isolamento e identificação de legionella spp. - ipq legionella... · isolamento e identificação...

Isolamento e Identificação de Legionella spp.

Milton Costa

Departamento de Ciências da Vida, Universidade de Coimbra

e

Biocant – Associação de Transferência de Tecnologia, Cantanhede

The Story of Legionella

Symptoms

high fever, chills and cough

muscle aches and headaches.

Time magazine

American Legion Convention July of 1976

182 ill

29 died

The Bellevue Stratford hotel, Philadelphia.

39 ill

5 died

en.wikipedia.org

•2–10 day incubation period - cases were dispersed across Pennsylvania •lack of a centralized record of attendance of the convention •known methods for culture, serology, tissue staining, and toxicology gave negative results


Symptoms

high fever, chills and cough

muscle aches and headaches.

Time magazine

Fraser DW. Lancet Infect Dis. 2005

American Legion Convention July of 1976

182 ill

29 died

The Bellevue Stratford hotel, Philadelphia.

39 ill

5 died

en.wikipedia.org

The Genesis of Germs (Gillen 2007)

Second, the newly discovered bacterium was isolated in pure culture in the laboratory. This necessitated investigating L. pneumophila’s nutritional requirements and designing special growth media that would meet these narrow requirements for bacterial growth.

First, if the etiological agent were biological, then the agent had to be found to be regularly associated with the disease. Tissues from lung biopsies and sputum samples were examined for a recurring microorganism. A Gram-negative rod with a tendency to form long, looping filaments was consistently detected in specimens.

Third, a susceptible animal was needed to demonstrate that L. pneumophila could produce disease, particularly a respiratory disease similar to Legionnaires’ disease in humans. The guinea pig was that animal. L. pneumophila was recovered from infected guinea pigs fulfilling Koch’s fourth postulate.


Legionella pneumophila strains distribution

Legionela-busters

Nascentes termais

Primeiros isolamentos de Legionella spp. em tabuleiros de água morna na unidade de prematuros no Hospital Pediátrico de Coimbra. Veríssimo, A., G. Vesey, M. G. Rocha, G. Marrão, J. Colbourne, P. J. Dennis & M. S. da Costa. (1990) A hot water supply as the source of Legionella pneumophila in incubators of a neonatology unit. Journal of Hospital Infections, 15: 255-263. O António Verissimo e eu relacionámos as temperaturas de isolamento de Legionella com temperatura de nascentes termais e decidimos saber se colonizavam nascentes termais.

As espécies do género Legionella

•L. adelaidensis

•L. anisa

•L. belardiensis

•L. birminghamensis

•L. bozemanii

•L. brunensis

•L. busanensis

•L. cherrii

•L. cincinnatiensis

•L. drancurtii

•L. dresdenensis •L. drozanskii

•L. dumoffii

•L. erythra

•L. fairfieldensis

•L. fallonii

•L. feeleii

•L. geestiana

•L. gormanii

•L. gratiana

•L. gresilensis

L. hackeliae

L. impletisoli L. israelensis

L. jamestowniensis

L. jordanis

L. lansingensis

L. londiniensis

L. longbeachae

L. lytica

L. maceachernii

L. massiliensis L. micdadei

L. moravica

L. nagasakiensis

L. nautarum

L. oakridgensis

L. parisiensis

L. pneumophila

L. quateirensis

L. quinlivanii

Cerca de 22 espécies associadas a doença

L. rowbathamii

L. rubrilucens

L. sainthelensi

L. santicrucis

L. shakespearei

L. spiritensis

L. steigerwaltii

L. tauriensis

L. tucsonensis

L. tunisiensis

L. wadsworthii

L. waltersii

L. worsleiensis

L. yabuuchiae

Anticorpos Policlonais L. pneumophila sg 1 L. micdadei

L. pneumophila sg 2 L. santicrucis L. pneumophila sg 3 L. spiritensis L. pneumophila sg 4 L. steigerwaltii L. pneumophila sg 5 L. wadsworthi L. pneumophila sg 6 L. dumofii L. pneumophila sg 7 L. gormanii L. pneumophila sg 8 L. oakridgensis L. pneumophila sg 9 L. londiniensis L. pneumophila sg 10 L. moravica L. pneumophila sg 11 L. nautorum

