issn 1726-7196 ediciÓn#003 junio 2013 salud...

Salud Latina

EDICIÓN#003 ▪ JUNIO 2013

Summum- Desiderium - Sapientia

Universidad Latina de PanamáFacultad de Ciencias de la Salud Dr. William C. Gorgas

Revista Oficial de la Facultad de Ciencias de la Salud

Dr. William C. Gorgas

ISSN 1726-7196

CONTENIDO JUNIO 2013 Medicina04 “Síndrome nefrótico” X. Sarmiento

Epidemiología10 “La sífilis congénita en nacidos en el Hospital Materno Infantil José Domingo de Obaldía 2007 - 2011” M. Yau

Odontología17 “Rehabilitación preprotésica” A. Espinal

Tecnología Médica28 “Determinación de plomo en sangre del personal expuesto” C. Barrios

Biotecnología34 “Caracterizaciòn molecular y bioquímica de cinco cepas de Bacillus thuringiensis y medición de la actividad biológica frente a S. frugiperda y S. exigua” O. Serrano, N. Rosas, A. Sanchez, J. Villegas

44 “Construcción de un baculovirus recombinante con el gen CCV1 del polidnavirus de Cotesia congregata” S. Young, M. Rodríguez, M. Pérez, E. de Luna

54 “Estudio de la variabilidad genética de Leishmania panamensis mediante marcadores moleculares generados vía AFLP” J. Juliao, R. Lleonart

64 “Análisis de expresión de un gen de trealosa -6- fosfato sintetasa en variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris)” S. Rodríguez, R. Rosas

84 “Obtención y aplicación de quitosano.” G. Chong, B. Córdova, M. Correa, M. Cuevas, J. Delgado, A. Tristán

93 “Producción de antisuero murino contra veneno de Bothrops asper y Porthidium lansbergii”

J. Young, M. Núñez, J. Juliao, T. Vial, C. Lyons, M. Urriola, O. Otero, O. Dupuy

Fisioterapia101 “Gimnasia laboral aplicada a la disminución del estrés laboral y mejora del desempeño en los colaboradores de Panasonic Latin America”

N. Fish

Ing. José Barrios Ng PRESIDENTE DE LA JUNTA DIRECTIVA

Dr. Modaldo TuñónRECTOR Dr. Jorge MedranoVICERRECTOR ACADÉMICO

Prof. Francisco IsosVICERRECTOR PARA SEDES DEL INTERIOR

Mgtra. Nadiya de UngoSECRETARIA GENERAL

AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD LATINA DE PANAMÁ

002CONTENIDO

MENSAJE DEEL EDITOR

Comité EditorialDr. Jorge Medrano, Decano de la Facultad de Ciencias de la Salud.Prof. Carlos Staff, Coordinador General.Dr. Luis Coronado, Director de la Escuela de Medicina.Dr. Eduardo Sierra, Director de la Escuela de Odontología.Prof. Yovani Morales, Director de la Escuela de Farmacia.Profra. Priscilla Jiménez, Directora de la Escuela de Tecnología Médica. Profra. Modesta Haughton, Directora de la Escuela de Enfermería.Profra. Yamileth Yuil, Directora de la Escuela de Fisioterapia.Dr. Omar Dupuy, Director de la Escuela de Biotecnología. Profra. Ariadna Españo de Ponce, Coordinación Académica Estudiantil.Lic. Olmedo Otero, Asistente de Investigación del ICGES.Lic. Joel Sánchez, Asistente de Investigación del IIBCB.Lic. Wilder Rodriguez, Docente investigador del IIBCB.

ContactoTel.: (507)-207-6709E-mail: [email protected]

Créditos

EDITOR: Dr. Jorge Medrano El trabajo científico y académico, al igual que la vida, siempre transita por caminos nuevos e inacabados lle-nos de dificultades y sorpresas, que paradójicamente son la razón y justificación para el esfuerzo del estu-dioso y pensador, que sueña, planea y busca nuevas alternativas para lograr el conocimiento y contribuir al progreso de la sociedad, de la ciencia y la cultura.El niño, el estudiante, el profesional y el científico se apoyan en la curiosidad observadora de todo lo que los rodea, de fenómenos extraordinarios que pi-den una explicación, y de las formas en que los seres humanos piensan, funcionan, se organizan y viven.Curiosidad, observación, razonamiento, método, comu-nicación, perseverancia, creatividad, eliminación de pre-juicios y, sobre todo, honestidad con uno mismo, y con los demás, aceptación de nuestros límites, de los de otros y del tiempo en que vivimos, pero con la imaginación puesta en el futuro, tratando de dejar un mensaje, aunque sea muy modesto, para que la humanidad pueda seguir avanzando.Las revistas científicas son una declaración y un com-promiso. Declaración de estar dispuestos a empren-der un camino diferente al del simple comentario, para perfeccionar el método de búsqueda de da-tos en el camino al mejor conocimiento, de las for-mas de decir, de pensar, de hacer, de organizarse, de entender la materia, los fenómenos y la vida y el uni-verso. Es un compromiso con una forma de vivir, de disciplina, de reconocimiento a quienes nos pre-cedieron, a los que conviven con nosotros y a todo lo que nos rodea, y es una proyección hacia un futuro mejor.Los miembros de nuestra Facultad, poco a poco, están comenzando a dar pasos que tienen que iniciar con el “gateo” de los estudiantes que se van formando para indagar, para analizar mejor, para comunicar y escribir, de la mano de otros compañeros y de docentes que comprenden que los científicos no solo se dedican a estudiar la estructura de la materia, o las reacciones, o lo que puede pesarse y medirse, sino que también deben emprender los caminos enmaraña-

dos del sentimiento, del pensamiento, de las percepciones, porque ellas son parte muy importante de la vida humana, para construir una sociedad donde todos aprendan a valerse mejor por sí mismos, a ser menos dependientes, a ad-ministrar mejor las cosas y a escuchar, transmitir y convivir.El mundo de hoy demanda estudiantes y docentes com-prometidos con reducir las diferencias de oportunidades para satisfacer las necesidades humanas, para aprender, y para participar de los bienes y servicios que vamos incor-porando al arsenal de beneficios que todos deben disfrutar. La educación en general, la educación en ciencias de salud, y la ciencia y la investigación no pueden utilizarse para perpetuar elitismos discriminatorios que excluyen a estudiantes que quedan en el camino y etiquetamos de mediocres o desertores. También excluimos, muchas veces sin querer, a muchos compañeros y estudiantes porque tienen otra forma de pensar y actuar, o porque no son de nuestro grupo, o porque su aspecto e incluso limi-taciones nos llevan a pensar que es mejor dejarlos fuera.La ciencia y la educación, el método y la divulgación científica tienen que ayudar a que el debate de las ide-as llegue a más y más gente, y por ello una revista es como la primavera, que siempre están cargadas del ver-dor de la esperanza, de entusiasmo, cuyo mantenimien-to depende de que nosotros aceptemos nuestra parte.Gracias a los organizadores de la revista, y no importa si está en papel, o en internet, y acepten todo lo que pueda representar pasos hacia el progreso de la misma, de la Facultad, de la Universidad Latina, de Panamá y del mundo.

Dr. Jorge MedranoDecano de la Facultad de Ciencias de la Salud

Universidad Latina de Panamá

Salud Latina, Revista semes-tral, Junio 2013. Editor Respon-sable: Jorge Medrano. Número de ISSN: 1726-7196. Domicilio de la Publicación: Facultad de Ciencias de la Salud Universi-dad Latina de Panamá, Calle 35, ave. Justo Arosemena, ciu-dad de Panamá, Rep. de Pan-amá.

El contedido de los artículos es responsabilidad de los autores. Prohibida la reproducción par-cial o total sin el permiso ex-preso de los editores.

C o p y r i g h t s © U n i v e r s i d a d Latina de Panamá - Todos los derechos reservados 2013, Panamá, Panamá.

“Síndrome nefrótico”

AUTOR: Xikzel Sarmiento Universidad Latina de Panamá

M

EDIC

INA 04

SALUDLATINA

“Síndrome nefrótico”

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09SALUDLATINA

AUTOR: Meiling Yau González1

1. Médico MINSA Chiriquí, Maestría en Epidemiología y salud de los Trópicos en la Universidad Latina de Panamá, Facultad de Ciencias de la Salud Dr. William C. Gorgas.

“La sífilis congénita en nacidos en el Hospital Materno Infantil José Domingo De Obaldía 2007 - 2011”

Objetivo: Revisar los casos de sífi-lis congénita en nacidos en el hospi-tal Materno Infantil José Domingo de Obaldía (HMIJDO) en los años 2007-2011 para conocer la incidencia y fac-tores que parecen estar asociados a esta enfermedad. Materiales y Méto-do: Se realizó un estudio descriptivo retrospectivo longitudinal, se revisaron 57 expedientes de las madres cuyos hijos nacieron con sífilis congénita en el HMIJDO en los años 2007-2011 y se procedió a estudiar las diferentes va-riables. Resultado: La tasa de inciden-cia de sífilis congénita en el HMIJDO en los años 2007 al 2011 fueron: 0.3, 1.4, 1.9, 2.6, 1.0 por mil habitantes. El 87.6% de las mujeres se encontraban en el rango de edad de 15-29 años. El 38.6% procedía de la comarca Ngäbe-Buglé. 87.8% de las mujeres tenían control prenatal; 64% de las pacientes con con-trol no se le consignó si se le mandó la prueba de VDRL; hubo 66.6% pa-cientes con VDRL positivo de las cuales a 66.6% de las pacientes se le dio tratamiento y al resto no se le con-signó si recibieron tratamiento. Conclu-siones: hubo un aumento de la tasa de incidencia de sífilis congénita del 2007 al 2010, y luego un descenso en el 2011. Palabras claves: sífilis congénita, historia perinatal, VDRL, tratamiento.

Objective: To review cases of congeni-tal syphilis in patients born at Jose Domingo de Obaldía Materno-Infantil Hospital from the years 2007-2011 to determine the incidence and fac-tors that appear to be associated with this disease. Materials and Methods: A longitudinal, descriptive study was made. We reviewed 57 cases of mo-thers whose children were born with congenital syphilis at José Domingo de Obaldía Hospital from the years2007-2011 and proceeded to study the different variables. Results: The incidence rates of congenital syphilis in the HMIJDO from the years 2007 to 2011 were: 0.3, 1.4, 1.9, 2.6, and 1.0 per thousand inhabitants. 87.6% of women were in the age range of 15-29 years. 38.6 % came from the Ngäbe-Buglé comarca. 87.8 % of wo-men had antenatal care. 64% patients with antenatal care have no information if VDRL test was made to them. There were 66.6% of patients with a positive VDRL of which 66.6% of these patients were treated and the rest have no infor-mation if they received treatment. Con-clusions: There was an increase in the incidence rates of congenital syphilis from 2007 to 2010, and then a decline in 2011. Key words: congenital syphi-lis, perinatal history, VDRL, treatment

RESUMEN ABSTRACT

EP

IDEM

IOLO

GÍA 010

SALUDLATINA

La sífilis congénita se produce cuando una mujer embarazada transmite a su hijo la sífilis por vía transplacentaria o por lesiones en el canal de parto. El agente causal es el Treponema pallidum. Las infecciones maternas no tratadas pueden causar la pérdida del feto hasta en 40% de los casos (con mayor frecuencia de mortinatos que de abortos, porque las lesiones fetales son tardías), premadurez, muerte neonatal o sífilis congénita si el lactante sobrevive. (13)

La ausencia de control prenatal, el tratamiento no adecuado son los factores importantes en la adquisición de sífilis congénita. A pesar de haber métodos diag-nóstico y un tratamiento económico aún se presentan casos en todo el mundo. En América Latina y el Caribe para el año 2007 más de 164.000 niños nacieron con sífilis congénita (SC). En Costa Rica, Colombia, Perú, Brasil, Paraguay, Uruguay y Ar-gentina, la SC constituye un problema de salud pública por que se reportan más de 0,5 casos por 1.000 nacidos vivos. (12) En Panamá, la incidencia de sífilis congénita en los años 1990 a 2009 se ha mantenido en tasas que oscilan entre 0.1 y 0.8 por 1000 nacimientos vivos. (7) En la provincia de Chiriquí las tasas en los años 2005 y 2010 oscilan entre 0 y 3.7 por 1000 nacidos vivos. (4)

Este trabajo tiene como propósito, conocer la incidencia y los factores asocia-dos al nacimiento de niños con sífilis congénita en el Hospital Materno Infantil José Domingo de Obaldía.

Se realizó un estudio descriptivo retrospectivo longitudinal. Se revisaron 57 ex-pedientes o archivos clínicos y la historia clínica perinatal de las madres cuyo hi-jos nacieron con sífilis congénita en el Hospital Materno Infantil José Domingo de Obaldía de la provincia de Chiriquí, y se buscaron las variables de interés (número de nacidos vivos en el HMIJDO, número de nacidos con sífilis congénita en el HMIJDO, tasa de incidencia de sífilis congénita el HMIJDO, edad, estado civil, procedencia, escolaridad, etnia, número de gestación y abortos, número de controles prenatales, trimestre de inicio de control prenatal, número de VDRL enviados durante el control prenatal, resultado del primer VDRL, resultado del segundo VDRL, tratamiento para sífilis, tratamiento recibido por la pareja, tipo de parto, tratamiento recibido por la madre, tratamiento recibido por niño ) se procedió a llenar una hoja de recolección de datos realizada por el autor, luego se tabuló la información de forma manual y se realizaron cuadros con el programa Excel.

La tasa de incidencia de sífilis congénita en el HMIJDO, estuvo en aumento des-de el año 2007 al 2010 y luego descendió en el 2011

INTRODUCCION

MATERIALES Y METODOS

RESULTADOS Y DISCUSION

011SALUDLATINA

La mayoría de las mujeres se encontraban en el rango de edad de 20-24 años con 47.3%, seguido de 15-19 con 21% y de 25-29 con 19.3%. El 38.6% procedía de la Comarca Ngäbe-Buglé y 28% de la mujeres procedían del distrito de David. 56% de las pacientes eran de etnia no indígena y 44% eran indígenas. El 37% contaban con estudios secundarios y 31.6% estudios primarios. 52.6% de las pacientes vivían en unión estable. 54 % eran multigestas, de las cuales 14% habían tenido abortos anteriores. 87.8% de las mujeres tenían control prenatal de las cuales 57.8% de las pacientes ingresaron al control prenatal en el primer trimestre. 43.9 % tuvieron cinco o más controles prenatales. A 64% de las pacientes con control no se les consignó si se le envió la prueba de VDRL. Hubo 66.6% con VDRL positivo de las cuales a 66.6% de las pacientes se le dio tratamiento y al resto no se le consignó si recibieron tratamiento. El 100% de los expedientes no repitieron tratamiento de pareja. El 96.5% de las mujeres tuvieron parto a término. 96.5% de las mujeres recibieron como tratamiento penicilina y 96.5% de los recién nacidos recibieron este mismo tratamiento.

En este estudio, se observó que en el Hospital Materno Infantil José Domingo de Obaldía la tasa de incidencia de sífilis congénita fue en aumento con una tasa de incidencia anual en el 2007 de 0.3 x 1000 hasta 2.6x1000 en el 2010 coincidiendo con los datos del depar-tamento de epidemiología del MINSA región de Chiriquí y con Ayala-Montoya y col., que encontraron un aumento de la incidencia de 4 a 5 veces, siendo en el 2005 de 0.6x1000 y en el 2008 de 3.2x 1000. Luego, descendió en el 2011 a 0.1x 1000 pudiendo tener como explicación que en el año 2010 se efectuó una supervisión a nivel regional buscando las de-bilidades en los controles prenatales y se le hizo recomendaciones a los diferentes distritos.

En este estudió de observo que 87.6% de las pacientes correspondían a edades entre 15 a 29 años y encontrándose la mayor cantidad de casos en el rango de 20-24 con 47.3%; en este mismo grupo se encontraba la tasa de incidencia por edad más alta con 2.3x1000, observándose un alto porcentaje de adolescentes y jóvenes afectadas, aproximándose a los resultados de Barba-Muñoz, que en su estudio las mujeres estaban el rango de 16-36 años.

012SALUDLATINA

El lugar de procedencia de la mayoría de los casos era de la Comarca Ngäbe- Bu-glé con 22 pacientes (38.6%) seguido el Distrito de David con 16 pacientes (28%), jun-tos suman un 66.6% de las afectadas. Sin embargo al calcular la tasa de incidencia por distrito, se observó que la mayor tasa se encuentra en la Comarca con 4.5x1000, seguido de Barú con 1.8x1000 y en cuarto lugar David con 1.3x1000. La Comarca Ngäbe- Buglé es un lugar con poca accesibilidad a los servicios de salud, ni a labo-ratorios; en donde hay pobreza extrema, que propicia que las mujeres embarazadas no tengan un adecuado control prenatal.

En cuanto el nivel de escolaridad, se observó que la mayoría de las pacientes 37% con-taban con estudios secundarios, 31.6% contaban con estudios primarios. Coincidiendo con Morales Sánchez A., que en su estudio 43.5% tenían estudios secundarios y 36.2 % conta-ban con estudios primarios. A pesar de que la mayoría de las pacientes (75.5%) tenían algún nivel de alfabetización, presentaron infección por sífilis, esto nos indica que tener estudios no implica conocimiento sobre la enfermedad y sus consecuencias.

Con respecto al estado civil, se observó que la mayoría de las mujeres estudia-

das estaban en unión estable (52.6%), pudiendo estar esto asociado a la falta de compromiso en la pareja y posible promiscuidad de las pacientes y/o sus parejas.

Con respecto a la gestación, la mayoría eran multigestas con 54% de las cuales 40% no habían tenido abortos y 14% habían tenido abortos, 46% de las pacientes eran primigestas. Esto nos indica, que debemos indagar a las pacientes por antecedentes de sífilis congénita en sus embarazos anteriores e incluir a los abortos y óbitos de madres con VDRL positivo como sífilis congénita.

Se observó que 87.8% de las pacientes estudiadas tuvieron control prenatal, de las cuales 17.5 % inició control en el primer trimestre; 57.8% en el segundo trimestre. El 43.9% de las pacientes acudió a cinco o más controles. Este resultado es contrario a la revisión bi-bliográfica (4) que indica que hay mayor riesgo de tener sífilis sin control prenatal, por lo que se sospecha que hay debilidades en el control prenatal.

En cuanto si se le envió la prueba de VDRL, de las 50 pacientes con control pre-natal, 32 pacientes, es decir 64%, no tenían consignados en sus expedientes si se le envió VDRL. A 18 pacientes (correspondiente 36%) que se le envió la prueba de VDRL, 12 resultaron positivas correspondiendo a 66.6% y cuatro negativas corres-pondiendo a 33.4%. De las 12 pacientes con VDRL positivo a 8 pacientes (66.6%) se le consignó que se le dio tratamiento, en la hoja perinatal del resto de la paciente no se constataba si recibió tratamiento.

013SALUDLATINA

En ningún expediente de las 57 mujeres estudiadas, se consignó si se le dio tratamiento a la pareja, nudo crítico en esta enfermedad ya que si las parejas no fueron tratadas, estas pudieron volver a infectar a las mujeres que sí recibieron tra-tamiento. Estos resultados nos indican que hay faltas de datos importantes en los expedientes clínicos, que nos hubiesen permitido saber si no se le está enviando la prueba a las pacientes o no se les está tratando o ellas no se realizan las pruebas.

96.5% de las pacientes estudiadas, tuvieron parto a término y se les trató con Penicilina. El inicio del tratamiento de la madre fue intrahospitalario, sin embargo no se localiza a la pareja para hacerle la prueba de VDRL, que pudiera ser una alterna-tiva para evitar reinfecciones.

En conclusión, hubo un aumento de la tasa de incidencia de sífilis congénita del 2007 al 2010, y luego un descenso en el 2011. La gran mayoría de las pacientes provenían de la comarca Ngäbe-Bugle y el distrito de David, hubo un déficit impor-tante de información al no consignar datos importantes como el envio de la prueba de VDRL y si se le dio tratamiento a la paciente y su pareja.

