institutul de cercetare – dezvoltare …...măr (78 plante), câte 10 soiuri păr şi prun (50 de...
TRANSCRIPT
ADER 2.2.7TEHNICI DE PRODUCERE ŞI MENŢINERE A MATERIALULUI SĂDITOR POMICOL DIN CATEGORIILE BIOLOGICE CANDIDAT, PREBAZĂ ŞI BAZĂ
Director proiect: Dr. ing. Valentina ISAC
INSTITUTUL DE CERCETARE – DEZVOLTAREPENTRU POMICULTURĂPITEŞTI - MĂRĂCINENI
OBIECTIVUL GENERALPerfecţionarea tehnicilor şi metodologiilor de producere, menţinere şi
control sanitar al materialului din categorii biologice superioare învederea creşterii calităţii şi reabilitări sectorului de producere amaterialului săditor pomicol, conform normelor în vigoare.
NECESITATEAObţinerea materialului săditor pomicol liber de virusuri, conservarea si utilizarea
lui în producerea pe scară largă a pomilor certificaţi. Prin programul decertificare sunt garantate statutul sanitar al materialului săditor pomicol cât şiautenticitatea acestuia.
RELEVANŢAProiectul este relevant pentru domeniul ştiinţific şi pentru cel economic al
producerii materialului săditor pomicol, deoarece produsele obţinute prinactivitatea de CD (ramuri altoi şi portaltoi libere de virusuri) sunt promovateşi valorificate direct în sectorul economic prin producerea pe scară largă dematerial săditor pomicol certificat.
2005
Ord. 1295 4 filiere de certificare a materialului de înmulţire
1. PB, B, C – liber de virus (vf)2. PB, B, C – testat de virus (vt)3. CAC
4. PB, B, C – autenticitate – la cererea RO
2010
Ord. 82
1. PB, B, C – liber de virus (vf)2. PB, B, C – testat de virus (vt)3. CAC
4. PB, B, C – autenticitate – la cererea RO
3 filiere de certificare a materialului de înmulţire
Reglementările noi, promulgate îndeosebi prin Legea 266/2002 ordinele 382/2002, 1295/2005 şi 82/2010 iau în considerare atât legislaţia UE (Directivele Europene 77/93/CCE, 92/103/CEE si 92/34/CEE) cât şi recomandările OEPP privind starea fitosanitară
Oct. 2012
SELECTIE IDENTIFICARE
FURNIZORPARCELA DE VERIFICARE
AUTENTICITATE
MATERIAL CANDIDATTESTARE VIROTICA SI ORGANISME
DAUNATOARE
MENTINERE”IN VITRO”
PARCELA CONTROLAUTENTICITATE
PARCELA CONTROLAUTENTICITATE
PARCELA CONTROLAUTENTICITATE
PREBAZAVIRUS FREE
PREBAZAVIRUS TESTED
BAZAVIRUS FREE
BAZAVIRUS TESTED
CERTIFICATVIRUS FREE
CERTIFICATVIRUS TESTED
MATERIAL DE PLANTARE FRUCTIFER
Certificat Vf.
MATERIAL DE PLANTARE FRUCTIFERCertificat Vt.
C.A.C.
MAT
ERIAL DE INMULTIRE
SCHEMA DE PRODUCERE SI CERTIFICARE (ord. 82/2010)
PARTENERI ŞI BUGET
657.250 627.900 95,5ICDP Piteşti ‐Mărăcineni
Buget iniţial Buget realizat %
124.125 118.226 95,2SCDP Bistriţa
41.125 39.688 96,5SCDP Constanţa
822.500 785.814 95,5TOTAL
OBIECTIVELE SPECIFICE• Crearea condiţiilor pentru menţinerea plantelor din categorii biologice superioare(spaţii insect proof).• Evaluarea şi implementarea unor metodelor rapide de testare (ELISA, PCR) pentrudeterminarea stării de sănătate virală.• Dezvoltarea procedeelor pentru eliminarea virusurilor şi menţinerea materialuluibiologic liber.• Managementul producerii materialului săditor pomicol conform schemelor decertificare din legislaţia actuală, prin folosirea unor elemente biotehnologice înînmulţirea plantelor sănătoase.• Realizarea unor verigi tehnologice privind obţinerea materialului biologic dincategorii biologice superioare.
REZULTATE MĂSURABILE
• Cuantificarea gradului de infectare cu virusuri;• Bază materială formată din 10 spaţii izolate care să
asigure condiţii pentru evitarea reinfectării;• 1-2 protocoale de lucru optimizate pentru testare şi
diagnosticare virală;• 35 - 45 clone selecţionate conforme privind
caracteristicile de autenticitate şi stare fitosanitară şitestate de virusuri;
• Verigi tehnologice privind eliberarea de virusuri la1 - 3 specii pomicole;
• Biotehnologii de înmulţire pentru obţinereamaterialului prebază la 1-2 specii pomicole;
• Plante prebază şi bază din soiurile a 10 - 12 speciipomicole.