L. pneumophila sg 12 L. pneumophila sg 13 L. pneumophila sg 14 L. pneumophila sg 15 L. bozemanii sg1 L. bozemanii sg2 L. erythra L. feelei sg1 L. feelei sg2 L. israelensis

L. jamestowniensis

L. jordanis L. longbeachae sg1 L. longbeachae sg2 L. rubrilucensis

Imunofluorescência indirecta

Anticorpos Monoclonais para L. pneumophila MAB 1 MAB 2 MAB 3 W32 33G2 32A12 144C2 W29 P4C3 P9C3 P 13-15 W36 W32 4032 W39 JR5 K1 G6

Um flagelante

Amostra de água

Filtração

Concentrado

Directo Tratamento calor

Tratamento ácido

Espalhamento em GVPC

Incubação a 37ºC, 3 a 10 dias

Processar amostras

Norma ISO 11731

BCYE BCYE INC

Incubação a 37ºC, 3 a 10 dias

Visualização das colónias suspeitas

Identificação presumptiva de Legionella spp.

BCYE BCYE sem cisteína

Purificação

Preservação Identificação

Identificação presumptiva

Norma ISO 11731

Latex Ser1, Ser2-14, Ser2-15 Ácidos gordos ou 16s rRNA

Identificação de Legionella a partir dos perfís proteicos

Identificação de Legionella pelos ácidos gordos

6790 amostras examinadas entre 1997 e 2013 para legionelas. Cerca de 1600 estirpes de Legionella identificadas pela análise dos ácidos gordos. Este banco de dados, foi adoptado pela MIDI e estamos agora acreditados dentro da Norma ISO 11731 e prNP4422. Em casos de dúvida podemos pesquisar o gene dotA for PCR para confirmar L. pneumophila. Mais vulgarmente usamos sequenciação do gene 16S rRNA- Temos conservadas um número muito grande de estirpes de espécies de Legionella. As não-pneumophila mais isoladas pertencem a L. oakridgensis, L. londiniensis, L.

parisiensis, L. steigerwaltii

Aquicella lusitana e Aquicella siphonis “Algumas coisas não são aquilo que parecem”

Santos, P., I. Pinhal, F. A. Rainey, N. Empadinhas, J. Costa, B. Fields, R. Benson, A. Veríssimo & M. S. da Costa (2003). The Gamma-Proteobacteria, Aquicella lusitana gen. nov., sp. nov. and Aquicella siphonis, sp. nov., infect protozoa and require activated charcoal for growth in laboratory media. Applied and Environmental Microbiology, 69:6533-6540.

Parentes mais próximos são Rickettsiella (doença em insectos). Rickettsiella spp., parasitas intracelulares, nunca foram cultivadas. Legionella spp. e Aquicella spp. são cultiváveis.

Aquicella spp. Crescem só em meios com carvão, extracto de levedura e a-cetoglutarato ou piruvato. Crescimento aeróbio ou microaeróbio. Não cresce em anaerobiose.


Meio de cutura líquido Espaçamento de agar Carvão Activado

Este processo permitiu-nos examinar várias condições de crescimento de Legionella e Aquicella

que não seria possível com meios sólidos contendo carvão. Gama de temperatura de crescimento, Gama de pH de crescimento, Substratos assimilados,


Aquicella lusitana Aquicella siphonis

Hartmannella vermiformis

Infecção crónica (103/cell), não é aguda (105-106/cell) como Legionella spp.