• Ayala-Montoya, Hernández-Pérez , Murillo-Llanes , Daut-Leyva . Incidencia de Sífilis Congénita en el Hospital General de Culiacán Dr. Bernardo J. Gastélum. 2011. Archivos de Salud Sinaloa 5(1): 5-8. URL disponible en: http://www.Ibiomed.com

• Barba-Muñoz F. Tovar-Guzmán V. Jiménez-Gauna F. Sífilis Congénita, Experiencia en Un Hospital Básico de Sonora.2010. Bol Clin Hosp Infant Edo Son 27(1): 41-47. URL disponible en: http:// www.Ibiomed.com

• Departamento de Salud Pública y Epidemiología. MINSA Chiriquí.

• Fauci A. Kasper DL. Braunwald E. Editores. 2005. Harrison: Principios de Medicina Interna. 17 ed. México. Mcgraw-Hill Interamericana.

• Heyman D. 2005. El control de las enfermedades transmisibles. 18 Edición. Washington D.C.OPS

• Morales Sánchez A. Factores sociodemográficos maternos que predisponen a la presencia de sífilis congénita en el neonato.2010.Enfermería Actual en Costa Rica, Núm. 17. URL disponible en: http://redalyc.uaemex.mx/src/inicio/ArtPdfRed

• MINSA Panamá. 2010. Plan Estratégico Nacional Multisectorial para la pre-vención de la transmisión materno infantil del VIH y Sífilis en Panamá 2009-2014. URL disponible en: http://www.paho.org

BIBLIOGRAFÍA:

014SALUDLATINA

• Organización Mundial de la Salud. 2007. Estrategia Global para la prevencióny control de las Infecciones de Transmisión Sexual: 2006-2015. Ginebra. URL dis-ponible en: http://www.who.int

• Organización Mundial de la Salud. 2004. Aspectos económicos y de progra-mación de la prevención de la Sífilis Congénita. Bull World Health Organ vol.82 no.6 Ginebra. URL disponible en: http://www.scielosp.org

• OMS 2008. Eliminación de sífilis congénita en América Latina y el Caribe: mar-co de referencia para su implementación. Washington: OPS; 2005. URL disponible en: http://www.paho.org/Spanish/AD/FCH/ AI/ EliminaSifilisLAC.pdf

• OMS. 2008. Eliminación Mundial de la Sífilis Congénita: fundamentos y es-trategias de acción. URL disponible en : http://www.ops.com

• OPS. 2009. Iniciativa Regional para la Eliminación de la transmisión materno-infantil del VIH y de la Sífilis Congénita en América Latina y el Caribe. URL Disponi-ble en: http://www.ops.org.

• OPS. 2010. Guía Clínica para la Eliminación de la Transmisión Maternoinfantildel VIH y de la Sífilis Congénita en América Latina y el Caribe. URL disponible en: http:// www.ops.org.

• Valderrama J. Zacarías F y Mazin R .2004. Sífilis materna y sífilis congénita enAmérica Latina: un problema grave de solución sencilla. Rev Panam Salud Pública. 16(3). URL disponible en: http://www.PAHO.org

015SALUDLATINA

016SALUDLATINA

“Rehabilitación preprotésica”

Estudiante: Adriana Lucía Espinal Jovel1

1.Universidad Latina de Panamá

CASOCLÍNICOUTILIZANDOLAMÉTODOLOGÍAODONTOLOGÍAINTEGRALAspectos Conceptuales y Metodológicos La Escuela de Odontología de la Universidad Latina de Panamá, desarrolla a través de su programa aca-démico la atención clínica, conceptual y metodológicamente, a través de la Odontología Integral, que es ofrecida: a niños, adolescentes, adultos y tercera edad. El estudiante durante sus nueve semestres de práctica clínica, desarrolla un alto nivel del conocimiento del sistema estomatognático. A través de los ciclos, organizados en niveles de complejidad creciente, se implementa la integralidad de las diversas especialidades odontológicas, las especialidades médicas vinculadas a las patología de la cavidad bucal y de los aspectos sociales relacionados con el caso clínico. La estrategia didáctica utiliza el método científico. integrando lo clínico y lo epidemiológico, es decir la práctica de la Odontología Integral para devolver a nuestro paciente el estado de salud integral que incluyen la función y estética. En la formación de la práctica clínica se incluye el desarrollo de la capacidad de mantener la observación periódica de las condiciones de la salud de su paciente, que se ubica dentro contexto ético que debe ser transparente en todos sus componentes y se inscribe dentro de la formación de la responsabilidad profesional de los tratantes.

Dr. Eduardo SierraDirector de la Escuela de Odontología

Datos del PacienteEdad: 53 años

Nacionalidad: Panameña

Sexo: Masculino

Historia Dental• Mastica de ambos lados

• Retención de alimentos

• Dolor dental nocturno en #46

• Ha recibido atención dental, le realizaron endodoncia retrógrada en #24,

manifiesta desagradarle el defecto óseo en dicha pieza.

• Se le realizaron múltiple restauraciones, las cuales estéticamente no le agradan.

• Factura de corona de #15

• Exodoncia #34, por falta de espacio

• Pérdida de varios dientes, por falta de higiene. No recuerda si fue por caries o problema periodontal.

O

DO

NTO

LOG

ÍA017SALUDLATINA

Historia Médica• No padece enfermedades sistémicas• Ha sido hospitalizado por accidente de tránsito• Presenta leve parálisis facial derecha a consecuencia de cirugía de su infancia. • Presión Arterial 110/70mmHg• Tipaje: B-

Evaluación Extrabucal• Forma de la cara: Ovalada• Presenta simetría facial• Ojos almendrados • Cejas pobladas• Labios medianos• Nariz perfilada

• La línea media dental coincide con línea media craneofacial• Presenta desviación de labio inferior derecho. Consecuencia de cirugía facial de la

infancia. Lo que se manifiesta como sonrisa asimétrica• Muestra 1/3 superior y ligeramente 1/3 inferior dentales

• Perfil convexo

018SALUDLATINA

Evaluación Intrabucal

• Línea media dental no coincide• Frenillos DLF• Mucosa del paladar, glándulas salivales, carillo, piso de lengua DLF• Presencia de encías inflamadas, cálculo dental, diastemas y rotaciones dentales

anterosuperiores

• Relación Molar: No evaluable• Relación Canina: Clase I de Angle

Perfil Derecho

• Relación Molar: No evaluable• Relación Canina: Clase I de Angle

Perfil Izquierdo

019SALUDLATINA

• Forma de la arcada: Ovalada• Número de dientes: 14• Mesialización de #27, #17• Rotaciones # 12, #22• Microdoncia #18• Resto radicular #24

Examen PeriodontalAbundante cálculo supragingival y subgingival.Sangrado al sondaje, presencia de bolsas con profundida de 4-6mmRadiográficamente: pérdida ósea horizontal y vertical, cálculo subgingival.

Periodontograma

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Odontograma

• Restauraciones en mal estado• Extracción indicada• Ausencia de dientes• Restauraciones en buen estado

Examen FuncionalPresenta:

• Manipulación mandibular de mediana dificultad• Evaluación de flexión y extensión de cabeza/cuello: normales• Bruxismo nocturno• Oclusal superior e inferior normal• Guía anterior presente funcional• Guía canina presente funcional

Análisis de los Modelos• Forma de la arcada superior ovoide

e inferior eliptica• Número de dientes superiores 14 e

inferiores 14• Migración de 17, 18, 27, 37, 38• Piezas rotadas 12, 35, 44, 46, 48• Facetas de desgaste: incisivos

superiores e inferiores• Obturaciones: 18, 17, 15, 14, 27, 37,

35,34,46, 47, 48• Relación molar no evaluable• Relación canina Clase I• Línea media coincide

021SALUDLATINA

Análisis radiográfico• Anomalías congénitasForma: #18, #28 Tamaño: microdoncia # 18, #28

• Signos de lesiones cariosa:Recurrentes: 17, 46, 25, 27

• Signos de Lesiones periodontales:

Cresta osea: 38, 37, 35, 41, 42, 43,44, 45,46,47,48Perdida ósea: 38, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47.Rarefacción periapical: 24Presencia de cálculo: 37(M y D) 36(D) 47 (M y D), 48 (m y D)

• Hueso Maxilar y mandibularNeumatización del Seno maxilar # 16 y # 26

Análisis de Riesgo

022SALUDLATINA

DiagnósticoEl paciente parcialmente edéntulo presenta:

• Periodontitis crónica generalizada Tipo III• Caries Dental• Alto riesgo cariogénico y periodontopático

Pronóstico• Favorable

Plan de Tratamiento

Fase I

• Profilaxis • RAR 1,2,3 y 4• Exodoncia # 18, 28, 38, 48, 24• Endodoncia # 15, #36• Restauraciones #17, 25, 27, 37, 35, 46, 47

023SALUDLATINA

Fase II

• Movimiento Mesial de #25 (ortodoncia Preprotésica), cierre de espacios y alineación de arcada superior.

• Distalización y levantamiento de # 37, alineación de arcada inferior• Perno colado # 15• Perno Prefabricado #46• Corona Metal porcelana #15,#46• Prótesis parcial fija 5 unidades dientes pilares ( # 23, 25 y 27).• Prótesis parcial fija posterior de 3 unidades ( #35-37).

Fase III

• Control y mantenimiento

Fase IV

• Controles

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FOTOS EXTRAORALES

ANTES DESPUES

025SALUDLATINA

FOTOS INTRAORALES

ANTES DESPUES

026SALUDLATINA

ANTES DESPUES

Comentarios Finales

• El paciente muestra gran satisfacción por los resultados obtenidos y se en-cuentra motivado a seguir todas las indicaciones y sus citas periódicas de mantenimiento y control.

• Se le realizará una resina en incisal del #21 para mejorar la estética de los inci-sivos anteriores.

• El paciente mantiene aparatología removible por un año para mantener el cierre de diastemas y rotaciones dentales.

• El paciente canceló su tratamiento en un solo pago.

027SALUDLATINA

AUTOR: Carroll S. Barrios C. 1

1.Universidad Latina de Panamá

“Determinación de plomo en sangre delpersonal expuesto”

La intoxicación por plomo se consi-dera hoy en día la exposición a metal más común, debido a que tiene muchos usos, las fuentes más frecuentes vienen de las minas y del reciclado de materiales con-teniendo plomo. Este metal es absorbido por pulmones y del tracto gastrointesti-nal. El diagnóstico es difícil porque la sin-tomatología es multisistémica: astenia, dolor abdominal, irritabilidad, náuseas, vómitos, pérdida de peso, cefalea, ane-mia, entre otros. En este trabajo se ha enfocado el estudio en la determinación más rápida y precisa para conocer el ni-vel de intoxicación que tiene el paciente mediante el sistema LeadCare. Los re-sultados mostraron que de un total de 50 muestras, 49 resultaron positivas, lo que equivale a una incidencia del 98%. Para los casos negativos solo resultó un paciente, lo cual equivale a un 2% de la población total. La mayoría de los trabajadores de estos lugares donde existe una gran exposición al plomo son hombres, por lo que consideramos que debido a su ocupación estos están más propensos que las mujeres de tener al-tas concentraciones en sangre de este metal. El hallazgo de una concentración elevada de plomo en sangre, por muy mínimo que sea, nos debe alertar y tomar las medidas necesarias para evitar que el nivel de riesgo aumente y tratar de re-ducirlo.Palabras clave: Multisistémica, ex-posición a metal, nivel de intoxicación.

Lead poisoning is considered today the most common metal exposure because it has many uses. The most frequent sources come from mines and recycling of materials containing lead. This metal is absorbed by lung and gastrointestinal tract. Diagnosis is difficult because the symptoms are multi-systemic: asthenia, abdominal pain, irritability, nausea, vo-miting, weight loss, headache, anemia, among others. This paper has focused the study on the faster and more accu-rate determination to know the level of intoxication that the patient has by the Lead Care system. The results showed that from a total of 50 samples, 49 were positive, corresponding to an incidence of 98%. For the negative cases, there was only one patient, equivalent to 2% of the total population. Most workers in these places where there is a large exposure to lead are men, so we believe that because of their profession, they are more likely to have high blood concentrations of this metal than women. The finding of an elevated blood lead concentration, however minimal, must be a warning to take the necessary measures to prevent the increased risk level and try to reduce it.Key Words: Multisystemic, metal expo-sure, level of intoxication.

RESUMEN ABSTRACT

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“Determinación de plomo en sangre delpersonal expuesto” El plomo en el ser humano produce efectos, los cuales al ser determinados como trazas

o pequeñas cantidades de metales producen una variedad de efectos sistemáticos según las cantidades absorbidas, las cuales pueden provenir del agua, alimentos, e incluso del aire, provocando un aumento de muertes a causa de la intoxicación por plomo. Desde hace mu-chos años hemos observado que la utilización de Plomo en compuestos como gasolinas las cuales provocan un ciclo no natural de este elemento y lo podemos comprobar al recordar que este elemento es quemado en los motores de los automóviles, lo que genera las sales de plomo que llegarán al ambiente y las partículas grandes precipitaran en el suelo o en la superficie de aguas, las pequeñas partículas viajaran largas distancias a través del aire y per-manecerán en la atmósfera. Parte de este plomo cae nuevamente sobre la tierra, luego de el efecto natural de la lluvia produce un ciclo “no natural” del Plomo, el que daño al ser vivo.

La contaminación por plomo hoy en día se ha convertido en un tema mundial, ya que esta no es solo causada por la gasolina que contiene este elemento sino también por otras actividades realizadas por el hombre como por ejemplo la com-bustión del petróleo, procesos industriales y la combustión de residuos sólidos. En este trabajo nos propusimos la determinación más rápida y precisa para conocer si el paciente tiene intoxicación, incluso un leve aumento de plomo en la sangre, con el sistema LeadCare.


Se tomaron muestras de sangre obtenidas por medio de venipuntura, en ca-pilares o tubos de colección de sangre con anticoagulante, como la heparina o el EDTA. Para la re-alización de este trabajo se utilizó un analizador y el sistema LeadCare. Se tomaron 50 µL de sangre del tubo de colección. Se mezcló suavemente la sangre con el reactivo y se dejó en reposo. Posteriormente se introdujo dentro de la mezcla el sensor del equipo, donde el mango del sensor debió cubrirla completamente.

Se procedió con el analizador, y al cabo de los 180 s, el analizador mostró el resultado del plomo en la sangre. La unidad de medida utilizada es µg/dl (microgramos de plomo por decilitros de sangre entera).


En la siguiente tabla aparecen los pacientes clasificados por un aumento de la concen-tración de plomo en sangre.

INTRODUCCION

029SALUDLATINA

Figura 1: Resultados de valores positivos y negativos de contaminación con plo-mo en microgramos de plomo por decilitros de sangre entera (µg/dl).

En el siguiente gráfico se muestra el número de pacientes positivos y negativos, por en-cima de 10 µg/dl, y por debajo de 10 µg/dl, respectivamente. De esta forma de un total de 50 muestras, 49 resultaron positivas, lo que equivale a una incidencia del 98%. Solo resulto un paciente negativo, lo cual equivale a un 2% de la población total (Figura 1, Figura 2).

Figura 2: Resultados de valores positivos y negativos de contaminación con plo-mo en microgramos de plomo por decilitros de sangre entera (µg/dl).

En la siguiente tabla y gráfico (Figura 3 y Figura 4) podemos apreciar de donde provienen los pacientes, dividiéndolos según su procedencia, ya sean de Baterías Nacionales o de Procesos y Análisis Metalúrgicos, 30 pacientes (representando el 60%) y 20 pacientes (representando 40%) respectivamente, de un universo de 50 muestras.

030SALUDLATINA

Figura 3: Pacientes estudiados según la zona de procedencia.

Figura 4: Pacientes estudiados según la zona de procedencia.

Una vez culminado este trabajo de investigación, en el cual se ha determinado la concentración de plomo en sangre de personal expuesto se concluye:

• En nuestro país la mayoría de los trabajadores expuestos, ya sea en fábricasde baterías o en lugares donde se procesen metales, se obtiene una alta concen-tración de plomo en sangre lo cual puede desencadenar una intoxicación por plomo y causar incluso la muerte.

• La mayoría de los trabajadores de estos lugares donde existe una gran ex-posición al plomo son hombres, por lo que consideramos que debido a su ocupación están más propensos que las mujeres a presentar altas concentraciones de este metal.

CONCLUSIONES

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• El hallazgo de una concentración elevada de plomo en sangre por muy mínimoque sea nos debe alertar y tomar las medidas necesarias para evitar que el nivel de riesgo aumente y tratar de reducirlo un poco.

• Consideramos que el primer paso para prevenir, curar o tratar una enfermedades identificarla y esto lo podemos hacer en solo 3 minutos acompañados de resul-tados confiables con el sistema LeadCare. Este sistema nos permite al detectar la concentración de plomo en sangre prevenir graves perjuicios en el sistema nervioso de los adultos y en el desarrollo de los niños.

• Una de las primeras y más importantes recomendaciones es la realizacióndel examen periódico de detección de plomo en sangre a todo personal expuesto, porque de existir una elevación de la concentración de este metal, se podrá detectar a tiempo y evitar una intoxicación por plomo e incluso la muerte.

• La información adecuada y precisa de cuáles son los riesgos a los que es-tán expuestos los trabajadores es de mucha importancia, ya que muchos de ellos desconocen que su ocupación tenga un nivel elevado de peligro.

RECOMENDACIONES:

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“Caracterización molecular y bioquímica de cinco cepas de Bacillus thuringiensis y medición de la actividad biológica frente a S. frugiperda y S. exigua”

AUTORES: O. Serrano1,2, N. Rosas2, A. Sanchez2, J. Villegas2

1Universidad Latina de Panamá, 2Centro de Biotecnología Genómica-Instituto

Politécnico Nacional, México, COJUCIP.

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Spodoptera frugiperda y Spodoptera exiguaSon plagas del orden de los lepidópteros de gran interés agrícola debido a que sus larvas afectan gran variedad de cultivos ocasionando pérdidas económicas cuantiosas en la agricultura.

Para el control de plagas en los últimos años se han buscado controladores biológicos que sean económica-mente rentables, debido a que los métodos de control que existen son insecticidas de origen químico con ne-fastas consecuencias para el ambiente. En este trabajo, se realizó la caracterización molecular y bioquímica de cinco cepas de Bacillus thuringiensis, del noreste de México para determinar su toxicidad frente a Spodop-tera frugiperda y Spodoptera exigua, plagas causantes de grandes pérdidas a la agricultura mundial. Las cepas, identificadas como RT15, RT32, RT35 y RN51 y RBT se les realizó la extracción de los cristales después de cultivarse en un medio a base de melaza. Por un sistema bifásico de polietilenglicol y buffer amortiguador de fosfatos, se recuperó un anillo intermedio rico en cristales, y por una electroforesis SDS PAGE se observó el tamaño de las proteínas. Los cristales solubilizados se sometieron a un tratamiento con tripsina. La detección de los genes cry 1, 2 y 9 se realizó lisando las células con lisozima y posteriormente, se aplicó el método de extracción por octanol-cloroformo. El producto se amplificó mediante PCR. Los ensayos biológicos realizados sobre las dos especies de insectos lepidópteros procedieron a partir de un pie de cría con dietas artificiales suplementadas, donde el extracto obtenido de las cepas de B. thuring-iensis se mezcló con la dieta y fue cuantificada la canti-dad de larvas muertas. De los resultados se obtuvo una variación considerable en la respuesta biológica, siendo S. frugiperda mucho más resistente que S. exigua. La cepa con mayor actividad insecticida fue la cepa RBT, la cual fue la única que poseía los 3 genes cry estudia-dos. Los cristales mostraron diferencias en su sucepti-bilidad a la tripsina. De esta forma una variación en di-cha suceptibilidad pudo haber ocasionado la variación de toxicidad entre ambas especies de lepidópteros.

