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INTEGRACIÓN DE LA FUNCIÓN DE VRK2 EN LAS RUTAS DE SEÑALIZACIÓN DE JNK Y P53.

TESIS DOCTORAL

Sandra Blanco Benavente

2006

Universidad de Salamanca Departamento de Microbiología y

Genética

Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer CENTRO DE INVESTIGACIÓN DEL CÁNCER

D. PEDRO A. LAZO-ZBIKOWSKI, PROFESOR DE INVESTIGACIÓN DEL

CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS (C.S.I.C.)

CERTIFICA

Que la memoria titulada “Integración de la función de VRK2 en las rutas de señalización de

JNK y p53” presentada por el licenciado SANDRA BLANCO BENAVENTE ha sido realizada

bajo su dirección en el Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer y reúne, a su juicio,

originalidad y contenidos suficientes para que sea presentada ante el tribunal correspondiente y

optar al grado de Doctor por la Universidad de Salamanca.

Y para que así conste, a efectos legales, expide el presente certificado en Salamanca a 27 de

Marzo 2006.

Fdo. Pedro A. Lazo-Zbikowski

Esta memoria ha sido realizada siendo Sandra Blanco Benavente beneficiario de una beca de

Formación de Personal Investigador (FPI) del Ministerio de Educación y Ciencia para la

realización de la tesis doctoral (2001-2005).

La investigación en el laboratorio ha sido financiada por los siguientes proyectos:

• Ministerio de Educación y Ciencia (SAF2000-0169, SAF2004-2900)

• Fondo de Investigación Sanitaria (FIS-PI02-0585)

• Fundación de Investigación Médica MM

• Junta de Castilla y León (CSI18-03, CSI0A05, SAN-SA01/04 y SAN-SA04/05)

• Fundación Memoria Samuel Solórzano Barruso.

A mis padres y a Susi.

ÍNDICE

INTRODUCCIÓN 15

1. QUINASAS. 17

1.1. El “Quinoma humano”. 17

1.2. La familia de quinasas VRK (Vaccinia-related kinase). 18

1.2.1. VRK1 (“Vaccinia-related kinase 1”). 20



2. LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS QUINASAS ACTIVADAS POR MITÓGENOS

(MAPKS). 22

2.1. La vía de ERK. 24

2.2. La vía de p38. 24

2.3. La vía de JNK. 25

2.3.1. Organización de la vía de señalización de JNK. 26

2.3.2. Función biológica de JNK. 28

2.3.2.a. Sustratos de JNK. 28

2.3.2.b. Mecanismos apoptóticos dependientes de JNK. 29

2.3.2.c. JNK está implicada en supervivencia celular. 30

2.3.2.d. Modelos genéticos murinos. 30

2.3.2.e. Papel de JNK en el desarrollo de tumores. 31

2. 4. La MAP3K TAK1. 31

2.4.1. Activación de la vía de TAK1. 31

2.4.2. Función biológica de TAK1. 33

3. LAS PROTEÍNAS DE ANCLAJE DE LAS VÍAS DE SEÑALIZACIÓN DE MAPKS. 35

3.1. La familia de proteínas de anclaje JIP (JNK interacting protein). 37

3.2. Interacciones funcionales de JIP1 y JIP2. 37

3.3. Interacciones funcionales de JIP3 y JIP4. 40

3.4. Activación de la vía de JNK. 40

3.5. Activación de la vía de p38. 41

3.6. Las proteínas de anclaje JIP como moléculas transportadoras. 42

4. EL FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN P53. 42

4.1. Estructura de p53. 43

4.2. Naturaleza de las señales de estrés que activan p53. 43

4.2.1. Regulación de la estabilidad de p53. 44

4.2.2. Modificaciones postraduccionales en p53. Regulación de la estabilidad y actividad

transcripcional de p53. 47

4.3. Función biológica de p53. 50

4.3.1. p53 y la parada de ciclo celular. 50

4.3.1.a. Parada del ciclo celular en G1. 50

4.3.1.b. Parada del ciclo celular en G2. 51

4.3.2. p53 y apoptosis. 52

4.3.2.a. Vía intrínseca. 52

4.3.2.b. Vía extrínseca. 52

4.3.2.c. Vía independiente de la actividad transcripcional. 53

4.3.3. La elección entre parada del ciclo o apoptosis. 53

4.3.4. Otras funciones de p53. 54

OBJETIVOS 55

RESULTADOS 59

1. CARACTERÍSTICAS DE VRK2 ENDÓGENA. 61

1.1. Localización y expresión de la quinasa VRK2. 61

1.2. El gen VRK2 genera dos isoformas que difieren en el extremo C-terminal. 63

1.3. Las dos isoformas de VRK2 se expresan en distintas líneas celulares tumorales. 66

1.4. Las dos isoformas tienen diferente localización subcelular. 67

1.5. VRK2B se expresa en células en las que VRK1 es citoplasmática. 68

1.6. Especificidad de sustrato. 70

2. VRK2 COMO REGULADOR DEL SUPRESOR DE TUMORES P53. 72

2.1. VRK2A y B fosforilan p53 en el residuo treonina 18 in vitro. 72

2.2. VRK2A y B no fosforilan Mdm2. 73

2.3. Solamente la sobre-expresión de VRK2B induce la acumulación de p53. 74

2.4. VRK2B fosforila p53 in vivo. 75

2.5. La forma inactiva de VRK2B interacciona de forma estable con p53. 77

2.6. VRK2B promueve la estabilización de p53 mediante un mecanismo postraduccional. 78

2.7. La sobre-expresión de VRK2B reduce la ubiquitinación de p53. 79

2.8. VRK2B promueve la acetilación de p53 por p300. 81

2.9. Fosforilación de p53 endógena por VRK2B. 82

2.10. VRK2B estabiliza p53 endógena y aumenta su actividad transcripcional. 84

2.11. Efecto de VRK2B sobre la estabilización de mutantes de p53. 86

2.12. La sobre-expresión de VRK2B aumenta apoptosis en células que expresan p53. 87

3. VRK2 COMO MODULADOR DE LA CASCADA DE FOSFORILACIÓN DE JNK. 89

3.1. Localización subcelular de JIP1. 89

3.2. VRK2A y VRK2B sobre-expresadas co-localizan con JIP1 endógeno. 90

3.3. VRK2A y VRK2B interaccionan con la región C-terminal de JIP1. 91

3.4. VRK2A y VRK2B interaccionan con JIP1 por su dominio N-terminal. 92

3.5. VRK2A y VRK2B fosforilan JIP1 en la región N-terminal. 94

3.6. JIP1 interacciona con la MAP3K TAK1. 95

3.7. Efecto de VRK2 sobre la interacción de JIP1 con JNK, MKK7 y TAK1. 96

3.8. VRK2A y VRK2B interfieren en la activación de JNK unida a JIP1. 99

3.9. Interacción de VRK2 con TAK1. 100

3.10. VRK2A y VRK2B inhiben la activación de la vía de AP1 dependiente de TAK1. 101

3.11. Activación de TAK1 por hipoxia, TGFβ e IL-1β. 102

3.12. VRK2A y VRK2B reprimen la activación de la vía de TAK1 por IL-1β e hipoxia. 103

DISCUSIÓN 107

1. LA QUINASA ENDÓGENA. EXPRESIÓN Y LOCALIZACIÓN. 109

2. ACTIVIDAD CATALÍTICA IN VITRO. 111

3. REGULACIÓN DE P53 POR VRK2B. 112

4. REGULACIÓN DE LA VÍA DE JNK POR VRK2A Y VRK2B. 117

CONCLUSIONES 125

MATERIALES Y MÉTODOS 129

1. CLONACIÓN DE SECUENCIAS CODIFICANTES DE VRK2A Y B. 131

1.1. Obtención del ADN codificante. 131

1.2. Generación de vectores recombinantes. 131

2. MUTAGÉNESIS DIRIGIDA. 131

3. PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DE FUSIÓN. 132

3.1. Purificación de proteínas de fusión unidas a GST (Glutation-S-Transferasa). 132

3.2. Purificación de proteínas de fusión unidas al epítopo 6xHis. 133

3.3. Tinción con Coomassie. 133

4. ENSAYOS DE ACTIVIDAD QUINASA IN VITRO. 133

5. ANÁLISIS DE FOSFOAMINOÁCIDOS. 134

6. PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES FRENTE A VRK2 HUMANA. 135

7. RT-PCR DE LÍNEAS CELULARES. 136

7.1. Extracción de ARN total de células en cultivo. 136

7.2. Síntesis de ADN codificante a partir de ARN total. 136

7.3. Detección de distintos mensajeros de VRK2 mediante amplificación por PCR. 136

7.4. RT-PCR cuantitativa en tiempo real. 136

8. CULTIVO CELULAR. 137

9. TRANSFECCIONES TRANSITORIAS DE ADN EN CÉLULAS EUCARIOTAS EN CULTIVO

MONOCAPA. 137

10. ELECTROFORESIS EN GELES SDS-PAGE Y WESTERN BLOT DE EXTRACTOS PROTEICOS. 138

11. FRACCIONAMIENTO NUCLEAR. 139

12. ENSAYOS DE CO-INMUNOPRECIPITACIÓN. 139

13. ENSAYOS DE INTERACCIÓN POR PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS DE FUSIÓN CON GST

(“ENSAYOS DE PULL-DOWN”). 140

14. INMUNOFLUORESCENCIA. 140

15. MEDIDA DE LA ACTIVIDAD TRANSCRIPCIONAL CON GEN REPORTERO DE LUCIFERASA. 141

15.1. Medida de la actividad transcripcional dependiente de p53. 141

15.2. Medida de la actividad transcripcional dependiente de AP1. 141

16. ANÁLISIS MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO (FACS). 141

17. EXPERIMENTOS DE SUPRESIÓN DE LA EXPRESIÓN CON ARN DE INTERFERENCIA. 142

18. REACTIVOS. 142

19. ABREVIATURAS. 142

TABLA 1. OLIGONUCLEÓTIDOS USADOS. 144

TABLA 2. CONSTRUCCIONES DE ADN RECOMBINANTE USADAS. 145

TABLA 3. LÍNEAS CELULARES USADAS. 149

TABLA 4. ANTICUERPOS USADOS. 150

BIBLIOGRAFÍA 151

AGRADECIMIENTOS 173

INTRODUCCIÓN

17

Introducción

1. QUINASAS.

Las proteínas quinasas son enzimas que catalizan la unión covalente de un grupo fosfato a

residuos de serina, treonina o tirosina en proteínas celulares específicas. Las proteínas quinasas

juegan un importante papel en la regulación de gran parte de las rutas de transducción de señales

celulares, ya que la modificación postraduccional es el mecanismo candidato para regular

situaciones donde se necesita una rápida modulación de la actividad de factores de transcripción

en respuesta a señales procedentes de receptores de la superficie celular. Con esta fosforilación

se pueden controlar propiedades como la actividad enzimática del sustrato, su localización

celular, su interacción con otras moléculas o su degradación [4, 5]. En definitiva, la

fosforilación reversible es un mecanismo esencial para la regulación de procesos celulares como

la transcripción génica, progresión del ciclo celular, metabolismo, reorganización del

citoesqueleto y migración celular, apoptosis o diferenciación. También es importante en la

comunicación intercelular durante el desarrollo, en respuestas fisiológicas y homeostasis y en el

funcionamiento del sistema nervioso e inmune. Por ello, la desregulación de proteínas quinasa

juega un papel fundamental en desordenes fisiológicos como las enfermedades humanas [3].

1.1. El “Quinoma humano”.

Recientemente Manning y colaboradores han catalogado filogenéticamente todas las quinasas

humanas en lo que se ha denominado el “Quinoma humano”, haciendo uso de las bases de datos

genómicas disponibles, los ADN codificantes y las EST (“expressed sequence tags”)

introducidas en el “GenBank”. De este modo han identificado 518 genes que codifican para

presuntas quinasas, de los cuales 71 no habían sido descritos hasta ese momento. Y se han

clasificado en 8 grupos, cada uno de ellos divididos en varias subfamilias [3]. Dentro del mismo

grupo que evolucionó a las caseína quinasas I, en una rama temprana se encuentra la familia de

quinasas VRK (vaccinia-related kinases), compartiendo una mayor similitud en el dominio

catalítico entre ellas[6] (Fig. 1).

Familia CKIFamilia CKI

Figura 1. Clasificación de las quinasas humanas de la familia de las caseína quinasas tipo I dentro del quinoma humano, según Manning et al. [3].

Introducción

18

1.2. La familia de quinasas VRK (Vaccinia-related kinase).

La familia VRK consta de tres miembros en humanos: VRK1 (NM003384), VRK2 (AB000450)

y VRK3 (NM016440). Inicialmente estas quinasas fueron identificadas por su homología con la

quinasa del virus Vaccinia B1R [7]. Se trata de una quinasa de expresión temprana durante la

infección viral y con un papel esencial en la replicación vírica [8, 9]. VRK1 tiene un 40% de

identidad sobre 305 aminoácidos de B1R y VRK2 un 38,7% sobre 300 aminoácidos. Además, la

expresión ectópica de VRK1 es capaz de complementar parcialmente la deficiencia en la

replicación del ADN viral que presenta el mutante sensible a temperatura ts2 del virus Vaccinia,

aunque no se recupera totalmente la producción de virus [10].

Los ARN mensajeros de VRK1 y VRK2 se detectaron mediante northern blot en todos los

tejidos examinados, con niveles de expresión especialmente altos en tejidos como hígado fetal,

testículos y timo para VRK1 y páncreas, músculo esquelético, corazón y leucocitos de sangre

periférica para VRK2. También se encontraron altos niveles de expresión en varias líneas

celulares tumorales como A549 (adenocarcinoma de pulmón), SW480 (adenocarcinoma

colorrectal), Raji (linfoma de Burkitt), MOLT-4 (leucemia linfoblástica), K-562 (leucemia

mielógena crónica), HL-60 (leucemia promielocítica) o Hela S3 (adenocarcinoma de cérvix).

Por sus altos niveles de expresión en líneas tumorales y en tejidos altamente proliferativos como

testículos, timo e hígado fetal se postuló que las quinasas VRK podrían estar involucradas en la

regulación del crecimiento celular con un posible papel en tumorigénesis [7]. Posteriormente se

ha identificado un tercer miembro de la familia, denominado VRK3, además de un pseudo gen

de VRK3 del que no se ha detectado expresión. Recientemente se ha llevado a cabo un análisis

comparativo de las proteínas de la familia VRK de mamíferos. Tanto VRK1 y VRK2 como

VRK3 se expresan en todos los tejidos analizados en humanos y ratón [11].

Existen homólogos de los genes VRK en organismos simples como el nematodo C. elegans. Se

sospecha que esta familia de proteínas apareció en organismos simples y a partir de ahí se

VRK1

VRK2

VRK3

Secuencia de localización nuclearDominio quinasa activoDominio quinasa degenerado

44%

23%33%

474

Sitio de unión a ATP Región transmembrana

396

508

1

1

1

Figura 2. Representación esquemática de la estructura de las quinasas humanas de la familia VRK alineadas según identidad de secuencia de aminoácidos. Se muestra el porcentaje de identidad de la secuencia completa de aminoácidos.

19

Introducción

expandió evolutivamente hasta organismos de organización más compleja desde la mosca hasta

humanos. De este modo, el homólogo de VRK1 en el nematodo Cahenorabditis elegans está

codificado por el gen F28B12.3, cuyo ortólogo en el Cahenorabditis briggsae es el gen

CBG02540. La inhibición del mismo por ARN de interferencia da lugar a un fenotipo letal

embrionario debido a fallos en las divisiones celulares del embrión temprano [12] o un fenotipo

post-embrionario de crecimiento lento [13]. Según estos datos este gen podría estar involucrado

en eventos esenciales de la división celular. En Drosophila melanogaster el gen homólogo de

esta familia es CG6386 que codifica para dos transcritos: CG6386-RA y CG6386-RB [14]. En

el pez cebra Dario rerio existen homólogos de VRK1 y VRK2 y en el anfibio Xenopus laevis

existen homólogos de los tres miembros, aunque su fenotipo todavía no ha sido caracterizado.

En levaduras, no se han descrito homólogos de esta familia, no obstante hay proteínas que

podrían ser los precursores de los que podrían derivar la familia VRK en organismos superiores.

Este es el caso del gen HRR25/YPL204W de Saccharomyces cerevisiae que codifica para una

proteína de la familia de caseína quinasa tipo I, la cual está implicada hipotéticamente en daño

al ADN y división celular, ya que el mutante nulo de esta proteína muestra un crecimiento lento

además de otras anormalidades en el ciclo celular e hipersensibilidad al daño en el ADN [15-

17], y también está implicada en el tráfico de vesículas desde el retículo endoplásmico [18]. Su

ortólogo en Schizosaccharomyces pombe es el gen HHP1 [19], el cual está implicado en

reparación del ADN tras radiación γ.

Figura 3. Relaciones filogenéticas entre las proteínas VRK1, VRK2 y VRK3 humanas (hVRK), de ratón (mVRK), rata (rVRK), pez cebra (DrVRK), Xenopus (XlVRK1), Drosophila (DmVRK1), C. elegans (F28B12.3), Vaccinia (B1R), S. cerevisiae (HRR25) y S. pombe (HHP1).

Introducción

20

También existen homólogos para los tres miembros en rata (Rattus norvegicus) y ratón (Mus

musculus). VRK1 de ratón, la cual posee una homología con la proteína VRK1 humana del 87%

(92% entre sus dominios catalíticos), se ha denominado 51PK en un primer momento [20], es

una proteína nuclear, que se autofosforila en residuos de serina y cuyo ARN mensajero da lugar

a tres formas mediante un procesamiento alternativo que excluye el exón 12, o los exones 12 y

13. En general se expresa en varios tejidos distintos, con altos niveles en testículos, bazo,

pulmón e hígado [11, 20, 21]. Durante el desarrollo embrionario de ratón existe un pico de la

expresión de los tres miembros principalmente en sangre periférica e hígado durante los días

11.5 y 13.5, los cuales corresponden a la fase de mayor expansión sugiriendo que en este tipo

celular, estas quinasas están relacionadas con proliferación. Sin embargo, en órganos adultos la

expresión está más extendida, sugiriendo una posible implicación en mecanismos de protección

de la célula [22].

1.2.1. VRK1 (“Vaccinia-related kinase 1”).

VRK1 humana es una proteína de 396 aminoácidos cuyo extremo amino, en el cual se encuentra

el sitio de unión a ATP entre los residuos 43-73 y el sitio serina-treonina quinasa activo entre

los residuos 173-185, presenta una elevada similitud con el dominio catalítico de la caseína

quinasa de tipo I δ [6], mientras que el dominio carboxilo contiene una secuencia de

localización nuclear (residuos 356-360) y no presenta homología con ninguna otra proteína

conocida, incluso difiere bastante de la parte carboxilo terminal de las otras quinasas de la

familia, VRK2 y sobre todo VRK3. VRK1 posee una identidad de secuencia del 44% con

respecto a VRK2 mientras que con VRK3 es del 33% (Fig. 2). Esto sugiere que esta región es

esencial para la regulación de la actividad de VRK1. VRK1 presenta una alta autofosforilación

en residuos de serina y de treonina [6]. Las caseína quinasas también presentan esta

característica aunque con un patrón diferente, y se ha descrito que en ellas la autofosforilación

de su carboxilo terminal inhibe su actividad [23]. En relación con éstas, que es el grupo con el

que está próximamente relacionada, VRK1 presenta una actividad quinasa característica, ya que

al igual que éstas, fosforila proteínas ácidas (fosvitina y caseína) pero a diferencia de ellas

también fosforila proteínas básicas (proteína básica de mielina “MBP” e histona 2b) [6].

Se desconocen los mecanismos de estimulación y modulación de la actividad de esta quinasa,

aunque recientemente se han descrito, mediante estudios de expresión génica de “arrays” de

ADN que el gen VRK1 está regulado positivamente por el factor de transcripción E2F y

negativamente por p16 y Retinoblastoma (Rb), situándolo como gen diana en la vía p16INK4A-

Rb-E2F [24]. También se ha encontrado sobre-expresado en respuesta a la expresión del proto-

oncogén c-Myc en linfocitos B [25, 26].

21

Introducción

Los estudios realizados hasta la fecha indicaban que era una proteína nuclear durante interfase,

excluida del nucleolo [20, 21], sin embargo, esta localización parece depender del tipo celular,

así en linfomas, sarcomas o carcinomas escamosos VRK1 es nuclear, pero en adenocarcinomas

es citosólica (datos sin publicar). En lo que respecta a posibles sustratos, hasta la fecha se ha

descrito que VRK1 fosforila y activa varios factores de transcripción, como son p53, ATF2 y c-

Jun. VRK1 fosforila específicamente p53 en el residuo treonina 18 aumentando su estabilidad

mediante un mecanismo postraduccional que no depende totalmente de la inhibición de la

interacción de p53 con su regulador negativo Mdm2, aumentando también la actividad

transcripcional y la acetilación de la misma dependiente de p300 [21]. Células en las que se ha

inhibido la expresión de VRK1 por ARN de interferencia específico tienen defectos en

proliferación, siendo incapaces de completar la división celular correctamente resultando en

ocasiones en la inducción de la muerte de la célula. Basándose en estas observaciones, en los

datos de expresión de VRK1 en tejidos altamente proliferativos y en el fenotipo de las células

deficientes en VRK1, se ha propuesto que esta quinasa podría tener un papel en el

mantenimiento de los niveles basales de p53 necesarios para que se produzca la división celular

en condiciones normales de proliferación o para inducir una activación completa de p53 en el

caso de que estrés o daño severo ocurran [21].

VRK1 fosforila al factor de transcripción ATF2 en los residuos serina 63 y treonina 73,

incrementando su estabilidad y actividad transcripcional, además de cooperar con JNK, la cual

fosforila los residuos treonina 69 y 71 [27]. También fosforila al factor de transcripción c-Jun en

los residuos serina 69 y 71 (los mismos que fosforila JNK), aumentando su estabilidad y

actividad transcripcional, siendo posible que su función en la regulación de c-Jun sea mantener

el nivel basal de actividad de este factor de transcripción. VRK1 todavía no ha sido integrada en

ninguna vía de señalización y tampoco parece estar relacionada con complejos de señalización

como el formado por las MAPKs y la proteína de anclaje JIP1 ya que VRK1 parece estar

siempre en el núcleo y estos últimos se forman en el citosol. Esto sugiere que VRK1 podría

estar relacionada con mecanismos implicados en respuestas a eventos que ocurren en el núcleo

como señalización de daño en el ADN [28].


El gen VRK2 se localiza en el cromosoma 2p16, contiene 13 exones y codifica para una proteína

de 508 aminoácidos, la cual posee un sitio serina-treonina quinasa activo entre los residuos 162-

174, sin embargo, no se ha encontrado ningún sitio de unión a ATP consenso, sino una

secuencia degenerada en lo residuos 35-61, aunque se sospecha que puede ser activa [7]. El

dominio carboxi-terminal difiere bastante de VRK1 y sobre todo de VRK3. Si comparamos las

secuencias de VRK2 con VRK1 observamos que posee una mayor similitud con VRK1, así la

Introducción

22

identidad de secuencia entre VRK2 y VRK1 es del 44% y del 23% con VRK3, si tenemos en

cuenta solamente el dominio catalítico la identidad es del 60% con VRK1 y del 34% con VRK3

(Fig. 2). Esto sugiere que la región C-terminal es clave para la regulación de la actividad y

localización de la quinasa [11].

Por otro lado, estudios de expresión génica mediante “arrays” indican que el gen VRK2 está

regulado positivamente en células T de sangre periférica estimuladas con anticuerpos anti-CD3

y anti-CD28 o con fitohematoglutinina (PHA), el ionóforo ionomicina o forbol 12-miristato 13-

acetato (PMA) [29], y se regula negativamente en células mononucleares de sangre periférica

estimuladas por lipopolisacárido o ionomicina y PMA [30]. Por otro lado, cabe destacar que el

grupo de Colin Bishop ha investigado de forma inadvertida los efectos de la eliminación del gen

VRK2, el cual se transcribe en la dirección opuesta en el genoma de ratón al gen Pog. Según este

grupo los ratones Vkr2-/-/Pog-/- son viables, aunque presentan problemas de fertilidad [31, 32].


VRK3 es el miembro más distante de la familia, posee el dominio catalítico en el extremo C-

terminal, el cual contiene varias sustituciones en residuos de lisina claves del dominio catalítico

y de hecho no presenta actividad quinasa [11] y es posible que, como ocurre con otras 50

proteínas que se asemejan a quinasas por su secuencia pero no presentan actividad enzimática,

pueda ser un sustrato para otras quinasas o tener una función de proteína de anclaje para la

formación de complejos de señalización [3]. Además contiene una secuencia de localización

nuclear (residuos 49-64) siendo nuclear su localización. También contiene posibles sitios de

fosforilación por CDK5 [11].

2. LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS QUINASAS ACTIVADAS POR

MITÓGENOS (MAPKS).

La superfamilia de proteínas quinasas MAPKs (Mitogen-activated protein kinases) está

compuesta por un grupo de quinasas cuya función, regulación y organización se han conservado

a lo largo de la evolución desde organismos unicelulares como las levaduras, hasta organismos

más complejos como los humanos. Las MAPKs representan una familia de serina-treonina

quinasas citosólicas que se caracterizan por transformar señales generadas en la membrana, a

través de una cascada de fosforilación en respuestas celulares específicas. Éstas son activadas

por numerosos estímulos extracelulares desde hormonas, factores de crecimiento, citoquinas que

actúan a través de receptores tirosina quinasa y distintos tipos de estrés como choque osmótico,

radiación ionizante y no-ionizante, lesiones isquémicas, etc. [33, 34]. La activación de proteínas

tirosina quinasas (PTKs) generalmente implica su dimerización en la membrana y

autofosforilación del dominio intracelular al que se unirán proteínas adaptadoras como Grb2, el

23

Introducción

cual es fosforilado y a continuación se unirá a factores intercambiadores de guanina (GEFs), al

que pertenecen la familia Sos y Ras-GRF, los cuales activan GTPasas de la familia Rho y Ras,

que a su vez transmiten la señal a las MAPKs. También existen otras formas de activación de la

cascada como es el caso de PKC, que activa la vía ERK a través de Raf1 [33].

Una vez estimuladas las vías de las MAPKs, éstas fosforilan sustratos específicos en motivos

Ser-Pro o Thr-Pro en el citosol o en el núcleo gracias a su capacidad de translocarse al núcleo

formando dímeros una vez activadas. Coordinan procesos como la síntesis de proteínas, ciclo

celular, muerte y diferenciación celular, regulando la expresión génica por fosforilación de

factores de transcripción, histonas y otras quinasas. También pueden contribuir a la

estabilización de determinados ARN mensajeros [34-36].

Las MAPKs forman parte de un módulo de transducción de señales citoplasmático compuesto

por tres quinasas que se activan mediante fosforilación secuencial. De esta forma las proteínas

MAPKs son activadas por MAPK-quinasas (MAP2Ks o MKKs), las cuales tienen capacidad

dual de fosforilar residuos de serina-treonina y tirosina, seleccionando aquellos motivos

treonina-X-tirosina en el subdominio de activación (VIII) dentro del dominio quinasa de las

MAPKs (donde X es glutamato, prolina o glicina para las quinasas ERK, JNK y p38

respectivamente). A su vez, las MKKs son fosforiladas en residuos de serina y treonina, también

en el subdominio VIII del dominio quinasa y activadas por MAPK-quinasas-quinasas (MKKKs,

MAP3Ks o MAPKKKs), las cuales son serina-treonina quinasas activadas por receptores de

membrana, proteínas asociadas a proteínas G u otras quinasas activadas por distintos estímulos.

Es en definitiva la diversidad de MKKKs y sus diferentes interacciones proteína-proteína y

modificaciones covalentes las que permiten la integración de vías específicas de señalización de

MAPKs que responden a diferentes estímulos [4, 34, 37, 38].

Prot

eína

de

ancl

aje MKKK

MKK

MAPK

QuinasasGTPasas

Proliferación, apoptosis, desarrollo, parada del ciclo celular, reparación celular, respuesta inmune, …

Figura 4. Organización de las vías de señalización de proteínas quinasas activadas por mitógenos.

Introducción

24

En organismos multicelulares se conocen básicamente cuatro grupos de MAPKs: ERK

(quinasas reguladas por señales extracelulares), JNK (quinasas del amino terminal de c-Jun,

también conocidas como quinasas activadas por estrés o SAPKs) y p38 [4, 35, 39-41].

Recientemente se ha identificado un cuarto grupo, el de ERK5 o BMK1 (Big MAPK kinase 1)

[42-44], que contienen un dominio de activación transcripcional y se activan por estrés y

factores de crecimiento, principalmente por neurotrofinas, a través de la vía MEKK2/3-MKK5 y

presentan una elevada expresión en cerebro de ratón durante el desarrollo embrionario [34, 37,

45, 46]. Otras quinasas identificadas bioquímicamente durante la secuenciación del genoma

humano o murino que podrían funcionar como MAPKs son ERK7 y ERK8 [47, 48].

2.1. La vía de ERK.

La vía de transducción de señales mejor estudiada en mamíferos es la formada por el módulo

Raf-MEK (quinasa de MAPK/ERK)-ERK. El grupo de ERK está constituida por dos quinasas,

ERK1 y 2 (también conocidas como p42 y p44). Son activadas principalmente por factores de

crecimiento, factores mitogénicos, citoquinas, virus, ligandos de receptores asociados a

proteínas G, agentes transformantes y carcinógenos que transmiten la señal a través de la familia

de proteínas quinasas C (PKC) o la familia de GTPasas Ras [36]. Los miembros mejor

caracterizados de la familia de GTPasas Ras son K-Ras, H-Ras y N-Ras, que junto con otros

proto-oncogenes de esta vía, están mutados en el 30% de los cánceres humanos [49, 50]. Estas

proteínas activan a la familia de MAP3Ks Raf (Raf1 o C-Raf, A-Raf y B-Raf), MEKK2 y 3 y

Tpl2 (tumor progresión locus-2), que a su vez activan a las MKKs MEK1 y 2, las cuales

mediante la fosforilación dual en motivos Thr-Glu-Tyr activan ERKs [51, 52]. Tras la

activación, ERK fosforila diferentes sustratos citoplasmáticos y nucleares como la proteína

quinasa ribosomal S6 p90RSK, la fosfolipasa A2 o factores de transcripción como c-Myc, Elk-

1, NF-IL6/C/EBPb/NFM, Tal-1, Ets-2, y proteínas STAT [34].

Estas quinasas se expresan ampliamente y regulan procesos como meiosis, mitosis,

proliferación, diferenciación, reorganización del citoesqueleto de actina y otros procesos

postmitóticos [4, 35, 40, 41]. La vía de ERK puede generar distintos tipos de respuestas

celulares dependiendo de la intensidad y duración de la señal, así aquellas señales de corta

duración promueven proliferación, mientras que la activación más prolongada estimula la

diferenciación celular [53].

2.2. La vía de p38.

El grupo de p38 lo constituyen 4 miembros: p38α, β, γ y δ, de los cuales la isoforma α es la

mejor caracterizada y la que se expresa en más tipos celulares [34]. Son fosforiladas en motivos

Thr-Gly-Tyr por las MKKs MKK3 y MKK6 [54], que a su vez son activadas por MKKKs como

25

Introducción

ASK1 (Apoptosis Signal-regulating Kinase 1 o MAPKKK5), MEKK2/4, MLKs (mixed lineage

kinases) y TAK1 (TGFβ-activated Kinase 1 o quinasa activada por el factor de crecimiento

transformante beta) [55]. A su vez son activadas por la familia de GTPasas Rho (Rho, Rac y

Cdc42). p38 controla la función de distintos factores de transcripción, quinasas o fosfatasas

como ATF-2, MEF2, MAPKAPK, CDC25, o MSK1/2 [35, 40, 41]. Aunque, al principio se

pensaba que esta vía sólo estaba implicada en la activación de la respuesta inmune y la

expresión de citoquinas [56] y era activada en células T por citoquinas inflamatorias (como IL-2

e IL-7) [57], ahora se sabe que también se activa por hormonas, ligandos de receptores

asociados a proteínas G, choque térmico, osmótico y otros tipos de estrés [58], los cuales

promueven parada del ciclo celular o muerte programada, supervivencia, crecimiento y

diferenciación celular [49, 59, 60]. En muchos de estos sistemas JNK colabora con p38 de

forma no redundante, siendo fundamental la actividad de ambas vías.

2.3. La vía de JNK.

Esta vía está formada por tres miembros, JNK1, 2 y 3. Fueron aisladas y caracterizadas

inicialmente como proteínas que fosforilaban el factor de transcripción c-Jun en su extremo N-

terminal en los residuos serina 63 y 73, el cual forma parte del complejo de transcripción AP1

(proteína activadora 1) [61, 62] y posteriormente se identificaron como proteínas activadas por

estrés, por ello también son conocidas como SAPKs [63, 64].

Existen tres genes en humanos que codifican para JNK1, 2 y 3 (también denominadas SAPKγ, α

y β respectivamente). Jnk1 y Jnk2 se expresan de forma ubicua y Jnk3 se expresa

preferentemente en sistema nervioso central, corazón y testículos. Además, estos tres genes

sufren un procesamiento alternativo del ARN dando lugar a 10 isoformas diferentes [65]. El

procesamiento alternativo ocurre esencialmente en el extremo C-terminal, dando lugar a los

Raf, Mos,Tpl2 MEKKs, MLKs, TAK1, ASK1 MLKs, MEKK4, ASK1, TAK1 MEKK2/3

MKK1/2

ERK1/2

MKK4/7

JNK1,2,3

MKK3/6

p38 α,β,γ

MKK5

ERK5

Factores de crecimiento, GPCR

Factores de crecimiento, GPCR, estrés, citoquinas inflamatorias

Factores de crecimiento,

GPCR, estrés

Crecimiento, diferenciación,

desarrollo

Crecimiento, diferenciación, desarrollo, apoptosis, inflamación

Crecimiento, diferenciación,

desarrollo

Figura 5. Distintas vías de señalización de las proteínas quinasas activadas por mitógenos.

Introducción

26

tipos 1 y 2, sin y con el extremo C-terminal respectivamente, y solamente en Jnk1 y 2 ocurre

otro procesamiento en la región entre los dominios IX y X dando lugar a los tipos α y β con

diferente especificidad de sustrato, ya que altera el sitio de reconocimiento del sustrato [64-66].

2.3.1. Organización de la vía de señalización de JNK.

La vía de JNK es activada por diversos tipos de estímulos como factores de crecimiento,

citoquinas como el factor de necrosis tumoral TNFα o la interleuquina IL-1β, choque osmótico

o térmico, radiación UV, lesiones isquémicas, anoxia o hipoxia a través de diferentes

mecanismos. MKK4 y MKK7 (también conocidas como SEK1/JNKK1 y SEK2/JNKK2) son

las MKKs encargadas de activar JNK mediante fosforilación dual en los residuos treonina 183

JIP

Crk G

rb2 Sos

Crk

L

Shc

RTKs

PI3K

Ras Rac Cdc42 Rho

POSH

Factores de crecimiento, UV

Estrés celular, radiación γ

FasL, UV, citoquinasinflamatorias

Estrés oxidativo

Receptores acoplados a proteínas G

Rac Cdc42

TRAD

D

TRAF

RIP

Dax

x

GβγGα

12/13PI3Kγ

MLKs TAK1 MEKK1/4 MEKK1, MLKs

MEKK1, MLKs

HPK

GCKs

ASK1 TAK1 MEKK1, MLKs

MEKK1, MLKs

MKK7

JNK1/2/3

MKPs

JNK1/2/3

MKK4/7

Apoptosis

Núcleo JNK1/2/3

JNK1/2/3

c-Jun ATF2 Elk1 p53 NFAT4 NFATc1

TRANSCRIPCIÓN

Crecimiento Diferenciación Supervivencia Apoptosis

Citosol

Figura 6. Organización esquemática de la vía de señalización de JNK.

27

Introducción

(principalmente por MKK7) y tirosina 185 (principalmente por MKK4) [67-69]. Mientras que

MKK7 se activa por estímulos como TNF o interleuquina 1, MKK4 se activa preferentemente

por estrés ambiental. Sin embargo, para la completa activación de JNK es necesaria la

cooperación de estas dos quinasas [34].

MKK4 es activada por fosforilación dual en serina 257 y en treonina 265 y MKK7 es

fosforilada en serina 271 y treonina 275 por quinasas activadoras que se encuentran por encima.

MEKK1 activa preferentemente MKK4, pero también a MKK7 [67, 70], y responde a estímulos

como el factor de necrosis tumoral (TNF) [71], drogas que desorganizan los microtúbulos [72],

estrés oxidativo [73] a través de GTPasas de la familia Rho y Ras, y GCKs asociadas a

complejos TNFR-TRAFs [74]. MEKK2 activa MKK4 y MKK7 y está implicada en activación

de células T [68]. MEKK3 está implicada en angiogénesis y desarrollo del aparato

cardiovascular [34]. Por último, MKK4 responde a estrés genotóxico a través de Rac/Cdc42

aunque parece ser más específica para p38 [67, 75]. TAK1 responde a citoquinas como TGF-β,

IL-1β y TNFα [76-79]. ASK1 contribuye a la activación de JNK como respuesta a estimulación

de larga duración por TNF, estrés oxidativo o Fas [80, 81]. Tpl2 fosforila MEKK4, MEK1,

MEK5 y MKK6 [82]. La familia de quinasas MLKs está compuesta por 7 miembros agrupados

en tres subgrupos: MLKs (comprende MLK1-4), DLK [que comprende DLK (dual leucine

zipper kinase) y LZK (leucine zipper kinase)] y ZAP. Son activadores de la vía de señalización

de JNK, aunque la sobre-expresión de algunos de los miembros de la familia también activan la

vía de p38. MLK3, MLK2 y DLK activan a MKK4, mientras que MKK7 es fosforilada in vivo

por MLK3, DLK y MLK2 [67, 83].

Las MKKKs descritas anteriormente son activadas como respuesta a las GTPasas activas de la

familia Rho, Rac1 y Cdc42, por la serina-treonina quinasa PAKs (p21-activated kinase) que

interacciona con MEKK y activa la vía de JNK y p38, por otro lado MLK2 y 3 son efectores

directos e interaccionan con Cdc42 y Rac activos, por último POSH (plenty of SH3 domains)

interacciona directamente con Rac1 y activa la vía de JNK [84]. La familia de quinasas

reguladas por estrés GKC (quinasa del centro germinal), dentro de las cuales se encuentran

GCK, GCKR (GCK-related), GLK (GCK-like kinase), HPK1 (hematopoietic progenitor kinase-

1), NIK (Nck-interacting kinase o HGK de HPK1/GCKlike Kinase), TNIK (TRAF and Nck

interacting kinase), y Nrk (NIK-related kinase). Todos ellas son activadas in vivo por TNF y

activan la vía de JNK a través de MEKKs excepto HPK1 que lo hace a través de MLKs [34].

Por último, la superfamilia de receptores de TNF (TNFR), los cuales responden a citoquinas

inflamatorias, el receptor de IL-1 (IL1R) y los receptores TLR (toll-like receptors), que

responden a endotoxinas, también activan las vías de JNK y p38 a través de los factores

asociados a TNFRs TRAFs (Fig. 6) [34].

Introducción

28

La actividad de JNK, al igual que la de otras MAPKs, puede ser regulada de forma negativa por

una familia de proteínas fosfatasas denominadas MKPs (mitogen-activated protein

phosphatases). Se dividen en tres categorías según su actividad, entre las ellas las fosfatasas de

actividad dual tirosina y serina-treonina (DSPs) son las que más contribuyen a la inactivación de

estas vías [85]. Se ha descrito que M3/6, MKP5, MKP7, MKP1 y MKP2 defosforilan JNK [84,

86, 87]. Las serina-treonina proteína fosfatasas PP1 y PP2A también parecen estar implicadas

en la inactivación de estas vías [84].

2.3.2. Función biológica de JNK.

2.3.2.a. Sustratos de JNK.

c-Jun fue el primer sustrato de JNK descrito y es fosforilado por JNK en los residuos serina 63 y

73 aumentando su estabilidad y su actividad transcripcional [61, 62, 88]. Posteriormente se ha

identificado otras dianas de JNK como son los factores de transcripción Elk-1, p53, y c-Myc

[41] y otros que no son factores de transcripción como Bcl2 y BclXL [89-91].

c-Jun forma parte del factor de transcripción AP1. El complejo AP1 está formado por

heterodímeros de factores de transcripción con una región de cremalleras de leucina

principalmente de las familias de Jun (c-Jun, JunB, JunD), Fos (c-Fos, FosB, Fra1 y Fra2), Maf

(c-Maf, MafB, MafA, MafG/F/K y Nrl) y ATF (ATF2, LRF1/ATF3, B-ATF, JDP1, JDP2).

Como consecuencia de esta variabilidad AP1 se une a diferentes elementos de respuesta entre

los cuales TRE (elemento de respuesta a 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato) y CRE (elemento

de respuesta a AMP cíclico) son las dianas más comunes de AP1. Está implicado en el control

de procesos de proliferación, supervivencia, diferenciación y transformación celular mediante la

activación de varios tipos de genes: oncogenes (c-jun y c-fos), genes supresores de tumores,

genes de proteasas implicadas en invasividad y en la respuesta inflamatoria (colagenasa I),

genes de factores angiogénicos (VEGF), citoquinas y otros factores reguladores del sistema

inmune [92]. Los miembros mejor estudiados son los de las familias de Jun y Fos, los cuales en

líneas generales regulan de forma positiva la proliferación celular, a excepción de JunB,

mediante la regulación de la expresión de genes reguladores del ciclo. Así c-Fos, FosB y c-Jun

estimulan la expresión de ciclina D1, c-Jun además disminuye la expresión de p53 y reprime su

actividad transcripcional, por tanto disminuye los niveles de expresión del inhibidor de CDKs

(quinasa dependiente de ciclina) p21, responsable de la actividad antiproliferativa de p53, y todo

ello contribuye a la progresión del ciclo celular y crecimiento normal, inhibiendo la inducción

de parada del crecimiento inducida por p53 al final de la respuesta celular al estrés. Sin

embargo, JunB estimula la expresión de p16/INK4, un inhibidor de complejos ciclina D1-

CDK4/6 y de p19/p14/ARF, un regulador positivo de p53 [93]. Jun y Fos también están

implicados en transformación celular. Por un lado, son homólogos de oncogenes retrovirales,

29

Introducción

además su actividad es inducida por varias onco-proteínas promotoras de tumores y cooperan

con oncogenes activados como Ha-Ras [92].

AP1 también está implicado en la inducción y prevención de apoptosis, respuestas que son

dependientes del tipo y estadio de desarrollo celular. La actividad pro-apoptótica de c-Jun se

debe en parte a la inducción de la expresión de Bim (un miembro de la familia de proteínas pro-

apoptóticas Bcl2), o el ligando de Fas (FasL). Sin embargo c-Jun también reprime la expresión

de Fas y aumenta la expresión de Bcl3, previniendo apoptosis [94, 95]. Es por tanto el balance

entre proteínas pro- y anti-apoptóticas el que determina el efecto final, el cual dependerá del tipo

celular y de la duración del estímulo.

