instituto politÉcnico nacional -...

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE INGENIERÍA

CAMPUS GUANAJUATO (UPIIG)

CENTRO DE INNOVACIÓN APLICADA EN TECNOLOGÍAS

COMPETITIVAS (CIATEC, A.C.)

«MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO

COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA BIODEGRADACIÓN DE

LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS»

T E S I S

PARA OBTENER EL TÍTULO DE:

INGENIERO BIOTECNÓLOGO

PRESENTA:

ÓSCAR SAÚL MORALES TAFOYA

ASESORES:

M. en C. VERÓNICA JIMÉNEZ HERNÁNDEZ

Dra. MARÍA SORAYA OSEGUEDA ROBLES

SILAO DE LA VICTORIA, GUANAJUATO.

2014

MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA

BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.

ii

El presente trabajo fue realizado en colaboración con el Dr. Ricardo

Guerra, en el Laboratorio de Ambiental del Centro de

Investigaciones Aplicadas en Tecnologías Competitivas A.C.

(CIATEC), bajo la dirección de la M. en C. Verónica Jiménez

Hernández, y en el Laboratorio de Química I de la Unidad

Profesional interdisciplinaria de Ingeniería Campus Guanajuato

(UPIIG) del Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección de la

Dra. María Soraya Osegueda Robles.



iii

DEDICATORIA

A mi madre, por hacer realidad cada uno de mis sueños desde el día en que

llegué a este mundo. Te amo infinitamente, gracias.

A mis abuelos, por llevarme de la mano con sus consejos y sabiduría. Por su

cariño y su paciencia. A mi familia, porque son parte medular de mis logros.

A mis amigos, con quienes caminé, tropecé y aprendí. Sé que nuestro viaje

no termina aquí.



iv

AGRADECIMIENTOS

«Gracias a la vida, que me ha dado tanto…», de esta manera quiero comenzar con este pequeño

apartado de enormes agradecimientos hacia todo lo que me ha permitido llegar aquí. Y es

precisamente a esa colección de vivencias, alegrías, desencantos y recuerdos, la vida misma…a

la que debo agradecer. Por ponerme en este tiempo y en este lugar, por enseñarme a caminar, a

equivocarme, a rectificar, y a ser muy feliz con lo que me da siempre.

A mi madre, Martha Patricia, por toda esa magia que siempre me ha mostrado. Por hacer

posible lo imposible, por guiarme, cuidarme, alentarme, reprenderme, amarme, y demostrarme

que si los límites existían, para nosotros eran invisibles. Esto es por y para ti.

A Don Jesús y Doña Cuca, mis abuelitos, mis segundos padres, mis héroes y ejemplos de todo

lo bueno que tengo. Sus valores, sus consejos, sus bendiciones y su presencia conmigo me

hacen sentir el más afortunado de todos.

A toda mi familia, mis tíos y tías, primos, por sus palabras de apoyo, por su interés en mí y en

mis proyectos. De manera especial para mis tíos Salvador Morales, Elvira Tafoya, Lupita

Hernández y Concepción Navarrete. Los quiero mucho, gracias.

A mis amigos, en la escuela, los de toda la vida y los que fui conociendo durante este viaje;

esas personas con quienes compartí horas de escuela, estudio, logros, estrés, risas, fiestas,

pláticas interminables, comida recalentada, y un sinfín de aventuras que nos hicieron darnos

cuenta que realmente solo somos tan jóvenes y tan libres una vez en la vida. Mayra, Jonathan,

Gaby, Julio, Caro, Bere, Ricardo, Ale Cruz, Aldo, Ale Reyes, Karla, Daniela, Diana, Pablo,

Ángel, Betzy, y los que faltan, gracias. TTYM BTCHS.

Al Instituto Politécnico Nacional, mi casa de estudios, que me aceptó, me formó y me dio las

herramientas para ser un mexicano consciente de los problemas de su país y procurar

resolverlos. Cierto apartado en el decálogo dice que se es politécnico por convicción y no por

circunstancia; y aunque las circunstancias me trajeron aquí, la convicción, el orgullo y el gusto

de pertenecer me hicieron quedarme con el guinda y blanco. ¡Huelum!

A la Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería Guanajuato, mejor conocida como

UPIIG, que pionera en una tierra lejana, fue quien me acogió y a través de los recursos con los

que contaba, me permitió una extraña y agradable estancia. Gracias a todos los profesores,



v

quienes me enseñaron que el conocimiento va más allá del saber, y que nunca se es demasiado

sabio, ni demasiado viejo, solo demasiado terco para aprender.

Un agradecimiento especial al CIATEC y al laboratorio de análisis ambientales, por recibirme

y ayudarme con este proceso, por el apoyo intelectual y financiero. Gracias al Dr. Ricardo

Guerra, por confiar en mí para este proyecto.

A Verónica Jiménez, mi asesora y colaboradora principal de todo este trabajo. Por su

compromiso, su pasión, su ética y responsabilidad, por sus consejos que tanto me han servido

en estas nuevas etapas de mi vida. Pero sobre todo gracias por esa infinita paciencia para

conmigo. Sé que no fue fácil.

A la Dra. Soraya Osegueda, profesora, consejera, y amiga, por aceptar ser mi guía en este

trabajo, por su nivel de compromiso, por sus pláticas y vivencias que me llevo conmigo. Por los

aventones, por los consejos y esa disponibilidad para siempre ayudar.

A la profesora Ana Rodríguez, que sin ella y su vinculación nada de esto hubiera sido posible,

por ver en mí el potencial y la pasión por la ciencia que a veces yo mismo olvido.