In recent years, insect pest control has been fo-cused on the search of economically profitable bio-logical control agents due to the chemicals , because the existing control methods are chemical insecticides which cause severe damages. In this paper, five strains of Bacillus thuringiensis isolates from Northeastern Mex-ico were analyzed through molecular and biochemical characterization and toxic activity against Spodoptera frugiperda and Spodoptera exigua. Such pests causing great losses to world agriculture. Crystals produced by the strains, identified as RT15, RT32, RT35 and RN51 and RBT were grown in a molasses-based medium and pro-duced crystals proteins. Such crystals were recovered using a biphasic system containing polyethylene glycol and phosphate buffer. After strong agitation an inter-mediate ring rich in crystals was obtained. Recovered crystals were electrophoresed to determine the size of proteins. Solubilized crystals were subjected to a trypsin treatment. Cells were lysed with lysozyme and sbujected to DNA extraction by the method of octanol-chloroform. The product was amplified by PCR to detect the cry 1, 2 and 9 genes. Bioassays carried out on two lepidop-teran insect species reared on artificial diets. The ex-tract obtained from B. thuringiensis isolates, was mixed with the diet. Mortality of exposed larvae was record-ed. Results indicated variation in biological response, S. frugiperda seems to be more resistant than S. exi-gua. The isolate with higher insecticidal activity was RBT, which is the only one that possesses the 3 cry genes studied. Crystals showed differences in sucep-tibility to trypsin action. Such variation may caused differences in toxicity between both lepidopterans.

RESUMEN ABSTRACT

035SALUDLATINA

Los agricultores necesitan poder controlar las plagas que día a día atacan sus sembradíos provocando pérdidas económicas considerables. Los métodos para el control de plagas en su gran mayoría son insecticidas de origen químico, los cuales si bien controlan los in-sectos plagas acarrean otra serie de inconvenientes como la contaminación de las aguas, el deterioro de la fauna de insectos benéficos y los perjudiciales, muchas de las trazas de estos productos en los alimentos podrían afectar la salud de quienes los consumen. Por esto es importante la búsqueda de nuevos controladores biológicos que sean económi-camente rentables, no perjudiciales a la salud humana o animal, que tengan alta especifi-cidad de base no química y posean una alta eficiencia. En este trabajo, se realizó la carac-terización molecular y bioquímica de cinco cepas de Bacillus thuringiensis, proveniente del noreste de México para determinar su toxicidad frente a Spodoptera frugiperda y Spo-doptera exigua, dos plagas que causan grandes pérdidas a la agricultura a nivel mundial.

Se tomaron cinco cepas de Bacillus thuringiensis del cepario del Laboratorio de Bio-tecnología Ambiental, del Centro de Biotecnología Genómica, identificadas como RT15, RT32, RT35 y RN51 y RBT. Como controles positivos se utilizaron las cepas de colección 4L1 y HD133. Se inoculó cada una de las cepas en 10 mL de caldo nutritivo y se incubaron a 28°C en agitación. A las 48 h se tomó una alícuota, con la que se realizó un frotis y poste-rior tinción de Gram, observando la morfología de cada una de las cepas en estudio.

Para la extracción de los cristales, a partir de un cultivo puro de las cepas de estu-dio se tomaron asadas y se inocularon en 50 mL de caldo triptosa fosfato (CTP). Se colo-caron en agitación durante 18 h a 200 rpm a 30°C. Pasado este tiempo se tomó 1 mL y se inoculó en 100 mL de medio a base de melaza. Se monitorearon los cultivos hasta el ter-cer día hasta apreciar alrededor de un 80% de esporulación. Después, el cultivo fue cen-trifugado a 10000 rpm por 30 min. Se tomó y pesó la biomasa obtenida, la cual fue trat-ada con lactosa al 5% y acetona durante 30 min en agitación. Se lavó el filtrado a través de filtros de papel Whatman # 1 con acetona, repitiendo este paso tres veces. El pro-ducto se dejó secar y fue macerado con un mortero hasta obtener un polvo fino.

Para la determinación del peso de las proteínas cry se cultivaron las bacterias en caldo nutritivo en agitación constante (200 rpm) a 28ºC durante 72 h. Poste-riormente, la biomasa fue separada por centrifugación a 3000 rpm durante 15 min.

INTRODUCCION


036SALUDLATINA

El proceso se repitió dos veces y finalmente la pastilla colectada se resuspendió en 5 mL de agua destilada. A través de un sistema bifásico de Polietilenglicol y buffer amor-tiguador de fosfato 2 M, se recuperó un anillo intermedio rico en cristales. Este proceso de agitación vigorosa, centrifugado a 3000 rpm durante 2 min y lavados con agua desti-lada se repitió de 3 a 4 veces. Al final se recobró el anillo con una pipeta Pasteur y se ob-servó al microscopio de contraste de fase para corroborar la purificación de los cristales.

De los cristales se tomó una alicuota de 200 mg/mL a la que se le agregaron volúmenes iguales de DTT y β mercaptoetanol. Se colocó a 100°C por 5 min para des-naturalizar las proteínas y se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS PAGE al 10% (Tabla 1) para observar el tamaño de las proteínas. Esta corrida se realizó a 60 V durante 1 h hasta observar el frente de corrida. Luego se incrementó el voltaje a 100 V por aproximadamente 3 h o hasta que el frente de corrida desapareciera del gel.

Para determinar la solubilidad de los cristales, se tomaron 15 de los cristales que habían sido previamente purificados por el método bifásico y se mezclaron con 15 mL de buffer (50 mmol/L de CAPS y 10 mmol/L de EDTA). Se incubaron por 2 h a 37°C a diferentes pH que oscilaron desde 8.5 hasta 12.5. Pasado el tiempo, se centrifu-garon a 14000 rpm durante 10 min. Se recuperó el sobrenadante y se midió la longi-tud de onda a 596 nm en un espectrofotómetro utilizando el método de Bradford.

Los cristales solubilizados se sometieron a un tratamiento con tripsina durante 2 h a 37°C. Luego se corrieron en una electroforesis SDS PAGE al 10% con las características antes descritas y se observó el patrón de bandas.

La detección de los genes cry 1, 2 y 9 se realizó a partir de los cultivos bacterianos creci-dos en caldo nutritivo. Para la extracción de ADN se lisaron las células con lisozima y poste-riormente, se aplicó el método de extracción por octanol-cloroformo. Luego, se procedió realizar una electroforesis en gel de agarosa al 1% para corroborar la extracción. Una vez constatado la integridad del ADN extraído se procedió a realizar la amplifi-cación mediante la técnica de PCR del ADN extraído de las distintas cepas de Ba-cilus thuringiensis usando cebadores específicos para los genes cry1, cry2 y cry9.

Los ensayos biológicos se realizaron sobre dos especies de insectos lepidópteros: Spo-doptera frugiperda y Spodoptera exigua. Ambas plagas de interés agrícola a nivel mundial. Es-tos insectos fueron criados a partir del pie de cría ya existente en el Insectario del Laboratorio de Biotecnología Ambiental. Los adultos se depositaron en recipientes forrados con bolsas de polietileno que servirían de soporte para que las hembras ovopositaran. Todo el proceso de cría se realizó con dietas suplementadas y debidamente preparadas en el laboratorio.

037SALUDLATINA

Para la realización de los bioensayos se utilizaron larvas neonatas de 1 a 2 días de nacidas tanto de S. frugiperda como de S. exigua, donde el extracto obtenido de las cepas de B. thuring-iensis se mezcló con la dieta antes descrita en concentraciones de 50 y 500 μg. Los bioensayos se realizaron con cada cepa por triplicado con muestras de 25 individuos cada uno para ambas concentraciones. Se realizaron dos controles negativos de 50 individuos donde se colocaba sola-mente la dieta sin el extracto. A la semana se observó y cuantificó la cantidad de larvas muertas.

Análisis de los pesos moleculares de las toxinas cry :

Del análisis de determinación de los tamaños proteicos se encontraron pro-teínas purificadas de las cepas de B. thuringiensis con un peso que oscilaban en-tre 46-140 kDa, Figura 1. En dependencia de la cepa estudiada se pudo observar una variación con respecto a la cantidad de bandas presentes en cada una de ellas.

Figura 1. Carril 1. Marcador masas, carril 2. 4L1, carril 3. HD133, carril 4. RT32, carril 5. RN51, carril 6. RT35, carril 7. RT15, carril 8. RBT.


038SALUDLATINA

Determinación de la solubilidad :

En el caso del porcentaje de solubilidad de los cristales prote-icos, no hubo una marcada diferencia ya que todas las cepas mostraron una solubilidad total en un rango de pH alrededor de 11.5 a 12. (Figura 2)

Figura 2. Solubilidad (%) de cristales de las cepas nativas, como de referencia,

expuestas a pH alcalino.

Perfil Molecular: cry 1, cry 2 y cry 9:

Los resultados obtenidos de las amplificaciones por PCR mostraron que los genes para cry 1 estaban presentes solo en la cepa RBT, lo cual también pudo observarse para las cepas de referencias 4L1 y HD133. Además, en la cepa RT15 se constató una débil presencia de este gen (Figura 3). Para corroborar esto se re-amplificó una banda con las características de cry 1, pero como producto se obtuvieron varias bandas de menores pesos moleculares, antes no vistas, lo que nos indicó una amplificación inespecífica. Estos resultados no fueron concluyentes.

De la amplificación realizada para determinar la presencia del gen de cry 2 se pudo observar que estaba presente en todas las cepas, excepto en la cepa RT 32 (Figura 4). La amplificación para cry 9 reveló que la cepa de referencia HD133 y la cepa RBT po-seen dicho gen, siendo éste el menos frecuente en las cepas estudiadas (Figura 5).

039SALUDLATINA

Bioensayos:

En los bioensayos se observó la cantidad de larvas muertas al cabo de una sema-na. De las cepas estudiadas la cepa que mostró una mayor actividad insecticida frente a S. exigua fue la cepa RBT donde la mortalidad fue de 93% para la concentración may-or y 88% para la menor. Estos resultados son comparables a los mostrados por la cepa de referencia HD133, donde la mortalidad a una concentración de 500 μg/mL fue de un 97.3 % y 81.3% a una concentración de 50 μg/mL. (Figura 6). La cepa RT 32 manifestó cierta actividad, lo mismo que la cepa de referencia 4L1, aunque esta actividad insec-ticida fue menor. La actividad más baja la manifestaron las cepas RT15, RN51 y RT 35.

Figura 3. Carril 1 Marcador de peso mo-lecular, carril 2. 4L1, carril 3. HD133, carril 4. RT32, carril 5. RN51, carril 6. RT35, carril 7. RT15, RBT.

Figura 4. Carril 1 Marcador de peso mo-lecular, carril 2. 4L1, carril 3. HD133, carril 4. RT32, carril 5. RN51, carril 6. RT35, carril 7. RT15, RBT.

Figura 5. Carril 1 Marcador de peso molecu-lar, carril 2. 4L1, carril 3. HD133, carril 4. RT32, carril 5. RN51, carril 6. RT35, carril 7. RT15, RBT

Figura 6

040SALUDLATINA

Por otro lado, los resultados variaron significativamente para S. frugiperda. (Figu-ra 7). Aunque estos dos lepidópteros están emparentados, la mayoría de las cepas rev-elaron poca efectividad al obtenerse valores de mortalidad muy por debajo de los ob-tenidos para S. exigua. Las cepas RT15 y RN51 no causaron mortalidad, comparados con las cepas de referencia 4L1 y HD133 con resultados mucho más favorables. Solo de las cepas estudiadas, RBT mostró resultados con cierta actividad insecticida importante.

1. Aunque ambas especies de lepidópteros están filogenéticamente muy em-parentadas los resultados con respecto a la toxicidad frente a las cepas varió de forma considerable, siendo S. frugiperda mucho más resistente que S. exigua.

2. La cepa con mayor actividad insecticida fue la cepa RBT, sien-do esta también la única que poseía los 3 genes cry estudiados.

3. La solubilidad de todos los cristales purificados de las diferentes cepas osciló en un ran-go de pH entre 11.5 a 12. Al no existir diferencias de solubilidad importantes se puede descar-tar que este sea uno de los factores en la variación de la toxicidad entre la misma especie.

4. La digestión con tripsina mostró la fragmentación de las proteí-nas la cual es necesaria para la activación de las toxinas. Todos los cris-tales estudiados fueron susceptibles a la acción de las proteasas.

CONCLUSIONES

Figura 7

041SALUDLATINA

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042SALUDLATINA

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043SALUDLATINA

“Construcción de un baculovirus recombinante con el gen CCV1 del polidnavirus de Cotesia congregata”

AUTORES: Stephany Young Yusty1, Miguel A. Pérez Rodríguez2, Erick de Luna Santillana2, Mario A. Rodríguez Pérez2 1Universidad Latina de Panamá, 2Instituto Politécnico Nacional. Centro de Biotecnología Genómica, Tamaulipas, México.

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LOS POLIDNAVIRUS (PDVS)Se encuentran en las avispas endoparasitoides que,las cuales los inyectan en el cuerpo de larvas hospederas durante la ovoposición. Un producto génico del PDV de la avispa endoparasitoide Cotesia congregata, es la proteína CcV1.

La utilización de los baculovirus como bioin-secticidas se ve favorecida con la inserción de genes foráneos en el genoma, incrementando con ello su pa-togenicidad y virulencia. Estos genes usualmente cod-ifican para proteínas que interfieren con el metabolis-mo y metamorfosis de los insectos, tales como toxinas y enzimas. Una alternativa es la introducción de genes con efectos inmunosupresores, como los codificados en los genomas de los polidnavirus. Los polidnavirus (PDVs) están en las avispas endoparasitoides, que in-yectan en el cuerpo de larvas hospederas durante el depósito de los huevos de las avispas. Un producto génico del PDV de la avispa endoparasitoide Cote-sia congregata, es la proteína CcV1. La CcV1 inhibe la función de los hemocitos de las larvas durante la parasitosis, mediante su interacción con la hemolina, la cual es a su vez una proteína del sistema inmune de la larva. Como parte de este trabajo, el ADNc del gen CcV1 del PDV de C. congregata fue insertado en el genoma del baculovirus de Autographa californica (AcMNPV). Para este fin, se construyeron dos vectores de transferencia en los que se insertó el gen CcV1, uno bajo el promotor de la proteína p10 (denominado pAcUW21-V1) y otro bajo el promotor de la proteína polihedrina (denominado pVL1392-V1). La cotransfec-ción se llevó a cabo en células de Spodoptera frugiper-da (línea celular Sf9), utilizando el ADN linearizado del AcMNPV y los mencionados vectores recombinantes. Los nuevos virus recombinantes fueron denomina-dos Ac-pP10-V1 y Ac-pPolh-V1, respectivamente. Las células Sf9 infectadas con estos virus mostraron cam-bios morfológicos como la pérdida de adherencia, el aumento en el tamaño celular, la lisis celular y en al-gunos casos, la presencia de cuerpos de oclusión en su interior. El potencial de estos baculovirus está por ser determinado mediante bioensayos con larvas de diferentes estadios de Spodoptera frugiperda, Spodop-tera exigua, Diatraea saccharalis, Eureoma loftini, entre otras especies. Estas especies de insectos son consid-erados plagas de gran importancia agrícola, ya que ocasionan enormes pérdidas económicas anualmente.

The use of baculoviruses as biological in-secticides is enhanced with the insertion of foreign genes in its genome, and it increases their pathogenicity and virulence. Such genes usuall y encode proteins that interfere with the me-tabolism and metamorphosis of insects, such as toxins and enzymes. An alternative is the intro-duction of genes with immunosuppressive ef-fects, such as those encoded in the genomes of polidnavirus. The polidnavirus (PDVs) are in the en-doparasitoid wasps, which are injected into the host larvae during oviposition. The CcV1 protein, a gene product of the PDV endoparasitoid wasp Cote-sia congregata, is associated with inhibition of the function of the hemocytes during larval parasit-ism, through its interaction with the hemolin, a protein of the larvae immune system. In the pre-sent study, the CcV1 gene product of the PDV of the parasitic wasp C. congregata was cloned into the genome of the Autographa californica baculovirus (AcMNPV). For this purpose two transfer vec-tors with the CcV1 gene were constructed, one under control of p10 protein promoter (named pAcUW21-V1) and polyhedrin protein promoter (named pVL1392-V1). Cotransfection was carried out on cells of Spodoptera frugiperda (Sf9 cell line) using linearized AcMNPV DNA and the recombinant vec-tors afore mentioned. The new recombinant viruses were named Ab-pp10-V1 and Ac-pPolh-V1, respec-tively. The Sf9 cells infected with these viruses showed morphological changes including loss of adhesion, increased cell size, lysis, and in some cases, the pres-ence of occlusion bodies. The potential of these bac-ulovirus will be determined by bioassays with dif-ferent stages of insect´s larvae such as Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Diatraea saccharalis, Eureoma loftini, and others. These insect species are considered important agricultural pests because they are causing great economical losses every year.

RESUMEN ABSTRACT

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La elevada cantidad de plagas que amenazan con reducir la producción agrícola, la baja disponibilidad de insecticidas químicos efectivos y la contaminación del medio am-biente han contribuido a la implementación de programas de control biológico mediante el uso de bioinsecticidas (Inceoglu et al., 2001). Con respecto a esto, los baculovirus rep-resentan una buena alternativa como agentes de control de insectos. Uno de los atribu-tos más importantes de este agente es que presentan especificidad de hospedero, carac-terística que hace que tengan la propiedad de infectar un número limitado de especies, siendo ésta la principal bondad, al no ejercer acción tóxica contra insectos benéficos.

Sin embargo, los baculovirus silvestres presentan la desventaja de poseer una baja velocidad para matar a sus hospederos. Es por esto, que se utilizan numerosas técni-cas de ingeniería genética para incrementar su patogenicidad, mediante la incorpo-ración de genes exógenos, los cuales codifican para toxinas u enzimas que potencian su acción (Harrison y Bonning, 2001). Actualmente, no se tienen reportes de la construc-ción de baculovirus recombinantes con el gen CcV1 del polidnavirus de Cotesia con-gregata para su uso como bioinsecticida. Esta construcción podría potenciar la efica-cia y virulencia del baculovirus silvestre, ofreciendo una posibilidad de mejora en los programas de control biológico. En este trabajo , nos propusimos como objetivos con-struir un baculovirus recombinante de Autographa californica (AcMNPV) que conten-ga el gen CcV1 del PDV de Cotesia congregata y evaluar su utilidad como bioinsectici-da. Para ello, se desarrollaron dos vectores recombinantes de transferencia específicos para baculovirus y dos baculovirus recombinantes de Autographa californica (AcMNPV) con el gen CcV1 y se evaluó el efecto in vitro de los baculovirus sobre la línea celular Sf9.

Confirmación de la Identidad del gen CcV1 :

El ADNc del gen CcV1 de Cotesia congregata se obtuvo de un clon recombinante con-struido en el vector pBluescriptK (Instituto de Biología del Centro Nacional de Investigación Científica en Demokritos en Atenas, Grecia y el Institut de Recherche sur la Biologie de Insecte, CNRS, Francia). El plasmido recombinante fue propagado en células de Escherichia coli incu-badas durante 24 h a 37°C y con agitación a 150 rpm en LB líquido suplementado con ampi-cilina (10 mg/mL). La extracción de ADN plasmídico se realizó mediante una mini-preparación por lisis alcalina. Los oligonucleótidos denominados CcV1-B y CcV2-SK fueron utilizados en la amplificación de dicho gen bajo condiciones de PCR (MJ Research®). La secuenciación del gen CcV1 se realizó en un secuenciador semiautomático Li-Cor® DNA Analyzer siguiendo el protocolo del estuche comercial Sequi Therm Excel II Sequencing (Figura 1).

INTRODUCCION


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Vectores de Transferencia Recombinantes pAcUW21-V1 y pVL1392-V1 :

Para este fin se construyeron dos vectores de transferencia en los que se in-sertó el gen CcV1, uno bajo el promotor de la proteína p10 (denominado pAcUW21-V1) y otro bajo el promotor de la proteína polihedrina (denominado pVL1392-V1).

La ligación de estos fragmentos utilizó una proporción aproximada inserto/vec-tor de 1:3, por lo que se usaron 50 ng de ADN del inserto y 150 ng de ADN del vector.

La ligación resultante fue utilizada para transformar células calcio competentes de E. coli.

Purificación de los Vectores de Transferencia pAcUW21-V1 y pVL1392-V1 :

Los vectores recombinantes se obtuvieron por mini-preparación de ADN plasmíd-ico. Se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1.0% y el producto fue visu-alizado. Las bandas de los plásmidos se cortaron, y se colocaron en una colum-na de purificación de ADN (AMBION®- Catálogo No#AM10065) para su elución. Se centrifugó a 13000 rpm durante 5 min. El producto resultante se filtró a 45 μm (Phe-nomenex®). El ADN resultante fue utilizado para llevar a cabo las co-trasfecciones.

