol de 90 a 92
(BASSO et al 2008) valores maiores do que os obtidos no presente trabalho
(Tabela 5)
Em termos de produtividades a Tabela 5 mostra que as maacuteximas
produtividades em ceacutelulas (Px) e em etanol (Pe) foram obtidas para um alto valor de
D (01 h-1) de cerca de 055 g L-1 h-1 e 417 g L-1 h-1 respectivamente Por outro
92
lado nessas condiccedilotildees o rendimento em etanol obteve menor valor (48) Quando
a taxa de diluiccedilatildeo eacute alta os accediluacutecares satildeo adicionados a uma velocidade mais raacutepida
do que satildeo consumidos logo a perda de accediluacutecar aumenta e a concentraccedilatildeo de
etanol reduz diminuindo consequentemente a eficiecircncia do processo Como se pode
observar no trabalho de Melzoch et al (1991) a produtividade de etanol maacutexima foi
de 15 g L-1 h-1 no regime permanente com uma concentraccedilatildeo de S cereviseae de 46
g L-1 e concentraccedilatildeo de etanol de 81 g L-1 em bioreator agitado continuamente com
reciclo total de ceacutelulas utilizando a ultrafiltraccedilatildeo
Nas condiccedilotildees adotadas nessa fermentaccedilatildeo com ART de 170gL-1 optou-se
por aplicar D igual a 0025 h-1 por obter um maior valor de rendimento alcooacutelico e
gerar CO2 suficiente a ser incorporado nos cultivos de A platensis em fotobiorreator
tubular
614 Avaliaccedilatildeo dos volaacuteteis orgacircnicos no gaacutes de arraste
De acordo com os resultados obtidos pelo Instituto de Pesquisas Tecnoloacutegicas
foram encontrados nos gaacutes de arraste da fermentaccedilatildeo alcooacutelica contiacutenua
predominacircncia de (CO2) pequenas proporccedilotildees de etanol (C2H6O) e elementos
traccedilos de acetaldeiacutedo (C2H4O) Isso estaacute de acordo com Romano et al (2003) que
relataram as transformaccedilotildees quiacutemicas durante a fermentaccedilatildeo por leveduras
produzem principalmente CO2 e etanol e em menores quantidades a formaccedilatildeo de
CVOs Basso et al (1996) relata que durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica por levedura
os produtos da fermentaccedilatildeo satildeo constituiacutedos de 43 ndash 47 de etanol 41 - 45 de
gaacutes carbocircnico e o restante satildeo formados por outros compostos orgacircnicos tais como
glicerol aacutecido succiacutenico aacutecido aceacutetico entre outros Dentre os volaacuteteis orgacircnicos
majoritaacuterios produzidos durante a fermentaccedilatildeo de mosto de cana-de-accediluacutecar por
Saccharomyces cerevisiae encontram-se o etanol acetaldeiacutedo propanol isobutanol
aacutelcool isoamiacutelico acetato de etila (CAEHOT et al 1991)
93
62 Avaliaccedilatildeo do crescimento da A platensis
Experimento 1
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 60 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Cilindro
Tabela 6 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de carbonato
total referentes ao experimento 1
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 405 plusmn 27 1155 plusmn 000
1 590 plusmn 32 -
2 884 plusmn 24 1193 plusmn 027
3 1248 plusmn 202 -
4 1368 plusmn 99 1186 plusmn 026
5 1914 plusmn 19 -
6 2292 plusmn 103 1131 plusmn 021
7 2379 plusmn 46 -
8 2899 plusmn 17 1124 plusmn 021
9 2831 plusmn 22 -
10 2952 plusmn 76 1106 plusmn 064
Graacutefico 8 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 1
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
94
Experimento 2
Fonte de nitrogecircnio = ureacuteia Intensidade luminosa= 60 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = Cilindro
Tabela 7 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 2 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -44554x3 + 54865x2 + 14317x + 400 (60 mol de foacutetons
m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de
nitrogecircnio (mM dia -1)
0 0484
1 0691
2 0832
3 0906
4 0913
5 0853
6 0726
7 0533
8 0277
Graacutefico 9 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 2 (60 mol de foacutetons m-2 s-1)
0
02
04
06
08
1
0 2 4 6 8 10
mM
Ureacute
ia
Tempo (dias)
95
Tabela 8 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 2
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
Amocircnia total (mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 406 plusmn 000 1155 plusmn 000 - -
1 534 plusmn 49 - - -
2 906 plusmn 18 1155 plusmn 027- 132E-05 240E-04
3 1059 plusmn 37 - - -
4 1538 plusmn 137 1290 plusmn 004 136E-05 197E-04
5 2003 plusmn 94 - - -
6 2330 plusmn 28 1154 plusmn 125 135E-05 212E-04
7 2602 plusmn 25 - - -
8 2847 plusmn 0 1002 plusmn 089 338E-06 827E-04
9 2869 plusmn 14 - - -
10 2847 plusmn 56 1078 plusmn 018 681E-04
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 10 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 2
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
96
Experimento 3
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 60 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 9 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de carbonato
total referentes ao experimento 3
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 490plusmn0 1155 plusmn 000
1 591plusmn92 -
2 1193plusmn87 1224 plusmn 05
3 1430plusmn10 -
4 1959plusmn197 1234 plusmn 023
5 2161plusmn171 -
6 2445plusmn48 129 plusmn 005
7 2621plusmn102 -
8 2789plusmn82 1138 plusmn 104
9 2782plusmn125 -
10 2832plusmn89 111 plusmn 104
Graacutefico 11 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 3
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 5 10 15
X (
mg
L
-1)
Tempo (dias)
97
Experimento 4
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa = 60 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 10 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 4 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -20689x3 + 11591x2 + 33292x + 400 (60 mol de foacutetons
m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 086
1 088
2 088
3 084
4 078
5 068
6 055
7 039
8 020
Graacutefico 12 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 4 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
000
020
040
060
080
100
0 2 4 6 8 10
mM
ureacute
ia
Tempo (dias)
98
Tabela 11 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 4
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
Amocircnia total (mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 494plusmn0 1155plusmn000 - 284E-04
1 618plusmn74 - - -
2 1213plusmn59 1139 plusmn 069 218E-04
3 1498plusmn33 - - -
4 1874plusmn76 1095 plusmn 05 324E-05 221E-04
5 2250plusmn44 - - -
6 2516plusmn147 1083 plusmn 139 42E-04 829E-04
7 2694plusmn105 - - -
8 2867plusmn28 1086 plusmn 091 13E-03 308E-05
9 2871plusmn34 - -
10 2860plusmn61 118 plusmn 071 35E-04 202E-03
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 13 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 4
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg
L
-1)
Tempo (dias)
99
Experimento 5
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 120 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Cilindro
Tabela 12 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 5
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 406 plusmn 0 1155 plusmn 000
1 529 plusmn 22 -
2 894 plusmn 4 1155 plusmn 080
3 1401 plusmn 76 -
4 2118 plusmn 82 1191 plusmn 136
5 2584 plusmn 50 -
6 3209 plusmn 110 1134 plusmn 003
7 3262 plusmn 115 -
8 3302 plusmn 100 1212 plusmn 000
Graacutefico 14 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 5
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
100
Experimento 6
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa= 120 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = Cilindro
Tabela 13 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 6 de
acordo com a equaccedilatildeo y = -13286x3 + 14486x2 + 62226x + 400 (120 mol de
foacutetons m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 0485
1 1010
2 1335
3 1462
4 1389
5 1117
6 0645
Graacutefico 15 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 6 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
0
02
04
06
08
1
12
14
16
0 2 4 6 8
mM
ureacute
ia
Tempo (dias)
101
Tabela 14 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 6
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total
(g L-1)
Amocircnia total
(mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 309 plusmn 00 1155 plusmn 000 - -
1 548 plusmn 10 - - -
2 797 plusmn 7 1117 plusmn 134 214E-05 197E-05
3 1267 plusmn 163 - - -
4 2062 plusmn 92 1101 plusmn 004 291E-06 182E-06
5 2558 plusmn 170 - - -
6 2980 plusmn 103 1253 plusmn 058 119E-06 252E-06
7 3093 plusmn 234 - - -
8 3266 plusmn 50 1033 plusmn 004 275E-06
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 16 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 6
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
102
Experimento 7
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 120 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 15 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 7
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 477 plusmn000 1155 plusmn 000
1 954 plusmn135 -
2 1151 plusmn140 1224 plusmn 080
3 1667 plusmn70 -
4 2165 plusmn256 1233 plusmn 136
5 2516 plusmn147 -
6 2969 plusmn23 1134 plusmn 035
7 2827 plusmn28 -
8 2969 plusmn59 1112 plusmn 114
Graacutefico 17 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 7
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
103
Experimento 8
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa= 120 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 16 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 8 de
acordo com a y = - 58128x3 + 38625x2 + 38606x + 400 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 105
1 115
2 117
3 110
4 095
5 070
6 037
Graacutefico 18 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao experimento 8 (120 mol de foacutetons m-2 s-1)
000
020
040
060
080
100
120
140
0 1 2 3 4 5 6 7
mM
ureacute
ia
Tempo (dias)
104
Tabela 17 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 8
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total
(g L-1) Amocircnia total
(mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 445 plusmn0 1155 plusmn 000 - -
1 767 plusmn46 - - -
2 1053 plusmn50 1117 plusmn 134 430E-04 307E-05
3 1554 plusmn31 - - -
4 2158 plusmn143 1101 plusmn 004 477E-04 273E-06
5 2552 plusmn87 - - -
6 2952 plusmn35 1253 plusmn 058 166E-04 54E-06
7 3048 plusmn96 - - -
8 3079 plusmn86 1033 plusmn 004 367E-05 194E-06
Graacutefico 19 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 8
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
105
Experimento 9
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 240 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = Cilindro
Tabela 18 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 9
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 410 plusmn 0 1155plusmn000
1 815 plusmn 94 -
2 1297 plusmn 206 1117plusmn027
3 2174 plusmn 90 -
4 2625 plusmn 297 1264plusmn033
5 2994 plusmn 213 -
6 3291 plusmn 207 1246plusmn112
7 3422 plusmn 172 -
8 3299 plusmn 117 1045plusmn064
Graacutefico 20 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 9
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
106
Experimento 10
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa= 240 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = Cilindro
Tabela 19 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 10
de acordo com a equaccedilatildeo y = -12057x3 + 10082x2 + 31899x + 400 (240 mol de
foacutetons m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 101
1 134
2 148
3 145
4 123
5 083
6 025
Graacutefico 21 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 10 (240 mol de foacutetons m-2 s-1)
0
02
04
06
08
1
12
14
16
0 1 2 3 4 5 6 7
mM
Ureacute
ia
Tempo (dias)
107
Tabela 20 - Valores meacutedios de concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amocircnia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 10
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total
(g L-1)
Amocircnia total (mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 402 plusmn 000 1155plusmn000 - -
1 461 plusmn 62 - - -
2 839 plusmn 139 1003 plusmn 080 27994E-05
3 1705 plusmn 89 - - -
4 2663 plusmn 95 1120 plusmn 130 153E-05 65768E-06
5 3015 plusmn 78 - - -
6 3236 plusmn 72 1101 plusmn 058 178E-05 95016E-05
7 3307 plusmn 30 - - -
8 3293 plusmn 113 1200 plusmn 017 232E-06 75662E-05
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 22 concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 10
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10
Xm
(m
gL
-1)
Tempo (dias)
108
Experimento 11
Fonte de nitrogecircnio = NaNO3 Intensidade luminosa= 240 mol de foacutetons m-2 s-1
Fonte de CO2 = fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 21 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) e concentraccedilatildeo de
carbonato total referentes ao experimento 11
Tempo (dias) X (mg L-1) Carbonato total (g L-1)
0 358plusmn0 1155plusmn000
1 976plusmn53 -
2 1298plusmn61 1003plusmn27
3 1928plusmn78 -
4 2428plusmn207 1141plusmn014
5 2834plusmn199 -
6 3102plusmn130 1053plusmn161
7 2969plusmn59 -
8 3109plusmn19 965plusmn079
Graacutefico 23 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 11
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10
X (
mg
L-1
)
Tempo (dias)
109
Experimento 12
Fonte de nitrogecircnio = Ureacuteia Intensidade luminosa= 240 mol de foacutetons m-2 s-1 Fonte
de CO2 = fermentaccedilatildeo alcooacutelica
Tabela 22 - Concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente no experimento 12
de acordo com a equaccedilatildeo y = -82763x3 + 62437x2 + 37265x + 400 (240 mol de
foacutetons m-2 s-1)
Tempo (dias) Adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia
(mM dia -1)
0 107
1 126
2 132
3 126
4 107
5 077
6 033
Graacutefico 24 Curva paraboacutelica de adiccedilatildeo de nitrogecircnio em funccedilatildeo do tempo referente
ao ensaio 12 (240 mol de foacutetons m-2 s-1)
000
020
040
060
080
100
120
140
0 2 4 6 8
mM
ureacute
ia
Tempo (dias)
110
Tabela 23 - Valores meacutedios de Concentraccedilatildeo celular (X) concentraccedilatildeo de carbonato
total amonia total e ureacuteia residual referentes ao experimento 12
Tempo (dias)
X (mg L-1) Carbonato total
(g L-1) Amocircnia total
(mol L-1)
Ureacuteia residual
(mol L-1)
0 400plusmn0 1155plusmn000 - -
1 625plusmn228 - - -
2 1095plusmn802 1003 plusmn 080 477E-05
3 1562plusmn357 - -
4 1912plusmn47 1120 plusmn 130 95E-05 110E-04
5 2609plusmn231 - -
6 3071plusmn111 1101 plusmn 058 220E-05 126E-04
7 3180plusmn820 - -
8 3200plusmn734 1200 plusmn 017 25E-06
Valor abaixo do limite miacutenino detectado pela metodologia
Graacutefico 25 Concentraccedilatildeo celular referente ao experimento 12
Resultados do processo descontiacutenuo alimentado no cultivo de Arthrospira
(Spirulina) platensis utilizando CO2 proveniente de cilindro ou de fermentaccedilatildeo
alcooacutelica com diferentes fontes de nitrogecircnio (nitrato de soacutedio ou ureacuteia) e intensidade
luminosas (60 120 ou 240 mol de foacutetons m-2 s-1) podem ser observados nos
Graacuteficos 8 10 11 13 14 17 18 20 22 23 e 26
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
X (
mg
L
-1)
Tempo (dias)
111
Os perfis das curvas de crescimento foram semelhantes com ausecircncia da fase
lag no cultivo de A platensis no iniacutecio do cultivo crescendo exponencialmente e
estabilizando na fase estacionaacuteria As diferentes fontes de nitrogecircnio (nitrato e ureacuteia)
utilizadas nas diferentes intensidades luminosas (60 120 e 240 mol de foacutetons m-2 s-1
avaliadas) natildeo influenciaram nos perfis das curvas de crescimento Essa
caracteriacutestica foi observada em trabalhos anteriores de Pelizer et al (2003) e Danesi
et al (2002) Isso se deve a semelhanccedila nas condiccedilotildees de crescimento tais como
composiccedilatildeo quiacutemica do meio de cultura e temperatura de crescimento entre a
preparaccedilatildeo do inoacuteculo e o cultivo Outro fator eacute que as ceacutelulas para a preparaccedilatildeo do
inoacuteculo estavam na fase exponencial de crescimento isto eacute o inoacuteculo era um cultivo
jovem constituiacutedo de ceacutelulas ativas De fato Pelizer et al (2003) que trabalharam
com KNO3 como fonte de nitrogecircnio relataram a influecircncia da idade do inoacuteculo no
crescimento da S platensis comprovando que a utilizaccedilatildeo de inoacuteculo no 6ordm dia de
cultivo proporcionou maiores valores no crescimento celular em cultivos realizados
em minitanques Nessas condiccedilotildees tambeacutem natildeo detectaram fase lag de
crescimento
Autores como Danesi et al (2002) trabalhando com ureacuteia como fonte de
nitrogecircnio tambeacutem natildeo observaram a presenccedila de fase lag no cultivo de S
platensis De fato mesmo em cultivos onde o inoacuteculo foi cultivado em meio com
nitrato como eacute o caso do presente trabalho seria esperado que o uso de fontes de
nitrogecircnio que levem agrave presenccedila de amocircnia no meio de cultivo natildeo apresentasse
fase lag de crescimento celular pois a amocircnia eacute a fonte de nitrogecircnio
preferencialmente utilizada pela S platensis (BOUSSIBA 1989 BELKIN
BOUSSIBA 1991b)
A fonte de nitrogecircnio no meio de cultura eacute nutriente fundamental para o
crescimento de micro-organismos fotossintetizantes (WEN CHEN 2001) Diferentes
fontes de nitrogecircnio inorgacircnico para o cultivo de S platensis tem sido estudados tais
como cloreto de amocircnio (CARVALHO et al 2004) sulfato de amocircnio (SOLETTO et
al 2005) nitrato de amocircnio fosfato de amocircnio (COSTA et al 2001) nitrato de soacutedio
(SCHLOumlSSER 1982) nitrato de potaacutessio (PAOLLETI 1975) e ureacuteia (SAacuteNCHEZ-
LUNA et al 2004)
Comparando-se os cultivos com nitrato (Graacuteficos 8 11 14 17 20 e 23) e os
cultivos com ureacuteia (Graacuteficos 10 13 16 19 22 e 25) para cada intensidade luminosa
e fonte de CO2 estudada observam-se que as curvas de crescimento dos cultivos e
112
as concentraccedilotildees celulares diaacuterias com ureacuteia foram semelhantes as curvas de
crescimentos e as concentraccedilotildees celulares diaacuterias utilizando nitrato Isso mostra que
a equaccedilatildeo de alimentaccedilatildeo com ureacuteia (Graacuteficos 9 12 15 18 21 e 24) obtida em
cada intensidade luminosa e fonte de CO2 reproduziu seu respectivo cultivo
utilizando o nitrato
Como pode ser observado nas Tabelas 8 1114 17 20 e 23 as concentraccedilotildees
de amocircnia e ureacuteia residual durante os cultivos sempre apresentaram concentraccedilotildees
inferiores ou proacuteximas 10-4 molar mostrando que natildeo houve acuacutemulo de amocircnia e
ureacuteia residual nos cultivos e essa concentraccedilatildeo tambeacutem satildeo consideradas natildeo
toacutexicas pois esta concentraccedilatildeo torna-se toacutexica numa concentraccedilatildeo acima de 10 mM
e inibitoacuteria na concentraccedilatildeo de 17 mM a 2 mM (ABELIOVICH AZOV 1976
CARVALHO et al 2004 CONVERTI et al 2006b)
O nitrato eacute fonte de nitrogecircnio convencional nos cultivos de micro-oganismo e eacute
encontrado em abundacircncia em ambientes naturais No entanto o emprego de
nitrato em meio sinteacutetico utilizado na produccedilatildeo comercial de micro-organismos
pode aumentar custo do produto final Por isso fontes de nitrogecircnio alternativas tecircm
sido estudadas visando agrave reduccedilatildeo nos custo de produccedilatildeo
Ureacuteia tem sido considerada uma fonte alternativa de nitrogecircnio no cultivo de S
platensis por proporcionar um aumento da concentraccedilatildeo celular (SASSANO et al
2004 SOLETTO et al 2005 DANESI et al 2004) e por ter alta competitividade
econocircmica Isso decorre do seu baixo custo e alto conteuacutedo de nitrogecircnio tendo
como consequumlecircncia o baixo custo por unidade de nitrogecircnio quando comparada a
outras fontes de nitrogecircnio
A ureacuteia quando hidrolisada origina duas moleacuteculas de amocircnia e uma de
dioacutexido de carbono Essa conversatildeo ocorre primeiramente quando a ureacuteia
(CO(NH2)2) combina com a aacutegua (hidroacutelise) e forma o carbonato de amocircnio
((NH4)2CO3) Esse composto eacute instaacutevel e decompotildee para formar o gaacutes amocircnia (NH3)
e o dioacutexido de carbono (CO2) (DORN 2007) A amocircnia por sua vez eacute uma moleacutecula
pequena e natildeo carregada que se move relativamente livre atraveacutes da bicamada
lipiacutedica Um possiacutevel mecanismo para a assimilaccedilatildeo da amocircnia pode envolver a
simples difusatildeo da amocircnia seguindo pelo seu aprisionamento atraveacutes da
protonaccedilatildeo uma vez que dependendo do pH (pH 8) em que se encontra a amocircnia
reage com a aacutegua formando o iacuteon amocircnio (NH4+) Portanto a membrana eacute
permeaacutevel agrave amocircnia mas impermeaacutevel ao iacuteon amocircnio (BOUSSIBA et al 1984)
113
Costa et al (2001) em estudos comparativos usando diferentes fontes de
nitrogecircnio em processo descontiacutenuo no cultivo de S platensis observaram que
001 M de ureacuteia ou nitrato de amocircnio proporcionaram maiores concentraccedilotildees
celulares de aproximadamente 1g L-1 natildeo diferindo estatisticamente do cultivo com
o nitrato de soacutedio No entanto nos cultivos com maiores concentraccedilotildees dessas
fontes de nitrogecircnio (003 M e 005 M) natildeo houve crescimento celular
