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MARCOS BRANDALISE
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE PROMOTORES TECIDO-
ESPECÍFICOS DE RAIZ E FOLHA DE Coffea arabica
BOTUCATU – SP
2007
MARCOS BRANDALISE
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE PROMOTORES TECIDO-
ESPECÍFICOS DE RAIZ E FOLHA DE Coffea arabica
Orientador: Prof. Dr.
Co-orientadora: Profa.
BOTUCA
20
Tese apresentada ao Instituto de Biociências
da Universidade Estadual Paulista – Campus
de Botucatu (SP), para obtenção do título de
Doutor em Genética
Ivan de Godoy Maia
Dr. Miriam Perez Maluf
TU – SP
07
1
Dedicatória
A todos, que tornaram
possível a realização desse projeto
2
Agradecimentos
A Sorte,
que sempre esteve ao meu lado;
3
Aos meus Pais, Nelson e Silvia Brandalise, principalmente pela oportunidade e confiança;
Ao meu ilustríssimo orientador e grande amigo Dr. Ivan de Godoy Maia, pelos
ensinamentos de bancada e especialmente de vida. Foram 10 anos de trabalho
em conjunto sem sequer uma discussão ou desentendimento;
À Dra. Miriam Perez Maluf, pela confiança depositada e pelo bom humor do dia-a-
dia;
Ao Dr. Guerreiro de Oliveiro Filho, pela amizade e conselhos dados na hora do
café;
Aos Drs. Andrés Yunes e Edson Kamper, pela orientação de extrema importância
no exame de qualificação;
Ao meu grande amigo Raul Andrés Cernadas, pelos conselhos, ajudas, amizade,
vinhos e cervejas no final da tarde...
A minha querida esposa Fabiana, por aturar meu mau humor e impaciência, mas,
sobretudo por cuidar de nosso filho Antônio, para que eu pudesse finalizar essa
etapa de minha vida;
Ao LNLS, mais precisamente ao Dr. Celso Eduardo Benedetti, pela colaboração e
abertura das portas do seu laboratório;
A todos os amigos do Centro de Café Alcides Carvalho; Centro de Biologia
Molecular e Engenharia Genética - UNICAMP (CBMEG) e Instituto de Biociências
(UNESP);
Ao Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café.
4
Epígrafe
“Tudo funciona,
até a hora que para de funcionar.” Marcos Brandalise
5
Resumo
6
Promotores são seqüências regulatórias capazes de direcionar a expressão
gênica para órgãos e tecidos específicos. A busca por seqüências promotoras
que regulam a expressão tecido-específica de genes é uma das prioridades para o
setor biotecnológico vegetal. No presente trabalho foram realizadas análises in
silico a partir das informações disponíveis no Banco de Dados do Projeto Genoma
Café, visando identificar genes com expressão tecido-especifica. Foram
selecionadas 13 e 15 etiquetas de seqüências expressas (EST) com expressão
específica em raiz e folha, respectivamente. A validação, via RT-PCR, dos
candidatos selecionados revelou a expressão tecido-específica de dois destes,
sendo um específico de folha e outro de raiz. As regiões imediatamente a
montante dos ESTs validados foram isoladas via genome walking e fragmentos de
2,0 kb (raiz) e ~0,9 kb (folha) foram obtidos. Vários elementos regulatórios foram
identificados em ambas seqüências amplificadas, incluindo elementos envolvidos
no controle da expressão tecido-específica e resposta a estresses. Os promotores
isolados foram fusionados ao gene repórter uidA e testados em experimentos de
expressão transiente em plântulas de café. Análises histoquímicas confirmaram a
funcionalidade e a órgão/tecido-especificidade da expressão modulada pelos
promotores isolados. Plantas de tabaco transformadas via Agrobacterium
tumefaciens com os cassetes acima descritos foram obtidas e análises
histoquímicas de gus revelaram que além de tecido-específicas, as seqüências
regulatórias investigadas são altamente induzidas por estresse biótico e abiótico.
7
Abstract
8
Promoters are crucial regulatory sequences that enable genes to be
transcribed in specific organs or tissues. Promoter sequences recovery, especially
those leading to tissue-specific expression, is of great interest in plant
biotechnology. In this study, an in silico analysis of the Brazilian Coffee Genome
Project Database was accomplished to identify genes with organ-specific
expression in coffee plant. Several ESTs showing root (13) and leaf-specific (15)
expression patterns were selected, but only two of them, one in root and the other
in leaf, were validated as being specific by RT-PCR experiments. The DNA regions
immediately 5’ to the validated ESTs were isolated by chromosome walking and
amplified fragments of 2,0 kb (root) and 0,9 kb (leaf) in length were obtained.
Several cis-regulatory elements were identified within the amplified sequences,
including those involved in the control of tissue-specificity and stress response.
The isolated promoters were transcriptionally fused to uidA reporter gene and
tested in transient expression assays using coffee seedlings. Gus histochemical
analyses confirmed the functionality and expected organ-specificity of the cloned
promoters. Transgenic tobacco plants transformed with Agrobacterium
tumefaciens bearing the corresponding cassettes were obtained and histochemical
analyses confirmed that besides tissue-specific expression, the investigated
regulatory sequences were also highly induced by biotic and abiotic stress.
9
Lista de Tabelas
10
Tabela. 1 Promotores isolados de café. ................43
Tabela 2. Listagem das bibliotecas, e seus respectivos
tecidos/tratamentos, geradas e seqüenciadas pelo projeto
Genoma Café. 46
Tabela 3. Listagem dos candidatos identificados via análise de
northern eletrônico, apresentado padrão de expressão
específico em raiz 81
Tabela 4. Listagem dos candidatos identificados via análise por
northern eletrônico, apresentando padrão de expressão
especifico em folha. 82
11
Lista de Figuras
12
Figura 1. Sintoma característico de folhas de Coffea arabica atacadas
com Bicho Mineiro.. ...........................................................................32
Figura 2. Sintoma característico de folhas de Coffea arabica
infectadas com a ferrugem alaranjada do cafeeiro (Hemileia
vastatrix). 33
Figura 3. Sintoma característico em raízes de Coffea arabica
infectadas com nematóides causadores de galhas da
espécie Meloidogyne spp. 36
Figura 4. Representação esquemática do vetor pRT103-Gus (~5 Kb)
que apresenta o gene repórter uidA (GUS) inserido entre os
sítios BamHI e NcoI sob o controle do promotor constitutivo
CaMV35S. 67
Figura 5. Ensaio de digestão parcial do vetor pRT103-Gus visando a
retirada do promotor constitutivo CaMV35S. 68
Figura 6. Representação esquemática dos cassetes de expressão
desenvolvidos para a análise funcional das regiões
promotoras amplificadas via genome walking (os promotores
não se encontram em escala). 69
Figura 7. Representação esquemática do plasmídeo pCAMBIA 1381
(Cambia) utilizado na construção dos cassetes de
expressão visando a posterior transformação estável de
tabaco empregando Agrobacterium tumefaciens. 72
13
Figura 8. Amplificação por RT-PCR de um transcrito ubíquo
codificando actina. 84
Figura 9. Análise de RT-PCR revelando amplificação de transcrito específico de raiz. 85
Figura 10. Análise de RT-PCR revelando a amplificação de transcrito
específico de folha em Coffea arabica, variedade Mundo
Novo. 87
Figura 11. Análise por northern blot da acumulação do transcrito
específico de raiz em condições de estresse mecânico. 89
Figura 12. Gel de agarose contendo os produtos de amplificação
obtidos para o candidato específico de raiz empregando a
técnica de genome walking e a combinação dos oligos
AP1/GSP1 e AP2/GSP2. 90
Figura 13. Gel de agarose contendo os produtos de amplificação
obtidos para o candidato específico de folha empregando a
técnica de genome walking e a combinação dos oligos
AP1/GSP1 e AP2/GSP2. 91
Figura 14. Seqüência parcial de nucleotídeos do promotor específico
de folha analisado com auxílio do banco de dados do
PLACE. 94
14
Figura 15. Esquema de localização dos elementos regulatórios
encontrados no promotor do gene com expressão específica
em folha por análise comparativa com banco de dados do
PLACE. 95
Figura 16. Localização dos elementos regulatórios encontrados no
promotor do gene com expressão específica em raiz por
análise comparativa com banco de dados do PLACE. 98
Figura 17. Ensaio de expressão transiente, via biobalística, em raiz e
folha de Coffea arabica. 99
Figura 18. Ensaio enzimático de Gus em folha de Coffea arabica
transformada via biobalística com o cassete de expressão
contendo o promotor específico de folha. 100
Figura 19. Expressão transiente de Gus em folha de Coffea arabica
transformada via biobalística com o cassete de expressão
contendo o promotor específico de folha. 101
Figura 20. Expressão transiente de Gus em raiz de Coffea arabica
transformada via biobalística com o cassete de expressão
contendo o promotor específico de raiz. 103
Figura 21. Ensaio histoquímico da atividade de ß-glucuronidase em
plântulas transgênicas de tabaco transformadas,
respectivamente, com os cassetes de expressão contendo
os promotores específicos de folha (A) e de raiz (B) isolados
de Coffea arabica. 105
15
Figura 22. Ensaio histoquímico da atividade da β-glucuronidase em
discos foliares de tabacos transgênicos transformados com
o cassete de expressão contendo o gene uidA sob controle
do promotor específico de folha. 107
Figura 23. Ensaio histoquímico da atividade da β-glucuronidase em
folhas de tabacos transgênicos transformados com o
cassete de expressão contendo o gene uidA sob controle do
promotor específico de folha, em resposta a dano mecânico. 108
Figura 24. Ensaio histoquímico da atividade da β-glucuronidase em
raízes de tabacos transgênicos transformados com o
cassete de expressão contendo o gene uidA sob controle do
promotor específico de raiz em resposta ao ataque de
nematóides. 110
Figura 25. Ensaio histoquímico da atividade da ß-glucuronidase em
raízes de tabacos transgênicos transformados com o
cassete de expressão contendo o gene uidA sob controle do
promotor específico de raiz, em resposta ao ataque de
nematóides. 112
Figura 26. Ensaio histoquímico da atividade da ß-glucuronidase em
raízes de tabacos transgênicos transformados com o
cassete de expressão contendo o gene uidA sob controle do
promotor específico de raiz, em resposta ao ataque de
nematóides. 113
16
Sumário
17
Resumo 7
Abstract 9
Lista de Tabelas 11
Lista de Figuras 13
1. Introdução 24
1.1 Inovações tecnológicas 25
1.2 Café e a sua importância 27
1.3 Principais pragas e doenças do cafeeiro 31
1.3.1 Bicho Mineiro 31
1.3.2 Ferrugem Alaranjada do Cafeeiro 32
1.3.3 Nematóides 34
1.4 Melhoramento genético clássico X biotecnologia 36
1.5 Promotores constitutivos X tecido- específicos 39
1.6 Projeto Genoma Café 44
2. Objetivos 47
18
3. Material e Métodos 49
3.1 Material Vegetal 50
3.2 Seleção in silico de ESTs com padrão de expressão órgão/tecido
- específico 50
3.3 Extração de RNA total de café 51
3.4 Quantificação do RNA e síntese de cDNA 53
3.5 Validação dos cDNAs obtidos 53
3.6 Confirmação da especificidade de expressão 54
3.7 Análise da indução da expressão do gene específico de raiz por
ferimento empregando northern blot 54
3.7.1 Marcação de sonda e hibridização da membrana 55
3.8 Isolamento e identificação das regiões promotoras 56
3.8.1 Isolamento de DNA total de folha de café 57
3.8.2 Amplificação das regiões promotoras por genome walking
(GW) 58
3.8.3 Isolamento, purificação e clonagem das regiões promotoras 59
3.8.4 Minipreparação de DNA plasmidial e seqüenciamento dos
insertos 61
3.8.5 Análise das seqüências e busca de domínios regulatórios 62
3.9 Análise funcional das regiões promotoras através de expressão
transiente em raiz e folha de Coffea arabica 63
3.9.1 Preparação das micropartículas 64
19
3.9.2 Teste controle de biobalística e ensaio enzimático de Gus 65
3.9.3 Construção do cassete de expressão no vetor pRT103 – Gus 66
3.9.4 Ensaio de expressão transiente em folha e raiz de Coffea
arabica via biobalística 70
3.10 Construção do cassete de expressão em pCAMBIA-1381 visando
transformação estável em tabaco 71
3.11 Transformação de Agrobacterium tumefaciens cepa LBA4404 por
eletroporação e confirmação das células transformadas 73
3.12 Obtenção de plantas transgênicas de tabaco 74
3.13 Análise dos transformantes via PCR e ensaio enzimático de Gus 75
3.14 Análise da expressão do gene repórter uidA em plantas
transgênicas transformadas com o cassete de expressão
contendo o promotor específico de folha em resposta a dano
mecânico 77
3.15 Análise da expressão do gene repórter uidA em plantas
transgênicas transformadas com o cassete de expressão
contendo o promotor específico de raiz em resposta ao ataque de
nematóides 77
20
4. Resultados 79
4.1 Seleção in silico de ESTs órgão/tecido – específicos 80
4.2 Extração e quantificação de RNA total de diferentes
órgãos/tecidos de Coffea arabica e de frutos em diferentes fases
de amadurecimento. Síntese e validação da integridade dos
cDNAs 83
4.3 Confirmação da especificidade de expressão dos candidatos
selecionados in silico 84
4.4 Análise da expressão do gene raiz-específico frente à injúria
mecânica 88
4.5 Isolamento e identificação de regiões promotoras 89
4.6 Seqüenciamento dos produtos de GW e obtenção dos consensos 91
4.7 Busca por elementos cis-regulatórios 92
4.7.1 Elementos cis-regulatórios presentes na região promotora do
candidato com expressão específica em folha 93
4.7.2 Elementos cis-regulatórios presentes na região promotora do
gene com expressão específica em raiz 96
4.8 Análise das regiões promotoras através de expressão transiente
do gene repórter uidA em raiz e folha de Coffea arabica 98
4.9 Análise de plantas de tabaco transgênicas 104
21
4.10 Análise da indução da expressão do gene repórter uidA em
plantas transgênicas transformadas com o cassete contendo o
promotor específico de folha em resposta a dano mecânico 106
4.11 Análise da indução da expressão do gene repórter uidA em
plantas transgênicas transformadas com o cassete de expressão
contendo o promotor específico de raiz em resposta ao ataque de
nematóides 109
5. Discussão 114
5.1 ESTs órgão/tecido-específicos e a análise in silico 115
5.2 Candidato com expressão em folha 116
5.2.1 Caracterização dos elementos regulatórios e análise
funcional do promotor específico de folha 117
5.3 Candidato com expressão específica em raiz 120
5.3.1 Caracterização dos elementos regulatórios e análise
funcional do promotor específico de raiz 121
6. Conclusões e Perspectivas 125
7. Bibliografia 128
22
23
1. Introdução
24
1.1 Inovações tecnológicas
A biotecnologia tem se destacado nos últimos anos como uma inovação
tecnológica capaz de agregar riquezas a diferentes áreas do setor produtivo. No
setor agrícola e florestal, a produção de plantas geneticamente modificadas com
características específicas derivadas da biotecnologia é um processo altamente
promissor cujos produtos finais apresentam alto valor agregado e podem ser
aplicados diretamente na cadeia produtiva. Ciente de tais vantagens, algumas
empresas de cunho biotecnológico pautadas na produção de novos produtos para
a agricultura têm sido criadas no Brasil nos últimos anos. O desenvolvimento de
uma indústria de base genética capaz de prover insumos à produção agrícola é
não só imprescindível como altamente benéfico para o setor produtivo brasileiro.
Embora novas plantas derivadas da biotecnologia venham sendo adotadas
em diversos países, estamos atingindo 12 anos de cultivo de produtos
geneticamente modificados, a biotecnologia vegetal ainda é alvo de controvérsias
e polêmicas. Para que essa inovação tenha maior alcance e aceitação,
investimentos importantes em pesquisa básica precisam ser realizados a fim de
gerar ferramentas necessárias para a aceleração de sua aplicação e sobretudo,
para a superação de algumas de suas limitações técnicas. Esse desafio deve ser
encarado pelos diferentes setores envolvidos, incluindo as universidades e
institutos de pesquisa do setor público.
A presente tese está inserida nesse contexto e tem como principal meta
identificar seqüências promotoras capazes de direcionar a expressão de genes, de
25
interesse agronômico, para órgãos/tecidos específicos da planta. Para tal, foram
utilizados os dados gerados no projeto de seqüenciamento de seqüências
expressas do café que contou com financiamento da diferentes entidades. Trata-
se, portanto de um trabalho de tese com enfoque acadêmico e aplicado.
Cabe ressaltar que por iniciativa do Consórcio Brasileiro de Pesquisa e
Desenvolvimento do Café, que financiou o presente projeto, e, sobretudo pelo
potencial de utilização das seqüências promotoras aqui descritas e caracterizadas
em programas biotecnológicos, as mesmas estarão sendo protegidas por uma
patente. Como esse pedido está sendo processado, os dados relativos às
seqüências promotoras e nome dos genes utilizados no presente trabalho estão
sendo apresentados em confidencialidade.
26
1.2 Café e a sua importância
O café é uma planta perene de porte arbustivo nativa do continente africano.
Sua chegada ao Brasil se deu em 1727 na cidade de Belém, sendo posteriormente
cultivado no Rio de Janeiro, São Paulo e Minas Gerais em 1780. Até então o café era
considerado o maior produto gerador de riquezas, destacando-se como o mais
importante da história do Brasil.