Elaborarea metodologiei de lucru - Stabilirea materialului biologic şireabilitarea facilităţilor
Selecţionarea celor mai bune clone din punct de vedere al autenticităţii,calităţilor pomologice şi al productivităţii - 76 soiuri:
• 10 soiuri de măr: Jonathan, Idared, Florina, Goldspur, Golden Delicious, Prima,Generos, Romus, Starkrimson, Mutsu şi portaltoii M 106 şi M9;
• 9 soiuri de păr: Williams, Cure, Tudor, Monica, Argessis, Carpica, Williams roşu,Euras, Conference şi portaltoiul Gutui A;
• 9 soiuri de prun: Agent, Ialomiţa, Gras ameliorat, Centenar, Silvia, Minerva, Diana,Andreea, Delia şi portaltoiul Mirobolan BN 4Kr;
• 6 soiuri de cireş: Ponoare, Daria, Tentant, Superb, Stella, Germrsdorf şi portaltoiulIPC 5.
• 6 soiuri de vişin: Mocăneşti 16, Ţarina, Rival, Stelar, Ilva, Schattenmorelle;• 7 soiuri de cais: Tudor, Goldrich, Traian, Sulmona, Sirena, Harcot, NJA 42;• 8 soiuri de piersic: Catherine sel. 1, Cora, Creola, Liana, Delta, Florin, Cardinal,
Redhaven;• 6 soiuri de căpşun: Premial, Real, Red Gauntlet, Coral, Magic, Benton;• 3 soiuri de zmeur: Cayuga, Opal, Ruvi;• 4 soiuri de mur: Darrow, Thornfree, Dar 8, Dar 24;• 6 soiuri de coacăz: Abanos, Deea, Tsema; Jonkheer van Teets, Red Lake,
Houghton Castle;• 2 soiuri de agriş: Virens, Verda;Studiu documentar referitor la sursele de material vegetal şi caracterizarea
genotipurilor luate în studiu (22 pagini).
Crearea condiţiilor impuse de reglementările în vigoare pentru menţinereaplantelor CANDIDAT şi PREBAZĂ (spaţii insect proof)
ICDP PITEŞTI(toate speciile)
•Izolator de 180 mp, cu plante crescute în containere şi cu fertirigare programată
SCDP BISTRIŢA(specia prun)
•Izolator de 52 mp, cu plante crescute în containere.•Izolator (300 mp), cu plante crescute în ghivece mari de 50 l, câte 6 ghivece pentru fiecare soi şi portaltoi de prun.
Reabilitarea a 10 izolatoare (2.200 mp), pentru menţinerea plantelor Iniţiale şi Prebază în
conformitate cu normele în vigoare şi asigurarea condiţiilor necesare evitării reinfectării cu virusuri.
TESTAREA VIROTICĂ A MATERIALULUI SELECTAT, RETESTAREA MATERIALULUI PREBAZĂ ŞI BAZĂ
Indexarea prin metode biologice, teste serologice şi moleculare (ELISA, PCR)pentru 68 boli virale, a arătat că:
• Plantele candidat selecţionate sunt sănătoase (-) şi pot fi utilizate pentru obţinereamaterialului PREBAZĂ şi ulterior BAZĂ.
• Rezultatele testelor ELISA au arătat că soiurile de cireş Ponoare, Daria şi Superbsunt infectate cu virusuri (ArMV, CLRV, PNRSV) iar soiul de vişin Mocăneşti cu PPV.
• Retestarea DAS–ELISA la PREBAZA de prun – Bistriţa, efectuată pentru PPV, PDV,PNRSV, ACLSV, ApMV şi MLRSV a fost negativă.
• De asemenea, rezultatele IC-RT-PCR au confirmat absenţa PPV.
Testare căpşun pe F. vesca UC – 04 Altoire de foliolă R. o.”Munger” - zmeur Altoire cu ramură detaşată - zmeur
Protocoale de lucru optimizate pentru testare şi diagnosticare
DIAGNOSTICUL MOLECULAR AL VIRUSULUIPLUM POX
IC-RT-PCR foloseste kitul Qiagen One Step RT-PCRşi perechea de amorse polivalente P1/P2 careamplifică un fragment de 243 bp corespunzătorregiunii C-terminus a proteinei capsidale (Wetzelşi colab., 1991). Pentru imunocaptură seutilizeaza antiser produs de BIOREBA.