Aquicella spp. infectam Hartmanella vermiformis

Células humans infectadas com Legionella

Aquicella spp. não infectam macrófagos humanos


AS PESSOAS E AS ORGANIZAÇÔES FINANCIADORAS

António Verissímo Fundação para a Ciência e a Tecnologia Fernanda Nobre Sociedade das Águas de Luso, SA Joana Costa Cinágua Graça Rocha Gina Marrão Alexandra Diogo Filipa d’ Avó Paula Morais Richard Bowker Barry Fields

Instituto Superior de Engenharia do Porto| 24 outubro 2013 Workshop "Prevenção e Controlo de Legionella nos Sistemas de Água"

Legionella pneumophila em ambientes aquáticos

Joana Costa

Transmissão de Legionella (Fraser, 1984)

Ambientes naturais Factores de amplificação

Disseminação

Ambientes intervenção humana

Exposição por uma população susceptível

Inoculação

LEGIONELOSE

Legionela – de organismo ambiental a agente patogénico acidental

http://www.youtube.com/watch?v=dD4d_apLtl0&feature=related

Água de profundidade Lagos

Natural spring

Rios

Nascentes quentes Biofilmes

Nascentes

Ambientes aquáticos naturais Ambientes aquáticos artificiais ou de intervenção humana

Fontes

Piscinas

Torres de arrefecimento Sistemas de distribuição

Chuveiros

Solo jardinagem



Fleirmans e colegas em 1981 analisaram centenas de amostras de inúmeros lagos e rios dos Estados Unidos. O estudo detectou legionelas na maioria das amostras, mas apenas 15% provocaram doença em porquinhos da índia. Verificaram ainda um efeito sazonal na detecção de legionelas, aumentando a sua concentração nos meses de verão.

Tison e colegas em 1983 realizaram um estudo nos lagos e rios do Monte de St. Helena e detectaram elevadas concentrações de legionelas nas águas termais aquecidas.

Estudos realizados em Portugal Continental e no Açores por Veríssimo e colegas também identificaram múltiplas espécies de legionelas em águas com temperaturas entre os 22ºC e os 67.5°C.

Apesar das legionelas serem facilmente recuperadas em águas superficiais, só recentemente Costa e colegas conseguiram isolá-las de águas de profundidade, onde se pensa que existam em muito baixas concentrações.

L. longbeach representa uma notável excepção, uma vez que é predominantemente isolada de solo. Esta espécie é responsável pela maioria dos casos de Legionelose na Austrália, que ocorrem entre jardineiros.

Os ambientes naturais são raramente associados a casos de legionelose. As legionelas multiplicam-se muito lentamente a baixas temperaturas, o que resulta num equilíbrio natural entre a concentração das bactérias e dos seus hospedeiros. Concentração esta abaixo do limite mínimo necessário para causar infecção em humanos. A maioria dos casos de doença está associada a ambientes sujeitos a intervenção humana onde temperatura da água é superior, alterando a concentração quer das bactérias quer dos seus hospedeiros naturais. Assim, variações na temperatura da água podem alterar o equilíbrio entre as legionelas e os protozoários, resultando num aumento rápido da concentração das bactérias, podendo causar doença.


Ambientes naturais Ambientes intervenção humana

103 a 106 leg/L <1% população

> 106 leg/L

50% população

Concentração bacteriana como factor determinante para a ocorrência de doença

temperaturas entre 6ºC e 63ºC – óptimo 37ºC

valores de pH entre 5.5 e 8.1

oxigénio dissolvido entre 0.3 e 9.6 mg/ml

Carácter ubíquo em ambientes aquáticos não salinos

Factores que favorecem o aumento da sua concentração

presença de outros organismos

zonas de reduzida circulação de água

presença de sedimentos



Legionellae multiplica-se no ambiente em: 14 espécies de amoebae 2 espécies de ciliados 1 espécie de Myxomycota

Os protozoários são ubíquos em diversos ambientes naturais, como água doce e salgada, água salobra, solos húmidos e em areias secas.

As legionelas não são bactérias de vida livre, multiplicam-se intracelularmente em vários tipos de protozoa sendo esta relação crucial para a ecologia do organismo.

A presença de protozoários é um factor determinante para a sobrevivência e aumento de concentração de legionelas

ciriscience.org

http://www.q-net.net.au

Amoeba aprisionando L. pneumophila

Macrófago preenchido com ~100 Legionella

Berk et al., 2008 Appl. Environ. Microbiol. Berk et al., 1998 Appl. Environ.