Atualmente, a cafeicultura desempenha uma importante função na economia
nacional exercendo um grande papel gerador de divisas da ordem de 2 bilhões de
dólares anuais ou 26 milhões de sacas exportadas ao ano (Companhia Nacional do
Abastecimento – Conab). Com um mercado ainda em expansão, o agronegócio do
café gera, em todo mundo, recursos na ordem de 91 bilhões de dólares ao
comercializar 115 milhões de sacas que, em média, são produzidas. A cafeicultura
envolve ainda meio bilhão de pessoas desde a produção ao consumo final
representando cerca 8% da população mundial (Embrapa Café).
No início do século, o Brasil se destacava dentre os paises produtores de
café, sendo responsável por 80% das exportações mundiais. Entretanto e
infelizmente, a produção brasileira passou por um grande retrocesso até chegar
aos dias atuais. Apesar da acentuada redução da área cafeícola nas últimas
décadas e de diversos fatores que têm determinado oscilações na sua produção
total, dentre estes, fatores abióticos como seca e geada e, bióticos como pragas e
doenças (Gonçalves, 1999), o Brasil ainda ocupa uma posição dominante no
27
mercado internacional, se destacando como maior produtor (contribuição de 30%
da produção mundial nas últimas safras) e exportador mundial de café, com
participação média de 25%. O agronegócio do café representa mais de 2,5 % do
valor total das exportações brasileiras além de gerar oito milhões de empregos diretos
e indiretos, sobressaindo-se como o setor que mais emprega no Brasil.
Anuário Estatístico Oficial Conab 2005/2006 revela que a produção
brasileira de café é de 40,62 milhões de sacas. Entretanto, quando essa é
comparada com a produção estimada em levantamento anterior publicado em
dezembro de 2005, que totalizou 43,58 milhões de sacas, uma redução de 6,8%
pôde ser observada. Essa redução representa um prejuízo de cerca de 800
milhões de reais para os produtores, sendo a mesma causada pela estiagem que
assolou as plantações de café nos períodos de floração e enchimento dos grãos.
O cafeeiro pertence ao subgênero Coffea, família Rubiacea, formado por cerca
de 100 espécies. Das espécies mais cultivadas no mundo, Coffea arabica L (café
Arábica) e Coffea canephora Pierre ex Froehner (café Robusta) são as mais
importantes economicamente. Coffea arabica L é uma espécie nativa do continente
africano, tendo como local de origem o sudoeste da Etiópia e do Sudão e o norte
do Quênia. Por apresentar uma qualidade da bebida superior quando comparada
com outras espécies, C. arabica destaca-se como a espécie mais cultivada,
representando cerca de 70% da produção mundial e 90% da produção na América
Latina. C. canephora por sua vez, apresenta como locais de origem a República
da Guiné, a Libéria, o Sudão e Uganda, respondendo por 30% do restante da
28
produção mundial (Carneiro, 1997). Apesar de somente C. arabica e C. canephora
terem importância econômica ativa no mercado mundial, espécies selvagens
apresentam uma grande importância do ponto de vista adaptativo, sendo potentes
fontes de variabilidade genética. Tais espécies não cultivadas comercialmente
possuem características altamente vantajosas como resistência a doenças e
pragas, tolerância à seca e outras alterações ambientais (Fazuoli et al., 1999). Um
exemplo desta aplicação genética é a variedade Apoatã de C. canephora
(IAC2258), utilizada como porta enxerto de C. arabica devido à resistência a
nematóide (Fazuoli, 1981).
C. arabica é a única espécie alotetraplóide (2n = 4x = 44 cromossomos) do
gênero e predominantemente autofértil em aproximadamente 90% das flores,
enquanto que C. canephora e as outras espécies conhecidas do gênero Coffea são
diplóides (2n = 2x = 22 cromossomos) e autoincompatíveis, multiplicando-se
exclusivamente por fecundação cruzada (Fazuoli et al., 1999; Berthaud, 1980). Por
se tratar de uma cultura perene e de período juvenil longo, o melhoramento genético
do cafeeiro é lento, sendo necessária a implementação de técnicas que facilitem e
acelerem a obtenção, seleção e avaliação de materiais superiores. A diversidade
genética de cultivares de Coffea arabica L. é relativamente pequena e a sua
ampliação torna-se importante para o futuro do melhoramento do cafeeiro. O
potencial competitivo do país, no entanto, poderá crescer ainda mais com a
redução de custos de produção e também através do aumento da produtividade.
29
Pragas e doenças são consideradas fatores limitantes para obtenção de
uma boa produção. Dentre as inúmeras doenças e pragas do café, destaca-se a
ferrugem alaranjada do cafeeiro causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix
(Carvalho e Fazuoli, 1993) e a lagarta do Bicho Mineiro (Leucoptera coffeella)
(Parra, 1985) afetando as folhas, e o nematóide Meloidogyne exígua sp. (Brown et
al., 1995) afetando as raízes.
Atualmente, a ferrugem e os nematóides atingem todas as regiões
cafeicultoras do Brasil e se não forem devidamente controladas podem causar
queda de até 45% na produção. O controle químico desses agentes tem se
mostrado eficiente, porém, além de representar cerca de 10 a 20% do custo total
de produção (Matiello et al., 1985; Vegro e Ferreira, 2000), pode levar ao
agravamento de outras doenças e pragas do cafeeiro devido à baixa seletividade,
e possibilitar por pressão de seleção, o surgimento de raças resistentes aos
produtos aplicados. Um dos maiores desafios tem sido encontrar métodos
eficientes de controle, com mínimo custo operacional e principalmente de baixo
impacto ambiental.
30
1.3 Principais pragas e doenças do cafeeiro
1.3.1 Bicho Mineiro
O Bicho-mineiro-do-cafeeiro (Leucoptera coffeella), é um lepidóptero
específico do gênero Coffea, afetando quase que todas as variedades comerciais
de Coffea arabica, muitas vezes de forma devastadora (Figura 1). Esta é
considerada uma das principais pragas da cultura no Brasil (Guerreiro et al.,
1990). No Estado de Minas Gerais, maior produtor brasileiro de café na atualidade
(49,5% da produção do país), essa praga quando não controlada chega a causar
danos de até 30% na produção.
A forma adulta do inseto realiza a postura na parte adaxial foliar e após a
eclosão dos ovos, as larvas penetram na região axial das folhas. As larvas se
alimentam exclusivamente do parênquima paliçádico, formando literalmente
galerias e/ou minas no tecido afetado. A injuria desencadeia uma resposta “imune”
inespecífica na planta, havendo aumento dos níveis de etileno, oxidação do tecido
atacado e conseqüentemente queda das folhas (Souza et al., 1998). Este
desfolhamento inesperado chega a causar grande redução no desenvolvimento do
sistema radicular e principalmente na atividade fotossintética da planta (Koronnova
e Veja, 1985).
Grandes avanços têm sido obtidos pela indústria de defensivos agrícolas,
entretanto a prevenção anual dessa praga chega a representar 15% do custo total
31
de produção. Além de agir de forma inespecífica, em outros organismos não alvos,
o produto aplicado pode causar sérios danos ao meio ambiente.
Figura 1. Sintomas característicos em folhas de Coffea arabica atacadas pelo
bicho-mineiro-do-cafeeiro (Leucoptera coffeella).
1.3.2 Ferrugem Alaranjada do Cafeeiro
Uma das principais e a mais severa doença que afeta a cafeicultura
brasileira e mundial na atualidade é a ferrugem alaranjada do cafeeiro (Figura 2).
Esta é causada por um parasita biotrófico foliar obrigatório Hemileia vastatrix
(Berkeley e Boome). No Brasil são encontradas ao redor oito raças virulentas,
havendo, entretanto grande predominância de fungos da raça tipo II.
O primeiro sintoma da doença é observado normalmente no lado adaxial da
folha, caracterizando-se como manchas amarelo-alaranjadas. Após esporulação e
disseminação do fungo na planta, ocorre oxidação e conseqüentemente, morte
32
dos tecidos foliares, havendo uma desfolha prematura e muitas vezes seca dos
ramos plagiotrópicos (ramos produtivos), prejudicando assim o crescimento,
florescimento, e conseqüentemente a produção do ano seguinte.
Esta doença quando não controlada adequadamente pode causar perdas
de até 40% da produção, enquanto que infestações mais severas podem provocar
a morte das plantas infectadas (Fernandez et al., 2004). Apesar de representar
cerca de 15% do custo total da produção, métodos de controle químico da doença
têm se mostrado eficiente. Entretanto, em alguns casos, o uso indiscriminado de
fungicidas não específicos, pode acarretar o surgimento de novas raças, além de
prejudicar de maneira drástica o meio ambiente. Mesmo com a ajuda dos
programas de melhoramento que lançaram cultivares resistentes ao patógeno,
novas raças fisiológicas do fungo têm ocasionado a quebra de resistência. Em
função disso, a durabilidade da resistência dos cultivares atuais é difícil de ser
prevista (Varzea et al., 2002).
Figura 2. Sintoma característico de folhas
de Coffea arabica infectadas com a
ferrugem alaranjada do cafeeiro (Hemileia
vastatrix).
1.1.1 Nematóides
33
1.3.3 Nematóides
Os nematóides formadores de galhas do gênero Meloidogyne spp. são
capazes de parasitar mais de 3000 espécies de plantas, sendo endoparasitas
sedentários obrigatórios. Quando não controlados adequadamente chegam a
causar grandes perdas à agricultura mundial (Abad et al., 2003). Sasser e
colaboradores, por exemplo, relatam que em 1987 esses microorganismos
geraram prejuízos da ordem de 100 bilhões de dólares ao agronegócio mundial.
Até então quinze espécies de Meloidogyne foram caracterizadas como parasitas
de café (López e Salazar, 1989; Campos et al., 1990; Eisenback e Triantaphyllou,
1991; Carneiro et al., 1996), destacando-se dentre essas a espécie M. Exígua,
considerada a mais importante e problemática para a cafeicultura de arábica,
principalmente pela sua ampla distribuição na América do Sul e Central (Anthony
et al., 2005).
Os fitonematóides formadores de galhas penetram no sistema radicular do
hospedeiro através do córtex, onde células parênquimatosas do xilema são
selecionadas para ancoragem e formação das células gigantes. Por uma
disfunção da maquinaria celular, gerada pelo parasitismo, as células gigantes são
multinucleadas, se desenvolvem normalmente em números reduzidos (de 5 a 7),
apresentando citoplasma denso e com grande concentração de organelas
celulares e pequenos vacúolos. Concomitantemente à formação das células
gigantes, ocorre hiperplasia e hipertrofia do tecido cortical, causando assim o
34
sintoma de galha ou nódulo que caracteriza a doença (Williamson e Hussey,
1996). O fenótipo desenvolvido pelo parasitismo gera deformação do sistema
radicular bem como mau funcionamento no sistema de absorção e translocação
de água e nutrientes.
Muitos dos processos fisiológicos da planta hospedeira como respiração,
fotossíntese, absorção e translocação de água e nutrientes, balanço hormonal,
assim como deformação morfológica e anatômica podem ser afetados direta ou
indiretamente pelo parasitismo (Gonçalves e Silvarolla, 2001).
Estes parasitas de plantas são considerados uns dos maiores vilões da
agricultura na atualidade. Em 1987, chegaram a causar danos na ordem de
bilhões de dólares para o agronegócio de alimento e fibras (Christopher et
al.,1994). Nos E.U.A os nematóides causadores de galha chegam a causar perdas
de 1 bilhão de dólares por ano ao agronegócio da soja (Alkharouf et al., 2004).
Figura 3. Sintoma característico em raízes de Coffea arabica infectadas com
nematóides causadores de galhas da espécie Meloidogyne spp.
35
1.4 Melhoramento genético clássico X biotecnologia
A crescente demanda mundial por alimentos de melhor qualidade e
principalmente livres de defensivos agrícolas, é um desafio que tem promovido um
avanço significativo em diversas áreas da produção vegetal. Dentre estas se
destaca o melhoramento genético vegetal (Borém, 1998).
O melhoramento genético de plantas visando melhorias agronômicas vem
sendo realizado pelo homem há milhares de anos utilizando-se de procedimentos
clássicos, funcionais, de cruzamentos controlados entre espécies. Entretanto, com
o advento da biologia molecular, somado ao desenvolvimento de técnicas
biotecnológicas avançadas, o melhoramento genético de plantas via engenharia
genética tornou-se uma ferramenta importante na obtenção de plantas
genotipicamente superiores em um curto espaço de tempo, sendo portanto de
grande interesse para o setor agrícola (Borém, 1998).
As novas tecnologias têm se destacado principalmente devido à
possibilidade de obtenção de resultados uniformes e direcionados para
características desejáveis. Dentre os inúmeros métodos biotecnológicos
mundialmente utilizados para o melhoramento, destaca-se como um dos mais
importantes, a produção de plantas geneticamente modificadas. A transgenia tem
permitido o melhoramento de genótipos selecionados por métodos convencionais
através da introdução de um ou poucos genes que, em muitos casos, são
encontrados em espécies distantes e que não poderiam ser transferidos via
36
recombinação, o que acontece obrigatoriamente entre indivíduos sexualmente
compatíveis. Por outro lado, se fossem transferidos levariam anos para obtenção
do genótipo desejado.
Em se tratando do melhoramento de espécies perenes, mais precisamente
da espécie investigada na presente tese (Coffea arabica), diversos programas de
melhoramento vêm sendo conduzidos com intuito de introduzir características
agronômicas desejáveis à cultura, tais como resistência a pragas e doenças, além
de processos de aperfeiçoamento da qualidade de bebida, maturação de frutos,
arquitetura da planta, ect... Entretanto, apesar do sucesso desses programas, o
processo de melhoramento de café demanda muito tempo, espaço físico e gastos
elevados, sobretudo se considerarmos que desde as primeiras hibridações até a
obtenção de novos cultivares pode-se levar no mínimo 20 anos. Dois exemplos
práticos desse delongado, porém funcional, processo são os cultivares Obatã e
Catuaí, cujo programa de melhoramento estendeu-se de 1968 a 2000 e de 1950 a
1992, respectivamente.
Como relatado anteriormente, o gênero Coffea é composto por
aproximadamente 100 espécies, destacando-se Coffea arabica L como a mais
importante economicamente. Esta espécie é a única tetraplóide do gênero, sendo
o restante diplóide e na sua maioria auto-incompatível. Em casos como o do café,
a transferência de genes entre espécies de ploidia diferente requer uma série de
processos delicados, como por exemplo, a duplicação de material genético nas
células germinativas (tratamento com colchicina). Essa etapa pode ocasionar
muitas vezes ploidias indesejadas, como triplicação, e também conduzir a uma
37
disfunção metabólica das células “injuriadas”. Além disso, a fase reprodutiva de
Coffea arabica ocorre normalmente uma vez ao ano, o que faz com que a
transferência de genes via melhoramento clássico fique restrita a esse período.
Nesse caso, a simples ocorrência de intempéries na fase de floração pode causar
abortamento das flores, fazendo com que o programa de melhoramento se
prolongue por ainda mais tempo.
O melhoramento de espécies perenes através da obtenção de organismos
geneticamente modificados tem sido apontado como uma alternativa ao
melhoramento clássico. Nesse contexto, a introdução via transgenia de
características desejáveis como a resistência a fatores bióticos e abióticos tende a
ser facilitada, uma vez que um grande número de genes envolvidos nessas
respostas ou induzidos por tais fatores em diferentes espécies tem sido
identificado e caracterizado. A disponibilidade de tais genes tem ampliado ainda
mais as possibilidades de manipulações por processos biotecnológicos.
Muitos destes genes têm sido identificados em projetos onde genomas
inteiros foram seqüenciados, como nos casos de Arabidopsis thaliana (Kaul et al.,
2000) e do arroz (Yu et al., 2002) ou em projetos nos quais foram seqüenciados
milhares de cDNAs oriundos de bibliotecas construídas a partir de diferentes
órgãos/tecidos e em diferentes condições de estresse, também conhecidos como
projetos ESTs (expressed sequence tags). Como exemplo do último caso, na área
vegetal destaca-se o projeto Café da Rede de Seqüenciamento financiado pelo
Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café, Embrapa, CNPq e
FAPESP.
38
Os projetos de seqüenciamento acima citados são de extrema importância,
entretanto sabe-se que a simples identificação de um gene não é garantia para a
sua utilização na obtenção de transgênicos. A produção eficiente de uma proteína
heteróloga em uma planta depende, por exemplo, da obtenção de altos níveis de
transcrição do gene introduzido e para isso promotores altamente ativos são
necessários (Rance et al., 2002).
1.5 Promotores constitutivos X tecido- específicos
O promotor é o processador central da regulação de um gene uma vez que
contém os sítios de ligação para os fatores de transcrição (TFs) e para a RNA
polimerase responsável pela transcrição gênica. Compreende por definição a
região 5' da seqüência a ser transcrita podendo se estender por algumas centenas
de pares de base (pb).
A região promotora de um gene eucarioto, em geral, possui uma seqüência
conservada (T/A)A(A/T) a aproximadamente 30 pb do ponto de início da
transcrição, a qual é comumente denominada TATA Box, e elementos promotores
proximais que estão localizados a aproximadamente 100 (CCAAT Box) e 200 pb
(GC Box) acima do ponto de início da transcrição (Stephen et al., 2003) Os
elementos contidos em tais seqüências normalmente determinam o ponto correto
de início da transcrição, bem como o local e o momento em que esse processo
biológico deverá ocorrer. Nesse contexto, a região mínima de seqüência contínua
39
de DNA necessária para dirigir corretamente o início da transcrição de um gene
pela maquinaria de transcrição, que inclui o próprio ponto de início de transcrição
(+1) bem como cerca de 35 nucleotídeos acima e abaixo do mesmo, é
denominada promotor principal ou core promoter (Butler e Kadonaga, 2002).
