instrumentalne metode spektroskopske metode ... · instrumentalne metode. spektroskopske metode...
TRANSCRIPT
INSTRUMENTALNE METODE
Spektroskopske metode
Elektroanalitske
metode
Separacijske metode
Ekstrakcija
Kromatografija
(Masna spektrometrija)
Elektroforeza
STACIONARNA FAZA
1. KOLONSKAMOBILNA FAZA
2. PLANARNAVZOREC
1. PLINSKA
2. TEKOČINSKA
3. SUPERKRITIČNA-TEKOČINSKAKROMATOGRAFIJA
KROMATOGRAFIJA
KROMATOGRAFIJAGC
LC
SFC
ADSORPCIJSKA
ADSORPCIJSKA(GSC)
(LSC)
PORAZDELITVENA PORAZDELITVENA
PORAZDELITVENA(GLC)
(LLC)
IONSKO-IZMENJALNA(IEC)
IZKLJUČITVENA(SEC)
MF
SF
SEPARACIJSKE METODE
a) Separacije s transformacijob) Separacije brez transformacije
Značilnost molekul kot osnova separacijskih metodPolarnost
-
Tekočinska kromatografija-
Plinska kromatografijaIonski značaj
-
Ionsko-izmenjevalna kromatografija-
Elektroforeza-
Masna spektrometrijaVelikost (masa)
-
Dializa in ultrafiltracija-
Izključitvena kromatografija-
UltracentrifugacijaOblika
-
Afinitetna
kromatografija-
Imunokemične
metode-
Encimske metode
EKSTRAKCIJA
ELEKTROFOREZA
conska izotahoforeza
izoelektričnoelektroforeza
fokusiranje
DIALIZA
ULTRACENTRIFUGACIJA
conska ultracentrifugacija
IMUNOKEMIČNE METODE
ENCIMSKE METODE
k-1
PEESES kk 21 +⎯→⎯⎯→←+ kkkk
1
21m
+= −
Figure 1: The
two-site assayemploying
two
monoclonalantibodies
directed
againsttwo
distinct
epitopes.
KROMATOGRAFIJA
ZgodovinaTekočinska kromatografija na koloni (Cvet 1903)Papirna in tankoslojna kromatografija (Izmailov, Shraiber 1938)Tekočinska porazdelitvena kromatografija (Martin, Synge 1941)Plinska kromatografija (petdeseta leta)Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (šestdeseta leta)
Klasifikacija kromatografskih
metod1. Plinska kromatografija (GC)
a) plin-trdno (GSC)b) plin-tekočina (GLC)
2. Tekočinska kromatografija (LC)
a) tekoče-trdno (LSC)b) tekoče-tekoče (LLC)c) ionsko izmenjevalna k. (IEC)d) izključitvena k. (SEC)e) afinitetna
k. (AC)3. Superkritično-tekočinska kromatografija (SFC)
Elucija
spojin skozi kolono
Kromatogram
Amob
↔ Astac
K = cS/cM
(konst. v širšem conc. območju → linearna kromatografija)tR
–
RETENCIJSKI ČASpovprečna (linearna) hitrost spojine
u = L / tM
povprečna (linearna) hitrost MF (mobilne faze)
f = moli spojine v MF/celokupno št. molov
RETENCIJSKI FAKTOR: k’
= K·VS / VM
v = u ·
1/(1+k’) → L/tR
= (L/tM) ·
1/(1+k’)k’
= (tR
– tM)/tm
optimalno: 1 <
k’
<
5
tLv R=
⎟⎠⎞
⎜⎝⎛×=
nnfuv
t
m
VVK1
1u
VcVc1
1uVcVc
Vcuv
M
S
MM
SSSSMM
MM
+×=
+×=
+×=
( ) dxe xNdN σμ
πσ2 22
21 −−=
Enačba Gauss-ove
krivulje:
Selektivnostni
faktor:
α
= KB
/KA
;
α
> 1
Uporabimo izraz: k’
= K·VS
/ VM
α
= k’B/k’A oz.