2.3.2.b. Mecanismos apoptóticos dependientes de JNK.

Se ha propuesto que la activación de JNK promueve apoptosis como respuesta a distintos tipo

de estrés como UV y radiación γ, inhibidores de síntesis de proteínas, hiperosmolaridad,

isquemia, choque térmico, drogas anticancerígenas, ceramida, estimulación del receptor de

células T, peróxido, o citoquinas inflamatorias como TNFα [41]. Respuesta que lleva a cabo

mediante el aumento de la transcripción de ligando de Fas o c-Myc, represión de la

transcripción de p53, inhibición por fosforilación de Bcl2 o BclXL e inducción de la liberación

de citocromo C y SMAC/Diablo en mitocondrias aisladas [41, 55]. P53 es una de las dianas pro-

apoptóticas de JNK. Además de los mecanismos descritos anteriormente por los cuales las vías

de p53 y AP1 están relacionadas, JNK puede regular la estabilidad y actividad transcripcional

de p53 en respuesta a distintos tipos de estrés mediante la fosforilación en varios residuos. JNK

fosforila p53 en serina 20 como respuesta a radiación UVB [96], en serina 15 como respuesta a

estrés oxidativo [97] y en treonina 81 como respuesta a daño en el ADN y agentes inductores de

estrés, siendo imprescindibles para la parada del ciclo en fase G1 [98]. JNK1 fosforila serina 34

c-Jun

JNK

UV

p53

FasLBimBcl3

Fas Daño irreparable

Reparación de daño

Balance

Apoptosis Supervivencia

Figura 7. Efecto de JNK y c-Jun en apoptosis. El efecto de c-Jun sobre la apoptosis depende del balance entre los genes pro- y anti-apoptóticos inducidos por c-Jun, lo cual depende del tipo celular y de la duración e intensidad del estímulo. Además, c-Jun también regula apoptosis mediante inhibición de p53, contribuyendo al balance final entre apoptosis y supervivencia.

Introducción

30

en células murinas [99]. Sin embargo, JNK en ausencia de estrés regula negativamente la

estabilidad de p53 mediante un mecanismo independiente de su actividad quinasa e

independiente a Mdm2 [100].

2.3.2.c. JNK está implicada en supervivencia celular.

No obstante JNK también promueve supervivencia celular: en los ratones jnk1-/-/jnk2-/- se

produce un aumento de la apoptosis en el cerebro en el estadio E10.5 durante el desarrollo

embrionario [101], los timocitos inmaduros y células T maduras deficientes en JNK1 son muy

sensibles a apoptosis inducida por Fas y CD3 [102]. No obstante la función anti-apoptótica de

JNK parece depender del estado de p53, así la supresión de la actividad de JNK en ciertos

tumores deficientes en p53 inhibe su crecimiento, probablemente porque JNK inhibe la parada

de ciclo inducida por p53 y promueve la actividad apoptótica de p53 [103]. Además JNK

también puede inducir supervivencia celular por la fosforilación e inactivación de la proteína

pro-apoptótica BAD, impidiendo que BAD interaccione e inactive la proteína anti-apoptótica

BclXL [90].

2.3.2.d. Modelos genéticos murinos.

La función de JNK ha sido analizada intensamente en modelos genéticos murinos, según los

cuales JNK está implicada en procesos morfogenéticos durante el desarrollo embrionario.

Ninguna de las deleciones por separado de los tres genes son letales y no producen defectos

graves, probablemente debido a la complementación entre ellos, aunque si existen defectos en la

transducción de señales en tejidos específicos, posiblemente debido al perfil de expresión de

cada isoforma [104]. Sin embargo, el doble “knock-out” jnk1-/-/jnk2-/- es letal y muere debido a

defectos en apoptosis y morfogénesis del tubo neural [101]. El análisis de los ratones

heterocigotos jnk1+/-/jnk2+/- , o deficientes en MKK4, y en general la reducción parcial de la

actividad de JNK1/2, implican a JNK en la producción de IL-2 en células T, en la proliferación

de células T efectoras y en la selección negativa de células T [105-108]. Sin embargo, los

linfocitos T deficientes en JNK1/2 exhiben una actividad transcripcional normal de AP1 aunque

parcialmente defectuosa de NF-AT, un factor de transcripción necesario para la inducción de

IL-2 [105-108].

Los ratones deficientes en c-Jun, MKK4 o MKK7 son letales debido a defectos en la

proliferación de hepatocitos [109, 110]. En aquellos ratones que expresan el mutante de c-Jun

que no puede ser fosforilado por JNK (c-JunS63/73A), y en ratones jnk3-/-, las neuronas del

hipocampo son resistentes a apoptosis como respuesta a estímulos excitotóxicos [111, 112],

estableciendo una función pro-apoptótica para aquellos estímulos que activan JNK de forma

31

Introducción

prolongada, sin embargo aquellos estímulos fisiológicos que activan JNK de forma transitoria

no producen apoptosis.

2.3.2.e. Papel de JNK en el desarrollo de tumores.

Se ha descrito que JNK se encuentra activada en muchas líneas celulares tumorales y que la

actividad transformante de muchos oncogenes depende de la actividad de JNK, probablemente

a través del factor de transcripción AP1 el cual también contribuye a la transformación celular y

tumorigénesis [113]. Así, c-Jun es necesario para la transformación inducida por Ras y la

mutación de los sitios de fosforilación por JNK de c-Jun inhibe este efecto. Sin embargo, JNK

también pueden desarrollar su efecto oncogénico a través de otros sustratos como Elk1 o

inactivando proteínas por-apoptóticas como BAD [114]. Por el contrario también se ha descrito

que células deficientes en JNK1 y 2 no solo son transformadas por Ras, sino que forman

tumores mayores que los producidos por células que expresan JNK. Se ha descrito que JNK3

está mutada en tumores cerebrales, MKK4 está mutada en cáncer de páncreas, mama, próstata y

colorrectal y la pérdida de función asociada a la mutación correlaciona con una pérdida de

activación de JNK y con una agresividad del tumor. Resultados que contradicen el párrafo

anterior y en lugar de colaborar con tumorigénesis, JNK parece ser un supresor de tumores

[114].

2. 4. La MAP3K TAK1.

TAK1 (quinasa activada por el factor de crecimiento transformante β) es un miembro de la

familia de MAP3Ks identificado inicialmente como una quinasa relacionada con la vía de

señalización de TGFβ [79], aunque no parece pertenecer a ninguna familia de quinasas

conocida. Manning y colaboradores tras la secuenciación completa del genoma humano han

clasificado todas las quinasa humanas por similitud del dominio catalítico en un gran árbol

filogenético denominado “quinoma humano”, según el cual TAK1 sería un miembro lejano de

la familia de MAP3Ks MLK [3]. Tak1 se expresa de forma ubicua y da lugar a cuatro isoformas

debido a un procesamiento alternativo del ARN. La diferencia entre ellas radica en el extremo

C-terminal y probablemente en las interacciones con diferentes moléculas reguladoras como el

factor TAB2 [115-117].

2.4.1. Activación de la vía de TAK1.

Se ha descrito que TAK1 se activa por citoquinas como el factor de necrosis tumoral TNFα,

interleuquina 1β (IL-1β), LPS (lipopolisacárido) y choque osmótico [76-78, 117-124]. Además

participa en la vía de señalización de Wnt [123, 125], de la proteína latente de membrana 1

(LMP1) del virus Epstein Barr [126] y en la vía de señalización de CD3/CD28 en linfocitos T

[126-128].

Introducción

32

Los factores de transcripción AP1 y el factor nuclear NFκB son los mediadores clave de la

respuesta inmune innata e inflamatoria y son activados por citoquinas inflamatorias a través de

los receptores de TNF (TNFR) y de IL-1 (IL-1R) y receptores de la familia TLR (Toll-like

receptor por ser homólogos a los receptores Toll en Drosophila) que se activan con productos

microbianos y endotoxinas como LPS. Éstos a su vez activan las vías de las quinasas IKK

(quinasa de IκB) y JNK/p38 que finalmente convergen en los factores de transcripción

mencionados, que a su vez dan lugar a la expresión de otras citoquinas, quimioquinas, proteasas

y enzimas metabólicas [129]. Sin embargo, y a pesar de que las rutas de señalización que se

activan son similares, estos tres tipos de mediadores inducen distintas respuestas biológicas, por

ejemplo TNF, pero no IL-1 induce apoptosis [130]. TAK1 es la MAP3Ks candidata que regula

la activación de AP1 y NFκB, aunque se ha descrito que otras MAP3Ks como MEKK1,

MEKK3 y MLKs también activan estas dos vías [131].

La unión de TNFα con su receptor TNFR1 induce la interacción de éste con la proteína

adaptadora TRADD (TNFR-associated death domain protein), los factores asociados al receptor

de TNF, TRAF2 y TRAF5, y la proteína quinasa RIP1 (proteína que interacciona con el

receptor). A su vez, este complejo promueve la asociación y activación de las quinasas IKK y

JNK/p38 [132]. IKK fosforila IκB promoviendo su degradación y la translocación de NFκB al

núcleo [133]. JNK se transloca al núcleo donde fosforila y activa AP1 [134, 135].

Los receptores TLR y IL-1R activan vías de señalización similares. En la vía de señalización de

IL-1β, la interacción de ésta con su receptor IL-1R promueve la asociación de éste con la

proteína accesoria IL-1Racp, que a su vez se asocian con las proteínas adaptadoras MyD88, las

quinasas asociadas a IL-1R IRAK1-4 y TRAF6 formando un complejo activo. La fosforilación

y degradación de IRAK1 induce la auto-ubiquitinación de TRAF6 mediada por el complejo con

actividad ubiquitina ligasa formado por TRAF6, Ubc13 y Uev1A (o TRIKA1) y la liberación

del resto del complejo al citoplasma donde activan las vías de IKK y JNK a través de TAK1

[120, 136, 137]. TAK1 fosforila y activa IKK en serina 177 y 181, que a su vez activa la vía de

IκB, y MKK6 (en serina 207 y treonina 211), así como MKK3, que activan p38 y MKK4 que

activa JNK [76-78, 121]. Aunque también se ha descrito que TAK1 interacciona directamente

con JNK1 activándola de forma independiente a MKK4/7 [138].

Por otro lado, TAK1 necesita unirse a los factores TAB1, 2 y 3 (TAK1 binding protein) para ser

activa [118, 123, 139, 140]. Así, TAB1 se une al extremo N-terminal de TAK1 e induce su

autofosforilación en serina 192 y treonina 184 y 187 [140-143]. La vía de NFκB parece ser

activada preferentemente por el complejo TAK1-TAB1 in vitro [77]. TAB2 interacciona con el

extremo C-terminal de TAK1 y es un adaptador que permite la interacción de TAK1 y

33

Introducción

TRAF2/6, pues la estimulación con IL-1β promueve la translocación de TAB2 de la membrana

al citosol donde induce la ubiquitinación de TRAF6 y la interacción de TRAF6 con TAK1 con

la consiguiente activación de TAK1 [118, 121-123, 144]. Además existe una regulación

negativa que implica la defosforilación de los sitios mencionados anteriormente, donde PP2Cβ1

y PP2Cε son las fosfatasas candidatas ya que se asocian con TAK1. PP2Cβ1 inhibe la

activación de TAK1 por IL-1β y PP2Cε se disocia de TAK1 durante la activación de ésta por

IL-1β [145, 146]. Asimismo, se ha descrito una regulación negativa por parte de p38α que

media la fosforilación del factor TAB1 (en serina 423 y treonina 431), TAB2 y TAB3 que a su

vez promueven la inhibición de la actividad de TAK1 [124, 139, 145].

2.4.2. Función biológica de TAK1.

TAK1 está conservada evolutivamente y se ha observado que en organismos modelo como en

Drosophila es esencial para la activación de las vías de JNK y NFκB durante la respuesta

inmune [147, 148]. En Xenopus está implicada en la inducción y formación del patrón del

mesodermo mediada por ligandos de la familia de TGFβ durante el desarrollo embrionario

[149].

En mamíferos, estudios in vitro y de sobre-expresión sugieren que TAK1, junto con los factores

a los que se asocia TAB1, TAB2 y TAB3, están involucrados en las vías de señalización de

TNFR e IL-1R/TLR, y activan las quinasas IKK y JNK/p38 y regulan la expresión de genes

relacionados con inflamación [118, 122, 140, 150]. Efectivamente, la eliminación de la

actividad de TAK1 por ARN de interferencia, mediante la sobre-expresión de dominantes

negativos de TAK1 o el uso de inhibidores de la actividad quinasa específicos para TAK1, la

TAK1

LTβR TNFR1 IL-1R TLR4 TGFβR

JNKIKKβ

Activación de NFκB Activación de AP1

SMAD

Activación de la vía de

TGFβ

Activación alternativa de

NFκB

RIP/TRAF2 MyD88/IRAK/TRAF6

NIK

IKKα

Figura 8. Representación esquemática de la vía de señalización de TAK1. LTβR: receptor de linfotoxina β; TGFβR: receptor de TGFβ; NIK: quinasa inductora de NFκB; SMAD: mediadores directos de la respuesta de TGFβ.

Introducción

34

activación de la vía de NFκB por IL-1β o TNF está afectada [77, 122, 150]. TNF promueve

supervivencia celular y proliferación mediante la expresión de proteínas anti-apoptóticas de la

familia Bcl2 e inhibidores de apoptosis de la familia IAP. Por otro lado, TNF también induce

apoptosis promoviendo la asociación del dominio de muerte de Fas y caspasa 8, con la

consiguiente activación de caspasa 3 [129]. El balance entre las dos vías dará lugar a distintas

respuestas, y en el caso de las células que no expresan TAK1 o expresan un dominante negativo,

la vía que promueve la expresión de genes anti-apoptóticos está alterada dando lugar a muerte

celular [150, 151]. También se ha observado que la inducción de proliferación y respuesta

inmune por antígeno es defectuosa en células B deficientes en TAK1, indicando que TAK1 está

implicada en la respuesta inmune innata y adquirida [151].

Los cofactores TAB no son totalmente necesarios para la activación de TAK1. Asimismo, a

diferencia de las células deficientes en TAB1 o TAB2, las células que no expresan TAK1

muestran una inhibición de la activación de la vía de JNK y NFκB por TNFR, IL-1R o TLR3 y

son sensibles a apoptosis inducida por TNFα, lo que sugiere que TAK1 es crucial para la

activación de JNK como respuesta a TNF o IL-1β, aunque no parece ser esencial en la

activación de NFκB [135]. En modelos murinos deficientes en TAB2 la vía de IL-1R no está

afectada [152]. Es posible que en estos modelos exista una redundancia de función entre TAB2

y su homólogo TAB3 [123, 139, 153, 154]. De hecho se ha descrito que la eliminación de

TAB2 y TAB3 mediante ARN de interferencia inhibe totalmente la activación de IKK y JNK

por IL-1β y TNFα [123, 124]. Por otro lado el complejo TAK1-TAB1 es necesario para la

activación de NFκB y AP1 por TGFβ, sin embargo la ausencia de TAB2 no afecta esta vía de

señalización [135].

Estudios in vivo sugieren que TAK1 es esencial para el desarrollo embrionario ya que los

ratones Tak1/Map3k7-/- mueren durante el estadio de desarrollo E 9.5-10.5, debido al desarrollo

anormal del tubo neural [135, 151]. Durante el desarrollo embrionario temprano del ratón se ha

observado que los niveles de expresión de TAK1 son moderados, aumentando de forma ubicua

durante los días 12.5, pero a mitad de la gestación (E14.5) decaen siendo específicos de sistema

nervioso, riñón, testículos, intestino, hígado, pulmón y páncreas [155]. El fenotipo de ratones

Tak1-/- es diferente de aquellos deficientes en moléculas implicadas en la señalización de

NFκB, como RelA/p65 o IKKβ, que mueren en el útero debido a apoptosis masiva en el hígado,

por lo tanto la ausencia de TAK1 no parece inhibir totalmente la vía de NFκB [151]. Por otro

lado, los ratones que no expresan TAB1 mueren en estadios tardíos de la gestación debido a

malformaciones del aparato cardiovascular y respiratorio, al igual que los ratones deficientes en

genes implicados en la vía de señalización de TGFβ, lo que sugiere la implicación de TAB1 en

esta vía de señalización. Los ratones Tab2-/- mueren a los 11.5-12.5 días debido a degeneración

35

Introducción

del hígado por apoptosis masiva [152, 156]. Estos resultados sugieren que TAK tiene funciones

que no dependen de su interacción con las proteínas adaptadoras TAB.

3. LAS PROTEÍNAS DE ANCLAJE DE LAS VÍAS DE SEÑALIZACIÓN DE MAPKS.

El comportamiento de los complejos sistemas de las vías de MAPKs se pueden modular

básicamente de tres formas: mediante proteínas de anclaje, mediante la localización de los

complejos de señalización en la célula y mediante el control de la duración de las señales que

pueden influir en la naturaleza de la respuesta biológica [157, 158].

Las proteínas de anclaje reúnen distintos componentes de las vías de señalización en módulos

funcionales. Normalmente no contienen ninguna actividad enzimática intrínseca, pero su

estructura les permite ensamblar diferentes factores de una misma vía de señalización de forma

simultánea, confiriendo de esta forma especificad a cada vía de señalización, permitiendo

además una activación más eficiente de las mismas en regiones limitadas de la célula como

respuesta a un determinado estímulo. No obstante, un mecanismo paralelo y alternativo es la

interacción física y de forma secuencial entre cada miembro de una determinada cascada de

fosforilación, de forma que cada interacción se interrumpe cuando la quinasa que está por

debajo ha sido activada. Las interacciones secuenciales entre quinasas que no implican proteínas

de anclaje proporcionan amplificación de la señal, aunque a expensas de sacrificar cierto grado

de especificidad. En estos casos la especificidad está dirigida por la presencia de sitios de unión,

normalmente distantes del sitio de fosforilación, y que son específicos para cada grupo de

JIP1

MLK

MKK7

JNK

HPK

MEKK1 MKK4

MEKK1

JNK

Estímulo

MKK4P P

MKK4P P

MKK4P PJNK

P P

Respuesta

A BEstímulo

Respuesta

Figura 9. Mecanismos de generación de especificidad en las vías de MAPKs. A) JIP1 actúa como una proteína de anclaje que une las MAPKs HPK1, MLK, MKK7 y JNK en un módulo de señalización específico y dinámico. B) Interacción secuencial y específica entre miembros de una cascada de fosforilación. MEK1 interacciona con MKK4 inactiva formando un complejo. MEKK1 fosforila y activa MKK4 y como resultado se disocia del complejo. MKK4 activada interacciona con JNK. JNK una vez activada se libera del complejo para fosforilar sus sustratos.

Introducción

36

MAPKs induciendo interacciones más estables que las interacciones enzima-sustrato. Así por

ejemplo, JNK1/2 se une al extremo N-terminal de MKK4, que a su vez interacciona con el

dominio catalítico de MEKK1 (Fig. 9) [35]. Los dos tipos de mecanismos funcionan de forma

paralela en la célula, dando lugar a distintos tipos de activación de la misma MPAK en función

del estímulo. Además, modificaciones postraduccionales como la fosforilación,

monoubiquitinación o sumoilación también pueden modular las interacciones proteicas [35].

Step5p fue la primera proteína de anclaje descrita, la cual ensambla el módulo de MAPKs

Ste11p-Ste7p-Fus3p de S. cerevisiae y está implicado en la regulación de apareamiento,

responde a cambios de osmolaridad y regula el crecimiento invasivo [159].

En mamíferos se han descrito varias proteínas de este tipo, relacionadas o no con vías de

señalización de MAPKs. Así para la vía de señalización de ERK1/2 se conocen varias proteínas

de anclaje: MP1 (MEK partner 1) que interacciona simultáneamente con MEK1 y ERK1,

facilitando su activación por Raf1, y con el adaptador endosomal p14, dirigiendo el complejo

MEK1/ERK1 hacia el endosoma tardío. MEK1/2, ERK1/2 y Raf también se unen a la proteína

de anclaje KSR, la cual localiza el complejo en la membrana plasmática como respuesta a la

activación de Ras [49, 158, 160]. β-arrestina1 y 2 unen Raf1, MEK1/2 y ERK1/2 translocando

el complejo de señalización a la membrana plasmática donde interaccionan con GPCRs

(receptores asociados a proteínas G) activos [49, 158]. A su vez β-arrestina 1 y 2 se unen a

GPCRs activos y bloqueando la interacción de éstos con proteínas G e induciendo la

internalización a endosomas. De esta forma, los complejos β-arrestina-GPCRs resultan en la

retención de ERKs unidas a endosomas, mientras que los complejos unidos a KSR se disocian

inmediatamente permitiendo la translocación de MAPKs al núcleo, de este modo la señalización

de estos complejos tienen diferente localización y duración. Paxilina, una proteína adaptadora

en adhesiones focales que regula la migración celular, se asocia de forma constitutiva a MEK y

en respuesta a HGF (factor de crecimiento de hepatocitos) a Raf1 y ERK. MEKK1 también se

comporta como una proteína de anclaje y une Raf1, MEK1 y ERK2 con proteínas del

citoesqueleto, lo que permite una respuesta celular más eficiente para aquellas señales

transmitidas a través de elementos del citoesqueleto [160, 161]. La proteína de anclaje OSM

regula la activación de p38 dependiente de MEKK3 [158].

También se han descrito proteínas de anclaje que podrían modular la vía de JNK. CrkII se une a

Paxilina y p130Cas y se localiza en adhesiones focales, además también interacciona con

MKK4 y JNK1/2, la cual fosforila paxilina y regula mecanismos de migración celular [158,

160]. MKK4 y TRAF2 se unen a Filamina, una proteína que interacciona y organiza filamentos

de actina y que podría ser una proteína de anclaje en la vía señalización de TNFα [68]. JIP1

37

Introducción

(JNK-interacting protein 1) fue la primera proteína descrita que ensambla componentes de la vía

de JNK, y del cual se han identificado 3 miembros más en la familia que componen diferentes

módulos de transducción de señales [160]. β-arrestina 2 forma un módulo de señalización con

ASK1, MKK4 y JNK3, expresándose de forma específica en cerebro y corazón que regula la

actividad de JNK3 en endosomas como respuesta a GPCRs [162-164]. La proteína asociada a la

quinasa IκB (IKAP), la MAPK fosfatasa MKPX y POSH son otros ejemplos de proteínas que

forman parte de módulos de activación de la vía JNK [160].

3.1. La familia de proteínas de anclaje JIP (JNK interacting protein).

La familia de proteínas de anclaje JIP está compuesto por 4 miembros y se puede dividir en dos

subgrupos en función de la similitud de sus secuencias, aunque todas ellas se caracterizan por

ser proteínas citoplasmáticas moduladores de la vía de JNK, también pueden activar la vía de

p38 y potencialmente son proteínas transportadoras ya que interaccionan con la proteína motora

quinesina. Además, todas ellas parecen funcionar como dímeros [165, 166].

Jip1 se expresa de forma ubicua, aunque predominantemente en cerebro, testículos, riñón y

pulmón [167], y genera dos isoformas mediante un procesamiento alternativo, JIP1 y JIP1b, esta

última de mayor tamaño contiene en el extremo C-terminal un dominio HLH (Helix-Loop-

Helix) y un dominio PID (phosphotyrosine interaction domain), y se detecta en niveles muy

altos en células β del páncreas[37, 166, 168-170]. La expresión de Jip2 es mucho más

específica, siendo casi exclusiva de neuronas y células neuroendocrinas [166]. También sufre un

procesamiento alternativo, al menos en ratón, dando lugar a una forma más corta [168].

Jip3/JSAP1 se expresa principalmente en neuronas y células neuroendocrinas, pero también se

detecta en niveles más bajos en corazón y testículos. En ratón da lugar a dos formas debido a un

procesamiento alternativo: JIP3a y JIP3b [165, 171]. En humanos existen tres isoformas JIP3,

JIP3β, que se expresan en neuronas y células neuroendocrinas, y JIP3γ que se expresa

principalmente en testículos [165, 172]. Cabe destacar que aquellas isoformas de JIP2 y JIP3

que se expresan principalmente en cerebro se concentran en adultos en regiones vulnerables a

estados patológicos como hipoxia-isquemia, epilepsia o Alzheimer como son el córtex cerebral

y el hipocampo [168]. Por último, JIP4 se detecta principalmente en cerebro, riñón, hígado,

corazón y testículos[173].

3.2. Interacciones funcionales de JIP1 y JIP2.

JIP1 y JIP2, también conocidos como IB1 y IB2 (islet brain), son estructuralmente similares e

interaccionan con componentes de la vía de JNK y p38. JIP1 consiste en un dominio JBD (JNK

binding domain), que comprende los aminoácidos 127 a 283 en el extremo N-terminal, por el

cual se une a JNK (los aminoácidos esenciales son 143-163), en el extremo C-terminal contiene

Introducción

38

un dominio SH3 (Src-homology 3) y un dominio PTB (phosphotyrosine-binding) (aminoácidos

291-660), y una región rica en prolinas (aminoácidos 281-448) con sitios consenso de unión a

dominios SH3 [167]. JIP2 también contiene un dominio SH3 y un dominio PTB [37, 166, 167,

170, 174]. JIP1 es una proteína citoplasmática, y parece estar asociada a membranas en

neuronas [167, 175].

JIP1 se une de forma selectiva a cualquiera los miembros de la familia JNK, aunque con mayor

afinidad a JNK1, pero no se une ni a ERK, ni a p38. La afinidad de JNK por JIP1 es 100 veces

mayor que la de JNK por su sustrato c-Jun. Fue previamente descrito como un inhibidor de la

vía de señalización de JNK ya que previene la translocación de JNK al núcleo [167]. JIP1

también interacciona de forma específica con componentes de la vía de JNK como son la MKK

activadora de JNK MKK7, aunque no con MKK4, y por último con miembros de la familia

MLK (MLK2 y 3, DLK y LZK), pero no con MEKK1. HPK1 también interacciona con JIP1,

pero de forma indirecta a través de los miembros de la familia MLK con los que interacciona

directamente [37, 83, 166]. Cada una de estas quinasas se une a regiones distintas de JIP1, así

JNK lo hace por la región comprendida entre los aminoácidos 143 y 163, MKK7 por los

aminoácidos 282 a 471 que corresponde a la región rica en prolinas y MLK3 por el dominio

SH3 entre los residuos 471 y 600 [37, 167]. ASK1 y JNK3 también interaccionan con la forma

JIP1b en neuronas [176]. JIP2 interacciona con JNK, MKK7 y MLK, aunque de forma más

débil que JIP1, y también se une a MKK3, a p38α por su dominio JBD y a p38δ por su extremo

C-terminal [37, 177-179]. Además, las dos proteínas interaccionan con las MAPK fosfatasas

MKP7 y M3/6, lo que sugiere que estos módulos de señalización incluyen los componentes

activadores pero también los inhibidores de la vía de señalización específicos [86]. Se ha

descrito que JIP1 y 2, al igual que el resto de los miembros de la familia forman oligómeros

funcionales, así JIP1 y 2 pueden formar homo o heterodímeros entre ellos mediante

interacciones del dominio C-terminal [165, 166].

Además de formar un módulo de señalización de las vías de JNK y p38 mediante múltiples

interacciones entre estas proteínas, también se ha descrito que JIP1 y 2 se unen a la cadena

ligera de quinesina por su extremo C-terminal [180, 181], actuando como proteínas

transportadoras a través de microtúbulos de los complejos de señalización MLK–MKK7–

JNK1/2, regulando espacialmente la localización y actividad de JNK. Así se ha descrito la

localización de éste módulo en los conos de crecimiento de neuronas en desarrollo y en las

sinapsis de neuronas maduras en condiciones normales, sin embargo, bajo condiciones de estrés,

JIP1 cambia de localización y pasa a encontrarse en la zona perinuclear celular [37, 83, 160,

166, 180-182].

39

Introducción

También interaccionan a través del dominio PTB con p190RhoGEF [183], con el precursor de

la proteína β-amielóide (βAPP) [184-187] y con miembros de la familia de receptores de

lipoproteínas de baja densidad ApoER2, LRP y megalina, cuyas variantes alélicas están

relacionadas con un mayor riesgo de padecer Alzheimer [188]. JIP2, y también JIP1 aunque de

forma más débil, se unen al factor intercambiador de Rac Tiam1 y Ras-GRF1 [179]. Además

JIP2, pero no JIP1, se asocia con la familia de proteínas homólogas al factor de crecimiento de

fibroblastos (FHF) [177, 178].

Estos módulos de señalización son dinámicos de forma que los miembros que los componen se

regulan entre ellos, principalmente mediante interacciones y reacciones de fosforilación. Se ha

propuesto un modelo según el cual JIP1 regula la actividad de DLK previniendo su

dimerización y activación uniéndose a monómeros de la quinasa en estado inactivo. Pero

aquellos estímulos que promueven la interacción de JNK y JIP1, por tanto la fosforilación de

JIP1 en treonina 103 y 205 por JNK, causan la liberación de DLK del complejo y permiten la

dimerización y activación de ésta. No obstante, JIP1 presenta fosforilación in vivo en residuos

que no son fosforilados por JNK, y por tanto otras quinasas del complejo o ajenas a este pueden

fosforilar JIP1 y cambiar su afinidad por las MAPKs [189, 190]. La unión de Akt a JIP1

promueve la activación de Akt y reprime la señalización de JNK en neuronas debido a la

inhibición de la interacción entre JIP1 y JNK. Sin embargo, la exposición de estas células a

estrés excitotóxico promueve la liberación de Akt de JIP1, aumenta la interacción JIP1-JNK y

por tanto la señalización a través del módulo JIP1-JNK [175, 191, 192]. La interacción de

MKP7 y M3/6 con JIP1 también inhibe la señalización de JNK ya que defosforilan a JNK [86].

Estos datos sugieren que estas proteínas de anclaje sirven para integrar múltiples señales que

regulan la actividad de JNK.

JIP

1

MLK-HPK1

MKK7

JNK

Estímulo,Rac, Cdc42

Jun, ATF2

JIP

2

MLK2,3,DLK

MKK7/MKK3

JNK/p38


Jun, ATF2/ MEF2C

JIP

3

MLK3/MEKK1

MKK7/MKK4

JNK/p38


Jun, ATF2/MEF2CJI

P4

MEKK3

MKK4

JNK/p38


Jun, ATF2/MEF2C Figura 10. Módulos de señalización formados por los distintos miembros de la familia JIP.

Introducción

40

3.3. Interacciones funcionales de JIP3 y JIP4.

JIP3/JSAP1 y JIP4 están relacionadas estructuralmente. Ambas proteínas contienen un dominio

JBD, un dominio de cremallera de leucinas y varios dominios “coiled-coil” y se unen a

componentes de las vías de JNK y p38. También contienen un dominio transmembrana, de

hecho ambas son proteínas asociadas a membranas, aunque no asociadas a mitocondrias al

aparato de Golgi o al retículo endoplásmico [165, 172, 173, 193]. JIP3 se une a JNK1 y 3,

MKK7 y MLK formando un módulo de señalización, pero también se asocia a MEKK1 y

MKK4 [83]. La asociación de JIP3 con MEKK1, así como el receptor de endotoxina TLR4

(Toll-like receptor 4) es esencial para la activación de JNK en respuesta a LPS, sin embargo, no

parece haber una asociación entre JIP3 y TAK1, otra MAP3Ks responsable de la activación de

JNK por LPS [194]. También se ha descrito la interacción de JIP4 con MEKK3, MKK4, JNK y

p38 aunque no con MKK7, MLK, y una isoforma murina de JIP4 interacciona con Max [165,

171, 173, 195]. Al igual que JIP1 y 2, se unen a la cadena ligera de quinesina por su dominio

“coiled-coil” [193], y se localizan, al menos JIP3, en los conos de crecimiento de neuronas

[165]. JIP3 y 4 también forman oligómeros funcionales e interaccionan entre si a través del

dominio “coiled-coil” [165, 166]. JIP3 es fosforilado por JNK en treonina 266, 267 y 288, estos dos últimos están conservados en

JIP4 (corresponden a treonina 97 y 113) y también son fosforilados por JNK junto a treonina 52

y 61[165, 173]. ASK1 fosforila a JIP3 en su extremo C-terminal facilitando la formación y

activación del módulo ASK1-JIP3 en respuesta a estrés oxidativo [165, 196]. JIP4 también es

fosforilado por p38 [173].

3.4. Activación de la vía de JNK.

Mediante ensayos de transfección se ha demostrado que las proteínas JIP potencian la activan de

JNK, posiblemente causada por las MLKs, aunque en un principio se describieron como

inhibidores de esta vía ya que JIP secuestra JNK en el citosol [37, 165, 166, 171, 195]. En

general se ha establecido que las proteínas JIP potencian la activación de JNK, no obstante, la

función fisiológica específica de cada uno de los miembros todavía no es clara.

Se ha descrito que la expresión de JIP1b es alta en células β del páncreas, se trata de una

proteína citosólica y nuclear y parece ser necesario para el funcionamiento normal de éstas,

incluyendo supervivencia y expresión de insulina y transportadores de glucosa de forma directa

o a través de la vía de JNK [37, 166, 170, 180, 197, 198]. JIP1 protege de la inducción de

apoptosis mediada por citoquinas (IL-1β, TNF-α e IFN-γ) en células β del páncreas, al mismo

tiempo la exposición de estas células a estas citoquinas disminuye los niveles de proteína de

JIP1, lo que produce un aumento de la actividad de JNK [199]. Asimismo, en humanos se ha

41

Introducción

descrito una variable alélica del gen Jip1/MAPK8IP1 que podría estar relacionada con la

aparición temprana de diabetes tipo II, e in vitro está asociada a una apoptosis acelerada y una

disminución de la actividad transcripcional dependiente de insulina [200]. JIP1 ha sido

implicado en la respuesta celular a estrés oxidativo [180, 192]. Además, en diferentes tipos

celulares, particularmente en neuronas, JIP1 está relacionado con la regulación de apoptosis

[186, 201, 202]. En todos los casos esta implicación está relacionada con su función en la

formación de complejos que participan en respuestas de estrés.

No obstante, el estudio de modelos genéticos murinos, en el caso de JIP1 es un poco

contradictorio, probablemente debido al uso de cepas con distintos fondos genéticos. Según el

grupo de G. Waeber la deficiencia de JIP1 causa la muerte del embrión en fases muy tempranas

antes de la implantación del blastocisto, aunque no ha sido estudiado el mecanismo por el cual

se produce [198]. Según el grupo de R.J. Davis los ratones no sólo son viables, sino que tienen

una esperanza de vida normal, y no presentan defectos morfológicos causados durante

desarrollo, no tienen defectos en el funcionamiento de las células β del páncreas y no son

diabéticos, ni tienen defectos en el desarrollo del cerebro como los ratones deficientes en

ApoER2 [180], quizás porque exista redundancia de función entre los 4 genes. Sin embargo, sí

presentan deficiencias en la activación de JNK en neuronas del hipocampo expuestas a estrés

excitotóxico o anoxia, pero no a UV o anisomicina [180, 203]. JIP1 es necesario para la

activación de JNK en tejido adiposo en ratones con diabetes tipo II [204].

La eliminación del gen Jip3 es letal. La muerte se debe a un fallo respiratorio después del

nacimiento a causa de defectos morfogenéticos del sistema nervioso [205]. JIP3 parece estar

implicado en la activación de JNK en respuesta a lipopolisacárido mediada por el receptor

TLR4 (Toll-like receptor 4), de hecho, JIP3 interacciona con este receptor [194]. Recientemente

se ha descrito que JIP3 interacciona con JNK, FAK, MEKK1, paxilina regulando migración

celular y que células que no expresan JIP3 son deficientes en la formación de lamelipodia y

protuberancias en la membrana [206]. Además los niveles de ARN mensajero de JIP3 son

elevados en tumores de cerebro, sugiriendo que JIP3 podría participar en la adquisición de

invasividad y malignidad de estos tumores [206].

3.5. Activación de la vía de p38.

En un principio se pensaba que las proteínas de anclaje JIP eran exclusivas de la vía de

señalización de JNK [37], sin embargo, estudios más recientes han demostrado que JIP2 y JIP4

interaccionan con componentes de la vía de p38 [177-179, 195]. Mediante estudios de

transfección se ha demostrado que JIP2 puede activar p38α en respuesta a los factores

Introducción

42

intercambiadores de Rac Tiam1 y Ras-GRF1 [179]. P38δ es activada en respuesta a FHF. JIP4

también activa p38 en ensayos de transfección en respuesta a ASK1 [173].

3.6. Las proteínas de anclaje JIP como moléculas transportadoras.

Una característica muy conservada de estas proteínas es la interacción con la cadena ligera de la

proteína motora quinesina [180, 181, 193], la cual transporta a cada una de las proteínas JIP a

través de los microtúbulos [207]. Esta interacción explica la acumulación de JIP en los conos de

crecimiento de neurona en desarrollo [166, 180, 181, 183]. En neuronas maduras se ha descrito

que JIP1 y JIP2 se acumulan en las sinapsis, mientras que JIP3 se localiza principalmente en

estructuras vesiculares perinucleares [169, 182, 193].

JIP podría actuar como molécula adaptadora para el transporte a través de los microtúbulos de

proteínas con las que interacciona como el precursor de la proteína β-amielóide (βAPP) o

miembros de la familia de receptores de lipoproteínas de baja densidad [184-188], MAPKs de la

vía de JNK o p38, regulando la activación de los mismos como respuesta a estímulos

específicos de forma local y por tanto contribuyendo a una regulación espacial de estas vías de

señalización in vivo. De hecho, en los ratones Jip1-/-, la distribución de los módulos de

señalización de JNK está desorganizada en neuronas del hipocampo [180] y esta es la función

del ortólogo de JIP3 en C. elegans y D. melanogaster [193, 208].

Por tanto, además de ensamblar y estabilizar complejos proteicos, las proteínas de anclaje

pueden funcionar como el vínculo entre proteínas motoras y el tráfico de membrana,

permitiendo localizar no sólo proteínas de membrana sino también módulos de señalización

citoplasmáticos en los dominios celulares adecuados proporcionado así un mecanismo de

regulación espacial apropiada y más ventajosa para las células.

4. EL FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN P53.

p53 ha sido descrito como “el guardián del genoma” por su papel en la prevención de la

acumulación de alteraciones genéticas. Tarea que realiza mediante la inducción de la parada del

crecimiento celular o senescencia para evitar la replicación del ADN dañado. Aunque su papel

como supresor de tumores depende de su actividad pro-apoptótica. p53 es un supresor de

tumores esencial ya que se encuentra mutado en el 50% de los cánceres humanos [209, 210].

Además, se estima que la vía de señalización de p53 está alterada en el 80% de todos los

cánceres [211]. Los individuos con síndrome de Li-Fraumeni, los cuales heredan el gen TP53

mutado, poseen un 50% de posibilidades de desarrollar cáncer antes de los 30 años, y la gran

mayoría lo padece en edades más avanzadas [212].

43

Introducción

Existen dos genes que codifican proteínas estructuralmente relacionadas con p53, TP73 y TP63,

los cuales a su vez estos genes generan varias isoformas. Ambos actúan también como factores

de transcripción y formas dominantes negativas se encuentran abundantemente en tumores,

aunque su papel como supresores de tumores es discutido [213, 214]. También han sido

descritas varias isoformas de p53, aunque su función no ha sido investigada en detalle y los

datos obtenidos hasta ahora resultan un tanto contradictorios [214].

4.1. Estructura de p53.

El gen TP53 codifica para una fosfoproteína nuclear de 53 kilodaltons de peso molecular y 393

aminoácidos cuya actividad principal es la transactivación o transrepresión de genes a través de

su unión a secuencias consenso específicas [215, 216].

La proteína está compuesta por varios dominios conservados evolutivamente denominados cajas

I-V, y cuatro dominios funcionales principales. La región N-terminal contiene el dominio de

transactivación (residuos 1-50) encargado de interaccionar con la maquinaria basal de

transcripción. Éste puede sufrir modificaciones postraduccionales y además interacciona con

proteínas reguladoras y co-activadoras de la transcripción como Mdm2, p300, TFIID, TBP o

TAF40 [214]. A continuación se encuentra una región rica en prolinas (aminoácidos 64-97) la

cual se une a proteínas con dominios SH3. La región central (aminoácidos 100-293) contiene el

motivo de unión a ADN [215]. Es la región más conservada evolutivamente entre especies y en

ella se encuentran en torno al 95% de las mutaciones de p53 en cáncer [217]. El dominio C-

terminal contiene una región flexible de unión a la parte central de la molécula (aa 300-325) y

un dominio de oligomerización (325-355), responsable de la formación de los tetrámeros de p53

necesarios para la unión al ADN [218]. Por último en la parte final de la proteína se encuentra

un dominio formado por residuos básicos (aa 363-393) con función reguladora menos clara pero

susceptible de varias modificaciones postraduccionales como ubiquitinación, sumoilación y

acetilación. p53 interacciona a través de la región carboxilo terminal con proteínas como 14-3-3

o el co-activador TBP [219]. Además este dominio posee la propiedad de unión al ADN de

forma inespecífica, la cual se une a ADN dañado y parece estar implicada en la reparación de

ADN dañado dependiente de p53 y en el anillamiento del ADN y ARN [2].

4.2. Naturaleza de las señales de estrés que activan p53.

Muchas señales de estrés, tanto extrínsecas como intrínsecas para la célula, pueden activar p53,

entre ellas se encuentran aquellas que producen daño en el ADN como radiación γ o UV,

alquilación de las bases de ADN o reacción con radicales libres de oxígeno. p53 es activada

principalmente mediante modificaciones postraduccionales como fosforilación, acetilación,

metilación, ubiquitinación, sumoilación, ribosilación y glicosilación. Diferentes tipos de estrés

Introducción

44

activan diferentes enzimas que modifican diferentes residuos de p53, de forma que según la

naturaleza de la señal de activación se reflejará en una combinación determinada de

modificaciones de p53 y por tanto en una respuesta diferente [220]. También se han encontrado

diferencias sustanciales en el patrón y estado de fosforilación de p53 en tumores y líneas

tumorales frente a las células no transformadas [221]. Niveles muy bajos de ribonucleótidos

trifosfato o de ribosomas producen una parada del ciclo celular, la hipoxia produce parada del

ciclo, apoptosis o senescencia. En general el daño al ADN, la activación de oncogenes, la

hipoxia, el acortamiento de los telómeros, la depleción de ribonucleótidos, el choque osmótico o

térmico, drogas que desorganizan el citoesqueleto e incluso la inflamación de tejidos activan

p53 [222].

4.2.1. Regulación de la estabilidad de p53.

Puesto que p53 es un inhibidor de crecimiento celular muy eficiente, su actividad debe ser

regulada de forma muy estricta para permitir el crecimiento y desarrollo normal celular,

mientras retiene la capacidad de ser inducida rápidamente en respuesta a estrés. Por

consiguiente existen muchos mecanismos por los cuales p53 es regulada, el control de la

transcripción y de la traducción de los mensajeros de ésta han sido descritas, sin embargo,

parece evidente que los mecanismos principales por los cuales la función de p53 es regulada son

modificaciones postraduccionales e interacciones con proteínas reguladoras que p53 de manera

rápida y transitoria, que dan lugar a la estabilización de la proteína y su acumulación en el

núcleo, la activación de su capacidad de unión a secuencias específicas de ADN, y la activación

de su dominio de transactivación que le permite interaccionar con la maquinaria basal de

transcripción [220, 223].

