interferència d'rna
TRANSCRIPT
RNA’s d’Interferència Molècules de 20-25 nt Precursors Llargs
Tipus d’RNAi2 tipus: principal diferencia és com silencien l'expressió dels gens (Knock Down)
• Bloqueja traducció proteïnes• No degrada mRNA• Aparellament imperfecte
• Degrada mRNA• Aparellament perfecte
siRNA
Precursor: llargues molècules de dsRNA
Dicer: RNAsa Tipus III. Degrada dsRNAa siRNA
RISC: RNA-induced-silencing complex . Riboproteïna que identifica mRNA en seqüencia complementària
RISC El complex RISC està format per l’RNAi i per diverses proteïnes. La més important és Argonauta (Ago).
Es troba en unes zones del citoplasma d’alta degradació de l’mRNA anomenades cossos P. Aquestes regions es creu que també podrien estar implicades en la sintesi de miRNA
Si el RISC es troba unit a un siRNA, indueix a la degradació de l’mRNA.
miRNA
Precursor: pri-microRNA (tipus de dsRNA)
RNAses: Drosha, DGCR8 i Dicer
Complex silenciador: miRISC/miRNP similars a siRISC
Processament de miRNA
Processament de miRNA
1.Transcrició de pri-miRNA's (RNApol II)2.Formació de bucles al pri-miRNA3.Processament al nucli: - Formació de pri-miRNA més petits (Drosha i DGR8)4.Transport nucli-citoplasma (Exp.5 i RanGTP)5.Processament al citoplasma:- Tall del bucle de pri-miRNA (Dicer)- Dúplex de RNA: miRNA/miRNA*6.Acoplament de miRISC: degrada miRNA*, incorpora miRNA7. Complex RISC-miRNA: - Reconeixement de regions diana al mRNA (miRNA)- Bloqueig de la traducció(RISC)
Inhibició traduccionalEls miRNA es caracteritzen per aparellament imperfecte amb la regió diana del mRNA, després d'aquest reconeixement reprimeixen l'expressió gènica (Knock down).
Aquest procés ,també, es dóna als cossos P
La inhibició transcripcional es pot dur a terme de 3 formes:
-Repressió de la traducció abans que s'inicii-Inhibició de la traducció un cop iniciada-Desestabilització del RNA per deadenilació
Malatia d’Alzheimer
Aplicació de siRNA contra BACE1
Raó principal: L’estructura característica del lloc actiu de BACE1 dificulta la possible creació de petites molècules inhibidores pel lloc actiu.
Un cop vist que pels mètodes tradicionals no era viable, és va optar per l’alternativa d’utilitzar siRNA (lenti-siRNA, que actuen en cèl·lules no divisories com les neurones) contra BACE1.
La idea és que el siRNA s’uneixi al mRNA que codifica per BACE1, inhibint així l’expressió d’aquest. Ja que un cop unit el siRNA al mRNA causa el seu bloqueig i la seva degradació.
Experiment 1 (I)Agafen 7 construccions de siRNA per comprovar quin és més efectiu.D’aquests només són efectius 3, ja que són els que baixen la quantitat de BACE1 i els nivells de Aβ:
D’aquests 3 només el si-BACE1-1 i el si-BACE1-6 són aplicables a l’experiment ja que són els que actuen tant en humans com en ratolins, ja que nosaltres experimentem amb ratolins.
S’acaba escollint siBACE1-6 perquè és el més efectiu.
Experiment 1 (II)
El tractament amb siBACE1-6 redueix l’acúmul del pèptid Aβ en cèl·lules transgèniques APP
Experiment 2 • Injecció de vectors lentivirals amb siBACE1-6 o siGlut4 (control) a
l’hipocamp de ratolins transgènics APP i ratolins no transgènics
• Immunodetecció de BACE1 a l’hipocamp disminueix en els ratolins tractats amb Lenti-BACE1-6 respecte als tractats amb Lenti-siGlut4. Al neocortex, on no hem injectat, la presència de BACE1 no depén del lentiviral sinó que hi ha diferència entre el trans-APP i el no trans.
Experiment 3
Immunoreactivitat de APP i CTF a l’hipocamp (a): en transgènics APP tractats amb lenti-siGlut4, APP i CTF molt alts en comparació als tractats amb lenti-siBACE1-6. Els no transgènics presenten nivells normals
ELISA Aβ1-42 (b): en transgènics APP tractats amb lenti-siGlut4, els nivells de Aβ1-42 són molt més alts que els no transgènics, mentres que els transgènics APP tractats amb lenti-BACE1-6 presenten nivells una mica més propers als no transgènics
• Fluoresecència de proteïnes Aβ a l’hipocamp i neocortex : en els no transgènics no hi ha un acúmul notable, mentres que en els transgènics APP tractats amb Lenti-siGlut4 si que es pot apreciar l’Aβ (e,i). A l’hipocamp de transgènics APP tractats amb Lenti-BACE1-6 (f) hi ha una disminució de l’acúmul de Aβ, mentre que al neocortex on no vam injectar res no hi ha hagut canvis respecte a l’altre transgènic APP.
Experiment 4
• Per comprovar l’efecte de lenti-siBACE1-6 en la neurodegeneració immunoreactivitat de Map2 per anticossos específics
Experiment 5• Per comprovar si lenti-siBACE1-6 produeix un a
millora en la conducta dels transgènics APP
Morris water maze: mètode de mesura de l’aprenentatge i la memòria espacial
• Durant l’experiment es comprova que el transgènic APP tractat amb lenti-siBACE1-6 mostren un comportament molt similar al dels no transgènic (a). En canvi, el transgènic APP tractat amb lenti-Glut4 presenta més dificultats per desplaçar-se al lloc de la plataforma quan aquesta està amagada.