Costa et al (2004) avaliaram o crescimento da S platensis na lagoa Mangueira
suplementando ureacuteia por processo descontiacutenuo alimentado e observaram um
aumento de 267 vezes na concentraccedilatildeo da biomassa no cultivo suplementado com
1125 mg L-1 de ureacuteia quando comparada nos cultivos natildeo suplementado com ureacuteia
No entanto nos cultivos com 2250 mg L-1 de ureacuteia houve uma reduccedilatildeo na
concentraccedilatildeo celular Isso sugere que a adiccedilatildeo de ureacuteia na lagoa Mangueira eacute
beneacutefica ao crescimento da S platensis mas se adicionada em altas concentraccedilotildees
podem inibir o crescimento Por outro lado Soletto et al (2005) compararam cultivos
de S platensis utilizando processo descontiacutenuo com a mesma concentraccedilatildeo de
sulfato de amocircnio ou ureacuteia como fonte de nitrogecircnio e observaram que na
concentraccedilatildeo de 17 mM houve um raacutepido crescimento da biomassa quando
utilizado ureacuteia e houve uma inibiccedilatildeo no crescimento quando utilizado o sulfato de
amocircnio Como sugerido em trabalhos preacutevios a accedilatildeo simultacircnea das condiccedilotildees
alcalina (DANESI et al 2002) e a accedilatildeo da urease (CARVAJAL et al 1982
SHIMAMATSU 2004) poderia ter promovido a hidroacutelise da ureacuteia em amocircnia
acoplado com a assimilaccedilatildeo da amocircnia pelas ceacutelulas minimizando portanto a
inibiccedilatildeo pela amocircnia
Sassano et al (2004) observaram que utilizando 500 mg L-1 de massa total de
ureacuteia alimentada durante 12 dias proporcionou aumento na concentraccedilatildeo de S
platensis em minitanques quando comparadas ao emprego do nitrato
Su et al (2007) observaram que o maior desempenho em termos de
rendimento de biomassa e conteuacutedo de lipiacutedios durante o crescimento da Isochrysis
galbana foi no meio contendo ureacuteia como fonte de nitrogecircnio indicando que a ureacuteia
eacute a fonte preferencial de nitrogecircnio em relaccedilatildeo ao (NH4)2SO4 e NH4Cl
O emprego da ureacuteia pode levar a inibiccedilatildeo do crescimento celular Em condiccedilatildeo
alcalina ou a presenccedila de urease no meio de cultivo hidrolisa uma moleacutecula de ureacuteia
em duas moleacuteculas de amocircnia e esta em altas concentraccedilotildees eacute considerada toacutexica
para as ceacutelulas (SASSANO et al 2004) Por outro lado quando em baixas
114
concentraccedilotildees podem limitar o crescimento uma vez que a presenccedila nitrogecircnio eacute
fundamental para o crescimento e manutenccedilatildeo celular Por isso o modo de adiccedilatildeo
de ureacuteia eacute importante para melhorar a produtividade do cultivo
O modo de alimentaccedilatildeo empregado no cultivo de ureacuteia pode prevenir o
acuacutemulo ou a falta desse nutriente no cultivo Sanchez-Luna et al (2004) relataram
que a adiccedilatildeo diaacuteria de ureacuteia a uma taxa constante pode ser usada no cultivo de S
platensis implicando em baixo custo na produccedilatildeo da biomassa por natildeo precisar de
bombas para alimentaccedilatildeo
A baixa concentraccedilatildeo de nitrogecircnio no cultivo limita o crescimento celular Por
outro lado a alta concentraccedilatildeo de nitrogecircnio inibe o mesmo Deste modo foram
feitos cultivos de A platensis utilizando a fonte de nitrogecircnio convencional (NaNO3)
para se observar a necessidade diaacuteria de nitrogecircnio consumida pelas ceacutelulas nas
diferentes intensidades luminosas e com base nessas curvas de crescimento
obtidas foram calculadas as quantidades de ureacuteia diaacuteria necessaacuterias visando evitar
a limitaccedilatildeo ou inibiccedilatildeo de crescimento celular pela fonte de nitrogecircnio como pode-se
observar nas Tabelas 7 9 10 13 16 19 e 22 Aleacutem disso foi empregado o
processo descontiacutenuo alimentado que deve ser usado para melhorar a densidade
celular no crescimento da A platensis desde que a concentraccedilatildeo de nitrogecircnio
soluacutevel possa ser adicionada ateacute alcanccedilar a produccedilatildeo maacutexima de biomassa sem
resultar na inibiccedilatildeo do crescimento
Outro fator importante no crescimento celular de micro-organismos
fotossintetizantes eacute a intensidade luminosa Nas culturas fotossinteacuteticas a
quantidade de energia luminosa captadas pelas ceacutelulas tem uma relaccedilatildeo direta com
a capacidade de fixaccedilatildeo do CO2 consequentemente a luz determina a
produtividade e a taxa de crescimento celular As diferentes intensidades luminosas
estudadas influenciaram nas concentraccedilotildees celulares maacuteximas Um aumento da
intensidade luminosa de 60 mol de foacutetons m-2 s-1 para 120 mol de foacutetons m-2 s-1
houve um aumento no valor da concentraccedilatildeo celular maacutexima No entanto um
aumento da intensidade luminosa de 120 mol de foacutetons m-2 s-1 para 240 mol de
foacutetons m-2 s-1 as concentraccedilotildees celulares maacuteximas obtiveram valores proacuteximos
Geralmente a taxa de crescimento das ceacutelulas microalgas aumenta com a
intensidade luminosa e a taxa atinge um valor de saturaccedilatildeo quanto maior for a
intensidade luminosa porque o excesso da energia luminosa natildeo pode ser utilizada
para a fotossiacutentese nas ceacutelulas e quando submetidas a um valor de intensidade
115
luminosa ainda maior o crescimento celular eacute reprimido como relatado por Hirata et
al (1998) e Chojnacka e Noworyta (2004a)
Segundo Hirata et al (1998) e Chojnacka e Noworyta (2004a) existe uma
correlaccedilatildeo entre o crescimento da Arthrospira ssp e a intensidade luminosa que satildeo
definidas por regiotildees denominadas regiatildeo limitada por luz saturada por luz e inibida
por luz A regiatildeo saturada por luz eacute definida como alta intensidade luminosa onde o
crescimento celular independe da intensidade luminosa Essa regiatildeo saturada por
luz pode ser observada no presente trabalho uma vez que o aumento da
intensidade luminosa natildeo interferiu na concentraccedilatildeo celular maacutexima O intervalo da
intensidade luminosa dessas regiotildees depende de vaacuterios fatores como configuraccedilatildeo
do reator micro-organismo condiccedilotildees de cultivo
S platensis cultivada em reator retangular alcanccedilou um aumento no valor da
velocidade especiacutefica de crescimento com o aumentou da intensidade luminosa de 8
a 34 W m-2 mas foi reduzido quando a intensidade luminosa aumentou de 34 W m-2
(156 mol de foacutetons m-2 s-1) para 158 W m-2 (724 mol de foacutetons m-2 s-1) e foi
completamente reprimida a 158 W m-2 (HIRATA et al 1998) Chojnacka e Noworyta
(2004a) avaliando o cultivo fotoautotroacutefico da S platensis em reator retangular
tambeacutem concluiacuteram que a velocidade de crescimento especiacutefica aumenta com o
aumento da intensidade luminosa ateacute um valor de 30 W m-2 Entre os valores de
intensidade luminosa de 30 W m-2 (138 mol de foacutetons m-2 s-1) a 50 W m-2 (229 mol
de foacutetons m-2 s-1) observa-se a regiatildeo de saturaccedilatildeo luminosa e acima desse valor
(50 W m-2) ocorre o fenocircmeno da fotoinibiccedilatildeo
Nos cultivos sob maiores intensidades luminosas (120 e 240 mol de foacutetons m-2
s-1) desenvolveram uma coloraccedilatildeo amarelada no decorrer do cultivo por outro lado
no cultivo a 60 mol de foacutetons m-2 s-1 as ceacutelulas apresentaram uma coloraccedilatildeo mais
verde-azulada claacutessica Como eacute bem conhecido sob condiccedilotildees limitantes de
nitrogecircnio o conteuacutedo de clorofila da S platensis diminui apresentando uma
coloraccedilatildeo verde-amarelada ao contraacuterio da coloraccedilatildeo verde-azulada claacutessica
(CARVALHO et al 2004) No entanto no presente estudo como natildeo houve
limitaccedilatildeo de nitrogecircnio durante os cultivos essa coloraccedilatildeo amarelada pode ser
devido agrave alta intensidade luminosa uma vez que as intensidades luminosas
estudadas atingiram a regiatildeo saturado por luz como definido por Hirata et al (1998)
e Chojnacka e Noworyta (2004a) Do mesmo modo Vonshak et al (1996) relataram
que o crescimento da S platensis torna-se saturado a um intervalo de 150 a 200
116
mol de foacutetons m-2 s-1 e esta faixa da intensidade luminosa corresponde a
aproximadamente de 10-15 da radiaccedilatildeo solar total a 400-700 nm
Geralmente o pH do meio aumenta durante o crescimento celular devido agrave
assimilaccedilatildeo da fonte de carbono o bicarbonato durante a fotossiacutentese (WATANABE
et al 1995 BINAGHI et al 2003) Os iacuteons bicarbonato satildeo transportados
ativamente para o interior celular convertidos a carbonato e gaacutes carbocircnico que eacute
utilizado na fotossiacutentese Para cada moleacutecula de CO2 utilizada pela ceacutelula ocorre a
liberaccedilatildeo de um iacuteon carbonato O pH da cultura foi mantido a 95 02 (SANCHEZ-
LUNA et al 2007 TREDICI ZITTELLI 1998) logo o CO2 consumido pelo micro-
organismo foi reposto por CO2 natildeo havendo modificaccedilotildees severas do pH o que
acarretaria uma reduccedilatildeo no crescimento da S platensis Valores de pH altos por
exemplo acima de 11 pode ser um fator no qual restringe a produtividade no
sistema air-lift usando ar natildeo suplementado com CO2 (WATANABE et al 1995)
Normalmente culturas de microorganismos fotossinteacuteticos usam como fonte
de carbono o bicarbonato eou carbonato Estes nutrientes satildeo adicionados em
grande quantidade no meio Schloumlsser para o cultivo de A platensis (1208 g L-1)
Adicionalmente estes micro-organismos tecircm a capacidade de fixar CO2 como fonte
de carbono na qual eacute liberado pelos efluentes industriais Logo este CO2 pode ser
adicionado ou substituiacutedo no meio de cultura reduzindo os custos da produccedilatildeo de
microorganismos fotossinteacuteticos bem como reduzindo os problemas ambientais
causados por esse gaacutes
O sequestramento de CO2 mostrou ser efetivo nas ceacutelulas de Chlorella
vulgaris e a presenccedila da mistura de CVOs (benzeno tolueno acetona metanol e
naftaleno) presente no efluente natildeo interferiu no uso desse CO2 e adicionalmente
11 dos CVOs foram removidos (KEFFER KLEINHEINZ 2002)
Diferentes autores relataram sobre o crescimento mixotroacutefico da A platensis
na presenccedila de glicose (ZHANG et al 1998 CHOJNACKA NOWORYTA 2004) ou
acetato (CHEN et al 2006) Maacuterquez et al (1993) mostraram que a S platensis eacute
capaz de crescer heterotroficamente ou mixotroficamente na presenccedila de glicose
sugerindo que o crescimento autotroacutefico e heterotroacutefico satildeo independentes Em
cultivos mixotroacuteficos o CO2 e composto orgacircnico satildeo assimilados conjuntamente
podendo ser um processo mais eficiente para a produccedilatildeo de biomassa microalgal
desde que isto implica em uma economia em energia usada para a siacutentese do
aparato fotossinteacutetico e para a fixaccedilatildeo do carbono (LEE 2004) Chen et al (2006)
117
mostraram que o acetato pode ser usado como fonte de carbono em cultivos
mixotroacuteficos de S platensis para a produccedilatildeo de vaacuterios pigmentos fotossinteacuteticos e
obtenccedilatildeo da concentraccedilatildeo de biomassa maacutexima (165 g Lminus1) na qual obtiveram
valores maiores que usando apenas bicarbonato (108 g L-1)
Menzyanova et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de pequenas quantidades
de etanol (01 - 03) aumentou a concentraccedilatildeo de Dunaliella viridis enquanto que
em quantidades maiores que 05 natildeo houve efeito no crescimento A adiccedilatildeo
muacuteltipla e sucessiva de etanol no cultivo favoreceu a um acuacutemulo de etanol no meio
de cultivo o que provocou uma inibiccedilatildeo o crescimento da D viridis quando a
concentraccedilatildeo de etanol foi de 03 e causou a morte celular na concentraccedilatildeo de
etanol de 05
Apesar do etanol ser o CVO predominante no material gasoso sua proporccedilatildeo
em relaccedilatildeo ao CO2 eacute pequena (resultados obtidos pelo instituto de Pesquisa
Tecnoloacutegica) Assim no presente trabalho natildeo se observou um efeito dos volaacuteteis
orgacircnicos (CVOs) liberados da fermentaccedilatildeo alcooacutelica no cultivo de A platensis
Esses CVOs satildeo constituiacutedos a maior parte por 43 ndash 47 de etanol (Basso et al
1996) e em menor quantidade acetaldeiacutedo propanol isobutanol aacutelcool isoamiacutelico e
acetato de etila (CAEHOT et al 1991) Logo A platensis pode ser usada para o
tratamento de efluentes gasosos nas induacutestrias de fermentaccedilatildeo alcooacutelica Logo
observou-se que o efluente gasoso liberado das induacutestrias de fermentaccedilatildeo alcooacutelica
pode ser usado no cultivo de A platensis sem prejudicar o crescimento celular
Similarmente Ferraz et al (1985) observaram que eacute possiacutevel cultivar S
maxima em reatores abertos (open ponds) borbulhando o CO2 proveniente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica de modo descontiacutenuo e usando nitrato com fonte de
nitrogecircnio
A adiccedilatildeo de CO2 no reator aleacutem de controlar o pH fornece a fonte de
carbono para o crescimento celular Como pode ser observado nas Tabelas 6 8 9
11 12 14 15 17 18 20 21 e 23 mesmo ocorrendo o crescimento celular as
concentraccedilotildees de carbonato total sempre apresentaram valores altos de um modo
geral proacuteximos aos 1208 g L-1 iniciais (concentraccedilatildeo indicada em Schloumlsser et al
1982) indicando que os cultivos tambeacutem natildeo foram limitados pela fonte de carbono
Durante a fotossiacutentese oxigecircnica realizada pela S platensis ocorre a
liberaccedilatildeo de O2 no meio de cultura Elevadas concentraccedilotildees de O2 no meio de
cultura pode prejudicar o crescimento celular uma vez que este pode danificar o
118
aparato fotossinteacutetico dificultando a realizaccedilatildeo da fotossiacutentese Por isso a
concentraccedilatildeo de O2 deve ser controlada durante o crescimento celular As
concentraccedilotildees de oxigecircnio foram analisadas diariamente e os valores natildeo atnigiram
niacuteveis inibitoacuterios pois foram sempre menores que 10 mg L-1 (Vonshak 1997)
119
63 Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm)
Produtividade em ceacutelulas (Px) e Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN)
Na Tabela 24 estatildeo descritos os valores da concentraccedilatildeo celular maacutexima
produtividade em ceacutelulas e fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas Nas Tabelas
25 28 e 31 estatildeo descritos a anaacutelise de variacircncia dos paracircmetros cineacuteticos Xm Px
e YXN respectivamente Os valores meacutedios de Xm Px e YXN para cada variaacutevel
independente estatildeo descritos nas Tabelas 26 27 29 30 32 e 33
Tabela 24 - Valores da concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) produtividade em ceacutelulas
(Px) e fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) com diferentes fontes de
CO2 fontes de nitrogecircnio e intensidades luminosas
Experimento Fonte de CO2 Intensidade luminosa (I)
Fonte de nitrogecircnio
Xm
(mg L-1)
Px
(mg L-1 d-1)
YXN
(g g-1)
1 Cilindro 60 NaNO3 2899 plusmn 17 250 plusmn 2 42 plusmn 003
2 Cilindro 60 Ureacuteia 2847plusmn 1 245 plusmn 1 14 plusmn 000
3 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 60 NaNO3 3120plusmn156 299 plusmn10 40 plusmn 014
4 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 60 Ureacuteia 2957 plusmn 99 308 plusmn 4 14 plusmn 017
5 Cilindro 120 NaNO3 3209plusmn109 454 plusmn18 45 plusmn 018
6 Cilindro 120 Ureacuteia 2980plusmn103 408 plusmn17 11 plusmn 050
7 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 120 NaNO3 2728 plusmn 27 428 plusmn 4 43 plusmn 004
8 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 120 Ureacuteia 2855 plusmn 11 425 plusmn 6 15 plusmn 02
9 Cilindro 240 NaNO3 3291plusmn206 482 plusmn 34 54 plusmn 038
10 Cilindro 240 Ureacuteia 3236 plusmn 72 473 plusmn 12 133plusmn034
11 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 240 NaNO3 3102plusmn130 450 plusmn 22 50 plusmn 024
12 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 240 Ureacuteia 3070plusmn112 445 plusmn19 14 plusmn 056
I = mol de foacutetons m-2
s-1
631 Concentraccedilatildeo celular maacutexima
Na Tabela 25 estatildeo apresentados os resultados da anaacutelise de variacircncia da
concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) e nas Tabelas 26 e 27 estatildeo apresentadas as
120
meacutedias do Xm nas variaacuteveis independentes fontes de nitrogecircnio e intensidades
luminosas respectivamente
Tabela 25 - Anaacutelise de variacircncia para a concentraccedilatildeo celular maacutexima
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
13585 1 13585 157 0225
Fonte de Nitrogecircnio
84 1 84 001 0922
Intensidade luminosa
443083 2 221542 2566 0000
Resiacuteduos 164033 19
total 620786 23
Como se observa na Tabela 25 a variaacutevel independente intensidade luminosa
foi estatisticamente significante na determinaccedilatildeo do Xm (p = 0000) enquanto que
as variaacuteveis independentes fontea de CO2 (p = 0225) e fonte de nitrogecircnio (p =
0922) natildeo influenciaram estatisticamente no valor de Xm De fato a similaridade das
fontes de nitrogecircnio jaacute era esperada uma vez que a adiccedilatildeo de ureacuteia nos cultivos para
cada intensidade luminosa foram baseadas em seus respectivos cultivos com nitrato
visando um crescimento celular natildeo limitado e nem inibido pela fonte de nitrogecircnio e
obtendo portanto valores de Xm meacutedios semelhantes Ambas as fontes de nitrogecircnio
utilizadas satildeo facilmente assimiladas pela A platensis os valores de Xm foram
estatisticamente iguais para cada intensidade luminosa avaliada (Tabela 26)
Em relaccedilatildeo agrave fonte de CO2 Isto mostra que o CO2 e os volaacuteteis orgacircnicos
liberados na atmosfera como resiacuteduo podem ser utilizados como fonte de carbono
no cultivo de A platensis sem prejudicar o crescimento celular
Tabela 26 - Meacutedias das concentraccedilotildees celular maacutexima para a variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio
Fonte de nitrogecircnio Xm meacutedia (mgL-1)
Nitrato 3027 plusmn 162ordf
Ureacuteia 3031 plusmn 174ordf
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
121
Comparando-se as meacutedias de Xm entre as diferentes intensidades luminosas
observa-se que o valor meacutedio de Xm na intensidade luminosa de 60 mol de foacutetons
m-2 s-1 foi estatisticamente diferente ao valor meacutedio de Xm quando a intensidade
luminosa foi de 120 mol de foacutetons m-2 s-1 e este foi estatisticamente semelhante ao
valor meacutedio de Xm quando a intensidade luminosa foi de 240 mol de foacutetons m-2 s-1
(Tabela 27) Essas comparaccedilotildees das meacutedias de Xm explicam o valor do niacutevel
descritivo obtido pela anaacutelise de variacircncia para a variaacutevel intensidade luminosa (p
=0000 Tabela 25) mostrando que a esta influencia no valor de Xm Esses
resultados estatildeo de acordo com Chojnacka e Noworyta (2004a) que avaliaram o
cultivo fotoautotroacutefico da S platensis em reator retangular tambeacutem concluiacuteram que a
velocidade de crescimento especiacutefica aumenta com o aumento da intensidade
luminosa ateacute um valor de 30 W m-2 (138 mol de foacutetons m-2 s-1) Entre os valores de
intensidade luminosa de 30 W m-2 (138 mol de foacutetons m-2 s-1) a 50 W m-2 (229 mol
de foacutetons m-2 s-1) observa-se a regiatildeo de saturaccedilatildeo luminosa Acima desse valor (50
W m-2) ocorre o fenocircmeno da fotoinibiccedilatildeo Do mesmo modo no presente trabalho
os valores de Xm foram estatisticamente iguais nas intensidades luminosas de 120
mol de foacutetons m-2 s-1 e 240 mol de foacutetons m-2 s-1 cujas intensidades luminosas satildeo
proacuteximas agraves intensidades luminosas que correspondem agrave regiatildeo de saturaccedilatildeo
luminosa observada por Chojnacka e Noworyta (2004a)
Tabela 27 - Meacutedias das concentraccedilotildees celular maacutexima para a variaacutevel independente
intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(mol de foacutetons m-2 s-1)
Xm meacutedia (mgL-1)
60 2851plusmn54ordf
120 3056plusmn115b
240 3180plusmn96b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
A maior concentraccedilatildeo celular maacutexima encontrada nesse trabalho foi maior do
que a obtida por Binaghi et al (2003) utilizando minitanques no cultivo de S
platensis (15 g L-1) e tambeacutem maior que a obtida por Watanabe e Hall (1996)
utilizando fotobiorreator tubular cocircnico no cultivo de S platensis (13 g L-1)
122
Morais e Costa (2007a) relataram que em cultivo de S platensis em
fotobiorreator tubular vertical obtiveram maiores valores de Xm de 413 g L-1
suplementado com 6 CO2 quando comparadas em cultivos em Erlenmeyer Esses
autores relatam que a S platensis podem crescer com 18 CO2 demonstrando que
estes suportam altas concentraccedilotildees de CO2 podendo ser usado para mitigar o efeito
do CO2 emitido pelos gases efluentes
Olguiacuten et al (2001) avaliando o crescimento da S platensis em meio contendo
aacutegua do mar suplementado com efluentes anaeroacutebicos a partir da digestatildeo de
resiacuteduo da suinocultura e em meio Zarrouk tambeacutem observaram um aumento no
valor de Xm com o aumento da intensidade luminosa de 66 mol de foacutetons m-2 s-1