Microbiol.

Acanthamoeba spp. produz vesículas respiráveis contendo legionelas

Ciliados expelem vesículas contendo legionelas

Hilbi et al., 2010 Mol. Microbiol.

C. elegans é um hospedeiro metazoário de legionelas

Brassinga et al., 2010 Mol. Microbiol.

A infecção de Humanos por legionelas é um desvio ao seu ciclo de vida natural em amoebae

Replicação de legionelas em células eucariotas: estratégia essencial de virulência


O relacionamento entre as legionelas e amebas propicia de facto uma forma de protecção capaz de potenciar a capacidade de sobrevivência destas bactérias a ambientes hostis.

Provavelmente esta protecção será a explicação mais plausível para o facto das legionelas conseguiram transitar de ambientes naturais para ambientes de

intervenção humana, suportando os vários tratamentos a que a água é sujeita.

stress térmico e osmótico.

biocidas

antibióticos

Biofilmes

A maior parte da actividade bacteriana na natureza ocorre, não com as células individualizadas,

mas com as bactérias organizadas em comunidades sob a forma de um biofilme. Esses

biofilmes são constituídos por uma comunidade estruturada de células aderentes a uma

superfície inerte (abiótica) ou viva (biótica), embebidas numa matriz de exopolissacárido.

A associação dos organismos em biofilmes constitui uma forma de protecção ao seu desenvolvimento,

fomentando relações simbióticas e permitindo a sobrevivência em ambientes hostis.

Em ecossistemas aquáticos, mais de 99,9% das bactérias crescem em biofilmes associadas a

uma grande variedade de superfícies.

Os biofilmes mais comuns na natureza são heterogéneos, compostos por duas ou mais

espécies, podendo os produtos do metabolismo de uma espécie auxiliar o crescimento

das outras e a adesão de uma dada espécie fornecer ligandos que promovem a ligação

de outras.

Inversamente, a competição pelos nutrientes e a acumulação de metabolitos tóxicos

produzidos pelas espécies colonizadoras poderão limitar a diversidade de espécies num

biofilme.

Biofilmes

Protecção contra:

• Radiações UV

• Fagocitose

• Desidratação

• Predadores

• Antimicrobianos

Os principais componentes estruturais de biofilmes são:

• Microrganismos

• Matriz de exopolímeros

• Componentes de origem não-biológica

Cooperação metabólica e disponibilidade de nutrientes

as legionelas atingem sistemas de distribuição de água potável, e através deles, mesmo após tratamento da água, permanecem viáveis até ao fim da linha de distribuição de água de hotéis, hospitais e outros edifícios, incluindo torres de arrefecimento de sistemas de ar condicionado, cilindros de aquecimento, torneiras e chuveiros

Biofilmes

Um estudo de genómica comparada demonstrou que bactérias e vida livre possuem, em regra, genomas maiores do que bactérias intracelulares. Contudo este paradigma não se aplica a bactérias que reside em amibas.

O paradigma de Legionella pneumophila

Moliner et al., 2009 FEMS Microbiol Rev

O paradigma de Legionella pneumophila

guinea pig alveolar macrophages infected in vitro with L. pneumophila

http://news.bbc.co.uk/2/hi/science/nature/3677756.stm

A capacidade inata das legionelas conseguirem replicar-se em diferentes protozoa equipou estas bactérias com a capacidade de se replicarem em macrófagos alveolares humanos.


http://www.youtube.com/watch?v=LlB2Wbo7K3M&feature=related

Residem na via endocítica

Interagem com a via secretora

Reside nos lisossomas

Bactérias que foram internalizadas por células eucarióticas necessitam de evitar a fusão com o lisossoma ou desenvolver estratégias para sobreviver neste organelo. Bactérias que reside em

vacúolos que mantêm as características de endossomas

Bactérias alteram a via

endocítica e estabelecem vacúolos com características

únicas




Residem na via endocítica

Adaptado de Garduno, RA. 2008. In: Legionella pneumophila: pathogenesis and immunity and Molmeret et al., 2004 Microbes Infect.

