instruksi kerja (ik) penetapan kadar etambutol dalam dbs

INSTRUKSI KERJA (IK) THESISPENETAPAN KADAR

ETHAMBUTOL DALAMDRIED BLOOD SPOT (DBS)

DENGAN LC-MS

No. IK Revisi 00Exp. date JULI 2015Halaman 1 dari 4

Kepala Laboratorium Dosen Pembimbing I Mahasiswa Peneliti

(…………………………………..…) Dr. rer nat. Endang Darmawan, M.Si., Apt Noverda Ayuchecaria, S.Farm., Apt

1. TUJUANValidasi metode penetapan kadar Ethambutol dalam Dried Blood Spot (DBS) menggunakan LC-MS

2. REFERENSIWiliam, R. M, Kim, M., Andrew. M, et.al., 2014. A Dried Blood Spot Method for Therapeutic

Drug Monitoring of Ethambutol, Pyrazinamide, and Moxifloxacin to Optimize Tuberculosis Treatment in Children Using LC-MS/MS. KCAS.

World Health Organization. 2006. Rifampicin, Isoniazid, Pyrazinamide and Ethambutol Hydrochloride Tablets Final text for addition to The International Pharmacopoeia. Jenewa : WHO.

ICH Harmonised Tripartite Guideline. 2005. Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology (Q2). USA; Japan; and European Union.

3. ALAT DAN BAHAN3.1. ALAT

3.1.1. Micropipet ukuran 100 – 1000 µL3.1.2. Micropipet ukuran 10 – 100 µL3.1.3. Syringe membrane filter 0.22 µm3.1.4. LCMS Shimadzhu dan peralatan penunjang3.1.5. Alat-alat gelas dan peralatan penunjang

3.2. BAHAN3.2.1. Mobile Phase A : 0.1% Formic Acid in DI H2O for LCMS3.2.2. Mobile Phase B : Acetonitrile/MeOH/Formic Acid (40:60:0.1. v/v/v) for LCMS3.2.3. Metanol 90% pa3.2.4. Aquabidest (Otsuka)3.2.5. Ethambutol (Pharos)

4. PREPARASI STANDAR ETHAMBUTOL4.1. LARUTAN INDUK

4.1.1. Standar ethambutol ditimbang sebanyak 10,0 mg.4.1.2. Standar dilarutkan ke dalam labu takar 10 mL dengan pelarut methanol hingga tanda

(Kadar ethambutol 1 mg/mL).



DENGAN LC-MS




4.1.3. Saring larutan standar tersebut dengan membrane filter 0,22 µm dan selanjutnya filtrat yang diperoleh disebut larutan induk ethambutol 1 mg/mL.

4.2. LARUTAN KURVA BAKU/LINEARITAS4.2.1. Dibuat larutan seri kadar dari larutan induk dengan cara memipet 100; 150; 300; 600;

900; dan 1000 µL masing-masing ke dalam labu takar 10 mL dan ditambahkan dengan metanol hingga tanda (larutan ethambutol yang diperoleh mempunyai kadar sebesar 10; 15; 30; 60; 90; dan 100 µg/mL). Sedangkan konsentrasi terendah diperoleh dengan memipet 1000 uL konsentrasi 10 µg/mL kedalam labu takar 10 mL dan ditambahkan dengan methanol hingga tanda sehingga diproleh konsentrasi 1 µg/mL.

4.2.2. Masing-masing larutan disimpan dalam vial 10 mL yang telah tertutup rapat dengan alumunium foil dengan indentitas yang telah ditempelkan sebelumnya.

4.2.3. Vial disimpan dalam freezer suhu -60 derajat celcius agar tidak terjadi kerusakan zat aktif.

5. PREPARASI SAMPEL5.1. PEMBUATAN KURVA BAKU/LINEARITAS

5.1.1. Larutan kurva baku dikeluarkan dari freezer hingga suhu kamar.5.1.2. Pipet 450 µL whole blood ke dalam microtube dengan menggunakan micropipette

sesuai dengan jumlah titik kurva baku yang akan dibuat.5.1.3. Pipet 50 µL masing-masing larutan kurva baku ke dalam microtube yang sudah berisi