para 144 mol de foacutetons m-2 s-1
632 Produtividade volumeacutetrica de ceacutelulas
Na Tabela 28 estatildeo apresentados os resultados da anaacutelise de variacircncia da
produtividade em ceacutelulas (Px) e nas Tabelas 29 e 30 estatildeo apresentadas as meacutedias
do Px nas variaacuteveis independentes fontes de nitrogecircnio e intensidades luminosas
respectivamente
Tabela 28 - Anaacutelise de variacircncia para a produtividade em ceacutelulas
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
315 1 315 137 0256
Fonte de Nitrogecircnio
1 1 1 000 0947
Intensidade luminosa
116579 2 58289 25372 0000
Resiacuteduos 4365 19 230
total 121260 23
Avaliando-se os paracircmetros produtividades em ceacutelulas pela anaacutelise de
variacircncia (Tabela 28) pode-se notar que a fonte de CO2 (p=0256) e a de nitrogecircnio
(p=0947) natildeo interferiram nas produtividades em celulares Portanto a intensidade
luminosa mostrou ser estatisticamente significante no valor de Px (p=0000)
123
Tabela 29 - Meacutedias das produtividades em ceacutelulas para a variaacutevel independente
fonte de nitrogecircnio
Fonte de nitrogecircnio Px meacutedio (mgL-1 d-1)
Nitrato 404 plusmn 74ordf
Ureacuteia 405 plusmn 75ordf
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
Como se pode observar na Tabela 29 os valores meacutedios de Px para as
diferentes fontes de nitrogecircnio estudadas natildeo diferiram estatisticamente Do mesmo
modo como ocorreu com o paracircmetro Xm os valores de Px nos cultivos com ureacuteia e
nitrato foram semelhantes para cada intensidade luminosa Isso jaacute era esperado
uma vez que a adiccedilatildeo de ureacuteia nos cultivos para cada intensidade luminosa foram
baseadas em seus respectivos cultivos com nitrato Spirulina platensis cultivadas em
minitanques com 257 mg L-1 de KNO3 ou 500 mg L-1 de ureacuteia obtiveram valores de
Px semelhantes para as intensidades luminosas estudadas 14 klux (168 mol de
foacutetons m-2 s-1) ou 56 klux (672 mol de foacutetons m-2 s-1) (RANGEL-YAGUI et al 2004)
Tabela 30 - Meacutedias das produtividades em ceacutelulas para a variaacutevel independente intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(mol de foacutetons m-2 s-1)
Px meacutedio (mgL-1)
60 306plusmn7a
120 443plusmn19b
240 463plusmn16b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
Os maiores valores de produtividade em ceacutelulas foram encontrados nas
maiores intensidades luminosas obtendo valores meacutedios de 443 plusmn 19 mg L-1 d-1 a
120 μmol de foacutetons m-2 s-1 e 463 plusmn 16 mg L-1 d-1 a 240 μmol de foacutetons m-2 s-1
independente da fonte de nitrogecircnio utilizada (Tabela 30) Durante a fotossiacutentese as
ceacutelulas podem utilizar somente uma soma limitada de energia luminosa por vez
Este fenocircmeno de saturaccedilatildeo luminosa eacute provavelmente resultado de um mecanismo
interno onde as ceacutelulas podem realizar a fotossiacutentese usando somente uma
124
determinada quantidade de luz (CARLOZZI 2003) Isso significa que durante a
saturaccedilatildeo luminosa um aumento da intensidade luminosa natildeo permitiraacute um
aumento da concentraccedilatildeo celular e nem reduziraacute o tempo de cultivo mantendo
proacuteximos os valores de produtividades de ceacutelulas nesse intervalo de saturaccedilatildeo
luminosa
Na menor intensidade luminosa (60 mol de foacutetons m-2 s-1) o valor de Px foi
menor em relaccedilatildeo agraves outras intensidades luminosas obtendo valor meacutedio de 306 plusmn 7
mg L-1 d-1 Do mesmo modo como observado nas outras intensidades luminosas as
fontes de nitrogecircnio estudadas natildeo influenciaram na produtividade celular Essa
diferenccedila nos valores de Px entre as intensidades luminosas foi devido a um maior
tempo de cultivo nos experimentos submetidos agrave intensidade luminosa de 60 mol
de foacutetons m-2 s-1 A produtividade eacute uma razatildeo inversa do tempo de cultivo logo
quanto maior a intensidade luminosa mais raacutepida as ceacutelulas atingem a concentraccedilatildeo
celular maacutexima e consequentemente maior seraacute a produtividade celular diaacuteria
Quanto maior a intensidade luminosa maior eacute a quantidade de foacutetons emitidos e
estes podem ser absorvidos pelas ceacutelulas isto eacute maior eacute a quantidade de energia
luminosa que seraacute convertido em energia quiacutemica que por sua vez as ceacutelulas
utilizam essa energia quiacutemica para a manutenccedilatildeo e o crescimento celular Esse
efeito tambeacutem foi observado por Danesi et al (2004) Rangel-Yagui et al (2004) em
cultivos de S platensis em minitanques utilizando KNO3 ou ureacuteia como fontes de
nitrogecircnio
O maior valor da produtividade encontrada nesse trabalho foi proacuteximo a 510 mg
L-1 d-1 obtido por Watanabe e Hall (1996) investigando o crescimento da S platensis
em fotobiorreator helicoidal cocircnico sob ciclos 12h12h (claroescuro) e uma meacutedia
de fluxo de foacutetons de 546 mol de foacutetons m-2 s-1 Watanabe et al (1995) em
processo descontiacutenuo utilizando a S platensis cultivada em fotobiorreator tubular
helicoidal cocircnico utilizando luz artificial (118 mol de foacutetons m-2 s-1) tambeacutem
obtiveram uma produtividade volumeacutetrica diaacuteria de 051 g L-1d-1 Foram usados dois
sistemas (airlift e bomba) para reciclar a cultura Com o sistema airlift os autores
encontraram a maior concentraccedilatildeo da biomassa de 16 g L-1 apoacutes 5 dias de
crescimento da S platensis e uma menor concentraccedilatildeo da biomassa quando
utilizado o sistema de bomba No fotobiorreator tubular helicoidal cocircnico quando
cultivado em ambiente externo a produtividade foi de 900 mg L-1 d-1 (TREDICI
125
ZITTELLI 1998) Travieso et al (2001) encontrou uma produtividade maacutexima de
040 g Lminus1 dminus1 em fotobiorreator tubular helicoidal operado de modo semicontiacutenuo
No presente trabalho os maiores valores da produtividade em ceacutelulas
encontradas foram maiores do que a relatada por Richmond (1990) em reatores
tubulares em ambiente externo que foi de 370 mg L-1 d-1 e Morais e Costa (2007b)
que obteve Xmax de 022 g Lminus1 dminus1 no cultivo de Spirulina sp na presenccedila de 6 de
dioacutexido de carbono em fotobiorreator tubular com trecircs estaacutegios em seacuterie Por outro
lado autores como Carlozzi e Pinzani (2005) conseguiram uma produtividade em
ceacutelulas maacutexima de 182 g L-1 dminus1 utilizando o processo descontiacutenuo em ambiente
externo Lee (2001) relata que dependendo da configuraccedilatildeo de fotobiorreator tubular
fechado e de placas retangulares a produtividade volumeacutetrica foi de 025 a 364 g L-1
d-1 utilizando o processo descontiacutenuo alimentado
Travieso et al (2001) relataram uma produtividade maacutexima de 04 g L-1 d-1 em
processo semicontiacutenuo de Spirulina utilizando uma diluiccedilatildeo de 15 e taxa de diluiccedilatildeo
de 00078 hminus1 Esses autores utilizaram o fotobiorreator patenteado bdquobdquoBiocoil‟‟ da
Biotechna Grasser UK (European patent EPO239272 March 6 1987)
Vernerey et al (2001) utilizando uma nova configuraccedilatildeo de fotobioretator para o
aumento da escala (72 litros) na produccedilatildeo de S platensis conseguiram uma
produtividade de 138 g L-1 d-1 com intensidade luminosa de 300 W m-2 e pH
controlado a 95 pela adiccedilatildeo de CO2
Cultivos de Arthrospira platensis em fotobiorreator tubular outdoor no periacuteodo
de marccedilo a setembro de 2002 na Repuacuteblica Checa com a maioria dos dias
ensolarados a irradiacircncia do ambiente maacutexima foi entre 15 and 18 mmol de foacutetons
mminus2 sminus1 Nessas condiccedilotildees a produtividade maacutexima atingida foi de 05 g Lminus1 dminus1
correspondendo a um rendimento de aacuterea (baseada na aacuterea superficial) de
aproximadamente 325 g mminus2 dminus1 na qual eacute um valor relativamente alto se considerar
que foi obtida no mecircs de setembro A concentraccedilatildeo celular oacutetima da cultura foi
obtida em um intervalo de 1 a 2 g L-1 demostrando que a faixa da concentraccedilatildeo
celular oacutetima no cultivo de Spirulina natildeo eacute muito restrita (MASOJIDEK et al 2003)
633 Fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas
Na Tabela 31 estatildeo os resultados da anaacutelise de variacircncia para o fator de
conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) e nas Tabelas 32 e 33 estatildeo os valores
126
meacutedios do YXN nas variaacuteveis independentes fontes de nitrogecircnio e intensidades
luminosas respectivamente
Tabela 31 - Anaacutelise de variacircncia para fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
054 1 054 091 0351
Fonte de Nitrogecircnio
5078 1 5078 8453 0000
Intensidade luminosa
043 2 022 036 0700
Resiacuteduos 1123 19 059
total 520 23
Como observado na Tabela 24 os maiores valores do fator de conversatildeo (YXN)
foram obtidos nos cultivos utilizando ureacuteia como fonte de nitrogecircnio independente
da fonte de CO2 e da intensidade luminosa utilizada Isso pode ser avaliado pela
anaacutelise de variacircncia (Tabela 31) onde apresenta o niacutevel descritivo para a fonte de
CO2 fonte de nitrogecircnio de p = 0000 e para a intensidade luminosa o p = 0700 A
maior meacutedia dos valores de YXN foi 1380 plusmn 090 g g-1 obtida nos cultivos utilizando
ureacuteia como fonte de nitrogecircnio (Tabela 32) diferindo estatisticamente dos valores
obtidos nos cultivos com nitrato (460 plusmn 055 g g-1) De fato nos cultivo utilizando
ureacuteia a concentraccedilatildeo de nitrogecircnio adicionada diariamente foi calculada com base
na necessidade das ceacutelulas para o crescimento e a manutenccedilatildeo celular natildeo
ocorrendo uma limitaccedilatildeo ou um excesso de nitrogecircnio adicionado durante o cultivo
(item 5) Como mencionado por Rangel-Yagui et al (2004) o excesso de ureacuteia
diminui a eficiecircncia de utilizaccedilatildeo desse nutriente e portanto menor o valor de YXN
Da mesma forma a menor massa total adicionada no cultivo proporcionou maiores
valores de YXN (739 g g-1) no cultivo de S platensis em minitanques utilizando o
cloreto de amocircnio como fonte de nitrogecircnio (Carvalho et al 2004) Por outro lado
nos cultivos com nitrato a concentraccedilatildeo deste foram mantidas acima de 1 g L-1 de
modo a evitar a limitaccedilatildeo do crescimento pela fonte de nitrogecircnio Por isso os
maiores valores de YXN foram obtidos nos cultivos utilizando ureacuteia Resultados
similares foram obtidos por Danesi et al (2003) empregando 25 g de ureacuteia em
127
diferentes protocolos de alimentaccedilatildeo e temperatura em relaccedilatildeo a KNO3 e por Danesi
et al (2004) que tambeacutem observaram um maior fator de conversatildeo utilizando ureacuteia
em relaccedilatildeo a KNO3 independente da intensidade luminosa utilizada (2 e 5 klux)
Rangel-Yagui et al (2004) tambeacutem observaram maiores valores de YXN nos cultivos
utilizando ureacuteia
Tabela 32 - Meacutedias dos fatores de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas para a
variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio
Fonte de nitrogecircnio YXN (mgmg-1)
Nitrato 460 plusmn 055ordf
Ureacuteia 1380 plusmn 090b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
Em relaccedilatildeo agrave variaacutevel independente intensidade luminosa pode-se observar na
Tabela 33 que natildeo diferiram estatisticamente nos valores de YXN Isto eacute
independente da intensidade luminosa utilizada os valores de conversatildeo de
nitrogecircnio em ceacutelulas foram estatisticamente iguais De fato a quantidade de
nitrogecircnio adicionada nos cultivos estaacute relacionada com o crescimento celular
portanto quanto maior o valor de Xm maior foi a quantidade de nitrogecircnio
adicionada nos cultivos independente da fonte nitrogecircnio utilizada (nitrato ou ureacuteia)
Com isso razatildeo entre biomassa formada e nitrogecircnio adicionado foi estatisticamente
igual nas diferentes intensidades luminosas estudas
A Intensidade luminosa influencionou no crescimento celular (Item 62) e a
fonte de nitrogecircnio (nitrato ou ureacuteia) foi adicionada de acordo com a necessidade da
ceacutelula para o crescimento celular (Item 5) Por isso o YXN foi estatisticamente igual
(p = 0245) nas diferentes intensidades luminosas estudadas (Tabela 31)
O fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas eacute definido como a quantidade de
nitrogecircnio utilizada para a formaccedilatildeo de biomassa como no presente trabalho o
nitrogecircnio adicionado foi de acordo com a necessidade diaacuteria das ceacutelulas os valores
meacutedios de YXN para cada intensidade luminosa natildeo poderiam variar como pode ser
observado na Tabela 33
Nos trabalhos apresentados por Bezerra et al (2008) Danesi et al (2004) e
Rangel-Yagui et al (2004) observaram que os valores de Xm e YXN aumentam com
128
o aumento da intensidade luminosa fornecida ao cultivo Maiores energias
fornecidas pelas mais altas luminosidades empregadas nos cultivos permitem as
ceacutelulas de consumirem o nitrogecircnio disponiacutevel levando a maiores valores de Xm e
YXN Isso ocorreu porque a mesma quantidade de nitrogecircnio foi adicionada nos
ensaios com diferentes intensidades luminosas logo o YXN foi uma funccedilatildeo de Xm
Por outro lado no presente trabalho os valores meacutedios YXN natildeo diferiram
estatisticamente com o aumento da intensidade luminosa porque a quantidade total
de nitrogecircnio adicionada variou nos cultivos com as diferentes intensidades
luminosas isto eacute quanto maior a intensidade luminosa maior foi a quantidade de
nitrogecircnio adicionada e consequentemente maior concentraccedilatildeo celular Por isso o
YXN natildeo diferiram nas diferentes intensidades luminosas estudadas (Tabela 26)
Tabela 33 - Meacutedias dos fatores de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas para a
variaacutevel independente intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(mol de foacutetons m-2 s-1)
YXN (mgmg-1)
60 922 plusmn 034ordf
120 902 plusmn 034a
240 935 plusmn 034a
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95
Os maiores valores do fator de conversatildeo encontrado nesse trabalho (1327 plusmn
028 mg mg-1) foi maior do que 739 g g-1 (CARVALHO et al 2004) 85 g g-1
(RANGEL-YAGUI et al 2004a) utilizando ureacuteia e 57 plusmn 017 g g-1 utilizando cloreto de
amocircnio como fonte de nitrogecircnio nos cultivos de S platensis em minitaques
(BEZERRA et al 2008) Isso porque no presente trabalho a S platensis foi
cultivada em fotobiorreator tubular fechado o que proporciona menor volatilizaccedilatildeo
da amocircnia e melhor eacute o seu aproveitamento pelas ceacutelulas ocasionando maiores
valores de YXN
129
64 Avaliaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de clorofila a
No final de cada experimento foi realizada a determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de
clorofila a na concentraccedilatildeo celular final e os resultados estatildeo descritos na Tabela
34
Tabela 34 ndash Concentraccedilotildees de clorofila na biomassa final
Experimento Fonte de CO2 Intensidade luminosaa
Fonte de nitrogecircnio
Concentraccedilatildeo de clorofila (mg cl g cel -1)
1 Cilindro 60 NaNO3 521plusmn028
2 Cilindro 60 Ureacuteia 415plusmn020
3 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 60 NaNO3 392plusmn008
4 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 60 Ureacuteia 326plusmn030
5 Cilindro 120 NaNO3 344plusmn010
6 Cilindro 120 Ureacuteia 296plusmn009
7 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 120 NaNO3 294plusmn040
8 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 120 Ureacuteia 210plusmn023
9 Cilindro 240 NaNO3 175plusmn037
10 Cilindro 240 Ureacuteia 181plusmn 015
11 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 240 NaNO3 294plusmn035
12 Fermentaccedilatildeo
alcooacutelica 240 Ureacuteia 210plusmn023
a mol de foacutetons m-2 s-1
Dentre os metaboacutelitos microalgais a clorofila foi muito pouco investigada Satildeo
os uacutenicos pigmentos naturais de coloraccedilatildeo verde em abundacircncia mas sua
instabilidade ao isolamento tem restringindo a sua utilizaccedilatildeo como corante natural na
induacutestria de alimentos As clorofilas utilizadas como corantes alimentares provecircm
principalmente de plantas terrestres (HENDRY 1996)
Microalgas fotossinteacuteticas satildeo organismos que capturam energia luminosa
eficiententemente O pigmento fotossinteacutetico clorofila a eacute o principal componente
130
fotoquiacutemico ativo na qual funciona como um receptor de luz para direcionar a
fotossiacutentese O conteuacutedo deste pigmento em microalga eacute portanto relatado para
atividade fotossinteacutetica (MACINTYRE et al 2002) A intensidade de luz captada
pelos pigmentos influencia na produccedilatildeo da biomassa e no acuacutemulo de produtos
alvos na microalga cultivada sob diferentes condiccedilotildees
As clorofilas satildeo pigmentos verdes de alto valor comercial encontradas em
plantas microalgas e cianobacteacuterias como A platensis A concentraccedilatildeo desse
pigmento nas ceacutelulas depende das condiccedilotildees ambientais Devido a sua cor e as
propriedades fiacutesico-quiacutemicas satildeo utilizadas como corantes naturais em produtos
alimentiacutecios
Na Tabela 35 observa-se que ambas as variaacuteveis independentes avaliadas
nesse estudo fonte de nitrogecircnio e intensidade luminosa interferiram na
concentraccedilatildeo de clorofila a na biomassa final Isso foi confirmada pela anaacutelise
estatiacutestica ANOVA onde apresentou um valor de niacutevel descritivo de 0011 para a
variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio e de 0000 para a intensidade luminosa
Tabela 35 - Anaacutelise de variacircncia para a concentraccedilatildeo de clorofila na biomassa final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Meacutedia dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
03725 1 03725 101 0328
Fonte de Nitrogecircnio
29751 1 29751 804 0011
Intensidade luminosa
158306 2 79153 2139 0000
Resiacuteduos 70318 19 01272
Total 26210 23
Avaliando-se as meacutedias da concentraccedilatildeo de clorofila a nas diferentes fontes de
nitrogecircnio (Tabela 34) observa-se que nos cultivos utilizando nitrato obtiveram
maiores concentraccedilotildees de clorofila em relaccedilatildeo aos cultivos com ureacuteia nas
intensidades luminosas de 60 mol de foacutetons m-2 s-1 e 120 mol de foacutetons m-2 s-1
Essa diferenccedila na concentraccedilatildeo de clorofila pode ser explicada pelo fato dos cultivos
com nitrato a concentraccedilatildeo de nitrato no meio de cultura foi mantida sempre
superior a 1 g L-1 enquanto que nos cultivos com ureacuteia a concentraccedilatildeo de ureacuteia no
131
meio cultura foi abaixo de 10-4 M (item 62) Essa concentraccedilatildeo de ureacuteia apesar de
natildeo interferir na concentraccedilatildeo celular pode ter influenciado na concentraccedilatildeo de
clorofila nas ceacutelulas Resultados similares foram observados por Danesi et al (2004)
e Rangel-Yagui et al (2004) em cultivos de S platensis em minitanques
substituindo a fonte de nitrogecircnio KNO3 por ureacuteia
O efeito da limitaccedilatildeo de nitrogecircnio e ferro comprometeu a capacidade
fotossinteacutetica reduziu o conteuacutedo de clorofila celular e diminuiu o rendimento
quacircntico do fotossintema II (YOUNG BEARDALL 2005) Muggli e Harrison (1996)
observaram que a concentraccedilatildeo de clorofila nas ceacutelulas de Emiliania huxleyi
cultivadas com nitrato foi estatisticamente maior que nas celulas cultivadas com
amocircnia sob condiccedilotildees limitadas de ferro e intensidade luminosa abaixo da
saturaccedilatildeo Por outro lado nos cultivos natildeo limitados com ferro as concentraccedilotildees de
clorofilas foram estatisticamente iguais Sob duas diferentes intensidades luminosas
abaixo da regiatildeo de saturaccedilatildeo (45 e 70 mol de foacutetons m-2 s-1) as ceacutelulas cultivadas
em nitrato mantiveram uma maior taxa de clorofila por volume de ceacutelulas que nas
ceacutelulas cultivadas com amocircnio similar ao que aconteceu nas condiccedilotildees limitadas
por ferro
A intensidade luminosa eacute uma importante variaacutevel que interfere na
concentraccedilatildeo de clorofila Como podemos observar na Tabela 34 maiores
concentraccedilotildees de clorofilas meacutedias independente da fonte de nitrogecircnio e de CO2
satildeo encontradas nas menores intensidades luminosas De um modo geral o
aumento da concentraccedilatildeo de clorofila com a reduccedilatildeo da luminosidade aumenta a
capacidade de absorccedilatildeo de luz pois a clorofila eacute quem efetivamente atua nas
reaccedilotildees fotoquiacutemicas da fotossiacutentese e representa um mecanismo de adaptaccedilatildeo agrave
condiccedilatildeo de menor intensidade luminosa A reduccedilatildeo do conteuacutedo de pigmentos a
altas irradiacircncias permite as algas reduzirem a taxa de fornecimento de energia pela
absorccedilatildeo da luz nas ceacutelulas com a finalidade de balancear a energia absorvida e a
energia necessaacuteria para a fixaccedilatildeo do carbono e crescimento celular (GEIDER et al
1997) Geralmente a clorofila e as ficobiliproteiacutenas tendem a aumentar sua