Ciclul termic utilizat pentru RT-PCR cuprinde:Reverstranscriere - 30 min la 50°C,denaturare/inactivarea reverstranscriptazei timpde 2 min la 94 °C urmată de 35 de cicluri:denaturare ADNc - 30 s la 94 °C, hibridarea cuamorsele - 45 s la 61 °C, elongaţia ADNc - 60 sla 72 °C.
După ultimul ciclu urmeaza elongaţia finală la 72 °Cpe durata a 10 min.
Produşii de amplificare se separa prin electroforeză,în gel de agaroză (Sigma) 1,5%.
Vizualizarea produşilor de amplificare s-a realizat înlumină UV, imaginea gelurilor fiind achiziţionatăcu o cameră video DocPrint.
DIAGNOSTICUL MOLECULAR AL FITOPLASMEIEUROPEAN STONE FRUIT YELLOW (ESFY)
Nested-PCR, se realizează în două etape deamplificare
Pentru amplificare se utilizeaza ADN-ul total dinfloem şi nervurile frunzelor de prun, extras cuajutorul kit-ului de extracţie Dneasy Plant MiniKit (Qiagen).
Pentru prima amplificare se recomanda primeriiP1/P7 (Schneider si colab., 1995), iar pentrucea de-a doua amplificare setul de primeriR16(X)F1/R16(X)R1 (Lee si colab., 1995).
Ciclul termic utilizat pentru Nested-PCR în ambeleetape de amplificare este următorul:denaturare - 5 min la 94°C, urmată de 35 decicluri: denaturare ADNc - 20 s la 92°C,hibridarea cu amorsele - 20 s la 55 °C,elongaţia ADNc - 40 s la 72 °C.
După ultimul ciclu urmeaza elongaţia finală la 72 °Cpe durata a 10 min.
Migrarea si vizualizarea produşilor PCR se faceidentic cu procedura pentru IC-RT-PCR
Au fost experimentate şi pot fi implementate protocoale ELISA - kit + protocol Bioreba şi kit + protocol Sediag pentru detectarea a 17 virusuri şi phytoplasme.Tehnicile moleculare de diagnostic au un potenţial foarte ridicat de detecţie virală şi sunt utile în procedura de certificare a materialului săditor.
Înmulţirea materialului selecţionat - devirozare• A fost înmulţit fondul biologic plante Candidat (iniţiale) la speciile pomicole
lemnoase şi la căpşun şi arbuştii fructiferi.• În urma lucrărilor de altoire efectuate la ICDP au fost înmulţite 13 soiuri la specia
măr (78 plante), câte 10 soiuri păr şi prun (50 de plante din fiecare specie), 3 soiurila cireş (15 plante), iar la vişin s-au obţinut 25 de plante din 5 soiuri.
• La prun, Bistriţa a înmulţit prin altoire în vederea obţinerii plantelor Candidat 7 soiuri(64 plante) testate serologic şi molecular şi stabilite ca „Virus free”.
• Aplicarea înmulţirii prin butaşi a permis realizat nucleul de plante Candidat la 3soiuri de coacăz negru şi 3 soiuri de coacăz roşu totalizând un număr de 32 plante lacontainer menţinute în prezent în spaţii izolate.
• Pentru realizarea nucleelor de Plante iniţiale şi Prebază (material in vitro) au fostfolosite şi elemente biotehnologice:
- Au fost optimizate protocoale de lucru şi randamentele în fiecare fază aculturii in vitro.
- au fost create nucleele de plante iniţiale in vitro la 5 soiuri de căpşun, 4soiuri de zmeur, 3 soiuri de mur şi a portaltoilor M9 şi M106 (măr), Gutui A (păr), IPC5 (cireş, vişin), Mirobolan BN 4Kr (prun). Plantele obţinute sunt folosite laproducerea prin micropropagare a nucleelor de plante Prebază în funcţie denecesităţile activităţii de producere a materialului săditor pomicol.
În procesul de devirozare au fost introduse un numar de 3 soiuri de cireş şi un soi devişin. Metoda aplicată a fost prin culturi de meristeme. A fost stabilit mediul decultura LF cu 0,3 mg/l GA3 si 0,01 mg/l IBA cât şi protocolul de lucru pentruspeciile respective.
Plante căpşun ‐ arbuşti fructiferi certificate la categoria Prebază
Specia/soiul Plantat la aclimatizare Număr plante certificate
Lot nr.