Os processos que proporcionam a modulação transcricional são
extremamente complexos e ocorrem através de uma intricada rede de interações
envolvendo os elementos já citados e outros elementos localizados em regiões
mais distantes da região core (“enhancers” e “silencers”). Promotores apresentam
inúmeros sítios de ligação para fatores de transcrição específicos, que por sua vez
são ativados sob as mais diversas situações, tais como, estímulos endógenos
(auxinas, giberilinas, ácido salicílico, acido jasmônico, etc...) e estímulos exógenos
(luz, pressão, umidade, temperatura, etc...). A ação combinatória dos mesmos
determina a ativação ou repressão da expressão gênica.
Os promotores constituem, portanto, uma ferramenta chave em processos
biotecnológicos a fim de garantir que a expressão de um gene de interesse seja
efetiva e regulada. Dentre os promotores usualmente empregados na produção de
plantas geneticamente modificadas destacam-se o promotor 35S do Vírus do
Mosaico da Couve Flor (CaMV 35S), os promotores dos genes que codificam
respectivamente a nopalina sintetase (NOS) e octopina sintetase (OCS) de
Agrobacterium tumefaciens e o promotor do gene que codifica a ubiquitina (Ubi-1)
de milho. Apesar dos grandes avanços obtidos com o emprego desses
promotores, os padrões de expressão dos transgenes submetidos à regulação dos
mesmos são variados e baixos em alguns casos (Zheng e Murai, 1997; Green et
40
al., 2002), não havendo garantia de expressão no órgão/tecido adequado
(Neuteboom et al., 2002).
O uso de promotores ubíquos, como os citados, determina a expressão do
produto gênico em todos os órgãos da planta, o que nem sempre é desejável.
Promotores como o CaMV 35S quando associados, por exemplo, a genes
utilizados para seleção de transformantes (tais como os que conferem resistência
a antibióticos) determinam, em geral, a expressão do produto gênico em todos os
tecidos da planta. Tal característica, desnecessária e indesejável em plantas
geneticamente modificadas destinadas, por exemplo, à alimentação animal e
principalmente humana, tende a diminuir a aceitação do produto final, ou de seus
derivados, pelos consumidores. Portanto, promotores tecido-específicos seriam de
grande importância nestes casos, e alguns estudos já vem sendo conduzidos com
esse propósito. Como exemplo podemos citar o trabalho realizado por Huang et al.
(2001) que desenvolveram em arroz, a partir da identificação de um promotor calo-
específico, um método de seleção de plantas transformadas que inviabiliza a
expressão do gene de resistência ao agente de seleção em outros órgãos/tecidos,
como por exemplo, no grão. Promotores com tais características permitem o
correto direcionamento da expressão dos genes de interesse evitando os efeitos
indesejáveis possivelmente derivados da expressão constitutiva em toda a planta.
Outro motivo de preocupação relativo ao uso de plantas geneticamente
modificadas refere-se à expressão de proteínas tóxicas como as utilizadas para o
controle de determinados insetos pragas. Muitos trabalhos relatam a eficiente
utilização da toxina Bt (de Bacillus thuringiensis) em plantas transgênicas no
41
controle de pragas (Shu et al., 2000; Leroy et al., 2000, Nester et al., 2002).
Entretanto, tal metodologia pode fazer com que os insetos alvo adquiriram
resistência quando mantidos sob constante pressão de seleção (Meng et al.,
2004), o que normalmente acontece quando promotores constitutivos são
utilizados para expressão das proteínas heterólogas. Adicionalmente, a presença
da toxina em todas as partes da planta pode causar a insatisfação e até mesmo
repulsão do produto pelo consumidor.
Esses efeitos indesejados poderiam ser minimizados através do uso de
promotores órgão/tecido-específicos que, se possível, fossem responsivos a
determinados estímulos como, por exemplo, a um determinado estresse biótico.
Neste caso, a expressão do transgene seria limitada ao período de duração do
estímulo e principalmente direcionada para o local onde o estímulo foi produzido.
Promotores com tais características já têm sido isolados em diferentes espécies
vegetais (Park et al., 2000; Song et al., 2002; Wang et al., 2002) e até mesmo
sinteticamente construídos para este fim (Rushton et al., 2002). Um aspecto
limitante, nesses casos, refere-se às questões de propriedade intelectual que
restringem a utilização dos mesmos. Por outro lado, a disponibilidade de
promotores com padrões de expressão conhecidos e restritos a determinados
órgãos/tecidos é praticamente inexistente em café (Tabela 1).
42
Tabela 1. Promotores isolados de café Promotor Produto do gene intacto Órgão/tecido Referência
11S** Proteína de reserva 11S Fruto/Sementes Marraccini et al.,
1999
NMT* N-metiltransferase Folha Satyanarayana et al., 2005
CcDH2* Dehidrina Fruto/Sementes Hinniger et al., 2006
rbcS1** Rubisco – subunidade menor Folha US Patent 7153953
Tub** Alfa-tubulina Ubíquo US Patent 6903247
OLE** Oleosina Fruto/Sementes WO/2007/005928
PAL** Fenilalanina amônia-liase Ubíquo US Patent 6441273
*Coffea canephora **Coffea arabica
A obtenção de plantas geneticamente modificadas com genes de interesse
agronômico (relacionados com resistência a pragas, doenças, seca, geada, etc...)
isolados de espécies selvagens de Coffea representa um avanço significativo, pois
permite acelerar drasticamente o processo de obtenção de novos cultivares.
Nesse contexto, o direcionamento da expressão dos genes de interesse para
determinados órgãos específicos da planta utilizando-se de promotores
tecido/órgão-específicos provenientes da própria espécie, constitui uma importante
ferramenta biotecnológica. Tal inovação viabiliza não só a construção de cassetes
de expressão compostos de subunidades (promotor e gene) pertencentes ao
gênero Coffea, mas também a obtenção de um padrão de expressão tecido-
específico altamente desejável tanto do ponto de vista de biossegurança como de
opinião pública. A busca por promotores com tais características tem sido uma
43
prioridade em programas biotecnológicos que visam a produção e liberação
comercial de organismos geneticamente modificados.
1.6 Projeto Genoma Café
Em fevereiro de 2002, por iniciativa do Consórcio Brasileiro de Pesquisa e
Desenvolvimento do Café (CBP&D-Café) (coordenado pela Embrapa Café), em
colaboração com a Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP) e a Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, teve início o Projeto
Genoma Café. O banco de dados gerado é composto por aproximadamente 37
diferentes bibliotecas de ESTs (Tabela 2) oriundas de diversos órgãos/tecidos
(folhas, raízes, frutos, flores e ramos) de Coffea arabica, Coffea canephora e
Coffea racemosa, órgãos/tecidos estes sadios ou submetidos a condições de
estresse biótico e/ou abiótico (pragas, doenças, frio, calor, seca) em diversos
estágios de desenvolvimento. Foram seqüenciados 214964 ESTs sendo 130792
de C. arabica, 12381 de C. canephora e 10566 de C. racemosa. Após a
clusterização dos mesmos chegou-se a um valor total de 17982 contigs e 32155
singletons, resultando em aproximadamente 33000 diferentes seqüências (Vieira
et al., 2006). Buscas empregando a ferramenta Blast no Genbank do National
Center for Biotechnology Information (NCBI) revelou que cerca de 22% das
seqüências geradas não apresentaram similaridade significativa com seqüências
depositadas no banco (Vieira et al., 2006).
44
Espera-se que as informações geradas a partir do projeto Genoma Café
possam viabilizar, com maior rapidez e eficiência, o desenvolvimento de
variedades tolerantes a estresse abióticos e principalmente resistentes ao ataque
de pragas e doenças.
45
Tabela 2. Listagem das bibliotecas, e seus respectivos tecidos/tratamentos,
geradas e seqüenciadas pelo projeto Genoma Café. À direita encontram-se os
valores numéricos de reads seqüenciados por biblioteca.
Bibliotecas Características Números de reads válidos
AR1,LP1 Plântulas e folhas tratadas com ácido araquidônico 5664
BP1 Suspensão celular tratada com acibenzolar-S-methyl 12379
CB1 Suspensão celular tratada com acibenzolar-S-methyl e brassinosteróides 10311
CL2 Hipocótilos tratados com acibenzolar-S-methyl 11615
CS1 Suspensão celular tratada com NaCl 10803
EA1,IA1,IA2 Calos embriogênicos 9191
EB1 Embrião zigótico (fruto imaturo) 192
EC1 Calos embriogênicos de Coffea canephora 8050
EM1,SI3 Sementes em germinação 9201
FB1,FB2,FB4 Botão floral em diferentes estágios de desenvolvimento 23036
FR1,FR2 Botão floral + chumbinho + frutos em diferentes estágios de maturação 14779
FR4 Frutos (Coffea racemosa ) 7967
FV2 Frutos estágios 1,2 e 3 (Coffea racemosa ) 7195
CA1,IC1,PC1 Calo não embriogênico com e sem 2,4 D 12135
LV4,LV5 Folhas jovens dos ramos plagiotrópicos 15067
LV8,LV9 Folhas adultas dos ramos plagiotrópicos 11864
NS1 Raízes infectadas com nematóides 569
PA1 Calo embriogênico primário 2483
RM1 Folhas infectadas com bicho-mineiro e ferrugem 5567
RT3 Raízes 560
RT5 Raízes com acibenzolar-S-methyl 2311
RT8 Células em suspensão estressadas com alumínio 9119
RX1 Ramos infectados com Xylella spp. 9563
SH1 Folhas de plantas em estresse hídrico (Coffea canephora ) 368
SH2 Plantas em estresse hídrico (vários tecidos) 6824
46
2. Objetivos
47
O presente trabalho teve como objetivo isolar e caracterizar promotores
específicos de raiz e folha de Coffea arabica, ativados ou não sob condições de
estresse biótico (nematóide e ferrugem), empregando-se para tal as informações
do Banco de Dados do Projeto EST Genoma Café.
48
3. Material e Métodos
49
3.1 Material Vegetal
Em todos os experimentos descritos no presente trabalho foram utilizados
órgãos/tecidos vegetais da espécie Coffea arabica, variedade Mundo Novo,
material este susceptível a ferrugem, bicho mineiro e nematóide, variedade esta
pertencente ao Programa de Melhoramento do Instituto Agronômico de Campinas
(IAC). Os materiais vegetais foram mantidos no Centro de Análise e Pesquisa
Tecnológica do Agronegócio do Café "Alcides Carvalho" situado no IAC, onde
também foram realizadas todas as análises empregando os mesmos.
3.2 Seleção in silico de ESTs com padrão de expressão
órgão/tecido – específico
Os ESTs com padrão de expressão órgão/tecido-específico foram
selecionados in silico empregando-se o banco de dados do Genoma Café
(http://www.lge.ibi.unicamp.br/cafe/). Para tal foram utilizadas as ferramentas de
northern eletrônico disponíveis no site.
A identificação dos ESTs órgão/tecido-específicos foi feita comparando-se
os contigs presentes em dada biblioteca tecido-especifica com os contigs
presentes nas demais bibliotecas. Os contigs formados por reads provenientes
unicamente de uma determinada biblioteca e representado um determinado tecido
ou órgão foram considerados tecido-específicos. Tais contigs foram então
50
analisados quanto à presença dos mesmos em bibliotecas oriundas de tecidos
submetidos a determinados estresses. Todos os ESTs selecionados e tidos como
tecido-específicos foram submetidos a análises de Blast no banco do NCBI
(http:www.ncbi.nlm.nih.gov.br) visando confirmação da identidade dos mesmos.
Após a fase de seleção in silico, a especificidade a um dado tecido foi confirmada
por meio da técnica de Transcrição Reversa (RT)-PCR utilizando-se
oligonucleotídeos específicos.
3.3 Extração de RNA total de café
Visando confirmar in vivo, via RT-PCR, a especificidade da expressão dos
ESTs selecionados nas análises in silico, o RNA total de diferentes órgãos/tecidos
de café foi extraído utilizando protocolo desenvolvido em nosso laboratório.
Amostras de flor, frutos em diferentes fases de desenvolvimento
(chumbinho, chumbão, verde, verde cana e maduro), folha sadia, folha atacada
com bicho mineiro, folha infectada com ferrugem, raiz sadia, raiz infectada com
nematóides, foram coletadas e mantidas à -80°C até o processo de extração ser
iniciado.
Aproximadamente 500 mg do tecido vegetal foi macerado em nitrogênio
líquido, com auxílio de um almofariz, juntamente com 5 ml de tampão de extração
(8 M Guanidina-HCl; 50 mM Tris-HCl pH 8; 20 mM EDTA pH 8; 2% PVP PM
40000 e 50 mM de β-mercaptoetanol) até a obtenção de um pó fino e
51
homogêneo. O macerado foi então transferido para um tudo de centrifuga de 15 ml
e mantido no gelo até o completo descongelamento do mesmo. Em seguida foram
adicionados 5 ml de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico, na proporção de
25:24:1(v/v), homogeneizando a solução por inversão por aproximadamente 30
segundos. Posteriormente as amostras foram centrifugadas a 10000g por 15
minutos a 4°C (todas centrifugações desse protocolo foram realizadas a 4°C).
Após centrifugação a fase superior foi coletada e transferida para um novo tubo de
15 ml e a extração repetida com a adição de 5 ml de fenol: clorofórmio: álcool
isoamílico (25:24:1, v/v) com subseqüente centrifugação a 10000g por 15 minutos.
A fase superior foi novamente coletada e lavada com 1 volume de clorofórmio:
isoamílico (24:1, v/v) até o completo desaparecimento de fase orgânica, sendo
que entre as lavagens o material foi centrifugado por 10000g por 15 minutos e a
fase superior coletada.
Com a fase aquosa livre de impurezas, o RNA foi precipitado com 0,2
volumes de acetato de sódio 1M e 1 volume de etanol absoluto gelado por 12
horas a 4°C. A amostra foi então centrifugada a 13000g por 30 minutos e o
sobrenadante descartado. O precipitado foi lavado duas vezes com 300 µl de
acetato de sódio 3M e uma vez com 1 ml de etanol 70% gelado. O precipitado foi
mantido à temperatura ambiente visando a completa evaporação do etanol, e logo
após, este foi ressuspendido em 100 µl de água estéril ultra pura.
52
3.4 Quantificação do RNA e síntese de cDNA
Após extração, o RNA total foi analisado por eletroforese em gel
desnaturante de agarose 1% contendo formaldeído como agente desnaturante. O
gel foi corado com brometo de etídeo 0,1 µg/ml. Após verificação da integridade,
os RNAs foram quantificados em espectrofotômetro a 260 nm e 280 nm,
assumindo que A260=1,0 corresponde a 40 µg/ml de RNA. Após quantificação, 1
µg de RNA total foi tratado com DNAse I e utilizado para síntese dos cDNAs.
Os cDNAs foram sintetizados utilizando-se o kit ThermoScript TM RT-PCR
System (Invitrogen Life Technologies) conforme protocolo descrito pelo fabricante.
3.5 Validação dos cDNAs obtidos
Os cDNAs foram validados via RT-PCR utilizando oligonucleotídeos
específicos (actin-F: GACCTCACAGATCACCTCAT, actin-R:
GTAGTCTCGTGGATACCAGC) cujo alvo de amplificação é o gene ubíquo que
codifica actina em café. As reações foram realizadas empregando 0.5 µl de cDNA
em tampão de reação 1X contendo 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 0,1 µM
de cada oligonucleotídeo e 5 unidades (u) da enzima Taq DNA polimerase
(Invitrogen). As condições de ciclagem foram: desnaturação inicial a 94oC por 5
minutos, seguida de 30 ciclos de 94oC por 45 segundos, 52oC por 40 segundos de
polimerização a 72oC por 1 minuto.
53
3.6 Confirmação da especificidade de expressão
A especificidade de expressão dos ESTs selecionados nas análises in silico
foi validada por PCR empregando-se alíquotas de cDNA dos diferentes
órgãos/tecidos de café. Para tal, pares de oligonucleotídeos (forward e reverso)
específicos para cada EST identificado no banco foram sintetizados (Tabelas 3 e
4) e utilizados nas reações de amplificação. Nesse caso, a seqüência de
nucleotídeos do read mais conservado do contig selecionado foi utilizada para
desenho dos oligos. As reações foram realizadas como descrito no item 3.5 (0.5 µl
de cDNA, 1X PCR Buffer; 1,5 mM MgCl2; 0,2 mM dNTP mix; 0,1 µM de oligos
forward e reverso; e 5 u de Taq DNA polimerase) e as condições de ciclagem
estabelecidas levando-se em consideração o tamanho do fragmento amplificado e
a temperatura de anelamento dos oligos gene-específicos.
3.7 Análise da indução da expressão do gene específico de
raiz por ferimento empregando northern blot
Com o intuito de verificar a possível indução da expressão do gene raiz-
específico por lesão mecânica, sementes de C. arabica var. Mundo Novo, foram
germinadas em papel de filtro umedecido com água destilada. As plântulas foram
mantidas em câmara de crescimento a 28°C sob fotoperíodo de 16 horas de luz
entre 30 á 40 dias, até que atingissem o grau de desenvolvimento radicular
54
desejado (~10 centímetros). Pequenas lesões radiculares foram induzidas
artificialmente com auxílio de bisturi estéril. Amostras foram coletadas nos tempos
0, 24, 48, 72 horas pós-ferimento para posterior extração de RNA total e análise
por northern blot utilizando uma sonda especifica.