concentraccedilatildeo com a reduccedilatildeo da intensidade luminosa (TOMASELLI et al 1997)
Nas menores intensidades luminosas onde a competiccedilatildeo pelo poder redutor eacute
maior observa-se que as ceacutelulas cultivadas em nitrato mantem maior niacuteveis de
clorofila que nas ceacutelulas cultivadas em amocircnia Portanto as ceacutelulas cultivadas em
nitrato precisam mais do poder redutor para transportar e utilizar sua fonte de
132
nitrogecircnio eles podem requerer mais clorofila que as ceacutelulas cultivadas em amocircnio
para suprir tais necessidades Por outro lado altas intensidades luminosas alteram o
complexo proteacuteico contendo pigmentos captadores de luz como observado por
Smith et al (1990) em ceacutelulas de Dunaliella salina Telfar et al (1990) mostrou que
iluminaccedilatildeo prolongada causa destruiccedilatildeo dos pigmentos da clorofila e conduz a
inibiccedilatildeo fotoquiacutemica do FSII
Cultivos de Spirulina subsalsa exposto agrave alta intensidade luminosa (100 mol
de foacutetons m-2 s-1) mostrou uma reduccedilatildeo no conteuacutedo de pigmentos nas ceacutelulas O
conteuacutedo de carotenoacuteide e clorofila a reduziu com o aumento da intensidade
luminosa de 25 mol de foacutetons m-2 s-1 para 100 mol de foacutetons m-2 s-1 O conteuacutedo
de ficobilissomos obteve uma maior reduccedilatildeo quando comparados com o conteuacutedo
de clorofila a (aproximadamente 70 e 57 respectivamente) Devido a uma
reduccedilatildeo nos carotenoacuteides zeaxantina foi o carotenoacuteide predominante a maior
intensidade luminosa (TOMASELLI et al 1995) Um aumento da intensidade
luminosa de 2 klux (24 mol de foacutetons m-2 s-1 ) para 5 klux (60 mol de foacutetons m-2 s-
1) houve uma reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de clorofila de 14 plusmn 18 mg cl g cel -1 para
80 plusmn 18 mg cl g cel -1 nos cultivos com KNO3 e 142 plusmn 08 mg cl g cel -1 para 72 plusmn
14 mg cl g cel -1 para os cultivos com ureacuteia respectivamente (DANESI et al 2004)
Pode-se observar que a concentraccedilatildeo de clorofila nos cultivos a 5 klux (60 mol de
foacutetons m-2 s-1) foram proacuteximas as concentraccedilotildees obtidas no presente trabalho nos
cultivos a 60 mol de foacutetons m-2 s-1 (NaNO3 = 521 plusmn 03 mg cl g cel -1 Ureacuteia = 415
plusmn 02 mg cl g cel -1 Tabela 34) Essa diferenccedila pode ser devido ao aumento do
efeito sombreamento ser maior em minitanques quando comparada aos
fotobiorreatores tubulares o que favorece a um aumento da concentraccedilatildeo de
clorofila nos cultivos em minitanques Soundarapandian e Vasanthi (2008)
observaram um maior teor de clorofila em diferentes cepas de S platensis cultivadas
a 3 klux (36 mol de foacutetons m-2 s-1) intensidade luminosa com ciclos alternados de 16
horas no claro e 8 horas no escuro
Dados na literatura mostram que na biomassa de A platensis possuem 1 de
clorofila (VONSHAK 1997 COGNO et al 2003) No entanto no presente trabalho a
maior concentraccedilatildeo de clorofila foi de 05 correspondendo ao experimento 1 (60
mol de foacutetons m-2 s-1 NaNO3 Tabela 13) Esse baixo valor de concentraccedilatildeo de
clorofila em relaccedilatildeo aos valores citados na literatura eacute devido agraves altas intensidades
luminosas utilizadas no neste trabalho Soundarapandian e Vasanthi (2008)
133
relataram que a concentraccedilatildeo de clorofila nas S platensis cultivadas a 3 klux pode
variar de 085 (8526 μg mg cel-1) a 097 (9723 μg mg cel-1) dependendo da
cepa utilizada Jimenez et al (2003) em cultivos de S platensis em minitanques
utilizando a energia solar no sul da Espanha obtiveram uma concentraccedilatildeo de
clorofila de 79 g kgminus1 (079)
Carlozzi e Pinzani (2005) observaram uma concentraccedilatildeo maacutexima de clorofila
de 2 em cultivos outdoor de S platensis em fotobiorreator espiralado fechado
Esta concentraccedilatildeo permaneceu constante do 6deg ao 10deg dia de cultivo Tomaselli et
al (1997) tambeacutem observaram um aumento na concentraccedilatildeo de clorofila de 151 μg
mg cel-1 para 263 μg mg cel-1 nos cultivos de A maacutexima em reator de vidro
retangular a intensidade luminosa de 144 mol de foacutetons m-2 s-1 e 25 mol de foacutetons
m-2 s-1 respectivamente Tredici e Zittelli (1998) em cultivos continuos ldquooutdoorsrdquo de
A platensis em fotobiorreator tubular e plano obtiveram a concentraccedilatildeo de clorofila
de 155plusmn002 e 163 plusmn002 na massa seca no iniacutecio do periacuteodo luminoso
De fato a concentraccedilatildeo de clorofila depende das condiccedilotildees ambientais
principalmente da intensidade luminosa No presente estudo nos cultivos
submetidos agrave alta intensidade luminosa favoreceram a uma reduccedilatildeo na
concentraccedilatildeo de clorofila principalmente nos cultivos a 240 mol de foacutetons m-2 s-1
Do mesmo modo Nakajima e Ueda (1997) observaram um aumento no crescimento
celular de Chlorella pyrenoidosa e uma reduccedilatildeo no conteuacutedo de pigmentos
captadores de luz nas ceacutelulas cultivadas a altas intensidades luminosas (50 μmol de
foacutetons m-2 s-1) Na presenccedila de excesso de luz o oxigecircnio produzido durante a
fotossiacutentese reage com a clorofila excitada originando um oxigecircnio singlete que eacute
muito mais reativo podendo oxidar as clorofilas e ocasionando consequentemente o
fenocircmeno denominado de branqueamento (MARIQUE 2003) As clorofilas tendem a
ser foto-oxidadas a alta irradiaccedilatildeo e devido aos carotenoacuteides poderem prevenir a
foto-oxidaccedilatildeo das clorofilas a relaccedilatildeo entre as clorofilas e carotenoacuteides pode ser
usada como um indicador potencial de perdas foto-oxidativas causadas por fortes
irradiaccedilotildees (HENDRY amp PRICE 1993)
134
65 Avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo centesimal
Micro-organismos fotossintetizantes usam fonte de carbono inorgacircnico energia
luminosa e nitrogecircnio para sintetizar compostos orgacircnicos como proteiacutenas
carboidratos vitaminas lipiacutedios pigmentos entre outros Com isso a composiccedilatildeo
centesimal da biomassa pode variar com as condiccedilotildees ambientais (RAFIQUL et al
2005 MOHANTY et al 1997)
Na Tabela 36 estatildeo apresentados os teores de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos
e cinzas das biomassas secas obtidas no final dos experimentos
Tabela 36 - Porcentagem de proteiacutenas lipiacutedios carboidratos e cinzas na biomassa
seca final
Experimento Intensidade
luminosa (I)
Fonte de CO2
Fonte de nitrogecircnio
Proteiacutenas totais ()
Lipiacutedios totais ()
Cinzas ()
Carboidratos totais ()
1 60 Cilindro NaNO3 319plusmn01 863plusmn03 442plusmn001 5226plusmn358
2 60 Cilindro Ureacuteia 233plusmn07 660plusmn09 442plusmn004 6471plusmn064
3 60 Alcooacutelica NaNO3 324plusmn07 101plusmn08 583plusmn002 5222plusmn341
4 60 Alcooacutelica Ureacuteia 427plusmn23 112plusmn14 508plusmn091 6492plusmn336
5 120 Cilindro NaNO3 281plusmn04 121plusmn06 476plusmn002 5500plusmn-016
6 120 Cilindro Ureacuteia 299plusmn06 730plusmn07 482plusmn018 5794plusmn005
7 120 Alcooacutelica NaNO3 315plusmn18 862plusmn06 497plusmn018 5576plusmn341
8 120 Alcooacutelica Ureacuteia 404plusmn07 953plusmn07 394plusmn063 4642plusmn091
9 240 Cilindro NaNO3 213plusmn01 142plusmn23 428plusmn004 6004plusmn243
10 240 Cilindro Ureacuteia 319plusmn09 129plusmn05 540plusmn050 5079plusmn147
11 240 Alcooacutelica NaNO3 278plusmn04 144plusmn29 579plusmn048 5222plusmn341
12 240 Alcooacutelica Ureacuteia 210plusmn03 117plusmn28 449plusmn004 6492plusmn336
I = Intensidade luminosa (mol de foacutetons m-2 s-1)
A Fotossiacutentese eacute o processo pelo qual a energia luminosa eacute convertida em
energia quiacutemica pelas plantas bacteacuterias fotossinteacuteticas e cianobacteacuterias A energia
luminosa eacute capturada pelos pigmentos fotossinteacuteticos como clorofila carotenoacuteides e
ficocianina na qual satildeo complexados com proteiacutenas que satildeo partes do fotossistema I
e II em cianobacteacuterias O sistema fotossinteacutetico eacute fortemente conectado com outras
135
vias metaboacutelicas como biossiacutentese de proteiacutenas e lipiacutedios nas quais satildeo
necessaacuterias para o crescimento celular (MOHANTY et al 1997)
Os teores de proteiacutena variaram de 21 a 42 Esses valores estatildeo proacuteximos
aos valores encontrados por Cantildeizares-Villanueva et al (1994) cultivando S maxima
em meio de cultura constituiacutedo por resiacuteduo da criaccedilatildeo de porcos (diluiacutedo a 50 em
aacutegua) Embora o teor de proteiacutena seja baixo (36) a biomassa ainda eacute apropriada
para o uso como suplemento aliementar para animais Jimeacutenez et al (2003) tambeacutem
encontraram um baixo teor de proteiacutena de 47 do peso seco em meacutedia na
produccedilatildeo industiral da Spirulina em Malaga no sul da Espanha
A biossiacutentese de proteiacutena depende principalmente da disponibilidade de
nitrogecircnio de carbono para formaccedilatildeo do esqueleto carbocircnico e da intensidade
luminosa na qual fornece energia para fixaccedilatildeo do CO2 Nos cultivos utilizando
nitrato bem como nos cultivos utilizando ureacuteia natildeo houve limitaccedilatildeo do crescimento
pela fonte de nitrogecircnio (Item 611) A fonte de carbono tambeacutem natildeo foi limitada
uma vez que o pH foi mantido durante todo o tempo de cultivo com a adiccedilatildeo de CO2
As intensidades luminosas foram altas pertencendo agrave regiatildeo de saturaccedilatildeo luminosa
(Item 611) Logo mesmo dispondo de nitrogecircnio carbono e energia as ceacutelulas natildeo
converteram o nitrogecircnio disponiacutevel em proteiacutenas SAKAMOTO e BRYAN (1999)
observaram que um aumento da intensidade luminosa de 250 mol de foacutetons m-2 s-1
para 1 mmol foacutetons m-2 s-1 no cultivo de Synechococcus sp PCC 6301 natildeo foi
observado um aumento na absorccedilatildeo de nitrato mostranto que a taxa do consumo
de nitrato foi saturado a intensidade luminosa de 250 mol de foacutetons m-2 s-1
Soundarapandian e Vasanthi (2008) observaram que o conteuacutedo de proteiacutena
nas S platensis cultivadas a 3 klux (36 mol de foacutetons m-2 s-1) com ciclos alternados
de 16 horas no claro e 8 horas no escuro pode variar de 5937 (5937μg mg-1 cel)
a 6421 (6421 μg mg-1 cel) dependendo da cepa utilizada Torzillo et al (1991)
observaram um aumento na siacutentese de carboidrato nas ceacutelulas de S platensis
cultivadas ldquooutdoorsrdquo a altas intensidades luminosas e temperatura de 25ordmC O
execesso do carboidrato sintetizado foi parcialmente utilizado a noite para a siacutentese
de proteiacutena Isso pode ter contribuiacutedo a um baixo teor de proteiacutena no presente
trabalho uma vez que os cultivos foram submetidos sempre a altas intensidades
luminosas natildeo obtendo ciclos claroescuro durante o cultivo
A anaacutelise de variacircncia (Tabela 37) indicou que a fonte de nitrogecircnio e de CO2
natildeo influenciaram na variaacutevel dependente teor de proteiacutena enquanto que a
136
intensidade luminosa influenciou como pode-se obversar na anaacutelise de diferenccedila
entre as meacutedias para essa variaacutevel (Tabela 38)
Tabela 37 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de proteiacutena na biomassa final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
5304 1 5304 235 0142
Fonte de Nitrogecircnio
1134 1 1134 050 0487
Intensidade luminosa
4341 2 2170 963 0001
Resiacuteduos 42833 19 2254
total 9268 23
Tabela 38 - Meacutedias do teor de proteiacutena na biomassa final para a variaacutevel
independente intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(mol foacutetons m-2 s-1)
Proteiacutena ()
60 358plusmn43ordf
120 326plusmn50ordf
240 256plusmn51b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
O modelo da biossiacutentese e metabolismo de lipiacutedios em cianobacteacuterias eou
algas satildeo afetados pelos fatores ambientais dentre esses as condiccedilotildees de
iluminaccedilatildeo (BABADZHANOV et al 2004 KHOTIMCHENKO e YAKOVLEVA 2005)
As ceacutelulas de Tichocarpus crinitus satildeo capazes de mudar o conteuacutedo de
armazenamento e estrutural de lipiacutedios e a composiccedilatildeo de aacutecidos graxos Altas
intensidades luminosas estimulam o acuacutemulo de lipiacutedios de armazenamento
(triacilgliceroacuteis) enquanto a baixas intensidades luminosas induzem a um aumento
nos lipiacutedios estruturais (glicolipiacutedios) Isto indica um alto grau de controle de
estrutura nas membranas das algas porque o grau de insaturaccedilatildeo dos aacutecidos
graxos tem sido considerado um dos fatores mais importantes no controle da fluidez
e funcionalidade da membrana celular Adicionalmente as diferenccedilas na
137
composiccedilatildeo dos lipiacutedios nas T crinitus cultivadas a altas e baixas irradiaccedilotildees solar
podem ser consideradas como uma resposta adaptativa das ceacutelulas algais para as
vaacuterias condiccedilotildees de crescimento Portanto a sobrevivecircncia das ceacutelulas nas
mudanccedilas ambientais pode ser atribuiacuteda agrave funcionalidade das membranas onde o
aparato fotossinteacutetico eacute formado (KHOTIMCHENKO e YAKOVLEVA 2005)
Nos cultivos com disponibilidade de nitrogecircnio carbono e altas intensidades
luminosas as ceacutelulas utilizam a energia e o carbono disponiacutevel para crescimento
manutenccedilatildeo celular e formaccedilatildeo de componentes orgacircnicos tais como proteiacutenas
lipiacutedios e carboidratos Como apresentados na Tabela 41 o teor de lipiacutedio aumenta
com a intensidade luminosa Esse efeito foi observado por Solovchenko et al
(2008) nos cultivos da microalga Parietochloris incisa Isto pode ser consequecircncia da
produccedilatildeo excessiva de aacutecidos graxos entre eles triacilgliceroacuteis provavelmente como
um modo de converter o excesso de luz em energia quiacutemica para evitar o dano
fotooxidativo (ASADA 1994 RABBANI et al 1998 MENDOZA et al 1999 NIYOGI
1999) Kaixian et al (1993) observaram um aumento no teor de lipiacutedios com o
aumento da intensidade luminosa nas ceacutelulas de Phaeodactylum tricornutum
Solovchenko et al (2008) relataram que os triacilgliceroacuteis acumuladas em algas
(Parietochloris incisa) sob condiccedilotildees de stress satildeo frequentemente depositadas em
gloacutebulos de lipiacutedios citoplasmaacutetico referidos como corpos oleosos na qual aumentam
em tamanho e nuacutemero sob deficiecircncia na nutriccedilatildeo mineral especialmente na falta de
nitrogecircnio e altas irradiacircncias
Como observado na Tabela 41 os cultivos a 240 mol de foacutetons m-2 s-1
obtiveram maiores teores de lipiacutedios Steiner et al (1970) observaram que as ceacutelulas
de Chromatium cultivadas a baixas intensidades luminosas (100 ftc = 01 klux = 12
mol de foacutetons m-2 s-1) obteve menor teor de fosfolipiacutedios em relaccedilatildeo aos cultivos a
altas intensidades luminosas (7500 ftc = 8 kux = 96mol de foacutetons m-2 s-1) 1 lux =
0929 foot-candles
Na Tabela 39 estatildeo apresentados os valores da anaacutelise de variacircncia dos teores
de lipiacutedios Como se pode observar apenas a intensidade luminosa influenciou nos
valores de lipiacutedios apresentando um valor de niacutevel descritivo menor que 5
Embora o niacutevel de significacircncia da variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio seja
menor que 5 a anaacutelise estatiacutestica diferenccedila entre as meacutedias mostraram essa
variaacutevel natildeo interfere no teor de lipiacutedio apresenta um valor de niacutevel descritivo maior
que 5 (Tabela 40)
138
Tabela 39 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de lipiacutedios na biomassa seca final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
143 1 143 059 0453
Fonte de Nitrogecircnio
1853 1 1853 762 0012
Intensidade luminosa
141 2 71 29 0000
Resiacuteduos 46 19 244
total 207 23
Tabela 40 - Meacutedias do teor de lipiacutedio na biomassa final para a variaacutevel independente
fonte de nitrogecircnio
Fonte de nitrogecircnio Lipiacutedios ()
Nitrato 109 plusmn 310ordf
Ureacuteia 918 plusmn 275a
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um
intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
Tabela 41 - Meacutedias do teor de lipiacutedio na biomassa final para a variaacutevel independente
intensidade luminosa
Intensidade luminosa
(μmoles m-2 s-1)
Lipiacutedios ()
60 763 plusmn 11a
120 972 plusmn 19a
240 136 plusmn 21b
Meacutedias com letras iguais natildeo diferem entre si estatisticamente considerando um intervalo de confianccedila de 95 (Teste de Tukey)
A similaridade entre as fontes de nitrogecircnio (Tabela 40) podem ser explicadas
pelo fato de que nos cultivos com ureacuteia a quantidade de ureacuteia adicionada foi
calculada com base nos seus respectivos cultivos com nitrato nas quais foram
139
cultivos natildeo limitados por nitrogecircnio (concentraccedilatildeo de nitrogecircnio superior a 1 g L-1)
Logo isso favoreceu a semelhanccedila entre os teores de lipiacutedios nos cultivos a
diferentes fontes de nitrogecircnio
Os valores de lipiacutedios encontrados variaram de 66 plusmn 09 a 144 plusmn 29
dependendo das condiccedilotildees de cultivo Esses valores estatildeo de acordo com Cogno et
al (2003) e Vonshak (1997) na qual relataram que o conteuacutedo de lipiacutedios da A
platensis em condiccedilotildees fotoautotroacuteficas podem variar de 8 ndash 12 quando cultivadas
em meio sinteacutetico Tokusoglu e Uumlnal (2003) encontraram um teor de lipiacutedio meacutedio
entre trecircs diferentes cepas de Splatensis de 753 natildeo diferindo estatisticamente
entre si
O teor de lipiacutedio foi de 863 plusmn 03 com NaNO3 e 66 plusmn 09 com ureacuteia na
intensidade luminosa de 60 μmoles de foacutetons m-2 s-1 utilizando CO2 de cilindro
Esses valores foram proacuteximos aos teores de lipiacutedios encontrados por Rafiqul et al
(2005) cultivando S platensis (74) e para S fusiformis (82) a 25 klux (30 μmol
de foacutetons m-2 s-1) Oliveira et al (1999) observaram um teor de lipiacutedios de 696 plusmn
086 nas ceacutelulas de S platensis cultivadas em 4 l Virtis fermenter a 180 μmol de
foacutetons mndash2 sndash1
Olguiacuten et al (2001) observaram uma menor concentraccedilatildeo de lipiacutedios nos
cultivos a maior intensidade luminosa em cultivos de S platensis cultivada tanto em
meio sinteacutetico (meio Zarrouk) como em meio complexo (aacutegua do mar do Golf do
Meacutexico suplementado com 2 de efluente anaeroacutebico da criaccedilatildeo de porcos) A
concentraccedilatildeo de nitrogecircnio no meio complexo possui 10 vezes a menos que o meio
sinteacutetico (25 g L-1 NaNO3) O teor de lipiacutedio de 8 encontrado no meio de cultivo
com 25 g L-1 NaNO3 a 66 μmols de foacutetons m-2 s-1 foi proacuteximo ao encontrado no
presente trabalho 66 plusmn 09 no cultivo natildeo limitado por NaNO3 e 60 μmols de foacutetons
m-2 s-1
Nos cultivos a 60 mol de foacutetons m-2 s-1 mostrou maiores valores de lipiacutedios
quando cultivadas com CO2 proveniente de fermentaccedilatildeo alcooacutelica em relaccedilatildeo aos
cultivos utilizando CO2 de cilindro Sob condiccedilotildees autotroacuteficas a produtividade de
lipiacutedios foram menores quando comparadas com o crescimento heterotroacutefico em
culturas de Chlorella vulgareis (LIANG et al 2009) e crescimento heterotroacutefico e
mixotroacutefico nas ceacutelulas de Chlamydomonas reinhardtii (BOYLE MORGAN 2009)
O teor de carboidrato nas ceacutelulas A platensis natildeo diferiram estatisticamente
pela anaacutelise de variacircncia nas diferentes condiccedilotildees estudadas (Tabela 44) obtendo
140
um niacutevel de significacircncia de 0118 0974 e 0562 para as variaacuteveis independentes
fontes de CO2 fonte de nitrogecircnio e intensidades luminosas respectivamente O
teor de carboidrato encontrado variou de 38 a 51 valores considerados altos No
entanto esses valores foram proacuteximos aos valores obtidos por Cantildeizares-Villanueva
et al (1994) que observaram um teor de carboidrato de 42 e 44 em ceacutelulas de S
maxima cultivadas em meio sinteacutetico (Zarrouk) e meio constituiacutedo por resiacuteduo da
criaccedilatildeo de porcos (diluiacutedo a 50) respectivamente sob intensidade luminosa de 3
klux (36 μmol de foacutetons m-2 s-1) O teor de carboidrato neste trabalho foi um pouco
maior que o observado por Cantildeizares-Villanueva et al (1994) provavelmente devido
a diferenccedila de intensidade luminosa pois maiores teores de carboidratos satildeo
obtidos nos cultivos sob maior intensidade luminosa
Olguiacuten et al (2001) obtiveram um alto teor de polissacariacutedeos de 2841 nas
ceacutelulas de S platensis cultivadas em meio complexo quando exposta a intensidade
luminosa de 144 μmol de foacutetons mminus2 sminus1 Esse alto valor poderia ter sido devido a
dois fatores simultacircneos deficiecircncia de nitrogecircnio e alta intensidade luminosa
Desse modo no presente trabalho natildeo houve deficiecircncia de nitrogecircnio nos cultivos
no entanto a aacuterea iluminada no fotobioreator tubular usado no presente trabalho eacute
maior quando comparada com os cultivos em bench raceway utilizados por Olguiacuten et
al (2001) e esse aumento pode ter favorecido a obtenccedilatildeo dos altos teores de
carboidratos