Premial 5400 2500 3AG6091 – 3AG01
Real 1100 500 3AG6101 – 3AG01
Magic 3000 1500 3AG6111 – 3AG01
Redgauntlet 1700 800 3AG6121 – 3AG01
Benton 1250 500 3AG6131 – 3AG01
Darrow 1500 250 3AG6471 – 3AG01
Thornfree 750 250 3AG 6481– 3AG01
Opal 1560 360 3AG3411 – 3AG01
Ruvi 440 40 3AG3421– 3AG01
Star 200 18 3AG3431– 3AG01
Gustar 500 10 3AG3491– 3AG01
Cayuga 960 165 3AG7361– 3AG01
Vely 500 100 3AG3551 – 3AG01
Testarea/retestarea şi menţinerea materialului Prebază şi Bază existent
P1 - În urma inspecţiei efectuate la SCDP Bistriţa, ITCSMS Cluj a eliberat documentele oficiale decertificare la categoria PREBAZA a şase soiuri de prun: Agent, Gras ameliorat, Centenar,Minerva, Andreea şi Delia. Rezultatele analizelor au reconfirmat statusul „virus-free” al plantelorBAZA menţinute în biodepozitarele de la SCDP Bistriţa.
P2 - A fost constituit nucleul de material Prebază format din 24 soiuri de piersic şi 23 soiuri la cais.Toate soiurile retestate au prezentat test negativ fără soiul Cardinal infectat cu PPV.
CP - A fost constituit un nucleu de plante Prebază pentruramuri altoi la speciile lemnoase pentru care a fost depusădocumentaţia la ITCSMS Argeş în vederea certificării.
• Retestarea virală a Prebazelor a identificat numai la prun,infecţie cu PPV: 3 plante din soiul Gras ameliorat şi 2 plantedin soiul Ialomiţa diagnostic confirmat atât prin metoda DAS-ELISA cât şi prin AGRISTRIP.
• Materialul sănătos rămas în biodepozitarul ICDP Piteşti-Mărăcineni constituie materialul din care se vor înmulţiplantele BAZĂ, necesare înfiinţării plantaţiilor mamă ramurialtoi, de butaşi şi a marcotierelor.
• Rezultatele retestărilor efectuate la soiurile de căpşun şiarbuştii fructiferi au arătat că plantele testate sunt sănătoase,starea lor sanitara fiind liber de virusuri.
Plante PREBAZĂ la container ICDP Piteşti
Specia Soiuri Nr. plante Specia Portaltoi Nr. planteMăr 10 42 Măr M 106 250Păr 9 24 M 9 2Prun 9 12 Păr, gutui BN 70 2Cireș 6 22 Gutui A 2Vișin 6 12 Prun Mirobolan dwarf 3Cais 4 5 Mirobolan C5 2Piersic 2 6 Mirobolan BN 4Kr 2Nectarin 1 1 Cireș, vișin IPC 2 2Zmeur 6 365 IPC3 2Mur 4 550 IPC4 2Coacăz negru 3 3 IPC5 2Coacăz roșu 3 3 IPC 7 2Agriș 2 2 Piersic Adaptabil 2Afin 2 2 Cais Apricor 2Cătină 2 2Căpșun 5 10.000
PREBAZA – ICDP ‐ 2013
Materialul biologic certificat la categoria Prebază în 2013 SCDP Bistriţa – prun
Soi/portaltoi Cant.
Lot nr. Etichete oficiale atribuite
Nr. total/serie/de la...pana la
Agent/Mirobolan29C 3 3BN0671-3BN01 3/BN/799840-799842Gras
ameliorat/Mirobolan29C
3 3BN0672-3BN01 3/BN/799843-799845
Centenar/Mirobolan29C 3 3BN0673-3BN01 3/BN/799846-799848Minerva/Mirobolan29C 3 3BN0674-3BN01 3/BN/799849-799851Andreea/Mirobolan29C 3 3BN0675-3BN01 3/BN/799852-799854Delia/Mirobolan29C 3 3BN0676-3BN01 3/BN/799855-799857Total 18
Aspecte din faza de fortificare la ghiveci a prebazelor de zmeur (A), căpşun(B), mur (C), portaltoi (D)
A B
C D
Diseminare - participare la 8 simpozioane şi sesiuni ştiinţifice, o conferinţănaţională şi o conferinţă internaţională. Au fost publicate 14 lucrări ştiinţifice atât înreviste cu caracter ştiinţific dar şi tehnic, utile instituţiilor de cercetare, universităţide profil horticol, pepiniere de producţie.
Sprijin financiarPERMANENT
Sprijin financiarPARTIAL
PREBAZA BAZA CERTIFICAT
‐ investiţii‐ întreţinere‐ testari virotice
‐ Investiţiespecifica
2013 2018 material de plantare fructiferPr. sectorial
Pentru creşterea competitivităţii sectorului de producere a materialului săditor din România, dar şi pentru acreşterea vizibilitatea şi credibilitatea ţării noastre pe plan internaţional în acest domeniu de interes pentruagricultură este necesară continuarea activităţii proiectului prezentat.