Al M. en C. Mario Aguilar, por la ayuda intelectual, sus aportes, su interés y su tiempo para la

parte escrita de este trabajo. Su colaboración se refleja en la gran mejoría de lo aquí presentado.

A las personas que conocí, a los lugares donde viví, a las aventuras extrañas y misteriosas, a los

buenos días, a los malos momentos, al proceso inevitable y mágico de crecer y ver en

retrospectiva todo lo que gracias a este trabajo gané, en general a todas las personas que, como

dice una canción, por cada sonrisa que les di recibí una de vuelta.

A quienes preguntaban: «¿Qué tú ya no habías salido?», «¿Cuándo presentas? », «¿Ya

terminaste?»; ahora sí es en serio… ya acabé. ¡Por fin!

A quienes olvido por amnesia o por conveniencia, a los buenos, a los malos, a quienes están y a

quienes ya no; y ya para no prolongar esto, citaré a un conocido cantautor argentino.

Para todos, ¡GRACIAS TOTALES!

Óscar



vi

ÍNDICE TEMÁTICO

1. INTRODUCCIÓN............................................................................................................ 1

1.1 Marco Teórico .......................................................................................................... 1

1.1.1 El suelo..................................................................................................................... 1

1.1.2 Hidrocarburos y petróleo ......................................................................................... 3

1.1.3 Clases de petróleo..................................................................................................... 6

1.1.4 Contaminación de los suelos por hidrocarburos ....................................................... 8

1.1.5 Suelos contaminados con hidrocarburos en México ................................................. 9

1.1.6 Clasificación de las tecnologías de remediación de suelos ........................................11

1.1.7 Intemperización y biodisponibilidad .......................................................................16

1.1.8 Biorremediación......................................................................................................17

1.1.9 Rutas de biodegradación .........................................................................................18

1.2 Antecedentes ............................................................................................................20

1.2.1 El sureste mexicano y la contaminación de los suelos........................................20

1.2.2 Suelo contaminado en Veracruz ..............................................................................21

1.3 Descripción del problema ..............................................................................................21

2. JUSTIFICACIÓN ...........................................................................................................23

3. HIPÓTESIS ....................................................................................................................24

4. OBJETIVO GENERAL ..................................................................................................25

5. OBJETIVOS ESPECÍFICOS..........................................................................................25

6. DESARROLLO EXPERIMENTAL................................................................................26

6.1 Caracterización fisicoquímica del suelo de Agua Dulce, Veracruz.................................26

6.2 Uso de dos tecnologías para la biorremediación de suelos .............................................27

6.2.1 Diseño de Experimentos ..........................................................................................27

6.3 Establecimiento de condiciones para los experimentos ..................................................30

6.3.1 Establecimiento de condiciones para bioestimulación .............................................31

6.3.2 Establecimiento de condiciones para bioventeo ........................................................31

6.4 Cuantificación de CO2 ...................................................................................................31

6.5 Determinación de pH ....................................................................................................32



vii

6.6 Determinación de humedad. ..........................................................................................32

6.7 Determinación de conductividad eléctrica del suelo contaminado .................................32

6.8 Determinación de materia orgánica...............................................................................32

6.9 Determinación de hidrocarburos totales a través de espectrofotometría UV- Visible .33

6.10 Determinación de hidrocarburos utilizando espectrofotometría infrarrojo (IR)..........33

6.11 Caracterización de microorganismos presentes en el suelo contaminado. ....................33

6.11.1 Aislamiento y cultivo de microorganismos hidrocarbonoclastos en el suelo

contaminado. ...................................................................................................................33

7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................................35

7.1 Cuantificación de parámetros en el proceso de bioestimulación ....................................35

7.1.1 Cuantificación de CO2. ............................................................................................35

7.1.2Cuantificación de pH ...............................................................................................38

7.1.3 Cuantificación de humedad.....................................................................................39

7.1.4 Cuantificación de conductividad eléctrica ...............................................................41

7.1.5. Cuantificación de materia orgánica........................................................................42

7.1.6. Cuantificación de hidrocarburos de fracción pesada (HFP) por espectrofotometría

UV e FTIR.......................................................................................................................47

7.3 Cuantificación de parámetros usando bioventeo. ..........................................................56

7.3.1 Cuantificación de CO2.............................................................................................56

7.3.2 Cuantificación de pH ..............................................................................................58

7.3.3 Cuantificación de humedad.....................................................................................60

7.3.4 Cuantificación de conductividad eléctrica ...............................................................61

7.4 Relación entre actividad metabólica y degradación de los hidrocarburos......................62

8. CONCLUSIONES ...........................................................................................................65

9. PERSPECTIVAS ............................................................................................................66

BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................................67

A. Preparación de medios enriquecidos............................................................................75

B. Análisis estadísticos .....................................................................................................75



viii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Clasificación de las clases texturales del suelo. El suelo franco arcilloso,

objeto del estudio de este trabajo se encuentra en el centro de la pirámide (Ibáñez

Asensio et al., 2010)……………………………………………………………………….2

Figura 2. Estructuras de las diferentes clases de hidrocarburos. Los hidrocarburos de

mayor presencia en suelos son los aromáticos y asfáltenos…………………………..4

Figura 3. Ejemplos de hidrocarburos saturados que forman parte de la mezcla de

hidrocarburos presente en el petróleo. Se presentan las estructuras más simples y las

más comunes encontradas en los suelos contaminados (Harayama et al.,

1999)……………………………………………………………………………………….4

Figura 4. Ejemplos de los hidrocarburos principales en la fracción aromática del

petróleo. Todos estos compuestos por su estructura, son los más difíciles de degradar a

moléculas más simples……………………………………………………………………5

Figura 5. Ejemplos de estructuras de asfáltenos (izquierda) y resinas (derecha). Como

se observa, los asfáltenos son estructuras más complejas químicamente debido a la

unión de anillos bencénicos y por tanto más insolubles (Harayama et al.,

1999)………………………………………………………………………………………..6

Figura 6. Pluma típica de contaminación en los suelos por la acción de hidrocarburos.