Tomaselli et al (1997) observaram uma reduccedilatildeo no teor de carboidrato nas
ceacutelulas de A maacutexima de 282 mgg-1 (28) para 180 mgg-1 (18) quando a
intensidade luminosa reduziu de 144 μmol de foacutetons mminus2 sminus1 para 25 μmol de foacutetons
mminus2 sminus1 A capacidade dos microganismos fototroacuteficos em estocar na forma de
carboidratos o excesso do carbono fixado durante a aclimataccedilatildeo a altas intensidades
luminosas e mobilizar esse esqueleto carbocircnico para a siacutentese de proteiacutena
representa um requisito importante para a sobrevivecircncia
141
Tabela 42 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de carboidratos na biomassa seca final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
107 1 107 268 0118
Fonte de Nitrogecircnio
004 1 004 000 0974
Intensiade luminosa
48 2 24 059 0562
Resiacuteduos 763 19 40
total 918 23
A partir dos estudos relatados previamente na literatura mostram que o teor de
carboidrato eacute 12 a 16 nas ceacutelulas de Arthrospira platensis cultivadas em meio
sinteacutetico e em condiccedilotildees fotoautotroacuteficas sem condiccedilotildees de stress como alta
salinidade alta intensidade luminosa deficiecircncia em nitrogecircnio (COGNO et al
2003 VONSHAK 1997) Carlozzi e Pinzani (2005) relataram que as ceacutelulas de
Artrospira platensis foram estimuladas para sintetizar carboidratos durante o dia e
estes foram consumidos para permitir a siacutentese de proteiacutenas durante a noite De
acordo com Ma et al (1997) uma menor taxa na siacutentese de proteiacutena eacute observado a
altas irradiaccedilotildees comparando com a siacutentese de carboidrato Isto pode conduzir a
um acuacutemulo de carboidrato nas ceacutelulas sem um concomitante aumento na siacutentese
de proteiacutena Tem sido sugerido que o carbono a partir dos poliacutemeros de carboidratos
estocados pode ser transferido para formaccedilatildeo de proteiacutenas durante a noite (Ma et
al 1997) No entanto como no presente trabalho natildeo houve fotoperiacuteodo de fase
claroescuro propiciou a um acuacutemulo de carboidrato nas ceacutelulas e a reduziu a
concentraccedilatildeo de proteiacutenas Adicionalmente Torzillo et al (1991) relataram que as
ceacutelulas de Spirulina expostas a altas irradiacircncais direcionam a biomassa a sintetizar
carboidratos na qual pode ser usado como um reservatoacuterio do poder redutor e a
uma reduccedilatildeo na siacutentese de proteiacutenas
Como podemos observar na anaacutelise de variacircncia (Tabela 43) o teor de cinzas
natildeo foi influenciado pelas variaacuteveis estudadas atingindo valores que variaram de
428 plusmn 004 a 583 plusmn 002 Esses valores estatildeo de acordo com os valores obtidos
por Miao (2005) que obtiveram um teor de cinzas de 636 plusmn 005 em cultivos
autotroacuteficos e 593 plusmn 004 em cultivos heterotroacuteficos de Chlorella protothecoides
Similarmente Tokusoglu e Uumlnal (2003) observaram um conteuacutedo de cinzas em trecircs
142
diferentes cepas de Spirulina denominada de 1 2 e 3 foram de 743 751 and
1038 respectivamente A microalga marinha Isochrisis obteve o maior conteuacutedo
de cinzas (1608)
Tabela 43 - Anaacutelise de variacircncia para o teor de cinzas na biomassa seca final
efeitos Soma dos quadrados
Nuacutemero de grau de
liberdade
Media dos quadrados
Teste F Niacutevel de
significacircncia
Fonte de CO2
068 1 069 18 0192
Fonte de Nitrogecircnio
058 1 058 152 0232
Intensiade luminosa
112 2 056 147 0255
Resiacuteduos 723 19 038
total 962 23
Jimeacutenez et al (2003) encontraram um alto teor de cinzas no cultivo de S
platensis aproximadamente 20 (valores tiacutepicos satildeo de 5ndash7) esse alto valor pode
ser explicado pelo fato de que a alga obtida a partir do filtro foi introduzida
diretamente spray drier sem passar pelo processo de lavagem Como o meio de
crescimento eacute altamente enriquecido com bicarbonato a lavagem eacute necessaacuteria para
eliminaacute-los Esse processo normalmente reduz o conteuacutedo de cinzas
No presente trabalho a composiccedilatildeo do meio de cultura foi mantido em todas as
condiccedilotildees experimentais com modificaccedilatildeo apenas da fonte de nitrogecircnio de nitrato
de soacutedio para ureacuteia em alguns experimentos Adicionalmente a biomassa passou
por um processo de lavagem antes da etapa de secagem que removeu os sais
adsorvidos nas ceacutelulas Portanto isso favoreceu a manutenccedilatildeo no teor de cinzas na
biomassa seca Canizares et al (2004) obtiveram elevados teores de cinzas (14)
na biomassa de Spirulina maacutexima utilizando 50 de efluente suiacuteno no meio de
cultura Isso foi atribuiacutedo ao elevado quantidade de partiacuteculas minerais presente no
meio
143
66 Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros bioenergeacuteticos
Foram avaliados os paracircmetros bioenergeacuteticos da A platensis durante os
cultivos avaliando os andamentos em funccedilatildeo do tempo dos paracircmetros energia de
Gibbs dissipada para o crescimento e manutenccedilatildeo celular (1YGX) das produccedilotildees
molares de O2 consumo de H+ e nuacutemero de foacutetons para sustentar o crescimento
fotoautotroacutefico Foi avaliada a eficiecircncia da fotossiacutentese em A platensis calculando-
se a energia molar de Gibbs absorvida da luz para produzir um C-mol de biomassa
a partir do correspondente nuacutemero de Einsteins absorvidos e da energia meacutedia
molar dos foacutetons
A energia de Gibbs dissipada por unidade da biomassa (1YGX kJ por C-mol X)
foi calculada pela Equaccedilatildeo 6 como descrita no item 45 A equaccedilatildeo mostra que na
dissipaccedilatildeo da energia de Gibbs estatildeo inclusos tanto a manutenccedilatildeo como o
crescimento celular A energia de Gibbs eacute utilizada tambeacutem para a manutenccedilatildeo das
funccedilotildees celulares como reposiccedilatildeo dos gradientes que faltam degradaccedilatildeo proteiacutenas
Esta energia de Gibbs eacute produzida pelo catabolismo de certas quantidades de
doadores de eleacutetrons (substratos)
No Graacutefico 26 ilustra o comportamento da dissipaccedilatildeo da energia de Gibbs para
o crescimento e manutenccedilatildeo celular 1YGX em relaccedilatildeo ao tempo Como regra geral
esse paracircmetro bioenergeacutetico aumentou com o tempo em todas as condiccedilotildees
testadas como resultado do crescente niacutevel de biomassa que foi responsaacutevel por
diminuir a velocidade especiacutefica de crescimento Um aumento na intensidade
luminosa ateacute 120 mol de foacutetons m-2 s-1 favoreceu o crescimento de ceacutelulas por
causa de fotolimitaccedilatildeo com isso as exigecircncias de energia aumentaram
notavelmente no periacuteodo de tempo mais curto Por outro lado nenhum (ureacuteia) ou
muito pouco (nitrato) aumento de 1YGX foram observados na faixa da intensidade
luminosa de 120-240 mol de foacutetons m-2 s-1 por causa da obtenccedilatildeo das condiccedilotildees
de saturaccedilatildeo de luz Esse comportamento tambeacutem eacute consistente com os menores
valores de 1YGX previamente observados em tanques abertos (TORRE et al 2003)
o que permitiu um menor crescimento devido ao efeito de sombreamento (DANESI
et al 2004)
144
Graacutefico 26 Energia de Gibbs de dissipaccedilatildeo durante o cultivo de A platensis
intensidade luminosa (μmol m-2 s-1) () 60 ( ) 120 () 240 Fonte de
nitrogecircnio nitrato (siacutembolo aberto) ureacuteia (siacutembolo fechado)
Com os dados da composiccedilatildeo elementar da biomassa seca obtida no final de
cada experimento foram calculados os coeficientes atocircmicos para os elementos C
N H O S principais elementos que constituem a composiccedilatildeo elementar da
biomassa Determinado o coeficiente atocircmico dos elementos C H O N S (descrito
no item 4653) e conhecendo-se os graus de reduccedilatildeo desses elementos (C = 4 H
=1 O = -2 S = 6 N-NH4+ = -3 ou N-NO3
- = 5) de acordo com os iacuteons nas quais satildeo
inseridos na biomassa (HCO3- H2O H+ O2 NH4
+ e SO4-2) foi possiacutevel calcular o
grau de reduccedilatildeo da biomassa (descrito no item 4654 Tabela 44) bem como os
coeficientes estequiomeacutetricos para balanccedilos de carbono nitrogecircnio oxigecircnio
enxofre carga iocircnica e poder de reduccedilatildeo para a produccedilatildeo fotoautotroacutefica de 1 mol
de carbono (C-mol) de biomassa seca usando NaNO3 e ureacuteia como fonte de
nitrogecircnio de acordo com Heijnen (2001) em cada condiccedilatildeo estudada de acordo
com a aplicaccedilatildeo do princiacutepio de conservaccedilatildeo
O crescimento autotroacutefico pode ser representado por uma equaccedilatildeo de
balanccedilo de massa global onde as fontes de nitrogecircnio (NO3- ou NH4
+) e carbono
(HCO3-) H2O e H+ estatildeo envolvidas para a formaccedilatildeo de 1 C-mol de biomassa
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
0 2 4 6 8 10 12
1Y
GX (
kJ
C-m
ol
DM
-1)
Tempo (dias)
145
a HCO3- + b NO3
- (or NH4+) + c H2O + d O2 + e H+ + f SO4
-2 +
CH1650O0531N0170S00007 = 0 (11)
Para esse propoacutesito foi usada a composiccedilatildeo elementar descrita por Cornet et
al (1992) (Equaccedilatildeo 11) ou a composiccedilatildeo elementar determinada
experimentalmente como descrita no item Materiais e meacutetodos
Os coeficientes estequiomeacutetricos foram estimados atraveacutes dos balanccedilos de
materiais de carbono nitrogecircnio oxigecircnio enxofre carga e grau de reduccedilatildeo da
biomassa usados para a formaccedilatildeo da biomassa Os principais iacuteons envolvidos na
formaccedilatildeo da biomassa e seus respectivos coeficientes estequiomeacutetricos estatildeo
descritos na Tabela 44
Como pode ser observado o grau de reduccedilatildeo da biomassa (γX) calculado no
modelo da composiccedilatildeo da biomassa determinado experimentalmente neste trabalho foi
sempre um pouco maior com o nitrato (489 ndash 519) do que com ureacuteia (399 ndash 432)
como esperado pelo maior nuacutemero de oxidaccedilatildeo do nitrato (HEIJNEN 2001)
Tabela 44 - Coeficientes estequiomeacutetricos estimados atraveacutes dos balanccedilos de materiais de
carbono nitrogecircnio oxigecircnio enxofre carga e grau de reduccedilatildeo da biomassa cultivada em
fotobiorreator tubular horizontal utilizando nitrato ou ureacuteia como fontes de nitrogecircnio
HCO3- NO3
- NH4+ H2O O2 H+ SO4
-2 Biomassa
Δgf‟i
(kJ mol-1) -5872 -1114 -794 -2373 0 -399 -7446 -670
Coeficiente estequiomeacutetrico (mol C-molDM-1)
testes Ia a b b C d e f γX b
1 c 60 -1 -020 - 020 145 -120 - 58
1 d 60 -1 -011 - 032 130 -111 000 519
2 d 60 -1 - -007 024 100 -093 000 399
3 d 120 -1 -011 - 023 122 -111 000 489
4 d 120 -1 - -008 042 103 -092 000 411
5 d 240 -1 -010 - 023 127 -110 000 509
6 d 240 -1 - -008 034 108 -092 000 432 a Intensidade luminosa (μmol m
-2 s
-1)
b Grau de reduccedilao da biomassa
c Composiccedilatildeo elementar da biomassa descrita por Cornet et al (1992)
d Composiccedilatildeo elementar da biomassa determinada experimentalmente
146
Estimando os coeficientes estequiomeacutetricos da reaccedilatildeo 11 e conhecendo a
energia de Gibbs de formaccedilatildeo de produtos e reagentes (Tabela 44) (HEIJNEN
2001) eacute possiacutevel calcular o numero de moles de foacutetons (Einsteins) para sustentar o
crescimento autotroacutefico de 1 C-mol de biomassa (nPh) pela Equaccedilatildeo 8 (item 45)
Embora os valores reais de Δgfi deveriam ter sido utilizados para este caacutelculo
foram utilizados os valores das condiccedilotildees bioloacutegicas padratildeo Torre et al (2003)
demostraram que as diferenccedilas entre a energia de Gibbs de formaccedilatildeo nas
condiccedilotildees reais de cultivo natildeo diferem entre si ou diferem natildeo mais que 3 apartir
de seus respectivos valores estimados com base nas condiccedilotildees bioloacutegicas padratildeo
(T = 2984K C = 10M pH = 70) Por isso foram utilizados os valores de energia de
Gibbs nas condiccedilotildees bioloacutegicas padratildeo
No entanto para o iacuteon H+ a energia de Gibbs de formaccedilatildeo (ΔgfH+) eacute por
definiccedilatildeo uma funccedilatildeo da cultura do pH Assim esse paracircmetro foi recalculado para
as condiccedilotildees reais da equaccedilatildeo de Gibbs
7
pH
ff10
10ln
HH
RTgg (Equaccedilatildeo 12)
Durante as reaccedilotildees luminosas da fotossiacutentese a energia livre carregada
pelos foacutetons eacute capturada por pigmentos (por exemplo a clorofila) organizadas em
grandes complexos de proteiacutenas chamado de centros de reaccedilatildeo A energia de um
foacuteton provoca excitaccedilatildeo eletrocircnica elevando um eleacutetron para um niacutevel maior de
energia exatamente igual agrave energia do foacuteton (hν) Satildeo exigidos um miacutenio de 8 foacutetons
para transferir 4 eleacutetrons de 2 moleacuteculas de H2O para reduzir a 2 moleacuteculas de
NADPH2 de acordo com a equaccedilatildeo
2 H2O + 8 hν +2 NADP+ rarr 2 NADPH + O2 + 2H+ (Reaccedilatildeo 12)
Subsequentemente os eleacutetrons satildeo transferidos do NADPH para o CO2
atraveacutes do ciclo de Calvin para produzir os constituintes da biomassa (RAVEN et al
2000)
Como mostrado na Graacutefico 27 a diminuiccedilatildeo progressiva da velocidade
especiacutefica de crescimento () ao longo do cultivo provocou um aumento (em valor
absoluto) no nuacutemero de Einsteins absorvido para produzir 1 C-mol de biomassa
147
(nPh) Nos maiores valores de quase atingiu o valor teoacuterico de nPh relatado por
Richmond (1983) para sustentar o crescimento sob condiccedilotildees ideais que eacute de 8
Einsteins por C-mol de biomassa
Como jaacute foi observado em trabalho anterior (TORRE et al 2003) a exigecircncia
de energia adicional em relaccedilatildeo agrave situaccedilatildeo ideal de 8 Einsteins C-mol DM-1 foi
insignificante no iniacutecio dos cultivos (alta velocidade especiacutefica de crescimento) e em
seguida aumentou consideravelmente durante a fase estacionaacuteria de cada
experimento sugerindo que em condiccedilotildees provavelmente limitada pelo
sombreamento a biomassa usa a energia preferencialmente para a manutenccedilatildeo
do que para o crescimento Em condiccedilotildees de limitaccedilatildeo de luz (no iniacutecio) ou de
sombreamento (na fase estacionaacuteria) um aumento progressivo da intensidade de
luz natildeo excedeu qualquer influecircncia significativa sobre este paracircmetro
Graacutefico 27 Influecircncia da velocidade especiacutefica de crescimento da A platensis sobre
o nuacutemero de moles de foacutetons absorvido para produzir 1 C-mol de biomassa em
diferentes condiccedilotildees de cultivo () Composiccedilatildeo elementar da biomass descrita por
Cornet et al (1992) PPFD = 60 μmol de foacutetons m-2 s-1 Composiccedilatildeo elementar da
biomass determinada experimentalmente PPFD (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60
() 120 () 240 Fonte de nitrogecircnio nitrato (siacutembolos abertos) ureacuteia
(siacutembolos fechados)
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
000 010 020 030 040 050 060 070 080
nP
h (
Ein
stei
n C
-mol
DM
-1)
(dias -1)
148
Como mostrado no Graacutefico 27 as culturas com nitrato necessitam de maiores
valores de nPh para sustentar o crescimento autotroacutefico em relaccedilatildeo agraves culturas
utilizando ureacuteia Como as concentraccedilotildees celulares dos cultivos utilizando nitrato ou
ureacuteia foram semelhante em todas as intensidades luminosas (Item 61) a exigecircncia
adicional foacuteton nos cultivos com nitrato foi provavelmente utilizado para reduzir o
nitrato a amocircnio (HATORI MYERS 1966) que eacute a forma preferencial de nitrogecircnio
assimilado pela A platensis (BOUSSIBA et al 1984) Este efeito tambeacutem foi
observada por Torre et al (2003) em tanques abertos
Finalmente pode ser observado na mesma figura que o uso do modelo
bioenergeacutetico acima com os coeficientes relatados por Cornet et al (1992) para a
composiccedilatildeo da biomassa de A platensis (CHNOS) levou a resultados praticamente
coincidentes com aqueles obtidos utilizando as experimentais determinadas neste
trabalho Essa constataccedilatildeo demonstra que a composiccedilatildeo da biomassa tem um
impacto pouco significativo sobre os resultados de tal modelo bioenergeacutetico logo
poderia simplesmente ser usado como um instrumento geral assumindo os dados da
literatura sem a necessidade de qualquer determinaccedilatildeo da biomassa
No Graacutefico 28 mostra os comportamentos da produccedilatildeo molar de O2 e do
consumo de H+ durante os cultivos nas diferentes intensidades luminosas Essas
tendecircncias demonstram que as diferentes atividades de consumo e produccedilatildeo
seguem fielmente o crescimento celular O aumento progressivo desses paracircmetros
com a intensidade luminosa confirma que esta foi o fator limitante ao crescimento
nunca atingindo as condiccedilotildees de inibiccedilatildeo da luz Como esperado este
comportamento foi qualitativamente semelhante nas culturas utilizando nitrato como
fonte de nitrogecircnio
149
Graacutefico 28 Produccedilatildeo molar de O2 (siacutembolo fechado) e consumo de H+ (siacutembolo
aberto) em funccedilatildeo do tempo em diferentes condiccedilotildees de cultivo Intensidades
luminosas (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 () 120 () 240 Fonte de
nitrogecircnio nitrato (linha rachurada) ureacuteia (linha contiacutenua)
Como eacute conhecido a energia do fluxo de eleacutetrons entre o FSII e NADPH
direciona proacutetons atraveacutes da membrana plasmaacutetica criando uma forccedila motriz de
proacutetons que fornece energia para a siacutentese de ATP pela ATP sintase (LEHNINGER
2004) Portanto assumiu-se que uma parte da energia molar de Gibbs absorvida
pelos dois fotossistemas foi usada para converter ADP em ATP Como mostrado no
Graacutefico 29 os maiores valores de ΔGa e ΔGATP foram obtidos no final do cultivo
devido a condiccedilotildees ambientais desfavoraacuteveis como a falta de nutrientes ou
liberaccedilatildeo de metaboacutelitos celulares No que se refere agrave intensidade luminosa os
maiores valores de ΔGa e ΔGATP foram observados nas culturas a intensidades
luminosas iguais e maiores que 120 μmol de foacutetons m-2 s-1 que garantiu a maior
concentraccedilatildeo de ceacutelulas (Item 61) Os valores de ΔGa e ΔGATP natildeo aumentaram no
caso dos cultivos utilizando ureacuteia ou aumentou muito pouco no caso dos cultivos
utilizando nitrato na faixa de intensidade luminosa de 120 - 240 μmol de foacutetons m-2
s-1 devido agraves condiccedilotildees de saturaccedilatildeo de luz como mencionado anteriormente
-015
-010
-005
000
005
010
015
020
0 2 4 6 8 10 12
q (
mo
lL
)
Tempo (dias)
150
Graacutefico 29 Energia total de Gibbs absorvida pelo aparato fotossinteacutetico (siacutembolo
fechado) (ΔGa) e energia transformada em ATP (siacutembolo aberto) (ΔGATP) durante o
cultivo da A platensis intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 (
) 120 () 240 Fonte de nitrogecircnio nitrato (linha tracejada) ureacuteia (linha
continua)
No Graacutefico 30 mostra os resultados da energia fixada pela fotossiacutentese (ΔH)
e a liberada como calor (Q) a diferentes condiccedilotildees de intensidades luminosas e
fontes de nitrogecircnio Pode ser visto que no final de cultivos tanto ΔH como Q
aumentaram com a intensidade luminosa Como eacute bem conhecido sob condiccedilotildees de
excesso de luz parte da energia absorvida eacute dissipada termicamente atraveacutes de um
mecanismo natildeo fotoquiacutemico (Non-Photochemical Quenching) (MOZZO et al 2008)
e uma quantidade significativa de energia livre eacute perdida como calor durante as
reaccedilotildees bioquiacutemicas entre a absorccedilatildeo luz e a formaccedilatildeo carboidratos (HAUSKA
ARNALD 2000) Esse resultado foi atribuiacutedo a um mecanismo fisioloacutegico para
proteger o aparelho fotossinteacutetico contra fotodestruiccedilatildeo (KARAPETYAN 2008
HEBER et al 2006) cuja funccedilatildeo eacute desempenhada pelos complexos antena do
aparato fotossinteacutetico que muda forma de captaccedilatildeo de luz para uma forma de
dissipaccedilatildeo teacutermica eficiente (MOZZO et al 2008)
-10000
-8000
-6000
-4000
-2000
0
2000
0 2 4 6 8 10 12
G
AT
P (
kJ
C-m
ol
DM
-1)
Tempo (dias)
151
Graacutefico 30 Energia fixada pelo aparato fotossinteacutetico (siacutembolo fechado) (ΔH) e
energia liberada como calor (siacutembolo aberto) (Q) durante o cultivo de A platensis
intensidade luminosa (μmol de foacutetons m-2 s-1) () 60 ( ) 120 () 240
Fonte de nitrogecircnio nitrato (linha rachurada) ureacuteia (linha contiacutenua)
Como era esperado pelo fato de que tanto a siacutentese de ATP como a formaccedilatildeo
de NADPH satildeo resultantes do mesmo complexo fotossinteacutetico o comportamento do
ΔH foi bastante semelhante ao observado para o ΔGATP
No Graacutefico 31 mostra a distribuiccedilatildeo percentual da energia luminosa absorvida
em funccedilatildeo do tempo nos cultivos a 60 μmol de foacutetons mndash2 sndash1 escolhidos como
exemplo Resultados qualitativamente semelhantes foram observados nos cultivos a
maiores intensidades luminosos (dados natildeo mostrados) Os cultivos com ureacuteia
apresentaram maiores valores de ηATP e ηF e menores valores de ηQ quando
comparado aos cultivos usando nitrato Isso pode ser explicado pelo fato de um