Cultivo de la Línea Celular Sf9 de Spodoptera frugiperda :

Se utilizaron células Sf9 de Spodoptera frugiperda (Orbigen®) a una concen-tración inicial de 1x107 UFC/mL de cultivo celular de insectos TNM-FH. Se depositaron en vi-ales y se esperó que se adhirieran a la superficie. Se descartó el medio, se adicion-aron 15 mL de TNM-FH y se incubó a 27˚C. La incubación continuó hasta que la mono-capa de células alcanzó del 80-90% de confluencia. Posteriormente, los cultivos celulares fueron traspasados antes de alcanzar una densidad de 2 x106 UFC/mL di-luyéndolas a una densidad de 1x106 UFC/mL. Las células fueron conservadas a -70º C.

Figura 1.Oligonucleótidos para amplificación del gen CcV1 agregando los sitios de restricción BglII, SphI y KpnI.

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Co-transfección mediada por calcio en Células Sf9 :La co-transfección se llevó a cabo en células de Spodoptera frugiperda (línea

celular Sf9), utilizando ADN linearizado de AcMNPV y los vectores recombinantes construidos. Los nuevos virus recombinantes fueron denominados Ac-pP10-V1 y Ac-pPolh-V1, respectivamente. Como control positivo de este experimento se usó un vector de transferencia pVL1392-xyle provisto por el fabricante y como control negativo no se usó ningún vector de transferencia. El virus generado de la co-trans- fección usando el vector pVL1392-V1 se denominó Ac-pPolh-V1. Por otra parte, el virus generado de la co-transfección utilizando el vector pAcUW21-V1 se denominó Ac-pP10-V1.

Extracción de ADN del sobrenadante infectivo fue realizado para confirmación de identi-dad de los virus recombinantes Ac-pP10-V1 y Ac-pPolh-V1.

Extracción de ADN de Sobrenadantes Infectivos para Confirmación de Identidad de los Virus Recombinantes Ac-pP10-V1 y Ac-pPolh-V1 :

Los sobrenadantes de las células SF9 infectadas del quinto pase, fueron utiliza-dos para la extracción de ADN genómico. Para este fin fue utilizado el kit comercial Wizard® Genomic DNA Purification de la casa comercial Promega®.

Amplificación por PCR del gen CcV1 para Confirmación de Identidad de los Virus Recombinantes Ac-pP10-V1 y Ac-pPolh-V1 :

El ADN previamente extraído de los sobrenadantes infecciosos fue utilizado para corroborar la identidad de los virus recombinantes Ac-pP10-V1 y Ac-pPolh-V1. Se efectuó una amplificación por PCR del gen CcV1 en un termociclador MJ Research®.

Cuantificación de los Títulos Virales :Para llevar a cabo la cuantificación de los títulos virales fueron enfrentadas 2x106 UFC

con diluciones seriadas de los stocks virales comenzando en 10-1 hasta 10-10, excepto en el caso del control negativo. Los tratamientos fueron incubados a 27˚C, y posteriormente se revisaron las células en busca de signos de infección a los 5 días en un microscopio invertido.

Después de amplificado y secuenciado el inserto procedente del plásmido pBlue-scriptKS-CcV1, se alineó mediante el programa BLAST (National Center for Biotech-nology Information (NCBI)). Los resultados indicaron correspondencia a la secuen-cia del décimo tercer círculo del genoma del CcBV, con identidad máxima del 100%.

Estos resultados coinciden con Espagne et al. (2004) quien había caracteriza-do previamente la secuencia del gen CcV1. Por otra parte, en el alineamiento uno a uno efectuado mediante el programa EMBOSS del European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI) entre la secuencia obtenida contra la generada por el pro-grama BLAST, se obtuvo una identidad y similitud del 99.8% entre las secuencias.


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Los resultados obtenidos a través de ambos programas nos permitieron corroborar mediante los alineamientos entre secuencias, la identidad del inserto como el ADNc del gen CcV1 de C. congregata.

Se elaboraron dos vectores de transferencia recombinantes con el gen CcV1 a partir de los vectores pVL1392 y pAcUW21. Para el primer vector el gen CcV1 fue insertado entre los sitios KpnI-Bglll bajo el promotor de la proteína polihedrina, y se le otorgó el nombre de pVL1392-V1. Para el segundo vector pAcUW21 el gen CcV1 fue insertado entre los sitios Sphl-Bglll bajo el promotor de la proteína p10, y se le otorgó el nombre de pAcUW21-V1. La correcta construcción e inserción de este gen fue verificado por medio de una digestión con las enzimas de restricción correspon-dientes a los sitios donde fue insertado el gen (Figura 2). El gen CcV1 en los recom-binantes pudo ser identificado en base a la banda de 1.4kb, la cual corresponde al gen.

Existen diferencias marcadas entre los vectores de transferencia construidos. Se ha demostrado que el gen de polihedrina y el de la proteína p10 no son eseciales para llevar a cabo la replicación, y el ciclo infeccioso de los baculovirus, por lo que pueden ser rempla-zados con genes foráneos de interés (Smith et al., 1983; Belyaevl y Roy, 1993).

La deleción o sustitución del gen de la polihedrina da como resultado virus negativos a polihedrina (Inceoglu et al., 2001). Por su parte, el gen de la proteína p10 es el respon-sable de la síntesis de una proteína no estructural (Belyaevl y Roy, 1993), cuya sustitución o deleción da como resultado baculovirus negativos a la proteína p10, pero capaces de completar su ciclo.

La recombinación homóloga entre cada uno de los vectores recombinantes construidos, y el ADN viral linearizado de AcNPV permitió la recircularización del mismo, agregando además el gen CcV1 al genoma de los nuevos virus recombinantes en la locación donde se insertó en el vector. El virus generado de la co-transfección usando el vector pVL1392-V1 se denominó Ac-pPolh-V1. Por otra parte, el virus gene-rado de la co-transfección utilizando el vector pAcUW21-V1 se denominó Ac-pP10-V1.

El cultivo de la línea celular Sf9 de S. frugiperda fue establecido de manera exitosa. Los cultivos celulares alcanzaron la confluencia aproximada del 80%-90% en un período pro-medio de 6 días (Figura 3).

Figura 2. Patrones de restricción de los vectores de transferencia recombinantes. Marcador de 1 Kb de Promega en carril A. Vector pGem+CcV1 en carriles B y E. Vectores nativos pAcUW21 y pVL1392 en carriles C y F. Vectores recombinantes en Carriles D y G.

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Al llevar a cabo la co-transfección mediada por calcio en células Sf9, los cul-tivos celulares desarrollaron signos de infección visibles. Esto produjo diferencias en cuanto a la morfología de cada cultivo celular infectado con un virus recombinante especí-fico, con respecto al control negativo y positivo posterior a los 4 días post-infección (Figura 4). En el control negativo de la co-transfección, se observaron células que conservaban su capacidad de adherencia y crecían en monocapa, lo cual es característico de células sanas libres de infección. En el caso de las células infectadas con el virus Ac-pPolh-V1, se observó pérdida de adherencia celular, aglomeración e hinchamiento de las células, y pérdida de la capacidad de reproducción celular. En las células infectadas con el virus Ac-pP10-V1, la mor-fología celular posterior a la co-transfección es similar a la presente en las células infectadas con el AcMNPV tipo silvestre. En este caso, se observaron células muy hinchadas, pérdida de la adherencia y capacidad de reproducción, y presencia de cuerpos de oclusión en el interior de las células. Sharon et al., (1998), investigaron el efecto de la infección por baculovirus en el ciclo de vida de las células Sf9.

Figura 3. Línea celular SF9 en confluencia.

Figura 4. Células Sf9 inoculadas con A) Control negativo, B) Ac-pPolh-CcV1, C) Ac-pP10-CcV1, D) AcMNPV Silvestre.

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Los investigadores demostraron que la infección detiene el crecimiento del 84% de las células en las fases G2/M de 18 a 24 horas posterior a la infección. Yanase, et al., en 1998 documentaron los cambios morfológicos como hincha-miento e incremento del volumen nuclear que ocurren en células Se301 derivada de S. exigua 72 horas con un baculovirus recombinante.

En el caso del Ac-pP10-V1, fue posible observar cuerpos de oclusión en el interior de las células infectadas, debido a que el vector pAcUW21 con que fue construido el virus, poseía el gen de polihedrina. Por otra parte, el vector pVL1392 con el cual fue construido el virus Ac-pPolh-V1 no contenía el gen de polihedrina, por lo que no se pudieron observar los cuerpos de oclusión en el interior de las células.

La presencia de fragmentos de aproximadamente 1400 pb fue evidenciado en los virus recombinantes Ac-pP10-V1 y Ac-pPolh-V1. No se observó amplificación del gen en el virus tipo silvestre, ni en el control negativo (Figura 5). El fragmento correspondiente a 1400 pb es indicativo de que los virus son recombinantes, ya que a su genoma les fue integrado el gen CcV1 de C. congregata.

Los títulos virales para los virus recombinantes Ac-pP10-V1 y Ac-pPolh-V1 re-sultaron en el orden de 1x103 UFP/mL y 1x106 UFP/mL, respectivamente al cabo de los cinco días post-infección. Títulos virales por debajo del orden de 1x106 UFP/mL se consideran bajos, por lo que se tendría que elevar los títulos del Ac-pP10-V1, previo a su uso en bioensayos. Por otro lado, para el virus AcMNPV silvestre (control positivo) se detectaron títulos por encima de 1010 UFP/mL, mientras que no se encontraron signos de infección en las células Sf9 utilizadas como control negativo.

Figura 5. Productos de PCR de la amplificación del gen CcV1 en ADN genómico de células Sf9. En carril A, marcador de 1 kb; En B y C, virus Ac-pP10-V1; En D y E, virus Ac-pPolh-V1; En F, el vector.pGem-CcV1 (Control) y en el G, ADN genómico de células Sf9 sin infectar (Control negativo).

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1- Se construyeron de forma exitosa dos baculovirus recombinantes de AcMNPV con el gen inmunosupresor CcV1 de Cotesia congregata, utilizando dos vectores de transferencia específicos para baculovirus.

2- Los virus construidos denominados Ac-pP10-V1 y Ac-pPolh-V1 produjeron alteraciones morfológicas en la línea celular Sf9, indicándonos que el genoma viral pudo recircularizarse y ser infectivo.

3- Las alteraciones morfológicas ocasionadas en las células Sf9 por lo virus recombinantes Ac-pP10-V1 y Ac-pPolh-V1 presentaron diferencias marcadas. En el caso del Ac-pP10-V1, fue posible observar cuerpos de oclusión en el interior de las células infectadas, mientras que con el Ac-pPolh-V1 sólo se produjeron alteraciones en la morfología celular.

4- La construcción de baculovirus recombinantes negativos a polihedrina para su uso como bioinsecticida es viable, debido a que siguen siendo capaces de infec-tar y matar larvas.

1- Llevar a cabo bioensayos con los nuevos virus recombinantes, exponiendo diferentes especies de insectos plaga y benéficos (como especie no blanco), en diversos estadios de desarrollo.

2- Realizar nuevas construcciones de baculovirus con otros genes de polidna-virus con efectos inmunosupresores.

3- Estudiar las propiedades y dilucidar la estructura de la proteína CcV1 de Cotesia congregata.

4- Evaluar el uso de abrillantadores o bien de agentes de co-oclusión con baculovirus tipo silvestre como nuevos formulados, para evitar el daño por agentes ambientales a los baculovirus recombinantes generados. Principalmente, a los que son negativos a polihed-rina.

RECOMENDACIONES

CONCLUSIONES

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• Ackermann, H.W. and Smirnoff, W.A. 1983. A morphological investigation of23 baculoviruses. Journal of Invertebrate Pathology 41: 269–280.

• Amaya,K.E.,Asgari,S.,Jung,R.,Hongskula,M.,Beckage,N.E.2005.ParasitizationofManduca sexta larvae by the parasitoid wasp Cotesia congregata induces an impaired host immune response. Journal Insect Physiology 51: 505–512.

• Asgari,S.andSchmidt,O.2001.PromoterstudiesofapolydnavirusgenefromCote-sia rubecula (Hym: Braconidae). Archives Virology 146:1979–1989.

• Belyaev, A.S. and Roy, P. 1993. Development of baculovirus triple and quad-ruple expression vectors: co-expression of three or four bluetongue virus proteins and the synthesis of bluetongue virus-like particles in insect cells. Nucleic Acids Research 21:1219-1223.

• Espagne, E., Dupuy, C., Huguet, E., Cattolico, L., Provost, B., Martins, N., Poirie,M., Periquet, G., Drezen, J.M. 2004. Genome sequence of a polydnavirus: insights into symbiotic virus evolution. Science 306:286-289.

• Harrison, R.L. and Bonning, B. 2001. Use of Proteases to Improve the Insecti-cidal activity of baculoviruses. Biological Control 20:199-209.

• Inceoglu, A.B, Kamita, S.G., Hinton, A.C., Huang, Q., Tonya, F.S., Kang, K., Ham-mock, B.D. 2001. Recombinant baculoviruses for insect control. Pest Management Science 57: 981-987

• Sharon,C.B.,Parr,R.,Belyavskyi,M.,Summers,M.D.1998.Autographa californica Nu-cleopolyhedrovirus Infection Results in Sf9 Cell Cycle Arrest at GVirology244:195-211. 2/M Phase.

• Smith, G.E., Fraser, M.J., Summers, M.D. 1983. Molecular Engineering of the Au-tographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus Genome: Deletion Mutations Within the Polyhedrin Gene. Journal of Virology 46:584-593.

• Yanase,T.,Yasunaga, C., Hara,T., Kawarabata,T. 1998. Co-infection ofSpodoptera exigua and Spodoptera frugiperda Cell Lines with the Nuclear Polyhedrosis Viruses of Au-tographa californica and Spodoptera exigua. Intervirology 41:244–252.

• Zhang, G., Schmidt, O., Asgari. S. 2004. A Novel Venom Peptide from an Endo-parasitoid Wasp Is Required for Expression of Polydnavirus Genes in Host Hemo-cytes. The journal of biological Chemistry 279:41580–41585.

BIBLIOGRAFÍA

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“Estudio de la variabilidad genética de Leishmania panamensis mediante marcadores moleculares generados vía AFLP”

AUTORES: Johanna G. Juliao Amaya1, Ricardo Lleonart C.2

1Universidad Latina de Panamá, 2INDICASAT AIP.

BIO

TECN

OLO

GÍA

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RESUMEN ABSTRACT

Leishmania panamensisProtozoos flagelados del género Leishmania capaces de producir diversas manifestaciones como lesiones cutáneas, mucocutáneas y viscerales.

AUTORES: Johanna G. Juliao Amaya1, Ricardo Lleonart C.2

1Universidad Latina de Panamá, 2INDICASAT AIP.

La Leishmaniasis es una enfermedad para-sitaria mortal, cuyos causantes son protozoos flagelados del género Leishmania capaces de pro-ducir diversas manifestaciones como lesiones cu-táneas, mucocutáneas y viscerales. Esta enferme-dad actualmente se encuentra en Latinoamérica y en nuestro país, donde se ha identificado la presen-cia de especies como Leishmania panamensis, amplia-mente distribuida en el territorio y de la cual no existen estudios realizados anteriormente. En este trabajo, se realizó la identificación y tipificación de cepas de ref-erencia de Leishmania panamensis y Leishmania guy-anensis, especies genéticamente similares. Para llevar a cabo la identificación y tipificación de las cepas, se utilizaron técnicas moleculares como PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y el posterior análisis de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) del producto amplificado para distinguirlas. Finalmente ,se realizó la detección de polimorfismos en el ADN de las especies, a través de la técnica de PCR-RFLP para la caracterización y tipificación de cepas de L. pa-namensis y L. guyanensis. Como resultados se obtuvo que el uso de la técnica PCR-RFLP del gen hsp70 con la enzima de restricción BccI, permitió la diferenciación entre las cepas de L. panamensis y L. guyanensis. Se recomienda continuar hasta la etapa final de desar-rollo de estos marcadores en Leishmania panamensis ensayando combinaciones de cebadores a partir de los ya escogidos para obtener resultados más precisos. También es importante probar las combinaciones de cebadores en más aislados de Leishmania panamensis y guyanensis.

Leishmaniasis is a deadly parasitic disease, whose causes are flagellate protozoa of the genus Leishma-nia and can produce various manifestations such as cutaneous, mucocutaneous, and visceral. This is a current disease in Latin America, and in our country it has been identified the presence of species such as Leishmania panamensis, widely distributed in the ter-ritory and from which there are no previous studies. In this paper, we made the identification and typing of references strains of Leishmania panamensis and Leishmania guyanensis, which are genetical-ly similar species. To carry out the identification and typing of strains, we used molecular tech-niques such as PCR reaction (Polymerase chain reaction) and subsequent analysis of frag-ment length (RFLP) to distinguish the amplified product. Finally, we detected polymorphisms in DNA of the species, by PCR-RFLP for the characterization and classification of strains of L. panamensis and L. guyanensis. The results showed that using the PCR-RFLP technique of the hsp70 gene with the restriction enzyme BccI, allowed differentiation between strains of L. panamensis and L. guyanensis. We recommend to continue the process until the final stage of development of these markers in Leishmania panamensis tested combinations of primers from those already selected for more accu-rate results. It is also important to test combinations of primers isolated from both Leishmania species.

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La leishmaniasis es una enfermedad parasitaria mortal, producida por protozoos flage-lados del género Leishmania capaces de producir diversas manifestaciones clínicas como lesiones cutáneas, mucocutáneas y viscerales. Esta enfermedad parasitaria actualmente se encuentra en Latinoamérica y en nuestro país, donde se ha identificado la presencia de Leishmania panamensis, ampliamente distribuida en el territorio. Es una enfermedad re- emergente en Panamá, clasificada de importancia I por la Organización Mundial de la Salud (OMS). Actualmente su situación epidemiológica empeora, con una incidencia de infección creciente, donde en los últimos años se ha llegado a diagnosticar hasta 3,000 casos anuales.

Durante años, la leishmaniasis estuvo confinada a las regiones selváticas y rurales, pero debido al crecimiento de la ciudad y la invasión de áreas boscosas se ha convertido en una amenaza para quienes entran en contacto con los vectores que la transmiten. Por ello se ha observado una tendencia al incremento de casos en zonas más cercanas a los centros urbanos (correlacionado con el incremento en la urbani-zación de estas áreas rurales).

Los estudios genéticos del parásito son de gran importancia para entender su evolución, ya que este conocimiento es esencial para impulsar los estudios epide-miológicos de la enfermedad para desarrollar mejores métodos diagnósticos, así como sistemas de control y evaluaciones de posibles candidatos vacunales.

En este estudio se realizó la identificación y tipificación de cepas de referencia de Leish-mania panamensis y Leishmania guyanensis, ya que ambas especies son genéticamente simi-lares.

Para el estudio se cultivaron cepas de Leishmania panamensis, las que fueron desconge-ladas y cultivadas en medio Schneider, el cual asemeja la hemolinfa del vector. Se incubaron a 25ºC para el cultivo óptimo de los promastigotes.

Posteriormente, se realizó la extracción de ADN genómico de los parásitos cultivados mediante el protocolo del Kit Wizard Genomic DNA purification (Promega). La electrofore-sis de ADN genómico se hizo para verificar el contenido de ADN de las muestras, en una concentración que no sobrepasara los 400 ng/μL, y después se sometieron las muestras de ADN genómico a una digestión con la enzima EcoRI. El marcador de peso molecular usado fue el Lambda HindIII, que posee una banda de 2.3 kb lo cual ayudó a comparar con el ADN genómico obtenido de Leishmania. Las muestras se corrieron durante 45 min a 110 V.

Para la amplificación del gen que codifica para la proteína de choque térmico Hsp 70 se realizó una PCR-Hsp 70, donde los cebadores utilizados amplificaban una región de 1,3 kp del gen, que permitía la caracterización entre especies de Leishmania.

INTRODUCCION


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Los cebadores fueron Hsp 70 sense (5’ GACGGTGCCTGCCTACTTCAA 3’) y Hsp 70 antisense (5’ CCGCCCATGCTCTGGTACATC 3’) (SIGMA Genosys, Inglaterra). Las condiciones de PCR para un volumen final de reacción de 50 μL fueron 2 μL de Primer mix (20pmol de cada primer), 25 μL de PCR Master Mix 1x (PROMEGA, WI, USA), 22 μL de agua ultra pura calidad de cultivo y 1μL de ADN. Los ciclos térmicos se realizaron en un termociclador GeneAmpThermoCycler 2700 (AppliedBiosystems).