Se observan los fenómenos que rigen los suelos intemperizados (Cortón et al.,

2006)……………………………………………………………………………………….10

Figura 7. Clasificación de las técnicas de remediación para suelos contaminados según

su tipo. La clasificación de la Tabla 5 solo se aprecia en las técnicas biológicas, por ser

más usada en estas (Martınez-Prado et al., 2014)……………………………………..15

Figura 8. Relación costo-tiempo entre algunos de los métodos de remediación de

suelos. Los métodos de bioestimulación y bioventeo se encuentran en el centro de la

gráfica (Reynolds et al., 1997)…………………………………………………………...15



ix

Figura 9. Representación de los eventos que rigen la biodisponibilidad de las

moléculas contaminantes. El símbolo (●) representa las partículas de hidrocarburo

dentro del suelo……………………………………………………………………………16

Figura 10. Pasos iniciales en la biodegradación de los PAHs por hongos, bacterias y

algas. Estas estructuras degradadas pueden entrar en procesos metabólicos como la β-

oxidación (Cerniglia, 1993)……………………………………………………………....19

Figura 11. Localización geográfica de Agua Dulce, Veracruz. Los municipios aledaños

(Minatitlán y Coatzacoalcos) a la izquierda, son los principales actores en procesos

petroquímicos……………………………………………………………………………..22

Figura 12. Gráfico de producción de dióxido de carbono en los tratamientos utilizados

en el proceso de bioestimulación. Las líneas representan la desviación estándar; los

valores 1 a 12 corresponden a los experimentos, P al testigo (suelo estéril) y N al

control negativo (ladrillo incinerado)…………………………………………………...36

Figura 13. Diagrama de Pareto para sales utilizadas en el diseño de experimentos del

proceso de bioestimulación. La línea azul representa el valor mínimo para que alguna

de las sales sea estadísticamente significativa en el resultado…………………………37

Figura 14. Valores registrados de pH para el tratamiento del suelo usando

bioestimulación. Las líneas representan la desviación estándar; los valores 1 a 12

corresponden a los experimentos, P al testigo (suelo estéril) y N al control negativo

(ladrillo incinerado)……………………………………………………………………....38


proceso de bioestimulación. La línea azul representa el valor mínimo para que alguna

de las sales sea estadísticamente significativa en el valor de

pH…………………………………………………………………………………...……..39

Figura 16. Valores registrados de porcentaje de humedad para el tratamiento del

suelo usando bioestimulación. Las líneas representan la desviación estándar; los



x


control negativo (ladrillo incinerado)…………………………………………..……….40

Figura 17. Valores registrados de conductividad eléctrica para el tratamiento del

suelo usando bioestimulación. Las líneas representan la desviación estándar; los


control negativo (ladrillo incinerado)…………………………………………...……….42

Figura 18. Valores registrados de materia orgánica para el tratamiento del suelo

usando bioestimulación. Las líneas representan la desviación estándar; los valores 1 a

12 corresponden a los experimentos, P al testigo (suelo estéril) y N al control negativo

(ladrillo incinerado)……………………………………………………………...……….43

Figuras 19 a,b,c. Diagramas de Pareto para la determinación de significancia de las

sales utilizadas para los valores en porcentaje de humedad, conductividad eléctrica

(CE) y materia orgánica. La línea azul representa el valor mínimo para que alguno de

los factores sea estadísticamente significativo en el resultado, cada una de las letras de

los factores representa las sales indicadas en la Tabla

7…………………………………………………………………………………………….44

Figura 20. Ruta metabólica para la degradación del Hexadecano. El producto final es

Palmitoil-CoA (Velasco-Álvarez, 2011)………………………………………………...46

Figura 21. Curva de calibración de fracción asfalténica. Se realizó previa extracción

del hidrocarburo…………………………………………………………………………..48

Figura 22. Valores de fracción pesada de hidrocarburos obtenidos durante los tiempos

del experimento utilizando bioestimulación. Las líneas representan la desviación

estándar; los valores 1 a 12 corresponden a los experimentos, P al testigo (suelo

estéril) y N al control negativo (ladrillo incinerado)…………………………………...48

Figura 23. Curva de calibración para FTIR, usando hexano. La celda utilizada para el

experimento fue de selenuro de zinc……………………………………………………..50



xi

Figuras 24 a,b.c. Frecuencias de FTIR a los 7, 14 y 28 días obtenidas en el

experimento 9. Se eligió este por ser el que menor cantidad de hidrocarburos de

fracción pesada registró a los 28 días……………………………………………………51

Figura 25. Niveles de producción de CO2 en el suelo contaminado tratado con

bioventeo. La nomenclatura utilizada es como ejemplo: C1 (Corrida) B1 (Reactor) T7