maior requerimento energeacutetico para a reduccedilatildeo de nitrato de amocircnia Aleacutem disso em
todos os experimentos a fraccedilatildeo de energia armazenada como ATP (ηATP) e a fixada
pelos sistemas (ηF) diminuiram ao longo do tempo enquanto que o liberado em
forma de calor (ηQ) aumentou
-2000
0
2000
4000
6000
8000
0 2 4 6 8 10
-H
Q
(k
J C
-mo
l D
M -1
)
Tempo (dias)
152
Graacutefico 31 Porcentagem na distribuiccedilatildeo da energia luminosa absorvida durante o
cultivo de A platensis usando nitrato (siacutembolo fechado) e ureacuteia (siacutembolo aberto)
como fonte de nitrogecircnio Energia fixada pelos fotossistemas () energia
transformada em ATP () energia liberada como calor ( )
Os maiores valores ηATP e ηF foram por volta de 12 e 23-27 nas culturas
com nitrato e 15 e 31-34 em culturas com ureacuteia respectivamente Nos cultivos a
maiores intensidades luminosas (120 e 240 μmol de foacutetons mndash2 sndash1) os valores de ηF
diminuem mais acentuadamente que os cultivos a 60 μmol de foacutetons mndash2 sndash1 devido
agrave maior concentraccedilatildeo de ceacutelulas (item 61) que reduziu a disponibilidade de luz para
a ceacutelula (efeito de sombreamento) A disponibilidade de nutrientes eacute outro importante
fator ambiental influenciando a composiccedilatildeo do aparato fotossinteacutetico de
cianobacteacuterias Murakami et al (1997) tecircm mostrado que as respostas ao CO2 Na+
e estresse pela luz em Synechocystis sp provocam alteraccedilotildees no estado redox de
componentes entre os sistemas de transporte de eleacutetrons Da mesma forma a
diminuiccedilatildeo na disponibilidade de alguns nutrientes no final do cultivo de A platensis
pode ter contribuiacutedo para diminuir os valores de ηF Como esperado ηQ mostraram
um comportamento oposto aumentando progressivamente a partir dos valores
miacutenimos (60-66 com nitrato e 49-54 com ureacuteia) no iniacutecio do cultivo e cerca de
90 no final Isto significa que no final do cultivo da maior parte da energia
absorvida foi liberada como calor
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2 4 6 8 10 12
h (
)
Tempo (dias)
153
67 Comparaccedilatildeo entre os fotobiorreatores de diferentes configuraccedilotildees
Apoacutes a escolha da melhor condiccedilatildeo do cultivo de A platensis em
fotobiorreator tubular horizontal utilizando CO2 de cilindro foram realizados
experimentos nas mesmas condiccedilotildees em fotobiorreator tubular espiralado para
avaliar o comportamento celular em duas diferentes configuraccedilotildees de
fotobiorreatores tubulares Luo et al (2003) tem mostrado que a configuraccedilatildeo de
cada reator eacute um dos principais fatores que controlam a produtividade do cultivo
fotossinteacutetico Por isso foram comparadas as curvas de crescimento A platensis
duas diferentes configuraccedilotildees dos fotobiorreatores tubulares uma horizonal (Figura
7) e outra espiralada (Figura 8)
Como observado no Graacutefico 32 os crescimentos celulares da A platensis nos
diferentes fotobiorreatores foram semelhantes obtendo valores de concentraccedilotildees
celulares diaacuterias proacuteximas Isso pode ser explicado pela semelhanccedila nas condiccedilotildees
fiacutesicas entre os fotobiorreatores tais como diacircmetro interno do tubo velocidade de
escoamento do liacutequido bem como as condiccedilotildees de cultivos como a intensidade
luminosa temperatura meio de cultivo que foram mantidas as mais semelhantes
possiacuteveis
Graacutefico 32 Concentraccedilatildeo celular nas duas diferentes configuraccedilotildees dos
fotobiorreatores tubulares ( ) horizontal e ( loz ) espiralado
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
Tempo (dias)
X (
mg
L-1)
154
7 Conclusotildees
Os paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima (Xm) e produtividade em ceacutelulas
(Px) foram influenciados pela variaacutevel independente intensidade luminosa (I)
obtendo maiores valores quando submetidos a maiores intensidades luminosas Por
outro lado a variaacutevel independente fonte de nitrogecircnio (N) natildeo influenciou nesses
paracircmetros mostrando a viabilidade na substituiccedilatildeo do nitrato pela ureacuteia nos cultivos
de Artrhospira platensis
A variaacutevel independente intensidade luminosa natildeo influenciou no paracircmetro
fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas (YXN) No entanto para variaacutevel
independente fonte de nitrogecircnio os cultivos utilizando ureacuteia apresentaram maiores
valores de YXN quando comparados aos cultivos com nitrato As diferentes fontes de
CO2 natildeo influenciaram nos paracircmetros analisados Xm Px e YXN Logo o CO2
juntamente com os volaacuteteis orgacircnicos liberados durante a fermentaccedilatildeo alcooacutelica
pode ser utilizado para o cultivo da A plantesis sem interferir no crescimento celular
Na composiccedilatildeo centesimal da biomassa pode-se observar que intensidade
luminosa influenciou nos teores de clorofila proteiacutenas e lipiacutedios obtendo maiores
valores de clorofila e proteiacutena nos cultivos a baixa intensidade luminosa enquanto
que nessas condiccedilotildees foram obtidos menores teores de lipiacutedios A fonte de
nitrogecircnio influenciou apenas no teor de clorofila obtendo maiores valores utilizando
nitrato como fonte de nitrogecircnio A fonte de CO2 natildeo influenciou na composiccedilatildeo da
biomassa Nenhuma das variaacuteveis independentes estudadas influenciou nos teores
de cinzas e carboidratos na biomassa final
Os resultados tambeacutem indicaram que todas as variaacuteveis independentes tiveram
uma certa influecircncia nos paracircmetros de bioenergeacutetica A dissipaccedilatildeo de energia de
Gibbs aumento com o tempo em todas as condiccedilotildees analisadas obtendo os maiores
valores em tempos mais curtos nos cultivos a 120-240 μmol de foacutetons m-2 s-1
independentemente da fonte de nitrogecircnio selecionado O nuacutemero de moles de
foacutetons absorvidos pelas ceacutelulas para produzir um C-mol de biomassa foi maior nas
culturas com nitrato independentemente da intensidade luminosa Os maiores
valores de produccedilatildeo molar de O2 e do consumo de H+ foram obtidos com os valores
mais elevados de intensidade luminosa utilizando nitrato As fraccedilotildees da energia
direcionada para a siacutentese de ATP fixada pela ceacutelula foram superiores em culturas
com ureacuteia quando comparadas com as culturas com nitrato que se revelou uma
fonte de nitrogecircnio capaz de sustentar o crescimento energicamente da A platensis
155
As diferentes configuraccedilotildees dos fotobiorreatores tubulares natildeo influenciaram
nas concentraccedilotildees celulares indicando que o formato do tubo que forma o
fotobiorreator seja horizontal ou espiralado natildeo interferem no crescimento da A
platensis
Com isso pode-se concluir que a intensidade luminosa eacute uma importante
variaacutevel que influencia nos paracircmetros concentraccedilatildeo celular maacutexima produtividade
celular fator de conversatildeo de nitrogecircnio em ceacutelulas bioenergeacuteticos e na
composiccedilatildeo quiacutemica da A platensis e que o emprego do CO2 proveniente da
fermentaccedilatildeo alcooacutelica juntamente com a ureacuteia como fonte de nitrogecircnio pode ser
uma alternativa viaacutevel para o cultivo de A platensis em escala industrial
proporcionando uma reduccedilatildeo no custo de produccedilatildeo
156
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178
ANEXOS
Artigos publicados submetidos e em fase de redaccedilatildeo para perioacutedicos internacionais
ANEXO 1 - BEZERRA RP MONTOYA EYO SATO S PEREGO P
CARVALHO JCM CONVERTI A Effects of light intensity and dilution rate on the
semicontinuous cultivation of Arthrospira (Spirulina) platensis A kinetic Monod-type
approach Bioresource Technology 102 p3215 - 3219 2011
ANEXO 2 - BEZERRA RP MATSUDO MC SATO S CONVERTI A
CARVALHO JCM Effects of photobioreactor configuration nitrogen source and
light intensity on the fed-batch cultivation of Arthrospira (Spirulina) platensis
Bioenergetic aspects Biomass and Bioenergy
ANEXO 3 - BEZERRA RP MATSUDO MC SATO S CONVERTI A
CARVALHO JCM Carbon dioxide from alcoholic fermentation as a carbon source
for the fed-batch cultivation of Arthrospira platensis Biomass and Bioenergy
BEZERRA RP MATSUDO MC SATO S CONVERTI A CARVALHO JCM
Chemical composition of the A platensis biomass cultivated on CO2 from alcoholic
fermentation Em fase de Redaccedilatildeo
179
ANEXOS
180
Anexo 1
181
182
183
184
185
Anexo 2
Effects of photobioreactor configuration nitrogen source and light intensity
on the fed-batch cultivation of Arthrospira (Spirulina) platensis
Bioenergetic aspects
Raquel Pedrosa Bezerraab
Marcelo Chuei Matsudoa Sunao Sato
a Patrizia Perego
b Attilio
Convertibc
Joatildeo Carlos Monteiro de Carvalhoa
a Department of Biochemical and Pharmaceutical Technology Faculty of Pharmaceutical
Sciences University of Satildeo Paulo Av Prof Lineu Prestes 580 Bl 16 05508-900 Satildeo Paulo-
SP Brazil
b Department of Chemical and Process Engineering ldquoGB Boninordquo University of Genoa via
Opera Pia 15 16145 Genoa Italy
c CAPES Fellowship holder Brazil
_________
Author for correspondence phone +55-11-30913695 fax +55-11-38156386
E-mail jcmdcarvuspbr
186
ABSTRACT
The bioenergetics of the photoautotrophic growth of the cyanobacterium Arthrospira
(Spirulina) platensis was investigated in different bioreactor configurations (tubular
photobioreactor and open ponds) using different nitrogen sources (nitrate and urea) and under
different light intensity conditions Although an increase in the light intensity increased the
Gibbs energy dissipated for cell growth and maintenance in both nitrogen sources it did not
exert any appreciable influence on the moles of photons absorbed by the system to produce
one C-mol biomass On the other hand both bioenergetic parameters were higher in cultures
with nitrate than with urea likely because of the higher energy requirements needed to reduce
the former nitrogen source to ammonia They appreciably increased also when open ponds
were substituted by the tubular photobioreactor where a more efficient light distribution
ensured a remarkably higher cell mass concentration The estimated percentages of the energy
absorbed by the cell showed that compared with nitrate the use of urea as nitrogen source
allowed the system to address higher energy fractions to ATP production and light fixation by
the photosynthetic apparatus as well as a lower fraction released as heat Thanks to this better
bioenergetic situation urea appears to be a quite promising low-cost alternative nitrogen
source for A platensis cultures in photobioreactors
Keywords Arthrospira (Spirulina) platensis bioenergetics nitrogen source light intensity
bioreactor configuration
187
1 Introduction
The production of the cyanobacterium Arthrospira platensis is increasing due to its high
content of highly-valuable proteins fundamental amino acids vitamins β-carotene and other
pigments mineral substances essential fatty acids and polysaccharides which find
application in several industrial productions like those of health foods and therapeutics [1]
Environmental factors such as light intensity and nitrogen source are well known to
influence the growth of photosynthetic microorganism In the absence of any other limiting
factor cell concentration increases with light intensity until reaching maximum biomass
concentration that is denominated ldquosaturation levelrdquo Light intensities higher than the
saturation level provoke damage of cell photosynthetic apparatus due to a phenomenon called
ldquophotooxidationrdquo or ldquophotoinhibitionrdquo
The nitrogen source is an additional environmental factor influencing cell growth
because this element is mainly used to form proteins and nucleic acids Alternative sources of
nitrogen such as urea [23] and ammonium salts [4] have been investigated in substitution of
nitrate to reduce the cost of large-scale A platensis cultivation
Also the reactor configuration can impact on cell growth Appropriately-designed
photobioreactors can in fact reduce the cultivation area by a vertical distribution of the
photosynthetic organism and enlarge the surface exposed to light thus increasing cell
concentration Tubular reactors allow for better light distribution and then higher
photosynthetic efficiency with respect to the conventional mini-ponds [56] where the cells
are subject to full light radiation at the surface and darkness at the bottom [7]
Only a few studies emphasized the bioenergetic aspects of the growth of
photosynthetic microorganisms based on Gibbs energy balances The Gibbs energy
dissipation per C-mol of biomass can be regarded as a simple thermodynamic measure of the
amount of biochemical work required to convert the carbon source into biomass by the
proper irreversible carbon-carbon coupling and oxidationreduction reactions [8] Up to now
188
the bioenergetics of the cyanobacterium A platensis were uninvestigated either in bench-scale
open ponds using urea and KNO3 as nitrogen sources [910] or in rectangular vessel under
different light intensities [11] To shed further light on these aspects in this study we
investigated the bioenergetics of this cyanobacterium when cultivated in tubular
photobioreactor under different light intensities and using different nitrogen sources and
compared these results with those previously obtained in open ponds [9]
2 Material and methods
21 Photobioreactors and culture conditions
Arthrospira (Spirulina) platensis UTEX 1926 was cultivated either in open ponds [9] on the
medium of Paoletti et al [12] or in tubular photobioreactor [13] on the medium of Schloumlsser
[14] both containing nitrate as nitrogen source The initial cell concentration and pH were set
at 400 mg l-1
[15] and 95 [1617] respectively
Open ponds cultivations were carried out elsewhere in the same medium of Paoletti et
al [12] at photosynthetic photon flux density (PPFD) of 72 μmol photons mndash2
sndash1
25 ordmC [9]
On the other hand for tubular photobioreactor cultivations we used the medium of Schloumlsser
[14] as well as medium in which NaNO3 was substituted by urea These runs were carried out
at 60 le PPFD le 240 μmol photons mndash2
sndash1
29 ordmC and the pH was controlled at 95 plusmn 02 by
pure CO2 addition Since the operating conditions at the lowest PPFD values were very
similar any difference in the kinetics and bioenergetics was ascribed to the different
bioreactor configurations The amount of urea to be daily added was estimated by an equation
describing the experimental growth curve obtained under non-limited conditions with NaNO3
as nitrogen source as previously described [13] Under these conditions the bioenergetics of
the system was investigated comparing the different nitrogen sources
189
22 Analytical determinations
The cell concentration of A platensis was determined by measuring the optical density of
cultures at 560 nm using a spectrophotometer model 600 PLUS (FEMTO Satildeo Paulo Brazil)
The optical density data were converted to cell dry weight by a calibration curve The
elemental composition of biomass obtained at the end of each run was determined by an
elemental analyzer Flash EA1112 series (CE Instruments Wigan UK)
Light intensity at the culture surface was measured using a quantum sensor model LI-
190 SB (Li-Cor Inc Lincoln NE USA) connected to a quantumradiometerphotometer
model LI-189 B
23 Theory
The Gibbs energy dissipation for cell growth and maintenance (1YGX) was estimated
according to Heijnen [18] by the equation (1)
G
GXGX
m
YY
max
11
(1)
in which max
GXY is the maximum biomass yield on Gibbs energy that corresponds to 986 C-
molX kJ-1
in photoautotrophic cultivation with CO2 as a carbon source [18]
In this equation the specific growth rate μ was defined according to Leduy and Zajic
[19] as
190
1
ln1
i
i
X
X
t
(2)
where Xi and Xi-1 are the biomass concentrations at the end and the beginning of the time
interval elapsing between two consecutive measurements (Δt = 1 day) while mG is the
biomass specific rate of Gibbs energy dissipation for maintenance corresponding to 45 and
712 kJ C-molX-1
h-1
at 25 and 29 degC respectively [18]
To estimate the moles of photons (Einsteins) to sustain the autotrophic growth nPh it
was necessary to resort to the Gibbs energy balance taking into account the energy
contributions for the growth 1YGX and the absorption of 1 Einstein of photons ΔgPh in
addition to those of formation of substrates and products Δgfi as described by the equation
ΔgfHCO3- +ΔgfN + ΔgfH2O + ΔgfO2
+ ΔgfH+ + ΔgfX + 1YGX + nPh ΔgPh = 0
(3)
The value of ΔgPh = 2062 kJ mol-1
was estimated through the equation
A
Ph
hcNg
(4)
being h = 6626 10
-34 J the Planck constant c = 299
10
8 m s
-1 the light velocity NA = 6022
10
23 photons Einstein
-1 the Avogadro number and λ = 580 nm the wavelength of absorbed
photons [9]
191
According to Torre et al [9] 2 photons at 580 nm are absorbed by the second
photosystem (PSII) and used to transfer 2 electrons to the first one (PSI) releasing two
photons with less energy Therefore knowing nPh we estimated the total molar Gibbs energy
absorbed by the photosynthesis (-ΔGa)
ΔGa = nPh ΔgPh
(5)
According to Torre et al [9] the molar O2 production (qO2) and H
+ consumption
(qH+) were calculated by multiplying their respective stoichiometric coefficients by the cell
concentration expressed in C-mol l-1
using the experimental biomass elemental composition
-ΔGa was assumed to be the sum of the energy fixed by the system to increase its own
enthalpic content (ΔH) that transformed into ATP and used for the growth and maintenance
(ΔGATP) and the released heat (Q)
ΔGa + ΔGATP + ΔH + Q = 0
(6)
where ΔGATP and ΔH were calculated from nPh the Gibbs energy associated to 1 ATP mol
and the average potential variation between PSI and PSII [9]
3 Results and discussion
Fig 1 shows the growth curves of A platensis using nitrate (A) or urea (B) as nitrogen
sources in open ponds [910] or in tubular photobioreactor at different PPFD values A
192
progressive increase in PPFD up to 240 μmol photons m-2
s-1
favored the growth of this
cyanobacterium and a maximum cell concentration of about 3500 mg l-1
was obtained almost
irrespectively of the nitrogen source These results suggest that the light intensity was the
factor limiting the growth under the selected conditions while ongoing experiments (results
not shown) point out that photosaturation takes place at PPFD ge 240 μmol photons m-2
s-1
Such a maximum PPFD threshold is higher than those reported for Erlenmeyer flasks (100-
150 μmol photons m-2
s-1
) [21] rectangular photobioreactor (138 - 229 μmol photons mndash2
sndash1
)
[22] and long open ponds (156 μmol photons mndash2
sndash1
) [23] Moreover even at PPFD of only
60 μmol photons m-2
s-1
(Fig 1) the final cell concentration was more than twice that
previously obtained in open pond under similar experimental conditions (25 degC 72 μmol
photons m-2
s-1
) [10] which suggests a better light distribution in the tubular photobioreactor
Fig 2 illustrates the behavior of Gibbs energy dissipation for cell growth and
maintenance 1YGX versus the time As a general rule this bioenergetic parameter increased
with the time under all the tested conditions as a result of the increasing biomass level that
was responsible for a decrease in the specific growth rate An increase in PPFD up to 120
μmol photons m-2
s-1
favored cell growth because of photolimitation therefore the energy
requirements mainly for maintenance remarkably increased On the contrary none (urea) or
very little (nitrate) increase in 1YGX took place in the PPFD range of 120-240 μmol photons
m-2
s-1
because of the achievement of light saturation conditions This behavior is also
consistent with lower 1YGX values previously observed in open ponds [9] where the well-
known shadowing effect [24] hindered the growth
The photoautotrophic growth can be represented by an overall mass balance equation
where the nitrogen (NO3- or NH4
+) and carbon (HCO3
-) sources H2O O2 SO4
-2 and H
+ are
involved in the formation of 1 C-mol biomass
193
a HCO3- + b NO3
- (or NH4
+) + c H2O + d O2 + e H
+ + f SO4
-2 + CH1650O0531N0170S00007 = 0
(7)
To this purpose we used either the elemental composition of biomass reported by
Cornet et al [25] utilized here as an example or those experimentally determined as
described in Material and methods
To make these redox reactions between electron acceptor and donor possible the
Gibbs energy is used by the cell to enable the construction of the complex biomass molecules
from the inorganic carbon source The respective stoichiometric coefficients estimated
through material balances of carbon nitrogen oxygen sulfur charge and reduction degree are
listed in Table 1 It should be noticed that the reduction degree of biomass (γX) calculated
from biomass composition experimentally determined in this work was always appreciably
higher with nitrate (489-519) than with urea (399-432) as expected by the higher oxidation
number of the former compound [18] In addition both this parameter and the nitrogen
stoichiometric coefficient were appreciably lower when using the elemental composition
experimentally determined in this work (Table 1) because the nitrogen content of biomass
