isolamento e manipulaÇÃo de um gene isolamento e... · preparar o gene ou dna a ser usado...
TRANSCRIPT
![Page 1: ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Isolamento e... · Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022042812/5fb214ef8b2d985c361cadab/html5/thumbnails/1.jpg)
ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO
DE UM GENE
![Page 2: ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Isolamento e... · Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022042812/5fb214ef8b2d985c361cadab/html5/thumbnails/2.jpg)
ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO
DE UM GENE
• Importância da Engenharia Genética
• Diversidade biológica X Diversidade gênica
•Etapas básicas da Clonagem
•Escolha e amplificação do gene
•Digestão do DNA com Enzimas de Restrição
•Escolha e Estrutura dos plasmídeos
•Ligação dos Insertos
•Transformação de um organismo
•Selecionar os organismos modificados
![Page 3: ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Isolamento e... · Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022042812/5fb214ef8b2d985c361cadab/html5/thumbnails/3.jpg)
Importância da Engenharia Genética
Análises de DNA (paternidade, forense, predisposição a doenças).
Melhoramento de culturas e maior produtividade de alimentos (transgênicos).
Produção de Vacinas e Medicamentos Imuno-Biológicos.
Melhoramento de Processos Industriais (áreas de energia, meio ambiente etc)
Volume 409 Number
6822
Pages 745-964
15 February 2001
Vol 291, Issue
5507,
Pages 1145-1434
16 February 2001
Quebra-cabeças de
bilhões de peças...... que montam uma
peça.
![Page 4: ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Isolamento e... · Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022042812/5fb214ef8b2d985c361cadab/html5/thumbnails/4.jpg)
Homo sapiens Arabidopsis thaliana Mus musculus Caenorhabitis elegans Drosophila melanogaster
Mycobacterium leprae Vibrio cholerae Plasmodium falciparum Mycobacterium tuberculosis Neisseria meningitidis
Helicobacter pyroli Xylella fastidiosa Bacillus subtilis Chlamydia pneumoniae Pseudomonas aeruginosa
E. coli Saccharomyces cerevisiae Yersinia pestis Salmonella enterica Schizosaccaromyces pombe
Div
ers
idad
e B
ioló
gic
a
![Page 5: ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Isolamento e... · Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022042812/5fb214ef8b2d985c361cadab/html5/thumbnails/5.jpg)
Diversidade Biológica X Diversidade gênica
![Page 6: ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Isolamento e... · Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022042812/5fb214ef8b2d985c361cadab/html5/thumbnails/6.jpg)
(HAR1) Human Accelerated Region 1
A região HAR1, assim como 98,5% do
nosso genoma, não codifica nenhuma
proteína
Em 6 milhões de anos a evolução
mudou 1% do genoma
![Page 7: ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Isolamento e... · Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022042812/5fb214ef8b2d985c361cadab/html5/thumbnails/7.jpg)
Etapas básicas da Clonagem
Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão).
Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA capaz de auto replicar-se).
Essas moléculas geralmente são plasmídios ou DNA viral.
Ligar, covalentemente, estes 2 fragmentos de DNA. A enzima que faz esta ligação
entre o vetor de clonagem e o DNA a ser clonado é a DNA ligase. Esse DNA
composto de moléculas de origem diferente é chamado de DNA recombinante ou
DNA quimérico.
Transferir o DNA recombinante do tubo de ensaio para uma célula hospedeira
que emprestará sua maquinaria enzimática para a replicação deste DNA.
Selecionar ou identificar as células hospedeiras que contém o DNA recombinante.