(Tiempo de Experimento…………………………………………………………………57

Figura 26. Valores de pH registrados en diferentes experimentos usando bioventeo. Se

realizó únicamente la cuantificación de los experimentos que obtuvieron resultados

favorables en la cuantificación de dióxido de carbono………………………………...59

Figura 27. Valores de humedad registrados en diferentes experimentos usando

bioventeo. Se realizó únicamente la cuantificación de los experimentos que obtuvieron

resultados favorables en la cuantificación de dióxido de carbono…………………….60

Figura 28. Valores de conductividad eléctrica registrados en diferentes experimentos

usando bioventeo. Se realizó únicamente la cuantificación de los experimentos que

obtuvieron resultados favorables en la cuantificación de dióxido de

carbono…………………………………………………………………………………….61

Figura 29. Relación CO2 producido – Hidrocarburos de Fracción Pesada para el

experimento 9…………………………………………………………………………..…63


experimento C1B2 de bioventeo………………………………………………………...64

Figura 31 a,b,c. Gráfica de probabilidad normal (línea azul) para los datos de CO2

producido en a) 7 días b) 14 días c) 28 días. A la derecha se encuentran los parámetros

estadísticos y el valor p de la prueba Kolmogorov-Smirnov…………………………76

Figura 32 a,b,c. Gráfica de probabilidad normal (línea azul) para los datos de pH


estadísticos y el valor p de la prueba Kolmogorov-Smirnov…………………………77



xii

Figura 33 a,b,c. Gráfica de probabilidad normal (línea azul) para los datos de % de

Humedad producido en a) 7 días b) 14 días c) 28 días. A la derecha se encuentran los

parámetros estadísticos y el valor p de la prueba Kolmogorov-Smirnov……………..79


Materia Orgánica producido en a) 7 días b) 14 días c) 28 días. A la derecha se

encuentran los parámetros estadísticos y el valor p de la prueba Kolmogorov-

Smirnov……………………………………………………………………………………81

Figura 35 a,b,c. Gráfica de probabilidad normal (línea azul) para los datos de

Conductividad Eléctrica producido en a) 7 días b) 14 días c) 28 días. A la derecha se

encuentran los parámetros estadísticos y el valor p de la prueba Kolmogorov-

Smirnov…………………………………………………………………………………....82

Figura 36 a,b,c. Gráfica de probabilidad normal (línea azul) para los datos de HFP

producidos en a) 7 días b) 14 días c) 28 días. A la derecha se encuentran los

parámetros estadísticos y el valor p de la prueba Kolmogorov-

Smirnov……………………………...............................................................................84



xiii

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Composición de las fracciones químicas del crudo del petróleo. En la tabla se

muestran algunos ejemplos de los compuestos en las fracciones indicadas (Viñas

Canals, 2005)………………………………………………………………………………. 3

Tabla 2. Clasificación del crudo según el API (American Petroleum Institute) En el

caso del crudo maya, de acuerdo a su clasificación en grados API se considera medio,

sin embargo la cantidad de azufre que contiene lo posiciona como un crudo pesado

(Castillo Gómez, 2014)…………………………………………………………………......7

Tabla 3. Características generales del crudo Maya (Centeno et al.,

2004)………………………………………………………………………………………...8

Tabla 4. Ventajas y desventajas de las tecnologías de remediación in situ y ex situ.

Aunque el lugar de remediación es un factor importante, el tipo de tratamiento es el

que define la estrategia más adecuada para la remediación (Alba-López,

2011)…………………………………………………………………………………….…12

Tabla 5. Comparación de los tipos de tratamientos de remediación de suelos. En él se

muestran. Los tratamientos biológicos son los que a pesar de su duración, son los más

amigables con el ambiente (Alba-López, 2011)…………………………………………14

Tabla 6. Valores propuestos para el uso de sales durante el proceso de

bioestimulación. Las sales, así como las cantidades, fueron evaluadas por distintos

autores……………………………………………………………………………………..28

Tabla 7. Diseño de experimentos obtenido para la selección de fuentes de nutrientes en

el proceso de bioestimulación. Las letras en la tabla 7 se muestran en las columnas de

esta tabla, representando las sales, mientras que los valores 1 y 0 mostrados e n esta

tabla representan valores de los niveles altos y bajos, respectivamente…………….29



xiv

Tabla 8. Diseño de experimentos obtenido para el proceso de bioventeo. Los valores 0

y 1 establecidos en la columna de nutrientes corresponden a la adición de la fuente ; el

1 representa una adición de 90 mL del medio Bushnell Hass, mientras que el 0

corresponde a la misma cantidad pero en agua destilada…………………………….30

Tabla 9. Caracterización inicial del suelo de Agua Dulce. La mayoría de las variables

fueron determinadas mediantes normas oficiales……………………………………...35

Tabla 10. Cofactores necesarios para el funcionamiento de las enzimas descritas. Las

enzimas son específicas para la degradación de un hidrocarburo, sin embargo los

cofactores indicados son comunes dentro de este proceso…………………………….47

Tabla 11. Resultados de análisis de estadística no paramétrica para los datos

colectados de las variables medidas a diferentes tiempos. Se utilizó el método de

Kruskal-Wallis, con un α= 0.05…………………………………………………………..53

Tabla 12. Correlación de coeficientes de Pearson para las variables involucradas en el

proceso de biodegradación de hidrocarburos de fracción pesada utilizando

bioestimulación. Loa valores en negritas son estadísticamente significativos por el p

valor………………………………………………………………………………………..55

Tabla 13. Especies reportadas como degradadoras de hidrocarburos, según la base de

datos de la Universidad de Virginia (Urbance et al., 2003)…………………………….62

Tabla 14. Comparación de medias estadísticas de las formulaciones de los medios las

variables en el proceso de biodegradación de los hidrocarburos de fracción pesada

utilizando bioestimulación. (*DMS Diferencia Mínima Significativa) Valores con la

misma letra son estadísticamente iguales……………………………………………….75

Tabla 15. Composición del medio Bushnell Haas, utilizado para el proceso de

bioventeo…………………………………………………………………………………85

Tabla 16. Valores obtenidos mediante el análisis de varianza para los efectos de las

sales en las variables medidas………………………………………………………….86



xv

Tabla 17. Interacciones de medias tiempo-medio entra los medios enriquecidos, los

tiempos y las variables en el proceso de biodegradación de los hidrocarburos de

fracción pesada utilizando bioestimulación. (*DMS Diferencia Mínima Significativa)