En condiciones normales p53 se expresa de forma constitutiva pero se encuentra en muy bajos

niveles dentro de la célula debido a su rápida degradación [224]. Uno de los componentes claves

que regula la estabilidad de p53 es Mdm2 (Mouse double minute 2, Hdm2 en humanos), el

principal regulador negativo de p53 que funciona como una enzima E3 ubiquitina ligasa. Mdm2

interacciona con p53 a través de su extremo N-terminal y la marca mediante poliubiquitinación

en varias lisinas de su extremo C-terminal, y posteriormente es reconocida y degradada por el

proteosoma [225]. Además, la interacción de Mdm2 con p53 inhibe la actividad transcripcional

de ésta, ya que previene su interacción con la maquinaria transcripcional [226], inhibe la

acetilación mediada por p300 [227, 228] mientras que promueve su deacetilación al

interaccionar con la deacetilasa HDAC1 [229], y mediante la inducción de la salida del núcleo y

posterior degradación [230, 231]. p53 posee varias señales de localización nuclear en el extremo

carboxilo terminal que contribuyen a su localización en el núcleo y dos señales de exportación

nuclear, una en el extremo carboxilo terminal y otra en la región de unión a Mdm2 [232]. La

45

Introducción

actividad ubiquitina ligasa de Mdm2 podría estar implicada en la translocación de p53 al

citoplasma, aunque no es totalmente necesaria [233]. La translocación de p53 contribuye a su

degradación por el proteosoma en el citosol [234, 235], aunque se ha descrito que la

degradación también puede ocurrir en el núcleo [236-238]. La sobre-expresión de Mdm2 por

tanto tiene consecuencias negativas para la célula en condiciones de estrés. De hecho se ha

observado la amplificación del gen MDM2 en 30-40% de sarcomas, así como la sobre-expresión

de la proteína en distintos tipos tumorales [239-241].

La región de interacción de p53 con Mdm2 comprende los residuos 1 al 41[242], entre los que

se encuentran varias serinas y treoninas susceptibles de fosforilación, mecanismo que promueve

la interrupción de la interacción entre p53 y Mdm2, impidiendo así su degradación y

permitiendo su acción transactivadora [243, 244]. Mediante estudios estructurales se ha

observado que la región mínima de interacción se encuentra entre los aminoácidos 18 al 23

[245]. Los residuos 18 al 26 forman una α-hélice anfipática, en la cara hidrofóbica los

aminoácidos más relevantes son Phe19, Trp23 y Leu26, los cuales encajan en una hendidura

hidrofóbica que forman los residuos 19 al 102 de Mdm2 [242]. En la cara hidrofílica los

residuos Thr18 y Asp21 están unidos por puentes de hidrógeno y esto permite la estabilización

de la α-hélice, de tal forma que la modificación o mutación de cualquiera de estos residuos

produce su desestabilización y por tanto impide la interacción de p53 con Mdm2 [246].

Además de la poliubiquitinación dependiente de Mdm2 existen otros mecanismos relacionados

que regulan la actividad y localización de p53. Por ejemplo, Mdm2 parece estar implicado en la

monoubiquitinación de p53, la cual modula la localización y actividad de p53 dirigiéndola hacia

el citoplasma [247, 248]. Recientemente ha sido descrita la actividad ubiquitina ligasa del co-

activador p300, el cual parece tener actividad E4 ubiquitina ligasa poliubiquitinando a p53

monoubiquitinada previamente por Mdm2, y junto con Mdm2 promueven su degradación.

Figura 11. Interacción de p53 y Mdm2. Representación esquemática de la α-hélice de p53 (verde) que interacciona con el bolsillo hidrofóbico de Mdm2 (morado). Se muestran los residuos treonina 18 y aspártico 21 unidos por puentes de hidrógeno y que son esenciales para la estabilización de la α-hélice. Adaptado [1].

Introducción

46

Recientemente se ha descrito que Mdm2 media la conjugación de p53 con NEDD8, una

molécula de la familia de la ubiquitina, inhibiendo su actividad transcripcional [249].

Existen múltiples mecanismos que activan p53 mediante la modulación del efecto inhibidor de

Mdm2. Estos incluyen la regulación negativa de la expresión de Mdm2, la inhibición de la

interacción y la inhibición de la degradación de p53. Por ejemplo, el daño en el ADN además de

las modificaciones postraduccionales en p53, también inducen modificaciones en Mdm2, como

la fosforilación de éste por ATM y otras quinasas, las cuales interrumpen la interacción p53-

Mdm2 [220, 250, 251] o la acetilación dependiente de CBP que inhibe su actividad ubiquitina

ligasa [252]. Mdm2 puede regular su propia estabilidad mediante una actividad de

autoubiquitinación, marcándose a sí mismo para ser degradado por el proteosoma [253, 254].

Además, Mdm2 es a su vez una diana transcripcional de p53, de forma que la activación de p53

induce la expresión de su propio regulador negativo asegurando así una activación transitoria de

p53 y estableciéndose un bucle autoregulatorio entre p53 y Mdm2 [255-257]. La activación de

oncogenes como c-Myc o Ras, así como respuestas mitogénicas inapropiadas, previenen la

degradación de p53 mediada por Mdm2 mediante la expresión de la proteína oncogénica

p14ARF, el cual secuestra a Mdm2 en el nucleolo o en cuerpos nucleares en el nucleoplasma,

impidiendo su acción sobre p53 [258, 259]. Existen otras proteínas que compiten con Mdm2 en

la unión con p53, entre ellas se encuentran el co-activador TAFII31, HIF1α, Rb o el supresor de

tumores ING1b [244, 260]. El gen supresores TSG101 y c-Abl también tienen un efecto

negativo sobre la ubiquitinación de p53 [261, 262]. La poli-ADP-ribosa polimerasa PARP

interacciona con p53 y está implicada en la estabilización de p53 en respuesta a daño en el ADN

[263]. p53 también puede ser activada mediante la eliminación de ubiquitinas con proteasas

específicas de ubiquitina como la proteína HAUSP de herpes virus, una antagonista directa de

Mdm2 que actúa quitando ubiquitinas de p53 tras activación por daño al ADN [264]. El

homólogo de Mdm2, Mdm4 (o MdmX) promueve la estabilización de p53 mediante la

degradación o la supresión de la función de Mdm2 [265, 266].

Existen otros mecanismos reguladores de la estabilidad de p53 independientes de Mdm2. Entre

los que se incluyen ubiquitinación por la proteína E6 del virus del papiloma humano [267],

degradación directa por JNK en células no estresadas [100], la interacción con el co-represor

mSin3a que la protege de la degradación por el proteosoma [268], degradación por la proteasa

calpaína en algunos sistemas [269] interacción con β-catenina que la protege de degradación

[270]. Recientemente se han descrito otras enzimas que también interaccionan y funcionan

como E3 ubiquitina ligasas induciendo su degradación de forma independiente a Mdm2, es el

caso del complejo de señalización COP1 [271], Pirh2 [272] y topors [273]. COP1 y Pirh2 a su

vez son genes diana de p53 estableciéndose un bucle regulador negativo similar al de Mdm2.

47

Introducción

4.2.2. Modificaciones postraduccionales en p53. Regulación de la estabilidad y actividad

transcripcional de p53.

Las modificaciones postraduccionales o la interacción con proteínas reguladoras de p53 juegan

un papel esencial tanto en la estabilización, localización y aumento de la capacidad de unión a

ADN así como aumento de la interacción con la maquinaria transcripcional [220].

Las modificaciones en el extremo C-terminal pueden incrementar su actividad transcripcional,

es el caso de la sumoilación por Ubc9 en el residuo Lys 386 en respuesta a daño en el ADN

[220, 274], la glicosilación, que aumenta la unión a ADN [275] o la ribosilación por la poli

ADP-ribosa polimerasa PARP en la región central y dominio carboxilo terminal en respuesta a

radiación ionizante que aumentando su estabilidad [276, 277]. La acetilación en respuesta a

daño en el ADN en las lisinas 373 y 382 por el co-activador p300/CBP y en lisina 320 por

PCAF, los cuales a su vez son residuos clave para la ubiquitinación de p53, incrementando la

unión a secuencias específicas de ADN de ésta [278-280]. Además, se ha descrito que p300

interacciona por el extremo N-terminal de p53 compitiendo con Mdm2 [228, 281], de tal forma

que las modificaciones postraduccionales que tengan lugar en este dominio, como la

fosforilación impiden la unión de Mdm2 y promueven la interacción de p300, aumentando la

estabilidad y actividad transcripcional de p53 [282, 283]. Estos residuos a su vez son

susceptibles de deacetilación por deacetilasas como Sir2α/SIRT1 [284].

Muchos procesos biológicos son regulados mediante fosforilación reversible y efectivamente la

fosforilación juega un importante papel en la regulación de la estabilidad y actividad de p53 y

permite una rápida respuesta tras exposición a distintos tipos de estrés [220]. Hasta el momento

se ha descrito que p53 es fosforilado en el dominio N-terminal en 7 serinas y 3 treoninas,

concretamente en las serinas 6, 9, 15, 20, 33, 37 y 46 y las treoninas 18, 55 y 81. En la región C-

terminal en las serinas 315, 371, 376, 378 y 392. La proteína murina se fosforila además en

otros sitios adicionales como las treoninas 73 y 83 por MAPK [285]. Estos residuos a su vez son

susceptibles de defosforilación por fosfatasas específicas para volver al estado inicial latente de

p53 y asegurar que la activación sea transitoria. Se conoce la existencia de algunas de ellas,

como por ejemplo la fosfatasa Wip1 [286] o Cdc14 [287, 288].

Son varias las quinasas que respondiendo a distintos estímulos modifican diferentes residuos de

p53. Por ejemplo, la quinasa activada por quinasa dependiente de ciclina CAK fosforila la serina

33 al menos in vitro, el cual es fosforilado tempranamente en respuesta a radiación ionizante y

UV [278, 289]. La serinas 37 y 46 son fosforiladas preferentemente tras radiación UV. ATR ha

sido implicada en la fosforilación de las serinas 37 y 15 en respuesta a radiación UV [290]. Las

MAPKs JNK, p38 y ERK fosforilan y activan p53 como respuesta a diversos tipos de estrés.

Introducción

48

ERK fosforila p53 murina en los residuos treonina 73 y 83 [291]. JNK fosforila treonina 81 en

respuesta a distintos tipos de estrés promoviendo parada del ciclo celular en G1 [98, 292]. En

células epidérmicas de ratón p38 fosforila p53 en serina 15 y 20 como respuesta a radiación

UVB [96, 293]. En neuronas la fosforilación en serina 15 por p38 como respuesta hipoxia

induce muerte [294]. p38 fosforila serina 46 y 33 estando implicada en la inducción de

apoptosis por UV [295]. El residuo 46 también es diana de fosforilación de las quinasas HIPK2

(homeodomain-interacting protein kinase 2) en respuesta a radiación UV, sin embargo en

respuesta a radiación ionizante ATM y la proteína inducible por p53 p53DINP1 (p53-regulated

apoptosis-inducing protein 1) están implicadas en la fosforilación de este residuo aunque de

forma indirecta [296, 297]. El residuo 55 es fosforilado por TAFII250, la subunidad mayor de

TFIID, aumentando la degradación de p53, y es defosforilado en respuesta a radiación UV

[298]. Las serinas 6, 9 y 15 son fosforiladas tempranamente tras radiación ionizante, y más

lentamente tras radiación UV [299-302]. Serina 9 y 18 son fosforiladas por CKIδ previa

fosforilación de serina 6 y 15 respectivamente [302, 303].

La interrupción de la interacción entre p53 y Mdm2 es esencial en la estabilización de p53. Por

tanto, las modificaciones postraduccionales en las regiones de p53 y Mdm2 responsables de esta

interacción tienen un importante papel en su regulación. Son varios los residuos fosforilados en

esa zona en respuesta a estrés. La fosforilación en serina 15 se induce de manera muy rápida y

S6S9 S15T18S20 S33S37 S46 T81 S315 S371S376S378 S392

Dominio de transactivaciónRegión rica en prolinasDominio de unión a ADNRegión de oligomerización

Señal de exportación nuclearSeñal de localización nuclear

Fosforilación

Acetilación

Sumoilación

CKI

ATM ATRCAK

p38

JNK CDK2 PKCCKII

Chk2

Chk1

p300

PCAF

K320 K373K382 K386

Ubc9

T55

HIPK2

?

TAFII250

VRK1

Figura 12. Representación esquemática de la estructura y modificaciones postraduccionales de p53. Se indican los residuos que sufren modificaciones postraduccionales (acetilación, fosforilación y sumoilación) y las proteínas responsables.

49

Introducción

transitoria en respuesta a radiación ionizante y de una manera más lenta y prolongada tras

tratamiento con radiación ultravioleta, cisplatino o DFO (que mimetiza hipoxia), pero no con

actinomicina D [304]. Tanto la quinasa ATM como ATR han sido implicadas en esta

fosforilación en respuesta respectivamente a radiación ionizante o UV. Sin embargo, la

modificación de este residuo no es suficiente para promover esta disociación [303]. Los

residuos candidatos dentro de la región mínima de interacción entre p53 y Mdm2 (aminoácidos

18-23) son la treonina 18 y la serina 20.

La fosforilación de p53 en serina 20 es importante en la regulación negativa de p53 por Mdm2

[305-307], sin embargo no parece promover la disociación de p53 y Mdm2 [301, 308]. Serina

20 es fosforilada en respuesta a daño al ADN por Chk2 y Chk1, las cuales son fosforiladas y

activadas por ATM en respuesta a radiación ionizante y ATR en respuesta a radiación UV

respectivamente [309, 310]. Por otra lado la fosforilación de este residuo induce la unión entre

p53 y el co-activador p300, promoviendo la acetilación del extremo carboxilo terminal de p53 y

su actividad transcripcional [283]

Según datos estructurales la treonina 18 es el único residuo que podría estar implicado

directamente en el mantenimiento de la interacción entre p53 y Mdm2 [246, 301, 311, 312].

Además se ha descrito que su fosforilación estabiliza la unión entre p300 y p53 [283]. Este

residuo está fosforilado en respuesta a daño al ADN o taxol, en células de cáncer de mama que

expresan p53 silvestre y en células que sufren senescencia replicativa [308, 313-315]. Pero la

quinasa responsable de esa fosforilación no está del todo caracterizada. Una posible candidata es

CKIδ ya que fosforila treonina 18 aunque necesita la fosforilación previa del residuo serina 15

[301, 303], propiedad enzimática propia de las caseína quinasas [316]. También se ha descrito

su fosforilación por las quinasa Chk2 y VRK1 [6, 317]. No obstante, y aunque la fosforilación

en treonina 18 y serina 20 pueden dificultar la asociación de Mdm2 con p53 in vitro, la sobre-

expresión de mutantes de p53 en estos residuos son susceptibles de estabilización en respuesta a

estrés en células transfectadas [304, 318].

La fosforilación en el dominio C-terminal por CKII en serina 392 y Cdc2 en serina 315

estimulan la unión al ADN [220, 285, 319, 320]. La fosforilación de la serina 378 por PKC

estimula la degradación de p53 en células no estresadas y el residuo serina 376 fosforilado por

la PKC es defosforilado en respuesta a radiación ionizante [287, 321]. Los 30 últimos residuos

del extremo C-terminal de p53 regulan negativamente la unión de ésta por el dominio central a

secuencias específicas de ADN [223]. El extremo C-terminal incluye una región básica a

continuación de la región de tetramerización donde se encuentran los sitios de fosforilación por

PKC (serinas 371, 376 y 378), los sitios de acetilación por p300 (lisinas 373 y 382) y el sitio de

Introducción

50

sumoilación (lisina 386). Las modificaciones postraduccionales en esta región, como la pérdida

relativa de cargas básicas mediante acetilación, sumoilación o fosforilación, de forma directa o

indirecta, pueden promover cambios conformacionales que previenen la interacción del dominio

C-terminal con el domino central de unión a ADN.

En general para la activación de una repuesta completa de p53 se requieren la integración de

varias señales que conducen a diversas modificaciones en la proteína. Se ha postulado que el

perfil de fosforilación y otras modificaciones podría ser un mecanismo para añadir selectividad

a la respuesta mediada por p53 [260]. Diversos tipos de estrés activan distintas vías de

señalización que pueden cooperar para conseguir una máxima y específica activación de p53.

4.3. Función biológica de p53.

Una vez activada p53 actúa principalmente como factor de transcripción regulando la expresión

de genes implicados en reparación de ADN, mantenimiento de la integridad genómica,

promoviendo la parada del ciclo celular, apoptosis, senescencia y diferenciación [2, 322]. Este

programa de transcripción reflejará la naturaleza de la señal de activación evitando la

acumulación de daños en el ADN y la proliferación y crecimiento de las células con el genoma

alterado por mutaciones, de hecho la mutación de p53 se correlaciona con amplificación génica,

deleciones y aneuploidía [323]. Durante el desarrollo tumoral se producen muchos de estas

señales, de modo que se provoca una activación de p53 cuyo efecto final será, generalmente, la

inhibición del crecimiento celular o la entrada de las células en apoptosis, impidiéndose de ese

modo la progresión tumoral.

4.3.1. p53 y la parada de ciclo celular.

p53 está implicado en la regulación de prácticamente todos los “checkpoints” conocidos que

previenen la replicación del ADN y la mitosis en las células con su genoma dañado, o cuando

las condiciones no son favorables [222]. El mecanismo mediante el cual se produce esta parada

de ciclo en respuesta a daño al ADN depende también del inductor específico del daño [324].

4.3.1.a. Parada del ciclo celular en G1.

El principal mediador de la parada del ciclo celular en G1 mediada por p53 es p21WAF1/Cip1

[325]. p21 es un inhibidor de los complejos ciclina A-E/CDK2, los cuales fosforilan a la

proteína Rb, el cual en estado hipofosforilado secuestra e inhibe la actividad transcripcional del

factor de transcripción E2F, y por tanto reprimiendo la expresión de genes requeridos para la

transición a fase S del ciclo celular [326]. De esta forma, la activación de p53 en respuesta a

daño en el ADN induce una parada del ciclo en fase G1, normalmente transitoria, permitiendo la

reparación del daño antes de la progresión a fase S.

51

Introducción

La activación de p53 mediante la expresión de proteínas oncogénicas (E2F-1, β-catenina, Myc,

Ras o la proteína adenoviral E1A) es mediada en parte por un mecanismo autoregulatorio que

resulta en el incremento de los niveles de p16INK4a y p19ARF (p14ARF en humanos) [327-331], que

a su vez inhiben Mdm2, resultando en un incremento de los niveles de p53. De esta forma,

mediante la activación de los supresores de tumores p53 y Rb se promueve la parada del ciclo

celular [259].

4.3.1.b. Parada del ciclo celular en G2.

La parada de ciclo celular en la transición G2/M inducida por p53 es mediada por la síntesis de

varios genes diana de p53 como 14-3-3σ [332, 333], GADD45 [334] y p21WAF1/Cip1 [335] y la

represión de la expresión de ciclina B1 y Cdc2 [336, 337], que en definitiva inhiben complejos

ciclina-CDK. Por ejemplo, 14-3-3σ se une a la fosfatasa Cdc25C y la secuestra en el citosol,

p300

DAÑO EN EL ADN

EROSIÓN DE TELÓMEROS

HIPOXIA/ANOXIA

DROGAS QUE DESORGANIZAN EL CITOESQUELETO

DEPLECIÓN DE RIBONUCLEÓTIDOS

PÉRDIDA DE SEÑALES DE

SUPERVIVENCIA

OCOGENES ACTIVADOS

DAÑO EN EL ADN

EROSIÓN DE TELÓMEROS

HIPOXIA/ANOXIA

DROGAS QUE DESORGANIZAN EL CITOESQUELETO

DEPLECIÓN DE RIBONUCLEÓTIDOS

PÉRDIDA DE SEÑALES DE

SUPERVIVENCIA

OCOGENES ACTIVADOS

Modificadoresespecíficos de

tejido y tipocelular

p53MDM2

UbUbUb

p53

PP

Ac

p53p53p53p53

MDM2

p300

GENES DIANA

APAF1 BAX FAS

NOXA p53DINP1 p53AIP1

PERP PIG3 PTEN PUMA PIDD WIP1

KILLER/DR5

APOPTOSIS Y SUPERVIVENCIA

14-3-3σGADD45 CDKN1A

p53R2

PARADA DE CICLO CELULAR Y

REPARACIÓN DE ADN

TSP1 MMP2

MASPIN KAI1 BAI1

GD-AIF

ANGIOGÉNESIS INVASIÓN

MDM2 TP73

CCNG1 COP1 PirH2 MdmX

AUTOREGULACIÓN

Figura 13. Respuesta celular de p53. p53 media la respuesta a diversas señales de estrés, mediante latranscripción de diversos genes diana que desencadenarán en cada caso una respuesta celular específica. Se muestran algunos de los genes relacionados con las respuestas de p53 mejor establecidos según [2].

Introducción

52

evitando que ésta active los complejos ciclina B1/Cdc2 mediante su defosforilación en el

núcleo, los cuales son necesarios para la transición del ciclo G2/M [338, 339]. 14-3-3σ además

regula la localización de los complejos ciclina B1/Cdc2 secuestrando Cdc2 en el citosol [332].

p53 también está implicado en otros “checkpoints”, uno mitótico que previene la

endoreplicación y otro que previene la reentrada en fase S para prevenir poliploidía [340-342] y

otro premeiótico [343].

4.3.2. p53 y apoptosis.

4.3.2.a. Vía intrínseca.

p53 promueve la muerte celular por apoptosis de las células sometidas a un estrés severo

mediante mecanismos dependientes e independientes de la función transactivadora de la

expresión génica [344]. En la denominada vía intrínseca o mitocondrial de apoptosis, la cual se

activa en respuesta a daño en el ADN, ciclo celular defectuoso, hipoxia, pérdida de factores de

crecimiento entre otros tipos de estrés severo, muchos de los genes que activan la liberación de

citocromo C, SMAC/Diablo y el factor inductor de apoptosis AIF de la mitocondria son

regulados positivamente por p53 y se activan normalmente de una forma específica de tejido

(proteínas pro-apoptóticas como Bax, Noxa, PUMA) [345-348]. El citocromo C una vez

liberado al citosol interacciona con el factor activador de proteasas activadoras de la apoptosis

APAF-1 [349], el cual también está regulado por p53, iniciándose una cascada de proteolisis por

proteínas caspasas desde la caspasa iniciadora (caspasa 9) a las ejecutoras (caspasas 3, 6 y 7),

por otro lado SMAC/Diablo interacciona e inhibe a las proteínas inhibidoras de apoptosis IAPs,

y en conjunto desencadenan todo un proceso de fragmentación del ADN y desorganización

celular que en último término lleva a la muerte de la célula afectada sin afectar a las que la

rodean [350]. Además, p53 reprime la expresión de proteínas anti-apoptóticas como Bcl2,

MAP4 y survivina [351-354], así como la actividad de Bcl2 mediante la expresión de Cdc42,

una proteína quinasa que lo fosforila inhibiéndolo [355].

Otra ruta alternativa mediante la cual p53 induce apoptosis a través de la mitocondria es la

activación de la expresión de genes implicados en la elevación de los niveles de especies

reactivas de oxígeno como PIG3, una enzima oxidorreductasa que genera especies reactivas de

oxígeno [356], aunque su expresión no es suficiente para iniciar apoptosis [357].

4.3.2.b. Vía extrínseca.

Por otro lado se encuentra la vía extrínseca, la cual no es suficiente para producir apoptosis pero

promueve la sensibilización de las células frente a las señales de muerte mediante de la

inducción de la expresión de receptores de muerte específicos de forma independiente de la vía

53

Introducción

mitocondrial o intrínseca [348, 358]. Entre estos genes se encuentran el receptor de muerte

Fas/Apo-1/CD95 con importantes implicaciones en la respuesta inmunológica [359], o el

receptor KILLER/DR5 [360]. p53 también induce la expresión de la proteína 3 de interacción

del factor de crecimiento IGF1 (IGF1-BP3) y reprime la expresión del receptor IGFR1,

bloqueando señales de supervivencia [361].

4.3.2.c. Vía independiente de la actividad transcripcional.

Por otro lado también se han descrito mecanismos por los cuales p53 activa la apoptosis de

forma independiente de su actividad transcripcional, mediante la interacción con proteínas

cruciales para activar la vía apoptótica, sugiriendo la existencia de dominios funcionales

implicados directamente en inducción de apoptosis como la región rica en residuos de prolina

entre los aminoácidos 60-97 [362]. Se ha observado la translocación de p53 a la mitocondria

tras hipoxia o daño en el ADN, donde interacciona e inhibe a las proteínas anti-apoptóticas Bcl2

o BclXL, e interacciona con Bax [363] [364], con la consiguiente liberación de citocromo C

[365]. También se ha descrito la interacción y translocación de la membrana al citosol del

receptor Fas mediada por p53 [366].

4.3.3. La elección entre parada del ciclo o apoptosis.

La elección entre sufrir parada de ciclo celular, entrar en un proceso de senescencia o apoptosis

dependerá del tipo celular, la eficiencia de los mecanismos de reparación del ADN, la

composición oncogénica de la célula, el tipo y la intensidad de los estímulos extracelulares, los

factores de supervivencia y crecimiento presentes o los niveles de expresión de p53 y de las

interacciones de las proteínas reguladoras de su actividad [222, 367]. Por ejemplo, el daño en el

ADN induce apoptosis en las células T, mientras que los fibroblastos responden mediante

parada del ciclo celular [368]. La interacción de p53 con proteínas reguladoras promueven la

función transactivadora de p53 dirigiendo específicamente hacia la transactivación de

determinados genes, así la interacción con las proteínas inductoras de apoptosis de p53 ASPP1 y

2 dirigen la expresión de genes pro-apoptóticos como Bax y PIG3 [369], JMY coopera con

p300 en la inducción de la expresión de Bax promoviendo apoptosis, los miembros de la familia

de p53, p63 y p73, también parecen ser necesarios para la inducción de apoptosis, el receptor de

la hormona tiroidea β1 inhibe la expresión de Bax y GADD45 o WT1 que también reprime la

vía apoptótica [367]. El factor de transcripción NFκB también influye la respuesta apoptótica de

p53 de forma positiva y negativa. NFκB muestra actividad anti-apoptótica en muchos sistemas,

en concreto en la inhibición de muerte celular inducida por la activación de receptores de

muerte por ligandos como TNFα [370]. NFκB inhibe p53 compitiendo por co-activadores como

p300 [371], sin embargo, otros estudios muestran la cooperación de NFκB y p53 en la inducción

de muerte celular [372].

Introducción

54

4.3.4. Otras funciones de p53.

p53 también está implicado en la inducción de senescencia celular o parada irreversible del ciclo

celular en G1 que ocurre en las células primarias en cultivo. Aunque todavía se sabe poco

acerca del programa genético inducido por p53, este fenómeno parece estar inducido por un

acortamiento cromosómico que a su vez activa la quinasa ATM [314, 373-375].

También, p53 juega un papel directo en el mantenimiento de la estabilidad genética,

participando directamente en los mecanismos de reparación del ADN [376], y en la inhibición

de la angiogénesis y metástasis [377, 378].

OBJETIVOS

57

Objetivos

Clonar la quinasa humana VRK2, e identificar otras isoformas

generadas por un procesamiento alternativo del ARN mensajero.

Caracterizar funcionalmente las quinasas VRK2A y VRK2B.

Establecer y caracterizar la modulación del supresor de tumores

p53 por VRK2B y la relación de esta modulación con VRK1.

Averiguar qué papel juegan VRK2A y VRK2B en la modulación

de la vía de JNK, y en concreto en la regulación de la proteína de

anclaje JIP1.

RESULTADOS

61

Resultados

1. CARACTERÍSTICAS DE VRK2 ENDÓGENA.

1.1. Localización y expresión de la quinasa VRK2.

Puesto que las proteínas de la familia VRK (Vaccinia-related kinases), en concreto VRK1 y

VRK2, fueron identificadas por Nezu y colaboradores y describieron que se expresaban de

forma ubicua en todos los tejidos analizados en su estudio, así como en diversas líneas celulares

tumorales y fueron involucradas en procesos de control del crecimiento y proliferación celular

[7]. Nosotros quisimos analizar el papel de VRK2 en la célula, para lo cual se comenzó

analizando la expresión y localización de VRK2.

Previamente se clonó el ADN codificante de VRK2 humana y se generaron anticuerpos

policlonales frente a la proteína de fusión GST-VRK2. Para determinar la localización

subcelular de las proteínas endógenas realizamos una inmunofluorescencia con los anticuerpos

policlonales generados en un panel de líneas celulares que iban a ser usadas posteriormente, de

las cuales A549 deriva de un adenocarcinoma de pulmón, MCF7 de un adenocarcinoma de

mama, WS1 son fibroblastos normales de piel y Cos1 es una línea tumoral de mono (Fig. 14).

En todas las líneas VRK2 se localizaba tanto en el núcleo excluida del nucleolo como en el

citosol, donde parecía tener una distribución particulada, lo que sugería que podría estar

asociada a algún orgánulo o formando algún tipo de agregado.

VRK2

Mez

cla

DAP

I

Cos1MCF7 WS1A549

Figura 14. Localización de VRK2 endógena en distintas líneas celulares. Localización específica de VRK2 determinada en distintas líneas celulares mediante inmunofluorescencia con un anticuerpo policlonal específico anti-VRK2 (Cy3 en rojo) y el núcleo marcado con DAPI (azul). La barra indica 50µm.

62

Resultados

Con el objetivo de averiguar la distribución subcelular exacta, se analizó en tres de las líneas

celulares anteriores la co-localización de VRK2 con tres marcadores específicos mediante el

análisis de microscopía confocal. DAPI como marcador de núcleo (Fig. 15 y 16), anticuerpos

frente a la proteína calnexina como marcador de retículo endoplasmático (Fig. 15) y Mitotracker

como marcador mitocondrial (Fig. 16). El análisis mostró que en las tres líneas celulares una

gran fracción de la proteína endógena estaba unida a la membrana del retículo endoplasmático,

y en menor proporción, y solamente en Cos1 y WS1 parecía estar asociada a mitocondria como

demuestra la co-localización de éstas con los correspondientes marcadores específicos. Estos

datos sugerían que la localización subcelular de la proteína podría estar modulada de alguna

forma o que la proteína existía en dos isoformas con distinta localización, una asociada a

orgánulos citoplasmáticos y la otra dispersa en el citosol y en el núcleo.

VR

K2C

alne

xina

DAP

IM

ezcl

a

MCF7Cos1 WS1

Figura 15. Co-localización de VRK2 con retículo endoplasmático. VRK2 (rojo) y el retículo endoplásmico identificado con el anticuerpo monoclonal específico para calnexina (verde). En azul tinción nuclear con DAPI. La barra indica 50µm.

63

Resultados

1.2. El gen VRK2 genera dos isoformas que difieren en el extremo C-terminal.

Al clonar el ADN codificante de VRK2, a partir de ARN total de la línea celular HeLa y

mediante la técnica RT-PCR, se obtuvieron dos ADN codificantes, uno de 1833 y otro de 1877

pb. La comparación de ambas secuencias con la secuencia completa del gen VRK2 reveló que el

mensajero de 1877 pb estaba formado por un procesamiento alternativo del ARN mensajero.

Este nuevo transcrito, que denominamos isoforma B, contenía un fragmento adicional de 44

nucleótidos flanqueado por secuencias donadoras y aceptoras de procesamiento de exones, que

pasó a ser el exón 13, localizado 8280 pb por debajo del exón 12 y 4542 pb por encima del

nuevo exón 14 (antiguo exón 13) en la secuencia genómica (Fig. 17).

La isoforma A codifica para una proteína de 508 aminoácidos, mientras que la isoforma B da

lugar a una proteína de 397 aminoácidos, ya que el nuevo exón cambia el marco de lectura e

introduce un codon de terminación prematuro. Ambas isoformas difieren por tanto en el

extremo carboxi-terminal; mientras VRK2A contiene una secuencia hidrofóbica (residuos 492-

508), en VRK2B los aminoácidos 395 al 508 son reemplazados por tres residuos (VEA) (Fig.

18). El dominio catalítico, localizado en el extremo N-terminal, es idéntico en las dos isoformas

VR

K2

Mito

Trac

ker

DAP

IM

ezcl

a

WS1Cos1 MCF7

Figura 16. Co-localización de VRK2 con mitocondrias. VRK2 (verde) y las mitocondrias marcadas con el reactivo MitoTracker Red CMXRos de Molecular Probes (rojo). En azul tinción nuclear con DAPI. La barra indica 50µm.

64

Resultados

y contiene un sitio de unión a ATP en los residuos 35-61 y un sitio catalítico activo entre los

residuos 162-174.

Debido a que los ARN mensajeros de ambas isoformas tienen un tamaño similar de 1.8

kilobases y no pueden ser discriminados por northern blot, se abordó una aproximación

experimental basándonos en una RT-PCR no cuantitativa, para la cual se diseñaron

oligonucleótidos que flanquean el exón 13 (VRK2TA y VRK2TB), de forma que se pudieron

detectar ambas isoformas en muestras de ARN de diferentes líneas celulares. La isoforma A se

detectó como una banda de 135 nucleótidos y era siempre la más abundante excepto en la línea

tumoral de carcinoma de colon WiDr, en la isoforma B era mayoritaria y se detectó como una

banda de 179 nucleótidos (Fig. 19A).

Ya que la función biológica en la célula es llevada a cabo por las proteínas, quisimos comprobar

si también existían las dos isoformas a nivel proteico. Posteriormente se analizó la expresión de

proteínas mediante western blot de extractos proteicos totales procedentes de un cultivo

asincrónico de las mismas líneas celulares utilizadas anteriormente con los anticuerpos

policlonales generados (Fig. 19B). La isoforma A se detectó en todas la líneas celulares y era la

más abundante, excepto en las líneas celulares HeLa (carcinoma de cérvix), MCF7 (carcinoma

de mama) y WiDr en las que VRK2B era la mayoritaria.

Gen VRK2 AGTGAGAGAAGCGCTGAGTCCTGTGCAACATGGAAAGTGCAGAAAGAGGAGAAACTGATTADNc_VRK2B AGTGAGAGAAGCGCTGAGTCCTGTGCAACATGGAAAGTGCAGAAAGAGGAGAAACTGATTADNc_VRK2A AGTGAGAGAAGCGCTGAGTCCTGTGCAACATGGAAAGTGCAGAAAGAGGAGAAACTGATT

EXÓN 12Gen VRK2 GGATTGATGAACAATGAAGCAGCTCAGGT.........8280 bp.......AGGTAGAAADNc_VRK2B GGATTGATGAACAATGAAGCAGCTCAG---------------------------GTAGAAADNc_VRK2A GGATTGATGAACAATGAAGCAGCTCAG---------------------------------

EXÓN 13Gen VRK2 GCTTAGGCTATTGATTTGAACCCACTATTTTTTCTAATGT........4542 bp.....ADNc_VRK2B GCTTAGGCTATTGATTTGAACCCACTATTTTTTCTAAT----------------------ADNc_VRK2A ------------------------------------------------------------

EXÓN 14Gen VRK2 AGGAAAGCACAAGGAGAAGACAGAAATATCAAGAGTCTCAAGAACCTTTGAATGAAGTAAADNc_VRK2B --GAAAGCACAAGGAGAAGACAGAAATATCAAGAGTCTCAAGAACCTTTGAATGAAGTAAADNc_VRK2A --GAAAGCACAAGGAGAAGACAGAAATATCAAGAGTCTCAAGAACCTTTGAATGAAGTAA

Figura 17. Generación de dos mensajeros de VRK2 mediante un procesamiento alternativo del ARN mensajero de VRK2. Identificación de un nuevo exón en el ARN mensajero que codifica para la isoforma VRK2B. Alineamiento de las secuencias de ADN que corresponden a la secuencia genómica de VRK2 (localización genómica en Ensembl: AC068193.7.1.170059), el ADN codificante (ADNc) para VRK2A (AB000450) y para VRK2B (AJ512204). En negrita se indican los sitios donadores y aceptores para el procesamiento de ARN.

65

Resultados

Para asegurarnos de que la movilidad electroforética de cada proteína endógena correspondía

con la esperada y descartar la posibilidad de que la banda de mayor movilidad fuera una banda

de degradación de la isoforma A, se analizaron por western blot extractos proteicos de MCF7

junto con las proteínas de fusión GST-VRK2A y GST-VRK2B digeridas con trombina.

Efectivamente se comprobó que la movilidad de las isoformas endógenas y de las sobre-

expresadas era la misma (Fig. 19C). Sitio unión a ATP VRK2A - MPPKRNEKYKLPIPFPEGKVLDDMEGNQWVLGKKIGSGGFGLIYLAFPTN -50 VRK2B - MPPKRNEKYKLPIPFPEGKVLDDMEGNQWVLGKKIGSGGFGLIYLAFPTN -50 Sitio unión a ATP VRK2A - KPEKDARHVVKVEYQENGPLFSELKFYQRVAKKDCIKKWIERKQLDYLGI -100 VRK2B - KPEKDARHVVKVEYQENGPLFSELKFYQRVAKKDCIKKWIERKQLDYLGI -100 VRK2A - PLFYGSGLTEFKGRSYRFMVMERLGIDLQKISGQNGTFKKSTVLQLGIRM -150 VRK2B - PLFYGSGLTEFKGRSYRFMVMERLGIDLQKISGQNGTFKKSTVLQLGIRM -150 Sitio quinasa activo VRK2A - LDVLEYIHENEYVHGDVKAANLLLGYKNPDQVYLADYGLSYRYCPNGNHK -200 VRK2B - LDVLEYIHENEYVHGDVKAANLLLGYKNPDQVYLADYGLSYRYCPNGNHK -200 VRK2A - QYQENPRKGHNGTIEFTSLDAHKGVALSRRSDVEILGYCMLRWLCGKLPW -250 VRK2B - QYQENPRKGHNGTIEFTSLDAHKGVALSRRSDVEILGYCMLRWLCGKLPW -250 VRK2A - EQNLKDPVAVQTAKTNLLDELPQSVLKWAPSGSSCCEIAQFLVCAHSLAY -300 VRK2B - EQNLKDPVAVQTAKTNLLDELPQSVLKWAPSGSSCCEIAQFLVCAHSLAY -300 VRK2A - DEKPNYQALKKILNPHGIPLGPLDFSTKGQSINVHTPNSQKVDSQKAATK -350 VRK2B - DEKPNYQALKKILNPHGIPLGPLDFSTKGQSINVHTPNSQKVDSQKAATK -350 VRK2A - QVNKAHNRLIEKKVHSERSAESCATWKVQKEEKLIGLMNNEAAQESTRRR -400 VRK2B - QVNKAHNRLIEKKVHSERSAESCATWKVQKEEKLIGLMNNEAAQVEA -397 VRK2A - QKYQESQEPLNEVNSFPQKISYTQFPNSFYEPHQDFTSPDIFKKSRSPSW -450 Región transmembrana VRK2A - YKYTSTVSTGITDLESSTGLWPTISQFTLSEETNADVYYYRIIIPVLLML -500 VRK2A - VFLALFFL -508 Figura 18. Alineamiento de las isoformas VRK2A y VRK2B. Alineamiento de las secuencias de proteína derivadas del ADN codificante donde se observa la divergencia del extremo carboxi-terminal. La flecha indica donde cambia el marco de lectura a consecuencia del nuevo exón.

Por otro lado, puesto que se han observado diferencias entre los niveles de ARN mensajero

detectadas mediante la RT-PCR no cuantitativa de cada isoforma y los correspondientes niveles

de proteína en algunas de las líneas celulares analizadas, se midieron los niveles de ARN

mensajero iniciales mediante una PCR cuantitativa en tiempo real, de las líneas celulares H1299

y MCF7. En este experimento se midieron por un lado los niveles de los dos mensajeros

utilizando los oligonucleótidos VRK2TA y VRK2TB, y por otro lado se midió el mensajero

específico de VRK2B, con los oligonucleótidos VRK2TC y VRK2TD (Fig. 19D). Se observó

que en ambos casos parece haber los mismos niveles de ambos mensajeros, y que el mensajero

de VRK2B es minoritario. Por tanto la diferencia observada entre los niveles de ARN y de

66

Resultados

proteína, al menos en estas dos líneas celulares, sugiere que la presencia de cada isoforma debe

estar regulada a nivel traduccional.

1.3. Las dos isoformas de VRK2 se expresan en distintas líneas celulares tumorales.

Para comprobar si existía alguna correlación entre el tipo de línea celular, o la procedencia

tumoral de la misma, con el patrón de expresión de ambas isoformas, en concreto con la de

VRK2B, puesto que era la isoforma más rara, se analizó por western blot la expresión de

proteínas de extractos celulares totales procedentes de un cultivo asincrónico de un panel de

líneas celulares tumorales (Fig. 20). VRK2A se expresaba en todas las líneas tumorales

mostradas, además los niveles de expresión eran bastante altos y no parecían variar entre las

distintas líneas celulares, sin embargo, los niveles de expresión de VRK2B eran muy variables y

su expresión era mayor en las líneas celulares C4-I, HeLa, MCF7 y WiDr. No obstante, no se ha

encontrado ninguna correlación entre el tipo de tumor del que procedía y los niveles de

expresión de la isoforma B.

Hep

G2

H12

99

38

836550

KDa

293T

A54

9

HeL

a

MC

F7W

iDr

VRK2AVRK2B

B

VRK2BVRK2A

A29

3TA

549

H12

99H

eLa

Hep

G2

MC

F7

WiD

r

194

118

nu

234

GAPDH

1 IBVRK2AVRK2B

2C

VRK2TA/B H1299 VRK2TA/B MCF7VRK2TC/D H1299 VRK2TC/D MCF7VRK2TA/B H1299 VRK2TA/B MCF7VRK2TC/D H1299 VRK2TC/D MCF7

D

IB

-200

0

200

400

600

800

1 6 111621263136 4146Ciclo

PCR

Lín

ea d

e ba

se

Mar

cado

r

Figura 19. Expresión del ARN mensajero de las dos isoformas de VRK2. A) Detección de la expresión de las dos isoformas en distintas líneas celulares mediante RT-PCR no cuantitativa usando los oligonucleótidos VRK2TA y VRK2TB. B) Detección por western blot de la proteína VRK2 endógena en distintas líneas celulares que proceden de distintos carcinomas 293T (riñón), A549 y H1299 (pulmón), Hela (cérvix), HepG2 (hígado), MCF7 (mama), WiDr (colon) y Cos1 (riñón de mono). C) Movilidad electroforética de VRK2A y B endógenas de extractos celulares de MCF7 (1) comparado con proteína de fusión a GST purificada en bacterias y digeridas posteriormente con trombina para eliminar el epítopo GST (2), y detectadas por western blot con anticuerpos policlonales específicos para VRK2. D) Detección de los niveles de ARN mensajero mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real del mensajero de VRK2 total detectado con los oligonucleótidos VRK2TA y VRK2TB (isoforma A y B, línea continua) o específico de VRK2B, detectado con los oligonucleótidos VRK2TC y VRK2TD (línea discontinua) en H1299 (azul) y MCF7 (rosa).