O RNA total (25 µg) extraído das raízes nos tempos amostrados foi
separado em procedimento padrão de eletroforese em gel desnaturante 1,2%
agarose em tampão MOPS 1X. Após a eletroforese, o RNA total foi transferido por
capilaridade, durante 16 horas, em solução 10X SSC para uma membrana de
nylon (Hybond N+; Amersham, Buckinghamshire, UK). Após a transferência, a
membrana foi levada ao forno a uma temperatura de 80°C, por cerca de 10
minutos (secagem da membrana), e em seguida, o RNA foi fixado por exposição
da membrana à luz ultravioleta durante 10 segundos.
3.7.1 Marcação de sonda e hibridização da membrana
A sonda foi marcada a partir de um molde correspondente a um fragmento
de 400 pb amplificado por PCR e purificado um gel de agarose. Este fragmento
correspondente a uma região interna do EST específico de raiz selecionado no
banco do Genoma Café, região esta, única ao EST em questão quando
comparada em análise empregando a ferramenta Blast no NCBI.
Aproximadamente 50 ng de DNA foram marcados com dATP32 utilizando-se
o kit Ready-To-Go TM DNA Labelling Beads (Amersham Pharmacia Biotec). O
55
procedimento de marcação e purificação da sonda foi realizado conforme descrito
pelo fabricante. A pré-hibridização da membrana foi realizada em solução de
hibridização (50% formamida deionizada; 5X SSPE, 5X Solução Denhards; 1%
SDS) durante 4 horas a temperatura de 42°C. Após a pré-hibridização, a sonda
previamente marcada com 32P e desnaturada por 5 minutos a temperatura de
100°C foi cuidadosamente adicionada à solução de hibridação (50% formamida
deionizada; 5X SSPE, 5X Solução Denhards; 1% SDS), sendo a membrana
incubada por 16 horas a 42°C. Após esse período, a membrana foi lavada por três
vezes durante 15 minutos em solução de lavagem (2X SSC + 0,1% SDS) à
temperatura de 42°C. Em seguida, a membrana foi exposta a um filme de auto-
radiografia por 72 horas a temperatura de –70°C sendo o mesmo posteriormente
revelado.
3.8 Isolamento e identificação das regiões promotoras
A região do DNA localizada a montante (5’) dos ESTs validados por RT-
PCR, correspondente portanto a região regulatória dos genes em análise, foi
amplificada empregando a técnica de genome walking e DNA genômico de café.
Para tal os seguintes procedimentos foram realizados.
56
3.8.1 Isolamento de DNA total de folha de café
As amostras de folha foram coletadas no inicio da manhã, sendo
selecionadas preferencialmente folhas jovens, pertencentes ao segundo par dos
ramos plagiotrópicos. Após a coleta, as folhas foram lavadas com etanol 70% e
água Milli-Q estéril e mantidas em nitrogênio líquido.
Aproximadamente 1 g do tecido vegetal foi macerado em nitrogênio líquido,
com auxílio de um almofariz, juntamente com 7 ml de tampão de extração (350
mM de Sorbitol; 100 mM Tris-HCl pH8; 50 mM EDTA pH 8; 0,5% Bisulfito de sódio
ou 50 mM de β-mercaptoetanol) até a obtenção de um pó fino e homogêneo. O
macerado foi então transferido para um tudo de centrífuga de 50 ml e mantido no
gelo até o completo descongelamento da amostra. Em seguida a amostra foi
centrifugada a 10000g por 20 minutos a 4°C. Após essa etapa o sobrenadante foi
descartado e o precipitado ressuspendido em 2,5 ml de tampão de extração.
Acrescentou-se 3,5 ml de tampão de lise (200 mM Tris-HCl pH8; 50 mM EDTA pH
8; 2 M NaCl; 2% MATAB), sendo a amostra homogeneizada por inversão.
Adicionou-se 700 µl de SDS 10%, procedendo-se novas inversões até a solução
ficar translúcida. Posteriormente a amostra foi incubada em banho-maria a 65°C
por 30 minutos, misturando-a ocasionalmente. Após esse período os tubos foram
retirados do banho e mantidos na capela até atingirem a temperatura ambiente.
Em seguida adicionou-se 1 volume (~7 ml) de clorofórmio: álcool isoamílico (24:1,
v/v) e procedeu-se uma nova homogeneização por inversão. A emulsão foi então
57
submetida a centrifugação a 10000g por 20 minutos a 4°C. A fase aquosa superior
foi transferida cuidadosamente para um novo tudo e o DNA precipitado com 500 µl
de acetato de sódio 3 M e 5 ml de isopropanol absoluto gelado, sendo mantida a -
20°C por no mínimo 4 horas. Após o período de incubação a amostra foi
centrifugada a 10000g por 30 minutos a 4°C e o sobrenadante descartado. O
precipitado foi lavado com etanol 70% gelado e mantido à temperatura ambiente
até a completa evaporação do mesmo. O DNA foi então ressuspenso em 200 µl
de solução TRIS-EDTA pH 8.0 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 e 1 mM EDTA, pH 8.0)
sendo mantido acondicionado em freezer -20°C.
3.8.2 Amplificação das regiões promotoras por genome
walking (GW)
As regiões promotoras putativas foram amplificadas utilizando-se o kit
Universal Genome Walker (Clontech), seguindo-se a risca o protocolo fornecido
pelo fabricante.
Foram sintetizados dois oligonucleotídeos gene-específicos reversos (GSP1
e GPS2), dispostos em seqüência, para cada seqüência alvo (read depositado no
banco). No desenho dos referidos oligos alguns parâmetros importantes foram
estabelecidos: tamanho (de 25 a 28 nucleotídeos); temperatura de melting (~67
°C) e conteúdo em G/C (de 40 a 60%). Para ambos genes com expressão tecido-
58
especifica em análise, os GSPs foram posicionados o mais próximo da região 5’
do EST cuja seqüência estava disponível no banco.
Para a construção das bibliotecas de GW, quatro alíquotas de DNA
genômico de café (20 µg/cada) foram digeridas separadamente com as enzimas
de restrição DraI, EcoRV, PvuII e StuI, durante 18 horas, sendo a digestão
monitorada periodicamente em gel de agarose. As amostras digeridas com as
enzimas EcoRV e PvuII não ficaram boas, sendo as mesmas descartadas.
Após digestão do DNA genômico com as enzimas DraI e StuI, adaptadores
foram ligados à porção terminal dos fragmentos originados para a montagem das
bibliotecas. Visando a amplificação das regiões promotoras, alíquotas de DNA das
bibliotecas foram submetidas a rounds de amplificação por PCR (de acordo com o
protocolo do fabricante) utilizando-se dos oligos GSP1/GPS2 e oligonucleotídeos
complementares aos adaptadores (AP1/AP2). Amostras foram analisadas em gel
de agarose 1% corado com brometo de etídeo.
3.8.3 Isolamento, purificação e clonagem das regiões
promotoras
Os fragmentos únicos amplificados na etapa de GW foram retirados do gel
de agarose com auxílio de uma lâmina descartável, e purificados utilizando-se o kit
QIAEX II Gel Extraction (Quiagen) de acordo com especificações fornecidas pelo
fabricante. O DNA foi eluído da coluna utilizando-se água ultrapura a 70°C e não
59
com solução TRIS-EDTA (TE), a fim de eliminar possível interferência do EDTA
em futuras ligações do inserto ao vetor.
Os produtos de amplificação purificados foram em seguida inseridos no
vetor pGEM® -T Easy (Promega). Alíquotas de aproximadamente 150 ng de DNA
foram dispostas em microtubo de 1 ml juntamente com 50% de Tampão de
Ligação 2X, 50 ng de vetor e 5 u de T4 DNA ligase. A reação de ligação
permaneceu por 16 horas à 14°C. Após esse período, uma alíquota do produto de
ligação foi inserida em Escherichia coli cepa DH5α por eletroporação.
Antes da eletroporação propriamente dita, células competentes de E. coli
cepa DH5α foram preparadas conforme descrito por Sambrook & Russel (2001), e
aliquotadas em tubos de 1ml e acondicionadas a -80°C.
No processo de eletroporação foram utilizados o equipamento BioRad
modelo Gene Pulser II e cubetas estéreis do mesmo fabricante. Foram aplicados
pulsos de 2.200-volts em 38 µl de células competentes adicionadas de 2 µl (~40
ng) do produto da ligação, totalizando um volume de reação 40 µl. Vale a pena
ressaltar que antes de efetuar os pulsos tanto a cubeta quanto as amostras foram
mantidas no gelo.
Imediatamente após o pulso, as células foram ressuspendidas em 1 ml de
meio Luria-Bertani (LB) líquido (10 g triptona; 5 g extrato de levedura, 10 g NaCl),
transferidas para tudo de microcentrífuga de 1,5 ml e mantidas sob agitação
constante de 300 rpm a 37°C durante 1 hora. Em seguida 300 µl da cultura foram
plaqueados em placas de Petri contendo meio LB sólido acrescido do antibiótico
apropriado, no caso ampicilina (100 mg/l) e contendo IPTG (24 mg/l) (isopropyl-β-
60
D-thiogalactopyranoside) e X-Gal (20 mg/l). As placas foram mantidas em estufa
a 37°C durante 16 horas.
3.8.4 Minipreparação de DNA plasmidial e seqüenciamento
dos insertos
Foram selecionados três clones de cada evento de transformação para
validação quanto à presença do plasmídeo recombinante. Prováveis colônias
recombinantes (brancas) foram repicadas em 3 ml de meio LB líquido acrescido
de ampicilina 100 mg/l e mantidas sob agitação constante de 300 rpm a 37°C
durante 16 horas. Após o período de incubação as amostras foram centrifugadas e
sucessivas minipreparações de DNA plasmidial foram realizadas, utilizando-se o
QIAGEN Kit Miniprep (Quiagen), conforme descrito pelo fabricante.
Os plasmídeos foram analisados via padrão de digestão com EcoRI e
visualização em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo. As digestões
foram realizadas a 37°C na presença de tampão de reação 1X, 30 ng de DNA
plasmidial e água. Confirmada a presença do inserto, o DNA plasmidial (200 ng)
foi submetido a uma reação de seqüenciamento empregando o ABI PRISM®
BigDye Terminator Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems). Foram
seqüenciados 3 clones de cada evento utilizando um equipamento automático
modelo ABI PRISM 377 (Applied Biosystems).
61
As seqüências foram analisadas utilizando-se o programa Chromas 2.30 e
um consenso a partir dos três clones seqüenciados foi obtido. Um PCR de
validação foi realizado a fim de confirmar a sobreposição das regiões amplificadas
em relação aos seus respectivos ESTs. Para tal foram utilizados oligos forward
desenhados com base nas seqüências promotoras putativas obtidas e os oligos
reversos gene-específicos GSP1 e GSP2. Os produtos foram analisados em gel
de agarose 1% corado com brometo de etídeo.
3.8.5 Análise das seqüências e busca de domínios
regulatórios
As seqüências obtidas foram submetidas a análises comparativas com
seqüências depositadas no banco de dados do NCBI usando Blastn. Ao mesmo
tempo foram realizadas buscas por motivos regulatórios normalmente presentes
em regiões promotoras de genes de plantas utilizando o banco do PLACE
database (http:///www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/) (Higo et al., 1999).
62
3.9 Análise funcional das regiões promotoras através de
expressão transiente em raiz e folha de Coffea arabica
Antes de darmos início às análises funcionais através de transformação
estável em tabaco, a funcionalidade das regiões promotoras isoladas foi testada
em experimentos de expressão transiente via biobalística, utilizando-se para tal,
plântulas de Coffea arabica variedade Mundo Novo.
Cerca de cem sementes foram esterilizadas em hipoclorito de sódio, na
concentração de 1% de cloro ativo, durante 30 minutos. As sementes foram então
lavadas em abundância com água Milli-Q estéril, depositadas em papel de
germinação e mantidas em câmara de crescimento a uma temperatura de 30°C
durante aproximadamente 40 dias, até atingirem o tamanho desejado
(denominado de orelha de onça).
A fim de testar a viabilidade do processo de expressão transiente via
biobalística em café (dados não disponíveis na literatura), utilizou-se inicialmente o
vetor pRT103-Gus (pRT103 modificado; Töpfer et al., 1987) como controle. Este
vetor apresenta o gene repórter uidA (que codifica a β-glucuronidase - Gus) sob o
controle do promotor constitutivo 35S de CaMV (Figura 4).
Foram realizados testes de biobalística com dois diferentes tipos de
micropartícula, sendo testados ouro e tungstênio. Realizamos também testes com
pressão de disparo de 1100 e 600 psi, respectivamente.
63
3.9.1 Preparação das micropartículas
Ambas micropartículas foram preparadas em paralelo (ouro BioRad 1.0
micron e tungstênio M25 BioRad), seguindo protocolo descrito por pesquisadores
da Embrapa Milho e Sorgo - Sete Lagoas (Manual de Transformação Genética de
Plantas).
Trinta miligramas de cada micropartícula foram transferidos para tubos de
microcentrífuga e tratados com 1 ml de etanol 70% durante 15 minutos sob
agitação baixa constante. Amostras foram centrifugadas a 15000g durante 5
minutos, o sobrenadante descartado e o pellet lavado 3 vezes com água Milli-Q
estéril, com sucessivas centrifugações (5 minutos a 15000g) entre as lavagens.
Após a última lavagem descartou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o pellet
em 500 µl de glicerol 50% estéril, distribuindo-se em alíquotas de 50 µl (~ 60
mg/ml) e estocando-as a -20°C.
Às alíquotas de micropartículas foram adicionados cerca de 10 µg de DNA
plasmidial (na concentração de 1 µg/µl), 50 µl de CaCl2 2,5 mM, 20 µl de
espermidina 100 mM, homogeneizando-as imediatamente e mantendo-as sob
agitação lenta durante 10 minutos. Uma centrifugação por 10 segundos a 8000g
visando uma leve sedimentação das micropartículas foi então realizada. O
sobrenadante foi descartado e o pellet cuidadosamente lavado duas vezes com
150 µl de etanol 70% e uma vez com etanol absoluto. As amostras foram
64
ressuspensas em 60 µl de etanol absoluto, e dispostas em alíquotas de 10 µl por
membrana de disparo (capton 50 micra).
3.9.2 Teste controle de biobalística e ensaio enzimático de
Gus
Nos experimentos de biobalística foi utilizado um acelerador de partículas
(Biomics) desenvolvido pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnológicos.
Foram utilizadas plântulas de café (variedade Mundo Novo) com
aproximadamente 45 dias pós-germinação em estágio de orelha de onça.
Durante os experimentos quase todos os parâmetros físicos variáveis de
bombardeio foram mantidos constantes. Apenas o tipo de micropartícula (ouro ou
tungstênio) e a pressão de disparo (1100 ou 600 psi de gás hélio) foram
modificados.
Foram realizados quatro disparos controle (pRT103 - Gus) por lote de seis
plântulas, sendo dois disparos na região epicotiledonar e dois na região
hipocotiledonar, alterando os parâmetros acima descritos (micropartícula/pressão),
a fim de verificar a melhor forma de obtenção de expressão transiente de Gus em
folhas e raízes de café.
O ensaio enzimático de revelação de Gus foi feito após 48 horas. O material
bombardeado foi submerso em solução de 50 mM de fosfato de sódio pH 7.5, 10
mM Na2EDTA, 0.1% Sarcosil, 0.1% Triton X-100, 5 mM Ferrocianato de potássio,
65
5 mM Ferrocianeto de potássio, 10 mM β-mercaptoetanol e 1 mM do substrato X-
Gluc. As amostras foram mantidas no escuro a temperatura de 30°C durante 16
horas. Após esse período o material foi lavado com etanol 70%, visando o
bloqueio da atividade de Gus e a completa retirada da clorofila (no caso das
folhas), e então fixado em glicerol 50%.
3.9.3 Construção do cassete de expressão no vetor pRT103
– Gus
Para viabilizar a clonagem dos fragmentos obtidos por GW (putativas
regiões promotoras) no vetor pRT103-Gus, oligonucleotídeos específicos foram
desenhados visando a amplificação completa das seqüências regulatórias em
estudo. Sítios de reconhecimento para as enzimas de restrição HindIII na região 5’
(oligo forward) e NcoI na região 3’ (oligo reverso) foram adicionados aos mesmos
para viabilizar a clonagem dos produtos amplificados no vetor pRT103-Gus
igualmente digerido. Assim procedendo, o promotor 35S do vetor é substituído
pela seqüência promotora em análise de tal forma que o códon de iniciação do
gene gus fique em fase como o primeiro nucleotídeo da região regulatória a ser
testada. Cabe citar que foram escolhidas as enzimas HindIII e NcoI, pois em
testes de digestão estas não clivavam os fragmentos amplificados por GW.
66
Como o vetor pRT103-Gus (Figura 4) apresenta dois sítios de restrição para
a enzima HindIII (circulado em vermelho), foi necessário realizar digestão parcial
do vetor para a retirada do promotor 35S (Figura 5).
Quatro alíquotas de aproximadamente 500 ng de pRT103-Gus foram
digeridas com 10 unidades (u) da enzima de NcoI a 37°C durante 3 horas. Depois
de monitorada, via gel de agarose, a linearização completa do vetor (Figura 5A),
este foi submetido a diferentes digestões com 5 u de HindIII em tempos de 5, 7, 10
e 15 minutos (Figura 5B). Verificou-se que a interrupção da reação após 10
minutos gerava produtos de digestão parcial que continham o fragmento desejado
(pRT103-Gus sem o promotor 35S). Repetiu-se então o processo de digestão no
tempo acima citado, e um fragmento de aproximadamente 4.3 kb, correspondente
ao vetor pRT103-Gus sem o promotor 35S, foi isolado e purificado do gel de
agarose utilizando-se o kit QIAEX II Gel Extraction (QIAGEN).
pRT103-Gus
bp
Sm14poly-A signal
AmpR
HindIII HindIII
BalI
NcoI BamHIGUS
35S
ori
Figura 4. Representação esquemática do vetor pRT103-Gus (~5 Kb) que
apresenta o gene repórter uidA (GUS) inserido entre os sítios BamHI e NcoI sob o
controle do promotor constitutivo CaMV35S. As posições dos sítios HindIII estão
indicadas por um círculo vermelho. Adaptado de Töpfer et al. (1987).