Valores con la misma letra son estadísticamente iguales…………………………….88

ÍNDICE DE ECUACIONES

Ecuación 1. Clasificación del crudo de acuerdo al API (American Petroleum

Institute)…………………………………………………………………………………….7

Ecuación 2. Fórmula para el cálculo de dióxido de carbono producido (mg CO2/kg

suelo)………………………………………………………….……………………………32

Ecuación 3. Fórmula para el cálculo del porcentaje de humedad del suelo, según la

NOM-021-SEMARNAT-2000 (AS-06)…………………………………………………32



xvi

RESUMEN

A lo largo de las décadas repetidos derrames de petróleo en toda la región suroccidental de

México han causado daños al medio ambiente. Los hidrocarburos del petróleo son de una

composición fracción pesada y otros compuestos persistentes. Dependiendo de la estructura

química del suelo estos hidrocarburos son complejos y son resistentes a la degradación.

Métodos de mitigación tradicionales como la incineración o excavación causan daños

medioambientales significativos a los ecosistemas costeros, ya que algunos procesos de

remediación fisicoquímicas alteran las propiedades del suelo y pueden propiciar la

aparición de contaminantes tóxicos. Además, debido a la composición única de los suelos

costeros, la mayoría de los métodos de reparación no son factibles para su uso. La falta de

procesos de remediación compatibles con el medio ambiente ha dado lugar a un número

creciente de sitios de derrame sin remediar.

El objetivo de este estudio es mejorar la biodisponibilidad de las muestras de suelo

contaminadas con hidrocarburos intemperizados tomadas de un sitio del derrame llamado

Agua Dulce, ubicada en la región suroeste de Veracruz. El diseño experimental se basa en

el método Plackett-Burman para identificar las variables significativas que participan en

proceso de biodegradación de hidrocarburos persistentes incluyendo fuente de nutrientes,

aireación, humedad y otros. Además, los parámetros fisicoquímicos de las muestras del

suelo fueron medidos para aplicar posteriormente a las nuevas tecnologías de remediación

usando bio-estimulación y bioventeo.

En este trabajo se realizaron las dos técnicas de remediación aplicación de un consorcio

nativo adaptado a suelos contaminados con hidrocarburos persistentes. El cálculo de la

cuantificación total de los hidrocarburos se realizó antes y después del tratamiento, para

identificar la relación entre el crecimiento microbiano y la reducción de Hidrocarburos de

Fracción Pesada (HFP). Al ser los nutrientes esenciales un factor limitante en el aumento de

la biodisponibilidad se encontró la mejor combinación de nutrientes que degrada la mayor

cantidad de HFP a un tiempo de 28 días, que junto con las otras variables medidas, mostró

un porcentaje de eliminación de hasta el 97,5% para el proceso de bioestimulación el cual

operó bajo las siguientes concentraciones de nutrientes NaCl 0.001 g/L; MgSO4 • 7H2O

0.006 g/L; CaCl2 0.002 g/L; NH4)2SO4 1 g/L; KH2PO4 5 g/L; FeCl3 • 6H2O 1 g/L;



xvii

(NH4)2PO4 0.01 g/L; NH4Cl 0.25 g/L; KH2NH3 1.065 g/L; FeSO4 0.1 g/L; NH4NO3 0.5

g/L. Las desviaciones estándar se mantuvieron generalmente por debajo del 10%, así

mismo el análisis estadístico se realizó mediante un método no paramétrico, Kruskal-Wallis

con un α=0.05. Una vez identificada la concentración de nutrientes que maximiza la

degradación se puede optimizar los parámetros de operación que conducen a la remediación

de un suelo contaminado con hidrocarburos intemperizados.



xviii

ABSTRACT

Over the span of decades repeated oil spills throughout southwestern region of Mexico

have caused significant environmental damage. Petroleum based hydrocarbons are of a

heavy fraction composition and considered persistent compounds. Depending on their

chemical structure these weathered soil hydrocarbons are complex and are resistant to

degradation. Traditional mitigation methods such as incineration or involve excavation and

causing significant environmental damage to the fragile coastal ecosystems, as some

physicochemical remediation processes alter the soil s properties and may require the

implementation of toxic pollutants. In addition, due to coastal soil s unique composition,

most remediation methods are not feasible for use. The lack of environmentally compatible

remediation processes has resulted in an increasing number of spill sites.

The objective of this study is to improve the biochemistry of weathered hydrocarbon

contaminated soil samples taken from a spill site named Agua Dulce, located in the

southwestern region of Veracruz. The experimental design is based on the Plackett-Burman

method to identify the significant variables involved with biodegradation process of

persistent hydrocarbons including source of nutrients, aeration, moisture and others. In

addition, the soil samples physicochemical parameters were measured to replicate

remediation technologies which implement bio-stimulation and bioventing.

In this study the two remediation techniques were performed implementing a native

consortium adapted to soil contaminated with persistent hydrocarbons. The calculation of

the quantifying total prior to the introduction of the hydrocarbons was performed before

and after the treatment, to identify the relationship between microbial growth and the

reduction of heavy fraction hydrocarbons (HFH). Because nutrient is a factor that increase

hydrocarbon availability was obtained the best combination of nutrients degraded as much

HFH selected a time of 28 days, which along with the other measured variables, showed a

percentage removal of up to 97.5 % in the bio-stimulation process which operated with the

followed nutrients NaCl 0.001 g/L; MgSO4 • 7H2O 0.006 g/L; CaCl2 0.002 g/L; NH4)2SO4

1 g/L; KH2PO4 5 g/L; FeCl3 • 6H2O 1 g/L; (NH4)2PO4 0.01 g/L; NH4Cl 0.25 g/L; KH2NH3

1.065 g/L; FeSO4 0.1 g/L; NH4NO3 0.5 g/L. The standard deviations were generally lower

than 10%. The non-parametric statistical analysis was carried out by Kruskal-Wallis



xix

method obtaining an α=0.05. Once identified the best combination of nutrients is possible

to optimize the operational parameters to remediate a contaminated soil with weathered

hydrocarbons.