Para la purificación del producto de PCR-Hsp 70, se usó acetato de sodio (NaAc) 2M y etanol absoluto. También se realizó directamente la purificación mediante el Kit Wizard SV Gel y PCR clean-up System, para lo que se resuspendió el ADN en 50 μL de agua libre de nu-cleasas. La verificación del producto purificado se realizó mediante una electroforesis utili-zando un marcador de 100 pb para descartar la pérdida de ADN en el proceso de purificación.

Para identificar y tipificar entre especies de Leishmanias se realizó una di-gestión enzimática del producto amplificado con Hae III, la cual permitía iden-tificar las especies de Leishmania pertenecientes al complejo Leishmania guyanensis (Leishmania panamensis y Leishmania guyanensis). La otra di-gestión fue con Bcc I. Esta enzima discrimina según su patrón de bandas, en-tre las especies Leishmania panamensis y Leishmania guyanensis. La digestión se realizó en un volumen final de 31 μl, con 20 μl del amplicón, usando 1U de HaeI-II (MBI Fermentas, StLeon-Rot, Germany) o 1U de BccI (New EnglandBiolabs, Ip-swich, MA, USA), 100 μg/mL de BSA. Las reacciones se incubaron a 37ºC de 3 a 4 h.

Para evidenciar la identificación y caracterización de las especies de Leishmania del complejo guyanensis (L. panamensis y L. guyanensis) se real-izó un análisis posterior de la longitud de los fragmentos de restricción del pro-ducto amplificado (RFLP). El análisis se hizo con un gel de agarosa al 2%, corriendo a 110 V por 1.5 h. Se utilizó un marcador de peso molecular de 100 pb (AMRESCO).

Además, para detectar los polimorfismos en el ADN de Leishmania se ensayó un AFLP, donde se usaron varias combinaciones de cebadores selectivos buscan-do cuales permitirían un número alto de bandas polimórficas en el rango útil de separación para el sistema de electroforesis capilar utilizado (50 a 500 pares de bases y más de 100 unidades de fluorescencia). Para la inyección de cada muestra se preparó 0.5 μl del marcador de talla GeneScan ROX 500, 1μl del producto de amplifi-cación selectiva y 20 μl de formamida (Applied Biosystems, USA). Las primeras mues-tras se analizaron mediante electroforesis capilar en un secuenciador Genetic Analyz-er ABI 3130 de cuatro capilares (Applied Biosystems, USA). Las siguientes se analizaron en el secuenciador del Smithsonian Genetic Analyzer ABI 3130 xl de 16 capilares (Applied Biosystems, USA). Los resultados de las corridas se procesaron con el programa GeneMapper v4.1 (Applied Biosystems, USA) y GeneMarker v1.95 (SoftGenetics, LLC).

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Para la etapa de identificación y caracterización de las muestras del comple-jo L. guyanensis es imprescindible obtener una cantidad satisfactoria de ADN (lue-go de la extracción del mismo). Por ello se realizó la primera electroforesis. La figu-ra 1 muestra diferentes concentraciones de ADN de seis muestras de L. panamensis.

El proceso de purificación que se realiza luego de la amplificación del gen hsp70 es indispensable para eliminar los restos de impurezas que con-tenga la muestra. Se debe procurar no perder el ADN en este proceso. La figura 2 muestra claramente un proceso de purificación realizado exitosamente, en el cual se observa claramente la presencia de la banda del gen amplificado.


Figura 1. Resultado típico de electroforesis de ADN genómico para verificar concentración, talla molecular e integri-dad del ADN de las muestras. El marcador de peso molecular usado es ADN de fago Lambda digerido con HindIII.

Figura 2. Verificación del producto purificado de hsp70 mediante electroforesis en un gel de agarosa1% para veri-ficar la talla. El marcador utilizado es de 100pb, el cual tiene una banda de 1.5kb que nos permite comparar con la banda del gen de 1.3kb.

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Al realizar la técnica de RFLP, se observó que las 22 muestras ensayadas correspondieron tanto a la especie L. panamensis como a L. guyanensis, ya que mostraron el mismo patrón de ban-das descritos por García y colaboradores. Observamos además, que ambas especies presen-taron el mismo patrón de bandas con HaeIII, lo cual significa que ambas pertenecen al complejo guyanensis. En cambio, se observaron diferentes patrones de bandas entre L. pa-namensis y L. guyanensis con BccI, lo que permitió diferenciar especies (Figura 3).

Finalmente el proceso de AFLP, última etapa en la que se realiza la explo-ración de la variabilidad genética de L. panamensis mediante la detección de polimorfismos en la secuencia de ADN se observa en la figura 4. En la mis-ma se puede observar la aparición de bandas no repetitivas entre especies.

De este proceso en general se encontraron en total 209 combinaciones las que fueron probadas mediante los tres kits mencionados. El Kit del Microbial mostró más cantidad de picos, consecuencia de que tiene menos bases selectivas y la complementariedad es más probable. De este mismo kit se tomaron las combi-naciones que dieron más de diez picos, con lo cual se redujo a 67 combinaciones.

Figura 3. Análisis de la longitud de los fragmentos de restricción de las especies L. panamensis y L. guyanensis. MM: marcador de peso molecular de 100pb; Líneas 1 y 2: ADN del amplicón de Hsp70 de L. panamensis; línea 3: ADN del amplicón de Hsp70 de L. guyanensis; líneas 1a, 2a y 3a, patrones de bandas con HaeIII; líneas 1b, 2b y 3b, patrones de bandas con BccI.

Figura 4. Ejemplo de un AFLP de fragmentos de DNA marcados con fluorescencia.

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Estas fueron ensayadas en cinco aislados de L. panamensis y L. guyanensis de referencias para evidenciar polimorfismos y explorar comparativamente. De estas 67 combinaciones probadas, se escogieron las combinaciones que mostraron polimorfismos y mayores picos. (Tabla 1)

También se ensayaron diferentes condiciones de ciclos de PCR para los pro-cesos de amplificación pre-selectiva con el fin de detectar aquellos que mayores números de picos reproducibles ofreciera. Este ensayo se realizó con un ADN control de Escherichia coli y los cebadores fueron EcoRI +0 y MseI +C. Los resultados obtenidos se re-sumen en la tabla 2, donde se muestra que los números más altos de picos detectados se dieron en el resultado de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con condiciones de mayores ciclos.

Tabla 1. Combinaciones de Cebadores de las series +0, +1, +2 que dieron altos números de picos en las especies de Leishmania ensayadas.

(1) Combinaciones de cebadores que dieron números más altos de alelos comunes para todas las L.guyanensis y L. panamensis ensayadas.(2) Combinaciones de cebadores que dieron números más altos de alelos presentes solo en L. guyanensis, ausentes en todas las L.panamensis.(3) Combinaciones de cebadores que dieron los números más altos de alelos comunes para todas las L. panamensis ensayadas, y ausentes en la L. guyanen-sis de referencia.(4) Combinaciones de cebadores que dieron el mayor número acumulativo de alelos en todas las L. panamensis ensayadas.(5) Combinaciones de cebadores que dieron el mayor número de alelos polimórficos en todas las L. panamensis ensayadas.(6) Combinaciones de cebadores que dieron el mayor porcentaje de alelos polimórficos en todas las L. panamensis ensayadas.

Tabla 2. Número de picos detectados reproducibles en un DNA control de E. coli después de varias condiciones de ciclos. (Ceba-dores EcoRI+0/MseI+C).

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Finalmente, se escogieron solo 13 combinaciones para seguir la exploración de la variabilidad genética en cepas de L. panamensis. En la tabla 3 se muestran las combinaciones finales de cebadores escogidas en base a la mayor cantidad de ale-los polimórficos en L. panamensis y el porcentaje más alto de picos polimórficos.

Figura 5. Electroferograma típico obtenido mediante la técnica de AFLP. A) Representa un pico polimórfico presente solo en la muestra L. guyanensis de referencia; B) Muestra un alelo común presente solo en los aislados de L. panamensis; C) Representa un pico polimórfico presente solo en una de las muestras de L. panamensis que corresponde a la muestra P9; D) Muestra un alelo común para ambas especies (L. guyanensis y L. pana-mensis).

Tabla 3. Combinaciones finales de cebadores escogidas en base a la mayor cantidad de alelos polimórficos en L. panamensis y el porcentaje más alto de picos polimórficos.

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1. Todas las técnicas llevadas a cabo para el experimento fueron enseñadas en forma teórica previamente durante la carrera, y éstas técnicas hoy en día nos han proporcionado muchos conocimientos para el avance científico, ya que al ser innovadoras constituyen una gran herramienta para llevar a cabo experimentos como, por ejemplo, el PCR-RFLP utilizado para la caracterización y tipificación de este estudio, ya que anteriormente solo se realizaba por electroforesis de variantes isoenzimáticas, cariotipaje molecular y otras técnicas más laboriosas y menos precisas.

2. Utilizando la técnica PCR-RFLP del gen hsp70 con la enzima de restricción BccI, he-mos podido comprobar que es una herramienta muy útil para diferenciar entre las cepas de L. panamensis y L. guyanensis.

3. También, se ha demostrado que la técnica de AFLP resulta ser muy útil en estudios de variabilidad genética para detectar sitios polimórficos en varios organismos. El empleo de esta técnica también presenta ventajas importantes, entre las cuales podemos mencionar su fácil y rápida implementación, permite un alto poder de discriminación, tiene alta repro-ducibilidad. No es necesario un conocimiento previo del genoma y finalmente permite la posibilidad de convertir rápidamente marcadores AFLP a marcadores co-dominantes.

1. Continuar hasta la etapa final de desarrollo de estos marcadores en Leishmania pana-mensis ensayando combinaciones de cebadores a partir de los ya escogidos para obtener resultados más precisos.

2. También, es importante probar las combinaciones de cebadores en más aislados de Leishmania panamensis y guyanensis.

RECOMENDACIONES

CONCLUSIONES

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• Dorfman; Passarelli. Introducción a la Microbiología Médica. Editorial Akadia.Pag 29 – 31.

• Garcia L., Kindt A., Bermúdez H., Llanos-Cuentas A., De Doncker S., ArévaloJ, Wilber K., Tintaya Q., and Dujardin J. 2004. Culture-Independent Species Typingof Neotropical Leishmania for Clinical Validation of a PCR-Based Assay Targeting Heat Shock Protein 70 Genes. Journal of Clinical Microbiology 42 (5), 2294-2297.

• Larry S Roberts; John Janovy Jr. Foundations of Parasitology. 5 edición.Kinetoplastide:trypanosomes and their kin 68 – 77.

• Marcial – Rojas. Pathology of Protozoal and Helminthic diseases with clinicalcorrelation. Marzo 1975. Cutaneous Leishmaniasis 97 – 114.

• MontalvoA.,FragaJ.,MontanoI.,MonzoteL.,MarinM.,VanDerAuweraG.,Dujar-din J. C., Vélez I., Muskus C., 2010. Differentiation of Leishmania (Viannia) panamensis and Leishmania (V.) guyanensis using BccI for hsp70 PCR-RFLP. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 104 (2010) 364-367.

• Montalvo A., Fraga J., Montano I., De Doncker S., Dujardin J. C., Van Der Au-wera G. Heat-shock protein 70 PCR-RFLP: a universal simple tool for Leishmania species discrimination in the New and Old World. Parasitology, page 1 of 10. Cam-bridge University Press 2010.

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• Roitt; Brostoff; Male. Inmunología. 4 edición. Harcourt Brace. InmunidadFrente a los Protozoos y los Helmintos.

BIBLIOGRAFÍA

063ARTICULOSINVESTIGACION

“Análisis de expresión de un gen de trealosa -6- fosfato sinteta-sa en variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris)”

AUTORES: Sandra Judith Rodríguez1,RaymundoRosasQuijano2

1Universidad Latina de Panamá, 2Centro de Biotecnología Genómica-Instituto Politécnico

Nacional, México.

BIO

TECN

OLO

GÍA

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Phaseolus vulgarises un cultivo ampliamente consumido en México y países latinoamericanos. Sin embargo, su rendimiento es afectado por distintos factores bióticos y abióticos, dentro de los cuales se destaca el estrés hídrico, generando pérdidas económicas importantes.

RESUMEN ABSTRACT El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es un cul-

tivo ampliamente consumido en México y países lati-noamericanos. Sin embargo, su rendimiento es afectado por distintos factores bióticos y abióticos, dentro de los cuales se destaca el estrés hídrico, generando pérdidas económicas importantes. Estudios realizados en organ-ismos eucariotas tolerantes a este tipo de estrés, dem-uestran la acumulación de un disacárido reductor, lla-mado “trealosa”, la cual está ampliamente distribuida en muchos organismos desde bacterias, hongos, insectos y plantas. La trealosa tiene distintas funciones biológicas, donde se distingue su papel como osmoprotector celu-lar en situaciones de estrés hídrico. Su síntesis en plantas ocurre a través de la enzima trealosa -6- fosfato sintetasa (TPS), codificada por el gen treaolosa -6- fosfato sintetasa (Arabidopsis thaliana, gen AtTPS1). Existen reportes so-bre la posible implicación de la trealosa en la tolerancia al estrés hídrico en frijol común (P. vulgaris), sin embargo se desconoce su verdadera función a nivel molecular en la tolerancia a la sequia, convirtiendo a P. vulgaris en un modelo excelente para medir la actividad transcripcional de la trealosa, por medio de la reacción en cadena de la polimerasa en transcripción inversa (RT-PCR). Con el fin de elucidar el papel que tiene la trealosa en esta toler-ancia, se construyeron oligonucleótidos específicos a partir de secuencias conservadas de genes TPS de otras plantas, con lo que se amplificó RNA mensajero de un segmento del gen de trealosa en dos variedades de frijol: BAT 407 tolerante a la sequía y Pinto UI 104 susceptible, sujetas a distintos tratamientos de estrés. La mayor ex-presión del gen de interés la observamos en el primer muestreo el cual se realizó a los 15 días de siembra, sin embargo como lo menciona la literatura, ésta expresión va disminuyendo a medida que avanza el tiempo de exposición al estrés. No se encontró diferencia en la ex-presión de este gen entre las variedades utilizadas.

The common bean (Phaseolus vulgaris L.) is a grain widely consumed in Mexico and Latin America. However, the crop is affected by different biotic and abiotic factors like the water stress, resulting in economical losses. Stud-ies made in eukaryotic organisms tolerant to this type of stress, show the accumulation of a reducing disaccharide, called “Trehalose”, which is widely distributed in many organisms like bacteria, fungi, insects, and plants. The trehalose has different biological func-tions where its role as osmoprotectant cellu-lar is distinguished in water stress situations. Its synthesis in plants occurs through the enzyme trehalose-6-phosphate synthase (TPS), encod-ed by the gene treaolosa -6 - phosphate synthase (Arabidopsis thaliana gene AtTPS1). There are reports about the possible participation of trehalose in water stress tolerance in the common bean (P. vulgaris), but its true function is unknown at the molecular level in tolerance to the drought, ma-king P. vulgaris an excellent model to measure the transcriptional activity of the trehalose, by means of the chain reaction of the polymerase in inverse transcription (RT-PCR). In order to elucidate the role that trehalose has in this tolerance, specific oligo-nucleotides were constructed from conserved se-quences of TPS genes from other plants, with which was amplified the messenger RNA of a gene seg-ment of trehalose in two varieties of beans : BAT 407 drought tolerant and susceptible Pinto UI 104, subject to various stress treatments. The greatest expression of the gene of interest was observed in the first sampling which was performed at 15 days after planting, however, as it was mentioned by the literature, this expression decreases as time goes on exposure to stress. There was no difference in the presence of this gene among the kinds of beans used.

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El frijol común Phaseolus vulgaris es una de las leguminosas más consumidas en México y demás países latinoamericanos (Leterme et al., 2002), ya que representa una importante fuente de proteínas y fibra, que incluso ayudan a la prevención de ciertas enfermedades (Granito et al., 2008). La producción de frijol en México es alta, sin embargo, este cultivo se ve afectado por una gran variedad de factores tanto bióticos como abióticos; siendo el princi-pal, el estrés hídrico, muy frecuente en el área de siembra (Santos et al., 2010).

Por otra parte, la trealosa es un disacárido no reductor formado por dos molécu-las de glucosa; en una gran variedad de organismos, después de ser sometidos natu-ralmente a la deshidratación la concentración del disacárido se ve incrementada, a tal grado, que existe una íntima relación entre la concentración de trealosa con la tolerancia al estrés hídrico.

Hasta ahora son conocidas cinco diferentes vías de síntesis de la trealosa, sin embargo, la que se encuentra más ampliamente distribuida en los organismos es aquella que involucra dos reacciones químicas, catalizadas por las enzimas trealosa 6 fosfato sintetasa (TPS) y trealosa 6 fosfato fosfatasa (TPP); en la etapa inicial, una molécula de UDP-glucosa y otra de glucosa-6-fosfato, reacción por la acción de la TPS para formar el precursor trealosa-6-fosfato. En la segunda etapa, el grupo fosfato es removido de la molécula precursora por la enzima TPP originando finalmente la molécula de la trealosa. De estas enzimas, la TPS tiene regulación, por lo que llama la atención su estudio. En la literatura se han reportado hasta 11 miembros de TPS para plantas.

Se sugiere que aquellos organismos que presentan los genes codificantes para las enzimas TPP y TPS, tienen la capacidad de acumular este azúcar en condiciones de estrés, por lo tanto, presentan una mayor tolerancia al mismo. Debido al impor-tante rol de la trealosa, propuesto en organismos tolerantes a la sequía (déficit hídri-co), se hace de suma importancia determinar su presencia y comportamiento en ru-bros indispensables en la alimentación en países en vías de desarrollo. Sobre todo al tratarse de un cultivo que se ve dramáticamente afectado por las condiciones am-bientales.

Es de notable importancia seleccionar variedades que presenten un alto rendimiento bajo condiciones de escasez de agua, o poder modificar genéticamente (transgénicos) otros rubros afectados por déficit hídrico, utilizando genes relacionados con la tolerancia a la se-quía. Conocido esto, nuestra hipótesis es la siguiente: ¿Podría la presencia y expresión de alguno de los genes de la familia de las enzimas TPS, en el genoma de Phaseolus vulgaris, favorecer la tolerancia al déficit hídrico de la variedad BAT 477, tolerante a la sequía; y lo con-trario en la variedad susceptible PINTO UI114?.

Cuyo objetivo general es: Identificar y medir la expresión un gen de Trealosa -6- fosfato sintetasa (TPS), en dos variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris); una variedad tolerante al estrés por déficit hídrico (BAT 477); y otra susceptible (Pinto UI 114).

INTRODUCCION

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Se utilizaron plantas de frijol común (P. vulgaris), una variedad experimental al déficit hídrico, BAT 477 y otra susceptible Pinto UI 114, crecidas en condiciones controladas de in-vernadero. Todas las muestras utilizadas durante este proyecto fueron proporcionadas por el Laboratorio de Biotecnología Vegetal del Centro de Biotecnología Genómica del I.P.N. en Reynosa, México (CBG).

Para la extracción de ácidos nucleídos, el ADN molde utilizado, fue extraído a partir de hojas de frijol común (P. vulgaris), de la variedad BAT 477 y se utilizó el Kit comercialdepurificacióndeADNgenómico“GenomicDNAExtractionWIZARDA1120”(Pro-mega, EEUU 2010). Para esto, se pesaron 100 mg de muestra de tejido vegetal. Se maceró rápi-damente con nitrógeno líquido, para evitar la degradación de los ácidos nucleídos y se añadió la solución de precipitación de proteínas. Se incubó durante 5 min y se centrifugó. Al sobre-nadante se agregó 600 µL de isopropanol. La muestra se centrifugó nuevamente, esta vez se descartó el sobrenadante. Se agregaron 600 µL de etanol al 70%, se centrifugó y descartó otra vez el sobrenadante. La muestra fue secada a temperatura ambiente, hasta desaparec-er trazas de etanol. Se rehidrató el sedimento, durante una incubación en baño maría a 65ºC durante 1 h. Las muestras se guardaron a -20ºC. Se determinó la eficiencia de la purificación y se evaluó la integridad y concentración del ADN en un gel de agarosa en TAE1x. Se registró en un fotodocumentador Molecular Imager Gel-DocTM XR de BioRad.