![Page 8: ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Isolamento e... · Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022042812/5fb214ef8b2d985c361cadab/html5/thumbnails/8.jpg)
Etapas básicas da Clonagem
![Page 9: ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Isolamento e... · Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022042812/5fb214ef8b2d985c361cadab/html5/thumbnails/9.jpg)
Escolhas Iniciais e Preparação
mRNA
•Purificar o mRNA
•Transcrição reversa (mRNA → cDNA)
DNA
•Purificar o DNA
Amplificação da região ou gene de interesse
DNA
•Purificar o DNA
Digestão do DNA
Clonagem de genes ou trechos de DNA Clonagem de todo o DNA
![Page 10: ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Isolamento e... · Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022042812/5fb214ef8b2d985c361cadab/html5/thumbnails/10.jpg)
Transcrição Reversa
•Molde a ser transcrito reversamente (mRNA)
•Transcriptase reversa
•Primer (oligonucleotideo dT = TTTTTTTTTTTT)
•dNTPs (ATP, CTP, TTP, GTP)
•Tampão adequado
![Page 11: ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Isolamento e... · Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022042812/5fb214ef8b2d985c361cadab/html5/thumbnails/11.jpg)
Amplificação de DNA(PCR – Reação em cadeia da polimerase)
•Molde de DNA a ser copiado
•DNA polimerase
•Primers (senso e anti-senso)
• dNTPs (ATP, CTP, TTP, GTP)
•Tampão adequado
![Page 12: ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Isolamento e... · Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022042812/5fb214ef8b2d985c361cadab/html5/thumbnails/12.jpg)
Digestão de DNA(Endonucleases)
•DNA a ser digerido
•Endonuclease
•Tampão adequado
![Page 13: ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Isolamento e... · Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022042812/5fb214ef8b2d985c361cadab/html5/thumbnails/13.jpg)
Análise de fragmentos de DNA(eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida)
•DNA já digerido ou produto de amplificação
•Tampão adequado
•Aplicação no gel e início da corrida (corrente
elétrica)
•Visualização usando molécula fluorescente à luz
UV que liga no DNA (brometo de etídeo)
![Page 14: ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Isolamento e... · Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022042812/5fb214ef8b2d985c361cadab/html5/thumbnails/14.jpg)
Análise de fragmentos de DNA(eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida)
![Page 15: ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Isolamento e... · Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022042812/5fb214ef8b2d985c361cadab/html5/thumbnails/15.jpg)
Southern e Northern Blot(Identificação de DNA e mRNA em membranas de nylon)
Fragmentos de DNA (ou RNA) separados por peso molecular usando-se eletroforese
em gel são transferidos para membranas.
• A técnica, quando usada para DNA, é chamada de Southern Blot
• A técnica, quando usada para RNA, é chamada de Northern Blot
![Page 16: ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Isolamento e... · Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022042812/5fb214ef8b2d985c361cadab/html5/thumbnails/16.jpg)
Southern e Northern Blot
![Page 17: ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Isolamento e... · Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022042812/5fb214ef8b2d985c361cadab/html5/thumbnails/17.jpg)
Fingerprint de DNA
![Page 18: ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Isolamento e... · Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022042812/5fb214ef8b2d985c361cadab/html5/thumbnails/18.jpg)
Relembrando as etapas iniciais da clonagem
mRNA
•Purificar o mRNA
•Transcrição reversa (mRNA → cDNA)
DNA
•Purificar o DNA
Amplificação da região ou gene de interesse (PCR)
Conferência usando eletroforese
DNA
•Purificar o DNA
Digestão do DNA
Conferência usando eletroforese (só se oriundo de 3)
Clonagem de genes ou trechos de DNA Clonagem de todo o DNA
1 2 3
![Page 19: ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Isolamento e... · Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022042812/5fb214ef8b2d985c361cadab/html5/thumbnails/19.jpg)
Etapas seguintes da clonagem
Digestão do DNA Digestão do plasmidio
Ligação
Transformação
Seleção
![Page 20: ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Isolamento e... · Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022042812/5fb214ef8b2d985c361cadab/html5/thumbnails/20.jpg)
Ligação(escolha do vetor - plasmídeo)
![Page 21: ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Isolamento e... · Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022042812/5fb214ef8b2d985c361cadab/html5/thumbnails/21.jpg)
Ligação(pontas coesivas e não coesivas)
![Page 22: ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Isolamento e... · Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022042812/5fb214ef8b2d985c361cadab/html5/thumbnails/22.jpg)
Transformação e Seleção(inserção dos vetores em outros organismos)
As bactérias ainda são os
organismos mais usados para
clonar DNA heterólogo
A seleção pode ser feita pela
habilidade de sobreviver a
antibióticos ou crescer em meios
de cultura pobres em algum
aminoácido ou nutriente
![Page 23: ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Isolamento e... · Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022042812/5fb214ef8b2d985c361cadab/html5/thumbnails/23.jpg)
Outras Técnicas: Biblioteca genômica
Uso de
bacteriófagos como
vetores: o fago λ
tem DNA de dupla
fita
![Page 25: ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Isolamento e... · Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022042812/5fb214ef8b2d985c361cadab/html5/thumbnails/25.jpg)
Outras Técnicas: Microarrajo de DNA
Array de 1046 cDNAs testado
com cDNA marcado de feito de
mRNA de medula óssea. O
nível de hibridização segue as
cores do espectro, com
vermelho sendo a maior
expressão e azul a menor