Nucleus

Forma Replicativa Forma Virulenta Intermediário Vesícula

Adesão e entrada

Saída

Maturação

Diferenciação

Estabelecimento

Replicação

Protozoa

Transmissão a humanos

através de aerossóis

contaminados

Fase replicativa Fase transmissiva

Macrófago

Ciclo de vida bifásico

Bruggemannet al., 2006 Cell Microbiol

Jules and Buchrieser 2007 FEBS Letters

Forma replicativa

Forma virulenta

Transição rigorosamente regulada

Expressão de factores relacionados com a virulência

Legionella - Ciclo de vida bifásico

Yang et al., 2008 IJSEM

53 espécies de Legionella,

todas capazes de infectar protozoários

24 espécies foram associadas a casos de doença


Yang et al., 2008 IJSEM

L. pneumophila sg. 1 90% dos casos de Legionelose


Há um bias entre a prevalência de L. pneumophila como principal responsável por casos de doença e a sua distribuição ambiental

Prevalência de Legionella sp. – doença vs ambiente

L. pneumophila sg.1; 84%

L. pneumophila sg. 2-14; 6%

Legionella bozemanae, L.

micdadei, and L. longbeachae;

7%

Other Legionella sp.; 3%

L. pneumophila sg 1;

29,1%

L. pneumophila sg 2-14; 46,5%

Total non-pneumophila legionellae;

24,4%

L. pneumophila sg.1 corresponde a 30% dos isolados ambientais e a 84% dos isolados clínicos

Distribuição ambiental

Distribuição clínica

Estirpes clínicas são menos diversas que

estirpes de ambientes artificiais

Ambientes artificiais

Estirpes clínicas

L. pneumophila sg1 associada a doença pode não ser devido à sua prevalência no ambiente, mas sim a uma maior capacidade infecciosa. Assim, isolados de ambientes artificiais e clínicos podem constituir um sub-grupo de todos os genótipos existentes especialmente adaptados.


Como as infecções têm origem

ambiental e não ocorre

transmissão entre pessoas, o

estudo da diversidade genética

subjacente a variações na

capacidade infecciosa de estirpes

isoladas de ambientes naturais,

bem como de ambientes artificiais

e clinicas, é fundamental na

determinação de quais os

mecanismos críticos no processo

infeccioso.

Apesar do seu carácter ubíquo em ambientes aquáticos, a maioria dos estudos em legionelas focam estirpes

isoladas de ambientes sujeitos a intervenção humana na tentativa de estabelecer a ligação epidemiológica entre

o ambiente e casos clínicos.

Ambientes Natural


Estirpes clínicas


Roy and Isberg, 1997 Infect. Immun.

Wild-type L. pneumophila

Defective for all icm/dot-mediated virulence

activities

dotAWild-type L. pneumophila

Defective for all icm/dot-mediated virulence

activities

dotA

Effector

protein

Invasion and

trafficking pore L. pneumophila Lysossm

e

maior ilha de patogeneicidade, o complexo “intracellular multiplication (icm)/defective organelle trafficking (dot)”

é absolutamente necessário para a multiplicação em amibas e macrófagos


80 estirpes naturais

74 estirpes de ambientes de intervenção humana

21 estirpes de referências e tipo (Bumgbaugh et al., 2002; Ko et al., 2002; Costa et al., 2005)

119 estirpes de ambientes de intervenção humana e clínicas não relacionadas (Ko et al., 2006)

Estirpes Paris, Lens and Corby (Cazalet et al., 2004; Glöckner et al., 2007)