67

Resultados

1.4. Las dos isoformas tienen diferente localización subcelular.

La presencia de un fragmento hidrofóbico en VRK2A sugería que ambas proteínas podrían

tener diferente localización celular, lo cual explicaría porque en la figura 15 y 16 observamos la

presencia de VRK2 endógena de forma libre o unida a membranas. Con el propósito de

determinar la localización específica de cada isoforma se clonaron los ADN codificantes de

cada una en un vector pCEFL con un epítopo HA, y se transfectaron en la línea celular Cos1. La

localización de las proteínas exógenas se determinó con un anticuerpo anti-HA. La isoforma A

se localizó en la membrana del retículo endoplasmático y la envuelta nuclear ya que co-

localizaba con el marcador específico calreticulina (Fig.21A). VRK2B, la cual no contiene el

dominio transmembrana, se localizaba principalmente dispersa por el citosol, y en muchos casos

también en el núcleo y excluida del nucleolo, a pesar de no tener ninguna secuencia de

localización nuclear conocida (Fig.21A y B). Debido a su presencia nuclear se comprobó si

VRK2B también co-localiza con el supresor de tumores p53, el cual es una proteína nuclear

diana de VRK1 [6, 379]. Para lo cual se transfectaron células H1299 (p53-/-) con cada una de las

isoformas de VRK2 y pCB6+p53. Como se observa en la figura 21B, VRK2B co-localizaba con

p53 en el núcleo, excluida del nucleolo.

VRK2AVRK2B

VRK2AVRK2B

CÉRVIX MAMA RIÑÓN PULMÓN COLONOSTEOSARC

OMA

LINF.T LIN

F.B

PRO

MI.

MO

NO

RAT

ÓN

SARCOMA EWING NEUROBLASTOMA

HEP

ATO

MA

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

PIEL

PULM

ÓN

00,5

11,5

22,5

33,5

12

34

56

78

910

1112

1314

1516

1718

1920

2122

2324

2526

2728

2930

3132

3334

35

VRK2AVRK2B

00,5

11,5

22,5

33,5

12

34

56

78

910

1112

1314

1516

1718

1920

2122

2324

2526

2728

2930

3132

3334

35

VRK2AVRK2B

Figura 20. Expresión de VRK2A y B en líneas celulares tumorales y normales. Detección de VRK2 endógena con anticuerpos policlonales específicos en diferentes líneas celulares tumorales que proceden de diferentes tejidos, excepto WS1 y IMR90 que proceden de fibroblastos normales. 1: C41; 2: HeLa; 3: SiHa; 4: SW756; 5: Cal51; 6: H9528T; 7: MCF-7; 8: A498; 9: 293T; 10: A549; 11: H1299; 12: Colo32; 13: HCT116; 14: WiDr; 15: OSA; 16: RM513; 17: HepG2; 18: Jurkat; 19: JY; 20: HPBALL; 21: jijoye; 22: HL60; 23: Cos1; 24: NIH3T3; 25: A4573 ; 26: A673; 27: SK-ES-1; 28: TC-71; 29: IMR-32; 30: LAN-1; 31: SK-N-AS; 32: SK-N-ER; 33: SK-N-JD; 34: WS1; 35: IMR-90. Se muestra además la representación gráfica de la expresión relativa de VRK2A y B.

68

Resultados

Puesto que el anticuerpo policlonal de VRK2 no discrimina las dos isoformas, para averiguar la

localización de las isoformas endógenas se llevó a cabo un fraccionamiento subcelular de

núcleos para detectar la localización nuclear de VRK2 mediante western blot. La isoforma B se

localizaba predominantemente en extractos procedentes de la fracción nuclear en distintas líneas

celulares (Fig. 22), mientras que VRK2A se localiza en la fracción citosólica mayoritariamente,

pero también en la fracción nuclear, quizás debido a la presencia de ésta en la envuelta nuclear.

1.5. VRK2B se expresa en células en las que VRK1 es citoplasmática.

La diferente localización y expresión de las dos isoformas de VRK2 sugiere que estas podrían

tener diferentes funciones celulares. No obstante, la localización nuclear de VRK2B parece ser

redundante con la de VRK1, la cual ha sido descrita como una proteína nuclear [6, 21, 27, 28].

Sin embargo, la localización de VRK1 parece variar dependiendo del tipo celular, así en

p53

VRK2AVRK2B

N C N C N C WiDrMCF7A549

MEK1

IB

HA

p53

Mez

cla

DA

PI

HA-VRK2A HA-VRK2BHA-VRK2A HA-VRK2B

HA

Cal

retic

ulin

aM

ezcl

aD

AP

I

A B

Figura 21. Localización subcelular de VRK2A y VRK2B. Localización específica de HA-VRK2A y HA-VRK2B expresadas exógenamente con orgánulos celulares determinada en Cos1 y H1299. A) Co-localización de HA-VRK2A, transfectada en Cos1 y detectada con un anticuerpo anti-HA, con retículo endoplásmico identificado con el anticuerpo policlonal específico para calreticulina (rojo). B) Co-localización en el núcleo de células H1299 transfectadas con HA-VRK2B y p53. HA-VRK2B fue detectada con un anticuerpo anti-HA (verde) y p53 con el anticuerpo policlonal CM1(rojo). En azul tinción nuclear con DAPI. La barra indica 50µm.

Figura 22. Fraccionamiento subcelular de VRK2 endógena. Detección por western blot de VRK2A y VRK2B endógenas en la fracción citosólica (C) y fracción nuclear (N) en distintas líneas celulares. Como control del fraccionamiento se utilizaron anticuerpos frente a la proteína nuclear p53 y frente a la proteína citosólica MEK1.

69

Resultados

linfomas, sarcomas y carcinomas escamosos es nuclear, mientras que en adenocarcinomas es

citosólica (datos no publicados). Y este cambio de localización de VRK1 coincide con la

detección de VRK2B, la cual es más abundante en adenocarcinomas. Para confirmar estos datos

se determinó la localización de VRK1 y 2 endógenas en líneas celulares que proceden de un

adenocarcinoma de mama (MCF7), de pulmón (A549) y de cérvix (HeLa) y en las cuales se

detectó la expresión de VRK2B por western blot (Fig.20). En la figura 23 se observa que

efectivamente VRK1 se encuentra en el citosol, mientras que VRK2 se localiza en ambos

compartimentos, citosol y núcleo, y en las líneas MCF7 y HeLa la tinción de VRK2 en el núcleo

respecto al citosol es mayor, lo cual coincide con una mayor expresión de la isoforma B.

VR

K1

Mez

cla

VR

K2

Fase

MCF7 HeLaA549

Figura 23. Localización de VRK1 y VRK2 endógenas en tres líneas celulares que derivan de adenocarcinomas. VRK1 detectada con un anticuerpo monoclonal (clon 1F6) específico para VRK1 y VRK2 fue detectada con un anticuerpo policlonal específico para VRK2. La barra indica 50µm.

70

Resultados

1.6. Especificidad de sustrato.

A pesar de las diferencias del extremo C-terminal, el cual debe estar implicada en la regulación

y localización de ambas quinasas, las dos isoformas comparten un dominio catalítico idéntico

(Fig. 18), lo cual sugiere que podrían fosforilar los mismos sustratos al menos in vitro. Para

determinar la actividad catalítica y la especificidad de sustrato de las dos quinasas, se llevaron a

cabo ensayos quinasa in vitro, aplicando las mismas condiciones estándar que para un ensayo

con caseína quinasa I (CKI), y se utilizaron como quinasas las proteínas de fusión GST-VRK2A

y GST-VRK2B purificadas a partir de la expresión de los plásmidos pGEX-VRK2A/B, y como

sustratos un panel de proteínas que son sustratos de la familia de quinasas CKI o de la quinasa

viral B1R.

Las dos quinasas, al igual que VRK1 [6], fosforilaban idénticamente proteínas ácidas como

caseína, que son sustratos típicos de CKI, pero también proteínas básicas que no son sustratos

de CKI como histona 2B y proteína básica mielínica (MBP), sustratos más comunes de serina-

treonina quinasas como las MAP quinasas o Akt [6] (Fig. 24), lo que nos permitía diferenciar la

familia VRK como un subgrupo relacionado con la familia CKI [3]. Ninguna de las dos

isoformas fosforilaba histona 3. Por último, también encontramos que ambas proteínas

presentan una fuerte actividad de autofosforilación.

Para identificar el tipo de residuo que era autofosforilado en VRK2A y B se llevó a cabo un

ensayo de fosfoaminoácidos a partir de proteínas de fusión GST-VRK2A y B autofosforiladas.

La fosforilación se detectó principalmente en residuos de serina, aunque también en residuos de

GST-VRK2AGST-VRK2B

Cas

eína

MBP

His

tona

H2B

H

isto

naH

3

GST

-- C

aseí

na

MBP

His

tona

H3

His

tona

H2B

GST

--KDa

GST-VRK2AGST-VRK2B

Caseína GST

MBP Histona H2B

Histona H3

CaseínaMBP Histona H2B

GST-VRK2A GST-VRK2B

9252,3

35,928,9

21

32P

32P 32P

Coomassie Coomassie

KD9252,3

28,9

21

35,9

Figura 24. Especificidad de sustrato de VRK2A y VRK2B. Se realizó un ensayo de actividad quinasa in vitro usando 2 µg de GST-VRK2A o B como quinasa y 10 µg de distintas proteínas como sustrato: GST, BSA (Sigma), Caseína (Sigma), Histona H3 (Sigma) y MBP (Sigma). Se muestran la incorporación de radiactividad durante el ensayo quinasa (panel superior) y tinción de las proteínas usadas con Coomassie (panel inferior).

71

Resultados

treonina, proporción que era menor para la isoforma más corta, indicando que el dominio C-

terminal de VRK2A también era autofosforilado (Fig. 25).

VRK2A VRK2BP-Ser

P-Thr

32P PAA fríos

Origen32P PAA

fríos

-10

20

50

80

110

VRK2A VRK2B

Ser Thr

Figura 25. Identificación del tipo de residuo autofosforilado en VRK2A y VRK2B. Tras realizar un ensayo quinasa similar a los descritos anteriormente, se analizó la incorporación de radiactividad en residuos de serina y treonina por efecto la autofosforilación de GST-VRK2A y B. Se muestra la incorporación de radioactividad y el revelado de los aminoácidos totales con ninhidrina (PAA fríos). En el panel inferior se representa la incorporación absoluta de radiactividad en los residuos indicados.

72

Resultados

2. VRK2 COMO REGULADOR DEL SUPRESOR DE TUMORES P53.

2.1. VRK2A y B fosforilan p53 en el residuo treonina 18 in vitro.

Con el fin de identificar sustratos de relevancia biológica para VRK2 se analizó si ambas

isoformas fosforilaban in vitro al supresor de tumores p53, el cual es un sustrato conocido de la

quinasa de la misma familia VRK1 [6, 379]. Para ello se realizó un ensayo quinasa in vitro,

utilizando como sustratos varias proteínas de fusión a GST del dominio N-terminal de p53, que

corresponde al dominio de transactivación, tanto de su versión silvestre como proteínas que

contienen sustituciones individuales o combinadas de los residuos serina o treonina [380, 381].

Observamos que las dos isoformas fosforilaban in vitro el residuo treonina 18 de p53, ya que

había una pérdida total de fosforilación siempre que este residuo era sustituido por alanina (Fig.

26A y B). Aquellos mutantes que incluyen la sustitución Ser15Ile mostraban una banda de

fosforilación más débil, probablemente debido a una alteración de la conformación de la

molécula al introducir un residuo de isoleucina, efecto también observado cuando se usaban

otras quinasas de la familia [6]. Para confirmar el tipo de residuo que era fosforilado se llevó a

cabo un ensayo de fosfoaminoácidos a partir de proteínas de fusión GST-p53 (1-85aa)

fosforiladas por VRK2B. La fosforilación se detectó en residuos de treonina (Fig. 26C).

WtF

P26

7 (1

-64)

Wt

S15I

T18A

S20A

S34A

S55N

S61A

S15I

/T18

AS1

5I/S

20A

S15I

/S34

AT1

8A/S

20A

S15I

/T18

A/S

20A

Wt

S4/6

/9A

T18A

S4/6

/9/T

18A

GS

T--

FP279 (11-63)FP221 (1-85)

GST-p53A

32P-GST-VRK2A

32P-FP26732P-FP279

32P-FP221

P-Ser

P-Thr

32POrigen

PAA fríos

C

B

32P-FP26732P-FP279

32P-FP221

32P-GST-VRK2B

32P (GST-VRK2A)

32P (GST-VRK2B)

Figura 26. Fosforilación de p53 en treonina 18 in vitro por VRK2A y B. A) Fosforilación de las proteínas de fusión GST-p53 que contienen diferentes sustituciones simples o combinadas de serinas o treoninas por la isoforma VRK2A. GST-p53 FP221, residuos 1-85; FP279, residuos 11-65; FP267, residuos 1-64. Las proteínas de fusión derivan de la proteína p53 murina, aunque la numeración de cada residuo corresponde a la posición del residuo conservado en la secuencia de p53 humana. B) Fosforilación de p53 por VRK2B. C) Análisis de fosfoaminoácidos de GST-p53 fosforilado por GST-VRK2B. Se muestra la incorporación de radioactividad y el revelado de los aminoácidos totales (PAA fríos).

73

Resultados

Por otro lado también se analizó la fosforilación de p53 humana completa y en otras regiones

distintas del extremo N- terminal. Para ello usamos como sustrato proteínas de fusión a GST

conteniendo los aminoácidos 90 al 290 ó 290 al 390, así como la proteína p53 humana completa

(Fig. 27). Observamos que ningún otro dominio de p53 parecía susceptible de fosforilación por

estas quinasas.

2.2. VRK2A y B no fosforilan Mdm2.

KDa

83

50

120

65

38

27

GST-HDM2(1-188)

GST

-- HD

M2-

His

GST

-HD

M2(

1-18

8)

GST

-- HD

M2-

His

GST

-HD

M2(

1-18

8)

HDM2-HisGST-VRK2A/B

GSTCoomassieCoomassie

GST

-- HD

M2-

His

GST

-HD

M2(

1-18

8)

GST

-- HD

M2-

His

GST

-HD

M2(

1-18

8)

GST-VRKA GST-VRKB

32P 32P

Figura 28. Ninguna de las dos isoformas de VRK2 fosforilan Mdm2. Ensayo quinasa in vitro de Hdm2 por VRK2A y B. Como sustratos de VRK2A (izquierda) o VRK2B (derecha) se utilizaron la proteína de fusión Hdm2 completa unida a un epítopo His y el fragmento amino terminal de Hdm2 (residuos 1-188). A la izquierda se muestra la tinción con azul de Coomassie y a la derecha la incorporación de radiactividad.

GS

T-- G

ST-

p53(

90-2

90)

GS

T-p5

3(29

0-39

0)

GS

T-p5

3(1-

390)

GS

T-- G

ST-

p53(

90-2

90)

GS

T-p5

3(29

0-39

0)

GS

T-p5

3(1-

390)

GST-VRK2A

GS

T-- G

ST-

p53(

90-2

90)

GS

T-p5

3(29

0-39

0)

GST-VRK2B

GS

T-p5

3(1-

390)

GS

T-- G

ST-

p53(

90-2

90)

GS

T-p5

3(29

0-39

0)

GS

T-p5

3(1-

390)

KDa83

50

38

65

27Coomassie 32PCoomassie 32P

Figura 27. Fosforilación in vitro de distintos fragmentos de p53 por VRK2A y B. Fosforilación de las proteínas de fusión GST-p53 completa y varios fragmentos de la misma por las dos isoformas de VRK2 in vitro. Las proteínas de fusión derivan de la proteína p53 humana silvestre. Autorradiografía (derecha) y tinción con azul de Coomassie (izquierda) de las proteínas de fusión indicadas tras un ensayo quinasa in vitro.

74

Resultados

Puesto que el dominio de transactivación de p53 interacciona con su regulador negativo

Mdm2/Hdm2, posteriormente estudiamos la fosforilación de éste por VRK2A y B. Utilizamos

como sustrato la proteína de fusión al epítopo His que contiene la proteína humana Hdm2

completa (Hdm2-His) o la que contiene la región de unión a p53 GST-HDM2(1-188). En las

condiciones en las que VRK2 fosforilaba a p53 en Thr18, esta no fosforilaba a Mdm2 in vitro

(Fig. 28).

2.3. Solamente la sobre-expresión de VRK2B induce la acumulación de p53.

La interacción de p53 con su principal regulador negativo Mdm2, promueve la degradación de

ésta vía proteosoma. La interrupción de esta interacción conlleva a una estabilización de p53,

por consiguiente, uno de los mecanismos por los que se regula la estabilidad de p53 es mediante

fosforilación principalmente del la región N-terminal [304]. Además, mediante el análisis de la

estructura de la unión entre p53 y Mdm2 se ha identificado el residuo treonina 18 como un

residuo fundamental para el mantenimiento de esta interacción. Esos datos han sido

confirmados por diversos autores, estableciendo la importancia de este residuo mediante

experimentos de competencia [1, 246, 382].

Por tanto, decidimos comprobar por western blot el efecto de la sobre-expresión de cada una de

las isoformas de VRK2 sobre la acumulación de p53. Para lo cual utilizamos la línea celular

H1299, que procede de un carcinoma de pulmón y no expresa p53, y por tanto se pueden

introducir exógenamente versiones silvestres o modificadas de p53. Las células se transfectaron

con las construcciones pCB6+p53 y cantidades crecientes de pCEFL-HA-VRK2B o pCEFL

HA-VRK2A, que codifican para las proteínas humanas p53, HA-VRK2B y HA-VRK2A,

p53 ─ + + + + HA- VRK2A ─ ─ 2 3 4 µg

p53

β-actina

p53

β-actina

p53 ─ + + + + HA-VRK2B ─ ─ 2 3 4 µg

IB

Niv

eles

rela

tivos

de

pro

teín

a (p

53/a

ctin

a)

HA

HA

HA-VRK2AHA-VRK2B

Vector

vacío-1

012345

p53

p53+

2µg VRK2

p53+

3µg VRK2

p53+

4µg VRK2

Figura 29. Estabilización de p53 inducida por la sobre-expresión de VRK2B. Las células de carcinoma de pulmón H1299 (p53-/-) se transfectaron con los vectores de expresión correspondientes para p53 (25 ng de pCB6+p53) y cantidades crecientes (0, 2, 3 y 4 µg) de los plásmidos pCEFL-HA-VRK2A y pCEFL-HA-VRK2B que codifican para HA-VRK2A y HA-VRK2B respectivamente. Los extractos celulares se analizaron por western blot, los niveles de p53 se detectaron con una mezcla de los anticuerpos monoclonales DO-1 y Pab1801. En la gráfica se muestra la cuantificación de los niveles de p53 normalizados frente a β-actina en distintos experimentos.

75

Resultados

respectivamente. Tras el análisis de los extractos proteicos celulares observamos que sólo la

sobre-expresión de VRK2B, la cual se localizaba en el núcleo al igual que p53 (Fig. 21B),

inducía un aumento en los niveles de p53 comparado con la expresión de p53 por sí sola (Fig.

29), mientras que la isoforma A, la cual se localiza anclada a membranas en el citosol (Fig.

21A), no inducía la estabilización de p53. Además, la acumulación de p53 era dependiente de

dosis de VRK2B, ya que aumentaba a medida que incrementaba la cantidad de la quinasa

transfectada.

2.4. VRK2B fosforila p53 in vivo.

Posteriormente se demostró que VRK2B fosforila p53 in vivo en treonina 18. Primero se

comprobó por western blot, con anticuerpos que detectan específicamente la fosforilación en

posición treonina 18, que la sobre-expresión de VK2B incrementa ligeramente la fosforilación

de p53 transfectada (Fig. 30A). No obstante, ya que la señal específica se detecta con dificultad,

probablemente porque sólo una fracción de células está transfectada y el anticuerpo no es muy

sensible, los extractos proteicos fueron sometidos a inmunoprecipitación de p53 total, y

posteriormente se detectó la fracción que estaba fosforilada en Thr18 (Fig. 30B).

C

32P-GST-VRK2B32P-FP221

FP221GST-VRK2B

GST

WT

KD

GST --

GST-VRK2B

32P

Coo

mas

sie

IB

β-actinaHA

p53-T18-Pp53

p53

p53+

HA-VRK2B

vecto

r vac

íoA

IP: p53p53p53-T18-P

IBp53

p53+

HA-VRK2B

vecto

r vac

ío

135

Niv

eles

rela

tivos

(p53

-T18

-P/p

53)

B

p53p53 + + + +

HA-VRK2BKD ─ 2 3 4 µg

β-actinaHA

D

IB

Figura 30. Fosforilación de p53 en T18 in vivo por VRK2B. A) Fosforilación in vivo de p53 transfectada en H1299. Las células H1299 transfectadas con 0.1 µg de pCB6+p53 y 6 µg de pCEFL-HA-VRK2B y 36 horas después se recogieron los extractos celulares para analizarlos por western blot. B) Se inmunoprecipitó p53 total de los extractos celulares del ensayo anterior y posteriormente se detectó por western blot p53 fosforilado en treonina 18 con el anticuerpo policlonal específico P-p53 (Thr18)-R. La cuantificación de la fosforilación relativa de p53 se muestra en la gráfica en la parte inferior. C) Ensayo de fosforilación in vitro de p53 por GST-VRK2B silvestre o el mutante inactivo K169E (GST-VRK2BKD). D) Se sobre-expresaron cantidades crecientes del plásmido que codifica para el mutante inactivo HA-VRK2BKD junto con p53 y se detectaron los niveles de p53 por western blot como en ensayos anteriores.

76

Resultados

Para confirmar que este efecto era dependiente de la actividad quinasa de VRK2B, introducimos

una mutación puntual en la secuencia de VRK2B mediante la que sustituimos el residuo

conservado lisina 169 por ácido glutámico, convirtiéndola en una quinasa catalíticamente

inactiva, ya que este es un aminoácido esencial para la funcionalidad del dominio catalítico en

las proteínas quinasas [5]. Estas secuencias fueron clonadas tanto en un vector de expresión

procariota de proteínas de fusión recombinantes, como de expresión en mamíferos. Primero se

comprobó mediante un ensayo quinasa in vitro que efectivamente la proteína no tiene ninguna

actividad quinasa en la fosforilación de un sustrato o en su autofosforilación (Fig. 30C). Cuando

co-transfectamos p53 con cantidades crecientes de este mutante de VRK2B comprobamos que

no se producía un aumento en los niveles de p53, por lo que concluimos que la actividad

quinasa de VRK2B es esencial para el aumento de la estabilidad de p53 exógenamente

expresado (Fig. 30D).

Posteriormente se comprobó si el efecto de VRK2B sobre la acumulación y fosforilación de p53

podría ser eliminado usando ARN de interferencia específico para VRK2. Para ello se

transfectaron células H1299 con pCB6+53, cantidades crecientes de pCEFL-HA-VRK2B en

ausencia o presencia de cantidades crecientes del plásmido pSUPERIOR-VRK2-230 que

codifica para un ARN de interferencia de VRK2. Como cabría esperar, VRK2B aumentaba la

estabilidad y la fosforilación en treonina 18 de p53, pero no en serina 15 ó 20 (Fig. 31). Sin

embargo, a medida que incrementan las cantidades del ARN de interferencia los niveles de p53

caen de nuevo, aunque no ocurre lo mismo con la fosforilación en treonina 18, quizás por la

presencia de cantidades de quinasa, que aunque sean mínimas para detectar por western blot,

son suficientes para fosforilar p53.

IBp53-T18-P

p53-S20-Pp53-S15-P

p53 + + + + + + + ─

siVRK2(µg) ─ ─ ─ ─ 2 3 4 ─

β-actinaHAp53

HA-VRK2B(µg) ─ 2 3 4 4 4 4 ─

Figura 31. Efecto del ARN de interferencia de VRK2 sobre la acumulación de p53. Las células H1299 (p53-/-) se transfectaron con los vectores de expresión correspondientes para hp53 (25 ng de pCB6+p53), cantidades crecientes (2, 3 y 4 µg) del plásmido pCEFL-HA-VRK2B que codifica para HA-VRK2B respectivamente y el plásmido pSUPERIOR-VRK2-230 que codifica para el ARN de interferencia de VRK2. Los extractos celulares se analizaron por western blot, los niveles de p53 se detectaron con una mezcla de los anticuerpos monoclonales DO-1 y Pab1801, los anticuerpos específicos para los residuos fosforilados treonina 18, serina 15 y serina 20 son P-p53 (Thr18)-R, P-p53 (Ser20)-R y P-p53 (Ser15)-R respectivamente.

77

Resultados

También se trató de eliminar o reducir los niveles endógenos de VRK2 con ARN de

interferencia con distintas secuencias transfectados como dúplex de ARN de interferencia o

transfectados en plásmidos específicos como pSUPER o pSUPERIOR, sin embargo, ninguno de

ellos redujo de forma significativa los niveles de VRK2A o B endógenas en esta línea celular,

aunque todas ellas parecían funcionar con proteína sobre-expresada. Esto era debido

probablemente a la estabilidad de estas proteínas. Para medir la estabilidad de la proteína VRK2

endógena tratamos la línea celular Hela con cicloheximida, un inhibidor de la síntesis proteica

que actúa bloqueando la traducción del ARN mensajero, y tomamos muestras antes del

tratamiento y a diferentes tiempos tras la adición de la droga (Fig. 32). La cantidad de proteína

VRK2 detectada mediante western blot no varió sensiblemente durante las 30 horas del

tratamiento. Como control usamos p53, el cual desaparecía a tiempos muy tempranos como

consecuencia de su corta vida media, y a partir de las 24 horas se empezaba a detectar de

nuevo, lo que indicaba que el tratamiento dejaba de tener efecto a partir de ese tiempo. Por otro

lado, reducir específicamente una de las isoformas supone una complejidad adicional a la hora

de diseñar los oligonucleótidos. En el caso de VRK2B, esta posibilidad no sería viable ya que

sólo se diferencia de VRK2A en la presencia del exón 13. De esta forma, cualquier fenotipo que

pudiéramos observar debería ser atribuido a cualquiera de las dos isoformas. No obstante, las

líneas celulares H1299 seleccionada para llevar a cabo todos los ensayos de p53 expresa

principalmente VRK2A (Fig.19B).

2.5. La forma inactiva de VRK2B interacciona de forma estable con p53.

Puesto que VRK2B y p53 co-localizan en el mismo compartimento celular, quisimos comprobar

si ambas proteínas interaccionaban de forma estable o si la interacción era transitoria como

producto de la reacción de fosforilación como ocurre con otras quinasas con sus sustratos. Para

ello se co-transfectaron células H1299 con un plásmido de expresión eucariótica que codifica

para GST-VRK2B, tanto la forma silvestre como la inactiva, con pCB6+p53, tanto la forma

silvestre como el mutante T18A no fosforilable. Los extractos celulares fueron incubados con la

resina Glutation sefarosa, con el objetivo de precipitar aquellas proteínas unidas a GST-

VRK2B. Previamente se comprobó la expresión de cada una de las construcciones en los

extractos celulares por western blot (Fig. 33, panel inferior), y posteriormente se detectaron las

proteínas asociadas a GST-VRK2B por western blot con los anticuerpos indicados. En la figura

VRK2

p53

0 0.5 1 2 4 6 8 10 12 24 30 2 12DMSO

β-actina

IB

Horas tras cicloheximida

Figura 32. Estabilidad proteica de VRK2 endógena. Estabilidad de VRK2 endógena en la línea celular HeLa analizada mediante western blot tras tratamiento con cicloheximida.

78

Resultados

33 se muestra que sólo la forma inactiva de VRK2B interaccionaba de forma estable con p53

silvestre y T18A, mientras que la forma silvestre de VRK2B no lo hacía, esto es debido

probablemente a que la quinasa activa reconoce el sustrato, en este caso p53 y p53T18A y lo

fosforila sin dan lugar a una interacción estable, sin embargo, la forma inactiva reconoce el

sustrato pero no es capaz de finalizar la reacción de fosforilación dando lugar a una interacción

estable. En cuanto al p53T18A, a pesar de no ser fosforilable sigue siendo reconocido por la

quinasa, formando un complejo estable con la forma inactiva.

2.6. VRK2B promueve la estabilización de p53 mediante un mecanismo postraduccional.

Existen múltiples mecanismos por los cuales se regula la actividad de p53, como la regulación a

nivel transcripcional o traduccional, sin embargo, el mecanismo principal es la regulación de la

estabilidad de la proteína mediante modificaciones postraduccionales, lo que permite una

respuesta rápida en la célula. Para ver si el efecto de VRK2B sobre p53 era un efecto

postraduccional, co-transfectamos la línea celular H1299 con pCB6+p53 o la combinación

pCB6+p53 y pCEFL-HA-VRK2B. 36 horas después se añadió cicloheximida al cultivo.

Preparamos extractos celulares en tampón RIPA a diferentes tiempos tras la adición de

cicloheximida y los niveles de p53 fueron detectados por western blot con anticuerpos

específicos, y normalizados frente a β-actina (Fig. 34). En ausencia de VRK2B, p53 es

degradada inmediatamente como cabría esperar. Sin embargo, en presencia de VRK2B los

niveles se mantenían estables incluso a las 8 horas. También se llevó a cabo el mismo

experimento con VRK2A, y como se observa en la figura 34, esta isoforma no protege a p53 de

Precipitado con Glutation Sefarosa

Extracto total

GST(GST-VRK2B)

GST

IB

β-actina

p53

GST(GST-VRK2B)

GST

p53

p53 + + - + - -- - + - + -- + + - - +- - - + + -

GST-VRK2BWTp53T18A

GST-VRK2BKD

Figura 33. Interacción de VRK2B y p53. Se transfectaron células H1299 con pCEFL-GST-VRK2B silvestre o inactiva (VRK2BKD) y pCB6+p53 silvestre o p53T18A. 48 horas después de la transfección se prepararon extractos totales con un tampón específico para este tipo de ensayos de interacción y se usó 1 mg de proteína para precipitar las proteínas de fusión con GST con la resina de Glutation sefarosa. Se analizó la proteína precipitada por western blot con anticuerpos específicos para p53 y GST.

79

Resultados

degradación como lo hace VRK2B. Representando los niveles de p53 normalizados, tanto de

p53 transfectada sola o con cada una de las quinasas y normalizados, obtenemos una vida media

de menos de 4 horas para el p53 transfectado en estas condiciones (quizás mayor que la del p53

endógeno), en presencia de VRK2A la vida media aumenta ligeramente, pero el incremento es

más evidente en presencia de VRK2B, llegando a ser mayor de 13 horas.

2.7. La sobre-expresión de VRK2B reduce la ubiquitinación de p53.

Uno de los mecanismos principales mediante los cuales se consigue la estabilización de p53 es

interrumpiendo la degradación vía proteosoma promovida por la ubiquitinación dependiente de

Mdm2. La interrupción de la interacción entre p53 y Mdm2 se consigue a través de distintos

estímulos activadores, los cuales promueven principalmente modificaciones postraduccionales,

como la fosforilación, la cual tiene un papel activo en este fenómeno [243, 244]. De hecho, la

fosforilación en la región N-terminal de p53 puede modular la afinidad de ésta por distintas

proteínas reguladoras, entre ellas Mdm2. Tal como se ha descrito anteriormente, el residuo

treonina 18 de p53 es esencial en el mantenimiento de esta interacción, y como consecuencia de

su fosforilación se produciría una reducción en la afinidad por Mdm2, resultando en una

disminución de su ubiquitinación [142, 246, 311, 312]. Puesto que VRK2B fosforila a p53 en

este residuo, se postuló que el desencadenante de la estabilización de p53 en presencia de

VRK2B podría ser provocado por una disminución en la ubiquitinación.

p53 + HA-VRK2B

p53+ HA-VRK2A

p53

β-actina

p53β-actina

p53β-actina

p53

C 0 4 8 12 16Horas tras CHX

IB

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 4 8 12 16

p53p53+HA-VRK2Ap53+HA-VRK2B

Horas tras adición de CHX

Niv

eles

rela

tivos

(p53

/act

ina)

Figura 34. VRK2B estabiliza a p53 por un mecanismo postraduccional. VRK2B aumenta la estabilidad de p53 transfectada en H1299 medida por el descenso de su tasa de degradación en presencia del inhibidor de síntesis de proteínas cicloheximida (CHX). Las células fueron transfectadas como en ensayos anteriores y tras 36 horas se añadió al cultivo 60 µg/ml de cicloheximida. Los niveles de p53 fueron determinados a distintos tiempos tras añadir la cicloheximida. En la parte inferior se muestra la gráfica de la cuantificación de p53 normalizada frente a β-actina en cada punto. C representa el control transfectado con vector vacío.

80

Resultados

Con el propósito de analizar los niveles de ubiquitinación de p53, se transfectaron células

H1299 con plásmidos que codifican para p53, Mdm2, VRK2B y ubiquitina para que no fuera un

factor limitante, y además las células fueron tratadas con el inhibidor de proteosoma

lactacistina, de forma que no se impide la degradación de las proteínas marcadas con ubiquitina.

Los extractos fueron analizados por western blot con anticuerpos frente a p53, y como se

observa en la figura 35A, se detectó p53 (sin marcar con ubiquitina) como una banda

mayoritaria, y una escalera más débil por encima de ésta que representa p53 unida a ubiquitina.

Observamos que en presencia de VRK2B disminuía la ubiquitinación de p53 por parte de

Mdm2 más de 80%, indicando que la fosforilación inducida por VRK2B podría cambiar la

afinidad de la interacción p53-Mdm2, y así promover la estabilización de p53.

+ + -- + -+ + -+ + -+ + -

HA-VRK2BMdm2

p53IB

p53

β-actina

HA

Mdm2

Ub-p53

GFP

GFP

Niv

eles

rela

tivos

(U

b-p5

3/p5

3)

Ubiquitina

A B

C

HA-VRK2B

p53

β-actina

HA-VRK2Bp53 + +

- + IB

p53β-actina

p53T18A- - + + + + + +- + - +

MG132

IB

0306090

120

p53+

Mdm

2

p53+

Mdm

2+H

A-V

RK2

B

Vac

ío

*

Figura 35. La sobre-expresión de VRK2B reduce la ubiquitinación de p53. A) Reducción de la ubiquitinación de p53 por Mdm2 en presencia de HA-VRK2B. Las células H1299 se transfectaron con 0,5 µg del plásmido de expresión pCB6+p53, pCoCMdm2X2 (1,5 µg), BRR12-His-ubiquitin (0,5 µg) y 2,5 µg de pCEFL-HA-VRK2B. 36 después de la transfección se añadió el inhibidor de proteosoma lactacistina (5 µM)al medio de cultivo durante 12 horas. Posteriormente se prepararon los extractos celulares con tampón RIPA y se analizaron mediante western blot con los anticuerpos específicos correspondientes. Se utilizó GFP como control de la transfección. En el panel inferior se muestra la cuantificación de p53 marcada con ubiquitina frente a p53 no marcada en experimentos independientes. * p<0.005. B) MEFs derivados del doble knock out p53-/-/Mdm2-/- se transfectaron con las proteínas indicadas. Los extractos celulares fueron procesados como en A. C) La línea celular H1299 se transfectó con los plásmidos para la expresión de p53 con la sustitución T18A (25 ng) y con o sin pCEFL-HA-VRK2B (4 µg). 6 horas antes de preparar los extractos celulares se trataron con 25 µM de MG132, un inhibidor de proteosoma en los casos en los que se indica. Los extractos se procesaron como en A.

81

Resultados

Para aclarar la participación de Mdm2 en esta estabilización, realizamos el mismo experimento

de co-transfección de p53 y VRK2B en una línea celular inmortalizada a partir de fibroblastos

de embriones de ratón derivadas del doble “knock out” para p53 y Mdm2, que por tanto no

expresan p53 ni Mdm2 (Fig. 35B). Como observamos, incluso en ausencia de Mdm2 la sobre-

expresión de VRK2B es capaz de promover la estabilización de p53 exógenamente expresado.

Por lo tanto, con este nuevo dato concluimos que el efecto de VRK2B sobre p53 no depende

solamente de la interrupción de la interacción p53-Mdm2.

Estos resultados ponen en duda el mecanismo propuesto anteriormente en el cual solamente la

fosforilación en la treonina 18 de p53 tras la sobre-expresión de VRK2B alteraría la interacción

Mdm2-p53 promoviendo la acumulación de p53. Por lo tanto, deducimos que VRK2B debía

estar promoviendo algún otro mecanismo mediante la fosforilación en otro residuo de p53 o

bien en otra molécula reguladora de la actividad de p53. Efectivamente, está descrito que p53

también es marcada para degradación vía proteosoma por otras ubiquitina ligasas como COP1 o

Pirh [271, 272], aunque los mecanismos de regulación de estas proteínas todavía son bastante

desconocidos, por lo tanto, debido a los resultados anteriores, postulamos que VRK2B puede

afectar también a la interacción de p53 con estas u otras proteínas reguladoras de p53 al igual

que VRK1 [21].

Igualmente, cuando usamos el mutante de p53 con una sustitución puntual del aminoácido

treonina 18 por el aminoácido no fosforilable alanina, la sobre-expresión de VRK2B también

era capaz de promover su estabilización en H1299 (Fig. 35C). Sin embargo, hay que tener en

cuenta que el mecanismo de estabilización de este mutante vía Mdm2 está alterado, ya que

menos susceptible a la degradación por parte de Mdm2 debido al papel esencial que tiene el

puente de hidrógeno que se establece entre la treonina 18 y la asparagina 21 de p53 para la

interacción de ésta con Mdm2 [1, 246]. Aunque como vemos en la figura 35C, este mutante es

todavía susceptible de degradación por el proteosoma como demuestra su acumulación en

presencia del inhibidor de proteosoma MG132. Esto podría confirmar que existen otros

mecanismos de degradación de p53 vía proteosoma independientes de Mdm2.

2.8. VRK2B promueve la acetilación de p53 por p300.

Como se ha mencionado anteriormente, la fosforilación del dominio de transactivación de p53

modula la afinidad de ésta con distintas proteínas reguladoras. Así, como consecuencia de la

fosforilación en treonina 18 y serina 20, aumenta la afinidad de p53 por el co-activador

transcripcional p300 [279, 280, 283]. p300 también interacciona con p53 a través de su región

amino terminal, como consecuencia de esta interacción p300 acetila a p53 en residuos del

dominio carboxilo terminal contribuyendo a la estabilización y activación de p53. De esta

82

Resultados

forma, el aumento de la afinidad de p53 por p300 sería otro de lo mecanismos por cuales la

sobre-expresión de VRK2B podría contribuir a la estabilización de p53.

Para verificar que efectivamente VRK2B promovía la acetilación de p53 por p300, se

transfectaron células H1299 con distintas combinaciones de los plásmidos que codifican para

p53, HA-p300 y HA-VRK2B y además las células fueron tratadas con el inhibidor de

deacetilasas Tricostatina A de Streptomyces. Una vez obtenidos los extractos correspondientes,

los niveles de la proteína p53 y el grado de acetilación de ésta en los residuos lisina 373 y 382

fueron analizados por western blot usando anticuerpos específicos. Se observó que VRK2B

contribuye ligeramente a la acetilación de p53 (Fig. 36A), sin embargo, el aumento de la señal

de p53 acetilado iba acompañado de un aumento de los niveles de proteína. Posteriormente se

concentró p53 total mediante inmunoprecipitación con anticuerpos específicos, para mejorar la

detección de p53 acetilado (Fig. 36B). La sobre-expresión de VRK2B aumentaba ligeramente

los niveles de acetilación de p53, posiblemente a través de p300 endógeno, aunque este efecto

se hacía más notable en presencia de p300 exógeno, lo que indicaba que toda la proteína p53

estabilizada por VRK2B era acetilada de novo por p300.

2.9. Fosforilación de p53 endógena por VRK2B.

Para estudiar el efecto de la sobre-expresión de VRK2B sobre p53 endógeno usamos la línea

celular A549, la cual expresa niveles de p53 silvestre un poco altos y deriva de un carcinoma de

pulmón al igual que H1299. Primero decidimos mirar si la sobre-expresión de VRK2B inducía

cambios en la fosforilación de p53 in vivo. Para ello las células fueron transfectadas con 1 y 3

Niv

eles

rela

tivos

Acp

53/p

53A

p53 ─ ─ + + ─ ─ + +HA-VRK2B ─ + ─ + ─ + ─ +

p300 ─ ─ ─ ─ + + + + IB

p53Acp53

β-actinaHA

P53+

P300

+VR

K2B

Acp53p53

P53+

P300

Vect

or v

acío

IBP53

P53+

VRK2

B

B

IP: p53

012345 *

Figura 36. Efecto de VRK2B sobre la acetilación de p53. A) VRK2B promueve ligeramente la acetilación de p53 por el co-activador p300. La línea celular H1299 fue transfectada con los vectores de expresión pCB6+p53, pCEFL-HA-VRK2B y pCMV-p300-HA. Horas antes de preparar los extractos celulares se añadió al cultivo el inhibidor de deacetilasas Trichostatina A de Streptomyces sp (TSA) (5µM). Los extractos fueron analizados por western blot. B) Las células se transfectaron como en A con los plásmidos indicados, se inmunoprecipitó p53 total con los anticuerpos monoclonales DO-1 y Pab240 y se detectó la acetilación de p53 en Lys 373 y 382 con un anticuerpo específico. En la gráfica se muestra la cuantificación en ensayos independientes. *p<0,05.

83

Resultados

µg de pCEFL-HA-VRK2B, como control negativo se transfectaron con vector pCEFL-HA

vacío y como control positivo las células fueron tratadas con drogas que causan daño en el ADN

y que activan p53 como adriamicina y taxol y realizamos un western blot con los extractos

proteicos obtenidos para detectar fosforilación en treonina 18 usando anticuerpos específicos

(Fig. 37).