Para la extracción de ARN de las muestras de ambas variedades de frijol, se usó el pro-tocolo del TRIzol® Reagent (Invitrogen). Se trituró la muestra sin descongelarla y se agregó 1mL del reactivo, todo esto permaneció en frío. Luego, la muestra se agitó y se incubó por 5 min 37ºC. Después, se agregó 0.2 ml de cloroformo atemperado, se mezcló y se incubó durante 3 min. Se centrifugó la muestra a 12000 rpm por 20 min a 8ºC y se recuperó la fase acuosa. Para precipitar el ARN se adicionaron 50 µL de isopropanol, se mezcló por inversión, y se incubó por 10 min a temperatura de laboratorio. Se centrifugó a 12000 rpm durante 10 min a 8ºC y se eliminó el sobrenadante. Se lavó con 1ml de etanol al 75%, y finalmente se centrifugó 5 min a 8000 rpm, se descartó el sobrenadante y se resuspendió en 20 µL a 30 µL de agua DEPC según el tamaño el sedimento.

El diseño de los cebadores para el ADN total fue a partir de un alineamien-to de secuencias conservadas de TPS en plantas, depositadas en la base de da-tos del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Los cebadores escogidos am-plificaban 6 regiones dentro del fragmento de interés de TPS. Los mismos tenían como finalidad encontrar fragmentos que por su buena resolución en los geles, puedan secuenciarse y analizarse en la base de datos. Los cebadores de TPS, programas de temperaturas y mezcla de reacción para PCR, fueron modificados a partir de los utiliza-dos en estudios previos (Santos et al., 2010). La cadena adelantada (forward), se identificó como, “F”, y los de la cadena reversa (reverse), con la letra “R”. Se realizaron ensayos de amplificación por PCR con diferentes cebadores cuyos datos no son mostrados y que cor-responden a los NTPS. Igualmente, fueron diseñados dentro del fragmento escogido (1,4), para amplificar nuevas regiones.


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Las combinaciones de amplificación fueron utilizadas: Pv1AF/Pv1BR, amplifica un fragmento de 240 pb, y fue diseñado en la base 100 del fragmento 1,4; Pv1BF/4R, amplifica un fragmento de 500 pb, diseñado a los 340 pb del fragmento 1,4; y por último Pv1AF/4R, amplifica un fragmento de aprox. 800 pb, diseñado a los 100 pb de fragmento 1,4. Se diseñaron cebadores específicos para β-actina de frijol común, a partir de una secuencia de ADNc de actina-1 de P. vulgaris depositada en la base de datos de NCBI. El programa utilizado fue el PrimerSelect del Suite DNAStar (Lasergene v. 7), con el que se determinaron los marcos de lectura y las características (tamaño, temperatura de alineamiento, formación de horquillas, etc.), más adecuadas. Se corroboró la secuencia con la base de datos del NCBI. Fueron sintetizados en Eurofins mwg/operon.

Para los cebadores se obtuvo una concentración final de 10µM. De las bandas amplificadas se tuvieron en cuenta las de mejor rendimiento y que se amplificaran por ambos cebadores, F y R. Se reamplificaron los productos de la PCR, cuando se necesitó aumentar el rendimiento de ADN en la muestra para los distintos procesos. Las cantidades de reactivos (MgCl2 y de buffer de reacción, etc.) fueron modificadas, así como la temperatura y tiempo de cada seg-mento del programa de amplificación, para obtener el programa más adecuado en cada caso. Para los ensayos de transcripción, el diseño de cebadores se basó en SMART PCR y SMART RT, junto con el cebador dT de Clontech. Se sintetizó el ADNc, y se realizó la PCR con los diferentes cebadores utilizados para ADN. Se realizaron amplificaciones utilizando la pareja de cebadores Pv4AF/dT. El cebador dT tenía aproximadamente 16 timinas (concentración, 10µM). Luego se corrió la totalidad de los productos en gel de agarosa (0.8%). Se purificaron y se man-daron secuenciar.

Se amplificaron 6 regiones utilizando el ADN de P. vulgaris como molde, dentro del mismo fragmento conservado antes mencionado, utilizando cebadores degenerados. Se utilizó el pro-grama en el termociclador 9800 Thermal Cycler de Apllied Biosystems para la reacción de PCR, siguiendo un esquema determinado. Los productos de amplificación fueron separados en geles de agarosa (0,8%), visualizados y registrados en el fotodocumentador Gel-DocTM XR de BioRad.

Para eliminar contaminaciones y asegurar la integridad de la muestra, se siguió el proto-colo de Invitrogen. Una vez obtenido el ADNc de las 80 muestras de P. vulgaris Pinto UI 114 y BAT 477, se procedió a amplificar los fragmentos escogidos con los cebadores Pv1AF/Pv1BR. Se amplificó sobre el producto del RT-PCR, utilizando los cebadores PvBacF/PvBacR , ajustando las reacciones al molde inicial con el gen de mantenimiento actina, usando el par de oligos β-actina para los cebadores TITANT One Tube RT-PCR System (Delp et al., 1997).

Las distintas concentraciones de agarosa para la electroforesis, fueron propor- cionales al tamaño de fragmento amplificado. Se usaron las concentraciones de aga-rosa más altas, 1.5% para bandas menores a 500 pares de bases (Sambrook et al., 1998), y los de menor concentración, 0.8%, para los fragmentos más grandes.

Después de separar en agarosa los segmentos, se cortaron los que contenían el fragmento deinterés.ÉstesepurificóconelKitcomercialQuiaexIIGelExtractionKit(150)ysemidiósuconcentración, pureza y rendimiento en una segunda separación en gel de electroforesis. Con unbisturíestérileneltrasiluminadorsecortócadabandayseguardaronenBufferQX.Seresus-pendieronen10µlLdelasílicaQiaexIIconvortexde30s.Seincubarona50ºCdurante10minhasta disolver completamente el trozo de agarosa.

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Se centrifugó y se descartó el sobrenadante. Se lavó una vez el sedimento con buffer QX1, y dos veces con buffer PE, descartando el sobrenadante en ambos ca-sos.

Luego se secó el sedimento al aire libre hasta tomar un color blancuzco, sin dejar secar demasiado. Se eluyó el ADN mezclando con vortex e incubando 5 min a temperatura de laboratorio. Se centrifugó la muestra por 30 s y el sobrenadante fue almacenado a -20º.

Se utilizaron dos variedades de frijol para los estudios de tolerancia a la sequía, B (BAT 477, tolerante) y P(PINTO UI114, susceptible). Dependiendo del tipo de tratamiento y la variedad utilizada se definió PMP (punto de marchitez permanente), S (plantas en sequía), pal (muestra inoculada con palillo) y R (plantas en riego).

Las plantas de frijol fueron inoculadas con M. phaseolina, cepa patogénica HMP5 a los 13 días luego de su siembra. Los muestreos empezaron a los 15 días de siembra y culmin-aron a los 24 días con el muestreo de recuperación. Las muestras fueron enfrentadas a los ensayos de RT-PCR, y amplificaciones sobre ADNc, que se muestran en los puntos anteriores. Los fragmentos de interés fueron sujetos a una reacción de secuenciación (kit comercial BigDye Terminator Sequencing) (Applied Biosys-tems). Los cebadores, Forward y Reverse, se usaron para la secuenciación del fragmento.

Para determinar la secuencia nucleotídica de los fragmentos de ADN, se usó un secuenciador ABI 3130, por el protocolo Big Dye Terminador (v3.1). La preparación y tratamiento de la muestra se realizó por el empaque comercial Cycle Sequencing Kit de Applied Biosystems. Se sometieron a un análisis tipo Blastx frente al banco de datos del NCBI. Los segmentos identificados como TPS se consideraron para el diseño de oligonucleótidos específicos para determinar la secuencia total del gen y para realizar los ensayos de expresión, mostrados en puntos anteriores. Para la medición semicuantitativa de bandas se utilizó la herramienta de volumen del pro-grama Quantify One del fotodocumentador Molecular Imager Gel-DocTM XR deBioRad.(VerQuantifyOneUserGuide).

El ADN molde extraído, con una concentración de 0,800 µg/µL, tuvo el suficiente rendimiento para su uso en los ensayos.

Los productos amplificados fueron: TPS1F/TPS2R (1,2), de tamaño esperado de 300 pb, (Figura 1), con buen rendimiento, aunque con una notable saturación de la reacción de PCR y demasiado fondo inespecífico. Esto pudo deberse a las temperaturas del programa o concentraciones utilizadas en la PCR. Esta inespecificidad no lo hizo un buen candida-to para purificar y secuenciar; por el contrario, el fragmento elegido TPS1F/TPS4R (1,4), mostró una única banda específica en 900 pb (tamaño esperado), sin fondo y con ex-celente rendimiento. Además, el fragmento 1.4 de mayor tamaño, incluye dentro el frag-mento conservado en la base de datos siendo excelente para la secuenciación, en compar-ación con otras TPS y modelos de diseños de otros cebadores más específicos. Los demás fragmentosTPS1F/TPS3R (1,3), TPS2F/TPS3R (2,3), TPS2F/TPS4R (2,4), TPS3F/TPS4R (3,4) co-incidieron en los tamaños esperados, sin embargo, se mostraron inespecíficos. Ninguno de estos fue escogido para la continuación del estudio.


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Se secuenció un fragmento en ambas cadenas, uno de la cadena positiva y otro de la cadena negativa, con los iniciadores elegidos TPS1F y TPS4R respectivamente.

La secuencia obtenida tuvo un total de bases legibles de 823 pb. Al empalmar las secuencias amplificadas por ambos cebadores (TPS1F Y TPS4R), quedó una zona central sin empalmar, para lo que se diseñaron nuevos cebadores utilizados sobre ADNc para conseguir el fragmento com-pleto. Del análisis bioinformático, se derivó que la cadena positiva tenía una identidad del 70% (93/132 aminoácidos) con la trealosa-6-fosfato de Ricinus communis; mientras que la cadena negativa arrojó una identidad de 82% (125/153 aminoácidos) que corresponden a la trealosa-6-fosfato de Ricinus communis. Se puede concluir que la identidad es de 218/235 aminoácidos, correspondiendo a un 75% con la trealosa-6- fosfato sintetasa de Ricinus communis. Los frag-mentos de las cadenas mostraron una región que no se empalmó (Figura 2).

En este punto resulta importante conocer la temperatura de alineamiento con la que el ce-bador se aparea con la hebra de ADN molde. Temperaturas muy bajas provocan un apareami-ento inespecífico que causa un barrido en la corrida electroforética y muestra bandas intensas, que pueden ser falsos positivos, por ejemplo el gel de ADN para elegir el fragmento 1,4 (Fig.1).

Fig 2. Alineamiento de secuencia Base de datos Blastx

Fig. 1. En la fotografía se muestra los distintos fragmentos amplificados: 1,2 (TPS1F/TPS2R); 1,3 (TPS1F/TPS3R); 1,4 (TPS1F/TPS4R); 2,3 (TPS2F/TPS3R); 2,4 (TPS2F/TPS4R); 3,4 (TPS3F/TPS4R).

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Por el contrario, utilizar temperaturas muy altas puede provocar que no se pegue del cebador.

Por otro lado, el tiempo de elongación, también constituyó un factor importante. Para fragmentos de alto peso molecular se recomienda un tiempo de reacción más pro-longado. Por ejemplo, el fragmento 1,4 de 900 pb utilizó 1 minuto de elongación, mien-tras que el fragmento amplificado por Pv1AF y Pv1BR de 240 pb utilizó 30 s. Esto se debe a que la enzima Taq polimerasa sintetiza aproximadamente 1 kb por min, es decir, necesi-ta el tiempo suficiente para polimerizar un fragmento de gran tamaño y menor tiempo para uno pequeño.

Para el ARN total, las muestras presentaron un excelente rendimiento, con el dob-lete característico del ARN ribosomal. Algunas muestras aparecieron degradas, probable-mente por el tiempo de duración de extracción o el estado de las hojas.

Se trata de una de las moléculas más susceptibles a cambios a nivel celu-lar. En la figura 3, se observa el doblete que corresponde a los ribosomas, los dNTP’S sobrantes en la reacción que corren con el frente de corrida semejante a bandas, y muestras degradas, con una enorme mancha al final del frente de corrida. No se observa contaminación con ADN.

En la figura 4, se observan los productos amplificados de los cebadores de los con-troles de β-actina tanto de ADN de P. vulgaris, como de ADNc de los distintos tratamien-tos. Se amplificó un fragmento de 550-600 pb ADN de frijol, mientras que sobre ADNc, un fragmento más pequeño de 490-550 pb (esperado: 585pb). Esto demuestra la difer-encia entre ADN, con presencia de intrones y exones. Mientras que en ADNc sólo vamos a encontrar las regiones codificantes para alguna proteína, es decir, los exones. Los ciclos de 30 y 35 utilizados en la reacción procedieron a la saturación del PCR, reflejado por la banda notablemente gruesa e intensa en gel. El cálculo de la diferencia de volúmenes de las bandas y la medición de la cantidad de ARN presente en cada una de las muestras no pudo determinarse, parámetros necesarios para saber el nivel de expresión del frag-mento de trealosa en los distintos tratamientos.

Fig. 3. Geles de agarosa de ARN extraído.

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Por tanto, se decidió tomar alícuotas de ciclos menores como 20 y 25, donde la concentración de β-actina resultó distinta en cada una de las muestras. El alto rendimiento observado se debió a que los genes de β-actina, son genes de man-tenimiento, indispensables para la vida de toda célula. Se trata de una proteína im-plicada en los microfilamentos de la célula vegetal, además de intervenir en otras importantes funciones en la división celular.

La muestras de ARN para los ensayos de RT-PCR fueron previamente desnaturalizadas, ya que esta molécula tiende a formar estructuras y enlaces intracatenarios muy fácilmente. La combinación Pv1AF/Pv1BR, amplificó un fragmento de 240 pb, como se esperaba y la combinación Pv1BF/4R, amplificó un fragmento de 500 pb, ambas en la prueba sobre ADN genómico. La temperatura de alineamiento (Tm) de 57ºC fue la seleccionada por el mejor rendimiento de los cebadores, en comparación con los otros programas utilizados con Tm más altas. En este programa la banda de 500 pb es única, no siendo así la banda de 240 pb. Además, se observó una banda inespecífica en las 600 pb con menor rendimiento. Esta ban-da podría tratarse de un homólogo del fragmento presente en ADN, y no necesariamente tiene que estar presente en ADNc (Figura 5).

Fig. 4. Gel de agarosa a donde se manifiesta la amplificación del gen de actina. Amplificación sobre el ADN genómico (ADNg/-ac) o en el cADN (cADN/-ac) tomando las muestra a los 30 o 35 ciclos de amplificación.

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Al amplificar utilizando este programa sobre ADNc de las muestras de tratamientos, se observó que sólo apareció el fragmento de 240 pb, más no el 500 pb, probablemente este último no es un fragmento codificante para ARNm, y se encuentra dentro de un intrón del fragmento de interés. Este intrón es amplificado en ADN, es decir, no es tran-scrita.

Fig. 3. Geles de agarosa de ARN extraído.

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Primer muestreo 15 días

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De los estudios de campo, observamos que algunas hojas presentaban pig-mento de hojas secas. Se piensa que por esta razón muchos de los ARNm se encon-traban degradados y no mostraron señal de TPS. Los controles negativos se mues-tran sin bandas, confirmando que efectivamente se amplificó ARN sin contaminación por ADN. La banda obtenida en el gel del muestreo de recuperación de 460 pb no correspondió con la banda de 240 pb esperada, sin embargo se cree que podía tratarse de un gen homólogo a los mensajeros TPS. De la misma después de purificada, concentrada y se-cuenciada se obtuvieron bases legibles desde la 12 hasta la base 360. En el análisis informáti-co no se mostró identidad con los genes de trealosa, pero aparece con alta homología con una proteína de vacuolas (Figura 6). Puede que se esté activando otros genes, que se relacio-nan a conservar agua dentro de la célula.

Los distintos muestreos revelaron una trascripción de trealosa por vía sintética TPS, que va disminuyendo a razón del avance del tiempo de exposición al estrés por déficit hídrico. Esto sugiere que al igual que en Saccharomyces cerevisiae, la trealosa se acumula en las prim-eras etapas de exposición a altas temperaturas, para luego sufrir un rápido decaimiento por degradación de la misma, al transcurrir el tiempo de exposición (Mahmud et al., 2010). Se debe resaltar que en este estudio medimos la expresión de ARNm por la vía biosintética de la enzima trealosa-6- fosfato sintetasa (TPS), y es frecuente encontrar organismos que tienen más de una vía de síntesis de trealosa (Gallardo et al., 2005). Probablemente, la trealosa con-tinúa sintetizándose en una cascada de transcripción de genes involucrados en la tolerancia al estrés hídrico, pero por distintas vías de síntesis a la de TPS (Fernández et al., 2010).

La banda de 460 pb observada correspondiente al muestreo de recuperación (20/10/08), fue secuenciada y comparada en el Blastx del NCBI, dando similitud con una proteína de vacuola. Esto sugiere que la síntesis de trealosa, podría activar otros genes involucrados en la retención de agua en vacuolas dentro de la célula, así como se han observado en organismo que sobreexpresan el gen, los cuáles muestran un 92% de retención de agua (Suárez et al., 2008). Pudiera deberse además, a que la trealosa cumpla su papel como molécula señal para que se restablezca inmediatamente la célula vegetal al primer contacto con el agua, ó se ac-tive la transcripción de genes relacionados con la tolerancia a los distintos estreses. (Gallardo et al., 2005).

Figuras 6. Banda hallada en muestras de recuperación (20/10/08)

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Otras bandas observadas en los geles de agarosa en los controles positivos, pudieron tratarse de genes homólogos de TPS.

No se determinó diferencia en el aumento o disminución en la expresión de trealosa entre las variedades de frijol común BAT 477 y Pinto UI 114. Tampoco fue encontrada la relación entre la infección con Macrophomina phaseolina y la expresión entre las dos varie-dades. Puede que la diferencia entre la tolerancia y susceptibilidad observada en estas var-iedades se deba o implique la expresión de otros genes, que puedan ser independientes a los TPS aquí estudiados.

1. Los genes TPS, representan la clave para la selección y multiplicación de variedades resistentes e incluso de cultivos transgénicos que sobreexpresen el gen. En nuestro estudio, el fragmento 1,4 seleccionado corresponde a una región dentro de un gen de la familia de TPS en P. vulgaris, con el que mostró alta similitud (75%) con la TPS de Ricinus communis.

2. Los cebadores específicos usados sobre ADNc, amplificaron un fragmento de 240 pb y otro de 420 pb. El primero corresponde a una región codificante para proteína, proba-blemente la enzima trealosa-6-fosfato sintetasa. El segundo corresponde a una región con alta similitud a una proteína de vacuola, que podría estar implicada en la recuperación de la planta al contacto con el agua.

3. No queda claro si la expresión o el incremento de la síntesis de trealosa tiene que ver directamente con la tolerancia en variedades resistentes de P. vulgaris, como la BAT 477; o su susceptibilidad a la sequía en la variedad Pinto UI 114. La trealosa se está ex-presando casi por igual, en éstas dos variedades, sin embargo, si se observa una mayor expresión del gen, cuando las condiciones de estrés se presentan inicialmente. Se observó el comportamiento anteriormente citado para trealosa, en las cuales este azúcar aparece durante las primeras etapas de las condiciones de estrés y luego va desapareciendo con el tiempo de exposición, hasta hacerse indetectable.

1. El fragmento escogido para el estudio fue el 1,4 amplificado por la combinación de cebadores TPS1F/TPS4R, los mismos fueron construidos casi a los extremos de la secuen-cia conservada de TPS en plantas, por lo cual era el fragmento con mayor peso molecular. Su tamaño, que encerraba casi toda la secuencia conservada escogida, su ausencia de bar-rido en gel y por lo tanto su alta resolución, indicaba la alta afinidad de los cebadores para amplificarlo por la PCR clásica y lo hace un excelente candidato para seguir utilizándolo en próximos estudios tanto para conocer los extremos flanqueantes del gen como realizar análisis de medición de ARN mensajeros.