Estrutura da população inferida pelo gene dotA

IZ47

IZ88

NM

19IZ

41IZ

58Alf1

Felg

14JL

P100

9IS

27AT

CC

3315

3IZ

7K0

135

K014

0SG

T50

SG3

ma2

9SG

T274

K012

5Al

f30

K013

9SG

T295

Aco1

3Fe

lg15

ATCC

3315

4IS

12

ATCC33

155

IZ19

JLP10

59

JLP10

62Alf3

1

ACO28

ATCC43283K0138Alf9

JLP1012

JLP1016

JLP1018K0161IZ4

NCTC11404K0134Felg20

SGT284K0142IZ75K0137K0124K0131K0141JLP1013K0132K0133K0129K0130K0136strainSF9JLP1038EDT-3JLP1060ED13ED7NCTC1191ATCC33823

JLP1003Can40K0151

ACO9HUC2HUC4MUR1

JLP1004MUR4MUR7

ATCC43736SG13

JLP1030Paris

K0143K0171K0145K0167

JLP1061

JLP1005

K0168K0154

ARN24

JLP1024K0169Por19

JLP1055

ATCC

35289JLP1045JLP1042JLP1039JLP1046JLP1027

ATCC

43110JLP1029JLP1056

K0159ATC

C43113

K0148strainO

LDA

K0146K0170K0172

JLP1040JLP1010

ARN23

JLP1043

JLP1031

JLP1044

ATCC43107por9

ATCC33152K0153

JLP1022K0163 JL

P105

3

FELG

84

JLP1

034

JLP10

21

JLP10

58

JLP10

33

ED10FELG75

JLP1015

JLP1032

ATCC35096

FELG78

CAN45

CAN44

AQ70CAN43

ATCC43106

ATCC43801

HRD2Can30K0155AQ71Le61ARN25AQ69HRD1Can10Can5JLP1002JLP1011Can26JLP1001JLP1020ATCC43130