Observamos que tanto la sobre-expresión de VRK2B como la adriamicina o el taxol inducen un

aumento de la fosforilación en treonina 18. La fosforilación de este residuo por VRK2B es

dependiente de dosis ya que en presencia de una mayor cantidad de quinasa aumenta la señal de

fosforilación detectada, además el incremento relativo de la fosforilación en presencia de

VRK2B es superior al inducido por la adriamicina, aunque similar al obtenido cuando tratamos

a las células con taxol (Fig. 37, panel medio). También se analizó por western blot la

fosforilación in vivo en serina 15, la cual no aumentaba en presencia de VRK2B. De este modo,

VRK2B inducía una mayor fosforilación en treonina 18 con respecto a la fosforilación de serina

15, mientras que en presencia de adriamicina o taxol ambos residuos eran igualmente

fosforilados (Fig. 37, panel inferior), esto sugería que VRK2B podría estar implicada en rutas de

señalización diferentes a las que inician la adriamicina o el taxol, además VRK2B no necesita la

fosforilación previa del residuo serina 15 para fosforilar p53 en treonina 18. En cuanto a la

detección absoluta de la fosforilación siempre es mayor en los casos de las células tratadas con

drogas, probablemente debido a que en estos casos la mayoría de la población responde

igualmente al tratamiento, mientras que en el casos en los que VRK2B se ha sobre-expresado

IBp53p53-T18-P

β-actina

µg HA-VRK2B0 1 3 Ta

xol

Adriam

icina

HAp53-S15-P

01234

Niv

eles

rela

tivos

(p

53-T

18-P

/p53

) p53-T18-P / p53

Niv

eles

rela

tivos

(p

53-T

18-P

/p53

-S

15-P

)

p53-T18-P / p53-S15-P

02468

Figura 37. Fosforilación de p53 endógena en treonina 18 in vivo por VRK2B. La línea celular A549 fue transfectada con distintas cantidades de HA-VRK2B y como control positivo las células se trataron con adriamicina (0.5 µg/ml durante 8 horas) o taxol (100 nM durante 12 horas). Se detectaron por western blot tanto p53 total como la fracción fosforilada en treonina 18 o serina 15. En la parte inferior se incluye la cuantificación relativa de la fracción de p53 fosforilada en treonina 18 frente a p53 total y frente a la fracción de p53 fosforilada en seria 15.

84

Resultados

solamente una fracción de la población ha sido transfectada, por eso es mayor la fosforilación

cuanto mayor es la cantidad de VRK2B transfectada.

2.10. VRK2B estabiliza p53 endógena y aumenta su actividad transcripcional.

Posteriormente se comprobó si la sobre-expresión de VRK2B también podía promover la

estabilización de la proteína p53 endógena. En este caso las células A549 fueron transfectadas

con pCEFL-HA-VRK2B o vector vacío, pero en muy pocas ocasiones se pudo observar un

incremento de los niveles de p53 (Fig. 37 y 38A).

No obstante, decidimos comprobar si la sobre-expresión de VRK2B aumentaba la vida media

de p53 endógeno, para lo cual en un experimento similar al anterior se trató a las células con

cicloheximida y se recogieron muestras a distintos tiempos. Los niveles de p53 endógeno fueron

analizados mediante western blot y normalizados frente β-actina (Fig. 38B). Observamos que en

presencia de VRK2B la vida media de p53 incrementa, aunque muy ligeramente, ya que los

niveles de p53 son siempre mayores en presencia de VRK2B. Probablemente con este modelo

no es posible ver el efecto de acumulación por parte de VRK2B que se observa con p53

exógeno, ya que en este último caso se sintetizado de novo y a niveles que mimetizan un estrés

inicial, siendo localizada directamente en el núcleo sin necesidad de translocación desde el

citoplasma, además los altos niveles de expresión de p53 endógeno en esta línea podrían

dificultar la detección de este efecto, y por último hay que tener en cuenta que todas las células

expresan p53 pero no todas han sido transfectadas y por tanto no expresan VRK2B exógena.

A consecuencia de la fosforilación en treonina 18 y del aumento de la estabilidad de p53 cabría

esperar un aumento de la actividad transcripcional de p53 [1, 303]. Para demostrar que p53

endógeno podría ser transcripcionalmente activado en presencia de VRK2B, las células A549

fueron transfectadas con vector vacío, pCEFL-HA-VRK2A y pCEFL-HA-VRK2B y la

Vector

vacío

HA-VRK2B

p53

β-actinaHA

IB

A

HA-VRK2B

p530 1 2 4 8 12 24

β-actina

IB

p53β-actina

0 1 2 4 8 12 24

Horas tras CHX

Vacío

B

Figura 38. Efecto de la sobre-expresión de VRK2B sobre p53 endógeno. A) Acumulación de p53 endógena en presencia de VRK2B. La línea celular A549 se transfectó con vector vacío o con pCEFL-HA-VRK2B. Tras 48 horas de la transfección los extractos se procesaron para western blot con los anticuerpos indicados. B) Estabilización de p53 endógena por VRK2B mediante un mecanismo postraduccional. Las células fueron transfectadas como en A. 36 horas después se añadió cicloheximida al cultivo y se analizaron los niveles de p53 a distintos tiempos.

85

Resultados

construcción reportera de la actividad transcripcional dependiente de p53, p53-Luc, que

contiene el gen de la luciferasa, el cual nos permite medir la actividad transcripcional, y en la

región promotora los elementos de respuesta a p53 sintéticos en tandem. Como control

negativo, las células fueron transfectadas con un vector pBASIC (o pGL2-BASIC) que contiene

una región promotora básica y por tanto da valores mínimos de actividad luciferasa, y como

control positivo el vector pSV40 (o pGL2-CONTROL) que contiene un promotor

constitutivamente activo y por tanto da valores máximos de actividad luciferasa (Fig. 39A). La

actividad luciferasa en este ensayo es sinónimo de actividad transcripcional dirigida por p53

endógena.

Pudimos comprobar que en presencia de VRK2A no se producía un aumento de la actividad

transcripcional, mientras que la sobre-expresión de VRK2B promovía un ligero incremento, el

cual no es muy fuerte probablemente porque el estado de activación de p53 endógeno tras la

transfección ya es bastante alto, como lo demuestra la presencia de una actividad similar en el

control positivo pSV40. En un ensayo similar en el cual se transfectaron las células con

cantidades crecientes de VRK2B, pudimos comprobar que el incremento de la actividad

transcripcional de p53 era dependiente dosis de VRK2B ya que a medida que incrementaba la

B

00,51,01,52,02,53,0

00,51,01,52,02,53,0

Act

ivid

ad lu

cife

rasa

(in

crem

ento

rela

tivo)

p53-LucHA-VRK2B(µg)

+ + + + + +─ 1 2 3 4 5

**** *****

A

00,51

1,52

2,5

pBASIC

pSV40

p53-L

uc

HA-VRK2AHA-VRK2B

p53-L

uc

+HA-V

RK2Act

ivid

ad lu

cife

rasa

(in

crem

ento

rela

tivo) Bax-Luc

00,5

1

1,52

2,5 14-3-3-Luc

00,5

11,5

22,5

Act

ivid

ad lu

cife

rasa

(inc

rem

ento

rela

tivo)

C

Mdm2-Luc

00,5

11,5

22,5

HA-VRK2B

Vector vacío

00,5

11,5

22,5 p21-Luc

HA-VRK2B

Vector vacío

Figura 39. Activación transcripcional de p53 endógena. A) La sobre-expresión de VRK2B incrementa la actividad transcripcional de p53 endógeno. En la línea celular A549 se introdujo el plásmido reportero de la actividad transcripcional de p53 con vector vacío, pCEFL-HA-VRK2A y pCEFL-HA-VRK2B, y un plásmido reportero de la actividad luciferasa de la renilla. 48 horas después de la transfección se midió la actividad luciferasa y se normalizó frente a la actividad luciferasa de la renilla asociada en cada caso. B) La activación transcripcional es dependiente de dosis de VRK2B. La células fueron transfectadas como en A pero con cantidades crecientes de pCEFL-HA-VRK2B. C) Las células fueron transfectadas con plásmidos de respuesta a p53 derivados de los promotores de los genes indicados con o sin HA-VRK2B. Los datos de al menos tres experimentos independientes se analizaron mediante la T de Student. *p<0.05; **p<0.005; ***p<0.0005.

86

Resultados

cantidad de quinasa también lo hacía la transactivación de p53 (Fig. 39B). Por lo tanto, la

proteína p53 estabilizada por VRK2B tiene capacidad de dirigir la transcripción, al menos del

reportero sintético, y es por tanto activo como factor de transcripción. Posteriormente quisimos

comprobar si la sobre-expresión de VRK2B también aumentaba la transcripción de genes diana

conocidos de p53, para ello también se analizó la actividad luciferasa en presencia y ausencia de

VRK2B de los vectores reporteros de luciferasa que contienen la región de respuesta a p53 del

promotor de Bax, 14-3-3σ, p21 o Mdm2, todos ellos acoplados al gen de la luciferasa. Sin

embargo, sólo observamos un incremento similar al del reportero sintético en el caso del gen

Mdm2 (Fig. 39C).

2.11. Efecto de VRK2B sobre la estabilización de mutantes de p53.

Existen muchas quinasas implicadas en la estabilización de p53 que responden a distintos

estímulos, y cada una de ellas fosforila un residuo determinado [220, 260, 383, 384] Así,

dependiendo del patrón concreto de fosforilación se podría determinar la actividad de p53, y por

tanto la respuesta concreta dirigida por el tipo de estímulo. Es previsible que una serie de

modificaciones actúen en conjunto para asegurar una correcta activación de p53. Sin embargo,

la proporción relativa de residuos fosforilados y la consecuencia funcional sobre p53 en un

determinado momento como respuesta a un estímulo no se conocen, aunque se sabe que el

patrón de fosforilación de p53 cambia a lo largo del ciclo [385], quimioterapia [315], o

senescencia [314]. Por tanto, VRK2B podría estar colaborando con otras quinasas para activar

p53, es decir que quizás sólo la fosforilación de VRK2B no sería suficiente para activar a p53,

necesitando la actuación de otras quinasas y viceversa. Como es el caso de caseína quinasa I la

cual fosforila p53 en treonina 18 pero necesita que previamente el residuo serina 15 haya sido

fosforilado [301]. Chk2 también fosforila p53 en T18 y también parece requerir previamente la

fosforilación en serina 15 [317].

HA-VRK2B

wt T18A S15AS20AS15/T18/

S20A- + - + - + - + - + - + - +

p53

β-actinaHA

S15/T18A S15/S20AIB

p53

Figura 40. Acumulación de mutantes en sitios de fosforilación de p53 por VRK2B. La línea celular H1299 se co-transfectó con los plásmidos para la expresión de p53 silvestre o con las sustituciones indicadas (25 ng) y con o sin pCEFL-HA-VRK2B (4 µg). Posteriormente se prepararon los extractos celulares con tampón RIPA y se analizaron mediante western blot con los anticuerpos específicos correspondientes.

87

Resultados

Para comprobar si VRK2B necesitaba de la fosforilación previa de otros residuos de p53 o

colaboraba con otras quinasas se analizó el efecto que produce la sobre-expresión de VRK2B

sobre la estabilidad de mutantes de p53 con sustituciones simples o combinadas en distintos

residuos serina o treonina que son fosforilados por otras quinasas en respuesta a estrés. Los

vectores de expresión de p53 (silvestre o mutante) se transfectaron solos o combinados con

pCEFL-HA-VRK2B en H1299 (Fig. 40). Aparte de la acumulación tanto de p53 silvestre como

del mutante p53T18A, VRK2B también induce la acumulación, aunque en distinta medida, de

los mutantes que contienen la sustitución serina 15 alanina (S15A), serina 20 alanina (S20A) y

del doble mutante serina 15/20 alanina (S15/20A). Solamente se deja de apreciar este efecto con

el doble mutante serina 15/18 alanina, y el triple mutante serina 15/18/20 alanina

(S15/20A/T18A), aunque los niveles de expresión de estos mutantes ya son bastante altos y

puede que no podamos conseguir un efecto acumulativo mayor en presencia de VRK2B por

tener una gran estabilidad. En general, auque la cantidad de ADN en las transfecciones ha sido

la mima para cada mutante, se observa que los niveles de expresión de partida de cada mutante

son distintos, y suponemos que se debe a que las propiedades de estabilidad de cada mutante

son diferentes. Pero podemos deducir que sólo cuando las mutaciones en serina 15 y en serina

20 están en combinación con la treonina 18 se pierde el efecto de VRK2B sobre p53, lo que

sugiere un posible efecto cooperativo entre VRK2B y otras quinasas que fosforilan a p53 en

serina 15 ó 20. Según estos datos, VRK2B podría dirigir la acumulación de p53 mutado en

treonina 18 a través de algún efecto mediado por modificaciones en otros residuos (serina 15 o

serina 20) aunque no mediante una fosforilación directa, mientras que los mutantes en serina 15

ó 20 se acumularían por el efecto de la fosforilación directa en treonina 18 por parte de VRK2B.

Por eso, sólo cuando se impide la fosforilación de alguno de estos residuos en combinación con

treonina 18 se eliminaría el efecto de VRK2B sobre la estabilidad de p53.

2.12. La sobre-expresión de VRK2B aumenta apoptosis en células que expresan p53.

Puesto que no conocemos el estímulo inductor de la actividad de VRK2B, realizamos

experimentos de sobre-expresión de esta quinasa en la línea celular tumoral que expresa p53

silvestre A549. Se transfectaron transitoriamente con el plásmido pEGFP-VRK2B, que codifica

para la quinasa unida al epítopo GFP (proteína verde fluorescente), y en paralelo se

transfectaron con el plásmido pEGFP, que codifica sólo para GFP. A las 48 horas después de la

transfección se analizó por citometría de flujo el perfil de ciclo de las células positivamente

transfectadas (marcadas con GFP) usando como control negativo células transfectadas con GFP.

Se observó que en aquellas células que expresaban GFP-VRK2B aumentaba la población de

células apoptóticas hasta un 40% (Fig. 41). Por lo tanto, este aumento de apoptosis podría

significar que la activación de VRK2B tendría un fenotipo de inducción de apoptosis

dependiente de p53.

88

Resultados

Control GFP GFP-VRK2B

0

1020304050

6070

80

APOPTOSIS G1 S G2/M

ControlGFPGFP-VRK2B

*

*

Eve

ntos

Contenido en ADN Contenido en ADN Contenido en ADN

Figura 41. Perfil de ciclo celular en A549 en presencia de VRK2B sobre-expresada. Perfil de ciclo celular según tinción con ioduro de propidio de la línea celular A549 en ausencia y presencia de GFP-VRK2B seleccionadas por FACS. La población indicada como control no ha sido transfectada. * p <0,01.

89

Resultados

3. VRK2 COMO MODULADOR DE LA CASCADA DE FOSFORILACIÓN DE JNK.

3.1. Localización subcelular de JIP1.

Otra vía de señalización comúnmente relacionada con procesos de proliferación, aunque

también diferenciación y muerte celular es la vía de las MAPKs. Estas vías se caracterizan por

transformar señales generadas en la membrana en respuestas celulares específicas, y son

activadas por numerosos estímulos extracelulares desde factores de crecimiento hasta distintos

tipos de estrés como radiación ionizante, lesiones isquémicas, etc. Se ha observado que VRK1

participa en estas rutas de señalización, en concreto VRK1 coopera con JNK en la activación

transcripcional de c-Jun y ATF2 [27, 28].

Recientemente se ha descrito la familia JIP de proteínas de anclaje para la vía de JNK. Estas

proteínas interaccionan con JNK y otras MAPKs facilitando la activación de la vía de

señalización en respuesta a determinados tipos de estrés u otras señales [37], y permitiendo una

regulación no sólo temporal sino también espacial de la vía de señalización. Se sabe que JIP1 se

regula por fosforilación por JNK, aunque se ha observado la fosforilación in vivo de JIP1 en

residuos que no son fosforilados por JNK [190]. Esto significa que JIP1 puede ser regulado

también por otras quinasas todavía no descritas.

JIP

1C

alne

xina

DA

PIM

ezcl

a

WS1 MCF7Cos1

JIP

1M

itoTr

acke

rD

API

Mez

cla

WS1 MCF7Cos1A B

Figura 42. Co-localización de JIP1 con orgánulos citoplasmáticos. Co-localización específica de JIP1 con orgánulos citoplasmáticos determinada en tres líneas celulares. A) JIP1 detectado con un anticuerpo policlonal (verde) y las mitocondrias marcadas con el reactivo MitoTracker Red CMXRos de Molecular Probes (rojo). B) JIP1 detectado con un anticuerpo policlonal específico (rojo) y el retículo endoplásmico identificado con el anticuerpo monoclonal específico para calnexina (verde). En azul tinción nuclear con DAPI. La barra indica 50µm.

90

Resultados

JIP1 que se expresa de forma ubicua, aunque principalmente en neuronas, células

neuroendocrinas, pulmón y riñón [167]. Es una proteína citoplasmática en condiciones normales

pero tras un estímulo parece translocarse y presenta una localización perinuclear [37, 166, 180,

181]. También se ha descrito asociada a membranas en células neuronales [175]. Esta

localización sugiere que en otros tipos celulares JIP1 podría co-localizar con la forma unida a

membranas de VRK2A.

Para comprobar esta hipótesis, y antes de estudiar una posible interacción entre estas dos

proteínas, previamente se analizó la localización subcelular de JIP1 endógeno en tres líneas

celulares distintas, en fibroblastos de mono Cos1, fibroblastos humanos WS1 y en células

tumorales de carcinoma de mama MCF7. Se usó calnexina como marcador de retículo

endoplásmico y el reactivo Mitotracker como marcador de mitocondrias. En las tres líneas

celulares JIP1 tiene un patrón reticulado y perinuclear, y co-localiza con ambos marcadores de

retículo y mitocondria, lo que sugería que JIP1 se localizaba próximo a estos orgánulos (Fig.

42A y B). La co-localización en mitocondria era más pronunciada en células Cos1, y más débil

en MCF7. Sin embargo, la co-localización con calnexina tenía un patrón bastante más similar en

las tres líneas celulares, aunque también parecía ser más evidente en Cos1 y MCF7. Este patrón

de localización es bastante similar al expuesto anteriormente para VRK2 endógena (Fig. 15 y

16). La proteína JIP1 no contiene ninguna región transmembrana conocida, por consiguiente la

asociación con estos orgánulos podría ser mediada por otras proteínas ancladas a estas

membranas y que a su vez interaccionan con JIP1 acercándolo a su vez a estos orgánulos.

3.2. VRK2A y VRK2B sobre-expresadas co-localizan con JIP1 endógeno.

Para comprobar la posible co-localización de JIP1 endógeno y las distintas isoformas de VRK2,

puesto que todavía no había anticuerpos monoclonales específicos para cada isoforma de VRK2

y los anticuerpos que reconocen JIP1 también eran policlonales, fue necesario transfectar una de

las proteínas. HA-VRK2A y B fueron transfectadas en Cos1 y se detectaron con un anticuerpo

monoclonal anti-HA. JIP1 endógeno fue detectado con los anticuerpos policlonales específicos.

En la figura 43 se observa de nuevo el patrón reticulado de JIP1 que coincide en parte con la

localización de VRK2A. En el caso de VRK2B, cuya señal es más difusa en el citosol, también

parece co-localizar, aunque la señal de co-localización es menor que para VRK2A. Estos datos

sugerían que posiblemente existía una interacción física in vivo entre JIP1 y las dos isoformas

de VRK2.

91

Resultados

3.3. VRK2A y VRK2B interaccionan con la región C-terminal de JIP1.

Como se ha dicho anteriormente es posible que VRK2A y B interaccionen de forma estable con

JIP1. Para comprobar esta conjetura se co-transfectaron células Cos1 con un plásmido de

expresión eucariótica que codifica para GST-JIP1 [166] en presencia o ausencia de los

plásmidos pCEFL-HA-VRK2A y pCEFL-HA-VRK2B, así como la forma inactiva de cada una

de estas quinasas (HA-VRK2AKD y HA-VRK2BKD, que contienen la sustitución K169E en el

dominio catalítico). Los extractos celulares fueron incubados con la resina Glutation sefarosa

con el objetivo de precipitar aquellas proteínas unidas a GST-JIP1. Previamente se comprobó la

expresión de cada una de las construcciones en los extractos celulares por western blot (Fig. 44),

y posteriormente se detectaron las proteínas asociadas a GST-JIP1 por western blot con los

anticuerpos indicados. Observamos que claramente las dos isoformas de VRK2 interaccionaban

de forma estable con GST-JIP1, y además la actividad quinasa no era necesaria para esta

interacción ya que la quinasas inactivas se asociaban de igual forma que las activas.

Posteriormente y con el objetivo de encontrar la región de JIP1 responsable de esta asociación

se llevó a cabo un experimento similar, pero en lugar de la proteína completa se usaron

plásmidos que codifican para distintos fragmentos de JIP1 unidos a GST. Como se observa en la

figura 45 la región de unión a JNK (JBD, JNK binding domain) no está implicado en esta

interacción ya que el mutante de JIP1 que no se une a JNK (JIP1-∆JBD) interacciona de igual

forma que JIP1 con VRK2A y B (Fig. 45A y B). Tampoco está implicada la región N-terminal

HA-VRK2A HA-VRK2B

HA

JIP1

DAP

IM

ezcl

a

Figura 43. Co-localización subcelular de JIP1 endógeno con HA-VRK2A y HA-VRK2B. Co-localización específica de HA-VRK2A y HA-VRK2B expresadas exógenamente en Cos1, detectadas con un anticuerpo monoclonal anti-HA (verde), con JIP1 endógeno detectado con un anticuerpo policlonal específico para JIP1 (rojo). En azul la tinción nuclear con DAPI. La barra indica 50µm.

92

Resultados

(Fig. 45C). La región mínima responsable de esta interacción está comprendida entre los

residuos 471 y 660, puesto que es la región mínima del dominio C-terminal que interacciona

con VRK2A y B (Fig. 45D y E), y que está implicada en la interacción con las MAPKs MLK y

DLK3, y cae fuera de la región de interacción con MKK7 (aminoácidos 282 a 471) y JNK

(aminoácidos 127 a 282) [37].

También cabe destacar que VRK2A parece unirse más eficientemente que VRK2B a diferentes

construcciones que codifican para JIP1 completo o fragmentos de éste, pues en los western blots

de los precipitados la señal correspondiente a VRK2A es más fuerte que la de VRK2B (Fig. 45

A, B, C, D), excepto en el caso del fragmento C-terminal GST-JIP1(471-660) (Fig. 45E), en el

que la señal de VRK2B es más fuerte. Probablemente, la interacción es más fuerte con VRK2A

(508 aminoácidos) debido a que la región de interacción, que quizás corresponda al extremo C-

terminal, pueda estar mejor plegada que en el caso de VRK2B (397 aminoácidos).

3.4. VRK2A y VRK2B interaccionan con JIP1 por su dominio N-terminal.

El hecho de que ambas isoformas interaccionen con JIP1 indicaba que la unión entre estas

proteínas estaba mediada por una región común a ambas quinasas. Teniendo en cuenta que

VRK2A y B se diferencian en el extremo C-terminal, la interacción debe estar mediada por el

dominio N-terminal, y si no implica al dominio catalítico, debería ser una región comprendida

entre los aminoácidos 300 y 395. Para confirmar esta hipótesis se realizaron varias

construcciones en el vector pCEFL que codifican para los fragmentos de VRK2 que

comprenden los aminoácidos 1-320, 1-115, 256-508, y 364-508 unidos al epítopo HA. Se co-

transfectaron cada una de estas construcciones con GST-JIP1 y se llevó a cabo un ensayo de

precipitación de proteínas unidas a GST como en el apartado anterior (Fig. 46).

HA (HA-VRK2A)

IB

GST (GST-JIP1)

Extracto total

HA (HA-VRK2B)

HA-V

RK2A

WT

HA-V

RK2A

KDHA

-VRK

2BW

THA

-VRK

2BKD

HA-V

RK2A

WT+

GST

-JIP

1

HA-V

RK2A

KD+G

ST-J

IP1

HA-V

RK2B

WT+

GST

-JIP

1

HA (HA-VRK2A)GST (GST-JIP1)

HA (HA-VRK2B)Precipitado con Glutation

Sefarosa

β-actina

HA-V

RK2B

KD+G

ST-J

IP1

GST

-JIP

1

Figura 44. Interacción de JIP y VRK2A y VRK2B. Se transfectaron células Cos1 con 5 µg de pCEFL-HA-VRK2A y B, silvestre (WT) o inactiva (KD) y 3 µg de pGBG-GST-JIP1. 48 horas después de la transfección se prepararon extractos totales con el tampón indicado en la sección de materiales y métodos, y se usó 1 mg de proteína para precipitar las proteínas de fusión con GST con la resina Glutation Sefarosa. Se analizó la proteína precipitada por western blot con anticuerpos específicos para HA y GST. La expresión de cada proteína también se detectó en los extractos totales.

93

Resultados

HA-VRK2AHA-VRK2B

HA-VRK2(1-320)HA-VRK2(256-508)HA-VRK2(364-508)

Región TransmembranaDominio quinasa

+++--

HA

-VR

K2A

HA

-VR

K2B

HA

-1-3

20

HA

-256

-508

HA-

364-

508

--

Extracto total Precipitado con Glutation Sefarosa

IB

GST-JIP1

HA (HA-VRK2)

JIP1

GST (GST-JIP1)

HA

-VR

K2A

HA

-VR

K2B

HA

-1-3

20

HA

-256

-508

HA

-364

-508

--

Región de interacción de JIP1 en VRK2

Figura 46. JIP1 interacciona con el dominio N-terminal de VRK2A y VRK2B. Se transfectaron células Cos1 con GST-JIP1 y distintas construcciones de pCEFL-HA-VRK2A y B completas o con los aminoácidos indicados. 48 horas después de la transfección se prepararon extractos y se precipitaron al igual que en ensayos anteriores. Se analizó la proteína precipitada por western blot con anticuerpos específicos para HA y GST. La expresión de cada proteína también se detectó en los extractos totales.

GST-JIP1WTGST-JIP1∆JBD

GST-JIP1(1-282)GST-JIP1(283-660)GST-JIP1(471-660)

Región de interacción de VRK2 en JIP1

HA-V

RK2A

WT

HA-V

RK2A

KDHA

-VRK

2BW

THA

-VRK

2BKD

HA-V

RK2A

WT

HA-V

RK2A

KDHA

-VRK

2BW

THA

-VRK

2BKD

HA-V

RK2A

WT

HA-V

RK2A

KDHA

-VRK

2BW

THA

-VRK

2BKD

HA-V

RK2A

WT

HA-V

RK2A

KDHA

-VRK

2BW

THA

-VRK

2BKD

HA-V

RK2A

WT

HA-V

RK2A

KDHA

-VRK

2BW

THA

-VRK

2BKD

--- --- --- --- --- ---

GST-JIP1-WT GST-JIP1∆JBD GST-JIP1(1-282) GST-JIP1(283-660) GST-JIP1(471-660)

HA (VRK2A)

IB

GST (JIP1)

HA (VRK2B)

HA (VRK2A)GST (JIP1)

HA (VRK2B)


Extracto Total

A B C D E

F

Dominio JBDDominio SH3

Dominio PTB

JIP1WTVRK2++-

++

Figura 45. VRK2A y VRK2B interaccionan por el dominio C-terminal de JIP1. Se transfectaron células Cos1 con pCEFL-HA-VRK2A y B, silvestre (WT) o inactiva (KD) y distintas construcciones de GST-JIP1: A) completa, B) sin el dominio de unión a JNK (∆JBD: aminoácidos 127 a 282), C, D, E) o con los aminoácidos indicados. 48 horas después de la transfección se prepararon extractos y se precipitaron al igual que en el ensayo anterior. Se analizó la proteína precipitada por western blot con anticuerpos específicos para HA y GST. La expresión de cada proteína también se detectó en los extractos totales. F) Representación esquemática de cada mutante de deleción y el sitio de interacción de JIP1 con VRK2A y B.

94

Resultados

3.5. VRK2A y VRK2B fosforilan JIP1 en la región N-terminal.

El complejo formado por JIP1-MLK-MKK7-JNK es un módulo dinámico, es decir, el complejo

no parece que esté siempre completo en la célula, sino que la activación de las quinasas que

forman parte de él es crucial para su formación, de este modo se regula por la fosforilación por

JNK en los residuos treonina 103 y 205 [189, 190], aunque también se ha observado la

fosforilación de JIP1 en residuos que no son fosforilados por JNK. Esto significa que JIP1

puede ser regulado también por otras quinasas todavía no descritas.

Para determinar si JIP1 podía ser una diana de fosforilación de la actividad quinasa de VRK2, se

llevó a cabo un ensayo quinasa in vitro con ambas isoformas, usando como sustrato varias

proteínas de fusión a GST que corresponden a los fragmentos de JIP1 que comprenden los

aminoácidos 1-127, 128-282 y 283-660 y también GST como control negativo. Las dos

isoformas fosforilan la región N-terminal de JIP1 (aminoácidos 1 al 127) (Fig. 47A), pero no

corresponde a la región de unión de JNK, localizada entre los aminoácidos 128 al 282.

P-Ser

P-Thr

32P PAAfríos

Origen-102050

80110

Ser Thr-102050

80110

Ser Thr

GS

T-JI

P1

(1-1

27 a

a)

GS

T-JI

P1

(128

-282

aa)

GS

T-JI

P1

(283

-660

aa)

GST

GS

T-JI

P1

(1-1

27 a

a)

GS

T-JI

P1

(128

-282

aa)

GS

T-JI

P1

(283

-660

aa)

GST

75 _50 _

37 _

25 _

KD

GST-VRK2A

GST-JIP1(1-127aa)

75 _50 _

37 _

25 _Coomassie

GST-JIP1(128-282aa)

GST-JIP1(283-660aa)

GST

GST-VRK2B

GST-JIP1(1-127aa)GST-JIP1(128-282aa)

GST-JIP1(283-660aa)

GST32P

A B

Figura 47. Fosforilación de JIP1 in vitro por VRK2A y VRK2B. A) Fosforilación in vitro de proteínas de fusión a GST que codifican para distintos fragmentos de JIP1 por las quinasas VRK2A y VRK2B. En el panel de la derecha se observa la tinción de las proteínas con azul de Coomassie y en el de la izquierda la incorporación de radiactividad durante el ensayo quinasa por exposición a película de rayos X. B) Análisis de fosfoaminoácidos de la proteína GST-JIP1(1-127 aa) fosforilado por la actividad quinasa de VRK2A y B. De forma representativa se muestra la incorporación de radioactividad en JIP1 (1-127 aa) fosforilado por VRK2A, puesto que para el caso de VRK2B es igual, y el revelado de los aminoácidos totales con ninhidrina (PAA fríos). A la derecha se muestra la cuantificación de incorporación de radiactividad en ensayos independientes.

95

Resultados

Para confirmar el tipo de residuo que era fosforilado se llevó a cabo un ensayo de

fosfoaminoácidos a partir de proteínas de fusión GST-JIP1(1-127aa) fosforiladas por VRK2A y

B. La fosforilación se detectó principalmente en residuos de serina pero también en residuos de

treonina (Fig. 47B), y según la gráfica de cuantificación (Fig. 47B, panel derecha) podrían ser

fosforiladas como mínimo dos serinas y una treonina.

3.6. JIP1 interacciona con la MAP3K TAK1.

Las MAPKs TAK1 y MKK7 forman parte de la vía de señalización de JNK, y cada una de ellas

ocupa una posición diferente en la cascada de fosforilación. En muchas de estas cascadas de

fosforilación además participan proteínas de anclaje de forma que la cascada de fosforilación

está de algún modo dirigida o favorecida de forma espacial por ésta proteína, como es el caso de

JIP1, la cual se une a MLK o DLK (MAP3Ks, que corresponde al primer nivel), MKK7

(MAPKKs, segundo nivel) y JNK (MAPKs, que ocupa la tercera o última posición en este

complejo de señalización) [37, 166, 167]. Este módulo de señalización está implicado en la

señalización de JNK en respuesta a estímulos como estrés excitotóxico o anoxia en neuronas, o

citoquinas como IL-1β y TNF-α en células secretoras del páncreas, pero no está relacionado con

la estimulación de JNK por radiación ultravioleta o anisomicina, que son estímulos clásicos que

activan a JNK [166, 180, 199, 203]. Otra quinasa que forma parte de la vía de señalización de

JNK a través de la fosforilación por MKK4 o MKK7 es TAK1 [76-78, 121], y está implicada en

la activación de AP1 y NFκB como respuesta a citoquinas como IL-1β, TGFβ, endotoxinas

como LPS y estrés celular [76-78, 117, 119, 120, 129]. TAK1 ha sido descrita en el “quinoma”

de Manning y colaboradores como una MAP3Ks, y aunque no forma parte claramente de

ninguna de las familias de quinasas que forman este dendrograma, está lejanamente relacionada

con la familia de MAP3Ks MLKs, pues ésta diverge de forma temprana de la rama principal

formada por las quinasas MLK [3]. Se ha descrito que las proteínas de la familia MLK son las

MAP3Ks que forman parte del módulo de señalización formado por JIP1, MKK7 y JNK [37,

83, 166], pero a pesar de existir similitud entre estas quinasas y TAK1 nunca se ha comprobado

la interacción de ésta con JIP1, aunque se ha determinado mediante ensayos de sobre-expresión

que TAK1 no interacciona con JIP3 [194].

Por tanto decidimos comprobar si TAK1 y JIP1 interaccionaban y formaban parte del mismo

complejo de señalización. Para ello se llevó a cabo un ensayo de interacción por precipitación

de proteínas unidas a GST, co-transfectando en células Cos1 los plásmidos que codifican para

HA-TAK1, el cofactor TAB1 unido al epítopo Flag, necesario para la activación de TAK1 [140-

143], y varias construcciones de GST-JIP1 que codifican para la proteína completa o fragmentos

de ésta. Efectivamente se corroboró que TAK1 interaccionaba con JIP1 de forma estable, a

través de la región de JIP1 que comprende los aminoácidos 282 al 471 (Fig. 48). Esta región es

96

Resultados

responsable de la interacción de JIP1 con MKK7 (MAP2K), la cual ocupa el segundo lugar en

la cascada de fosforilación, mientras que TAK1 ocupa el primer lugar. Si esto es así físicamente

en el módulo de señalización, y puesto que la región comprendida entre los aminoácidos 282 al

471 es bastante grande, probablemente MKK7 y TAK1 no ocupen la misma región, además

TAK1 debería interaccionar por una región próxima al dominio C-terminal de JIP1 al igual que

MLK. No obstante, también ha sido descrito que TAK1 interacciona de forma directa con JNK

(la cual ocuparía la última posición e interacciona por la región N-terminal de JIP1) y la activa

de forma independiente a MKK4/7 [138].

3.7. Efecto de VRK2 sobre la interacción de JIP1 con JNK, MKK7 y TAK1.

Puesto que VRK2A y B fosforilan e interaccionan con JIP1, sospechamos que VRK2A o B

podrían afectar a la interacción de JIP1 con alguna de las MAPKs mencionadas en el apartado

anterior, tal como ocurre con la interacción y/o fosforilación por otras quinasas que pueden o

no formar parte del complejo, y que cambian la afinidad de JIP1 por las MAPK a las cuales se

une, como ocurre con JNK o Akt [175, 190-192]. Por consiguiente se analizó el efecto de ambas

isoformas de VRK2, usando tanto la forma quinasa activa como la inactiva, sobre cada una de

las tres MAPKs.

La primera interacción examinada fue con TAK1. Para ello se co-transfectaron células Cos1 con

pCMV-HA-TAK1 junto con su activador pCMV-Flag-TAB1 y plásmidos que codifican para

WT

∆JB

D

1-28

2

282-

660

471-

660

-

GST-JIP1

GST-JIP1WTGST-JIP1∆JBD

GST-JIP1(1-282)GST-JIP1(283-660)GST-JIP1(471-660)

GST (GST-JIP1)

HA (HA-TAK1)

IB


WT

∆JB

D

1-28

2

282-

660

471-

660

-

Región de interacción de TAK1 en JIP1

GST-JIP1HA-TAK1 + Flag-TAB1

TAK1

Dominio JBDDominio SH3 Dominio PTB

++-

+-

Figura 48. TAK1 interacciona por el dominio central de JIP1. Se transfectaron células Cos1 con plásmidos que codifican para HA-TAK1, el cofactor Flag-TAB1 y distintas construcciones de GST-JIP1: completa, sin el dominio de unión a JNK (∆JBD: aminoácidos 127 a 282) o con los aminoácidos indicados. Los extractos celulares fueron tratados como en ensayos anteriores.

97

Resultados

GST-JIP1 y cada una de las isoformas de HA-VRK2 silvestres o inactivas, y se llevó a cabo un

ensayo de interacción por precipitación de proteínas unidas a GST como en casos anteriores.

Previamente se analizó la expresión por igual de todas las proteínas en los extractos totales de

cada una de las combinaciones por western blot (Fig. 49, panel superior). A continuación

realizamos un ensayo de precipitación de proteínas de fusión con GST, usando la resina

Glutation sefarosa, y después analizamos por western blot las cantidades de HA-TAK1 y HA-

VRK2A/B que se habían precipitado junto con GST-JIP1. Observamos que JIP1 interaccionaba

con las dos quinasas, puesto que al precipitar JIP1 también precipitamos TAK1 y VRK2A o

VRK2B (Fig. 49, panel inferior). Sin embargo, la afinidad de JIP1 por TAK1 no estaba afectada

por ninguna de las formas de VRK2.

Posteriormente se llevó a cabo el mismo ensayo con MKK7, usando la construcción pCMV-

Flag-MKK7β1, quinasa que ocuparía la posición intermedia en el complejo de señalización. En

todas las combinaciones tanto VRK2 como MKK7 fueron detectadas como proteínas que

interaccionan con GST-JIP1, lo que sugiere que la sobre-expresión de las distintas formas de

VRK2 tampoco interfería en la afinidad de JIP1 por MKK7 (Fig. 50).

Por último se analizó la interacción de JIP1 y JNK, que se une a los aminoácidos 128 al 282 de

JIP1. Para ello se co-transfectaron células Cos1 con plásmidos que codifican para GST-JIP1,

HA-JNK y cada una de las isoformas de HA-VRK2 silvestres o inactivas. Tras comprobar en

extractos totales que la cantidad de Flag-JNK era igual en todos los puntos (Fig. 51, panel

superior), realizamos un ensayo de precipitación de proteínas de fusión con GST. A

HA (HA-TAK1)

IB

HA (HA-VRK2A)

HA-TAK1/TAB1HA-VRK2AWT

HA-VRK2BWT

+ + + + + + -- + + + + + -- - + - - - -- - - + - - -- - - - + - -- - - - - + -

GST (GST-JIP1)

GST-JIP1

HA (HA-VRK2B)

HA-VRK2AKD

HA (HA-TAK1)

GST(GST-JIP1)

HA-VRK2BKD

HA (HA-VRK2A)

HA (HA-VRK2B)

Extracto total


β-actina

Figura 49. Efecto de VRK2A y B sobre la interacción de TAK1 con JIP1. Se transfectaron células Cos1 con 3µg de pGBG-GST-JIP1, 50 ng de pCMV-HA-TAK1 + 50 ng de pCMVT-Flag-TAB1 y 5 µg de pCEFL-HA-VRK2A/B silvestres o inactivas. 48 horas después de la transfección se prepararon extractos totales y se usó 1 mg de proteína para precipitar las proteínas de fusión con GST con la resina Glutation sefarosa. Se analizó la proteína precipitada por western blot con anticuerpos específicos para HA, GST y β-actina. Los niveles de todas las proteínas se detectaron también en extractos totales.

98

Resultados

continuación analizamos las cantidades de Flag-JNK y HA-VRK2A/B que se habían precipitado

junto con GST-JIP1. Observamos una vez más que en presencia de VRK2A o VRK2B no había

cambios en la cantidad de Flag-JNK unida a JIP1 (Fig. 51, panel inferior). Como control

negativo se usó el mutante de JIP1 que no contiene la región de interacción con JNK (JIP1-

JBD) el cual interacciona con VRK2A y VRK2B pero no con JNK (Fig. 51, panel inferior).

Flag (Flag-MKK7)HA (HA-VRK2A)

Flag-MKK7β1HA-VRK2AWT

HA-VRK2BWT

+ + + + + + -- + + + + + -

- - + - - - -- - - + - - -- - - - + - -- - - - - + -

GST (GST-JIP1)

GST-JIP1

HA (HA-VRK2B)

HA-VRK2AKD

GST (GST-JIP1)

HA-VRK2BKD

HA (HA-VRK2A)HA (HA-VRK2B)

IB


Extracto totalβ-actina

Flag (Flag-MKK7)

Figura 50. Efecto de VRK2A y B sobre la interacción de MKK7β1 con JIP1. Se transfectaron células Cos1 con 3µg de pGBG-GST-JIP1, 1 µg de Flag-MKK7β1 y 5 µg de pCEFL-HA-VRK2A/B silvestres o inactivas. 48 horas después de la transfección se prepararon extractos totales y se usó 1 mg de proteína para precipitar las proteínas de fusión con GST con la resina Glutation sefarosa. Se analizó la proteína precipitada por western blot con anticuerpos específicos para HA, GST, Flag y β-actina. Los niveles de todas las proteínas se detectaron también en extractos totales.

Flag (Flag-JNK)

IB

HA (HA-VRK2A)

Flag-JNKHA-VRK2AWT

HA-VRK2BWT

- - - - - + -+ + + + + - -+ + + + + + +- + - - - - -- - + - - - -- - - + - - -- - - - + - -

GST (GST-JIP1)

GST-JIP1-WT

HA (HA-VRK2B)

HA-VRK2AKD

Flag(Flag-JNK)

GST (GST-JIP1)

HA-VRK2BKD

HA (HA-VRK2A)HA (HA-VRK2B)


β-actina

p-JNK

p-JNK

GST-JIP1-∆JBD

Extracto total

Figura 51. Efecto de VRK2A y VRK2B sobre la interacción de JNK con JIP1. Se transfectaron células Cos1 con 3 µg de GST-JIP1, 3 µg de Flag-JNK y 5 µg de pCEFL-HA-VRK2A y pCEFL-HA-VRK2B silvestres o inactivas. Y al igual que en los ensayos anterior, se analizó la proteína precipitada por western blot con anticuerpos específicos para HA, GST, p-JNK, Flag y β-actina. Los niveles de todas las proteínas se detectaron también en extractos totales.

99

Resultados

Sin embargo, decidimos ver el estado de fosforilación de JNK unida a JIP1, y por tanto su

estado de activación, usando un anticuerpo específico para JNK fosforilada en los residuos

treonina 183 y tirosina 185, que son los residuos fosforilados por MKK7 y MKK4. En primer

lugar observamos una fosforilación muy débil de JNK, probablemente debido a la ausencia de

estímulos que la activen, y tampoco observamos ningún cambio significativo del estado de

fosforilación de JNK unida a JIP1 en presencia de las quinasas VRK2A o B. Por lo tanto en

ninguno de los tres casos la presencia de VRK2A o VRK2B parecía interferir o competir en la

interacción de JIP1 con las MAPKs. Cabe destacar que en todos los casos JIP1 se une a todas

las quinasas, no obstante esto no quiere decir que formen parte del mismo complejo, ya que

podrían ser poblaciones independientes de JIP1-VRK2 y JIP1-MAPKs.