under the selected conditions was always lower than that reported by Cornet et al [25]
The moles of photons (Einsteins) to sustain the autotrophic growth of 1 C-mol
biomass (nPh) were calculated by Eq (3) Although the actual Δgfi values should have been
used for this calculation Torre et al [9] demonstrated that the Gibbs energy of formation
under the actual variable conditions of a cultivation does not differ at all or differs by no more
than 3 from that estimated under standard biological conditions On the contrary ΔgfH+ is
by definition a function of the pH So this parameter was recalculated for the actual
conditions by the well-known equation of Gibbs
194
7
pH
ff10
10ln
HH
RTgg
(8)
As shown in Fig 3 the progressive decrease in the specific growth rate throughout the
cultivations brought about a corresponding increase (in absolute value) in the Einsteins
absorbed to produce one C-mol biomass (nPh) As expected at the highest growth rates this
parameter approached theoretical values very close to that reported by Richmond [26] to
sustain growth under ideal conditions (only 8 effective Einsteins C-molDM-1
)
During the light reactions of photosynthesis the free energy carried by photons is in
fact captured by pigments (ex chlorophyll) held in large protein complexes called ldquoreaction
centersrdquo When a special chlorophyll molecule of PSII absorbs the energy of a photon (hν) an
electron gains higher energy level Because this state of an electron is very unstable it is
transferred from one to another molecule creating a chain of redox reactions referred to as
Electron Transport Chain (ETC) The electron flow goes from PSII to cytochrome b6f of PSI
where the electron gets the energy from another photon The final electron acceptor is
NADP+ which produces NADPH A minimum of 8 photons is then required to transfer 4
electrons from 2 H2O molecules to produce 2 NAPDH molecules according to the equation
2 H2O + 8 hν +2 NADP+ rarr 2 NADPH + O2 + 2 H
+
(9)
Subsequently the electrons are transferred from NAPDH to CO2 through the Calvin cycle to
produce biomass constituents [27]
As already observed in previous work [9] the additional energy requirement with
respect to the ideal situation of 8 effective Einsteins C-molDM-1
is negligible at the beginning
195
of cultivations (high specific growth rates) and then considerably increases during the
stationary phase This suggests that under conditions likely limited by shadowing biomass
uses energy preferentially for maintenance rather than for growth Although the behavior of
nPh was qualitatively similar for cultivations performed in open ponds and in tubular
photobioreactor (Fig 3) the excess light requirements in the latter configuration were
certainly due to the higher levels of biomass ensured by more effective distribution As
expected a progressive increase in the light intensity did not exert any appreciable influence
on this nPh (Einstein C-molDM-1
)
In addition the cultures with nitrate needed highest nPh values to sustain the
autotrophic growth compared to those with urea even though the cell concentration was
similar at all the PPFD values (Fig 1) Thus the additional photon requirement was likely
utilized to reduce nitrate to ammonia [28] which is the preferential nitrogen form assimilated
by A platensis [29] This effect was also observed by Torre et al [9] in open ponds It should
also be noticed that the use in the above bioenergetic model of the coefficients reported by
Cornet et al [25] for A platensis biomass composition (CH1650O0531N0170S00007) led to
results practically coincident to those obtained using the experimental ones determined in this
work (Fig 3) This observation demonstrates that biomass composition has a negligible
impact on the predictions by the model and then it could be used as a general tool to elaborate
data from the literature without any determination of biomass composition
Fig 4 shows the time behaviors of molar development of O2 and consumption of H+
during the cultivations performed either in open pond or in the tubular photobioreactor at
variable PPFD These trends clearly demonstrate that both activities faithfully followed cell
growth being biomass the final product of the photosynthetic metabolism and were lower in
the open pond compared with the tubular photobioreactor consistently with the better light
distribution in the latter reactor configuration Moreover their progressive increase with
PPFD confirms that the light intensity was the factor actually limiting the growth and that the
196
system never reached photoinhibition conditions This behavior was qualitatively similar in
the cultures using nitrate as nitrogen source (data not shown) As expected by the above-
mentioned need of reducing nitrate to ammonia as an obligatory intermediate to utilize any
nitrogen source [30] both parameters were higher using nitrate than urea
As is well known the energy from flow of electrons between PSII and NADPH drives
protons across the plasma membrane creating a proton-motive force that provides the energy
for ATP synthesis by ATP synthase [31] Therefore it was assumed that a portion of molar
Gibbs energy absorbed by the two photosystems was used to convert ADP to ATP As shown
in Fig 5 the highest -ΔGa and ΔGATP values were obtained at end of cultivation due to
unfavorable environmental conditions such as the lack of nutrients or release of cell
metabolites As far as the influence of light intensity is concerned the highest energy
requirements were observed for cultures performed at PPFD up to 120 μmol photons m-2
s-1
which ensured the highest cell concentration (Fig 1) As previously mentioned the -ΔGa and
ΔGATP values did not increase (urea) or increased very little (nitrate) in the PPFD range of 120
ndash 240 μmol photons m-2
s-1
because of light saturation conditions A qualitatively similar
behavior was observed for cultures using nitrate in tubular photobioreactor (results not
shown) Moreover at the lowest PPFD values both parameters showed similar behaviors in
open pond and in tubular photobioreactor which means that the reactor configuration had
negligible influence on them
Fig 6 shows the results of the energy fixed by photosynthesis (-ΔH) and that released
as heat (Q) under different conditions of light intensity nitrogen source and reactor
configuration It can be seen that at the end of cultivations both parameters increased with
light intensity Almost coincident results were also obtained using nitrate as nitrogen source
(results not shown) As is well known under excess light conditions part of the absorbed
energy is thermally dissipated via a mechanism called Non-Photochemical Quenching (NPQ)
[32] and a significant quantity of free energy is lost as heat during the biochemical reactions
197
between light absorption and carbohydrate formation [33] Such a result has been ascribed to
a certain physiological mechanism to protect the photosynthetic apparatus against
photodestruction [3435] where a fundamental role is played by the antenna complexes of
photosynthetic apparatus which would switch from a light harvesting form to an efficient
thermal dissipation form [32]
As expected by the fact that both the ATP synthesis and the formation of NADPH
implied in the biosynthetic pathways are resulting from the activity of the same
photosynthetic apparatus [33] the ΔH behavior was quite similar to that observed for ΔGATP
Fig 7 shows the percentage distribution of the light energy absorbed versus time at the
lowest PPFD chosen as an example but qualitatively similar results were observed at higher
PPFD values As expected by the additional energy requirements of nitrate-to-ammonia
reduction cultures with urea compared with those with nitrate exhibited higher energy
fractions stored as ATP (ηATP) and fixed by the system to increase its enthalpic content (ηF)
and lower fraction released as heat (ηQ) Moreover in all the experiments both ηATP and ηF
decreased along the time whereas ηQ increased
The highest ηATP and ηF values were around 12 and 23ndash27 in cultures with nitrate
and 15 and 31ndash34 in those with urea respectively In cultures performed at the highest
PPFD values (120 and 240 μmol photons mndash2
sndash1
) ηF decreased more sharply than at the
lowest ones (results not shown) because of the highest cell concentrations (Fig 1) that
reduced the light availability to the cell (shading effect) The nutrient availability is another
important environmental factor influencing the composition of cyanobacterial photosynthetic
apparatus Murakami et al [36] have shown that the responses to CO2 Na+
and light stresses
in Synechocystis sp cause alterations in the redox state of intersystem electron transport
components Likewise the decrease in the availability of some nutrient at the end of our A
platensis cultivations may have contributed to lower ηF As expected ηQ showed an opposite
behavior progressively increasing from minimum values at the beginning of cultures (60-
198
66 with nitrate and 49-54 with urea) to around 90 at the end This means that at the end
of any cultivation most of the energy absorbed is released as heat
Similar behaviors were observed using either open ponds with nitrate or the tubular
photobioreactor with both nitrogen sources which means that the energy distribution was not
appreciably influenced by the reactor configuration
4 Conclusions
The results of the current study indicate that the bioenergetic parameters of the blue-green
cyanobacterium Arthrospira (Spirulina) platensis were influenced by bioreactor
configuration nitrogen source and photosynthetic photon flux density (PPFD) In particular
the highest values of the Gibbs energy dissipation for cell growth and maintenance were
obtained at 120-240 μmol photons m-2
s-1
irrespective of the selected nitrogen source while
the number of photons moles absorbed by the cell to produce one C-mol biomass was higher
in the cultures with nitrate irrespective of light intensity The highest values of the molar
production of O2 and consumption of H+ were obtained at the highest PPFD values using
nitrate as a nitrogen source and the tubular photobioreactor Contrarily the bioreactor
configuration did not exert any appreciable influence on the fractions of the absorbed energy
addressed to the synthesis of ATP fixed by the cell and released as heat The first two
fractions were higher in cultures performed with urea which proved a nitrogen source able to
energetically sustain A platensis growth
Acknowledgements
The authors grateful acknowledge the financial support of the Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
Pesquisa do Estado de Satildeo Paulo (FAPESP) Satildeo Paulo Brazil (process no 0654959-3 and
199
0656976-2) of the Coordenaccedilatildeo de Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES)
Brazil (process no 397808-7 and Prof A Converti Fellowship no 0350-112010) of the
Italian Ministry of Education University and Research (MIUR) (PRIN ProtN 200744HMBN
and FIRB Prot N RBIP06993E) and of the Vigoni Program (Deutsch-Italienisches
Hochschulzentrum)
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204
Caption of Figures
Fig 1 Growth of A platensis using nitrate (A) and urea (B) as nitrogen sources at different
PPFD values (μmol photons m-2
s-1
) Tubular photobioreactor () 60 ( ) 120 and () 240
Open ponds [10] 72 ()
Fig 2 Dependence of Gibbs energy dissipation for A platensis growth and maintenance
(1YGX) on PPFD (μmol photons m-2
s-1
) Tubular photobioreactor () 60 ( ) 120
() 240 Open ponds [10] 72 () Nitrogen source nitrate (open symbols or ) urea
(full symbols)
Fig 3 Influence of A platensis specific growth rate (μ) on the moles of photons absorbed to
produce one C-mol biomass (nPh) under different culture conditions Tubular photobioreactor
() elemental biomass composition reported by Cornet et al [25] PPFD = 60 μmol photons
m-2
s-1
elemental biomass composition experimentally determined in this work PPFD (μmol
photons m-2
s-1
) () 60 () 120 () 240 () Open ponds [10] elemental
biomass composition reported by Cornet et al [25] PPFD = 72 μmol photons m-2
s-1
Nitrogen source nitrate (open symbols or ) urea (full symbols)
Fig 4 Time behaviors of molar development of O2 (full symbols) and consumption of H+
(open symbols) under different culture conditions Tubular photobioreactor PPFD (μmol
photons m-2
s-1
) () 60 () 120 () 240 Open ponds [10] PPFD = 72 μmol
photons m-2
s-1
() Nitrogen source nitrate (dashed line) urea (continuous lines)
Fig 5 Total Gibbs energy absorbed by the photosynthetic apparatus (full symbols) (-ΔGa)
and energy transformed into ATP (open symbols) (ΔGATP) during A platensis cultivations
205
Tubular photobioreactor with urea PPFD (μmol photons m-2
s-1
) () 60 ( ) 120
() 240 Open ponds with nitrate [10] PPFD = 72 μmol photons m-2
s-1
()
Fig 6 Energy fixed by the photosynthetic apparatus (full symbols) (-ΔH) and energy released
as heat (open symbols) (Q) during A platensis cultivations Tubular photobioreactor with
urea PPFD (μmol photons m-2
s-1
) () 60 ( ) 120 () 240 Open ponds with
nitrate [10] PPFD = 72 μmol photons m-2
s-1
()
Fig 7 Percentage distribution of the light energy absorbed during A platensis cultivations
using nitrate (full symbols) and urea (open symbols) as nitrogen sources Tubular
photobioreactor PPFD = 60 μmol photons photons mndash2
sndash1
(continuous lines) Open ponds
[10] PPFD = 72 μmol photons m-2
s-1
(dashed lines) Energy fixed by the photosynthesis
() energy transformed into ATP () energy released as heat ( )
206
Figure 1
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
Bio
ma
ss c
on
cen
tra
tio
n (
mg
l-1
)
Time (d)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
Bio
ma
ss c
on
cen
tra
tio
n (
mg
l-1
)
Time (d)
A
B
207
Figure 2
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
0 2 4 6 8 10 12
1Y
GX (
kJ
C-m
ol
DM
-1)
Time (d)
208
Figure 3
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
000 010 020 030 040 050 060 070 080
nP
h (
Ein
stei
n C
-mo
l D
M-1
)
(d -1)
209
-015
-010
-005
000
005
010
015
020
0 2 4 6 8 10 12
q (
mol
l-1)
Time (d)
210
Figure 4
Figure 5
-9000
-8000
-7000
-6000
-5000
-4000
-3000
-2000
-1000
0
1000
0 2 4 6 8 10 12
G
a
GA
TP (
kJ
C-m
ol
DM
-1)
Time (d)
211
Figure 6
-2000
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
0 2 4 6 8 10 12-H
Q
(k
J C
-mol
DM
-1)
Time (d)
212
Figure 7
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2 4 6 8 10 12
h(
)
Time (d)
213
Table 1 Stoichiometric coefficients estimated through material balances of carbon nitrogen
oxygen sulfur charge and reduction degree for biomass cultivated either in open ponds or in
tubular photobioreactor using nitrate or urea as nitrogen sources
HCO3- NO3
- NH4
+ a H2O O2 H
+ SO4
-2 Biomass
Δgf‟i
(kJ mol-1
)
-5872 -1114 -794 -2373 0 -399 -7446 -670
Stoichiometric coefficients (mol C-molDM-1
)
Run
PPFD
(μmol photons
m-2
s-1
)
a b b c d e f γX b
1 c 72 -1 -020 - 020 145 -120 - 580
2 d 60 -1 -020 - 020 145 -120 - 580
2 e 60 -1 -011 - 032 130 -111 000 519
3 e 60 -1 - -007 024 100 -093 000 399
4 e 120 -1 -011 - 023 122 -111 000 489
5 e 120 -1 - -008 042 103 -092 000 411
6 e 240 -1 -010 - 023 127 -110 000 509
7 e 240 -1 - -008 034 108 -092 000 432
a NH4
+ is the result of urea hydrolysis
b Reduction degree of biomass
c Minipond considering the elemental biomass composition reported by Cornet et al [25]
d Tubular photobioreactor considering the elemental biomass composition reported by Cornet et al
[25]
e Tubular photobioreactor elemental biomass composition experimentally determined
214
Anexo 3
Carbon dioxide from alcoholic fermentation as a carbon source for the
fed-batch cultivation of Arthrospira platensis
Raquel Pedrosa Bezerraab
Marcelo Chuei Matsudoa Sunao Sato
a Attilio Converti
bc Joatildeo
Carlos Monteiro de Carvalhoa
a Department of Biochemical and Pharmaceutical Technology Faculty of Pharmaceutical
Sciences University of Satildeo Paulo Av Prof Lineu Prestes 580 Bl 16 05508-900 Satildeo
Paulo-SP Brazil
b Department of Chemical and Process Engineering ldquoGB Boninordquo University of Genoa via
Opera Pia 15 16145 Genoa Italy
c CAPES Fellowship holder Brazil
_________
Author for correspondence phone +55-11-30913695 fax +55-11-38156386
E-mail jcmdcarvuspbr
215
Abstract
It was evaluated the Arthrospira platensis cultivation using CO2 from alcoholic fermentation
and either urea or nitrate as nitrogen source at different light intensities (60 le I le 240 μmol
photons m-2
s-1
) Whereas the CO2 source (pure CO2 or from alcoholic fermentation) did not
influence the maximum cell concentration (Xm) cell productivity (PX) and nitrogen-to-cell
conversion factor (YXN) the use of urea instead of nitrate led to higher YXN values Xm and PX
increased when I was increased from 60 to 120-240 μmol photons m-2
s-1
Using CO2 from
alcoholic fermentation the best performance (Xm = 2952 plusmn 35 mg L-1
PX = 425 plusmn 59 mg L-1
d-1
and YXN = 15 plusmn 020 mg mg-1
) was obtained at I = 120 μmol photons m-2
s-1
with urea The
results obtained in this work demonstrate that urea and CO2 from alcoholic fermentation could
be simultaneously used in large-scale cultivations to reduce the environmental impact
associated to the release of this greenhouse gas as well as the production cost of
cyanobacteria
Keywords
Arthrospira (Spirulina) platensis CO2 alcoholic fermentation fed-batch cultivation urea
light intensity
1 Introduction
Renewable energy sources such as ethanol have been seen as a promising alternative
to fossil fuel consumption providing environmental benefits by reduction in greenhouse gas
emissions and the national security benefits by less dependency on volatile crude oil imports
(Tyner and Taheripour 2007) Brazil is the worldrsquos largest exporter of bioethanol and second-
largest producer after the United States (Balat and Balat 2009) Considering the increasing
demand for this fuel and the fact that alcoholic fermentation is responsible for a CO2 release
216
on weight basis almost coincident with ethanol production it would be of great concern
developing a process for CO2 fixation able to turn it into a useful product Photosynthetic
microorganisms can fix CO2 efficiently from different sources including the atmosphere
industrial exhaust gases and soluble carbonate salts (Wang et al 2008) Moreover CO2
biofixation by microalgae leads to higher yield of biomass per hectare in comparison with
terrestrial plants (Packer 2009) It has been shown that the cost of CO2 in large-scale algal
cultures is of primary importance to the total economics (Tapie and Bernard 1988) Since 45ndash
50 of the dry algal mass is made up of carbon (Cornet et al 1992) 165ndash 183 g CO2 would
theoretically be needed for the biosynthesis of 1 g (DW) of algal biomass Thus CO2
biofixation by microalgae has the potential not only to offset carbon emissions but also to
reduce the costs of culture media on an industrial scale (Hughes and Benemann 1997)
Combination of CO2 fixation and production of biomass containing high-value bioactive
products may provide a very promising alternative to current CO2 mitigation strategies
Nowadays there are numerous commercial applications of A platensis such as the
enhancement of the nutritional value of foods and animal feed feed in aquaculture
bioremediation use in cosmetics and others applications (Spolaore et al 2006) Besides the
CO2 source the nitrogen source is an additional important factor in the cultivation of
photosynthetic microorganisms since this element is used mainly to provide proteins and
nucleic acids which are essential for cell maintenance and growth (Watanabe and Hall
1996) Salts of nitrate are largely used as nitrogen source for A platensis culture but urea
(Danesi et al 2004) and ammonium salts (Bezerra et al 2008) have recently been proposed
as alternative cheap nitrogen sources
Compared to open ponds appropriately designed closed photobioreactors are able to
minimize the loss of ammonia nitrogen sources by off gassing reducing the amount of this
nutrient necessary in a large-scale process Additionally these reactors can reduce the
217
cultivation area by distributing the photosynthetic organisms vertically and increase the CO2
residence time thereby improving its utilization efficiency (Ono and Cuello 2004)
The aim of this study was to check if the combined use of CO2 released from alcoholic
fermentation and urea in tubular photobioreactor could be a feasible and cheap alternative
way to cultivate A platensis For this purpose fed-batch cultivations were carried out at
variable light intensity using two different sources either of nitrogen (sodium nitrate or urea)
or of carbon (pure CO2 from cylinder or gaseous emissions from alcoholic fermentation) the
latter to simultaneously control the pH and maintain the desired carbon level The results
obtained were finally compared by means of analysis of variance to identify the statistically
significant effects of the above independent variables (light intensity nitrogen source and
carbon source) on the selected responses namely the maximum cell concentration cell
productivity and nitrogen-to-cell conversion factor
2 Materials and methods
21 Microorganism and culture medium
Arthrospira (Spirulina) platensis UTEX 1926 was maintained in the culture medium
of Schloumlsser (1982) having the following composition (per liter) 136 g NaHCO3 403 g