67
1 2 3 4 M CO 5 7 10 15 M CO
B)- 5 Kb
A)
Figura 5. Ensaio de digestão parcial do vetor pRT103-Gus visando a retirada do
promotor constitutivo CaMV35S. Quatro amostras de 500 ng de pRT103-Gus
foram linearizadas com 10 u NcoI a 37°C durante 3 horas e analisadas em gel de
agarose 1% corado com brometo de etídeo (A). Digestões parciais posteriores
com HindIII com duração de 5, 7, 10 e 15 minutos (B) revelaram que o melhor
tempo para o isolamento do fragmento correspondente ao vetor sem o promotor
CaMV35S encontra-se no tempo de 10 minutos. M, marcador de peso molecular;
CO, controle plasmídeo linearizado.
As ligações foram realizadas na proporção de 3:1 (inserto : vetor) durante
18 horas a 16°C, sendo os produtos de ligação posteriormente utilizados para
transformação de E. coli eletrocompetente, cepa DH5α. As transformações foram
realizadas em eletroporador (BioRad) como descrito, plaqueadas em meio LB
seletivo contendo antibiótico apropriado (ampicilina 100 µg/ml) e colocadas para
crescer em estufa a 37°C durante 18 horas.
Cinco clones de cada construção foram repicados e colocados para crescer
em meio LB líquido seletivo a 37°C durante 16 horas sob agitação constante (200
rpm). Minipreparações de DNA plasmidial dos clones obtidos e ensaios de
digestão com enzimas de restrição foram realizados para confirmar a correta
68
inserção dos fragmentos promotores no vetor. As seguintes construções foram
então obtidas: promotor do gene com expressão específica em raiz fusionado
transcricionalmente ao gene da uidA (Figura 6A) e promotor do gene com
expressão específica em folha fusionado transcricionalmente ao gene da uidA
(Figura 6B).
B)
A)
ATG
NcoI HindIII
Poly-A signal uidA Promotor de folha
ATG
NcoI HindIII
Poly-A signal uidA Promotor de raiz
Figura 6. Representação esquemática dos cassetes de expressão desenvolvidos
para a análise funcional das regiões promotoras amplificadas via genome walking
(os promotores não se encontram em escala). A) Promotor do gene com
expressão específica em raiz fusionado ao gene repórter uidA e B) Promotor do
gene com expressão específica em folha fusionado ao gene repórter uidA. Os
cassetes foram inseridos em vetor pRT103-Gus desprovido do promotor
CaMV35S.
69
3.9.4 Ensaio de expressão transiente em folha e raiz de
Coffea arabica via biobalística
Os plasmídeos contendo os cassetes de expressão usados nos ensaios de
expressão transiente (Figura 6) foram purificados empregando-se o QIAGEN
Plasmid Midi Kit (QIAGEN), segundo protocolo fornecido pelo fabricante. Após as
preparações, alíquotas do DNA plasmidial foram quantificadas em
espectrofotômetro a 260 nm e as amostras ajustadas para a concentração final
desejada (1 µg/µl).
Para os ensaios de biobalística foram utilizadas as construções abaixo
relacionadas e como controle positivo o vetor pRT103-Gus fechado, isto é,
contendo o gene uidA sob controle do promotor CaMV35S. Os tratamentos foram:
• Construção 1 - Controle positivo CaMV35S + Gus
• Construção 2 - Promotor específico de folha + Gus
• Construção 3 - Promotor específico de raiz + Gus
Todas construções foram bombardeadas tanto na região hipocotiledonar
como na epicotiledonar adotando os procedimentos descritos no protocolo do
Manual de Transformação Genética de Plantas, produzido pela Embrapa Milho e
Sorgo - Sete Lagoas, com algumas modificações. Foram realizados 8 disparos por
planta, sendo quatro na região hipocotiledonar (1100 psi), dois disparos de cada
70
lado da plântula e quatro na região epicotiledonar (600 psi), sendo repetida as
inversões.
Após os ensaios de biobalística, o material vegetal foi mantido em papel de
germinação umedecido com água Milli-Q em câmara de crescimento a 30°C
durante 48 horas, tempo após o qual foi iniciado o ensaio enzimático de revelação.
A revelação foi realizada como descrito anteriormente (item 3.9.2) e o material
analisado em lupa e em microscópio óptico.
3.10 Construção do cassete de expressão em pCAMBIA-
1381 visando transformação estável em tabaco
Cerca de 1 µg dos plasmídeos pRT103 contendo os cassetes de expressão
em análise, utilizados e principalmente funcionais em experimentos de expressão
transiente, foram digeridos a 37°C durante 3 horas com as enzimas de restrição
HindIII e NcoI para a excisão das regiões promotoras. O vetor de transformação
pCAMBIA-1381 (Figura 7) foi igualmente digerido com HindIII e NcoI.
As ligações foram realizadas na proporção de 3:1 (inserto : vetor) durante
18 horas a 16°C, sendo os produtos de ligação posteriormente utilizados para
transformação de E. coli eletrocompetente, cepa DH5α. As bactérias foram então
plaqueadas em meio LB seletivo contendo antibiótico apropriado (canamicina 100
µg/ml) e incubadas em estufa a 37°C durante 18 horas.
71
Três clones de cada construção foram repicados em meio LB líquido
seletivo e colocados para crescer a 37 °C durante 16 horas sob agitação
constante (200 rpm). Após a obtenção do DNA plasmidial, estes foram
seqüenciados em seqüenciador automático visando analisar se as regiões
promotoras aqui identificadas encontravam-se corretamente fusionadas ao gene
uidA do vetor pCAMBIA-1381.
Figura 7. Representação esquemática do plasmídeo pCAMBIA-1381 (Cambia)
utilizado na construção dos cassetes de expressão visando a posterior
transformação estável de tabaco empregando Agrobacterium tumefaciens. Os
promotores identificados nesse trabalho foram clonados entre os sítios HindIII e
NcoI em fusão com o gene repórter uidA (Fonte:
http://www.cambia.org/daisy/cambia/home.html).
72
3.11 Transformação de Agrobacterium tumefaciens cepa
LBA4404 por eletroporação e confirmação das células
transformadas
Células eletrocompetentes de Agrobacterium tumefaciens cepa LBA4404
foram transformadas com as referidas construções conforme descrito no item
3.9.3, entretanto com algumas modificações. No processo de eletroporação foram
aplicados pulsos de 2.200-Volts em 38 µl de células competentes contendo 2 µl
(~40 ng) da ligação. Imediatamente após o pulso, as células foram ressuspensas
em 1 ml de meio YEP líquido (10 g triptona; 10 g extrato de levedura, 10 g NaCl),
transferidas para tudo de microcentrífuga de 1,5 ml e mantidas sob agitação
constante de 300 rpm a 28°C durante 4 horas. Após esse período, 300 µl foram
plaqueados em meio YEP sólido acrescido de antibiótico apropriado, no caso
canamicina 100 µg/ml, estreptomocina 300 µg/ml e rifampicina 100 µg/ml. As
placas foram mantidas em estufa a 28°C durante 48 horas.
Após esse período, três clones de cada construção foram repicados em 3
ml de meio YEP liquido seletivo (contendo canamicina 100 µg/ml, estreptomocina
300 µg/ml e rifampicina 100 µg/ml) e a cultura permaneceu em estufa a 28°C
durante 48 horas sob agitação constante de 200 rpm. Minipreparações de DNA
plasmidial (QIAGEN Kit Miniprep) e análises de PCR utilizando-se de oligos
73
específicos foram realizadas a fim de confirmar a transformação das
agrobactérias.
3.12 Obtenção de plantas transgênicas de tabaco
As agrobactérias transformadas com os cassetes de expressão contendo
os promotores de raiz e folha, respectivamente, foram incubadas em 5 ml de meio
YEP líquido seletivo com agitação entre 100-150 rpm a 28°C, até atingirem uma
absorbância (600 nm) entre 0.5 e 1. Posteriormente, 1 ml do inóculo de cada
construção foi transferido para um tubo de centrífuga de 50 ml, ao qual foi
adicionado 4 ml de meio YEP líquido. Tais amostras foram mantidas à
temperatura ambiente até a utilização.
Plantas de tabaco (Nicotiana tabacum SR1) cultivadas in vitro foram
utilizadas no processo de transformação. Discos foliares de 1 cm2 foram retirados
com auxílio de um vazador de ferro previamente esterilizado, e mantidos em placa
de Petri até o processo de transformação. Para cada construção foram utilizadas
cinco placas de Petri com dez discos foliares cada. Os discos foram imersos por
15 minutos no meio YEP contendo as agrobactérias sendo posteriormente secos
em papel de filtro estéril e transferidos para placas contendo meio MS sólido
(Murashige & Skoog, 1962). Essas placas forma mantidas no escuro durante 48
horas em sala de crescimento a 28°C. Após esse período, os discos foram
transferidos para placas de Petri contendo meio MS sólido adicionado de 100
74
µg/ml de higromicina, 500 µg/ml de cefotaxima, 1 µg/ml de 6-benzilaminopurina
(BAP) e 100 µg/ml ácido naftalenoacético (ANA). As placas foram mantidas por
aproximadamente 30 dias em sala de crescimento sob fotoperíodo de 16 horas de
luz até o surgimento de calos. Como controle positivo foram utilizados discos
foliares não transformados mantidos no meio seletivo acima citado.
Posteriormente as pequenas plântulas formadas a partir desses calos foram
individualizadas em potes de vidro contendo meio de enraizamento (meio MS
descrito acima, porém desprovido do hormônio 6-benzilaminopurina) para indução
da formação de raízes.
3.13 Análise dos transformantes via PCR e ensaio
enzimático de Gus
Foram regeneradas 17 plantas transformadas com a construção contendo o
promotor específico de folha e 27 com a construção contendo o promotor
específico de raiz, respectivamente. A fim de confirmar a inserção dos cassete de
expressão, DNA genômico das prováveis plantas transgênicas foi extraído a partir
de tecido foliar, utilizando o protocolo descrito por Konieczny e Ausubel (1993),
com algumas modificações.
Cerca de 100 mg de tecido foliar de tabaco, previamente macerado em
nitrogênio líquido, foram transferidos para tubo de microcentrífuga e a este
adicionado 500 µl de tampão de extração, contendo 100 mM Tris pH 8, 50 mM
75
EDTA pH8, 500 mM NaCl, 10 mM de β-mercaptoetanol e 35 µl de SDS 20%. As
amostras foram incubadas a 65°C por 10 minutos e após esse período foi
adicionado 130 µl de acetato de potássio 5 M. Em seguida as amostras foram
mantidas durante 5 minutos no gelo e posteriormente centrifugadas durante 15
minutos a 15000g. O sobrenadante foi então transferido para um novo tubo, e o
DNA precipitado com 640 µl de isopropanol e 60 µl de acetato de sódio 3 M,
permanecendo durante 30 minutos a -20°C. As amostras foram então
centrifugadas a 15000g durante 15 minutos, o sobrenadante descartado e o
sedimento (DNA) lavado com 500 µl de etanol 70% gelado. Após a completa
secagem do mesmo, o DNA foi ressuspenso em 50 µl de água Milli-Q.
A inserção dos cassetes de expressão nas plantas regeneradas foi
confirmada em reações de PCR empregando 2 µl de DNA genômico em tampão
de reação 1X, contendo 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 1µM
oligonucleotídeo específicos forward e reverso, e 5 u de Taq DNA polimerase
(Invitrogen). Os produtos de amplificação foram analisados em gel de agarose 1%
corado com brometo de etídeo. As plantas tidas como positivas na reação de PCR
foram submetidas a ensaio histoquímico de Gus como descrito no item 3.9.2.
76
3.14 Análise da expressão do gene repórter uidA em plantas
transgênicas transformadas com o cassete de expressão
contendo o promotor específico de folha em resposta a dano
mecânico
Para tal foram analisadas aleatoriamente cinco plantas da geração F1 de
cinco diferentes eventos de transformação (sendo amostrado portanto um total de
vinte e cinco plantas), todas positivas em análise de PCR e em ensaio
histoquímico de Gus. Plântulas de aproximadamente 30 d.a.g (dias após
germinação) tiveram parte de suas folhas lesionadas, com auxilio de uma pinça
estéril e 4 horas após tratamento, as mesmas foram submetidas a ensaio
histoquímico de Gus como descrito no item 3.9.2.
3.15 Análise da expressão do gene repórter uidA em plantas
transgênicas transformadas com o cassete de expressão
contendo o promotor específico de raiz em resposta ao ataque de
nematóides
Neste experimento foram utilizados nematóides da espécie Meloidogyne
javanica reproduzidos e isolados de tomateiros. Aproximadamente 300 gramas de
77
tecido radicular infectado com M. javanica foram triturados durante 30 segundos,
com auxilio de um liquidificador comercial, em 200 ml de hipoclorito de sódio a
0,05%. A solução foi então peneirada em telas de nylon de 250 e 25 µM,
respectivamente. O material depositado na peneira de 250 µM foi descartado
(restos de tecido radicular) e o retido na peneira de 25 µM (ovos e nematóides em
estágio juvenil) foi enxaguado com água em abundância, visando a completa
retirada do hipoclorito de sódio. Posteriormente o material foi coletado, diluído em
200 ml de água potável e transferido para um Becker de vidro. Esta solução foi
mantida sob aeração constante, com auxílio de uma bomba de aquário, e mantida
em banho-maria a 28ºC durante 72 horas no escuro. Esta etapa é de extrema
importância a fim de obter um inoculo homogêneo, com grande quantidade de
nematóides em estágio juvenil. Após esse período, uma amostra de 1 ml da
solução foi analisada em microscópio óptico e uma contagem estimada do número
de nematóides foi realizada. Foram inoculadas 60 plantas, sendo amostradas
aleatoriamente 12 plantas de 5 diferentes eventos de transformação, todas
positivas em ensaio de PCR, utilizando-se para tal, aproximadamente 4.000
nematóides em estágio juvenil por planta. As plantas inoculadas foram submetidas
a ensaio histoquímico de Gus, como descrito no item 3.9.2, após 24, 72 e 336 (14
dias) horas de tratamento.
78
4. Resultados
79
4.1 Seleção in silico de ESTs órgão/tecido–específicos
As análises in silico dos genes com expressão órgão/tecido-específica
foram realizadas utilizando-se as informações e ferramentas disponíveis no Banco
de Dados do projeto EST Genoma Café (http://www.lge.ibi.unicamp.br/cafe/). Para
tal, critérios mencionados no item 3.2 foram seguidos.
Durante as análises foram identificadas treze seqüências com provável
expressão específica em raiz, isto é, contigs formados unicamente por reads
oriundos de bibliotecas de tecido radicular (Tabela 3) e quinze seqüências com
provável expressão específica em folha, ou seja, contigs formados unicamente por
reads provenientes de bibliotecas de folha (Tabela 4). A fim de confirmar a
identidade dos candidatos selecionados, as seqüências de nucleotídeos dos ESTs
correspondentes foram anotadas manualmente e comparadas com as seqüências
depositadas no Genbank (NCBI). Pares de oligos específicos aos candidatos
selecionados foram sintetizados (Tabela 3 e 4) e utilizados em experimentos de
validação por RT-PCR empregando RNA total extraído de diferentes
órgãos/tecidos de café.
80
Tabela 3. Listagem dos candidatos identificados via análise de northern eletrônico, apresentado padrão de expressão específico
em raiz. As seqüências dos oligonucleotídeos empregados para validação da especificidade dos ESTs selecionados in silico
estão disponibilizadas.
Cluster Blast RT-PCR Oligos (5’- 3’)
CART8-061-D05 Glutathione S-Tranferase Peroxidase N F-ATTGATGAGGTTTGGCATGA R-CCTTTTCAGGATCAGCAAGG CART5-010-E02 Peroxidase (EC 1.11.1.7) Isozyme 40K Precursor R, L F-AAGCAGGCTTTCGTTTCTCA R-CCCTTGGAAGAACTCACTGC Contig 126944 Disease Resistance Protein (CC-NBS class) Todos F-CAAGGGCTTCTCTCCTCCTT
R-TTTGGTGACGAGTCCCTTGT Contig 13823 Phosphomannose Isomerase R, L F-GTAGGCTGCCGTTTTTGCT R-AGAACGTACGTAGCGCCTTG Contig 13619 Alcohol Dehydrogenase R, L, F F-TGTTCCTCGTTGTCGATCAG
R-GTACCATCGAAGGCATGAGC Contig 13952 Putative Regulatory Protein Todos F-TGTTCCTCGTTGTCGATCAG
R-TGGATCATCGGGATCAATTT Contig 219558 Putative Peroxidase R, F F-GGCACCTTTTCCTGATTCAA R-GTGCCTCCTTTTCTCCTTGG Contig 3887 PRUAR Major allergen Pru ar 1 Todos F-GTTGGTATTGCGCTTGAGGT R-TTACCAAGATGCTGCCACAG Contig 6221 Pectin Methylesterase Todos F-GCAATTGCACCAAGTGAAGA R-TTGGAATGCATCAATCTTGC Contig 2507 Putative Germin-like Protein R, F F-TTGCAGGATTTTTGTGTTGC R-AAGAACGCCCTCTAACACGA Contig 5896 Pathogen-Inducible Alpha-Dioxygenase R, F F-TGAGCCCCACTAACAAATCC R-TATCAATGGGTCACCAAGCA Contig118723 Glutathione S-Transferase R, L, F F-TTTGCAAAGCCCGTAAGAAT R-GCCCAGAACTTTGAGTGAGC
R – Raiz; L – Folha; F – Fruto; N – Não houve amplificação; Todos – Houve amplificação em todos os órgãos/tecidos analisados.