AGN

2K0

164

GER8

AGN8

GER81

GER3

Corby

JLP1

063

K014

9JL

P102

5

Por3

JLP1

023

FELG

172

SGT150

AGN3FELG183

AGN9Alf22ALF18JLP1028JLP1026

NM1NM6NM44 IMC9

Le52IMC17IMC23IMC12Le73IMC2IMC5IMC15IMC1Le66

JLP1048SG46IS65IS60IS13ma19JLP1050ma36IS30IS22EDT-10

EDT-1

ma34

AGN4

AGN7

FELG215

FELG244

SGT54SG150

Ger12

SGTED8SGT51SG

T327Le78SG

T53SG

T256G

ER10

SG1

SGT129

SGT79

SG82

SGT280

Aco60AC

O5

SG64

SGT302

ACO

33ACO

15ACO

41SG

T67SG69Le171JLP1066

Aco29ATCC43703

SGT286

JLP1068JLP1054JLP1070

JLP1069

JLP1064

ma31Aco22ATCC43290ma18ACO48Faco3Aco8JLP1041Aco 20JLP1007K0162K0152JLP1057

FRO6ALF15

IS1JLP1071

ma28

ma32

ma1

FRO

5JLP1049JLP1052JLP1067K0126K0147ATC

C33215

K0127JLP1006JLP1037Faco1Faco5LensATC

C43112

JLP1008m

a16JLP1036

K0128JLP1035

ACO12

Aco67

JLP1047

JLP1065

JLP1051

NM18NM49NM22NM53

Le58

Le49

K0157

K0156K0165ATCC33216

K0166K0158ATCC33735ATCC33736ATCC33737

ATCC33156 JLP1017 JLP1014 ATCC35251

JLP1019

0.02

dotA-A

dotA-B

dotA-C

dotA-D

dotA-E

IZ47

IZ88

NM

19IZ

41IZ

58Alf1

Felg

14JL

P100

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27AT

CC

3315

3IZ

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135

K014

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T274

K012

5Al

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K013

9SG

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3Fe

lg15

ATCC

3315

4IS

12

ATCC33

155

IZ19

JLP10

59

JLP10

62Alf3

1

ACO28

ATCC43283K0138Alf9

JLP1012

JLP1016

JLP1018K0161IZ4



JLP1003Can40K0151

ACO9HUC2HUC4MUR1

JLP1004

IZ47

IZ88

NM

19IZ

41IZ

58Alf1

Felg

14JL

P100

9IS

27AT

CC

3315

3IZ

7K0

135

K014

0SG

T50

SG3

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9SG

T274

K012

5Al

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K013

9SG

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ACO28

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JLP1003Can40K0151

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ARN23

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3

FELG

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JLP10

21

JLP10

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JLP10

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ATCC35096

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CAN45

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JLP1030Paris

K0143K0171K0145K0167

JLP1061

JLP1005

K0168K0154

ARN24

JLP1024K0169Por19

JLP1055

ATCC


ATCC

43110JLP1029JLP1056

K0159ATC

C43113

K0148strainO

LDA

K0146K0170K0172

JLP1040JLP1010

ARN23

JLP1043

JLP1031

JLP1044

ATCC43107por9

ATCC33152K0153

JLP1022K0163 JL

P105

3

FELG

84

JLP1

034

JLP10

21

JLP10

58

JLP10

33

ED10FELG75

JLP1015

JLP1032

ATCC35096

FELG78

CAN45

CAN44

AQ70CAN43

ATCC43106

ATCC43801


AGN

2K0

164

GER8

AGN8

GER81

GER3

Corby

JLP1

063

K014

9JL

P102

5

Por3

JLP1

023

FELG

172

SGT150

AGN3FELG183


NM1NM6NM44 IMC9



EDT-1

ma34

AGN4

AGN7


AGN

2K0

164

GER8

AGN8

GER81

GER3

Corby

JLP1

063

K014

9JL

P102

5

Por3

JLP1

023

FELG

172

SGT150

AGN3FELG183


NM1NM6NM44 IMC9



EDT-1

ma34

AGN4

AGN7

FELG215

FELG244

SGT54SG150

Ger12

SGTED8SGT51SG

T327Le78SG

T53SG

T256G

ER10

SG1

SGT129

SGT79

SG82

SGT280

Aco60AC

O5

SG64

SGT302

ACO

33ACO

15ACO

41SG

T67SG69Le171JLP1066

Aco29ATCC43703

SGT286

JLP1068JLP1054JLP1070

JLP1069

JLP1064

ma31Aco22ATCC43290ma18ACO48Faco3Aco8JLP1041Aco 20JLP1007K0162K0152JLP1057

FRO6ALF15

IS1JLP1071

ma28

ma32

ma1

FRO

5JLP1049JLP1052JLP1067K0126K0147ATC

C33215

K0127JLP1006JLP1037Faco1Faco5LensATC

C43112

JLP1008m

a16JLP1036

K0128JLP1035

ACO12

Aco67

JLP1047

JLP1065

JLP1051

NM18NM49NM22NM53

Le58

Le49

K0157

K0156K0165ATCC33216

K0166K0158ATCC33735ATCC33736ATCC33737

ATCC33156 JLP1017 JLP1014 ATCC35251

JLP1019

0.02

dotA-A

dotA-B

dotA-C

dotA-D

dotA-E

dotA-A

dotA-B

dotA-E

dotA-D

dotA-C

Neighbor-joining method (MEGA4)

Costa et al., 2010

Environ. Microbiol.


Costa et al., 2010

Environ. Microbiol.

Influência da recombinação na evolução do gene dotA

RDP3 (Recombination detection program)