Na2CO3 050 g K2HPO4 250 g NaNO3 100 g K2SO4 100 g NaCl 020 g MgSO4middot7H2O
004 g CaCl2middot2H2O All the nutrients were dissolved in distilled water containing (per liter)
60 mL of metal solution (970 mg FeCl3middot6H2O 410 mg MnCl2middot4H2O 50 mg ZnCl2 20 mg
CoCl2middot6H2O 40 mg Na2MoO4middot2H2O) 10 mL of micronutrient solution (500 mg Na2EDTA
618 mg H3BO3 196 mg CuSO4middot5H2O 440 mg ZnSO4middot7H2O 200 mg CoCl2middot6H2O 126 mg
MnCl2middot4 H2O 126 mg Na2MoO4 middot2H2O) and 10 mL15 g Lminus1
B12 vitamin solution
Fed-batch runs were carried out either using the above medium containing NaNO3 as
the nitrogen source or after substituting in it NaNO3 with urea
218
22 Cultivation
The bench-scale tubular photobioreactor (Fig 1) utilized in this study was developed
at the Fermentation Technology Laboratory of the Department of Biochemical and
Pharmaceutical Technology of Satildeo Paulo University (Ferreira et al 2010) It was made up of
transparent glass tubes (10 m length 10 cm internal diameter 05 cm wall thickness) with
inclination of 2 (115ordm) to make the fluid flow easier PVC tubes were used to connect the
glass tubes The reactor was illuminated by 20 W fluorescent lamps Ambient air was injected
at the bottom of the tubes to drive the liquid from the bottom to the top of the reactor A
degassing bottle provided with magnetic stirrer ensured efficient medium homogeneity The
total and illuminated volumes of the reactor were 350 and 212 L respectively
Cultivations were carried out with initial biomass concentration of 400 mg Lminus1
(Ferreira et al 2010) in tubular photobioreactor (PBR) and temperature of 29 ordmC The pH was
set and maintained at 95 plusmn 02 (Saacutenchez-Luna et al 2007) by addition of pure CO2 from
cylinder or CO2 from continuous alcoholic fermentation under steady-state conditions using a
pH controller (Mettler Toledo Barueri SP Brazil) coupled to a solenoid valve In
experiments with NaNO3 nitrate concentration was maintained above 1 g L-1
(Faintuch
1989) to avoid growth limitation by this nutrient When urea was used as nitrogen source its
amount to be daily added was estimated as suggested by Ferreira et al (2010) Briefly from
the curve of cell concentration versus time of each standard run with nitrate (Fig 2) we
obtained an interpolated curve described by a third order-polynomial equation By derivation
of this equation it was possible to obtain the second order equation of cell productivity and
from that the equation expressing the amount of urea to be daily added to sustain the expected
cell growth taking into account that the dry mass of A platensis contains about 7 of
nitrogen (Bezerra et al 2008) The light intensity expressed as photosynthetic photon flux
density (PPFD) was varied in the range of 60-240 μmol photons mndash2
sndash1
Table 1 show the
219
different conditions adopted in this work for cultivations All experiments were carried out in
duplicate
221 CO2 sources
Pure CO2 of analytical grade (999) was obtained from a cylinder (Oxylumen Satildeo
Paulo SP Brazil)
CO2 from alcoholic fermentation was produced continuously by Saccharomyces
cerevisiae CCT7150 (Fundaccedilatildeo Tropical Andreacute Tosello Culture Collection Campinas SP
Brazil) cultivated in a glass bioreactor (Infors-HT Bottmingen Switzerland) containing 10 L
of diluted sugarcane blackstrap molasses at temperature of 30 plusmn 1 ordmC (Kock et al 2000)
impeller speed of 500 rpm and dilution rate of 0025 h-1
Sugar concentration in the feed
expressed as total reducing sugars (TRS) was 170 g L-1
(Guerreiro et al 1997) Urea (05 g
L-1
) was added to the mash After adjustment of pH at 45-50 by addition of H2SO4 it was
controlled at 45 plusmn 01 (Jones et al 1981) by addition of 15 N NaOH solution Penicillin (500
ui L-1
) was added to prevent contamination (Carvalho et al 2003) Continuous feeding was
started after 12 h of batch fermentation
23 Analytical techniques
231 A platensis cultivation
Cell concentration was determined by optical density (OD) measurements at 560 nm
using a calibration curve (Leduy and Therien 1977) The liquid phase of the medium was
used to determinate the concentrations of total carbonate (Pierce and Haenisch 1948) nitrate
(Vogel 2002) and volatile organic compounds (Joslyn 1970) The concentration of total
ammonia was determined immediately before the daily addition of urea on cell-free medium
samples using a potentiometer and selective ammonia ion electrode model 95-12 (Orion
Cambridge MA USA) (Leduy and Samson 1982) The residual urea level was determined
220
by the same way after previous hydrolysis with H2SO4 at 200 degC (Cezare 1998) Incident
photon flux density of photosynthetically active radiation (400-700 nm) was measured by
means of an integrating quantumradiometerphotometer model LI-190 SB (Li-Cor Lincoln
NE USA) provided with a LI-190 SB quantum sensor cell
232 Alcoholic fermentation
Cell concentration was measured by filtering 50 mL samples through Millipore
membranes with 12 μm pore diameter washing with 50 mL of distilled water and drying at
105-110 degC until constant weigh (Carvalho et al 2003) The total reducing sugars (TRS)
concentration was expressed as glucose and determined according to Somogy (1952) after
acid hydrolysis of samples (Falcone et al 1959)
Ethanol concentration was determined by the micro-dichromate method (Joslyn
1970) The effluent gas was qualitatively analyzed by a gas chromatograph coupled to mass
spectrometer model GCMS-QP5050A (Shimadzu Kyoto Japan) equipped with CP Sil
PONA CB column (100 m x 025 mm x 05 μm) Helium was used as a carrier gas at flow rate
of 1 mL min-1
Samples (1 mL) were injected in the column at a split ratio of 1100 Injector
and detector temperatures were 200 and 250 degC respectively The column temperature was
initially set at 40 degC and then increased at a rate of 2 degC min-1
up to 100 degC and subsequently
at 10 degC min-1
up to 250 degC
24 Calculation of A platensis cultivation parameters
The cell productivity (PX mg L-1
d-1
) was calculated by dividing the difference
between maximum and initial cell concentration (Xm - Xi) by the cultivation time
corresponding to Xm The nitrogen-to-cell conversion factor (YXN mg mg-1
) was calculated as
the mass ratio of dried produced cells and nitrogen added
221
24 Statistical analysis
Maximum cell concentration (Xm mg L-1
) maximum cell productivity (PX mg L-1
d-1
)
and nitrogen-to-cell conversion factor (YXN mg mg-1
) were evaluated by the analysis of
variance (ANOVA General Linear Model) and the Tukey test to compare the mean values at
a significance level of 5 (p lt 005) using the MINITAB 15 statistical software
3 Results and discussion
31 Continuous alcoholic fermentation
The mean results of continuous alcoholic fermentation of blackstrap molasses under
steady state conditions were the following cell concentration of 609 plusmn 054 gDW L-1
(dry
weight) TRS of 532 plusmn 567 g L-1
and ethanol concentration of 553 plusmn 757 g L-1
corresponding to a fermentation yield of 64 Such a process yield was of the same order of
magnitude as those previously obtained with the same carbon source (Carvalho et al 2003)
and ensured the release of a CO2 flux suitable to maintain the pH of A platensis culture at the
desired value (95 plusmn 02)
32 Effects of carbon dioxide and nitrogen sources and light intensity on A platensis
growth
Figs 2 to 4 show that the use of pure CO2 or CO2 from alcoholic fermentation led to
almost coincident cell concentration profiles and Xm values which points out no significant
influence of the CO2 source on A platensis growth These findings which were confirmed by
ANOVA (p 005 Table 2) highlight the feasibility of using such a by-product from
industrial bioethanol production as carbon source for cyanobacteria cultivation
It is well known that when bicarbonate is used for the photosynthetic growth of
microalgae there is a progressive release of OH- in the medium (Goldman et al 1982) thus
222
the pH control is fundamental in processes leading to high cell concentrations As stressed by
Watanabe et al (1995) high alkalinity (pH gt 110) restricts the productivity in the air-lift
photobioreactors using air not supplemented with CO2 In cultivations having high demand of
carbon due to high cell concentrations the addition of CO2 can ensure at the same time
control of pH and suited supply of the carbon source This has been done in the present work
where the culture pH was maintained at 95 plusmn 02 (Saacutenchez-Luna et al 2007) by addition of
CO2 either from a cylinder or from alcoholic fermentation so that the CO2 consumed by the
microorganism was permanently replaced Such a control also allowed maintaining the carbon
source level along the cultivations at a value (around 1208 g L-1
of total carbonate)
practically coincident with that of the medium of Schloumlsser (1982) thus avoiding any carbon
source limitation or accumulation and reducing its cost
In experiments carried out with CO2 from alcoholic fermentation the analysis of
effluent gas by headspace gas chromatography revealed it was mainly made up of CO2 with
only small contents of ethanol and acetaldehyde Despite of this it was not detected any
appreciable concentration of organic volatile compounds in the medium likely because this
microorganism has the enzymes needed to metabolize ethanol or even due to their
condensation in the pipe and consequently no influence of these compounds on A platensis
growth was observed In addition the use of CO2 from alcoholic fermentation did not lead to
any precipitation of salts or flocculation like those observed by Ferraz et al (1985) for A
maxima cultivations in open-ponds using a semi-synthetic medium constituted by malt and
yeast extracts peptone and sucrose
As far as the influence of the nitrogen source on A platensis growth is concerned
urea a classical fertilizer was chosen to substitute the conventional nitrogen sources (KNO3
NaNO3) because of its low cost and because it has been recognized as a promising alternative
nitrogen source in the cultivation of A platensis (Danesi et al 2004 Sassano et al 2007)
223
For a given light intensity and CO2 source no significant difference in growth curves
of cultivations carried out with nitrate (Fig 2) or urea (Figs 3 and 4) as nitrogen source was
observed and the Xm values obtained with both nitrogen sources were statistically coincident
(p 005 Table 2) These results point out the success of the approach of using standard
curves obtained with NaNO3 under non-limited conditions (Fig 2) to foresee the nitrogen
demand of fed-batch A platensis cultivations with urea and confirm the feasibility of using
this cheap nitrogen source
Ammonia and residual urea concentrations during the cultivation (lt 10-4
M) were
always much lower than those considered toxic (10 mM) or even inhibitory for cyanobacteria
growth (17 mM to 2 mM) (Abeliovich and Azov 1976) thereby demonstrating that there
was no accumulation either of ammonia or urea in the medium Since the pH of the culture
(95 plusmn 02) was higher than the pKa of the ammonium (93) this compound was likely
assimilated by simple diffusion and then trapped within the cell cytoplasm by protonation
(Boussiba et al 1984)
Light is the energy source that drives photosynthesis therefore its intensity is an
additional important growth factor which has been often associated with shifts in metabolic
activity (Vonshak et al 2000)
During photoautotrophic growth the amount of light energy received by the
photosynthetic apparatuses determines the amounts of inorganic carbon fixed Xm was
significantly increased (p lt 005 Table 2) by an increase in the light intensity from 60 to 120
micromol photons m-2
s-1
(Figs 2 to 4) whereas it reached a plateau in the range 120-240 micromol
photons m-2
s-1
(Table 3) This result is consistent with the typical behavior of the autotrophic
growth of A platensis (Vonshak et al 2000) which can be depending on I (i) light limited
(ii) light saturated or (iii) light inhibited and whose specific growth rate initially increases
linearly with light intensity then reaches a plateau and finally falls
224
The highest Xm value found in this work was higher than those reported for A
platensis cultivations in minipond (15 g L-1
) (Binaghi et al 2003) and conical tubular
photobioreactor (13 g L-1
) (Watanabe and Hall 1996)
33 Cell productivity
Table 2 shows that cell productivity (PX) was not statistically affected either by the
nitrogen or the CO2 source (p 005) Indeed the almost coincident PX values obtained in
cultures with urea and nitrate were expected by the fact that the amounts employed of the
former nitrogen source under every conditions were always based on the results of the
corresponding runs with nitrate As for Xm also the use of different CO2 sources did not
influence the productivity (p 005 Table 2) as well the cultivation time
On the other hand PX increased by about 45 when increasing the light intensity from
60 to 120 micromol photons m-2
s-1
while Xm increased by only 7 Since the higher the light
intensity the higher the biomass concentration in the middle of runs (Figs 2 to 4) it is likely
that the effect of I is more marked when the overall culture conditions are favorable and there
is some shadowing effect (Vonshak et al 2000) In fact the higher the light intensity the
larger the amount of energy converted into ATP to be utilized for cell growth and
maintenance and then the cells reach more quickly the maximum cell concentration (Vonshak
et al 2000)
This behavior was also observed by Danesi et al (2004) and Rangel-Yagui et al
(2004) in A platensis cultures carried out in miniponds with KNO3 or urea as nitrogen
sources On the other hand the similar PX values obtained at 120 and 240 micromol photons m-2
s-
1 (Table 3) were the likely result of photosaturation or shadowing (Chojnacka and Noworyta
2004 Vonshak et al 2000) as described earlier for Xm
225
Therefore the highest cell productivities were obtained at the highest light intensities
(443 plusmn 20 and 463 plusmn 16 mg L-1
d-1
at I = 120 and 240 micromol photons m-2
s-1
respectively)
irrespective of the nitrogen or CO2 sources used (Table 3) These values are close to that (510
mg L-1
d-1
) obtained by Watanabe et al (1995) who investigated the A platensis growth in
conical helical photobioreactor at 118 μmol photon m-2
s-1
Other studies showed that this parameter reached maximum values of 92 mg L-1
d-1
in
a cylindrical glass tank using urea at 108 μmol photons mndash2
sndash1
(Sassano et al 2007) and 96
mg L-1
d-1
in long minitanks using ammonium chloride at 13 klux (156 μmol photons mndash2
sndash1
)
(Bezerra et al 2008) Since these light intensity thresholds are close to that obtained in this
study the remarkably higher values of PX shown here demonstrate the excellent performance
of the tubular photobioreactor configuration
34 Nitrogen-to-cell conversion factor
The ANOVA statistical analysis indicates a significant effect of the nitrogen source (p
lt 005 Table 2) on the nitrogen-to-cell conversion factor (YXN) whose highest mean values
were achieved in cultures using urea (Table 1) Indeed in these cultures the nitrogen amount
added daily was based on the actual needs for cell growth and maintenance and then its
residual concentration was always lt 10-4
M therefore there was no limitation or excess of
nitrogen during cultivation On the other hand in cultures with nitrate its concentration was
always maintained above 1 g L-1
to avoid any growth limitation (Faintuch 1989) thus
resulting in a YXN decrease
Contrarily no significant effects of CO2 sources and light intensities on YXN (p 005
Table 2) were observed Taking into account that YXN is the ratio between the masses of dry
cell produced and nitrogen added such an observation had to be expected by the fact that the
amount of nitrogen added to the culture is associated to cell growth as stressed above These
results apparently disagree with those obtained by Bezerra et al (2008) and Danesi et al
226
(2004) who observed a YXN increase with light intensity However since those experiments
were carried out using the same amount of nitrogen regardless of the light intensity YXN was
only a function of Xm which was in turn an increasing function of I
The highest YXN value found in this study (138 plusmn 090 mg mg-1
) was remarkably
higher than those reported for urea (74-85 mg mg-1
) (Rangel-Yagui et al 2004) and
ammonium chloride (57 plusmn 017 mg mg-1
) (Bezerra et al 2008) as nitrogen sources in
miniponds because the use in this study of a closed tubular photobioreactor certainly reduced
the nitrogen loss as ammonia by off gassing (Ferreira et al 2010)
4 Conclusions
The results of this work showed that the simultaneous use of two low cost or even no-
cost nutrients (CO2 from alcoholic fermentation and urea) could be an interesting alternative
for A platensis cultivation in tubular photobioreactor The fed-batch cultivation of this
cyanobacterium at 120 μmol photons m-2
s-1
using these nutrients as carbon and nitrogen
sources respectively did in fact provide a maximum cell concentration of 2960 plusmn 35 mg L-1
and a cell productivity of 425 plusmn 59 mg L-1
d-1
The production of A platensis biomass which
is a source of valuable compounds using as carbon source the CO2-rich gaseous emissions
from the alcohol industry may contribute to reduce the release of such a greenhouse gas into
the atmosphere
Acknowledgements
The authors grateful acknowledge the financial support of the Fundaccedilatildeo de Amparo agrave
Pesquisa do Estado de Satildeo Paulo (FAPESP) Satildeo Paulo Brazil (process no 0654959-3 and
065679-2) and of the Coordenaccedilatildeo de Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior
(CAPES) Brazil (processes n 397808-7 and 0350-112010)
227
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232
Caption of Figures
Figure 1 Scheme of the photobioreactor employed for fed-batch cultivations of A platensis
(1) Degasser (2) Condenser tube (3) Air pump (4) Rotameter (5) Magnetic stirrer (6)
20W Fluorescent lamps (7) Airlift system
Figure 2 Cell concentration (X mg L-1
) versus time during fed-batch A platensis cultivations
carried out using nitrate and A) CO2 from cylinder or B) gaseous emissions from alcoholic
fermentation at different light intensities (μmol photons m-2
s-1
) 60 (diams) 120 (times) and 240 (+)
The estimated curves are drawn as continuous lines
Figure 3 A) Cell concentration (X mg L-1
) (open symbols) and B) daily urea addition (mM
d-1
) (full symbols) versus time during fed-batch A platensis cultivations carried out using CO2
from cylinder at different light intensities (μmol photons m-2
s-1
) Triangle 60 Square 120
Circle 240
Figure 4 A) Cell concentration (X mg L-1
) (open symbols) and B) daily urea addition
(mM d-1
) (full symbols) versus time during fed-batch A platensis cultivations carried out
using CO2 from alcoholic fermentation at different light intensities (μmol photons m-2
s-1
)
Triangle 60 Square 120 Circle 240
233
Figure 1
234
Figure 2
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg L
-1)
Time (days)
A)
B)
235
Figure 3
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10 12
X (
mg L
-1)
Time (days)
000
020
040
060
080
100
120
140
160
0 2 4 6 8 10
Time (days)
ure
a ad
dit
ion (
mM
d-1
)
236
Table 1 Maximum cell concentration (Xm) cell productivity (PX) and nitrogen-to-cell
conversion factor (YXN) obtained in fed-batch A platensis cultures carried out at different
light intensities and using different CO2 and nitrogen sources
run
I
(mol m-2
s-1
)a
CO2
source
Nitrogen
source
Xm
(mg L-1
) b
PX
(mg L-1
d-1
) b
YXN
(mg mg-1
) b
1 60 C c NaNO3 2899plusmn17 250plusmn17 42plusmn003
2 60 C Urea 2847plusmn10 245plusmn00 14plusmn000
3 60 A d NaNO3 2789plusmn82 299plusmn10 40plusmn014
4 60 A Urea 2867plusmn28 308plusmn35 14plusmn017
5 120 C NaNO3 3209plusmn109 454plusmn18 45plusmn018
6 120 C Urea 2980plusmn103 408plusmn17 11plusmn050
7 120 A NaNO3 2968plusmn24 428plusmn40 43plusmn004
8 120 A Urea 2952plusmn35 425plusmn59 15plusmn020
9 240 C NaNO3 3291plusmn206 482plusmn34 54plusmn038
10 240 C Urea 3236plusmn72 473plusmn12 13plusmn034
11 240 A NaNO3 3102plusmn130 450plusmn22 50plusmn024
12 240 A Urea 3070plusmn112 445plusmn19 14plusmn056
a I = light intensity
b Values represent means of two experiments and its standard error
c C = cylinder
d A = alcoholic fermentation
237
Table 2 Values of the descriptive level (p) for the maximum cell concentration (Xm) cell
productivity (PX) and nitrogen-to-cell conversion factor (YXN) at different light intensities (60
120 or 240 mol photons m-2
s-1
) and using different sources of CO2 (cylinder or alcoholic
fermentation) and nitrogen (nitrate or urea)
Factors Xm PX YXN
CO2 0225 0256 0351
Light intensity 0000 0000 0700
Nitrogen 0922 0947 0000
238
Table 3 Means values of maximum cell concentration (Xm) and cell productivity (PX)
obtained in fed-batch A platensis cultivations carried out at variable light intensity
Light intensity
(mol photons m-2
s-1
)
Xm
(mg L-1
)
PX
(mg L-1
d-1
)
60 2851plusmn54ordf 306plusmn7a
120 3056plusmn115b 443plusmn20
b
240 3180plusmn96b 463plusmn16
b
Values with the same superscript are not significantly different according to the Tukey test
(p gt 005)