3.8. VRK2A y VRK2B interfieren en la activación de JNK unida a JIP1.

Aunque no observamos ningún cambio en la afinidad de JIP1 por JNK, ni en el estado de

fosforilación de ésta en presencia de VRK2, decidimos ver el estado de fosfororilación de JNK

al ser activada por la quinasa TAK1 como activadora de la cascada de fosforilación. Para lo cual

transfectamos células Cos1 con una cantidad fija de GST-JIP1 y de Flag-JNK, con cantidades

crecientes de pCEFL-HA-VRK2A y B silvestres o inactivas, y con plásmidos que codifican

para HA-TAK1 y Flag-TAB1. Tras comprobar en extractos totales que la cantidad de Flag-JNK

era igual en todos los puntos (Fig. 52, panel superior), realizamos un ensayo de precipitación de

Flag(Flag-JNK)

IB

HA (HA-VRK2)

Flag-JNK

+ + + + + + + + +- + + + + + + + +

+ + + + + + + + -- - 3 5 7 - - - -- - - - - 3 5 7 -

GST (GST-JIP1)

HA-TAK1/TAB1GST-JIP1

pp--JNKJNK

HA (HA-TAK1)

Flag(Flag-JNK)HA (HA-VRK2)

GST (GST-JIP1)

pp--JNKJNK

HA (HA-TAK1)

Extracto total


β-actina

HA-VRK2WT (µg)HA-VRK2KD (µg)

+ + + + + + + + +- + + + + + + + +

+ + + + + + + + -- - 3 5 7 - - - -- - - - - 3 5 7 -

HA-VRK2A HA-VRK2B

Figura 52. Efecto de VRK2A y VRK2B sobre el estado de fosforilación de JNK unida a JIP1. Se transfectaron células Cos1 con 3 µg de GST-JIP1, 3 µg de Flag-JNK, 50 ng de pCMV-HA-TAK1 + 50 ng de pCMVT-Flag-TAB1 y 5 µg de pCEFL-HA-VRK2A y pCEFL-HA-VRK2B silvestres o inactivas. 48 horas después de la transfección se prepararon extractos totales y se usó 1 mg de proteína para precipitar las proteínas de fusión con GST con resina de Glutation sefarosa. Se analizó la proteína precipitada por western blot con anticuerpos específicos para HA, GST, p-JNK, Flag y β-actina. Los niveles de todas las proteínas se detectaron también en extractos totales.

100

Resultados

proteínas de fusión con GST. A continuación analizamos el estado de fosfororilación de JNK

unida a JIP1. Observamos que en ausencia de TAK1 no había fosforilación de JNK, mientras

que en presencia de TAK1, JNK está fosforilada y por tanto es activa (Fig.52, panel inferior),

pero la presencia de VRK2A o VRK2B disminuía el estado de fosforilación de JNK por TAK1

unida a JIP1. Este efecto era dependiente de dosis de quinasa, aunque no dependía de la

actividad catalítica, ya que las quinasas inactivas también inducían una inhibición en la

fosforilación de JNK. Este efecto parecía ser más específico de la isoforma A puesto que la

inhibición de la fosforilación era más evidente en presencia de ésta que de VRK2B.

3.9. Interacción de VRK2 con TAK1.

En estos módulos las quinasas no sólo interaccionan con una molécula de anclaje, sino que

además se asocian simultáneamente entre ellas, lo que sugería que VRK2 podía interaccionar

con alguna de las MAPKs descritas anteriormente. Para abordar esta idea se llevaron a cabo

experimentos de interacción mediante precipitación de proteínas unidas a GST, esta vez ambas

isoformas de VRK2 unidas al epítopo GST. Se co-transfectaron células Cos1 con plásmidos que

codifican para GST-VRK2A y B, con TAK1 en presencia o ausencia de JIP1, el cual actuaría

como molécula intermediaria de la interacción, en el caso de que VRK2 no interaccionase

directamente con TAK1.

IB

Flag-TAB1HA-TAK1

+ + + + + + + + - + + -+ + - + + -+ - - + - -

GST-VRK2

T7-JIP1

HA (HA-TAK1)

JIP-1(T7-JIP1)

HA (HA-TAK1)


Extracto totalβ-actina

GST-VRK2

JIP-1(T7-JIP1)GST-VRK2

VRK2A VRK2BA B

VR

K2A

VR

K2B

1-32

025

6-50

8

364-

508

--


IB

GST-VRK2

VR

K2A

VR

K2B

1-32

0

256-

508

364-

508

--

+--++

Región de interacción de TAK1 en VRK2

GST

GST (GST-VRK2)

TAK1GST-VRK2AGST-VRK2B

GST-VRK2(1-320)

Región TransmembranaDominio quinasa

GST-VRK2(256-508)GST-VRK2(364-508)

HA (HA-TAK1)

Figura 53. VRK2A interacciona con TAK1. A) VRK2A interacciona de forma estable con TAK1. Se transfectaron células Cos1 con pCMV-HA-TAK1 + pCMVT-Flag-TAB1 y distintas construcciones de pCEFL-GST-VRK2A y B silvestres en presencia o ausencia de T7-JIP1. B) La interacción tiene lugar por el extremo C-terminal de VRK2A. Se transfectaron células Cos1 con pCMV-HA-TAK1 + pCMVT-Flag-TAB1 y distintas construcciones de pCEFL-GST-VRK2A y B completas o con los aminoácidos indicados. 48 horas después de la transfección se prepararon extractos y se precipitaron al igual que en ensayos anteriores. Se analizó la proteína precipitada por western blot con anticuerpos específicos para HA, JIP1 y GST. La expresión de cada proteína también se detectó en los extractos totales.

101

Resultados

Para ello se co-transfectaron plásmidos que codifican para cada forma de GST-VRK2, HA-

TAK1, Flag-TAB1 y T7-JIP1 y se llevó a cabo un ensayo de interacción por precipitación de

proteínas unidas a GST como en casos anteriores. Previamente se analizó la expresión por igual

de todas las proteínas en los extractos totales de cada una de las combinaciones por western blot

(Fig. 53A). Se observó que VRK2A interaccionaba de forma estable con TAK1 sin la

necesidad de JIP1 como molécula intermediaria, ya que HA-TAK1 era precipitado con GST-

VRK2A igualmente en presencia o ausencia de T7-JIP1. Por el contrario VRK2B sólo

interaccionaba con TAK1 en presencia de JIP1 (Fig. 53A).

Esto nos llevó a pensar que quizás VRK2A interaccionaba con TAK1 por su extremo C-

terminal, ya que es la zona no común entre VRK2A y B. Para comprobarlo se llevó a cabo un

ensayo de interacción co-transfectando células Cos1 con plásmidos que codifican para HA-

TAK1, el cofactor Flag-TAB1, y distintos fragmentos de la proteína VRK2 unidos a GST (1-

320, 256-508 y 364-508 de VRK2A). Observamos que TAK1 interaccionaba con el dominio C-

terminal específico de VRK2A (Fig. 53B).

3.10. VRK2A y VRK2B inhiben la activación de la vía de AP1 dependiente de TAK1.

El complejo que forma JIP1 con diferentes MAPKs es un módulo de transmisión de señales

generadas por varios tipos de estímulos y receptores. Dado que VRK2A o VRK2B inhiben la

transmisión a través del complejo formado por TAK1, MKK7, JNK y JIP1, por consiguiente

decidimos comprobar si VRK2 podría modular la transmisión de señales de este complejo

basándonos en un ensayo luciferasa para medir la actividad transcripcional dependiente del

complejo de señalización endógeno asociada al reportero pAP1-Luc, que contiene sitios de

respuesta para AP1. Transfectamos células Cos1 con el reportero sintético de luciferasa pAP1-

Luc y la combinación con HA-TAK1 + Flag-TAB1 con el objetivo de transactivar el complejo

AP1, y además se transfectaron cantidades crecientes de HA-VRK2A y HA-VRK2B, tanto las

formas silvestres y las inactivas, así como el plásmido pSUPERIOR-VRK2-230 que codifica

para el ARN de interferencia específico para VRK2, como control se usó el plásmido

pSUPERIOR-VRK1-01 que codifica para un ARN específico para VRK1, pero no para VRK2

(Fig. 54). Observamos que tanto la forma silvestre como la inactiva de HA-VRK2A y HA-

VRK2B reprimían la activación del reportero pAP1-Luc dependiente de TAK1, por tanto en

este caso el efecto tampoco era dependiente de la actividad quinasa, sin embargo, si era

dependiente de la dosis de quinasa, ya que a medida que aumentaba la dosis de éstas disminuía

la transactivación de AP1, pero a medida que aumentaba la dosis del ARN de interferencia

específico para VRK2, y por tanto disminuía la dosis de quinasa entonces aumentaba de nuevo

la transactivación de AP1, cosa que no ocurría con el ARN de interferencia inespecífico.

102

Resultados

3.11. Activación de TAK1 por hipoxia, TGFβ e IL-1β.

Puesto que la sobre-expresión de VRK2A o VRK2B interfería en la señalización de AP1

cuando éste era activado por TAK1, decidimos probar que tipos de estímulos podían activar o

cooperar con TAK1. Para lo cual transfectamos células Cos1 con el reportero de actividad

transcripcional pAP1-Luc en combinación con TAK1 y TAB1, y tratamos las células con las

02468

10121416181920

pAP1-L

uc

pAP1-L

uc/TAK1

pAP1-L

uc/TAK1+

IL-1β

pAP1-L

uc/TAK +T

GFβ

pAP1-L

uc/TAK1+

DFO

pAP1-L

uc/TAK1+

UV

Activ

idad

luci

fera

sa

(incr

emen

to re

lativ

o)

*

*

1

2

3

4

5

6

7

8

9VRK2AWT

VRK2BWT

- - 0,1 0,25 1 - - - 1 1 1 1 VRK2WT (µg)- - - - - 0,1 0,25 1 - - - - VRK2KD (µg)- - - - - - - - 0,1 0,25 1 - siVRK2 (µg)- - - - - - - - - - - 1 siVRK1 (µg)

VRK2WT VRK2KDVRK2WT+

siVRK2

**

***

***

*

*** ******

**

***

* *

*** ******

- + + + + + + + + + + + TAK1/TAB1+ + + + + + + + + + + + pAP1-Luc

VRK2AKDVRK2AWT

+siVRK2

VRK2BKDVRK2BWT

+siVRK2

Act

ivid

ad lu

cife

rasa

(in

crem

ento

rela

tivo)

VRK2AWT+siVRK1

VRK2BWT+siVRK1

Figura 54. Represión de la transactivación de AP1 dependiente de TAK1 por VRK2A y VRK2B. Se transfectaron células Cos1 con 0,8 µg de pAP1-Luc, 10 ng de pRL-TK, 50 ng de pCMV-HA-TAK1 + 50 ng pCMVT-Flag-TAB1 y las cantidades indicadas de pCEFL-HA-VRK2A/B silvestre, inactiva y pSUPERIOR-VRK2-230 que codifica para el ARN de interferencia de VRK2 y como control se usó pSUPERIOR-VRK1-01 que codifica para el ARN de interferencia específico para VRK1. La actividad luciferasa se midió 48 horas después de la transfección y se normalizó con el control de la Renilla-luciferasa. Se representa la media de seis experimentos independientes, analizados mediante la T de Student con respecto a la actividad del reportero activado por TAK1. *p<0,05; **p<0,005; ***p<0,0005.

Figura 55. Activación de la actividad transcripcional de AP1 dependiente de TAK1. Se transfectaron células Cos1 en placas de 6 pocillos con 0,8 µg del plásmido reportero sintético pAP1-Luc, 10ng de Renilla y 50 ng de pCMV-HA-TAK1 + 50 ng pCMVT-Flag-TAB1. Tras 24 horas se cambió el medio a DMEM 0% suero, y tras 6h se les añadió 10 ng/ml de TGFβ o 10 ng/ml de IL-1β (ambos de Peprotech Ec.) en aquellas tratadas con estas citoquinas. En el resto, 16 horas antes de recoger los extractos se añadió 300µM DFO (de Sigma) o se expuso las células a radiación UV (80J/m2). La actividad luciferasa se midió 48 horas después de la transfección y se normalizó con el control de la Renilla-luciferasa. Se representa la media de al menos tres experimentos independientes, analizados mediante la T de Student con respecto a la actividad del reportero activado por TAK1. *p<0,05.

103

Resultados

citoquinas TGFβ e IL-1β, las cuales se ha descrito que activan TAK1 [76-78, 117-120], y con

otros tipos de estímulos menos conocidos como radiación UV (80J/m2) o Deferoxamina (DFO),

un quelante de hierro que inhibe (al igual que la hipoxia) las hidroxilasas de HIF (EGLNs) y por

tanto mimetiza hipoxia. Observamos que la radiación UV no cooperaba con TAK1 en la

transactivación de AP1, tanto TGFβ como IL-1β activaban a TAK1 tal como se había descrito y

de todos los estímulos probados la Deferoxamina producía la mayor activación del reportero

(Fig. 55).

3.12. VRK2A y VRK2B reprimen la activación de la vía de TAK1 por IL-1β e hipoxia.

Puesto que la transactivación de AP1 por IL-1β e hipoxia a través de TAK1 parecía depender de

la formación de un módulo de señalización dependiente de JIP1-JNK, y ya que VRK2A y

VRK2B inhibían la respuesta de activación de TAK1, decidimos comprobar si la sobre-

expresión de VRK2A y VRK2B también inhibía el efecto cooperativo de TAK1 junto con IL-

1β. Para ello se llevó a cabo un ensayo de actividad transcripcional como se ha descrito

anteriormente, en presencia de HA-VRK2A y HA-VRK2B, tanto de las formas silvestres,

inactivas, así como el ARN de interferencia específico para VRK2 (Fig. 57 y 58). Observamos

que la sobre-expresión de ambas quinasas claramente inhibían la activación de AP1 por estos

estímulos, y este efecto no dependía de la actividad quinasa de VRK2, puesto que las quinasas

inactivas también inducían este efecto, aunque no de forma tan eficaz como las quinasas

silvestres. Además esta inhibición dependía de la dosis de quinasa, ya que a medida que

incrementaba la quinasa sobre-expresada disminuía la activación del reportero, mientras que en

presencia del ARN de interferencia se recuperaba la activación del reportero.

02468

10121416182022 - JIP1-∆JBD

+ JIP1-∆JBD

+ + + + pAP1-Luc- - + + TAK1/TAB1- + - + DFO

*

**

*

Act

ivid

ad lu

cife

rasa

(in

crem

ento

rela

tivo)

IBJIP1-∆JBDHA(TAK1)Flag(TAB1)

pAP1-Luc + + + + + + + +

TAK1/TAB1 - - - - + + + +DFO - - + + - - + +

JIP1-∆JBD - + - + - + - +

Figura 56. La transactivación de AP1 dependiente de DFO y TAK1 es reprimida por el mutante de JIP1 que no interacciona con JNK. Se transfectaron células Cos1 en placas de 6 pocillos con 0,8 µg del plásmido reportero sintético pAP1-Luc, 10ng de Renilla, 50 ng de pCMV-HA-TAK1 + 50 ng pCMVT-Flag-TAB1 y 1µg de GST-JIP1-∆JBD. A las 16 horas antes de recoger los extractos se añadió 300µM DFO. La actividad luciferasa se midió 48 horas después de la transfección y se normalizó con el control de la Renilla-luciferasa. Se representa la media de tres experimentos independientes. Se analizaron con la T de Student. *p<0,05; **<0,005; ***p<0,0005. En la parte derecha del panel se muestra un western blot de los extractos celulares.

104

Resultados

- - 0,1 0,5 1 2 - - - - 2 2 2 2 VRK2WT (µg) - - - - - - 0,1 0,5 1 2 - - - - VRK2KD (µg) - - - - - - - - - - 0,1 0, 5 1 2 siVRK2 (µg)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

-IL-1β

+IL-1β +VRK2A+IL-1β +VRK2B

+ + + + + + + + + + + + + + pAP1-Luc- + + + + + + + + + + + + + TAK1/TAB1

**

*

* *

****

** **

*

*

*

**

*

**

*

**

**

****

****

Act

ivid

ad lu

cife

rasa

(in

crem

ento

rel

ativ

o)

VRK2WT VRK2KDVRK2WT+

siVRK2

+IL-1β

Figura 58. Represión dependiente de dosis de quinasa de la transactivación de AP1 activado por IL-1β. Se transfectaron células Cos1 en placas de 6 pocillos con 0,8 µg del plásmido reportero sintético pAP1-Luc, 10ng de Renilla y distintas cantidades de pCEFL-HA-VRK2A/B silvestre, inactiva y pSUPERIOR-VRK2-230 que codifica para el ARN de interferencia de VRK2. Tras 24 horas se cambió el medio a DMEM 0% suero, y tras 6h se les añadió 10 ng/ml de IL-1β. A las 16h se recogieron extractos y se midió la actividad luciferasa, se normalizó con el control de la Renilla-luciferasa. Se analizaron con T de Student 6 experimentos de cada punto. *p<0,05; **p<0,005.

+ + + + + + + + pAP1-Luc- + + + + + + + TAK1/TAB1

- - - 2 - - 2 - VRK2KD (µg) - - - - 2 - - 2 siVRK2 (µg)

VRK2A VRK2B

02468

1012141618

-IL-1β+IL-1β

* * **

** * *

IBVRK2HA(TAK1)Flag(TAB1)

Act

ivid

ad lu

cife

rasa

(in

crem

ento

rela

tivo)

- - 2 - 2 2 - 2 VRK2 (µg)

Figura 57. Represión de transactivación de AP1 dependiente de IL-1β por VRK2A y VRK2B. Se transfectaron células Cos1 en placas de 6 pocillos con 0,8 µg del plásmido reportero sintético pAP1-Luc, 10ng de Renilla y 2µg de pCEFL-HA-VRK2A/B silvestre, inactiva y pSUPERIOR-VRK2-230 que codifica para el ARN de interferencia de VRK2. Tras 24 horas se cambió el medio a DMEM 0% suero, y tras 6h se les añadió 10 ng/ml de IL-1β. A las 16h se recogieron extractos y se midió la actividad luciferasa, se normalizó con el control de la Renilla-luciferasa. Se analizaron con T de Student 6 experimentos de cada punto. *p<0,05. En la parte inferior del panel se muestra un western blot de los extractos celulares.

105

Resultados

Posteriormente se comprobó si el efecto de VRK2 sobre la represión de la actividad

transcripcional de AP1 podría ser eliminado usando ARN de interferencia específico para

VRK2. Para ello se transfectaron células HeLa con pAP1-Luc, pRL-tk (renilla) en presencia de

distintos plásmidos que codifican para los ARN de interferencia de VRK1, que se usó como

control negativo, y tres plásmidos que codifican para ARN de interferencia de VRK2 que

corresponden a distintas secuencias, así como un punto en el que se transfectaron los tres

plásmidos con el objetivo de disminuir más los niveles de expresión de VRK2 (Fig. 59B). Como

se observa en el western blot el ARN de interferencia de VRK1 y el VRK2-438 de VRK2 no

disminuían la cantidad de proteína, los demás puntos disminuían los niveles en un 50%. La

disminución de los niveles de VRK2 aumentaba la transactivación del reportero pAP1-Luc en

todos los casos hasta 5 veces tanto en presencia como en ausencia del estímulo (Fig. 59A).

Del mismo modo decidimos comprobar si la sobre-expresión de VRK2A y VRK2B también

inhibían el efecto de hipoxia. Para ello se llevó a cabo un ensayo igual que el anterior (Fig. 60).

En este caso, la cooperación o activación de TAK1 por hipoxia producían una activación mayor

que en el caso anterior, no obstante la sobre-expresión de todas las quinasas, silvestres o

inactivas, también inhibían la transactivación del reportero.

0

5

10

15

20

25

30

Sin estímulo IL-1β

AP1-LucAP1-Luc/siVRK1AP1-Luc/siVRK2-230AP1-Luc/siVRK2-438AP1-Luc/siVRK2-1335AP1-Luc/siVRK2-pool

**

*

**

Activ

idad

luci

fera

sa (i

ncre

men

to r

elat

ivo)

IBVRK2

β-actina

Con

trol (

siVR

K1)

si-V

RK

2-23

0

si-V

RK

2-43

8

si-V

RK

2-13

35

si-V

RK

2-po

ol

CN

T

A B

Figura 59. Transactivación de AP1 por IL-1β en células que expresan niveles más bajos de VRK2. A) Se transfectaron células HeLa en placas de 6 pocillos con 0,2 µg del plásmido pAP1-Luc, 10ng de Renilla y 6µg de los plásmidos que codifican para los ARN de interferencia específicos para las quinasas indicadas. Tras 4 horas se cambió el medio a DMEM 0% suero, y tras 40h se les añadió 10ng/ml de IL-1β. A las 4h se recogieron extractos y se midió la actividad luciferasa, se normalizó con el control de la Renilla-luciferasa. Se analizaron con T de Student 3 experimentos de cada punto. *p<0,005. B) Western blot de los extractos celulares revelado frente a anticuerpos específicos para VRK2 y β-actina como control de carga. CNT: control no transfectado.

106

Resultados

- - 2 - 2 2 - 2 VRK2 (µg)

02468

10121416182022

-DFO+DFO

+ + + + + + + + p AP1-Luc- + + + + + + + TAK1/TAB1

- - - 2 - - 2 - VRK2KD (µg) - - - - 2 - - 2 siVRK2 (µg)

VRK2A VRK2B

****** *** ***

IBVRK2HA(TAK1)Flag(TAB1)

Act

ivid

ad lu

cife

rasa

(in

crem

ento

rela

tivo)

Figura 60. Represión de la transactivación de AP1 dependiente de DFO por VRK2A y VRK2B. Se transfectaron células Cos1 en placas de 6 pocillos con 0,8 µg del plásmido pAP1-Luc, 10ng de Renilla y 2µg de los plásmidos que codifican para las quinasas silvestres e inactivas, y RNA de interferencia específicos para las quinasas indicadas. Tras 30 horas se añadió 300µM DFO. La actividad luciferasa se analizó a las 48 horas después de la transfección. Se analizaron con T de Student 6 experimentos de cada punto con respecto a la actividad del reportero activado por TAK1 o TAK1+DFO. *p<0,05; **p<0,005; ***p<0,0005. En la parte inferior del panel se muestra un western blot de los extractos celulares.

DISCUSIÓN

109

Discusión

1. LA QUINASA ENDÓGENA. EXPRESIÓN Y LOCALIZACIÓN.

La quinasa humana VRK2 fue inicialmente descrita por el grupo de J. Nezu [7], según el cual su

ARN mensajero se expresaba en multitud de tejidos con alta capacidad proliferativa y en varias

líneas celulares tumorales humanas. El ADN codificante de 1833 pb daba lugar a una proteína

quinasa de 508 aminoácidos, y a pesar de poseer un dominio quinasa degenerado postulaban

que fuese funcionalmente activa. Nosotros, previamente, hemos analizado la localización

subcelular de VRK2 usando anticuerpos policlonales específicos para su detección. Hemos

observado que esta quinasa se localiza tanto en el núcleo como en el citosol asociada a

membranas, mayoritariamente a membranas del retículo endoplasmático y a la envuelta nuclear,

y en menor medida a mitocondrias, tanto en líneas celulares normales como tumorales. Esta

localización subcelular nos hizo pensar en la existencia de otras isoformas de VRK2 que eran

reconocidas por el anticuerpo.

Posteriormente hemos clonado dos ARN mensajeros de VRK2, uno de ellos correspondiente a

la forma ya descrita de 1833 pb y 13 exones, que da lugar a la isoforma VRK2A [7, 11], y otro

de 1877 pb y 14 exones, generado por un procesamiento alternativo del exón 13, el cual

contiene un codon de terminación prematuro y da lugar a la isoforma VRK2B de 397

aminoácidos. Las dos proteínas comparten un domino quinasa común localizado en la región N-

terminal, pero difieren en el extremo C-terminal, que en VRK2B es 100 aminoácidos más corto.

La región C-terminal probablemente está implicada en la regulación de la actividad y de la

localización de estas dos isoformas, así como en otros miembros de la familia VRK, mediante

modificaciones postraduccionales e interacciones con proteínas reguladoras. Por tanto, cabría

esperar diferencias en la actividad funcional, la regulación y la localización de estas dos

isoformas en la célula. En un primer análisis y comparación de las secuencias proteicas de

ambas quinasas hemos comprobado la existencia de una región transmembrana (aminoácidos

492-508) en VRK2A y posteriormente hemos observado que VRK2A es una proteína citosólica

unida a membranas. VRK2B, la cual no contiene esta secuencia hidrofóbica, se ha detectado

mayoritariamente dispersa en el citosol, pero también en el núcleo y fuera del nucleolo a pesar

de no poseer ninguna secuencia de localización nuclear (NLS) consenso. Posiblemente, la

localización de VRK2B en el núcleo dependa de la interacción con algún factor celular que

contenga una NLS y que promueva su translocación al núcleo, ya que su tamaño molecular no

le permitiría la difusión pasiva a través del complejo del poro [386]. Otra posibilidad es la

existencia en VRK2B de una NLS no básica como las descritas hasta el momento, como el caso

de c-Myc, que posee una NLS atípica con aminoácidos neutros e incluso ácidos [387].

Por consiguiente, la distribución celular de la proteína VRK2 que observamos en un principio se

debe a la existencia de dos isoformas, una citosólica y unida a las membranas del retículo

Discusión

110

endoplasmático y de la envuelta nuclear y en menor medida a mitocondrias, y otra dispersa

tanto en el citosol como en el núcleo. La localización subcelular y la compartimentación son

factores importantes en la regulación de las interacciones de las quinasas con sus sustratos.

Estudios en levaduras muestran que la función de la quinasa CKI constitutivamente activa está

regulada por su localización subcelular promoviendo el acercamiento de quinasa y sustrato [16,

388, 389]. Por ejemplo, el mutante de S. cerevisiae deficiente en Hrr25 se complementa por las

quinasas homólogas a CKI en S. cerevisiae asociadas a membranas YCK1 o YCK2 a las que se

les ha eliminado el sitio de isoprenilación. De forma recíproca, los mutantes que no expresan

YCK1 o YCK2, son complementados por la sustitución de la secuencia de localización nuclear

por un sitio de isoprenilación en la quinasa nuclear Hrr25 [16, 388]. En mamíferos, existen

muchos casos de isoformas alternativas, por ejemplo la familia de quinasas más próxima de las

VRKs, las CKI además de estar formadas por al menos siete miembros presenta varias formas

alternativas, las cuales contienen inserciones en el extremo C-terminal y difieren en sus

propiedades bioquímicas, localización, función celular y especificidad de tejido [390, 391].

Se ha comprobado por western blot y RT-PCR la expresión de las dos isoformas en distintas

líneas celulares. VRK2A es relativamente abundante en todas las líneas celulares tumorales

probadas, procedentes de tejidos como cérvix, mama, riñón, colon, hueso, pulmón, hígado, y en

células sanguíneas, así como en fibroblastos humanos normales procedentes de piel y pulmón.

Hasta el momento no podemos describir ninguna línea celular en la que no se detecte VRK2A,

por lo que su expresión parece ser ubicua en todos los tipos celulares. Sin embargo, la expresión

de VRK2B es mucho más variable, siendo en la mayoría de los casos minoritaria, a excepción

de ciertos tipos celulares derivados de adenocarcinomas. No obstante, el ARN mensajero de esta

isoforma se detecta en todas las líneas celulares examinadas, aunque casi siempre de forma

minoritaria comparado con la isoforma A. Esto sugiere que la expresión de la isoforma B parece

estar regulada mediante un mecanismo postranscripcional todavía desconocido, no obstante,

cabe destacar que podría estar coordinado con la localización subcelular de VRK1, la cual, a

pesar de haber sido descrita como una proteína nuclear [6, 21, 27, 28] hemos observado que en

células derivadas de adenocarcinomas es citosólica, en concreto perinuclear aparentemente

asociada a algún orgánulo celular. Lo que sugiere que posiblemente cuando la localización de

VRK1 está desregulada, y por lo tanto ésta no puede llevar a cabo su función nuclear, entonces

la célula es capaz de compensar esta deficiencia mediante la expresión de una isoforma nuclear

de su relativo más cercano, que es VRK2.

111

Discusión

2. ACTIVIDAD CATALÍTICA IN VITRO.

Respecto a su actividad catalítica in vitro, las dos isoformas presentan una alta autofosforilación

en residuos de serina y de treonina al igual que VRK1 [6], predominantemente en residuos de

serina, y presumiblemente parte de ésta fosforilación tiene lugar en el dominio C-terminal, ya

que VRK2B presenta una menor fosforilación, que resulta más patente en residuos de treonina.

Esta propiedad es típica en algunas familias de quinasas, entre ellas las caseína quinasas I. En

ellas la autofosforilación, que ocurre principalmente en el extremo carboxilo terminal, aunque

en algunos casos también en el dominio quinasa, es un mecanismo de regulación mediante el

cual se inhibe su actividad quinasa [23], lo que sugiere que ésta podría ser una propiedad de la

familia VRK. Por otro lado, la secuencia de aminoácidos diana de fosforilación de las caseína

quinasas requiere un residuo ácido o un grupo fosfato que confiere carga negativa, localizado

tres o cuatro residuos del amino terminal del residuo fosforilado [316, 392]. Sin embargo, este

no es el caso de las quinasas VRK2A ni VRK2B, ya que al igual que VRK1 [6], fosforilan

proteínas ácidas y básicas. No obstante, la secuencia consenso de fosforilación de esta familia

de proteínas todavía no ha sido identificada, ya que el número de sustratos regulados por las

mismas es todavía muy pequeño, pero el hallazgo de nuevos sustratos nos permitirá identificar

los procesos celulares en los que están implicadas.

Puesto que diferentes tipos celulares presentan diferentes proporciones de ambas isoformas de

VRK2, y además la especificidad de sustrato de ambas proteínas y su relativa VRK1 es similar,

al menos in vitro, incluyendo sustratos específicos como p53 [6, 21, 379], postulamos que el

efecto biológico mediado por estas quinasas podría estar determinada por su localización

subcelular así como las proteínas presentes en el compartimento celular correspondiente, y su

dominio C-terminal, el cual media la interacción con diferentes proteínas. En este último caso,

VRK2B y VRK1 difieren en los últimos 90 aminoácidos de su extremo C-terminal, pero

comparten un 60% de homología en su extremo N-terminal, donde reside el dominio catalítico,

por tanto, su regulación será diferente y vendrá determinada por el extremo C-terminal, el cual

determina las interacciones específicas con proteínas reguladoras todavía sin identificar.

Discusión

112

3. REGULACIÓN DE P53 POR VRK2B.

La estabilización de p53 forma parte del mecanismo de respuesta celular a condiciones de

estrés, y habitualmente se regula mediante fosforilaciones llevadas a cabo por un gran número

de quinasas, que modifican diferentes residuos, principalmente localizados en el extremo N-

terminal, dando lugar a un complejo patrón de fosforilación necesario para activar una respuesta

completa y específica de p53 [315]. El dominio N-terminal de p53 media las interacciones con

varias proteínas reguladoras como acetiltransferasas [393], poli-ADP ribosa polimerasas [394] o

ubiquitina ligasas como su principal regulador negativo Mdm2 [225], entre otras. La

especificidad de las interacciones puede ser modulada mediante la fosforilación en

determinados residuos de los cuales las serinas 15 y 20 son los mejor caracterizados y

promueven la estabilización de p53 [304]. Sin embargo, se ha descrito la acumulación de p53 en

ausencia de la fosforilación en estos residuos, lo que sugiere que la estabilización de p53 puede

ocurrir mediante otros mecanismos de los cuales un posible candidato es la fosforilación en

treonina 18, u otros mecanismos de estabilización independientes de las fosforilaciones en el

extremo N-terminal [395].

El residuo treonina 18, se ha descrito, mediante estudios estructurales, como el único residuo

esencial en el mantenimiento de la α-hélice necesaria para interaccionar con Mdm2. Las

modificaciones en este residuo, tales como fosforilación o mutación a alanina, impiden la

formación de un puente de hidrógeno entre la treonina 18 y la asparagina en posición 21 [1, 246,

382]. Se han descrito algunas quinasas que lo fosforilan, entre ellas CKIδ, aunque ésta necesita

la fosforilación previa en serina 15, además se trata de una proteína citosólica durante interfase

[396]. También se ha observado la fosforilación de p53 en treonina 18 por Chk2 como respuesta

a estrés [317], aunque también parece necesaria la fosforilación previa de serina 15. No

obstante, se ha comprobado una cierta fosforilación en treonina 18 en condiciones basales, sin

estrés ni fosforilación en serina 15 previa [301, 397]. Nosotros hemos comprobado que las dos

isoformas de VRK2 catalizan, al igual que VRK1, la fosforilación de p53 específicamente en el

residuo treonina 18 in vitro, sin necesidad de la fosforilación previa del residuo serina 15, y

además, a diferencia de CKIδ, VRK1 y VRK2B son proteínas nucleares. Como consecuencia de

la sobre-expresión de VRK2B en la línea celular nula para p53 H1299, se produce la

estabilización de p53, probablemente debido a esta fosforilación que también es observada in

vivo, de una forma que depende de dosis de quinasa, mientras que la isoforma VRK2A, que

tiene una localización diferente exclusivamente citosólica y que no co-localiza con p53, no

parece promover esta estabilización, aunque in vitro ambas isoformas fosforilan de la misma

forma p53. Esto sugiere que VRK2A se comportaría como la quinasa CKIδ, la cual también es

una proteína citosólica y fosforila p53 en el residuo treonina 18 in vitro [397]. VRK2B y p53 no

sólo se localizan en el mismo compartimento sino que además interaccionan, pero sólo en

113

Discusión

presencia de la quinasa inactiva, lo que sugiere que esta interacción en realidad es transitoria y

dependiente de la reacción de fosforilación, pero indica que ambas proteínas interaccionan entre

ellas in vivo. Por consiguiente, las dos isoformas de VRK2, aunque comparten la misma

actividad catalítica in vitro tienen diferentes funciones biológicas debido a una localización

subcelular y un dominio de modulación diferentes.

Ninguna de las dos variantes fosforilan a Mdm2 en la parte amino terminal, responsable de su

unión a p53, por lo que todo efecto sobre la interacción p53-Mdm2 parece deberse a la

fosforilación de la quinasa sobre p53. Además, el efecto es suprimido cuando la proteína

introducida es una quinasa inactiva.

La actividad de p53 es principalmente regulada por diferencias en su estabilidad, que provocan

cambios rápidos y transitorios en la cantidad de proteína. En conclusión, VRK2B debe ejercer

su efecto aumentando la estabilidad de la proteína mediante un mecanismo postranscripcional,

seguramente mediante una reducción en su tasa de degradación. De este modo, aumenta la vida

media de la proteína resultando en una acumulación de p53 detectable por diversas técnicas.

Evidentemente, la fosforilación en el dominio N-terminal de p53 es un mecanismo que modula

sus sitios de interacción, y en particular, el residuo treonina 18 afecta directamente a la

interacción de su regulador negativo Mdm2, y otras proteínas reguladoras como el co-activador

p300 [283, 312, 393, 398]. La consecuencia de la fosforilación de este residuo por VRK2B debe

de ser la interrupción de la interacción entre p53 y Mdm2, de esta manera disminuye la

ubiquitinación de p53 contribuyendo en parte a su estabilización, y promoviendo la interacción

con otras proteínas que contribuyen a la transactivación [1, 21, 246, 382]. Este es el caso del co-

activador p300, el cual se une a la misma región que Mdm2 en p53, promoviendo su

estabilización y su transactivación mediante la acetilación del extremo carboxi terminal [228,

282, 399]. Aunque ambos fenómenos parecen ir unidos, ya que Mdm2 y p300 compiten por la

interacción en la misma región de p53, en nuestro sistema, la disminución de la ubiquitinación

parece jugar un papel más importante que el incremento de la acetilación. Teniendo en cuenta la

implicación de la fosforilación en treonina 18 en la interrupción de la interacción con Mdm2,

posiblemente la fosforilación de p53 por VRK2B es el principal mecanismo que desencadene la

estabilización de p53 de forma dependiente a Mdm2, dada la significativa disminución de la

ubiquitinación por Mdm2 en presencia de VRK2B. Sin embargo, no descartamos un efecto

indirecto por fosforilación de otros sustratos o por acción sobre otros moduladores de p53

independientes del efecto de Mdm2. De hecho, VRK2B es capaz de promover la acumulación

de un mutante de p53 en el residuo treonina 18 a alanina, que por tanto no puede ser fosforilado.

No obstante, se ha descrito que este mutante también inhibe la interacción con Mdm2, ya que

Discusión

114

impide la formación del puente de hidrógeno de la treonina 18 con la asparagina 21 [246, 312].

Además, se ha detectado un aumento en la actividad transcripcional de este mutante, aunque no

un aumento de su estabilidad intrínseca [312], indicando la presencia de otros mecanismos de

degradación de p53 en los que podrían participar otras ubiquitina ligasas. Por otro lado, hemos

observado que VRK2B también induce la estabilización de p53 en una línea celular sin Mdm2 y

que p53 es susceptible de acumulación en presencia de inhibidores específicos del proteosoma,

incluso más que en presencia de VRK2B sobre-expresada, lo que sugiere la presencia de otros

mecanismos de poliubiquitinación y degradación independientes de Mdm2. Entre estos pueden

estar otras ubiquitina ligasas conocidas para p53 como COP1, Pirh2 o topors [271-273] u otras

todavía no descritas. Sin embargo, VRK2B es incapaz de promover un aumento mayor de los

niveles de p53 que el alcanzado con estos inhibidores, por lo que deducimos que su efecto es

ejercido a través de un mecanismo de inhibición de la degradación, quizás también mediante la

interrupción de la interacción de estas ubiquitina ligasas con p53, lo que explicaría la

acumulación del mutante p53T18A. Otra posibilidad sería la fosforilación de algún otro residuo

de p53 in vivo mediada por VRK2B de forma directa, aunque no hemos observado esa

fosforilación in vitro, o de forma indirecta, aunque por el momento no tenemos evidencias

experimentales para apoyar esta hipótesis.

VRK2B no sólo induce la estabilización de los mutantes de p53 en treonina 18, sino también los

mutantes en serina 15, serina 20 y el doble mutante en serina 15 y serina 20 a alanina, es decir la

eliminación de estos sitios de fosforilación por separado o la combinación de algunos de ellos

que no incluyen la treonina 18, no son capaces de neutralizar el efecto de VRK2B. La

acumulación inducida por VRK2B sólo se previene por mutación de treonina 18 en

combinación con alguna otra, lo que podría sugerir la colaboración con otras quinasas para

conseguir un patrón de fosforilación adecuado y promover su acumulación. Por tanto, la

acumulación del mutante p53T18A sería causado de forma indirecta por la fosforilación de

otros residuos, ya que in vivo la colaboración entre distintas quinasas es necesaria para producir

una activación completa y dotar de especificidad a la respuesta de p53. Las quinasas candidatas

serían varias de la familia de PI3K como ATM, ATR y DNA-PK, que fosforilan serina 15 y 20

en p53, bien directamente o a través de otras quinasas como Chk1 y Chk2 [260, 314, 315].

Se ha observado la fosforilación de treonina 18 in vivo en células tratadas con taxol, en

respuesta a daño al ADN, en células de cáncer de mama que expresan p53 silvestre y en

fibroblastos que sufren senescencia replicativa [308, 313, 314, 400]. No obstante, la

fosforilación en este residuo en respuesta a taxol o adriamicina está acompañada de un aumento

de la fosforilación de serina 15, probablemente debido a la activación de vías de respuesta a

estrés. Este no parece ser el caso de VRK2B, el cual induce un aumento en la fosforilación en

115

Discusión

treonina 18, pero no de la serina 15, en p53 expresado de forma endógena. En este caso el

incremento relativo de la fosforilación en treonina 18 es mayor que el que tiene lugar al tratar

las células con taxol o adriamicina, lo que sugiere que podría estar implicada en otras rutas de

señalización, o bien que puede formar parte de ésta, aunque cooperando con otras quinasas. De

hecho, se ha postulado que la fosforilación en el residuo treonina 18 podría estar implicado en

procesos de proliferación y crecimiento normal celular [21], y esta debe ser una de las razones

de su detección durante senescencia celular [314]. En el caso de las fosforilación de treonina 18

por VRK2B también hemos observado un incremento de la estabilidad de p53 midiendo los

niveles de proteína, no obstante este efecto no es tan claro cuando medimos la vida media de

p53 endógeno en presencia de la quinasa. Por otro lado, no sólo observamos un incremento de

los niveles de proteína, sino que además ésta es transcripcionalmente activa, tal como cabría

esperar si se interrumpe la interacción de p53 y Mdm2, y se promueve la interacción de ésta con

co-activadores como p300 y la consiguiente acetilación [282, 393]. Este tipo de efectos

derivados de la fosforilación en este residuo ya habían sido descritos en el residuo equivalente

en la proteína murina, la treonina 21 [401]. Éste también es el caso de la fosforilación en

treonina 18 por VRK1 que estabiliza p53 y promueve su unión a p300 y Mdm4 [21]. Por otro

lado, sabemos que p53 puede ser fosforilado en varios residuos por diferentes quinasas, aunque

desconocemos cual serían las consecuencias funcionales resultantes de las diferentes

combinaciones de residuos fosforilados. No obstante, se ha descrito que la quinasa viral B1R

fosforila p53 al menos en cuatro residuos a lo largo de toda la proteína. Esta hiperfosforilación

da lugar a una molécula de p53 menos estable, aunque transcripcionalmente activa [402].

Recientemente se han descrito varias isoformas de p53 a las que les falta el dominio N-terminal

[403], sin embargo, todavía se desconocen los mecanismos por los que estas variantes son

reguladas, aunque podrían estar afectados por algún mecanismo independiente de la

fosforilación, como es el caso de las VRKs.

p53 así acumulada es transcripcionalmente activa sobre promotores sintéticos, pero de entre

todos los promotores específicos probados sólo hemos detectado la activación diferencial del

promotor de Mdm2, el cual no está implicado en ningún tipo de respuesta concreta, ya sea

parada de ciclo celular o apoptosis. Sin embargo, cuando analizamos el ciclo celular de células

que expresan p53 silvestre de forma endógena y sobre-expresan VRK2B, observamos que

VRK2B induce un incremento de la apoptosis en un 40%, aunque no podemos deducir si este

efecto está mediado directamente por la activación de p53 o si también participan otras vías de

señalización.

Como conclusión, VRK2B se presenta en nuestro sistema experimental como un activador de

p53 e inductor de su actividad transcripcional (Fig. 61), y aunque para la activación de una

Discusión

116

respuesta completa y específica de p53 es necesaria la activación de varías vías de señalización

y la colaboración de varias quinasas, ésta parece inducir una respuesta apoptótica en la célula.

No obstante, no podemos descartar la posibilidad de la activación de otras rutas por VRK2B,

que en colaboración con p53 den lugar a esta respuesta.