1. INTRODUCCIÓN

1.1 Marco Teórico

1.1.1 El suelo

El suelo está integrado por rocas de diferentes tamaños, sustancias de origen orgánico e

inorgánico, aire, agua y organismos vivos. Estos elementos están organizados en partículas

que establecen relaciones topográficas precisas de acuerdo a su tamaño, y ello da lugar a

formación de espacios que se comunican entre sí, como son los poros o canales, que pueden

estar ocupados con aire y agua, estos espacios a su vez, albergan diferentes especies

microbianas tales como bacterias, levaduras y hongos los cuales desempeñan funciones

específicas. El suelo está compuesto por la fase sólida, fase mineral, fase orgánica, fase

líquida y fase gaseosa; y como consecuencia este presenta determinadas propiedades que

determinan su naturaleza (Scragg, 2001).

Las propiedades físicas, químicas y mineralógicas del suelo determinan las características y

la productividad de los mismos; conocerlas permite un mejor desarrollo actividades en él.

Algunas de las propiedades de los suelos son:

Plasticidad: Es la propiedad de los materiales en las que existen las deformaciones sin

rebote; es decir, no hay variación volumétrica y no se desmorona ni se agrieta.

Compresibilidad: Es la capacidad de los suelos para ocasionar una deformación de sus

partículas sin perder sus propiedades por unidad de área.

Resistencia: Fuerza de oposición a la deformación en los suelos.

Permeabilidad: Facilidad de transporte de fluidos dentro de una matriz sólida por unidad de

tiempo; en los suelos esta propiedad se rige por el tamaño de las partículas de los suelos, así

como su separación entre las mismas.

Porosidad: Es la capacidad de un material de absorber en su superficie líquidos o gases.

(García Rivero, 2003)



2

La fracción orgánica de los suelos contaminados se muestra como un polímero

tridimensional compuesto por hidrocarburos aromáticos y alifáticos con cadenas laterales y

compuestos polares. La presencia de esta fracción orgánica mejora la adhesión de partículas

produciendo suelos con estructuras más estables. Entre más contenido orgánico exista en un

suelo, también será mayor la porosidad, por lo que a los contaminantes exógenos como

metales o hidrocarburos, les será más fácil adherirse a estos (García Rivero, 2003).

En la figura 1 se muestra un gráfico con la clasificación de los tipos texturales de suelos, de

acuerdo a su porcentaje de arcilla, arena y limo.

Figura 1. Clasificación de las clases texturales del suelo. El suelo franco arcilloso, objeto

del estudio de este trabajo se encuentra en el centro de la pirámide (Ibáñez Asensio et al.,

2010).



3

1.1.2 Hidrocarburos y petróleo

El petróleo es una mezcla de hidrocarburos, conformados por átomos de diferentes

elementos como carbono (C), hidrógeno (H), nitrógeno (N), azufre (S), oxígeno (O), y otros

metales. Es un compuesto de origen orgánico, menos denso que el agua y con un olor fuerte

y característico. Regularmente se utiliza el término «crudo» para denominar el petróleo que

no tiene algún tratamiento (Huang et al., 2004).

Los hidrocarburos componen la familia más importante de compuestos presentes dentro del

crudo del petróleo, por lo que son los principales responsables de la contaminación

ambiental en suelos, aguas y organismos ((SENER), 2014). El tipo de crudo del petróleo

está determinado por el contenido de los hidrocarburos en él, y estos a su vez tienen

distintas subdivisiones: saturados, aromáticos, resinas y asfáltenos, tal como lo muestra la

Tabla 1 (Hager R. Ali, 2012). Algunas de las estructuras principales se muestran en la

figura 2.

Tabla 1.Composición de las fracciones químicas del crudo del petróleo. En la tabla se

muestran algunos ejemplos de los compuestos en las fracciones indicadas (Viñas Canals,

2005).

Fracción del hidrocarburo Composición

Saturada n-alcanos, alcanos de cadena ramificada, isoprenoides,

cicloparafinas y cicloalcanos.

Aromática Hidrocarburos monoaromáticos, diaromáticos, aromáticos

policíclicos (HAP)

Resinas Pirolinas, quinolinas, carbazoles, tiofenos, sulfóxidos y

amidas

Asfáltenos Agregados de HAPs, sulfuros, metaloporfirinas, fenoles y

ácidos grasos.



4

Figura 2. Estructuras de las diferentes clases de hidrocarburos. Los hidrocarburos de mayor

presencia en suelos son los aromáticos y asfáltenos (Viñas Canals, 2005).

1.1.2.1 Fracción saturada de los hidrocarburos

Los hidrocarburos saturados o alifáticos son aquellos que en su estructura química no

poseen dobles enlaces. Están divididos en función de su estructura química en alcanos o

parafinas y cicloalcanos o naftalenos. Los alcanos a su vez tienen subdivisiones de acuerdo

a las ramificaciones en su estructura lineal; ya sea que contengan un anillo de átomos de

carbono, o que presenten sustituyentes de tipo alquilo a lo largo de su estructura lineal, tal

como se muestra en la figura 3. (Harayama et al., 1999).

Figura 3. Ejemplos de hidrocarburos saturados que forman parte de la mezcla de

hidrocarburos presente en el petróleo. Se presentan las estructuras más simples y las más

comunes encontradas en los suelos contaminados (Harayama et al., 1999).