81
Tabela 4. Listagem dos candidatos identificados via análise por northern eletrônico, apresentando padrão de expressão
especifico em folha. As seqüências dos oligonucleotídeos empregados para validação da especificidade dos ESTs selecionado in
silico estão disponibilizadas.
Cluster Blast RT-PCR Oligos (5’- 3’) CALV5-050-G01 NBS-LRR- Similar Type Resistance Gene L,F,R F-GGGAACAAAGCATGATCACA
R-TAGGATTTGCGCAGGTAGGT Contig 13074 Disease Resistance-like Protein Todos F-AAGCAGACCGACCGACTCTA R-AGAACGTACGTAGCGCCTTG Contig 619 Hypothetical Protein L,F F-GCGAAAAATACCACCAGCAG
R-CTGCTGTTGCACGAAACCGC Contig 13743 Hypothetical Protein Todos F-GGCACCTTTTCCTGATTCAA R-GTGCCTCCTTTTCTCCTTGG Contig 12440 Oxidoreductase - Zinc-binding Dehydrogenase Family L,R F-GAAAGCCTGACGCTGGTAGA R-GCAATACGACGGCTCACAC Contig 1117 Sensory Box Histidine Kinase-Response Regulator N F-AAGGCTTCCTTGGCTTCTTC R-GCAACTCGATGGTGTGATCT Contig 12571 Thioredoxin-like Protein CDSP32 L,F,R F-TGAAGCTGCTGCCTTAACAA R-TGAAGCATCTGCACCATCTC Contig 142 Carbonic Anhydrase Todos F-TTCTCCACCTTGAGATGCAA R-TCGATGCAGTCGAGAAGTTG Contig 12073 CITLA Malate Dehydrogenase L, F F-GATCAGCAATCCCGTGAACT R-ACACCAGCATCACCCCTAAG Contig 11772 Cytochrome B6-F Complex Iron-Sulfur Subunit 1 N F-AAGTCGCCAGTGTCCTGTCT R-CAAGTGTGCCTGCTGATGAT Contig 12251 GOSHI Catalase Isozyme 1 Todos F-TACTCCACAAGTGGGCTTCC R-TTGATCTGGTGGGGAACAAT Contig 12440 Chloroplast Ferredoxin Oxidoreductase precursor L,F F-TGTCATCGATTCCCTTCTCC R-CGGGAAAGAAATGCTAATGC Contig 12327 Fructose-Bisphosphate Aldolase L,F,R F-AGCTCCTCTTCACCTCACCA R-GCTCCGATGGTTCAGTAGGA Contig 12717 Photosystem I Subunit XI L,F F-TCTCTGCAGCTCCATTCAGA R-TTGATGTCGGTGTTCCTCAA R – Raiz; L – Folha; F – Fruto; N – Não houve amplificação; Todos – Houve amplificação em todos os órgãos/tecidos analisados.
82
4.2 Extração e quantificação de RNA total de diferentes
órgãos de Coffea arabica e de frutos em diferentes fases de
amadurecimento. Síntese e validação da integridade dos cDNAs
Amostras de RNA total de diferentes órgãos de C. arabica, com ou sem
estresse, e de frutos em diferentes fazes de maturação, foram extraídas e os
respectivos cDNAs sintetizados empregando a enzima Superscript III e oligo-dT
(Invitrogen). A fim de avaliar a integridade e a qualidade dos cDNAs sintetizados
na RT, uma amplificação prévia foi realizada empregando-se oligos específicos
para o gene que codifica actina em café. Conforme pode ser constatado na Figura
8, uma banda de tamanho esperado foi amplificada em todas as amostras
analisadas, indicando haver uma concentração similar de cDNA entre os
diferentes órgãos analisados.
83
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 CO M
- 0.3 kb
Figura 8. Amplificação por RT-PCR de um transcrito ubíquo codificando actina. O
produto esperado de 300 pb foi observado em todas as amostras analisadas (1-
chumbinho, 2- chumbão, 3- fruto verde, 4- fruto verde-cana, 5- fruto maduro, 6-
folha sadia, 7- folha infectada com bicho mineiro (6 dias), 8- folha infectada com
bicho mineiro (11 dias), 9- raiz sadia, 10- raiz infectada com nematóide (24 horas),
11- raiz infectada com nematóide (72 horas), CO - controle positivo, M- marcador
de peso molecular. As amostras foram analisadas em gel 1% agarose corado com
brometo de etídeo.
4.3 Confirmação da especificidade de expressão dos
candidatos selecionados in silico
Treze candidatos com provável expressão em raízes (Tabela 3) e quinze
com provável expressão em folha (Tabela 4) foram selecionados nas análises in
silico. A verificação da especificidade de expressão foi realizada através de PCR
utilizando todos os cDNAs sintetizados e testados anteriormente e
oligonucleotídeos desenhados para cada um dos candidatos em análise. Esses
experimentos confirmaram a expressão órgão-específica de dois desses
84
candidatos sendo um expresso exclusivamente em raiz (Figura 9) e outro em folha
(Figura 10).
O EST validado como sendo específico de raiz foi identificado no banco de
dados do projeto Genoma Café como uma seqüência única (singleton), presente
em biblioteca de raiz induzida com benzothiadiazole (acibenzolar-S-methyl) (BHT),
análogo do ácido salicílico. Essa seqüência quando submetida ao banco de ESTs
do café não se alinha com nenhuma outra seqüência, representando portanto um
transcrito único. Já o EST cujo padrão de expressão foi validado como sendo
específico de folha é formado por um contig composto por reads provenientes das
bibliotecas de folhas infectadas com ferrugem e folhas sadias (Tabela 2),
respectivamente.
Uma análise detalhada dos resultados de RT-PCR obtidos para o candidato
com expressão em raiz demonstra a amplificação de um fragmento de tamanho
esperado (500 pb) na amostra de cDNA proveniente de tecido radicular (Figura 9;
linha 8). Nenhum produto de amplificação foi observado nos demais
órgãos/tecidos analisados. Adicionalmente, uma banda de maior intensidade,
provavelmente refletindo um maior acúmulo do transcrito em questão, foi
observada em tecido radicular infectado com nematóides (Figura 9; linhas 9, 10 e
11), sugerindo que o gene em questão é induzido pelo ataque de nematóides.
85
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M
- 500 pb
Figura 9. Análise de RT-PCR revelando amplificação de transcrito específico de
raiz em Coffea arabica, variedade Mundo Novo. A amplificação de um fragmento
de tamanho esperado (500 pb) em amostras provenientes de RNA total de raiz
demonstra que o gene é somente expresso nesse órgão. Um aumento de
expressão desse gene em raízes infectadas por nematóides pode ser observada
(comparar linhas 8, 9, 10 e 11). As amostras foram analisadas em gel 1% agarose
corado com brometo de etídeo. Amostras: 1- chumbinho, 2- chumbão, 3- fruto
verde, 4- fruto verde-cana, 5- fruto maduro, 6- folha sadia, 7-folha atacada por
bicho mineiro, 8- raiz sadia, 9- raiz infectada com nematóide (24 horas), 10- raiz
infectada com nematóide (72 horas), 11- raiz infectada com nematóide (240
horas), M- marcador de peso molecular.
Ao analisarmos os resultados obtidos nos experimentos de RT-PCR para o
gene com expressão específica em folha, verificamos a amplificação de um
fragmento de tamanho esperado (300 pb) em amostras de cDNA provenientes de
tecido foliar sadio e em folhas infectadas com bicho mineiro e ferrugem (Figura 10;
linhas 7, 8 e 10). Entretanto, o transcrito estudado não foi amplificado em
amostras provenientes de plantas de C. arabica (Catuaí) resistentes à ferrugem,
sugerindo que em tais plantas a via de ativação do gene em questão está
desligada.
86
1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 10 11
- 300 pb
Figura 10. Análise de RT-PCR revelando a amplificação de transcrito específico
de folha em Coffea arabica, variedade Mundo Novo. A amplificação de um
fragmento de tamanho esperado (300 pb) em amostras provenientes de RNA total
de folha demonstra que o gene é somente expresso nesse tecido, mesmo quando
atacado por bicho mineiro. As amostras foram analisadas em gel 1% agarose
corado com brometo de etídeo. Amostras: 1-chumbinho, 2-chumbão, 3-fruto verde,
4-fruto verde-cana, 5-fruto maduro, 6-raiz, 7-folha sadia, 8-folha atacada por bicho
mineiro e ferrugem (6 dias), 9- folha de híbrido resistente (Coffea arabica com
Coffea racemosa) atacada por bicho mineiro e ferrugem (6 dias), 10- folha atacada
por bicho mineiro e ferrugem (11 dias), 11- folha de híbrido resistente (Coffea
arabica com Coffea racemosa) atacada com bicho mineiro e ferrugem (11 dias),
M-marcador de peso molecular.
A falta de material vegetal na época do ano em que os experimentos de
validação foram realizados inviabilizou a inclusão de amostras de flor em tais
análises. Entretanto, experimentos posteriores realizados pela doutoranda Carla
Barsalobres, utilizando os oligonucleotídeos específicos aqui obtidos e amostras
de cDNA de flor e caule de C. arabica, indicaram que os genes validados não são
expressos nesses órgãos.
87
4.4 Análise da expressão do gene com expressão em raiz
frente à injúria mecânica
Como observado nos experimentos de validação do candidato com
expressão específica em raiz (Figura 9), um maior acúmulo do transcrito estudado
em raízes infectadas por nematóide foi observado, sugerindo que além de
órgão/tecido-específico, este gene tem seu padrão de expressão aumentado
quando induzido pelo ataque do parasita. Visando descartar a hipótese de que o
aumento de expressão observado ocorreu devido ao dano mecânico
(machucado), novos experimentos foram elaborados.
Nesse caso, lesões radiculares foram induzidas artificialmente e amostras
foram coletadas em diferentes tempos visando a extração de RNA total e análise
de expressão via northern blot empregando sonda específica. Os resultados
obtidos (Figura 11) indicam que não existe uma correlação entre a lesão induzida
e o aumento da expressão do gene em estudo. Tal fato sugere uma indução
específica pelo ataque do parasita e não pela injuria mecânica.
88
0 24 – 24 + 48 + 72 + horas A) B)
Figura 11. Análise por northern blot da acumulação do transcrito específico de raiz
em condições de estresse mecânico. Amostras de RNA total (20 µg) de raízes
lesionadas artificialmente foram coletadas em diferentes tempos, separadas em
gel de agarose desnaturante e transferidas para membrana Hybond N+. Esta foi
hibridizada com sonda específica ao transcrito, marcada com 32P. A) tempo 0; 24-
24 h sem ferimento; 24+ 24 h pós-ferimento; 48+ 48 h pós-ferimento; 72+ 72 h
pós-ferimento; B) Padrão de carregamento corado com brometo de etídeo.
4.5 Isolamento e identificação das regiões promotoras
Confirmada a especificidade da expressão gênica via RT-PCR, iniciou-se o
isolamento da região posicionada a montante (5’) da seqüência do EST
depositada no banco (provável região promotora) empregando o kit Universal
Genome Walker (Clontech).
Após alguns rounds de PCR utilizando ciclos particulares e uma
combinação dos oligonucleotídeos específicos (AP1-GSP1), um produto de
89
amplificação único de aproximadamente 2 kb para o gene com expressão
específica em raiz foi amplificado (Figura 12 – biblioteca StuI). Da mesma
maneira, quando a combinação AP1-GSP1 foi utilizada para isolar a região
promotora do gene com expressão específica em folha, um produto também único
de 850 pb foi amplificado (Figura 13 – biblioteca DraI). Ambos os fragmentos
amplificados confirmaram a especificidade quando reamplificados com oligos
internos (combinação AP2-GSP2) (Figura 12B e 13B). Os fragmentos em questão
foram purificados em gel de agarose, clonados em vetor pGEM®-T Easy
(Promega) e inseridos em E. coli cepa DH5α.
Dra I
Stu I
Stu I
Stu I
A) B) -2.0 Kb
C+C-M
-2.0 Kb
MC-C+C-
AP1-GSP1 AP2-GSP2
Figura 12. Gel de agarose contendo os produtos de amplificação obtidos para o
candidato com expressão específica em raiz empregando a técnica de genome
walking e a combinação dos oligos AP1/GSP1 e AP2/GSP2. A) produto único de
amplificação, de aproximadamente 2 kb, obtido a partir da biblioteca StuI
utilizando-se AP1/GSP1. B) Produto obtido a partir de um segundo round de
amplificação utilizando os oligos AP2/GSP2 (canaleta 1 - Stu I) confirmando a
especificidade da amplificação. C+, controle positivo; C-, controle negativo; M,
marcador de peso molecular.
90
B)-0.85 Kb
Stu I
tu ISDra I M C-C+C-
-1.0 Kb
M C-C+C- Dra I
A)
AP1-GSP1 AP2-GSP2 Figura 13. Gel de agarose contendo os produtos de amplificação obtidos para o
candidato com expressão específica em folha empregando a técnica de genome
walking e a combinação dos oligos AP1/GSP1 e AP2/GSP2. A) produto único de
amplificação, de aproximadamente 850 pb, obtido a partir da biblioteca DraI
utilizando os oligos AP1/GSP1. B) Produto obtido a partir de um segundo round
de amplificação utilizando os oligos AP2/GSP2 (canaleta 1 - DraI) confirmando a
especificidade da amplificação. C+, controle positivo; C-, controle negativo; M,
marcador de peso molecular.
4.6 Seqüenciamento dos produtos de GW e obtenção dos
consensos
Três clones que continham o inserto de 850 pb foram seqüenciados e um
consenso foi formado a partir das seqüências obtidas, sendo este denominado
região promotora específica de folha. O mesmo foi realizado com o fragmento de 2
kb, mas devido ao tamanho do produto amplificado, não foi possível finalizar a
91
seqüência do mesmo numa única tentativa. Novos oligos, internos à região
seqüenciada, foram sintetizados e novas reações de seqüenciamento permitiram a
obtenção de uma seqüência consenso de 2097 pb.
Visando verificar se as seqüências amplificadas estavam realmente
situadas a montante dos ESTs validados, reações de PCR empregando DNA
genômico de café e oligos específicos (F - dentro da região promotora e R -
situado na região 5’ do EST) resultaram na amplificação de produtos específicos
(não apresentado), demonstrando que a seqüência amplificada por GW estava
correta e apresentava uma sobreposição com a porção 5’ do candidato
selecionado. Esse resultado confirma que as seqüências amplificadas estão
realmente situadas a montante dos ESTs depositados no banco.
A submissão das seqüências amplificadas por GW no Genbank
empregando a ferramenta Blastn revelou a ausência de qualquer identidade ou
similaridade com seqüências depositadas, indicando tratar-se de seqüências até
então desconhecidas.
4.7 Busca por elementos cis- regulatórios nos promotores
Foram realizadas buscas por elementos regulatórios nas seqüências
amplificadas por GW utilizando-se o banco de dados PLACE
(http:///www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/) (Higo et al., 1999).
92
4.7.1 Elementos cis-regulatórios presentes na região
promotora do candidato com expressão específica em folha
Uma comparação da seqüência amplificada por GW com o EST depositado
no banco do Genoma Café revelou a existência de uma região 5’ não traduzida
(UTR) de aproximadamente 280 pb, indicando portanto que o fragmento
amplificado (875 pb) continha 280 pb de região 5’ UTR e 595 pb de provável
região promotora. Os resultados obtidos nas análises computacionais desse
fragmento, utilizando informações do banco de dados do PLACE, revelaram a
presença de elementos regulatórios específicos (Figura 14 e 15) que corroboram a
provável função fisiológica desempenhada pelo gene em estudo na planta.
Além da presença de motivos típicos de regiões promotoras de eucariotos,
como o TATA-box, normalmente presente a 30 pb do ponto de início da
transcrição (+1), e elementos proximais tipicamente localizados a
aproximadamente 100 (CCAAT-box) e 200 pb (GC-box) acima do ponto de início
da transcrição (Stephen e James, 2003), outros elementos chaves foram
encontrados, especialmente aqueles relacionados com a indução por fatores
abióticos e principalmente bióticos (Figura 15).
Um desses elementos regulatórios corresponde à seqüência TGTCA,
motivo característico de ligação a fatores de transcrição associados à resposta de
resistência em plantas.
93
Um outro elemento encontrado na região amplificada foi o motivo W Box
composto por seqüências do tipo [(T)TGAC(C)] ou TGAC (Eugem et al., 1999).
No fragmento em análise, a seqüência TGAC encontra-se repetida in tandem e
separada por um elemento GATA-box (Figura 14). Dezessete nucleotídeos pós a
seqüência acima, mais três repetições de motivos W Box (TAATTTCTGACCTTA)
com a mesma disposição são encontradas.
-444 CTAATTTCTGACCTTACAAGATAATACTAATTTCTGACCTTACAA -399
TAATTTCTGACCTTACCTTAGAAGATATTATCTTACTAGATAATTTCTGACCTTAATTCTAATTTCTAACCTTACAAGATATTATCTTACAAGATAATTTCTGACCTTAC
- 272 - 382
Figura 14. Seqüência parcial de nucleotídeos do promotor específico de folha
analisado com auxílio do banco de dados do PLACE. As seqüências sublinhadas
representam sítios conservados do tipo W Box, elementos caracterizados por
serem regiões de reconhecimento de fatores de transcrição do tipo WRKY.