Se ha propuesto que la quinasa nuclear VRK1 está implicada en la regulación de p53, en

concreto en la respuesta celular en condiciones fisiológicas normales durante la proliferación

como la reparación de daño al ADN durante replicación [21], que es la situación fisiológica

normal. La fosforilación del residuo treonina 18 probablemente forma parte de un mecanismo

necesario para mantener unos niveles basales de p53 funcional en la célula, que son esenciales

para garantizar una correcta proliferación, además de estar preparada para responder

rápidamente a condiciones de estrés severo [21]. Sin embargo, en líneas celulares derivadas de

adenocarcinomas, VRK1 presenta una localización citosólica, por consiguiente no puede llevar

a cabo su función regulando p53 y es en esta situación es en la que se expresa VRK2B, la cual

se localiza en el núcleo, donde debe reemplazar funcionalmente a VRK1, compensando la

deficiencia de estas células. Esto sugiere dos nuevos niveles de regulación de la familia, uno es

la coordinación de su expresión, de tal forma que cuando VRK1 no se localiza en el núcleo se

expresa la isoforma nuclear de su relativo más próximo, VRK2. Y otro concierne a la regulación

de la localización de VRK2B ya que a pesar de no poseer una secuencia de localización nuclear

como VRK1, ésta es translocada al núcleo [6]. El efecto de VRK2B sobre la fosforilación de la

treonina 18 es por tanto funcionalmente redundante con el efecto de VRK1 respecto a p53,

aunque probablemente los mecanismos de regulación de ambas quinasas sean diferentes ya que

éstas se diferencian en el extremo C-terminal. Esta redundancia funcional explicaría que el ratón

deficiente en VRK2 sea viable [31, 32].

p300p53

DEGRADACIÓNDEGRADACIÓN ACTIVACIÓNACTIVACIÓN

?

OTRAS QUINASAS

VRK2B

UbUbMDM2

MDM2

p53S15

T18 S20 Ac373Ac382

VRK1

Figura 61. Regulación de p53 por VRK2B. VRK2B activa p53 mediante la fosforilación en treonina 18 y algún otro mecanismo desconocido, que conllevan a la inhibición de la interacción de reguladores negativos como Mdm2 y la promoción de la unión de reguladores positivos como p300.

117

Discusión

4. REGULACIÓN DE LA VÍA DE JNK POR VRK2A Y VRK2B.

En el desarrollo embrionario de ratón encontramos generalmente un patrón de expresión similar

en los tres genes de la familia VRK. El pico de mayor expresión coincide con el desarrollo

hematopoyético, en cual el hígado sufre una mayor expansión en el número de células [22]. Los

altos niveles de expresión estas quinasas durante el desarrollo embrionario podrían señalar un

posible papel en diferenciación o proliferación celular en fases del desarrollo. También se ha

observado una amplia expresión en tejidos adultos, especialmente aquellos con una tasa

proliferativa alta, y en células tumorales [7]. En células en las que se ha reducido la expresión

de VRK1 mediante ARN de interferencia se observa una reducción en la tasa de proliferación

así como defectos en el desarrollo normal de la mitosis [21]. Por otro lado se ha detecta una alta

expresión en el hígado adulto de ratón así como en otros tejidos, donde no hay proliferación

celular considerable. Todo esto refleja que el papel de estas quinasas es más complejo,

implicado quizás en mecanismos protectores necesarios para una correcta proliferación.

Hemos descrito que VRK2B debe desempeñar funciones muy similares a las de VRK1,

existiendo una redundancia de función, no obstante, VRK2B debe desempeñar funciones

adicionales en proliferación distintas a la activación de p53, mediadas por otras moléculas

efectoras. Por otro lado, la alta y constante expresión de VRK2A respecto a VRK2B en todas

las líneas celulares analizadas pone de manifiesto una gran importancia de esta quinasa quizás

implicada en proliferación. Se conocen otros sustratos para VRK1, algunos de ellos

relacionados también con proliferación y rutas de señalización de estrés celular, como los

factores de transcripción ATF2 y c-Jun, implicados en el control del crecimiento celular,

diferenciación y respuestas celulares a estrés [27, 28]. Todo esto nos llevó a pensar en la posible

implicación de VRK2A y B en otras vías de señalización relacionadas con proliferación y

diferenciación, no sólo durante el desarrollo embrionario sino también durante la etapa adulta,

como lo es la vía de señalización de JNK.

Las proteínas de anclaje reúnen distintos componentes de las vías de señalización en módulos

funcionales, confiriendo especificidad a cada vía de señalización, permitiendo una activación

más eficaz en regiones limitadas de la célula como respuesta a un determinado estímulo.

Recientemente se ha descrito la familia JIP de proteínas de anclaje para la vía de JNK, aunque

también existen otras proteínas de este tipo relacionadas con otras vías de señalización. En

concreto JIP1 interacciona con JNK, MKK7 y MLKs [37, 167] facilitando la activación de esta

vía de señalización en respuesta a determinados tipos de estrés y otras señales extracelulares

[37]. A estos módulos se unen otras proteínas reguladoras, que modularán la actividad de estos

complejos mediante modificaciones covalentes o interacciones proteína-proteína. Las diferentes

combinaciones de estas proteínas reguladoras en un momento y lugar determinado de la célula,

Discusión

118

condicionarán la respuesta biológica. En este sentido, hemos observado que las proteínas

VRK2A y VRK2B forman parte de este módulo de señalización, ya que interaccionan con el

extremo C-terminal de JIP1. A pesar de que la interacción es más específica para la isoforma

VRK2A, ésta tiene lugar a través del extremo N-terminal común para las dos quinasas. No

obstante, esta propiedad parece común en estas quinasas ya que la proteína viral B1R, cuyos

305 aminoácidos comparten un 38,7% de identidad con el extremo N-terminal de VRK2,

también interacciona con JIP1 (datos no publicados).

Hemos comprobado que JIP1 es una proteína citoplasmática en células epiteliales tumorales

humanas (MCF7), células epiteliales de mono (Cos1) y en fibroblastos normales humanos

(WS1). En estas células se encuentra asociada a membranas del retículo endoplasmático,

envuelta nuclear y mitocondrias, localizándose en una región perinuclear. En esta región co-

localiza e interacciona con las proteínas VRK2, especialmente con la isoforma A, la cual

también se asocia al mismo tipo de membranas. Esto explicaría que la interacción de JIP1 y

VRK2 sea más específica para la forma A. La localización perinuclear es característica de JIP1

y ya se había descrito en neuronas, donde además está modulada, de forma que en condiciones

normales se encuentra en las sinapsis y conos de crecimiento, lo que permitirá la activación del

módulo de señalización por estímulos extracelulares, tras el cual se transloca a la región

perinuclear donde también parece asociado a membranas [37, 167, 175, 180-182]. Nosotros

observamos esta localización perinuclear incluso en condiciones normales, y no tenemos

pruebas experimentales que nos indiquen la existencia de una regulación tan fina en estas

células como en neuronas, aunque cabe destacar que en este tipo celular los complejos tienen

que translocarse largas distancias, desde las dendritas al núcleo, y en el menor tiempo posible.

A pesar de que la interacción tiene lugar por el dominio catalítico y de que las dos quinasas

fosforilen a JIP1 in vitro en su extremo N-terminal, en una región próxima al dominio de unión

de JNK, la actividad catalítica no es necesaria para la formación de estos complejos estables. No

obstante, no tenemos evidencias de que esta fosforilación ocurra in vivo, pero se ha descrito que

JIP1 presenta fosforilación in vivo en residuos que no son fosforilados por JNK, y por tanto

otras quinasas del complejo o ajenas a este podrían fosforilar JIP1 y modular su actividad [189,

190].

La formación de los complejos entre JIP1 y cada una de las isoformas de VRK2 parece regular

de alguna forma la actividad de estos módulos de señalización, aunque la actividad quinasa no

es esencial para llevar a cabo esta modulación, puesto que tanto las quinasas silvestres como

aquellas que no poseen actividad catalítica, modulan de igual forma a estos complejos.

Tampoco parece deberse a la competencia por la interacción a una misma región de estas

119

Discusión

quinasas con las MAPKs que forman parte del complejo, ya que la presencia de ambas

isoformas no impide ni disminuye la interacción con las quinasas TAK1, MKK7 y JNK cuando

se unen a JIP1. Existe la posibilidad de que la simple interacción de VRK2A y B con JIP1

conlleve un cambio conformacional en la molécula que impida la señalización a través del

módulo, aunque no mediante un cambio en la afinidad de éste por las MAPKs que forman parte

del complejo, sino dando lugar a una disminución en la fosforilación y activación de JNK, la

cual no se translocaría al núcleo, y por tanto no activaría los factores de transcripción. Estas

proteínas de anclaje sirven para integrar múltiples señales que regulan la actividad de JNK. Por

ejemplo, se ha descrito que la unión de Akt a JIP1 promueve la activación de Akt y reprime la

señalización de JNK en neuronas en respuesta a estrés excitotóxico, debido a la inhibición de la

interacción entre JIP1 y JNK, efecto que no parece depender de la actividad quinasa de Akt

[175, 191]. También se ha descrito la interacción de fosfatasas como MKP7 y M3/6 las cuales

inhiben la señalización a través del módulo al defosforilar a JNK [86]. Esta podría ser otra

posibilidad, es decir VRK2A y B aumentarían la interacción del módulo con reguladores

negativos dando lugar a la inhibición de la señalización observada, sin embargo, no tenemos

evidencias experimentales sobre esta hipótesis.

Hasta el momento se había descrito la interacción de JIP1 con varios miembros de la familia

MLK como MAP3K, además de MKK7 y JNK [37, 166, 167], formando un módulo de

señalización implicado en la activación de JNK en respuesta a determinados estímulos como

estrés excitotóxico o anoxia en neuronas, o citoquinas como IL-1β y TNF-α en células

secretoras del páncreas, pero no por radiación ultravioleta o anisomicina [166, 180, 199, 203].

Nosotros hemos observado que TAK1 también interacciona con JIP1, de la misma forma que

las quinasas de la familia MLK, de la que TAK1 parece estar próximamente relacionada en

cuanto a su evolución y función [3]. No obstante, TAK1 interacciona con JIP1 por una región

diferente a MLK, más próxima a la región de interacción con MKK7 (MAP2K). De esta forma

TAK1, que es activada por citoquinas como TNFα, IL-1β, endotoxinas como LPS y estímulos

de estrés celular al igual que MLK [76-78, 117, 119, 120, 129], podría formar parte de este

módulo mediante la fosforilación de JNK, bien a través de MKK4 o MKK7 [76-78, 121], o

también mediante la interacción directa a JNK, activándola de forma independiente a MKK4/7

como ha sido descrito [138]. En último término regularía la activación de AP1 al igual que

MLK [131].

En estas vías de señalización las quinasas pueden interaccionar con una molécula de anclaje,

pero además también se asocian simultáneamente entre ellas, al igual que ocurre con VRK2A y

TAK1, las cuales interaccionan directamente a través del extremo C-terminal específico de

VRK2A, mientras que VRK2B sólo se asocia a TAK1 en presencia de la proteína de anclaje

Discusión

120

JIP1 común a las dos, lo que sugiere que en la célula podrían coexistir varias subpoblaciones

formadas por JIP1 unida a cada una de las quinasas por separado o coincidir algunas de estas

proteínas unidas a JIP1 simultáneamente como es el caso de VRK2B y TAK1. Por tanto, con los

datos obtenidos mediante estos ensayos propondríamos dos modelos de interacción entre estas

proteínas. Aunque cabe destacar que no pretendemos definir un modelo de estructura, ya que no

se conocen datos estructurales de JIP1 (Fig. 62). En el modelo A observamos que JIP1 se

encuentra plegado de forma que su extremo N y C-terminal están próximos, JNK interacciona

con JIP1 cerca de su extremo N-terminal, MKK7 y TAK1 interaccionan con JIP1 por una

región central, y por último VRK2A, que está anclada a membranas, interacciona con TAK1 por

su extremo C-terminal y por su extremo N-terminal se une al extremo C-terminal de JIP1,

siendo así posible la fosforilación en cis observada en el extremo N-terminal de JIP1 por VRK2

(Fig. 62A). Sin embargo, también es posible que JIP1 no esté plegado y la fosforilación sea en

trans (Fig. 62B). Por último, VRK2B interacciona establemente con JIP1, pero al no contener el

extremo C-terminal prolongado como VRK2A, no interacciona directamente con TAK1, lo que

también explicaría la inestabilidad de la interacción JIP1-VRK2B con respecto a VRK2A, la

cual al unirse a TAK1 y JIP1 hace que los complejos sean más estables.

Hemos observado ciertos estímulos que activan o cooperan con TAK1 en la activación de AP1,

como las citoquinas TGFβ e IL-1β, las cuales ya estaban descritas como activadores de TAK1,

[76-78, 117-120], y otros tipos de estímulos menos conocidos como Deferoxamina (DFO) que

mimetiza hipoxia. De todos ellos, DFO e IL-1β [37] activan la vía de JNK a través del módulo

formado por JIP1, ya que en presencia de un mutante de JIP1 que no puede unirse a JNK, y por

A B

JNK

TAK1

TAB1

VRK2A

JIP1

P MB

MKK7JNK

TAK1TAB1

VRK2A

JIP1

P

MB

MKK7

Figura 62. Modelo de interacción entre las proteínas JNK, MKK7, TAK1-TAB1, JIP1 y VRK2A. A) Modelo que permite la fosforilación de JIP1 por VRK2 en cis. B) Este modelo implicaría la fosforilación de JIP1 por VRK2 en trans. MB: membrana; P: grupo fosfato.

121

Discusión

tanto no puede transmitir la señal de activación de la vía a JNK, AP1 no puede ser activado por

DFO, y la cooperación de TAK1 y DFO también resulta reprimida. Sin embargo, en el caso de

la activación de AP1 por TAK1 sobre-expresada, la inhibición de la activación no es tan

evidente y se observa una activación residual probablemente debido a la presencia de JIP1

endógeno o a la existencia de un mecanismo de activación de AP1 por TAK1 independiente del

complejo formado por JIP1, y en este caso, al sobre-expresar la quinasa, se hace más patente.

Además, la interacción de VRK2A o VRK2B con JIP1 inhibe, de manera dependiente de dosis e

independiente de actividad quinasa, la activación de AP1 por TAK1, y la activación o

cooperación de TAK1 y los estímulos IL-1β o DFO, probablemente mediante la interrupción de

la transmisión de la señal a través del módulo de señalización formado por TAK1, MKK7, JNK

y JIP1.

La relevancia fisiológica de la interacción JIP1-VRK2 todavía no ha sido examinada. Sin

embargo, hemos comprobado que VRK2B induce apoptosis en células que expresan p53

silvestre. Uno de los mecanismos por los que VRK2B induce apoptosis puede ser mediante la

activación de la respuesta apoptótica de p53 y en segundo lugar, por la inhibición de la vía de

señalización de JNK a través de la modulación de JIP1, que podría contribuir a la inducción de

la muerte celular. De hecho, JIP1 parece tener un papel protector frente a apoptosis. Se ha

descrito que la sobre-expresión de JIP1 en neuronas protege de la apoptosis inducida por falta

del factor de crecimiento neuronal NGF [404], en neuronas que expresan bajos niveles de JIP1

la inducción de muerte celular inducida por estrés excitotóxico o hipoxia/anoxia se ve

aumentada [201, 405], la supresión de la expresión de JIP1 mediante oligonucleótidos

antisentido revelan un aumento en la apoptosis de células β del páncreas [406], mientras que su

sobre-expresión reduce la inducción de apoptosis por IL-1β en células secretoras de insulina

[170]. Por otro lado, los niveles de expresión de JIP1 parecen estar regulados, de tal forma que

sus niveles disminuyen tras la exposición de las células a determinados estímulos como

isquemia, hipoglucemia o citoquinas [170, 201]. Todo ello sugiere que la regulación de los

niveles o actividad de JIP1 son necesarios para el desarrollo y proliferación normal. Por tanto, la

vía de señalización de citoquinas como IL-1β o estrés como hipoxia (DFO), en las que está

implicado el complejo JIP1-JNK, está modulada de forma negativa por VRK2A y VRK2B, lo

que sugiere la supresión del papel protector de JIP1 frente a apoptosis.

JNK participa a través de AP1 en la regulación de la expresión de determinados genes

relacionados con respuestas apoptóticas, mediante la activación de la expresión de genes pro-

apoptóticos como Bim o FasL, o la represión de genes anti-apoptóticos como Bcl2 o BclXL,

pero también participa en respuestas de supervivencia mediante la activación de la expresión de

genes anti-apoptóticos como Bcl3 o la represión de genes apoptóticos como p53 (cuya actividad

Discusión

122

transcripcional también es inhibida por c-Jun), Fas o p14/ARF, y en la activación de genes

necesarios en proliferación como ciclina D1 [407]. Por otro lado, JNK fosforila e inactiva a la

proteína pro-apoptótica BAD, impidiendo que ésta interaccione e inactive la proteína anti-

apoptótica BclXL [90]. Es por tanto el balance entre proteínas pro y anti-apoptóticas o proteínas

necesarias para la proliferación presentes, junto a otras vías de señalización y la duración y el

tipo de estímulo, los que darán lugar a una respuesta celular determinada. De esta forma, la

alteración de este balance es crítico en la célula ya que dará lugar a diferentes respuestas según

el estado de cada una de estas vías. Teniendo en cuenta que VRK2B o VRK1 regulan

positivamente p53, es probable que la activación de VRK2A y VRK2B (o VRK1 como

alternativa de VRK2B), induzcan apoptosis mediante la inhibición de la respuesta anti-

apoptótica de JNK y la promoción de la respuesta apoptótica de p53 (Fig. 63).

p53

BAX

Citocromo C

Bcl2, BclXL

IAPs

AIF

Citocromo CAPAF-1

Caspasas

Smac/Diablo

APOPTOSISAPOPTOSIS

Fas

AP1

Bcl3

VRK2B

JIP1

TAK1

MKK7

JNK

VRK2A/BVRK1

VRK1

FasL

Bim

BAD

Figura 63. Modelo propuesto para la activación de la respuesta apoptótica celular por VRK1, VRK2A y VRK2B. VRK1 y VRK2B activan p53, VRK2A y B inhiben la vía de JNK por interacción con la proteína de anclaje JIP1, de forma que promueven preferentemente la expresión y activación de genes pro-apoptóticos y no de genes anti-apoptóticos.

123

Discusión

Como he mencionado anteriormente, JNK también puede inducir apoptosis, su efecto final

depende del equilibrio entre proteínas pro y anti-apoptóticas presentes, así como la duración del

estímulo. En este sentido, cabe destacar el papel de VRK1 en la activación de los factores de

transcripción ATF2 y c-Jun comunes a JNK y que forman parte del complejo AP1. Se ha

sugerido que VRK1 podría estar implicada en rutas de estrés, no obstante también se ha

propuesto que la fosforilación de estos factores de transcripción por VRK1 promovería su

actividad basal, que podría ser necesaria para la proliferación celular en condiciones normales

[27, 28].

La función de JIP1 ha sido estudiada principalmente en células secretoras del páncreas donde

parece tener un papel protector de la apoptosis inducida por citoquinas (IL-1β, TNF-α e IFN-γ),

y en neuronas donde JIP1 protege de la apoptosis inducida por estrés excitotóxico o

hipoxia/anoxia [180, 199, 203]. Por otro lado, aunque los fibroblastos deficientes en TAK1

presentan una alta sensibilidad a apoptosis [135, 151], es cierto que TAK1 parece estar

involucrada en la activación de vías de señalización de respuesta inmune e inflamatoria por la

activación de NFκB por IL-1β [77] y por TNFα [122] y de JNK en respuesta a IL-1β [76-78,

121]. El hecho de que VRK2B regule de forma positiva a p53 y de forma negativa a JNK parece

indicar que VRK2B y VRK2A tienen un papel importante en la promoción de la respuesta

apoptótica celular y por tanto un papel protector frente a situaciones estresantes en la célula,

aunque también podrían participar en la regulación de respuestas celulares a la infección como

son apoptosis o inflamación. De hecho, existen evidencias que indican que VRK2 podría

participar en la respuesta inmune, de tal forma que su expresión está regulado positivamente en

células T de sangre periférica estimuladas [29], y se regula negativamente en células

mononucleares de sangre periférica activadas [30]. No obstante, su expresión ubicua, al igual

que la de JIP1 y TAK1 [7, 115, 116, 167], sugieren la implicación de estas moléculas en otras

funciones celulares. Además, los ratones deficientes en TAK1 y JIP1 son letales, aunque en este

último caso existe cierta controversia, pero parecen indicar que su función es esencial para el

desarrollo embrionario [135, 151, 198]. Este no parece el caso de VRK2 [31, 32], posiblemente

debido a una redundancia de función con otras quinasas de la familia. No obstante, en el

desarrollo embrionario de ratón encontramos generalmente un pico en la expresión de los tres

miembros principalmente en sangre periférica e hígado durante la fase de mayor expansión,

sugiriendo que en este tipo celular estas quinasas están relacionadas con la proliferación celular

normal [22].

CONCLUSIONES

127

Conclusiones

1. El gen VRK2 genera, mediante un procesamiento alternativo del ARN mensajero,

dos isoformas que difieren en el extremo carboxilo terminal.

2. VRK2A es una quinasa citosólica asociada a las membranas del retículo

endoplasmático, la envuelta nuclear y mitocondrias y se expresa intensamente en

diferentes tipos celulares.

3. VRK2B se encuentra dispersa en el citosol, pero también en el núcleo, fuera del

nucleolo, y su expresión es más limitada, pudiendo estar condicionada por la

localización citosólica de VRK1.

4. La sobre-expresión de la isoforma nuclear VRK2B promueve la estabilización de

p53, inhibiendo su ubiquitinación y promoviendo su fosforilación, acetilación y

activación transcripcional. En este contexto la función de VRK2B parece ser

complementaria a la de VRK1 y por tanto existe una redundancia de función.

5. TAK1 interacciona con la proteína de anclaje JIP1, formando un módulo de

señalización a través de la cual activa a JNK en respuesta a IL-1β e hipoxia.

6. VRK2A y VRK2B fosforilan e interaccionan de forma estable con la proteína de

anclaje JIP1, disminuyendo el estado de fosforilación de JNK unida a JIP1 y, por

tanto, inhibiendo la señalización a través de este módulo.

7. VRK2A y VRK2B inhiben la activación transcripcional de AP1 por TAK1, IL-1β

e hipoxia posiblemente como consecuencia de la interacción con JIP1.

MATERIALES Y MÉTODOS

131

Materiales y Métodos

1. CLONACIÓN DE SECUENCIAS CODIFICANTES DE VRK2A Y B.

1.1. Obtención del ADN codificante.

Con objeto de generar y clonar el ADN codificante completo de VRK2 (nucleótidos 130-1657)

se diseñaron los oligonucleótidos VRK2X, VRK2S y VRK2A basándonos en la secuencia de la

bases de datos (GenBank AB000450). Se utilizó 1 µl de RT-PCR sobre ARN de células HeLa,

junto con tampón de PCR, 1 unidad de “Taq ADN polimerasa” (ambos de Promega, Madison,

WI, USA), 1 µl de cada oligonucleótido (a una concentración de 100pmoles/ml), 0,2mM dNTPs

(Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN, USA), 1,5mM MgCl2 en un volumen

final de 50 µl. La amplificación se llevó a cabo según el siguiente programa de PCR: 5 minutos

a 92ºC, 30 ciclos que incluyen 40 segundos a 92ºC, 40 segundos a 55ºC y 40 segundos a 72ºC y

por último un ciclo de terminación de 10 minutos a 72ºC. Los productos de PCR se clonaron en

el vector pCR2.1, según las instrucciones indicadas en por el sistema “TA Cloning Kit”

(Invitrogen, San Diego, CA, USA). Los productos de PCR ya clonados fueron secuenciados de

forma automática utilizando un secuenciador ABI Prism 377 de Perkin-Elmer, para confirmar la

naturaleza del producto amplificado. Estos vectores fueron usados para amplificar por PCR el

ADN codificante, usando los oligonucleótidos detallados en la Tabla 1 (ISOGEN Bioscience

BV, Utrecht, Holanda), y subclonarlos en otros vectores plasmídicos.

1.2. Generación de vectores recombinantes.

Los vectores recombinantes que codifican para VRK2A y VRK2B se generaron insertando

secuencias de ADN codificante en los correspondientes vectores mediante reacciones de

digestión de fragmentos con endonucleasas de restricción (Promega, Madison, WI, USA) y

posterior ligación con la enzima “T4 ADN-Ligasa” (Promega, Madison, WI, USA) según

protocolo estándar [408]. Las construcciones así obtenidas se transformaron en las cepas de

Escherichia coli DH5α o BL21DE3 para la expresión de proteínas de fusión en bacterias, tras

seleccionar las colonias transformadas con la resistencia específica para cada vector, se aislaron

y guardaron aquellas que habían incorporado la construcción correcta. La confirmación de cada

clon se realizó mediante análisis de restricción y posterior electroforesis y secuenciación. Las

construcciones de ADN que se han usado en este estudio están detalladas en Tabla 2.

2. MUTAGÉNESIS DIRIGIDA.

Para llevar a cabo la mutagénesis en nucleótidos puntuales se precedió según el método

recomendado por el sistema comercial “QuickChange Site-Directed Mutagenesis” de

Stratagene. Se utilizó como sustrato 50ng del ADN del plásmido recombinante de doble cadena

donde se va a insertar la mutación, junto con 100 ng de cada oligonucleótido, 0,2mM dNTPs

(Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN, USA), tampón de PCR [KCl 100 mM,

(NH4)2SO4 100 mM, Tris-HCl 200 mM (pH 8.8), MgSO4 20 mM, Tritón X-100 1%, BSA


132

1mg/ml] y una unidad de la enzima “Pfu Turbo ADN polimerasa” (ambos de Stratagene) en un

volumen final de 50µl. Los oligonucleótidos usados se detallan en la Tabla 1. Antes de añadir la

polimerasa la mezcla de reacción se incubó a 95ºC durante 15 minutos para desnaturalizar las

hebras de ADN. Para la mutación de una sola base las condiciones de la reacción fueron las

siguientes: un ciclo de desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos, seguido de 12 ciclos que

consistían en 90 segundos a 95ºC, seguido de 90 segundos a 55ºC y una elongación a 68ºC

durante 15 minutos para plásmidos de un tamaño aproximadamente de 5 Kb, ó 30 minutos para

plásmidos mayores de 7 Kb de tamaño. El ADN parental fue eliminado tras tratar con la

endonucleasa DpnI, con acción específica sobre secuencias metiladas y hemimetiladas,

resultando así seleccionadas las copias mutantes. El producto de PCR se transformó en cepas

DH5α de Escherichia coli competentes seleccionando las colonias transformantes con la

resistencia específica para cada vector.

3. PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DE FUSIÓN.

3.1. Purificación de proteínas de fusión unidas a GST (Glutation-S-Transferasa).

El sistema de fusión de proteínas con GST (Amersham Biosciences) permite una rápida y fácil

purificación de proteínas sobre-expresadas en E. coli. Previamente el plásmido recombinante se

transforma en la cepa BL21DE3 de E. coli. Los clones se crecieron toda la noche a 37ºC en

medio selectivo (LB + ampicilina 50 µg/ml). Al día siguiente se hizo una dilución 1:10 del

preinóculo en medio fresco selectivo y se incubó 1-2 h a 37ºC, hasta alcanzar una densidad

óptica a 600 nm de 0,6-0,8. En este momento, cuando el cultivo está en fase exponencial, se

indujo la expresión de la proteína de fusión añadiendo IPTG (Boehringer Mannheim) a una

concentración final de 0,1-1mM y se incubó a 37ºC durante 2-4. Tras este tiempo el cultivo se

centrifugó a 8000 rpm durante 10 minutos, se retiró el sobrenadante y las células se

resuspendieron en tampón de lisis (PBS frío + 1% Triton X-100, 0.2µg/ml Lisozima, 1mM

PMSF, 5mM DTT, 10µg/ml aprotinina y 10µg/ml leupeptina). La suspensión se sonicó con 2

pulsos de 30 segundos separados de 30 segundos a 4ºC y baja potencia en un sonicador

“Misonic XL2010” y se centrifugó a 30000g, 30 minutos a 4ºC. El sobrenadante resultante

contiene las proteínas solubles, entre las que se encuentra de forma mayoritaria la proteína de

fusión expresada. Esta fracción soluble se incubó con la resina Sefarosa-glutation “Glutathion

Sepharose 4B beads” (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) durante 2-12 h a 4ºC en

agitación suave. Una vez unida la proteína de fusión a la resina, se lavó varias veces con el

mismo tampón de lisis (esta vez sin lisozima), y posteriormente la proteína fusionada a GST se

eluyó en una solución 10mM glutation reducido en 50mM Tris-Cl pH 8.0 a 4ºC durante 1 hora

en agitación orbital. Tras una breve centrifugación de 2 minutos a 2000 rpm se recogió el

sobrenadante con la proteína eluida y se comprobó la purificación de la proteína mediante

electroforesis SDS-PAGE seguida de Tinción con Azul de Coomassie o Western Blot.

133


Finalmente la solución de elución se dializó mediante membranas de diálisis (Serva) frente a

PBS + 5% Glicerol y se concentró en un centricón “Amicon Ultra” (Millipore, Carrigtwohill,

Co. Cork, Irland). La concentración proteica se determina por colorimetría mediante “BIO-

RAD protein assay” (Biorad), empleando BSA para establecer una recta patrón.

Algunas proteínas unidas a la resina Sefarosa-glutation se separaron de su epítopo GST por

digestión con trombina (10 unidades/mg proteína de fusión) durante 16 horas a temperatura

ambiente. A continuación se centrifugó durante 5 minutos a 1500 x g y se guardó el

sobrenadante, correspondiente a la proteína purificada.

3.2. Purificación de proteínas de fusión unidas al epítopo 6xHis.

El protocolo seguido fue el mismo que para expresión y purificación de proteínas fusionadas a

GST salvo que en el tampón de lisis así como a los lavados se eliminó el DTT y se añadió

10mM de Imidazol (Merck, Darmstadt, Alemania). La resina usada en este caso fue “TALON

Metal Affinity Resin” (BD Biosciences, Palo Alto, CA, USA) y el método de elución era en PBS

con Imidazol en concentraciones crecientes desde 50mM y hasta 500mM. Tras su

comprobación mediante SDS-PAGE y tinción de Coomassie se unieron todos los eluidos que

contenían pura la proteína en cuestión y se dializaron y concentraron y cuantificaron de la

misma forma.

3.3. Tinción con Coomassie.

Para monitorizar el proceso de purificación y para comprobar la correcta purificación de la

proteína, las fracciones proteicas obtenidas se separaron por tamaño mediante una electroforesis

vertical en geles SDS-PAGE. Posteriormente el gel de poliacrilamida se fijó y se tiñó durante 10

minutos en solución de Coomassie (0,5 % Coomassie brilliant blue R250, 50% metanol, 10%

ácido acético glacial) y posteriormente se destiñó con solución de distinción (50% metanol,

10% ácido acético glacial) en agitación hasta la correcta visualización de las bandas de interés.

Finalmente se transfirió a papel Whatman 3M y se secó en un secador de geles (Biorad) durante

2h a 80ºC.

4. ENSAYOS DE ACTIVIDAD QUINASA IN VITRO.

La actividad serina-treonina quinasa se analizó mediante un ensayo de fosforilación in vitro.

Para ello se mezclaron aproximadamente 2 µg de la quinasa purificada, 10 µg de otra proteína

como sustrato si se indica en un tampón específico para caseín quinasas que consiste en 50mM

Tris-HCl pH7.5, 5mM MgCl2, 0.5mM DTT, 150mM KCl, 5µM ATP-Mg2+ y 5µM (5 µCi)

[γ32P] ATP en un volumen final de 25 µl. La mezcla se incubó durante 30 minutos a 30ºC en

agitación en un agitador “Thermomixer Compact” de Eppendorf. Posteriormente las muestras


134

fueron procesadas y fraccionadas en un gel de poliacrilamida al 10%/0.1% SDS, teñido en

tinción de Coomassie y secado como se ha descrito anteriormente. Finalmente para detectar las

bandas radiactivas los geles fueron expuestos en películas de rayos X (Fujifilm) a -80ºC durante

1-24 h, según cada caso. Tras revelar las películas se interpretaron las señales de fosforilación

utilizando como referencia el gel teñido con Coomassie.

5. ANÁLISIS DE FOSFOAMINOÁCIDOS.

Inicialmente se llevó a cabo un ensayo quinasa in vitro, descrito en el apartado anterior, con los

sustratos que iban a ser analizados. Las muestras se separaron en geles SDS-PAGE y se

transfirieron a membranas de PVDF “Immobilon-P membrane” (Millipore). Las membranas

fueron expuestas en películas de rayos X para visualizar las proteínas fosforiladas por

autorradiografía. La banda de la proteína de interés se recortó y se incubó durante 10 minutos en

metanol, y se lavó abundantemente con agua. Posteriormente se troceó la membrana en

pequeños fragmentos y se introdujeron en un tubo “eppendorf” con 200 µl de HCl 6N,

asegurándose de que queda completamente sumergida. Se gasearon con nitrógeno, para impedir

que se oxiden las ligaciones dobles de las proteínas, y se incubaron 1 hora a 110ºC para liberar

los aminoácidos mediante la hidrólisis ácida del enlace peptídico. Se incubaron 15 minutos en

hielo, se centrifugaron 5 minutos a 13000 rpm a temperatura ambiente y se transfirió el

sobrenadante a un tubo nuevo. Este se congeló a -20 ºC y se sublimó en un concentrador de

vacío “Speed Vac” (UNIVAPO 100 H, UniEquip). El precipitado se resuspendió en 10 µl de una

solución 6% de fosfoaminoácidos fríos (fosfoserina, fosfotreonina y fosfotirosina) y 94% de

tampón pH 1.9 (ácido fórmico:ácido acético:agua 2,5:7:89,7 v/v). Se añadió 1 µl de bromofenol

0,1% y se agitó con vortex. A continuación se centrifugó 2 minutos a 13000 rpm, se transfirió el

sobrenadante a un tubo nuevo y se cuantificaron las CPM (counts per minute) en un contador de

cintilación “Wallac 1409 DSA”. Se aplicó el mismo número de CPM de cada muestra en

cromatoplacas de celulosa (Merk, Darmsadtd, Alemania) de 20x20 cm de longitud y 0,1 mm de

espesor, secando la muestra con nitrógeno después de cada aplicación. Para la separación

electroforética usamos el sistema Multiphor II (Pharmacia Biotech). La primera dimensión

empleó tampón pH 1.9. Se humedeció la cromatoplaca con el tampón, evitando excesos de

líquido, y se colocaron unos puentes de papel Whatman 3MM de 13x20 cm. Las condiciones de

electroforesis fueron 1000 V durante 90 min. A continuación se incubaron en un solución de

ninhidrina 0,25% (peso/volumen) en acetona durante 8 minutos a temperatura ambiente y a

continuación se secaron a 65 ºC para revelar los fosfoaminoácidos fríos. Los fosfoaminoácidos

radiactivos se revelaron por exposición en película de rayos X.

135


6. PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES FRENTE A VRK2 HUMANA.

Previamente se purificó la cantidad suficiente para todas las inoculaciones necesarias de

proteína de fusión GST-VRK2A humana, según el protocolo descrito en el apartado anterior, se

dializó frente a PBS y se concentró hasta 1mg/ml. Para cada inoculación se utilizaron 200 µg de

proteína GST-VRK2A purificada. En la primera inmunización, la proteína se emulsionó con

“Adyuvante de Freund’s Completo” (SIGMA, Saint Louis, Missouri) y la inyección fue

subcutánea para conseguir una mayor reacción inmune. Para las siguientes dosis de recuerdo la

proteína se emulsionó con “Adyuvante de Freund’s Incompleto” (SIGMA, Saint Louis,

Missouri) y la inyección fue intramuscular, de esta forma la respuesta inmune es más duradera.

Se dieron un total de tres dosis de recuerdo, cada 20 días después de la última inmunización.

Para hacer un seguimiento de los anticuerpos generados en el suero, se realizó una extracción

de suero pre-inmune (antes de la primera inoculación) que nos sirvió como control negativo.

Las demás extracciones se hicieron 10 días después de cada inoculación. Para comprobar el

enriquecimiento del suero tras las distintas inoculaciones se llevaron a cabo western blots de

geles preparativos de la proteína de fusión GST-VRK2A utilizando distintas diluciones del

suero. Tras la primera dosis de recuerdo la respuesta inmune fue muy alta. La cantidad de

anticuerpos específicos no pareció mejorar tras la tercera dosis de recuerdo, por tanto el animal

fue sacrificado.

Posteriormente el suero inmune se purificó por columna de afinidad de antígeno. La columna de

afinidad se preparó conjugando 10 mg de la misma proteína usada para la inmunización por

cada ml de resina “NSH-activated sepharose 4B Fast Flow” (Amershan Pharmacia Biotech,

Uppsala, Sweden) en 0.5M Na2PO4 (pH 7.5), y posteriormente se incubó con 10 volúmenes de

una solución 100mM Etanolamina (pH7.5) durante 4 h a 4ºC. Para eliminar el antígeno no

unido, la resina se lavó abundantemente con distintos tampones: 10mM Tris pH 7.5, 100mM

glicina pH2.5, 10mM Tris pH8.8 hasta que el pH de los lavados fue de 8.8, 100mM

Trietanolamina pH 11.5, y finalmente con 10mM Tris pH7.5 hasta que el pH de los lavados fue

de 7.5. Posteriormente se diluyó el suero 1:10 en 10mM Tris pH7.5 y se pasó por la columna de

afinidad con flujo lento. A continuación se lavó abundantemente con el tampón 10 mM Tris pH

7.5, y posteriormente con 500mM de NaCl + 10mM Tris pH 7.5. Los anticuerpos purificados

fueron eluidos en dos pasos: aquellos unidos con cargas positivas con 100mM Glicina pH 2.5,

y aquellos unidos con carga negativa con 100mM Trietanolamina pH 11.5. Los anticuerpos

fueron finalmente dializados y concentrados con un centricón “Amicon Ultra” (Millipore,

Carrigtwohill, Co. Cork, Irland) frente a PBS con 0.02% de azida sódica. Una vez purificados

se titularon para su uso en Western blot, inmunofluorescencias e inmunoprecipitaciones.


136

7. RT-PCR DE LÍNEAS CELULARES.

7.1. Extracción de ARN total de células en cultivo.

Se partió de 10x106 células de cada línea celular que habían crecido hasta un 80% de

confluencia, se lavaron con PBS frío y se extrajo el ARN mediante el uso de membranas

basadas en silica-gel de la casa comercial Quiagen (“RNAeasy kit”). El ARN así obtenido se

analizó y cuantificó usando el sistema “Bioanalyzer 2100 nano-lab chip” de Agilent

technologies.

7.2. Síntesis de ADN codificante a partir de ARN total.

Se incubó 1µg de ARN con agua libre de ARNasas hasta un volumen final de 10 µl a 65ºC

durante 10 minutos para desnaturalizar el ARN. Posteriormente se añadieron 0,5 µl de ARNsin

(inhibidor de ARNasa), 2 µl de dNTPs 10 mM, 4 µl de MgCl2 25 mM, 1 µl de oligodT, 1 µl de

retrotranscriptasa (20 unidades aproximadamente) y 2 µl del tampón indicado por el fabricante

(todos los productos son de “First Strand cDNA Synthesis Kit” de Promega). La mezcla se

incubó 1 hora a 42ºC. Para detener la reacción se incubó 10 minutos a 95ºC y se añadieron 80

µl de agua tratada con DEPC (un inhibidor de ARNasa) a la reacción.

7.3. Detección de distintos mensajeros de VRK2 mediante amplificación por PCR.

Se utilizó 1 µl del ADNc obtenido según el apartado anterior en cada reacción de PCR. La

mezcla de reacción y las condiciones de la PCR fueron las mismas que en el apartado 1. En esta

ocasión, puesto que queremos detectar la existencia de los mensajeros en distintas líneas

celulares, se diseñaron los oligonucleótidos VRK2TA y VRK2TB que flanquean la región

donde tiene lugar inserción de los 44 nucleótidos, en la posición 1312. Los productos de la

reacción se fragmentaron en geles verticales de poliacrilamida del 5% y 20 cm, en tampón TAE

a un voltaje constante de 120 voltios durante 2-3 h. Posteriormente se tiñeron en tampón TAE

con 0,5 µg/ml de bromuro de etidio durante 20 minutos. Como marcador de tamaños “Ready

LoadTM ФX174 DNA/Hae III Fragments” (GIBCO-Life Technologies). La secuencia de

VRK2TA, VRK2TB y los oligonucleótidos para amplificar GAPDH (GAPDH5 y GAPDH3) se

detalla en la Tabla 1.

7.4. RT-PCR cuantitativa en tiempo real.

Se usaron 100 ng de ARN total en una reacción de RT-PCR a tiempo real usando el kit

“Quantitec SYBR Green RT-PCR kit” de Quiagen en un termociclador “iCycler” (Biorad,

Hercules, CA) y los oligonucleótidos sonda específicos en cada caso. La reacción se analizo con

el software de “iCycler”.

137


8. CULTIVO CELULAR.

Las líneas celulares usadas se cultivaron en incubador a 37ºC y con una atmósfera al 5% de CO2

y 98% de humedad relativa. Los medios de cultivo fueron suplementados en todo caso con

2mM de Glutamina, 50 unidades/ml de penicilina y 50 µg/ml de estreptomicina. Todos los

medios, sueros y suplementos fueron obtenidos de GIBCO-Life Technologies. En la Tabla 3 se

resumen las características de las líneas celulares utilizadas.

9. TRANSFECCIONES TRANSITORIAS DE ADN EN CÉLULAS EUCARIOTAS EN CULTIVO

MONOCAPA.

En todos los experimentos de sobre-expresión de proteínas en células eucariotas se hicieron

transfecciones transitorias de células en cultivo monocapa. Para lo cual, 24 h antes de la

transfección las células fueron sembradas a una densidad de modo que estuvieran entre un 60-

80% de confluencia en el momento de la transfección. El ADN para las transfecciones se

preparó con el sistema comercial “JETStar endotoxin-free maxiprep kit” (Genomed, Bad

Oeynhausen, Alemania). Las células se transfectaron con las construcciones de ADN indicadas

en cada experimento con uno de los siguientes métodos:

- Precipitación con fosfato cálcico según [409]. Se mezcló el ADN a una concentración

final de 25 µg/ml con CaCl2.2H2O a 0,25M, se agitó con vortex y se incubó durante 1

hora a temperatura ambiente. La solución se añadió gota a gota y agitando con vortex a

una solución 50 mM Hepes, 280 mM NaCl y 0,23% peso/volumen de NaH2PO4.H2O.

Se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora tras lo cual se agitó con vortex y se

añadió la mezcla de transfección a las células. 12 horas después de la transfección las

células fueron sometidas a un choque con glicerol al 10% durante 1 minuto, antes de

retirar los precipitados, para aumentar la eficiencia de transfección. Este método se usó

principalmente con la línea celular Cos1 en experimentos de inmunofluorescencia.

- Usando “JetPEI™ Cationic polymer transfection reagent” (Polyplustransfection, Illkirch,

Francia). Se diluyeron por separado el ADN y el reactivo JetPEI en un volumen

determinado de NaCl 150 mM en una proporción N/P (número de residuos de nitrógeno

del reactivo por fosfato del ADN) de 5 según recomendación de la casa comercial. Se

agitó cada una de las mezclas con vortex y a continuación se añadió la solución de

JetPEI sobre la solución de ADN, se agitó en vortex y se incubó a temperatura

ambiente. Tras 15-30 minutos se añadió a las células y se homogeneizó con el medio de

cultivo. Usamos este reactivo con líneas celulares con baja eficiencia de transfección

con el método de precipitación con fosfato cálcico, como en MEFs, H1299, A549 y en

general en los casos en los que se indica en experimentos de detección de proteína por


138

Western blot, inmunofluorescencia o en ensayos de detección de actividad

transcripcional.