5

1.1.2.2 Hidrocarburos aromáticos

Los hidrocarburos aromáticos son aquellos que poseen uno o más anillos aromáticos, y

pueden tener como sustituyentes radicales alquilo. El petróleo incluye compuestos que

poseen de uno a cinco anillos aromáticos. Estos compuestos son muchos más estables que

los cicloalcanos, debido a que comparten sus electrones. El benceno es el más simple de

estos compuestos aromáticos, junto al tolueno y el xileno. Sin embargo, estos primeros al

ser los más presentes y solubles en el agua, son indicadores de contaminación en suelos y

aguas (E. Schroeder et al., 2000).

Los hidrocarburos poliaromáticos (PAH), como el antraceno y fenantreno, surgen de los

diversos procesos industriales a los que el crudo del petróleo es sometido. Generalmente

son poco solubles en agua, y debido al alto peso molecular que poseen, son menos volátiles

y solubles que los hidrocarburos mono y diaromáticos (Largo Pereda, 2014).

Figura 4. Ejemplos de los hidrocarburos principales presentes en la fracción aromática del

petróleo. Todos estos compuestos por su estructura, son los más difíciles de degradar a

moléculas más simples (Viñas Canals, 2005).

1.1.2.3 Resinas y asfáltenos

La fracción del crudo conocida como resinas y asfáltenos, a diferencia de otros compuestos

presentes en los hidrocarburos, contiene compuestos polares no hidrocarbonados. Los

compuestos en general contienen nitrógeno, azufre y oxígeno en altas cantidades. Los



6

pesos moleculares de estos compuestos oscilan entre 600 y 200,000 g/Mol. Sus estructuras

moleculares son altamente complejas; pueden poseer una gran cantidad de anillos

aromáticos, además de estructuras acíclicas y heterocíclicas unidas a la cadena

hidrocarbonada (Murgich et al., 1999). Son compuestos recalcitrantes, y debido a su

insolubilidad, y a su alto peso molecular propiciado por sus grupos funcionales unidos,

están protegidos de ataques microbianos, siendo casi imposibles de degradar (Eweis et al.,

1999).

Para diferenciar entre resinas y asfáltenos, se utiliza el parámetro de la solubilidad en

disolventes similares al n-heptano. La diferencia radica en la solubilidad de las resinas

sobre los asfáltenos en estos compuestos (Harayama et al., 1999).

Figura 5. Ejemplos de estructuras de asfáltenos (izquierda) y resinas (derecha). Como se

observa, los asfáltenos son estructuras más complejas químicamente debido a la unión de

anillos bencénicos y por tanto más insolubles (Harayama et al., 1999).

1.1.3 Clases de petróleo

Las clases de petróleo se diferencian de acuerdo a su volatilidad y su composición de

elementos. Al calentarse el petróleo se volatilizan los hidrocarburos ligeros (de estructura

química sencilla y bajo peso molecular, mientras que los componentes más pesados tienden

a acumularse en la superficie del suelo debido a su persistencia (Benavides-López et al.,

2006).



7

Los hidrocarburos están clasificados de acuerdo a su gravedad API (parámetro

internacional del American Petroleum Institute), que diferencia las calidades del crudo. Los

grados API se definen como:

°API = (Ecuación 1)

Donde Sg es la gravedad específica a 60 °F.

En México se producen tres tipos de petróleo crudo: Olmeca, Istmo y Maya. La diferencia

entre estos crudos estriba en su densidad y el contenido de azufre. El crudo Olmeca y el

Istmo están clasificados como superligero y ligero, respectivamente; mientras que el crudo

Maya está clasificado como un crudo pesado, con una densidad de 1.0 a 0.92 g/cm3 y un

contenido mínimo de azufre de 3.3 %, como la tabla 2 muestra (Beltrán-Paz et al., 2006).

Tabla 2. Clasificación del crudo según el API (American Petroleum Institute) En el caso del

crudo maya, de acuerdo a su clasificación en grados API se considera medio, sin embargo

la cantidad de azufre que contiene lo posiciona como un crudo pesado (Castillo Gómez,

2014).

Crudo Tipo de

crudo

° API Densidad

(kg/m3)

% (S)

Istmo Ligero > 31.1 <870 1.45

Maya Medio 22.3 – 31.1 870 – 920 3.3

Pánuco Pesado 10 – 22.3 920 – 1000 3.0

Olmeca Extrapesado <10 >1000 0.8

Aunque de manera general México produce tres tipos de crudo, el Maya constituye casi un

50% de la producción, por lo que es el suelo contaminado es común encontrar una alta

concentración de asfáltenos. En la tabla 3 se muestran algunas de las propiedades del crudo

Maya, donde se observa un alto contenido de S, Vanadio (V), Níquel (N), entre otros

compuestos, los cuales aumentan la viscosidad del crudo propiciando la recalcitrancia y

dificulta su biodegradación.



8

Tabla 3. Características generales del crudo Maya (Centeno et al., 2004).

Variable Valor

Peso específico

Gravedad API

0.9220

21.51

Análisis elemental (% en peso) Valor

Carbono

Hidrógeno

Oxígeno

Azufre

Nitrógeno

83.96

11.80

0.34

3.51

0.36

Metales, partes por millón (ppm) Valor

Níquel

Vanadio

53

292

Una alternativa para mejorar la biodisponibilidad de los hidrocarburos es el empleo de un

consorcio previamente adaptado a la fracción pesada del crudo Maya, el cual puede ser

empleado simultáneamente con un balance adecuado de nutrientes y oxígeno para

incrementar el potencial de degradación de los hidrocarburos intemperizados. Los

subproductos de la biodegradación: ácidos carboxílicos, biopolímeros, CO2, H2O, entre

otros mejoraran la biodisponibilidad de los hidrocarburos fuertemente sorbidos en el suelo

por fuerzas electrostáticas o de naturaleza química (Díaz-Ramírez et al., 2003).