A aproximadamente -215 pb, uma seqüência de ativação induzida por
giberilina e ácido abscísico (GARE – TTTTTTCC) pode ser observada. Um
sítio MYC (CATGTG), que possui um importante papel no processo de
indução do gene ERD1 (Early Responsive to Dehydration Stress 1) em
resposta a estresse hídrico em A. thaliana (Tran et al., 2004), também foi
constatado.
Mais adiante, chegando próximo ao provável ponto de início de
transcrição, identificou-se um novo sítio W-box contendo a seqüência
TTGACC, que é encontrado nos elementos W1 e W2 dos promotores dos
94
genes PR1-1e PR1-2 de salsa (Petroselinum crispum), sendo PR1 um gene
induzido por patógenos. Os boxes W1 e W2 são sítios de ligação para os
fatores WRKY1 e WRKY2, respectivamente.
Dois motivos característicos de promotores de genes induzidos por
luz e principalmente envolvidos na biosíntese de flavonóides, denominados
ACE (ACGT) e MRE (MYB) (Hartmann et al., 2005) também estão
presentes e localizados próximo a ponto de início de transcrição.
-456 -456 -456 --- 436436436 ---410410410 ---375375375 ---335335335 ---280280280 ---100100100 ---444444
---595 595 595 111---
5’5’5’5’
TATA BOXTATA BOXTATA BOXTATA BOXMREMREMREMRE
MYCMYCMYCMYCACEACEACEACE
GAREGAREGAREGAREGATAGATAGATAGATA
TGTCATGTCATGTCATGTCAW BoxW BoxW BoxW Box
3’3’3’3’
Figura 15. Esquema de localização dos elementos regulatórios encontrados no
promotor do gene com expressão específica em folha por análise comparativa
com banco de dados do PLACE.
95
4.7.2 Elementos cis-regulatórios presentes na região
promotora do gene com expressão específica em raiz
A busca por elementos cis-regulatórios presentes na região promotora do
gene com expressão específica em raiz, utilizando-se de informações disponíveis
no banco de dados do PLACE, revelou a presença de inúmeros motivos
comumente encontrados em regiões promotoras de plantas.
Além da presença dos bem caracterizados TATA Box, CCAAT Box e GC
Box (Stephen e James, 2003) encontrados em promotores de eucariotos, foram
também encontrados diversos elementos especificamente presente em regiões
promotoras de genes induzidos por fatores bióticos (Figura 16).
Próximo à extremidade 5’ do fragmento de 2 kb foi possível identificar um
motivo TGACG (“as-1 element activity), comumente presente em promotores de
genes ativados por auxina e ácido salicílico (Klinedinst et al., 2000). Em plantas,
esses elementos conferem uma expressão específica em raiz, sendo induzidos
em resposta a hormônios e estresse xenobióticos (An et al., 1990; Liu and Lam,
1994; Ulmasov et al., 1994; Xiang et al., 1996).
Duas repetições da seqüência TGTCA também são encontradas. A
seqüência TGTCA corresponde ao sítio de reconhecimento de proteínas do tipo
BIHD1 (BELL type homedomain proteins) caracterizadas em arroz. Luo et al.
(2005) demonstraram que o gene OsBIHD1 de arroz é induzido por
benzotiadiazole (BTH).
96
Ao longo da região promotora isolada verificamos a presença de três
repetições da seqüência CATATG encontrada no promotor do gene SAUR 15A de
soja, cuja expressão é regulada por auxina (Xu et al., 1997). Próximo à região do
putativo TATA-box encontra-se o sítio GT-1 que é capaz de estabilizar o complexo
TFIIA-TBP-DNA, e está presente em vários promotores de diferentes espécies de
plantas (Terzaghi et al., 1995).
Além disso, foi encontrado um sítio GARE (sitio de ativação induzido por
giberilina e ácido abscísico) bem como inúmeros sítios de ligação para os fatores
de transcrição descritos no item anterior como WRKY, ERF, bZIP, MYB e MYC,
fatores estes considerados chaves na resposta de defesa das plantas (Rushton
and Somssich, 1998; Riechmann and Ratcliffe, 2000; Singh et al., 2002). Cabe
destacar a presença dos motivos AAAGAT e CTCTT encontrados inicialmente na
região promotora do gene lbc3 que codifica leghemoglobina em soja e é específico
de raiz. A região apresenta também, ao centro da região amplificada, um motivo
GAGAC caracterizado em promotores de genes induzidos por deficiência de
enxofre em A. thaliana. Várias seqüências do tipo CANNTG (MYC) e uma
seqüência do tipo CAATTG foram encontradas próximo ao provável TATA-box.
Escobar e colaboradores (1999) caracterizaram a região CAATTG em um
promotor de um gene altamente induzido em raiz de tomate quando infectadas
com nematóides causadores de galha (Meloidogyne incognita).
97
10801080 --
CANNTGCANNTGCANNTGGATAGATACAATTGCAATTGCAATTG
TATA BOXTATA BOXTATA BOXGAGACGAGACGAGACGACAATGACAATGACAATCTCTTCTCTTCTCTT
AAAGATAAAGATAAAGATCATATGCATATGCATATG
TGACGTGACGTGACGTGTCATGTCATGTCA
816 816 --2097 2097 11--
5’5’ 3’3’ -- Figura 16. Localização dos elementos regulatórios encontrados no promotor do
gene com expressão específica em raiz por análise comparativa com banco de
dados do PLACE. Cabe ressaltar que a numeração negativa é putativa, já que não
se conhece a exata localização do sítio de início de transcrição.
4.8 Análise das regiões promotoras através de expressão
transiente do gene repórter uidA em raiz e folha de Coffea arabica
Visando avaliar a funcionalidade e especificidade das regiões promotoras
isoladas no presente trabalho, cassetes de expressão foram desenvolvidos de
acordo com o item 3.9.3 e utilizados em experimentos de expressão transiente em
plântulas de café. Para tal, foram utilizadas as seguintes construções: 1) controle
positivo (vetor pRT103-Gus fechado ;Figura 4), 2) promotor específico de folha +
uidA (Figura 6A), 3) promotor específico de raiz + uidA (Figura 6B). Análises
prévias realizadas no presente trabalho indicaram que a técnica de transformação
transiente via biobalística em plântulas de café é viável e apresenta maior
98
eficiência de transformação quando são utilizadas micropartículas de ouro sob
pressão de 1100 psi na região hipocotiledonar e 600 psi na região epicotiledonar.
Todas construções foram bombardeadas tanto na região hipocotiledonar
como na epicotiledonar adotando os procedimentos descritos no item 3.9.2
Análises da atividade da enzima β-glucuronidase em plântulas controle
(bombardeadas com a construção 1), utilizando-se uma lupa com aumento de
10X, indicaram que o experimento foi bem sucedido. Estas demonstraram
atividades pontuais da enzima em ambas regiões bombardeadas, as quais foram
mais evidentes em tecidos jovens (Figura 17A e B).
A)
B)
Figura 17. Ensaio de expressão transiente, via biobalística, em raiz e folha de
Coffea arabica. Detecção da atividade do gene repórter uidA em raízes (A) e
folhas (B) transformadas com o vetor pRT103-Gus. Foram utilizadas partículas de
ouro BioRad 1.0 micron sob pressão de disparo de 1100 psi e 600 psi em raiz e
folha, respectivamente.
99
As plântulas bombardeadas com a construção 2 (uidA sob o controle do
promotor específico de folha) apresentaram um padrão de expressão da atividade
Gus diferente das plântulas controle, sendo os pontos correspondentes a essa
atividade (pontos azuis) observados nitidamente somente em tecido foliar (Figura
18A, B e C). Por outro lado, nenhuma atividade foi verificada (ausência de pontos
azuis) na região hipocotiledonar, mais especificamente em tecido radicular.
Análises do tecido bombardeado por microscopia óptica (aumento de 20X e
40X vezes) confirmaram a expressão celular pontual de Gus (Figura 19), sendo
essa a característica principal da técnica de biobalística.
CB A
Figura 18. Ensaio enzimático de Gus em folha de Coffea arabica transformada via
biobalística com o cassete de expressão contendo o promotor específico de folha.
A detecção da atividade do gene repórter em folha (setas em A, B e C) revela que
a região isolada via genome walking apresenta atividade transcricional específica
nesse órgão. Foram utilizadas partículas de ouro BioRad 1.0 micron sob pressão
de disparo de 600 psi.
100
Au -1µm
D E F
CB A
Figura 19. Expressão transiente de Gus em folha de Coffea arabica transformada
via biobalística com o cassete de expressão contendo o promotor específico de
folha. A análise de microscopia óptica confirma transformação pontual das células
epidermais (A, B, C, D e E), sendo verificada a presença de micropartículas nas
células transformadas. Foram utilizadas partículas de ouro BioRad 1.0 micron
(painel F) sob pressão de disparo de 600 psi.
Análises mais detalhadas, em microscópio óptico, do tecido foliar de café
bombardeado com a construção 2 (uidA sob o controle do promotor específico de
folha) revelaram a presença um grande número de estômatos transformados
(Figura 19, painel B e C) quando comparados com outras células.
Quando a construção 3 (uidA sob controle do promotor específico de raiz)
foi empregada, os pontos de atividade Gus foram observados somente na região
hipocotiledonar, nas raízes mais precisamente, não sendo detectados quaisquer
101
resquícios de atividade em outras partes da planta. Observações em microscopia
óptica também confirmaram a transformação e expressão celular pontual da
atividade de Gus em raízes (Figura 20).
Cabe ressaltar que um alto índice de transformação de células
meristemáticas, localizadas nas pontas das raízes, foi observado. Esse fato
sugere uma maior atividade promotora nessas células quando comparadas com
células adultas, indicando haver uma correlação entre os motivos caracterizados
in silico e a ativação do promotor em células meristemáticas.
102
D E F
CB A
Figura 20. Expressão transiente de Gus em raiz de Coffea arabica transformada
via biobalística com o cassete de expressão contendo o promotor específico de
raiz. A detecção da atividade do gene repórter Gus em raízes transformadas via
biobalística revela que a região isolada via genome walking apresenta atividade
transcricional específica (A). Confirmação da transformação pontual das células
por análise de microscopia óptica. (A, B, C, D, E e F). Foram utilizadas partículas
de ouro BioRad 1.0 micron sob pressão de disparo de 1100 psi.
103
4.9 Análise das plantas de tabaco transgênicas
Análises de PCR utilizando DNA genômico e oligonucleotídeos específicos
revelaram que das 17 plantas de tabaco regeneradas e transformadas com o
cassete de expressão contendo o gene uidA sob controle do promotor específico
de folha, 14 eram positivas e continham o referido cassete. Já das 27 plantas de
tabaco transformadas com o cassete de expressão contendo o promotor
específico de raiz, 20 foram positivas. Todas as plantas regeneradas, inclusive as
negativas em PCR, foram mantidas em casa de vegetação até obtenção de
sementes. Plântulas da geração F1 de todos os regenerantes foram analisadas
pelo ensaio histoquímico de Gus. Neste caso, das 14 plantas positivas em PCR
para o promotor de folha, 12 estavam realmente expressando o gene repórter
(Figura 21A). Por outro lado, das 20 plantas positivas em PCR para o promotor de
raiz, todas foram positivas para a atividade Gus (Figura 21B).
Como pode ser constatado na Figura 21A, nas plântulas transgênicas
transformadas com o gene repórter uidA sob controle do promotor específico de
folha, a expressão de Gus limita-se à região epicotiledonar, mais precisamente em
tecido foliar, indicado que o a região promotora isolada de Coffea arabica é
funcional e apresenta expressão tecido-específica. Cabe ressaltar que nenhum
sinal de Gus foi observado em tecido radicular de todas as plantas analisadas.
Já quando as plântulas transformadas com o promotor específico de raiz
foram analisadas, para nossa surpresa, a expressão do gene repórter foi
104
detectada tanto na região epicotiledonar como na região hipocotiledonar (Figura
21B).
B A
Figura 21. Ensaio histoquímico da atividade de β-glucuronidase em plântulas
transgênicas de tabaco transformadas, respectivamente, com os cassetes de
expressão contendo os promotores específicos de folha (A) e de raiz (B) isolados
de Coffea arabica. Painel A encontra-se uma amostra que define o padrão de
expressão do gene repórter observado em todas as plântulas transgênicas
transformadas com o cassete contendo o promotor específico de folha. Painel B
encontra-se uma amostra que define o padrão de expressão do gene repórter
observado em todas as plântulas transgênicas transformadas com o cassete
contendo o promotor especifico de raiz.
A perda de especificidade verificada nas plântulas transformadas com o
gene uidA sob controle do promotor específico de raiz (Figura 21B), foi observada
apenas nos estágios iniciais de desenvolvimento, limitando-se à região
epicotiledonar. Acredita-se que esta disfunção deva ser decorrente de uma
105
incorreta regulação do sistema transcricional nos estágios iniciais de
desenvolvimento das plântulas de tabaco, uma vez que, após o surgimento do
terceiro par de folhas, nenhum sinal de atividade Gus foi detectado nessa região.
4.10 Análise da indução da expressão do gene repórter uidA
em plantas transgênicas transformadas com o cassete contendo
o promotor específico de folha em resposta a dano mecânico
Vinte e cinco plantas (geração F1) de cinco diferentes eventos de
transformação com o cassete de expressão contendo o promotor específico de
folha, todas positivas em PCR e nos ensaios histoquímicos (Figura 22), foram
avaliadas nos experimentos de dano mecânico. Mínimas pressões foram
cuidadosamente geradas, com auxílio de uma pinça estéril, em todas as plantas
avaliadas. As injúrias foram limitadas a uma folha por planta (em apenas um lado
da folha) com preferência para o terceiro par de folhas. As plântulas foram então
analisadas, através de ensaio histoquímico, 4 horas após indução do estresse
mecânico.
106
Figura 22. Ensaio histoquímico da atividade da β-glucuronidase em discos foliares
de tabacos transgênicos transformados com o cassete de expressão contendo o
gene uidA sob controle do promotor específico de folha. Este ensaio foi realizado
visando a seleção de plantas positivas para utilização em experimentos de
estresse mecânico. Coluna 1, linha 3-planta controle não transformada.
Como pode ser constatado na Figura 23A, não foi possível detectar a
atividade do gene repórter em plantas controles (não transformadas) submetidas
ao estresse por dano mecânico. Entretanto, foi possível constatar que o dano
mecânico em plantas transgênicas (Figura 23B, C, D, E, F) ativou uma resposta
de expressão temporal e localizada do gene repórter. A somatória dos resultados
obtidos confirmam com segurança a hipótese de que a região promotora isolada a
partir do candidato com expressão específica em folha de Coffea arabica, além de
apresentar especificidade de expressão, é rapidamente induzida por ferimento.
107
D E F
B C A
Figura 23. Ensaio histoquímico da atividade da β-glucuronidase em folhas de
tabacos transgênicos transformados com o cassete de expressão contendo o
gene uidA sob controle do promotor específico de folha, em resposta a dano
mecânico. A) Planta selvagem lesionada, onde não há detecção da atividade do
gene repórter. Os painéis B, C, D, E e F representam o padrão de expressão de
Gus observado em todas as plantas transgênicas submetidas ao estresse por
dano mecânico.
108
4.11 Análise da indução da expressão do gene repórter uidA em plantas transgênicas transformadas com o cassete de expressão contendo o promotor específico de raiz em resposta ao ataque de nematóides
Sessenta plantas de tabaco transgênicos (geração F1) de
aproximadamente 60 dias, todas positivas em PCR para o cassete de expressão
contendo o promotor específico de raiz, foram inoculadas com nematóides da
espécie Meloidogyne javanica como descrito no item 3.15. Amostras foram
coletadas nos tempos de 24, 72 e 336 (14 dias) horas pós-inoculação com base
em resultados de expressão diferencial obtidos por Uehara et al. (2007) em
tomateiros infectados com nematóides causadores de galha. Nesse caso, os
autores verificaram que um homólogo do gene cujo promotor foi isolado em café, é
altamente expresso nas raízes de plantas infectadas poucos dias após penetração
do parasita.
Nenhum sinal de atividade do gene repórter pode ser detectado 24 horas
pós-inoculação (Figura 24; 20 plantas analisadas); entretanto, uma expressão
acentuada do gene repórter na raiz principal pode ser observada 72 horas pós-
inoculação em todas as plantas analisadas (20 plantas).
109
A B C
D
G H
E
Figura 24. Ensaio histoquímico da atividade da β-glu
tabacos transgênicos transformados com o cassete
gene uidA sob controle do promotor específico de raiz
nematóides. Os painéis A, B, C, D, E, F, G, H e I
expressão de Gus observado em todas as plantas tra
estresse biótico após 72 horas.
Quando analisadas amostras com 14 dias pós-tr
a expressão do gene repórter Gus foi especificamen
parasitadas pelos nematóides, as galhas (Figura 26A,
Pontos de atividade de Gus foram também observa
F
I
curonidase em raízes de
de expressão contendo o
em resposta ao ataque de
representam o padrão de
nsgênicas submetidas ao
atamento (Figura 25 e 26),
te localizada nas regiões
B, C, D, E, F, G, H e I).
dos nas fases iniciais de
110
infecção, regiões estas onde há início de hipertrofia celular (Figura 25A, B, C, D,
E, F, G, H e I). É possível verificar na Figura 25, painéis B e F, que a expressão do
gene repórter fica limitada à região central da raiz (cilindro vascular), local este
onde os nematóides iniciam a atividade parasitaria com conseqüente formação do
sítio de alimentação e das células gigantes.