450 µL whole blood. Konsentrasi masing-masing titik kurva baku menjadi 1/10 dari konsentrasi semula (0,1; 1; 1.5; 3; 6; 9 dan 10 µg/mL)

5.1.4. Homogenkan microtube dengan bantuan vortex selama 20 detik dengan kecepatan maksimal.

5.1.5. Teteskan pada plate kertas DBS. Tempatkan pada suhu 37ºC selama 1 jam. 5.1.6. Potong punch DBS dengan diameter 7mm.5.1.7. Masukan potongan punch kedalam perlarut Metanol 90% sebanyak 300µL.5.1.8. Campuran di sonifikasi 60 menit.5.1.9. 100 µL larutan hasil sonifikasi ditambah 300 µL 0.1% Formic Acid dalam deionized

water.



DENGAN LC-MS




5.1.10. Injeksikan ke dalam sistem sebanyak 8 µL.5.1.11. Data yang diperoleh antara zat aktif ethambutol diolah untuk membuat persamaan

regresi linear dengan ketentuan persyaratan R>0.99 dan %Error untuk nilai LOQ<20% dan titik kurva baku yang lain <15%.

5.2. PRESISI DAN AKURASI5.2.1. Dibuat dari larutan induk dengan konsentrasi:

Larutan I dengan kadar 1 µg/mL : Lower Limit of QuantificationLarutan II dengan kadar 15 µg/mL : QC – LowLarutan III dengan kadar 45 µg/mL : QC – MediumLarutan IV dengan kadar 90 µg/mL : QC – High

5.2.2. Pipet 50 µL masing-masing larutan I-IV ke dalam microtube yang sudah berisi 450 µL whole blood. Konsentrasi masing-masing larutan menjadi 1/10 dari konsentrasi semula (0.1; 1.5; 4.5; dan 9 µg/mL)

5.2.3. Lakukan langkah 5.1.5 sampai 5.1.10 seperti diatas.5.2.4. Data yang diperoleh diolah dengan menggunakan persamaan regresi linear yang telah

diperoleh untuk memperoleh kadar ethambutol untuk menghitung akurasi dan presisi. Presisi dinilai dari Relative Standar Deviation (RSD) dan akurasi dinilai dari Relative Error (RE).

5.3. UJI STABILITAS5.3.1. Uji stabilitas dilakukan dengan menempatkan plate DBS yang telah ditetesi darah

dalam kondisi :- Kondisi Suhu ruang (37ºC) selama 1 minggu, 2 minggu dan 1 bulan- Kondisi Suhu ekstrim (50ºC) selama 1 hari, 2 hari dan 1 minggu

5.3.2. Lakukan langkah 5.1.6 sampai 5.1.10 seperti diatas.5.3.3. Data yang diperoleh diolah dengan menggunakan persamaan regresi linear yang telah

diperoleh untuk memperoleh kadar ethambutol.

5.4. PENETAPAN KADAR SAMPEL5.4.1. Sampel plate DBS dikeluarkan dari plastic box penyimpanan.5.4.2. Lakukan langkah 5.1.6 sampai 5.1.10 seperti diatas.



DENGAN LC-MS




5.4.3. Area Under Curve (AUC) yang diperoleh diolah dengan menggunakan persamaan regresi linear yang telah diperoleh untuk memperoleh kadar ethambutol dalam sampel.

6. PARAMETER INSTRUMENT

Liquid Chromatograpy : ShimadzuAutosamplerColumn

: Perkin Elmer 200: Prodigy ODS3 (50x2 mm) by Phenomenex

Fase gerak : Phase A (0.1% Formic Acid in DI H2O Phase B Acetonitrile/MeOH/Formic Acid (40:60:0.1, v/v/v)

Kecepatan alir : 0.3 mL/minDetektor : UV 210 nmWaktu Retensi : ± 0.8 minVolume injek : 8 µL

Mass Spectrometry : AB Sciex API 3000Polarity : PositiveScan type : Multiple Reaction Monitoring

Ethambutol : m/z 205.0 116.0

7. DOKUMEN TERKAIT7.1. Laporan hasil validasi metode penetapan kadar ethambutol dalam DBS.7.2. Laporan hasil penetapan kadar ethambutol dalam DBS.

instruksi kerja (ik) penetapan kadar etambutol dalam dbs

Documents