CONCLUSIONES

RECOMENDACIONES

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2. En este estudio se probaron ensayos para amplificar fragmentos de TPS sobre el hongo patógeno M. phaseolina, cepa HMP5. Las amplificaciones de ADN por medio de PCR, mostraron bandas de distintos tamaños, las que fueron comparadas con las observadas en P.vulgaris diferentes a las mostradas en los fragmentos de TPS de frijol común (debido a que pueden tratarse de distintas familias de genes), podrían tratarse de fragmentos del gen en el hongo (datos no mostrados). Valdría la pena llevar a cabo, estudios para elucidar qué papel juega el gen de TPS, en las condiciones de co-infección y si efectivamente la TPS, está relacio-nada con su tolerancia a la sequía.

3. En este estudio llevamos a cabo ensayos de restricción y ligación de ADN genómico de P. vulgaris, por los cuales se buscaba conocer por PCR inversa los extremos flanqueantes del gen de TPS. Los resultados mostraron un interesante patrón de bandas con alto peso mo-lecular que podrían tratarse de la parte faltante de este gen. Se recomienda continuar, para lograr secuenciar el gen de TPS completamente. Al igual que la banda de 460 pares de bases encontrada en el muestreo de recuperación, resultaría interesante secuenciarla completa-mente y vislumbrar a que proteínas pertenece verdaderamente.

4. Deberían hacerse ensayos de medición de mensajeros, en hojas tiernas de P. vulgaris, durante las primeras etapas de exposición al estrés. En nuestro estudio, no se logró medir el nivel basal o constitutivo del fragmento de TPS. Esto podría elucidar el comportamiento de la trealosa desde la etapa en cual aún no se ha llegado al punto de marchitez, y cuál es el nivel de expresión que muestra la planta cuando aún no ha sido puesta bajo condiciones de estrés.

5. Continuar en P. vulgaris, investigaciones sobre trealosa sintetizada por otras vías en-zimáticas, por ejemplo, la de trealosa -6- fosfato fosfatasa (TPP), para su expresión.

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“Obtención y aplicación de quitosano”

AUTORES: G. Chong, B. Córdova, M. Correa, M. Cuevas, J. Delgado, A. Tristán Universidad Latina de Panamá

BIO

TECN

OLO

GÍA

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LAQUITINALa quitina, polímero natural que se clasifica dentro del tipo polisacárido, derivado de la celu-losa y es uno de los componentes principales del resistente exoesqueleto de los crustáceos. Este polisacárido, blanco, duro e inelástico, es la mayor fuente de contaminación superficial de las áreas cercanas al mar.

AUTORES: G. Chong, B. Córdova, M. Correa, M. Cuevas, J. Delgado, A. Tristán Universidad Latina de Panamá

RESUMEN ABSTRACT La quitina, polímero natural que se clasifica den-

tro del tipo polisacárido, derivado de la celulosa y es uno de los componentes principales del resistente exoesqueleto de los crustáceos. Este polisacárido, blanco, duro e inelástico, es la mayor fuente de contaminación superficial de las áreas cercanas al mar. Es altamente insoluble en agua y en solventes orgánicos debido a los enlaces de hidrógeno que presenta la molécula. La quitina se vuelve soluble en ácidos inorgánicos diluidos cuando pierde el acetilo del grupo acetilamino, convirtiéndose en quitosano. El quitosano es un polisacárido de ca-dena lineal poco frecuente en la naturaleza, tiene gran potencial y es soluble en soluciones acuosas de algunos ácidos. Es un polímero con propiedades tales como biocompatibilidad, biodegradabilidad, toxicidad nula. Las propiedades del quitosano han permitido su aplicación en una gran variedad de áreas tales como la alimentación, medicina, agri-cultura, cosmética, y farmacia, entre otras. Por esta razón nos propusimos obtener quitosano a partir del exoesqueleto de camarones desechados por el Mer-cado de Marisco. Para ello aislamos y purificamos la quitina mediante un proceso químico de desmine-ralización y desproteinización del exoesqueleto del camarón, obtenido como desecho en el procesa-miento del mismo. Obtuvimos el quitosano a partir de la desacetilación de la quitina aislada, mediante un tratamiento alcalino fuerte, y enunciamos cinco vías de uso del mismo. Con la realización de este proyecto se obtuvo un polisacárido poco común en la naturaleza, el quitosano, siendo este, producto de la desacetilación química de la quitina encontrada en los exoesqueletos del camarón, en forma final de polvo o de hidrogel.

Chitin, a natural polymer that is classified within the polysaccharide derived from cellulose and is one of the main components of resistant exoskeleton of crustaceans. This polysaccharide, white, hard and inelastic is the largest source of surface contamina-tion of the areas near the sea. It is highly insoluble in water and in organic solvents due to the hydrogen bonds present in the molecule. Chitin becomes solu-ble in dilute inorganic acids when it loses the acetyl acetylamino group, turning into chitosan. Chitosan is a polysaccharide of a linear chain, rare in nature. It has great potential and is soluble in aqueous solu-tions of some acids. It is a polymer with properties such as biocompatibility, biodegradability, and none toxicity. The properties of chitosan have enabled its application in a variety of areas such as food, medi-cine, agriculture, cosmetics, and pharmaceuticals, among others. For this reason, we decided to obtain chitosan from the exoskeleton of shrimp discarded by the seafood market. We isolated and purified the chitin by a chemical process of demineralization and deproteinization of the exoskeleton of shrimp, obtained as waste in the processing of it. We ob-tained chitosan from the deacetylation of isolated chitin by means of a strong alkali treatment on it, and we enunciated five ways for using it. With the completion of this project, we got the chitosan an unusual polysaccharide in nature,and this is a pro-duct of the chemical deacetylation of chitin found in the exoskeletons of shrimp, in a final form of powder or hydrogel.

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La quitina es un polímero natural que se clasifica dentro del tipo polisacárido, derivado de la celulosa y es uno de los componentes principales del resistente exoesqueleto de los crustáceos. Normalmente la quitina es blanca, dura, inelástica y es la mayor fuente de contaminación superficial de las áreas cercanas al mar. Es altamente insoluble en agua y en solventes orgánicos debido a los enlaces de hi-drógeno que presenta la molécula. La quitina se vuelve soluble en ácidos inorgánicos diluidos cuando pierde el acetilo del grupo acetilamino, convirtiéndose en quitosano. El quitosano es un polisacárido de cadena lineal poco frecuente en la naturaleza, tiene gran potencial y es soluble en soluciones acuosas de algunos ácidos. Es un polímero con propiedades tales como biocompatibilidad, biodegradabilidad, toxici-dad nula, etc. Las propiedades del quitosano han permitido su aplicación en una gran variedad de áreas tales como la alimentación, medicina, agricultura, cosmética, y farmacia, entre otras.

Estos productos bioquímicos se pueden obtener a partir del tratamiento químico de exoesqueletos del camarón. El quitosano se obtiene por modificación química de la quitina, la cual es tratada con una solución alcalina concentrada y caliente con el fin de retirar la mayor cantidad de unidades acetilo de la estructura del polímero. El polímero que se obtiene posee ciertas características químicas y físicas de gran interés industrial.

En este trabajo se presentan los materiales y métodos necesarios para la produc-ción de quitosano por modificación de la quitina extraída de exoesqueletos de camarones obtenidos en el Mercado del Marisco, para así reducir el efecto de contami-nación y disminuir la cantidad de basura que se genera. A nuestro conocimiento, los exoesqueletos desechados en el Mercado no han sido objeto de estudio con fines de obtener una sustancia útil de gran valor industrial que pueda ser aplicado de manera eficiente.

Tanto el quitosano como sus derivados han presentado excelentes propie-dades físicas y químicas para desarrollar un amplio número de productos con características sumamente interesantes para el sector de la salud. Sus aspec-tos fundamentales tales como sus propiedades muco adhesivas facilitan la libe- ración de los principios activos directamente al tracto nasal o peri oral y las bi-ológicas permiten que el quitosano sea útil para el tratamiento de reconstruc-ción de la piel y las características humectantes y antibactericidas hace que sea útil para personas con quemaduras graves o con problemas de la piel.

El consumo de los crustáceos deja como desechos, aproximadamente, entre el 70 y 80%, considerados contaminantes. Al hacer uso de estos desechos, la presente investigación estaría aportando con el control de la contaminación ambiental. Los desechos pueden aprovecharse para la obtención de dos biopolimeros especializa-dos que ha tomado mucho auge por la infinidad de aplicaciones que ha logrado en-contrárseles, y, especialmente, por su poco impacto ambiental que son la quitina y su derivado funcional, el quitosano. De esta manera se pueden crear productos de mayores valores comerciales y aceptados mundialmente.

INTRODUCCION

ANTECEDENTES

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Ambos biopolímeros están químicamente emparentados; la quitina mediante una reacción de desacetilación que elimine al menos un 50 % de sus grupos acetilo, se convierte en quitosano. Estos dos biopolímeros poseen la ventaja de ser cono-cidos por la naturaleza desde hace millones de años. En efecto, si hacemos caso de infinidad de hallazgos paleontológicos, es posible asignarle a la quitina una edad de al menos 570 millones de años, al haber sido encontrada en el exoesqueleto de artrópodos acuáticos fósiles conocidos como trilobites, que datan de la era paleo-zoica.

Los derivados de quitina tienen un inmenso campo de aplicación con relevante valor económico, por ejemplo en la utilización en la medicina por sus propiedades antimicrobianas y capacidad de retención de humedad. A pesar de las ventajas considerables de usar materiales poliméricos, aún en áreas tan delicados como la medicina, por ejemplo, en el reemplazo de órganos, aún está pendiente resolver problemas como su biocompatibilidad y su biodegradación. En ese sentido la ba-lanza se ha ido inclinando cada vez más por el uso de materiales ya existentes en la naturaleza, o por la modificación fisicoquímica de éstos, con el propósito de lograr su reconocimiento por los principales agentes degradantes naturales, en el caso del medio ambiente, o evitar el temido rechazo, en el caso de implantes quirúrgicos.

En la industria textil, para evitar el encogimiento de los tejidos, el quitosano fija el color de componentes de fibras que se utilizan en la mejora de lanas, impermea-bilización de algodones y linos. En el tratamiento de agua, para removedores de iones metálicos, quelantes de metales de transición y contaminantes ambientales, floculantes, coagulantes y precipitantes de proteínas, aminoácidos, tintes, color-antes, algas, aceites, metales radioactivos, partículas en suspensión y pesticidas. En la industria alimentaria para aditivos en los alimentos, espesantes, gelificantes y emulsionantes, agentes que previene la precipitación del vinagre, aditivos con características nutricionales, aditivos para la alimentación animal, envoltura y re-cubrimiento protector de alimentos, retrasa el envejecimiento, disminuye la oxi-dación, disminuye las perdidas por transpiración y protege frente al ataque de hon-gos, entre otros usos.

En nuestro país no existe ninguna empresa o entidad privada que se encargue de la producción de quitosano en tierras panameñas. Ha habido investigaciones previas apoya-das por el SENACYT para la producción y caracterización de quito-sano, pero ninguna con carácter comercial, dirigida a la producción y venta del producto a nivel nacional e inter-nacional.

Por lo tanto, la presente investigación aportará en lo social y medio ambiental del país; asimismo forma una cadena productiva con la pesca, la preservación del medio ambiente y los consumidores finales.

El problema se crea a partir de la facilidad con la cual se genera desechos, lo cual ha contribuido a incrementar el interés por la búsqueda de opciones de reduc-ción y de aprovechamiento, adquiriendo mayor relevancia la incorporación de pro-cesos de gestión ambiental. Todo proceso productivo no es reconocido solo por la calidad de sus productos, sino también por la calidad total, desde la utilización de materia prima hasta los desechos finales del proceso.

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La industria camaronera no puede hacer caso omiso de las tendencias mundiales ya que esto ha traído consigo un incremento en la cantidad de desechos. Cabezas y exoesqueletos son depositados en vertederos de basura a cielo abierto o en el mar, constituyendo una fuente de contaminación ambiental. Se estima que los desechos de camarón constituyen alrededor del 30% en peso del recurso; en 1994 se produjeron 990 toneladas de desechos y en 1995 1.090 toneladas.

Por otra parte, el camarón destinado al mercado nacional es fuente creciente de desechos debido a cambios en los hábitos de consumo de los pobladores y en la co-mercialización del producto. Los exoesqueletos de cangrejo, langosta y camarón son fuentes importantes de materia prima para producción de quitina y de quitosano. La quitina y el quitosano deben importarse, de allí que se haya dado un impulso para evaluar la posibilidad de utilizar los desechos generados por la industria camaronera para la extraer dichos productos por medio de tratar los desechos.

La mayoría de los países tienen una riqueza de biomasa marina incalculable, pero lamentablemente este recurso se explota muchas veces irracionalmente, sin tomar en cuenta las implicaciones medio ambientales que esta genera. Con la apertura de los mercados, las empresas nacionales del sector farmacéutico se ven en la obligación de dirigir sus esfuerzos hacia la investigación y el desarrollo de productos innovadores, que les permitan mantenerse compitiendo frente a las grandes empresas a nivel mun-dial.

Este estudio plantea la obtención de quitosano a partir de biomasa marina resi-dual, como una alternativa para disminuir la contaminación ambiental producida por los desechos de crus-táceos. La utilización de estos biopolímeros extraídos de las fuentes marinas será la base para el diseño de productos farmacéuticos innovadores en el campo de soportes poliméricos com-patibles para ser utilizados en regeneración de tejidos humanos, como lo es la piel. Por tanto nos proponemos, comprobar que podemos obtener quitosano a partir de la desacetilación de la quitina extraída del exoesqueleto de camarones provenientes del mercado de marisco y utilizarlo en las diferentes líneas de aplicación.

Por esta razón, nos trazamos como objetivo general obtener quitosano a partir del exoesqueleto de camarones desechados por el mercado de marisco.

Como objetivos específicos aislar y purificar quitina mediante un proceso quími-co de desmineralización y desproteinización del exoesqueleto del camarón, obtenido como desecho en el procesamiento del mismo; obtener quitosano a partir de la de-sacetilación de la quitina aislada, mediante un tratamiento alcalino fuerte de ésta; apli-car el quitosano en cinco vías de utilización.

DIA 1: Se viajó al Mercado del Marisco donde se obtuvieron 6 libras de desecho de cama-

rón, separados de cáscaras de cabeza, patas y cola.Las 6 libras se lavaron tenazmente con abundante agua para eliminar cualquier residuo

orgánico, esto se hizo en 3 tanques de lavado en cadena, con cambios de agua al ver el agua muy turbia. Todo este proceso tomó 5 h, de 6 libras de desechos se


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obtuvo 1 libra de cáscara: limpia, suave, de color casi transparente y se procedió a congelar por 3 días. Y se sacaron del congelador la noche anterior al secado.

DIA 2 Las cáscaras se calentaron dentro de un vaso químico en un plato caliente a 225ºC,

a esta temperatura se calentaban y se ponían duritas, tostadas. Después de secar los exoesqueletos se van a pasar en porciones pequeñas al mortero de porcelana donde se van a triturar hasta llegar a hojuelas muy pequeñas y finas. Al final del tamizado se obtuvo 108 g de polvo, a partir de 1 libra de cáscara lavada.

DIA 3De los 108g de polvo de cáscara se tomaron 20 g y se colocara en un vaso que contiene

una solución de HCl 0.6N en una relación 1:11 sólido-líquido a una tempe-ratura de 28ºC-30°C durante 3 h con agitación constante. Al final del proceso se obtuvo un sólido al fondo del vaso. Se decantó el líquido.

El sólido obtenido se trató utilizando NaOH 1% durante 3 horas de agitación constante a 65ºC. Al no saber la cantidad de NaOH 1% a utilizar se procedió a agregar poco a poco el hidróxido y se fue midiendo el pH hasta llegar a de 10.7, que se consiguió con 85 mL. Después de las 3 horas se obtiene una masa desproteínizada.

El material desproteinizado se filtró a vacío, este lavado y filtrado al vacío se da hasta que el agua filtrada sea tranparente. El producto final de estos cinco pasos es la Quitina. Para ello se realizó una prueba de caracterización de azúcares conreactivo de Molish y ácido sulfúrico, la prueba dio positiva al observar la aparición de un anillo morado.

DIA 4Se pesaron 8 g de la quitina obtenida y se vertió en un vaso químico con 32 mL de

NaOH al 50% en una relación 1:4 sólido líquido y se calentó primero por 2 horas a 60°C. Al terminal las 2 horas se hizo secado al vacío con agua destilada. Se procedió a añadir otros 32 mL de NaOH al 50% y se calentó por 1,5 h, sin agitación a 100°C. Al cabo de las 2 horas sehizoelúltimolavadoalvacío.ElproductoobtenidofueelQuitosano,quesepresentócomo una especie de cristal, color blanco, aceitoso y brillante. Se realizó una prueba de caracterización de polisacáridos con Lugol y la prueba dio positiva al observar un color chocolate.

DIA 5, 6 y 7. Se empezó el segundo ciclo de producción de Quitosano utilizando el resto de

la cáscara pulverizada. Todos los procesos se realizaron de igual manera.

DIA 8.En el Laboratorio de Residuos Tóxicos del MIDA se procedió a lavar con agua destilada

el producto en un filtrado a presión hasta obtener un pH neutro. Al medir el pH la primera vez del producto, este era de 9.61. Después de varios lavados con un total de 500 mL se llegóalpH7.0.Elresultadodelamuestrafinalfuede59gdeQuitosanopurificadoapartirde76gdeQuitina.

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Uso como Antimicrobiano.

Se procedió a hacer cultivos de diferentes bacterias, a los cuales se le aplicaron discos de papel filtro empapados en soluciones de quitosanos diluido en ácido acético al 30% y un con-trol de ácido acético al 30%. Las concentraciones utilizadas fueron 01 mg/mL, 0.5 mg/mL, 1.0 mg/mL, 2.0 mg/mL, 2.5 mg/mL.

Una vez terminado los procesos químicos para transformar las cascara de camarón a quitina y posteriormente la desacetilación de la misma, se obtuvo el producto es-perado, el quitosano, como un polvo fino de color blanco.

Las pruebas de caracterización con lugol, específica para polisacáridos, resultaron positivas, al igual que la prueba con el reactivo de molish que es una prueba general para azúcares.

Al producto se le procedió a realizar pruebas de espectrofotometría infrarroja en el Insituto Especializado de Análisis (I. E. A.) de la Universidad de Panamá. Se realizó la prueba de cenizas en la cual se obtuvo un resultado de 0.19 % (g / 100 g) y la identificación de la señal en el es-pectrofotómetro infrarrojo FTIR (Fourier Transform Infrared Spectrophotometer) coincidio con el patrón, en un pico a 2886.60 (cm-1), pico característico del quitosano según la literatura (Hernández y col. (2009). El quitosano patrón fue proporcionado por COMACO.

La actividad antimicrobiana mostrada en la tabla 1 y en la figura 4 pudo deberse a la inter-acción electrostática entre los grupos amino del quitosano y los sitios aniónicos de las paredes celulares bacterianas con restos de ácidos carboxílicos y fosfolípidos. En el caso de E. coli, la ac-ción bactericida del quitosano se explica por la unión de los policationes del polímero con los aniones de la superficie bacteriana, alterando la permeabilidad de la membrana, de la glucosa y lactato deshidrogenasa.

Tabla No. 1: Diámetro del halo en centímetros producidos por Quitosano en el Anti-biograma


*No hubo crecimiento

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Figura 4: Antibiograma de quitosano diluido a diferentes concentraciones de ácido acético al 30%

Con la realización de este proyecto se obtuvo un polisacárido poco común en la naturaleza, el quitosano, siendo este, producto de la desacetilación química de la quitina encontrada en los exoesqueletos del camarón, en forma final de polvo o de hidrogel.

Los beneficiarios finales serán los seres humanos, ya que el quitosano se podría utilizar en diferentes áreas de uso común para hombre, como la medicina, la estética y cosmética. Los agricultores podrán utilizar quitosano para la mejora de sus cose-chas, también los científicos podrían utilizar este producto en el campo de los bio-sensores, tanto de macro como de nano partículas.