Tais resultados indicam claramente que a região promotora isolada de café,
além de apresentar uma expressão específica em órgão radicular, é
preferencialmente ativada em situações onde ocorre infecção por nematóides.
111
D E
G H I
F
CA B
Figura 25. Ensaio histoquímico da atividade da β-glucuronidase em raízes de
tabacos transgênicos transformados com o cassete de expressão contendo o
gene uidA sob controle do promotor específico de raiz, em resposta ao ataque de
nematóides. Os painéis A, B, C, D, E, F, G, H e I representam o padrão de
expressão do gene uidA observado em todas as raízes das plantas transgênicas
submetidas ao estresse biótico 14 dias após a infecção.
112
E D
G H I
F
CB A
Figura 26. Ensaio histoquímico da atividade da β-glucuronidase em raízes de
tabacos transgênicos transformados com o cassete de expressão contendo o
gene uidA sob controle do promotor específico de raiz, em resposta ao ataque de
nematóides. Os painéis A, B, C, D, E, F, G, H e I representam o padrão de
expressão do gene uidA observado em todas as galhas das plantas transgênicas
submetidas ao estresse biótico 14 dias após a infecção.
113
5. Discussão
114
5.1 ESTs órgão/tecido específicos e a análise in silico
Vinte e oito ESTs com provável expressão órgão/tecido-específica foram
selecionados do banco do Genoma Café a partir de uma análise in silico utilizando
a ferramenta virtual de northern eletrônico. Tal tecnologia nos permitiu identificar
com rapidez candidatos potencialmente tecido-específicos, entretanto, após
validação da expressão dos mesmos por RT-PCR, verificamos que a maioria
apresentava expressão inespecífica, detectada em tecidos não alvos.
A taxa de validação positiva foi muito baixa, ao redor de 7,14%, sendo esta
decorrente da confirmação do padrão de expressão órgão/tecido específico por
RT-PCR de apenas 2 ESTs (um de folha e outro de raiz). Um elevado número de
falsos positivos é normalmente esperado quando se compara os dados obtidos in
silico com as análises de expressão in vivo. Em trabalho semelhante de validação
de ESTs tecido-específicos em eucalipto e cana-de-açúcar, por exemplo, Sassaki
(comunicação pessoal) e Hoshino (2007) obtiveram uma taxa de validação de
8,6% e de 13,8%, respectivamente. A não confirmação da tecido-especificidade
resulta muito provavelmente do fato de que os candidatos selecionados
apresentam uma taxa de transcrição muito baixa em determinados órgãos,
fazendo com que os mesmos não sejam amostrados durante a preparação das
bibliotecas. Estes genes são, na realidade, enriquecidos no órgão considerado
específico pela análise in silico, mas durante a validação são amplificados nos
demais órgãos analisados devido à sensibilidade da PCR.
115
5.2 Candidato com expressão em folha
A análise da expressão diferencial do candidato com provável expressão
em folha, em diferentes órgãos de café sob diferentes situações de estresse,
permitiu constatar que o gene em estudo apresenta expressão em folhas sadias
bem como em folhas infectadas com bicho mineiro e ferrugem. Entretanto, a
análise da expressão desse candidato em amostras provenientes de plantas de C.
arabica (Catuaí) resistentes à ferrugem, revelou a ausência do transcrito
correspondente, indicando que em tal variedade a via de ativação do gene está
reprimida. Este fato sugere que em plantas susceptíveis este gene é regulado de
forma positiva pelo patógeno.
Dados da literatura corroboram a hipótese levantada, já que homólogos
desse gene, presentes em outras espécies, são induzidos pelo ataque de fungos
(Kim et al., 2003). Cabe ressaltar que o material infectado utilizado nesse
experimento foi obtido em campo de forma aleatória. Em experimentos mais
precisos de inoculação do fungo em condições assépticas e amostragem em
função do tempo de germinação do esporo em folhas de café Mundo Novo, a
avaliação da expressão desse gene por PCR em tempo real revelou um aumento
de 50 vezes quatro horas pós-inoculação (Severino, comunicação pessoal).
116
5.2.1 Caracterização dos elementos regulatórios e análise funcional do promotor específico de folha
Além da presença de elementos típicos de regiões promotoras de
eucariotos, foi possível verificar na seqüência promotora amplificada a presença
de inúmeros elementos regulatórios de plantas (Figura 15). Um dos mais
interessantes foi o elemento de seqüência TGTCA, característico de ligação a
fatores de transcrição associados à resposta de resistência em plantas. Luo e
colaboradores (2005), por exemplo, caracterizaram um gene que codifica um fator
de transcrição em arroz (denominado OsBIHD1) cuja proteína recombinante liga-
se ao motivo TGTCA in vivo. Análises de northern blot demonstraram um aumento
da expressão do gene OsBIHD1 em plântulas de arroz tratadas com
benzotiadiazole (BTH), composto capaz de induzir resistência. Verificou-se
também que a expressão de OsBIHD1 é rapidamente aumentada após 6 horas de
inoculação das plantas com Magnaporthe grisea, sugerindo que OsBIHD1 é um
fator de transcrição cuja indução estaria associada à resposta de resistência em
arroz. Dessa maneira, a presença do elemento TGTCA no promotor do gene
específico de folha sugere uma possível ativação dessa região regulatória por
fatores ligados à resposta de resistência da planta.
Ainda mais empolgante é a presença nesse promotor de cinco repetições
do motivo W-box, dispostas in tandem, e compostas por uma seqüência idêntica
de 15 nucleotídeos cada. Dong et al. (2003) identificaram um número elevado de
motivos W-box em promotores de genes de Arabidopsis induzidos por patógenos
117
e ácido salicílico regulados por fatores de transcrição do tipo WRKY. Dados da
literatura sugerem que os mecanismos de defesa das plantas mediados pela
regulação por fatores WRKY envolvem uma extensa ativação e/ou repressão
transcricional pelos próprios membros dessa família (Dong et al., 2003).
Um outro motivo interessante encontrado na referida região promotora foi o
elemento MYC, que possui um importante papel no processo de indução do gene
ERD1 em resposta a estresse hídrico em Arabidopsis. Tran et al. (2004) isolaram
três clones de cDNA que codificam proteínas ligantes ao promotor de EDR1 (que
apresenta o motivo CATGTG), identificando-as como fatores de transcrição
pertencentes à família das NACs. Experimentos realizados in vitro e in vivo
confirmaram a especificidade de ligação das NACs ao sítio CATGTG, sendo estas
ainda capazes de ativar a transcrição de GUS através de uma região de 63 pb
contendo o motivo CATGTG. As NACs isoladas nesse trabalho eram induzidas por
seca, estresse salino e ácido abscísico. Análises histoquímicas a partir de
Arabidopsis transformadas com o gene repórter GUS sob controle do promotor de
um gene NAC, revelaram a expressão específica do repórter em tecido foliar.
Um outro motivo W-box foi identificado próximo ao provável ponto de início
de transcrição, motivo esse presente nos promotores dos genes PR1-1 e PR1-2
de salsa (Petroselinum crispum), sendo PR1 um gene induzido por patógenos.
Experimentos de expressão transiente demonstraram a presença de dois
elementos de resposta ao ataque por fungos nos promotores dos genes PR1-1 e
PR1-2. Esses elementos contém a seqüência (T)TGAC(C), que quando mutadas
conduzem a uma inativação da função do promotor (Rushton et al.,1996). Laloi et
118
al. (2004) caracterizaram um gene que codifica uma tioredoxina, AtTRXh5, cuja
expressão é induzida por lesão mecânica, ataque de patógeno e em situações
capazes de gerar estresse oxidativo em Arabidopsis. Durante o tratamento com
um elicitor bacteriano, observou-se que um fator nuclear é capaz de reconhecer e
se ligar a um elemento W-box proximal presente na região promotora do gene
AtTRXh5, sugerindo que a resposta, nesse caso, pode ser mediada por um fator
de transcrição do tipo WRKY. Curiosamente, uma análise detalhada do promotor
desse gene revelou a presença de sete cópias da seqüência TTGACC/T
distribuídas na região (1 kb) a montante do sítio de início de transcrição,
distribuição esta similar à encontrada no promotor que regula o gene com
expressão tecido-específica em folha caracterizado no presente trabalho.
A funcionalidade da região promotora em estudo quando analisada em
experimentos de expressão transiente em plântulas de Coffea arabica foi positiva,
apresentando um padrão de expressão específico em tecido foliar. Já nos
experimentos de expressão estável em tabaco transgênico foi possível observar
que em folhas sadias, não estressadas, o promotor isolado não apresenta
atividade transcricional. Entretanto, quando as folhas são submetidas a lesões
mecânicas, o mesmo é rapidamente ativado (poucas horas pós-indução) sendo tal
resposta altamente específica e localizada.
Os resultados obtidos nos referidos experimentos quando consorciados aos
dados obtidos em PCR em tempo real, revelam um aumento significativo da
expressão do gene em estudo em amostras de folhas de café após 4 horas de
inoculação com esporos da ferrugem. Esse tempo é somente suficiente para que
119
ocorra a germinação dos esporos e início da atividade parasitaria através da
penetração das hifas germinativas por meio das células estomáticas. Dados da
literatura corroboram tal observação e demonstram que em outras espécies
vegetais, a expressão de genes homólogos ao estudado em café também é
induzida por fungo, atingindo seu pico máximo de indução nas primeiras horas
pós-infecção. Estes fatos sugerem fortemente que o promotor isolado de café
apresenta uma rápida ativação em células estomáticas, sendo altamente regulado
por estresse biótico.
5.3 Candidato com expressão específica em raiz
As análises de RT-PCR do candidato com expressão específica em raiz,
em diferentes órgãos de café sob diferentes situações de estresse, permitiram
inferir que o gene estudado, além de tecido-específico, também é induzido pelo
ataque de nematóides. Dados da literatura corroboram a hipótese levantada, já
que genes homólogos ao gene investigado, presentes em outras espécies, são
induzidos pelo parasita em poucos dias pós-infecção (Uehara, et al.,2007,
Alkharouf, et al., 2003).
Uma região de 2000 pb situada à montante do provável ponto de início de
transcrição do EST selecionado no banco foi seqüenciada, sendo identificados
inúmeros elementos regulatórios ao longo da mesma.
120
5.3.1 Caracterização dos elementos regulatórios e análise funcional do promotor específico de raiz
Na região promotora específica de raiz foram identificados inúmeros
elementos regulatórios. Dentre os mais importantes e que corroboram a função
fisiológica desempenhada pelo produto do gene em plantas, destaca-se o
elemento as1 (as-1 element activity), comumente presente em promotores de
genes ativados por auxina e ácido salicílico (Klinedinst et al., 2000) e
principalmente, conferindo uma expressão específica em tecido radicular (An et
al., 1990; Liu e Lam, 1994; Ulmasov et al., 1994; Xiang et al., 1996). Genes que
codificam proteínas que se ligam aos elementos as-1, denominadas de fatores
TGA, foram isolados em um grande número de plantas superiores. Fatores TGA
pertencem à família dos fatores de transcrição do tipo bZIP e apresentam papel
importante na regulação da expressão tecido-especifica. Os genes TGA1a e PG13
homólogos aos TGAs de tabaco, por exemplo, são altamente expressos em raiz
(Katagiri et al., 1989; Fromm et al., 1991). Experimentos realizados in vivo via
transfecção de protoplastos, demonstraram que TGA1a é um fator de transcrição
induzido por estresse xenobiótico (Pascuzzi et al., 1998). Adicionalmente,
Klinedinst et al. (2000) demonstraram em experimentos de localização celular que
o gene TGA1a é preferencialmente expresso na ponta das raízes, especialmente
em tecido meristemático.
Recentemente, Fehlberg et al. (2005) caracterizaram o promotor do gene
VfLb29 que codifica uma leghaemoglobina de Vicia faba e demonstraram que o
121
mesmo é ativado em células nodulares de raiz infectadas por bactérias in vivo. A
presença de dois elementos de regulação, AAAGAT e CTCTT, foi necessária para
que o promotor desse gene fosse funcional em células nodulares sendo os
mesmos considerados elementos órgão-específicos (Stougaard et al., 1990).
Esses elementos também são encontrados na região promotora raiz-específica
aqui caracterizada. No centro da região promotora amplificada, observa-se o
elemento GAGAC comumente presente em promotores de genes induzidos por
deficiência de enxofre em Arabidopsis. Maruyama-Nakashita et al. (2005)
analisando as regiões promotoras de genes prematuramente expressos em raiz
de Arabidopsis em resposta à deficiência de enxofre, verificaram a presença
conservada desse motivo em todas regiões analisadas. Esse resultado sugere
que esse elemento é conservado e comumente regulado visando adaptação das
plantas à deficiência de enxofre.
Cabe ressaltar que, de maneira geral, os elementos regulatórios
identificados através da análise in silico na região promotora específica de raiz,
corroboraram os resultados obtidos até então nas análises funcionais realizadas in
vivo. Tais análises evidenciam que a expressão do gene repórter sob controle
desse promotor é induzida por fatores bióticos e especialmente ativada na
interação nematóide - hospedeiro.
Os experimentos de expressão transiente em plântulas de café revelaram
que a região promotora específica de raiz apresenta um padrão de expressão
diferenciado, sendo o gene repórter pouco expresso e sua localização limitada a
células meristemáticas. De posse dos resultados de northern blot, onde não foram
122
constatadas quaisquer alterações nos níveis de expressão do gene regulado pelo
promotor investigado em raízes machucadas de café, das análises de RT-PCR e
dos elementos regulatórios identificados in silico, é possível concluir que esse
gene é pouco expresso em tecido radicular de Coffea arabica vindo a ser induzido
na presença de nematóides.
Abad et al. (2003) caracterizando a expressão diferencial de genes em
células gigantes parasitadas por nematóides, demonstram um maior acúmulo de
transcritos de genes de defesa nos primeiros dias após a infecção do parasita
(formação do sítio de alimentação, hipertrofia celular e multinucleação), vindo a
diminuir ao longo da infecção. Esses dados corroboram com o resultado
observado na Figura 9, onde um maior acúmulo do transcrito estudado foi
observado na fase inicial de infecção.
Curiosamente, as análises histoquímicas em plântulas trangênicas de
tabaco demonstraram uma perda da especificidade de expressão do gene repórter
sob controle do promotor específico de raiz, sendo este detectado em tecido foliar
e na região hipocotiledonar. Koyama et al. (2005) ao caracterizarem um promotor
raiz-específico em Arabidopsis, também verificaram uma perda de especificidade
durante a análise funcional em plantas transgênicas, detectada pela expressão do
gene repórter Gus em plântulas com até 10 dias pós-germinação. Por outro lado,
a expressão voltava a ser específica em plantas adultas, corroborando os
resultados observados em nossas analises.
Todas essas hipóteses foram validadas no experimento do item 3.15 onde
foi possível verificar nitidamente uma rápida ativação na raiz principal, 72 horas
123
pós-inoculação, da expressão do gene repórter sob controle desse promotor em
resposta a infecção por nematóides. Nematóides causadores de galha, em estágio
juvenil (J2), penetram através do córtex radicular (12-24 horas), migrando a partir
daí para o cilindro vascular, onde se estabelecem e desenvolvem o sítio de
alimentação (Barthels, et al., 1997). Nos experimentos aqui descritos foi possível
verificar que ao longo da infecção (14 dias), a expressão do gene repórter foi
sendo limitada às regiões das galhas. É possível verificar na Figura 25 (painéis B,
D e F) que expressão do gene repórter, induzida pelo parasita, localiza-se em
locais de hipertrofia celular, ou seja, onde ocorreu a instalação do sítio de
alimentação.
124
6. Conclusões e Perspectivas
125
Diante dos resultados obtidos nesse trabalho, pode-se concluir que o
método in silico utilizado para identificação de genes com expressão órgão/tecido
específica é pouco sensível, gerando grande quantidade de falsos positivos.
Os fragmentos isolados empregando a técnica de genome walking e
provenientes de genes com expressão específica em folha (0.8 kb) e raiz (2 kb),
respectivamente, apresentam atividade transcricional dirigindo a expressão de um
gene repórter nos órgãos esperados tanto em experimentos de expressão
transiente em plântulas de café, bem como em experimentos de expressão
estável, utilizando para tal tabaco transgênico.
O método de bombardeamento desenvolvido e utilizado para confirmação
da atividade transcricional das regiões promotoras aqui isoladas foi extremamente
funcional e seguro, demonstrando com rapidez que as regiões isoladas são
funcionais e órgão-específicas.
Podemos afirmar com segurança que a região promotora do gene com
expressão específica em folha, isolada de Coffea arabica, apresenta um padrão
de expressão altamente específico, sendo o mesmo limitado ao tecido foliar e
rapidamente ativado em situações de estresse biótico e abiótico. Já o promotor
isolado do gene com expressão específica em raiz apresenta um padrão de
expressão diferenciado, sendo específico de raiz e ativado somente em resposta
ao ataque de nematóides e não por dano mecânico.
Do ponto de vista biotecnológico e principalmente de biossegurança o
presente trabalho disponibiliza duas importantes ferramentas que viabilizam a
126
expressão racional de transgenes, em órgãos chaves da planta, livrando os
órgãos destinados à alimentação humana da proteína heteróloga indesejada.
Muitos estudos ainda deverão ser conduzidos com intuito de checar a
viabilidade de utilização das seqüências promotoras caracterizadas no presente
trabalho em outras espécies de interesse agronômico como milho, soja, algodão,
cana de açúcar, dentre outras. Essas são espécies de grande importância para o
agronegócio brasileiro e altamente prejudicadas por parasitas foliares e
radiculares, o que evidencia o potencial de uso de tais promotores.
127
7.Bibliografia
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