α
= (tR(B)
– tM
)/ (tR(A)
– tM
)
oz.
dzzNdN e 2
21 2−=πσ
H [cm]: dolžina kolone, ki vsebuje frakcijo spojine, ki se nahaja med L-σin L (34 % celokupne spojine); L ±
σ ≈ 68 %
[
sek2]
–
varianca “peak-a”
( 96 %, x ±
2σ
oziroma 2 )
in ker je H = σ2
/ L →
H = LW2
/ 16tR2
in ker je N = L / H →
oziroma N = 5,54 ( tR
/ W1/2 )2
τ2
( )tLv Rσ=σ=τ
τ= 4W τ
t4LW
R
=σ
⎟⎠⎞
⎜⎝⎛=
Wt16N R
2
RS
= ( tB
– tA
)/ W (predpostavka WA
= WB
≈
W; oba tR
dovolj blizu)
(ker je )
4N
tttR
B
ABS ×
−=
4N
k1kkR '
B
'A
'B
S ×+−
=
(ker je )
(ker je )
Nt4W R=
tttk
M
MR' −=
⎟⎠
⎞⎜⎝
⎛+
⎟⎠⎞
⎜⎝⎛
α−α
=k1
k14N
R 'B
'B
S
kk
'A
'B=α
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛ +⎟⎠⎞
⎜⎝⎛
−αα
=kk1
1R16N 'B
'B
222S
Modificirana van
Deemter-jeva enačba:H = B/u + cS
· u + cm
· u
Resolucija RS
( )WWtt2R
BA
ABS +
−⋅=
⎟⎠
⎞⎜⎝
⎛+
⋅⎟⎠⎞
⎜⎝⎛
α−α
⋅=k1
k14N
R 'B
'B
S
Diagram tekočinskega kromatografa
Figure 2: Concentration
profilesof
analyte
bands
A and
B at twodifferent
times
in their
migrationdown
the
column.
Figure 3: Definition
of
plateheight
H = δ2
/ L.
Figure 4: Two
component
chromatograms
illustrating
two
methods
ofimproving
separations: (a)boriginal
chromatogram
with
overlapping
peaks, improvements
brought
about
by
(b) an
increase
in band separation, and
(c) a decrease
in band spread.
Figure 5: Determination
of
the
standard deviation
τ
from
a chromatographicpeak: W = 4τ.
Figure 6: Effect
of
mobile-phase
flowrate
on plate
height
for
(a) liqiudchromatography
and
(b) gaschromatography.
Table 1: Variables
That
Affect
Column
Efficiency
*Increases
as temperature increases
and
viscosity
decreases.
Variable Symbol Usual Units
Linear velocity of mobile phase u cm/s
Diffusion coefficient in mobile phase* DM cm2/s
Diffusion coefficient in stationary phase* DS cm2/s
Capacity factor (Equation 24-8) k’ unitless
Diameter of packing particle dp cm
Thickness of liquid coating on stationary phase
df cm
Table 2: Kinetic
Processes
That
Contribute
to Peak
Broadening
u, DM, DS, df, dp, k’
are as defined
in Table 1 f: function
ofkD, q: constantstd: average
desorption
time of
analyte
from
surface; td
= 1/kd, where
kd
is first-order
rate
constantfor
desorptiondc: column
diameterB: coefficients
of
mass
transfer in stationary
and
mobile
phase, respectively†
Stationary
phase
is an
immobilized
immiscible
liquid‡
Stationary
phase
is a solid
surface
at which
adsorption
takes
place
Process Term in Equation 24-19
Relation ship to Column*
and Analyte Properties
Longitudinal diffusion B/u
Mass transfer to and from liquid stationary phase†
CSu
Mass transfer to and from solid stationary phase‡
CSu
Mass transfer in mobile phase
CMu
uDk2
uB MD=
( ) Dk1udqkuC
S2
2f
'
S '+=
( )k1ukt2uC ' 2
'd
S+
=
( )u
Du,d,df
uCM
2c
2p
M =
FIgure
7: Separations
at three
resolutions. Here, RS
= 2ΔZ / (WA
+ WB)