Philadelphia

Lansing 3Paris

Lansing 382A3105

Alf18Concord 3

Chicago 8

Leiden 1

Bloomington 2

IN-23G1-C2

797-PA-H

LE58AGN2

LE58 Bloomington 2 797-PA-HCorby

Lens713

Alf18

Unknown Dallas 1EIMC23

UnknownFelg244

UnknownIS30

Unknown1169-MN-H

Leiden 1Unknown Bloomington 2

NM1

Leiden 1Unknown

U7W

Corby UnknownMICU B

Corby UnknownU8W

Corby UnknownLansing 3

UnknownLos Angeles 1

UnknownDallas 1E

U8W UnknownLE58

713Unknown

Chicago 2

LE58Dallas 1E

Togus 1

LE58Dallas 1E

570-CO-H

LE58Dallas 1E

LE58Dallas 1E

713

Lens

Lansing 3

Lansing 3

Lansing 3

Lansing 3

Lansing 3

Lansing 3

Lansing 3

17

LE58

AGN2

17

17

17

17

17

17

17

17

4

19

19

19

16 7

10

18

315

15

15

15

15

15

5

6

2

13

13

13

12

12

12

12

12

128

9

12

14

14

14

14

1

11

11

11

11

dotA-A

dotA-B

dotA-C

dotA-D

Philadelphia

Lansing 3Paris

Lansing 382A3105

Alf18Concord 3

Chicago 8

Leiden 1

Bloomington 2

IN-23G1-C2

797-PA-H

LE58AGN2

LE58 Bloomington 2 797-PA-HCorby

Lens713

Alf18

Unknown Dallas 1EIMC23

UnknownFelg244

UnknownIS30

Unknown1169-MN-H

Leiden 1Unknown Bloomington 2

NM1

Leiden 1Unknown

U7W

Corby UnknownMICU B

Corby UnknownU8W

Corby UnknownLansing 3

UnknownLos Angeles 1

UnknownDallas 1E

U8W UnknownLE58

713Unknown

Chicago 2

LE58Dallas 1E

Togus 1

LE58Dallas 1E

570-CO-H

LE58Dallas 1E

LE58Dallas 1E

713

Lens

Lansing 3

Lansing 3

Lansing 3

Lansing 3

Lansing 3

Lansing 3

Lansing 3

17

LE58

AGN2

17

17

17

17

17

17

17

17

4

19

19

19

16 7

10

18

315

15

15

15

15

15

5

6

2

13

13

13

12

12

12

12

12

128

9

12

14

14

14

14

1

11

11

11

11

dotA-A

dotA-B

dotA-C

dotA-D


dotA-A

dotA-B

dotA-C

dotA-D

Philadelphia 1

Paris

82A3105

Concord 3

Chicago 8

Leiden 1

Bloomington 2

IN-23-G1-C2

797-PA-H

AGN2

Corby

Alf18

IMC23

Felg244

IS30

1169-MN-H

NM1

U7W

U8W

MICU B

Lansing 3

Los Angeles 1

Dallas 1E

LE58

Chicago 2

Togus 1

570-CO-H

Lens

713

F26 S1041

dotA-A

dotA-B

dotA-C

dotA-D

Philadelphia 1

Paris

82A3105

Concord 3

Chicago 8

Leiden 1

Bloomington 2

IN-23-G1-C2

797-PA-H

AGN2

Corby

Alf18

IMC23

Felg244

IS30

1169-MN-H

NM1

U7W

U8W

MICU B

Lansing 3

Los Angeles 1

Dallas 1E

LE58

Chicago 2

Togus 1

570-CO-H

Lens

713

F26 S1041

Substituição de aminoácidos

HAPPLOT Costa et al., 2010

Environ. Microbiol.


Estirpes de L. pneumophila isoladas de ambientes naturais (i.e. rios, lagos), possuem maior diversidade alélica e são distintas da maioria das linhagens contendo estirpes relacionadas com casos de doença.

os alelos do gene dotA de estirpes isoladas de ambientes artificiais e relacionadas com casos clínicos estão sob pressão selectiva purificadora, antevendo que essas estirpes pertencem a um sub-grupo de todos os clones que foi selecionado pela sua capacidade de sobreviver e proliferar em ambientes artificiais e infectar com sucessos humanos.

A preservação da diversidade alélica do gene dotA nas estirpes ambientais antevê adaptações a diversos nichos.

Costa et al., 2010

Environ. Microbiol.


Ambientes Natural


Estirpes clínicas



Bactérias organizadas em comunidades sob a forma de um

biofilme que constitui uma forma de protecção

Agradecimentos

Milton da Costa

António

Veríssimo

Filipa d’Avó Filipa Passos Rui Figueiredo

Legionella busters

isolamento e identificação de legionella spp. - ipq legionella... · isolamento e identificação...

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