CONCLUSIONES

POSIBLES BENEFICIARIOS

Klebsiella sp. E. coli Pseudomonas sp. S. pyogenes S. auereus

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BIBLIOGRAFÍA092SALUDLATINA

AUTORES: Josué Young1,2, Marlon Núñez2, Johanna Juliao2, Thiago Vial2, Cirilo Lyons1, Mario Urriola3, Olmedo Otero1,2,Omar Dupuy2

1Instituto Conmemorativo Gorgas de Estudios de la Salud, Rep. de Panamá.2Instituto de Investigaciones en Biotecnología y Ciencias Biomédicas, Escuela de Biotecnología, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Latina de Panamá, Rep. de Panamá. 3Serpentario Maravillas Tropicales, Valle de Antón, Rep. de Panamá.

Producción de antisuero murino contra veneno de Bothrops asper y Porthidium lansbergii

Los envenenamientos por mordeduras de serpi-entes constituyen un problema de salud pública en Pan-amá. Las serpientes de la familia Viperidae son las prin-cipales causantes de los accidentes ofídicos en nuestro país. Existen limitaciones técnicas para la identificación y cuantificación del veneno de serpiente en sangre. El objetivo de esta investigación fue obtener antisuero murino contra el veneno de las serpientes Bothrops as-per y Porthidium lansbergii, que será evaluado en futuros inmunoensayos. Las giras de colectas fueron realizadas a Punta Soropta, Bocas del Toro y El Valle de Antón, Coclé. Se capturaron 10 B. asper y 5 P. lansbergii y se les realizó la extracción del veneno. Ratones Balb/c fueron inocu-lados intraperitonealmente con 100 ml de veneno de B. asper (días 0, 7, 14, 26, 33) y P. lansbergii (días 0, 7, 19, 26, 37) diluido 1:1000, se extrajeron muestras de sangre se-manalmente y se separó el suero. Se realizaron pruebas de ELISA utilizando los sueros de los ratones inoculados y el veneno de las serpientes. Los resultados muestran que los sueros murinos obtenidos a partir del día 7 post-inmunización con veneno de B. asper, reconocieron (p <0.001) el veneno de esta serpiente en un ELISA. Los su-eros de los ratones inoculados con veneno de P. lansber-gii, reconocieron el veneno correspondiente a partir del día 19 post-inmunización (p <0.001). En conclusión, los sueros obtenidos de ratones inoculados con veneno de B. asper y P. lansbergii reconocen el veneno de estas ser-pientes en un ELISA. En la siguiente etapa de esta investi-gación, estos antisueros serán ensayados en el desarrollo de inmunoensayos, para la detección de venenos de B. asper y P. lansbergii en suero.

Envenoming by snake-bite is a public health prob-lem in Panama. Snakes of the Family Viperidae are the main causes of the snake-bites in our country. There are technical limitations for the identification and quantifi-cation of snake venom in blood. The aim of this research was to obtain murine antiserum against the venom from snakes Bothrops asper and Porthidium lansbergii, which will be evaluated in future immunoassays. Tours of col-lections were carried out at Punta Soropta, Bocas del Toro and El Valle de Antón, Coclé. Ten B. asper and five P. lansbergii were captured and the extraction of venom was performed. Balb/c mice were intraperitoneally in-oculated with 100 ml of venoms from B. asper (days 0, 7, 14, 26, 33) and P. lansbergii (days 0, 7, 19, 26, 37) diluted 1:1000, blood samples were weekly extracted and serum was separated. ELISA tests using sera from inoculated mice and the venom from the snakes were performed. Results show that murine sera obtained from day 7 post-immunization with venom from B. asper recognized (p < 0.001) venom from this snake in ELISA. The sera from inoculated mice with the venom from P. lansbergii, rec-ognized the corresponding venom from day 19 post-im-munization (p < 0.001). In conclusion, the sera obtained from inoculated mice with venom from B. asper and P. lansbergii recognizes these snake venoms. In the next part of this research, these antisera will be tested in the development of immunoassays for the detection of ven-oms from B. asper and P. lansbergii in serum.

RESUMEN ABSTRACT

BIO

TECN

OLO

GÍA

093SALUDLATINA

Palabras claves: Veneno, antisuero, serpientes, ELISA, Bothrops asper, Porthidium lans-bergii.

Los accidentes ofídicos en Panamá se estiman en unos 2 000 casos anuales (Gutiérrez et al., 2007; Lomonte, 2012), por lo que constituyen un problema de salud pública en nues-tro país, especialmente en las áreas rurales. Las serpientes de la familia Viperidae son las principales causantes de los envenenamientos por mordeduras de ofidios en territorio pa-nameño (Bolaños, 1982). Los venenos de los vipéridos (como Bothrops asper y Porthidium lansbergii, entre otros) pueden producir manifestaciones locales que incluyen edema, do-lor, hemorragia, dermonecrosis, mionecrosis y formación de ampollas (Gutiérrez y Lomonte 1989, Nishioka y Silveira 1992), y manifestaciones a nivel sistémico como alteraciones de la coagulación, trombocitopenia, sangrados a distancia, equimosis, hipotensión e insuficien-cia renal (Barrantes et al., 1985; Kamiguti et al., 1991; Cardoso et al., 1993). La detección y medición de veneno de serpiente en sangre es importante para confirmar la identificación de la serpiente, determinar si se administró suficiente antiveneno, detectar la recurrencia de envenenamiento y en investigación forense, sin embargo, a menudo no existe la disponibi-lidad técnica para la identificación y cuantificación del veneno de serpiente en sangre (Kula-wickrama et al., 2010). El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) es un método eficiente para la detección de veneno de serpiente (Theakston, 1983; Chavez-Olortegui et al., 1993) y podría ser útil para el seguimiento de la cinética de distribución de los antígenos ofídicos en pacientes o animales envenenados (Núñez Rangel et al. 2012).

El objetivo de esta investigación fue obtener antisuero murino contra el veneno de las serpientes B. asper y P. lansbergii, con miras a determinar, en inmunoensayos futuros, los niveles séricos de veneno de estas serpientes en envenenamientos ofídicos.

MATERIALES Y METODOSAnimales

Ratones BALB/c machos de entre 5-8 semanas de edad y ~20 g de peso fueron manteni-dos en condiciones ambientales estándares. Los ratones fueron alimentados con una dieta de “pellet” estándar y agua ad libitum.

Las serpientes fueron capturadas durante la realización de cinco giras de colectas, una de las giras fue realizada a Punta Soropta, Bocas del Toro, y las otras cuatro a El Valle de Antón, Coclé. En estas giras se colectaron 10 ejemplares de B. asper (Figura 1A) y 5 ejem-plares de P. lansbergii (Figura 1B). Los especímenes colectados fueron mantenidos en cau-tiverio en terrarios acondicionados según las necesidades de las serpientes, para lo cual se incluyó un bebedero para cada animal. Las serpientes fueron alimentadas de acuerdo a las preferencias de cada especie.

INTRODUCCION

094SALUDLATINA

Obtención del venenoLa extracción del veneno de las serpientes B. asper y P. lansbergii se realizó por medio

del método tradicional de ordeño, el cual consistió en forzar la mordida de cada serpiente a través de un guante que cubría la boca de un recipiente colector mientras se exprimían manualmente las glándulas de veneno del animal. El veneno colectado de cada serpiente se mezcló en un “pool” y fue congelado a -20°C hasta que fue utilizado.

Toxicidad Ratones BALB/c fueron inyectados intraperitonealmente (i.p.) con 100 mL de veneno de B. asper y P. lansbergii diluido 1:1, 1:10, 1:100 y 1:1000 en solución salina estéril. Los ani-males fueron observados diariamente durante 72 h para detectar signos de toxicidad (dis-minución de la actividad y muerte). Las inmunizaciones descritas más adelante se realizaron a partir de veneno de serpiente diluido 1:1000.

Producción de Antisuero Veinte ratones BALB/c fueron distribuidos al azar en cuatro grupos. El primer grupo, fue inoculado i.p. con 100 mL de veneno de B. asper diluido 1:1000 en solución salina esté-ril, siguiendo el esquema que se muestra en la tabla 1.

Tabla 1. Esquema de inmunización de ratones BALB/c con veneno de B. asper.

Día Cantidad de Veneno (mL) Cantidad de Adyuvante (ml)0 0.5 99.5 (Adyuvante Completo)7 1.0 99 (Adyuvante Incompleto)14 1.0 99 (Adyuvante Incompleto)26 1.5 98.5 (Adyuvante Incompleto)33 1.5 98.5 (Adyuvante Incompleto)

El segundo grupo de ratones (control) fue inyectado i.p. sólo con 100 ml de solución salina estéril los días 0, 7, 14, 26 y 33.El tercer grupo de ratones fue inoculado i.p. con veneno de P. lansbergii siguiendo el esque-ma que se muestra en la tabla 2.

Tabla 2. Esquema de inmunización de ratones BALB/c con veneno de P. lansbergii.Día Cantidad de Veneno (mL) Cantidad de Adyuvante (ml)0 0.5 99.5 (Adyuvante Completo)7 1.0 99 (Adyuvante Incompleto)19 1.0 99 (Adyuvante Incompleto)26 1.5 98.5 (Adyuvante Incompleto)37 1.5 98.5 (Adyuvante Incompleto)

095SALUDLATINA

El cuarto grupo de ratones (control) fue inyectado i.p. sólo con 100 mL de solución salina estéril los días 0, 7, 19, 26 y 37.

Se extrajeron semanalmente 500 mL de sangre de la región retroorbital de cada ratón, desde el día 0 hasta el día 40 post-inmunización. Las muestras de sangre fueron centrifugadas a 14 000 rpm por 10 min y el plasma fue congelado a -20°C hasta su posterior utilización.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA)

Los sueros de los ratones inoculados con veneno de B. asper y los de los ratones controles fueron ensayados en un ELISA. Para ello, se diluyó 0.5 ml del veneno de B. asper en 49.5 mL de solución tampón de recubrimiento (Sigma, EE.UU) por pocillo, y se incubó toda la noche a 4°C. Los platos fueron lavados cuatro veces con Tween 20 (AppliChem, Alemania) al 0.1% en solución salina tampón de fosfato pH 7.4 (PBS, Sigma, EE.UU). Luego, los platos fueron cubi-ertos con PBS que contenía 5% de leche en polvo y se incubaron durante 1 h a 37°C. Posteri-ormente, se lavaron cuatro veces con PBS-Tween y se agregó en cada pocillo 100 mL de suero de los ratones inoculados, diluido 1:50 en PBS que contenía leche descremada al 5%. Seguid-amente, los platos fueron incubados durante 1 h a 37°C y se lavaron con PBS-Tween. Luego, se agregó en cada pocillo 100 ml de anticuerpos anti-IgG de ratón marcados con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch, EE.UU), diluida 1:5000 en PBS que contenía 5% de leche en polvo. Posteriormente, los platos fueron incubados durante 1 h a 37°C y luego fueron lavados con PBS-Tween y se agregó 100 mL de una solución de o-fenilenediamina (Sigma, EE.UU) a 2 mg/mL en solución tampón de fosfato de potasio al 0.01 M, pH 7.3 (Sigma, EE.UU) en presencia de peróxido de hidrógeno (Fischer Scientific, EE.UU) al 0.06%.

La reacción se desarrolló durante 10 min a 37°C en oscuridad. Luego de lo cual se detuvo añadiendo HCl al 1 M por pocillo y se midió la absorbancia a 492 nm con un lector de platos de microtitulación (HumanReader HS, Alemania).

Los sueros de los ratones inoculados con veneno de P. lansbergii y los de los controles también fueron ensayados en un ELISA utilizando veneno de P. lansbergii, siguiendo la me-todología descrita arriba.

Adicionalmente, se realizaron inmunoensayos para determinar si los sueros de los ratones inmunizados con veneno de B. asper reconocían el veneno de P. lansbergii y viceversa.

Análisis estadístico

Los datos fueron evaluados por medio de un análisis de varianza (ANOVA). Los resultados se presentan como el promedio de las absorbancias ± la desviación estándar. P < 0.05 fue considerado como nivel de significancia estadística.

RESULTADOS Las inoculaciones realizadas con diluciones 1:1, 1:10 y 1:100 de veneno de B. asper y P.

lansbergii causaron la muerte de los ratones. Los animales inmunizados a partir de diluciones de veneno 1:1000 sobrevivieron todo el estudio.

096SALUDLATINA

Los sueros murinos obtenidos a partir del día 7 post-inmunización con veneno de B. asper, reconocieron (p < 0.001) el veneno de esta serpiente en un ELISA (Figura 2). En el caso de los ratones inoculados con veneno de P. lansbergii, los sueros obtenidos a partir del día 19 post-inmunización (p <0.001) reconocieron el veneno correspondiente (Figura 3).

Los sueros de los ratones inmunizados con veneno de B. asper reconocieron el veneno de P. lansbergii y viceversa

Figura 1. Especímenes colectados de A. Bothrops asper (Equis) y B. Porthidium lansber-gii (Patoca).

Figura 2. Promedio de las absorbancias registradas desde el día 0 hasta el día 40 por medio de un ELISA realizado con antisuero murino post-inoculación con veneno de B. asper. Desde el día 7, se observa un incremento en la absorbancia de los ratones inmuni-zados con veneno de B. asper a diferencia de los ratones controles no inmunizados. * P < 0.001. Sueros 1:100, Conjugado 1:5000, Sustrato OPD 2 mg/mL, H2O2 0.06%.

097SALUDLATINA

Figura 3. Promedio de las absorbancias registradas desde el día 0 hasta el día 37 por medio de un ELISA realizado con antisuero murino post-inoculación con veneno de P. lans-bergii. Desde el día 19, se observa un incremento en la absorbancia de los ratones inmuni-zados con veneno de P. lansbergii a diferencia de los ratones controles no inmunizados. * P <0.001. Sueros 1:100, Conjugado 1:5000, Sustrato OPD 2 mg/mL, H2O2 0.06%.

Las variaciones geográficas de los componentes del veneno de los ofidios, demandan el desarrollo de pruebas inmunodiagnósticas regionales, específicas para las serpientes que habitan una región determinada (Brunda et al., 2006; Núñez Rangel et al., 2012).

Existen reportes de trabajos realizados en otros países, que demuestran que es posible la utilización de inmunoensayos, para la detección de veneno de serpientes con fines di-agnósticos (Theakston, 1983; Cox et al., 1992; Chavez-Olortegui et al., 1993, Kulawickrama et al., 2010, Núñez Rangel et al., 2012).

Esta investigación forma parte de un proyecto destinado a desarrollar un método para la detección del veneno de B. asper y P. lansbergii en suero. La identificación de la serpi-ente involucrada en el accidente ofídico, permite la selección del antiveneno específico correcto (Núñez Rangel et al., 2012).

Los antisueros murinos contra B. asper y P. lansbergii podrían ser utilizados en el dis-eño de un dispositivo que detecte los niveles séricos de los venenos de B. asper y P. lans-bergii en víctimas de accidentes ofídicos y en animales envenenados experimentalmente.

Resultó evidente que la inmunización de los ratones con veneno de B. asper se alcanzó antes que la realizada con veneno de P. lansbergii, esto podría deberse, al menos en parte, a diferencias en la inmunogenicidad de los componentes de los venenos de ambas serpi-entes.

El hecho de que los sueros de los ratones inmunizados con veneno de B. asper recono-cieron el veneno de P. lansbergii y viceversa, podría deberse a que ambos venenos poseen algunos inmunógenos similares y/o a reacción cruzada.

DISCUSIÓN

098SALUDLATINA

El desarrollo de inmunoensayos para la detección del veneno de B. asper y P. lansber-gii podría contribuir a mejorar el diagnóstico y tratamiento de los accidentes ofídicos en Panamá.

En conclusión, los sueros obtenidos de ratones inmunizados con veneno de B. asper y P. lansbergii reconocen el veneno de estas serpientes. En la siguiente etapa de esta inves-tigación, estos antisueros serán ensayados en el.

AGRADECIMIENTOS Agradecemos a la Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT)

por financiar esta investigación.

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100SALUDLATINA

AUTOR: Nicole R. Fish M.

Panasonic Latin America; Panamá, Panamá.

“Gimnasia laboral aplicada a la disminución del estrés laboral y mejora del desempeño en los colaboradores de Panasonic Latin America”

La Gimnasia Laboral (GL) es una técnica de cinesiterapia en donde se aplica ejercici-os en el área de trabajo de un individuo. Este estudio se realizó con el objetivo de realizar ejercicios en el puesto de trabajo en corto tiempo sin generar gastos de tiempo ni din-ero al empleador de quien lo práctica. Para ello, se elaboró un programa de GL para la empresa Panasonic Latin America PLA con el propósito de que los realizaran 3 veces dia-rias 6 ejercicios, con ello comprobar al cabo de 8 semanas que disminuye el estrés en es-tas personas y mejora su desempeño labo-ral. Participaron de este estudio 21 personas para conseguir un 85% de acertamiento. Se realizó una encuesta al inicio y al final del estudio. Para 136, la evaluación del estrés se realizó la suma de las ponderaciones en donde se clasifico el estrés como nulo, poco o mucho. El inicio en relación al final del es-tudio es que en su mayoría migraron hacia lo positivo hablando del estrés. Al final, logra-mos comprobar que se disminuye el estrés con tan solo 18 min de ejercicio diario aprox-imadamente y se mejoró el desempeño lev-emente.

The Labor Gymnastics (L.G.) is a kinesitherapy technique in which exercise is done at the work place of an individual. This study was conducted with the purpose of encouraging exercise in the workplace taking a short period without generating costs, in both time and money for the employer of the personnel. These L.G programs were developed for the company Panasonic Latin America PLA. The plan included to do six kinds of exercises, three times a day, with a follow up. After eight weeks we found that stress was reduced on these people and their job performance had improved. The study group of 21 people resulted in approximately 85% of improvement. A survey was conducted at the beginning and end of the study. For the evaluation of stress, it was classified as a lot, little or none. Over the course of the study it was found that most participants mi grated from the negative state to the positive one. At the end of the study we saw that with only 18 minutes of daily exercise, an improvement in both stress reduction and production was obtained.

RESUMEN ABSTRACT

Key Words Labor Gymnastics, stress at work, sedentary work, job performance, physical self.

Palabras Claves Gimnasia Laboral, Estrés laboral, sedentarismo laboral, Desempeño Laboral, au-togestión física.

Fis

iote

rapi

a

101SALUDLATINA

La gimnasia laboral es una nueva disciplina que busca prevenir las lesiones y dolores posturales, que repercute en la disminución del estrés y motiva a los em-pleados de una empresa a través de estiramientos, ejercicios de balance y coordi-nación que serán llevados a cabo en el área de trabajo durante cortos períodos de tiempo.

Este proyecto llevó como misión central, la prevención de los problemas laborales producidos por estrés en los colaboradores de Panasonic Latin America y como objetivos la poca “pérdida de tiempo laboral” por parte de los colabora-dores que quisieran participar. Estuvo conformado por tres fases de aplicación que fueron:

La capacitación del programa La supervisión de los ejercicio in situs laboral La recolección de los datos

Se muestra por parte de colaboradores y de la empresa un gran entusiasmo por la aplicación de dicho programa.

Folleto Invitación, Presentación en Power Point de la capacitación, programa de GL para PLA, cuadros de supervisión.

En 21 personas se aplica un programa de gimnasia laboral para disminuir el es-trés laboral y mejorar el desempeño al cabo de 8 semanas.

Con una intensidad media y una mediana de 18 ejercicios diarios, durante 8 sema-nas en el puesto de trabajo, se logró que mejorara el estrés en los empleados en un 80% aproximadamente.

Al igual que en el estrés la mayoría de los colaboradores que participaron del estudio mejoraron su desempeño laboral en casi un 90%.

INTRODUCCION

MATERIALES

MÉTODOS

RESULTADOS

102SALUDLATINA

Los ejercicios a corto tiempo aplicados en el puesto de trabajo funcionan para disminuir el estrés en los empleados de una empresa y a mejorar su desempeño laboral.

Agradezco al profesor Rudy Quijano y Flia. que me apoyaron en todo momento,a mi Flia. que siempre fueron mis pilares para alcanzar esta meta. Y a mis com-pañeras porque juntas superamos esta etapa.

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DISCUSIÓN

AGRADECIMIENTOS

BIBLIOGRAFÍA

103SALUDLATINA

Revista Salud Latina 2013

issn 1726-7196 ediciÓn#003 junio 2013 salud...

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