Como control de la eficiencia de la transfección, fue introducido un vector para expresión

eucariota constitutiva de la proteína fluorescente verde GFP en cantidad y condiciones iguales a

las de las construcciones transfectadas para el experimento.

10. ELECTROFORESIS EN GELES SDS-PAGE Y WESTERN BLOT DE EXTRACTOS

PROTEICOS.

Para la obtención de extractos proteicos totales de células en cultivo, las células se lavaron con

PBS frío y en todos los casos se recogieron directamente en tampón de lisis (150 mM NaCl,

1,5mM Mg Cl2, 10mM NaF, 10% glicerol, 4mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 50mM

Hepes pH 7,4) más inhibidores de proteasas y fosfatasas (1mM PMSF, 10 µg/ml aprotinina, 10

µg/ml leupeptina, 2 mM DTT, 1mM ortovanadato de sodio ), salvo en algunas excepciones en

las que se indica. Tras incubación de 30 minutos en hielo se centrifugaron los extractos durante

20 minutos a 16.000 x g a 4ºC. Se recuperó la fracción soluble y se midió la cantidad proteica

total con “BIORAD protein assay” (Biorad), usando BSA para hacer una curva patrón.

Se resolvió una cantidad igual de extracto proteico (25-75 µg) mediante electroforesis vertical

en gel SDS-PAGE (sodium-dodecylsulfate-polyacrlamide gel electrophoresis) con un

porcentaje de acrilamida adecuado al tamaño de la proteína a analizar. Para ello las muestras se

procesaron con tampón de carga (62.5mM Tris-HCl pH6.8, 10% glicerol, 2.3% SDS, 0.1% azul

de bromofenol, 5% β-mercaptoetanol) y se hirviendo durante 5 minutos. El gel se corrió en

condiciones desnaturalizantes en tampón de carrera adecuado (25mM Tris, 192mM glicina y

1.7mM SDS) según [410]. Como marcadores de masa molecular se utilizaron marcadores

preteñidos “Precision Plus Protein™ Standards Dual Color” de Biorad.

Las proteínas se transfirieron después a una membrana PVDF (Millipore) mediante

transferencia húmeda en el tampón de transferencia según [411] (25 mM Tris, 19.2mM glicina y

20% metanol).

Para llevar a cabo el Western blot la membrana se bloqueó durante 1h a temperatura ambiente o

toda la noche a 4ºC en agitación en 5% de leche en polvo desnatada en el tampón TBS-T

(25mM Tris, 50mM NaCl, 2.5mM KCl y 0.1% Tween-20). A continuación la membrana fue

incubada con el anticuerpo primario a la dilución adecuada que se indica en la Tabla 4 durante

1-2 h a temperatura ambiente, seguido de varios lavados de TBS-T en agitación durante 30

minutos. El anticuerpo secundario correspondiente (ver Tabla 4) conjugado con peroxidasa se

139


incubó con la membrana a la dilución adecuada durante 1 h a temperatura ambiente. En algunos

casos se utilizó un puente de biotina para mejorar la detección. Para ello la membrana se incubó

tras el primario con el anticuerpo secundario correspondiente marcado con biotina y

seguidamente con Streptavidina-Peroxidasa. La membrana se lavó varias veces en agitación

durante 30 minutos antes de detectar la luminiscencia tras incubación con el reactivo “ECL

Western Blotting Detection Reagents” (Ammersham Biosciences). La luminiscencia emitida se

detectó exponiendo las membranas con películas de rayos X.

11. FRACCIONAMIENTO NUCLEAR.

Se recogieron las células crecidas en placas de cultivo mediante tripsina-EDTA 5 minutos a

37ºC y centrifugaron y se lavaron con PBS. Las células se resuspendieron en un tampón TM-2

(0.01 M Tris-HCl pH7.4; 0.002 M MgCl2; 0.0005 M PMSF) más inhibidores de proteasas

durante 1 minuto a temperatura ambiente y 5 minutos en hielo, tras los cuales se añadió Triton

X-100 a 0,5% v/v y se incubaron 5 minutos más en hielo. Estos extractos se pasaron por agujas

21G (0,8x25 mm). La fracción soluble del citosol se obtuvo centrifugando el extracto total

primero a 1000 g durante 10 minutos, y el sobrenadante a su vez a 20000 g durante 10 minutos,

mientras que los precipitados (los núcleos) se lavaron con el tampón TM-2, se resuspendieron y

se incubaron 30 minutos en tampón B (20mM Hepes-KOH pH7.9; 0,4M NaCl; 1mM DTT) más

inhibidores de proteasas. Finalmente se centrifugaron a 20000 g durante 5 minutos para obtener

la fracción soluble nuclear.

12. ENSAYOS DE CO-INMUNOPRECIPITACIÓN.

Las inmunoprecipitaciones se llevaron a cabo a partir de 1-1.5 mg de extracto proteico total. En

este caso los extractos se lisaron con el tampón indicado en cada experimento. Para evitar

uniones inespecíficas se pre-incubó el extracto con 30 µl de resina “GammaBind Plus

Sepharose” (Ammersham Biosciences), equilibrada con el tampón en el que están hechos los

extractos proteicos, durante 1 hora a 4ºC en agitación orbital. Posteriormente se retiró la resina y

se incubó el extracto total con el anticuerpo concreto a la concentración adecuada durante toda

la noche a 4ºC en agitación orbital y a continuación se añadieron 50 µl de resina bloqueada

previamente con sero-albúmina bovina al 1%. Se incubó esta mezcla durante 2 h más a 4ºC con

agitación. Tras este tiempo se recogió la resina por centrifugación suave y se lavó con el tampón

de lisis varias veces antes de ser procesadas con tampón de carga. Por último se analizaron

mediante electroforesis SDS-PAGE y Western blot.


140

13. ENSAYOS DE INTERACCIÓN POR PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS DE FUSIÓN CON

GST (“ENSAYOS DE PULL-DOWN”).

Estos ensayos se llevaron a cabo para precipitar complejos de proteínas fusionadas a GST

expresadas en células eucariotas. Se partió de 1-1.5 mg de extracto proteico total recogido en un

tampón de lisis específico (20 mM tris-HCl pH 7.4, 137 mM NaCl, 2 mM EDTA, 25 mM β-

glicerofosfato, 10% (v/v) glicerol y 1% Triton X-100) más inhibidores de proteasas y fosfatasas

(1mM PMSF, 10mg/ml aprotinina, 10mg/ml leupeptina, 1mM Ortovanadato de sodio). Para

precipitar las proteínas de fusión con GST se incubaron los extractos con 20 µl de resina

“Glutathion Sepharose 4B beads” (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) durante 4-12 h a

4ºC en agitación suave. Tras este tiempo se recogió la resina por centrifugación suave y se lavó

con el tampón de lisis varias veces antes de añadirles tampón de muestra y analizar las proteínas

así precipitadas con anticuerpos específicos mediante electroforesis SDS-PAGE y Western blot.

14. INMUNOFLUORESCENCIA.

Con el objetivo de detectar y localizar mediante microscopía óptica proteínas sobre-expresadas

o endógenas en células en cultivo se llevaron a cabo ensayos de inmunofluorescencia. Para lo

cual las células se sembraron sobre cubreobjetos de vidrio estériles y en el caso de proteína

sobre-expresada las células se transfectaron como se indica en el apartado 9. Transcurridas 24 a

48 h, según el tipo de ensayo, las células fueron lavadas con tampón PBS frío y fijadas con

paraformaldehido al 4% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la fijación, las

células fueron tratadas durante 10 minutos con Glicina 10mM a temperatura ambiente para

bloquear los sitios aldehído libres y posteriormente permeabilizadas en PBS frío con 0.2% de

Triton X-100 durante 30 minutos. A continuación se bloquearon con 1% de BSA en PBS

durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después se incubaron 30 minutos a 37ºC con el

anticuerpo primario en la misma solución. Tras lavar las células tres veces con 0.1% Triton X-

100 en PBS, se incubaron con el anticuerpo secundario específico marcado con un fluorocromo.

Tras otros 3 lavados en el mismo tampón de lavado, los núcleos celulares se tiñeron con DAPI

(4’,6’-diamidino-2-fenilindol) durante 10 minutos en PBS a temperatura ambiente. Tras un

último lavado con PBS los cubreobjetos se montaron sobre portaobjetos con Gelvatol

(Monsanto) y la localización subcelular de los antígenos se analizó mediante microscopía

confocal en un microscopio confocal Zeiss LSM510. Las imágenes así adquiridas se analizaron

con el programa LSM Image Examiner de Zeiss.

141


15. MEDIDA DE LA ACTIVIDAD TRANSCRIPCIONAL CON GEN REPORTERO DE

LUCIFERASA.

La actividad transcripcional de los factores de transcripción se determinó usando diferentes

construcciones con elementos de respuesta bien sintéticos o bien específicos para genes que son

transactivados por el factor de transcripción en cuestión. En todo caso, el promotor usado induce

la expresión de la proteína luciferasa de luciérnaga. Como control de la cantidad de proteína y

de la eficiencia de la transfección se usó el plásmido pRL-tk, que codifica para la luciferasa de

Renilla. En todos los casos se utilizaron como controles internos del ensayo dos reporteros de

luciferasa que nos permiten conocer el máximo de actividad luciferasa (pSV40) y el mínimo o

fondo de actividad luciferasa (pBASIC).

15.1. Medida de la actividad transcripcional dependiente de p53.

Las células de la línea celular A549 se sembraron a 5x105 células por placa en placas de p60

(60mm de diámetro). 24 h después se transfectaron mediante el reactivo “JetPEI™ Cationic

polymer transfection reagent” (Polyplustransfection, Illkirch, Francia) con 0,5µg de la

construcción reportera específica, 0,3 µg de pRL-tk y las cantidades indicadas del plásmido

codificante para VRK2A o VRK2B. El vector vacío pGEX4T1 se usó como ADN de relleno. La

actividad luciferasa se midió a las 48 h tras la transfección usando el sistema “Dual Luciferase

reporter” de Promega y determinando la luminiscencia emitida con un luminómetro MiniLumat

LB9506 (Berthold).

15.2. Medida de la actividad transcripcional dependiente de AP1.

Las células de la línea celular Cos1 fueron sembradas en placas de 35 mm, 24 h después se

transfectaron mediante el reactivo “JetPEI™ Cationic polymer transfection reagent”

(Polyplustransfection, Illkirch, Francia) con 0,8 µg de la construcción reportera de luciferasa

AP1-Luc, 10 ng de pRL-tk y distintas cantidades de pCEFL-HA-VRK2A/B salvaje o la quinasa

inactiva y/o un plásmido que codifica para un ARN de interferencia del gen VRK2 humano,

además de otras quinasas y/o proteínas que se indican en cada experimento. La actividad

luciferasa se midió a las 40 h después de la transfección.

16. ANÁLISIS MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO (FACS).

Para analizar el perfil de ciclo de células con VRK2 sobre-expresada, se realizó un análisis

simultáneo del contenido de ADN mediante el marcaje con ioduro de propidio y de proteína

verde fluorescente (GFP). Para lo cual las células se transfectaron con un vector de expresión

para GFP-VRK2 o GFP como control. Tras 48 horas se recogieron las células creciendo en

placas de cultivo y se lavaron con PBS. A continuación se resuspendieron en 1ml de

paraformaldehido al 1% (SIGMA) durante 15-30 minutos a temperatura ambiente, se


142

centrifugaron y se resuspendieron en 700µl de 70% de etanol frío, manteniéndose así a 4ºC.

Tras la fijación las células se lavaron 3 veces con PBS y se resuspendieron en la solución de

marcaje con ioduro de propidio (5 µg/ml de ioduro de propidio y 200 µg/ml de ARNasa A en

PBS, pH 7.4 preparada fresca) y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente en

oscuridad. Por último las células marcadas se analizaron en un citómetro FACScalibur

(Beckton-Dickinson) midiendo la fluorescencia verde asociada a GFP y la fluorescencia roja

asociada al ADN del ioduro de propidio.

17. EXPERIMENTOS DE SUPRESIÓN DE LA EXPRESIÓN CON ARN DE INTERFERENCIA.

Las secuencias para clonar el dúplex de DNA de VRK2A (AB000450) en pSUPER

(OligoEngine, DNAengine, Seattle, WA) fueron diseñadas en el programa Oligoengine

(http://www.oligoengine.com/). Se seleccionaron varias de ellas, aunque sólo parece

funcionar las secuencias 5’-GAAGATTGGCTCTGGAGGA-3’ que anilla en la posición 230-

249 del ADN codificante y 5’-ATACACTTCCACAGTCAGC-3’ que anilla en la posición 1335

del ADN codificante. Estas secuencias deben estar integradas a su vez en otra para formar el

dúplex y poder ligarlas al vector pSUPER y pSUPERIOR. Uno de los dúplex resultantes que

fueron sintetizados por Isogen son:

5’-GATCCCCGAAGATTGGCTCTGGAGGATTCAAGAGATCCTCCAGAGCCAATCTTCTTTTTGGAAA-3’

5’-AGCTTTTCCAAAAAGAAGATTGGCTCTGGAGGATCTCTTGAATCCTCCAGAGCCAATCTTCGGG-3’

Estos dúplex se hibridaron y se ligaron al vector según instrucciones del manual del vector.

Posteriormente se llevó a cabo transfecciones con el reactivo JetPEI (Polyplustransfection,

Illkirch, Francia) en Hela, para comprobar que disminuían los niveles de proteína endógena o

sobre-expresada VRK2A o VRK2B.

18. REACTIVOS.

Todos los reactivos usados fueron obtenidos de las compañías Sigma o Calbiochem.

19. ABREVIATURAS.

aa: aminoácidos ADN: ácido desoxiribonucleico ARN: ácido ribonucleico ATP: del inglés “Adenosine TriPhosphate” BSA: del inglés “bovine serum albumin”. Sero-albúmina bovina Chk: del inglés “checkpoint kinase” CKI: del inglés “casein kinase I” CKII: del inglés “casein kinase II” CPM: del inglés “counts per minute”. Cuentas por minuto. DAPI: del inglés “4’,6’-DiAmidino-2-Phenil Indol”

143


DMEM: del inglés “Dubelco’s modified- Minimum Essential Medium” DTT: DiTioTreitol EDTA: del inglés “EthyleneDiamine-Tetraacetic Acid” FBS: del inglés “Fetal Bovine Serum”. Suero fetal bovino GFP: del inglés “Green Fluorescent Protein” GST: Glutation-S-Transferasa Hdm2: correspondiente humano a Mdm2. IB: inmunoblot o western blot IPTG: IsoPropil-β-D-TioGalactopiranósido KD: del inglés “kinase dead”, quinasa inactiva KDa: kilodalton LB: medio “Luria bertani” Mdm2: del inglés “Mouse Double Minute-2” MEFs: del inglés “Mouse Embryo Fibroblast”. Fibroblasto de embrión de ratón nm: nanómetro mg: miligramo ml: mililitro mm: milímetro mM: milimolar ng: nanogramo un: nucleótidos ºC: grado centígrado PBS: del inglés “Phosphate Buffer Salinum” PCR: del inglés “Polimerase Chain Reaction” PMSF: del inglés “Phenyl Methyl Sulfonyl Phuoride”. Fluoruro de fenilmetilsulfonilo PVDF: del inglés “PolyVinyliDene Fluoride” SDS: del inglés “Sodium Dodecyl Sulfate” SDS-PAGE: del inglés “SDS-Polyacrilamide Gel Electrophoresis” v/v: relación volumen/volumen w/v: relación peso volumen WT: del inglés “wild type”, silvestre x g: veces la fuerza de la gravedad µCi: microcurio µg : microgramo µl: microlitro µM: micromolar Aminoácidos A Ala alanina C Cys cisteína D Asp aspartato E Glu glutámico F Phe fenilalanina G Gly glicina H His histidina I Ile isoleucina K Lys lisina L Leu leucina M Met metionina N Asn asparagina P Pro prolina Q Gln glutamina R Arg arginina S Ser serina T Thr treonina V Val valina W Trp triptófano Y Tyr tirosina Bases Nitrogenadas A adenina C citosina U uracilo G guanina T timidina


144

TABLA 1. OLIGONUCLEÓTIDOS USADOS.

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145


TABLA 2. CONSTRUCCIONES DE ADN RECOMBINANTE USADAS.

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1V

RK

2B h

uman

a si

lves

tre c

ompl

eta

Bam

HI-S

al I

Exp

resi

ón p

rote

ína

de fu

sión

con

G

ST

en b

acte

rias

pGEX

-VR

K2A

KD

pGE

X-4T

1V

RK

2A m

utan

te in

activ

o K

169E

Bam

HI-S

al I

Exp

resi

ón p

rote

ína

de fu

sión

con

G

ST

en b

acte

rias

pGEX

-VR

K2B

KD

pGE

X-4T

1V

RK

2B m

utan

te in

activ

o K

169E

Bam

HI-S

al I

Exp

resi

ón p

rote

ína

de fu

sión

con

G

ST

en b

acte

rias

HA-

VRK

2ApC

EFL

-HA

VR

K2A

hum

ana

com

plet

aB

gl II

-Not

IE

xpre

sión

euc

ario

taH

A-VR

K2B

pCE

FL-H

AV

RK

2B h

uman

a co

mpl

eta

Bgl

II-N

otI

Exp

resi

ón e

ucar

iota

HA-

VRK

2AK

DpC

EFL

-HA

VR

K2A

mut

ante

inac

tivo

K16

9EB

gl II

-Not

IE

xpre

sión

euc

ario

taH

A-VR

K2B

KD

pCE

FL-H

AV

RK

2B m

utan

te in

activ

o K

169E

Bgl

II-N

otI

Exp

resi

ón e

ucar

iota

Myc

-VR

K2A

pEF1

-Myc

/His

VR

K2A

hum

ana

silv

estre

com

plet

aB

amH

I-Not

IE

xpre

sión

euc

ario

taM

yc-V

RK

2BpE

F1-M

yc/H

isV

RK

2B h

uman

a si

lves

tre c

ompl

eta

Bam

HI-N

otI

Exp

resi

ón e

ucar

iota

Myc

-VR

K2A

KD

pEF1

-Myc

/His

VR

K2A

mut

ante

inac

tivo

K16

9EB

amH

I-Not

IE

xpre

sión

euc

ario

taM

yc-V

RK

2BK

DpE

F1-M

yc/H

isV

RK

2B m

utan

te in

activ

o K

169E

Bam

HI-N

otI

Exp

resi

ón e

ucar

iota

HA-

VRK

2B(2

56-3

97)

pCE

FL-H

AV

RK

2B, d

omin

io C

-term

inal

(256

-397

aa)

Bam

HI-N

otI

Exp

resi

ón e

ucar

iota

HA-

VRK

2(1-

320)

pCE

FL-H

AV

RK

2A/B

, dom

inio

N-te

rmin

al (1

-320

aa)

Bam

HI-S

al I

Exp

resi

ón e

ucar

iota

HA-

VRK

2(1-

115)

pCE

FL-H

AV

RK

2A/B

, dom

inio

N-te

rmin

al (1

-115

aa)

Bam

HI-N

otI

Exp

resi

ón e

ucar

iota

HA-

VRK

2A(2

56-5

08)

pCE

FL-H

AV

RK

2A, d

omin

io C

-term

inal

(256

-508

aa)

Bam

HI-N

otI

Exp

resi

ón e

ucar

iota

HA-

VRK

2A(3

64-5

08)

pCE

FL-H

AV

RK

2A, d

omin

io C

-term

inal

(364

-508

aa)

Bam

HI-N

otI

Exp

resi

ón e

ucar

iota

GST

-VR

K2A

pCE

FL-G

ST

VR

K2A

hum

ana

com

plet

aB

amH

I-Not

IE

xpre

sión

euc

ario

taG

ST-V

RK

2BpC

EFL

-GS

TV

RK

2B h

uman

a co

mpl

eta

Bam

HI-N

otI

Exp

resi

ón e

ucar

iota

GST

-VR

K2A

KD

pCE

FL-G

ST

VR

K2A

mut

ante

inac

tivo

K16

9EB

amH

I-Not

IE

xpre

sión

euc

ario

taG

ST-V

RK

2BK

DpC

EFL

-GS

TV

RK

2B m

utan

te in

activ

o K

169E

Bam

HI-N

otI

Exp

resi

ón e

ucar

iota

GST

-VR

K2(

1-32

0)pC

EFL

-GS

TV

RK

2A/B

, dom

inio

N-te

rmin

al (1

-320

aa)

Bam

HI-N

otI

Exp

resi

ón e

ucar

iota

GST

-VR

K2B

(256

-397

)pC

EFL

-GS

TV

RK

2B, d

omin

io C

-term

inal

(256

-397

aa)

Bam

HI-N

otI

Exp

resi

ón e

ucar

iota

GST

-VR

K2A

(256

-508

)pC

EFL

-GS

TV

RK

2A, d

omin

io C

-term

inal

(256

-508

aa)

Bam

HI-N

otI

Exp

resi

ón e

ucar

iota

GST

-VR

K2A

(364

-508

)pC

EFL

-GS

TV

RK

2A, d

omin

io C

-term

inal

(364

-508

aa)

Bam

HI-N

otI

Exp

resi

ón e

ucar

iota

pSU

PER

IOR

-VR

K2-

230

pSU

PE

RIO

RA

RN

de

inte

rfere

ncia

de

VR

K2

(pos

ició

n 23

0)E

coR

I-Hin

dIII

Sup

resi

ón d

e la

exp

resi

ón d

e V

RK

2 po

r AR

N d

e in

terfe

renc

ia

pSU

PER

IOR

-VR

K2-

438

pSU

PE

RIO

RA

RN

de

inte

rfere

ncia

de

VR

K2

(pos

ició

n 43

8)E

coR

I-Hin

dIII

Sup

resi

ón d

e la

exp

resi

ón d

e V

RK

2 po

r AR

N d

e in

terfe

renc

ia

pSU

PER

IOR

-VR

K2-

1335

pSU

PE

RIO

RA

RN

de

inte

rfere

ncia

de

VR

K2

(pos

ició

n 13

35)

Eco

RI-H

indI

II S

upre

sión

de

la e

xpre

sión

de

VR

K2

por A

RN

de

inte

rfere

ncia

pSU

PER

IOR

-siV

RK

1-01

pSU

PE

RIO

RA

RN

de

inte

rfere

ncia

de

VR

K1

Eco

RI/H

indI

II E

xpre

sión

euc

ario

taF.

Veg

a


146

TABLA 2 (CONTINUACIÓN).

Con

stru

cció

nVe

ctor

Inse

rto

Dia

nas

de

rest

ricci

ónU

soPr

oced

enci

a

pGEX

pGE

X-4T

1E

xpre

sión

de

GS

T en

bac

teria

sP

harm

acia

Bio

tech

FP 2

21pG

EX-

2Tp5

3 m

urin

a, d

omin

io a

min

o te

rmin

al (a

a 1-

85)

silv

estre

Exp

resi

ón p

rote

ína

de fu

sión

con

G

ST

en b

acte

rias

DW

Mee

k (D

unde

e, U

K)

PF 2

21 T

18A

pGE

X-2T

p53

mur

ina,

dom

inio

am

ino

term

inal

(aa

1-85

) m

utan

te T

18A

F.V

ega

FP 3

80pG

EX-

2Tp5

3 m

urin

a, d

omin

io a

min

o te

rmin

al (a

a 1-

85,

S4/

6/9A

) silv

estre

E

xpre

sión

pro

teín

a de

fusi

ón c

on

GS

T en

bac

teria

sD

W M

eek

(Dun

dee,

UK

)

PF 3

80 T

18A

pGE

X-2T

p53

mur

ina,

dom

inio

am

ino

term

inal

(aa

1-85

, S

4/6/

9A) m

utan

te T

18A

DW

Mee

k (D

unde

e, U

K)

FP 2

67pG

EX-

2Tp5

3 m

urin

a, d

omin

io a

min

o te

rmin

al (a

a 1-

64)

silv

estre

Exp

resi

ón p

rote

ína

de fu

sión

con

G

ST

en b

acte

rias

DW

Mee

k (D

unde

e, U

K)

FP 2

79

pGE

X-2T

p53

mur

ina,

dom

inio

am

ino

term

inal

(aa

11-6

3)

silv

estre

Exp

resi

ón p

rote

ína

de fu

sión

con

G

ST

en b

acte

rias

DW

Mee

k (D

unde

e, U

K)

PF 2

79 S

15I

pGE

X-2T

p53

mur

ina,

dom

inio

am

ino

term

inal

(aa

11-6

3)

mut

ante

S15

Exp

resi

ón p

rote

ína

de fu

sión

con

G

ST

en b

acte

rias

S. L

ópez

Bor

ges

PF 2

79 T

18A

pGE

X-2T

p53

mur

ina,

dom

inio

am

ino

term

inal

(aa

11-6

3)

mut

ante

T18A

Exp

resi

ón p

rote

ína

de fu

sión

con

G

ST

en b

acte

rias

S. L

ópez

Bor

ges

PF 2

79 S

20A

pGE

X-2T

p53

mur

ina,

dom

inio

am

ino

term

inal

(aa

11-6

3)

mut

ante

S20

AE

xpre

sión

pro

teín

a de

fusi

ón c

on

GS

T en

bac

teria

sS

. Lóp

ez B

orge

s

PF 2

79 S

34A

pGE

X-2T

p53

mur

ina,

dom

inio

am

ino

term

inal

(aa

11-6

3)

mut

ante

S34

AE

xpre

sión

pro

teín

a de

fusi

ón c

on

GS

T en

bac

teria

sS

. Lóp

ez B

orge

s

PF 2

79 S

55N

pGE

X-2T

p53

mur

ina,

dom

inio

am

ino

term

inal

(aa

11-6

3)

mut

ante

S55

NE

xpre

sión

pro

teín

a de

fusi

ón c

on

GS

T en

bac

teria

sS

. Lóp

ez B

orge

s

PF 2

79 S

61A

pGE

X-2T

p53

mur

ina,

dom

inio

am

ino

term

inal

(aa

11-6

3)

mut

ante

S61

A

Exp

resi

ón p

rote

ína

de fu

sión

con

G

ST

en b

acte

rias

S. L

ópez

Bor

ges

PF27

9 S1

5I +

S20

ApG

EX-

2Tp5

3 m

urin

a, d

omin

io a

min

o te

rmin

al (a

a 11

-63)

m

utan

te S

15I y

S20

AE

xpre

sión

pro

teín

a de

fusi

ón c

on

GS

T en

bac

teria

sD

W M

eek

(Dun

dee,

UK

)

PF 2

79 S

15A

+ S3

4ApG

EX-

2Tp5

3 m

urin

a, d

omin

io a

min

o te

rmin

al (a

a 11

-63)

m

utan

te S

15I y

S34

AE

xpre

sión

pro

teín

a de

fusi

ón c

on

GS

T en

bac

teria

sD

W M

eek

(Dun

dee,

UK

)

PF 2

79 S

15A

+ T1

8ApG

EX-

2Tp5

3 m

urin

a, d

omin

io a

min

o te

rmin

al (a

a 11

-63)

m

utan

te S

15I y

T18

AE

xpre

sión

pro

teín

a de

fusi

ón c

on

GS

T en

bac

teria

sC

.J. S

anto

s

PF 2

79 T

18A

+ S2

0ApG

EX-

2Tp5

3 m

urin

a, d

omin

io a

min

o te

rmin

al (a

a 11

-63)

m

utan

te T

18A

y S

20A

Exp

resi

ón p

rote

ína

de fu

sión

con

G

ST

en b

acte

rias

C.J

. San

tos

PF 2

9 S1

5A +

T18

A +

S20A

pGE

X-2T

p53

mur

ina,

dom

inio

am

ino

term

inal

(aa

11-6

3)

mut

ante

S15

I, T1

8A y

S20

AE

xpre

sión

pro

teín

a de

fusi

ón c

on

GS

T en

bac

teria

sC

.J. S

anto

s

GST

-p53

(1-3

93)

pGE

X-2T

p53

hum

ana

com

plet

a (a

a 1-

393)

Exp

resi

ón p

rote

ína

de fu

sión

con

G

ST

en b

acte

rias

T. K

ouza

rides

(Cam

brid

ge,

UK

)

147



Con

stru

cció

nVe

ctor

Inse

rto

Dia

nas

de

rest

ricci

ónU

soPr

oced

enci

a

GST

-p53

(90-

290)

pGE

X-2T

p53

hum

ana,

dom

inio

cen

tral (

aa 9

0-29

0)E

xpre

sión

pro

teín

a de

fusi

ón c

on

GS

T en

bac

teria

s T.

Kou

zarid

es (C

ambr

idge

, U

K)

GST

-p53

(290

-390

)pG

EX-

2Tp5

3 hu

man

a, d

omin

io c

arbo

xilo

term

inal

(aa

290-

390)

E

xpre

sión

pro

teín

a de

fusi

ón c

on

GS

T en

bac

teria

s T.

Kou

zarid

es (C

ambr

idge

, U

K)

His

-Hdm

2pE

T23a

Hdm

2 hu

man

o co

mpl

eto

Bam

HI-X

hoI

Exp

resi

ón p

rote

ína

de fu

sión

con

H

is e

n ba

cter

ias

F.V

ega

GST

-Mdm

2(1-

188)

pGE

X-2T

Mdm

2 do

min

io a

min

o te

rmin

al (a

a 1-

188)

Exp

resi

ón p

rote

ína

de fu

sión

con

G

ST

en b

acte

rias

A. L

evin

e (R

ockf

elle

r U

nive

rsity

- E

EU

U)

pCB

6+p5

3pC

B6+

p53

hum

ano

silv

estre

S15

A, T

18A

y S

20A

Eco

RI-B

amH

IE

xpre

sión

euc

ario

taJ.

A. P

iete

npol

(Nas

hvill

e,

EE

UU

)

pCB

6+p5

3 T1

8ApC

B6+

p53

hum

ano

mut

ante

T18

AE

coR

I-Bam

HI

Exp

resi

ón e

ucar

iota

J.A

. Pie

tenp

ol (N

ashv

ille,

E

EU

U)

pCB

6+p5

3 S1

5ApC

B6+

p53

hum

ano

mut

ante

S15

AE

coR

I-Bam

HI

Exp

resi

ón e

ucar

iota

J.A

. Pie

tenp

ol (N

ashv

ille,

E

EU

U)

pCB

6+p5

3 S2

0ApC

B6+

p53

hum

ano

mut

ante

S20

AE

coR

I-Bam

HI

Exp

resi

ón e

ucar

iota

K. V

ausd

en (G

lasg

ow, U

K)

pCB

6+p5

3 S1

5A+T

18A

pCB

6+p5

3 hu

man

o m

utan

te S

15A

+ T

18A

Eco

RI-B

amH

IE

xpre

sión

euc

ario

taF.

Veg

apC

B6+

p53

S15A

+S20

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B6+

p53

hum

ano

mut

ante

S15

A +

S20

AE

coR

I-Bam

HI

Exp

resi

ón e

ucar

iota

F. V

ega

pCB

6+p5

3 S1

5A+T

18A+

S20A

pCB

6+p5

3 hu

man

o m

utan

te S

15A

+ T

18A

+ S

20A

Eco

RI-B

amH

IE

xpre

sión

euc

ario

taF.

Veg

a

pCoC

Mdm

2-X2

pC

oCM

dm2

de ra

tón

Eco

RI

Exp

resi

ón e

ucar

iota

M. O

ren

(Reh

ovot

, Isr

ael)

BR

RS1

2-U

biqu

itina

BR

RS

12H

is-U

biqu

itina

Eco

RI-N

otI

Exp

resi

ón e

ucar

iota

D. L

ane

(Gla

sgow

, UK

)

pCM

V-p3

00-H

ApC

MV

p300

Not

I-Hin

dIII

Exp

resi

ón e

ucar

iota

A. Z

ante

ma

(Lei

den,

H

olan

da)

p53-

Luc

pGL2

Pro

mot

or s

inté

tico

con

elem

ento

s de

resp

uest

a a

p53

Rep

orte

ro d

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ión

euca

riota

de

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fera

sa c

on p

rom

otor

de

resp

uest

a a

p53

Stra

tage

ne

p21W

af-L

uc

Pro

mot

or p

21W

af

Hin

dIII-

Sal

IR

epor

tero

de

expr

esió

n eu

cario

ta

de lu

cife

rasa

con

pro

mot

or d

e p2

1M

. Ore

n (R

ehov

ot, I

srae

l)

pBax

-Luc

pGL3

Pro

mot

or B

ax (3

70 p

b)K

pnI-S

acI

Rep

orte

ro d

e ex

pres

ión

euca

riota

de

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fera

sa c

on p

rom

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de

BA

XM

. Ore

n (R

ehov

ot, I

srae

l)

pMdm

2-Lu

cpG

L3P

rom

otor

Mdm

2 K

pnI-H

indI

IIR

epor

tero

de

expr

esió

n eu

cario

ta

de lu

cife

rasa

con

pro

mot

or d

e m

dm2

M. O

ren

(Reh

ovot

, Isr

ael)


148


Con

stru

cció

nVe

ctor

Inse

rto

Dia

nas

de

rest

ricci

ónU

soPr

oced

enci

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149


TABLA 3. LÍNEAS CELULARES USADAS.

Nombre Organismo Tejido de procedencia Principales características Propagación

NCI-H1299 Humano Cáncer de pulmón de célula no pequeña

Deleción parcial en homocigosis de p53. No expresión de p53.

RPMI 1640 + 10% FBS

A549 Humano Carcinoma de pulmón Expresión normal de p53 silvestre RPMI 1640 + 10% FBS

MEFs p53 mdm2 -/- Ratón Fibroblastos embrionários Delección de los genes p53 y

mdm2 DMEM + 10% FBS

Cos1Mono verde (Cercopithecus aethiops )

Fibroblastos de riñón Transformadas por virus SV40 DMEM + 10% FBS

HeLa Humano Adenocarcinoma de cérvix

Transformadas por el papillomavirus HPV-18. Expresión normal de pRB y baja de p53

DMEM + 10% FBS

SiHa Humano Carcinoma esquamoso de cérvix

Células epiteliales. Transformadas por papillomavirus HPV-16

DMEM + 10% FBS

C 4I Humano Carcinoma de cérvix Transformadas por papillomavirus HPV-18 DMEM + 10% FBS

SW756 Humano Carcinoma escamoso de cérvix Células epiteliales DMEM + 10% FBS

Cal51 Humano Carcinoma de mama RPMI 1640 + 10% FBS

H9528T Humano Carcinoma de mama RPMI 1640 + 10% FBS

MCF-7 Humano Adenocarcinoma de mama Expresión normal de p53 silvestre RPMI 1640 + 10% FBS

A498 Humano Carcinoma de Riñón RPMI 1640 + 10% FBS

293T Humano Carcinoma de Riñón Expresión normal de p53 silvestre DMEM + 10% FBS

Colo 320 DM Humano Carcinoma colorectal DMEM + 10% FBS

HCT116 Humano Carcinoma de colon DMEM + 10% FBSWiDr Humano Carcinoma colorectal DMEM + 10% FBSOSA Humano Osteosarcoma DMEM + 10% FBSRMS-13 Humano Rabdomiosarcoma DMEM + 10% FBS

HepG2 Humano Carcinoma hepatocelular Sobre-expresión de receptores TRβ DMEM + 10% FBS

Jurkat Humano Leucemia linfoide T aguda RPMI 1640 + 10% FBS

JY Humano Leucemia linfoide T RPMI 1640 + 10% FBS

HPBALL Humano Leucemia linfoblástica T RPMI 1640 + 10% FBS

Jijoye Humano Linfoma de Burkitt Infectadas por EBV (Epstein-Barr virus) RPMI 1640 + 10% FBS

HL-60 Humano Leucemia promielocítica aguda RPMI 1640 + 10% FBS

NIH3T3 RatónFibroblastos de embrión de ratón NIH Swiss. Células no cancerosas

DMEM + 10% CS

SK-N-MC Humano Neuroblastoma (área supra-orbital neuroepitelioma) DMEM + 10% FBS

WSI Humano Fibroblastos de piel Fibroblastos humano normal DMEM + 10% FBS

IMR-90 Humano Fibroblastos de pulmón Fibroblastos humano normal DMEM + 10% FBS


150

TABLA 4. ANTICUERPOS USADOS.

Nombre Antígeno Tipo Dilución de uso Procedencia

Anti-VRK2 VRK2 humana policlonal de conejo 1:10001F6 VRK1 humana IgG1 monoclonal de ratón 1:1000

Calreticulina Calreticulina (aa 405-417) humana IgG policlonal de conejo 1:1000 Calbiochem

Calnexina (AF18) Calnexina IgG1 monoclonal de ratón 1:500 Santa Cruz

MEK1(C-18) MEK1, extremo C-terminal IgG policlonal de conejo 1:1000 Santa Cruz

DO-1 p53 (aa 11-25) IgG2a monoclonal de ratón 1:1000 Santa Cruz

Pab-1801 p53 (aa 32-79) IgG1 monoclonal de ratón 1:500 Santa CruzPab-240 p53 (aa 156-214) IgG1 monoclonal de ratón 1:500 Santa Cruz

CM-1 p53 IgG policlonal de conejo 1:1000Novocastra LaboratoriesLtd

p-p53(Ser15)-R P-Ser15-p53 IgG policlonal de conejo 1:750 Santa CruzAnti-Phospho-p53(Thr18) P-Thr18-p53 IgG policlonal de conejo 1:500 Cell signaling

Anti-Phospho-p53(Ser20) P-Ser20-p53 IgG policlonal de conejo 1:500 Cell signaling

Ac-p53 Ac-Lys 373 y 382 p53 IgG policlonal de conejo 1:500 Upstate Biotech

MDM2 (SMP-14) Hdm2 (aa 154-167) humano IgG1 monoclonal de ratón 1:500 DAKO

JIP-1 (M-300) Jip1 policlonal de conejo 1:1000 Santa Cruz

P-JNK (G-7) P-Thr183 P-Tyr185 JNK IgG1 monoclonal de ratón 1:750 Santa Cruz

GST (B-14) GST monoclonal ratón 1:100 Santa CruzAnti-Flag epítopo Flag IgG policlonal de conejo 1:1000 SigmaHA.11 epítopo HA IgG1 monoclonal de ratón 1:1000 Covanceβ-actina (AC-15) β-actina IgG1 monoclonal de ratón 1:5000 Sigma

GFP (B-2) epítopo GFP IgG2a monoclonal de ratón 1:1000 Santa Cruz

Anti-mouse HRP IgG de ratón cabra 1:10000 Amersham Biosciences

Anti-rabbit HRP IgG de conejo oveja 1:10000 SigmaFluoroLinkCy2 anti-rabbit IgG IgG de conejo cabra (absorbancia 489nm,

emisión 506) 1:200-10000 Amersham Biosciences

FluoroLinkCy3 anti-rabbit IgG IgG de conejo cabra (absorbancia 550nm,

emisión 570 1:200-10000 Amersham Biosciences

FluoroLinkCy2 anti-mouse IgG IgG de ratón cabra (absorbancia 489nm,

emisión 506) 1:200-10000 Amersham Biosciences

Anti-rabbit IgG-biotinylated IgG de conejo burro 1:30000 Amersham

BiosciencesAnti-mouse IgG-biotinylated IgG de conejo burro 1:30000 Amersham

Biosciences

Streptavidin-HRP Estreptavidina conjugada con HRP 1:30000 Amersham

Biosciences

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153

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Este trabajo es el resultado del esfuerzo, comprensión y ayuda que me han brindado durante los últimos años un gran número de personas, a los que me gustaría agradecer su contribución. A mi director de tesis Pedro, por haber apostado por mí, por tu confianza en mi capacidad para hacer este trabajo, por haberme introducido en el mundo de la investigación, por haberme guiado durante estos años, por todas las sugerencias, comentarios y correcciones. A mis compañeros de laboratorio, los que ya se han ido, los que estamos a punto de hacerlo y a los que llegan con entusiasmo. Gracias Francisco, Mónica, Víctor, Ramiro, Lucia, Ana, Claudio, Teresa, Ema, Inma, Marta e Isabel por todas las horas que hemos compartido juntos en el laboratorio, por todas las cosas que hemos aprendido juntos y por todos los comentarios y sugerencias científicas, pilares de esta investigación. Por acompañarme durante todos estos años y darme la oportunidad de aprender todos los días de vosotros, como profesionales, compañeros y ante todo como amigos. A Ana, por esas inolvidables aventuras que hemos compartido recorriendo Europa, y por escuchar todas mis preocupaciones. A Claudio, por soportar todas mis interrupciones y por saber escucharme, por todas esas discusiones científicas y todas las sugerencias y nuevas ideas, por estar siempre listo para responder a mis preguntas, y por esos pasteles tan buenos que hace tu madre. A Francisco, por servirme de ejemplo tantas veces y ser un estímulo continuo para superarme. Gracias Virginia por estar siempre dispuesta a ayudar, por tu paciencia y buen hacer y por implicarte tanto para que todo saliera bien. A todos los compañeros del Centro de Investigación del Cáncer, siempre dispuestos a escucharte a ayudarte a darte toda su ayuda, ideas y reactivos. Y a todos aquellos que además han compartido conmigo muchos buenos ratos. Gracias Josiño, Inma, Sergio. A Antonio, por no tener horarios, por tu apoyo incondicional, por estar pendiente de todo el desarrollo de la tesis, por todos los comentarios, todas las sugerencias, por saber decir la palabra adecuada en cada momento, por todas las facilidades que me has dado para que pudiese centrarme en este trabajo, por pelearte con las imágenes 3D, por hacer tuyas mis preocupaciones y por estar siempre dispuesto a reírte un rato. A mis amigas de siempre Lucy y Bego, por soportar mis días buenos y los no tan inspirados. Gracias por pasar todo esto conmigo, siempre con buena cara y buenas palabras, por alegraros conmigo, y hacer mis preocupaciones más pequeñas. Gracias por haber compartido conmigo tantos momentos buenos (¡y los que nos quedan!). A mi segunda familia en Salamanca, Laura, Hana, Esther, Sonia y DJ, por haber recorrido conmigo este camino, por estar a mi lado 24h a pesar de la distancia estos últimos años. Por estar siempre dispuestos para escucharme (por mail) y darme ánimos. Gracias Chiquis por ser y estar y porque la distancia no ha sido el olvido. A Chus por tus sugerencias, todo el ánimo que me has dado y por saber escucharme. Por enseñarme que la Biología es también un arte, por todas esas horas de enseñanza mutua. Y también por las ideas para el diseño de la portada, claro. Y por supuesto a mi familia, porque sois los que realmente habéis sufrido mi dedicación a la investigación. Gracias por estar siempre a mi lado, por darme ánimos y tener tanta paciencia conmigo. Gracias por alegraros y preocuparos conmigo. Gracias por escucharme. Gracias a mis padres por habérmelo dado todo, por facilitarme tanto las cosas, y por haber apoyado mis decisiones. Y gracias Susi, gracias por todo, gracias por enseñarme tanto, gracias por hacerme reír y no dejarme llorar.

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