1.1.4 Contaminación de los suelos por hidrocarburos

La contaminación de los suelos es un problema que ha tomado importancia a lo largo de las

últimas décadas, ya que el crecimiento de la población, así como el de los sectores



9

industriales y las tecnologías para obtener recursos han sobreexplotado y deteriorado los

horizontes edafológicos. Uso de fertilizantes, pesticidas, depósito de metales, y derrames de

hidrocarburos son las principales vertientes de este problema.

La contaminación de los suelos se clasifica de acuerdo a su origen en endógena y exógena.

La contaminación endógena se produce por la acumulación o aumento de toxicidad en los

elementos presentes del suelo. La contaminación exógena es consecuencia de actividades

relacionadas con procesos en donde el ser humano influye, y es la más grave, ya que puede

llegarse a modificar la matriz misma del suelo en cuestión (Alba-López, 2011). En ambos

aspectos la biodisponibilidad de los compuestos disminuye.

En el suelo, los hidrocarburos impiden el intercambio gaseoso con la atmósfera, e inician

una serie de procesos físico-químicos simultáneos, tales como evaporación y penetración.

De acuerdo al tipo de hidrocarburo, así como a características edafológicas tales como

temperatura, textura humedad, cantidad de suelo contaminado, entre otros, el daño

toxicológico es variable (Benavides-López et al., 2006). Los suelos contaminados tienden a

aumentar su grado de salinidad, lo que dificulta más su tratamiento. Debido a que altos

gradientes de salinidad en un suelo pueden destruir la estructura terciaria de las proteínas,

desnaturalizar enzimas y deshidratar células, lo cual es letal para la microbiota existente y

para muchos microorganismos utilizados para la biorremediación de aguas y suelos (Ortiz-

Salinas et al., 2014).

1.1.5 Suelos contaminados con hidrocarburos en México

México es uno de los países «en vías de desarrollo», y este desarrollo ha permitido una

creciente concentración de la industria petrolera. Hasta 1970 no se aplicaba ningún criterio

ambiental para los procesos derivados del petróleo como extracción, refinación y

distribución. La infraestructura petrolera está integrada por pozos petroleros, baterías de

separación, complejos procesadores de gas, centrales de almacenamiento y bombeo, un

sistema de ductos que recorre las principales refinerías del país y presas para el

confinamiento de desechos procedentes de las operaciones petroleras (Ortínez-Brito et al.,

2009).



10

A mediados de la década de los 70, hubo una reestructuración masiva de la industria

petrolera, ya que la industria petroquímica se convirtió en uno de los motores del

crecimiento a futuro en México, aunque también se convirtió en una fuente de

contaminación, aunado a la producción de otras sustancias industriales (Quadri, 1994).

Desde esta época, se comenzó el explotamiento de diferentes zonas del país donde se

encontraban yacimientos petroleros, sin tomarse las precauciones adecuadas y causando

una contaminación casi irreversible. Hasta nuestros días, estos sitios no han sido

remediados, ya que muchos han sido olvidados debido a que se encuentran en zonas de

difícil acceso, como ecosistemas pantanosos.

Cuando hay derrames de hidrocarburos en el suelo, se generan «plumas de contaminación»,

donde el petróleo derramado se mueve hacia las capas subyacentes del suelo, contaminando

los mantos freáticos que se encuentran debajo del mismo, como se explica en la figura 6

(Cortón et al., 2006).

Figura 6. Pluma típica de contaminación en suelos por la acción de hidrocarburos. Se

observan los fenómenos que rigen los suelos intemperizados (Cortón et al., 2006).

Recientemente, no se tenía conocimiento sobre el verdadero daño que sufre el suelo al ser

contaminado por diferentes sustancias y desechos industriales. Los hidrocarburos son



11

elementos que pueden permanecer durante mucho tiempo en el suelo, y causar graves e

irreversibles daños al perfil edafológico.

En tiempos recientes, se han evaluado diferentes tecnologías para la evaluación, tratamiento

y remediación de los suelos contaminados con hidrocarburos, en las diferentes áreas

geográficas de México y el mundo donde existe este problema de contaminación. Se busca

mejorar el éxito de los métodos ya conocidos y la implementación de nuevas alternativas,

siempre que no causen un daño mayor al que están tratando de mitigar y evaluando los

costos de operación.

1.1.6 Clasificación de las tecnologías de remediación de suelos

Las tecnologías para la remediación de suelos se clasifican de acuerdo a los siguientes

principios: estrategia de remediación, lugar en el que se realiza el proceso de remediación y

tipo de tratamiento (De La Rosa-Pérez et al., 2007).

1.1.6.1 Estrategia de remediación.

Para remediar los suelos contaminados, según la bibliografía, existen 3 estrategias básicas:

a) Destrucción o modificación de los contaminantes.

b) Extracción o separación.

c) Aislamiento e identificación de los contaminantes.

(De La Rosa-Pérez et al., 2007)

1.1.6.2 Lugar donde se realiza el proceso de remediación.

De acuerdo a esta clasificación, existen dos maneras de realizar el proceso de remediación

edafológica:

a) In situ. Estos procesos se realizan en el sitio donde se encuentra el problema de

contaminación sin la necesidad de excavar, remover o trasladar el suelo.



12

b) Ex situ. Estos procesos se realizan fuera del sitio original del suelo; es decir, hay

que realizar procesos de excavación, remoción, dragado o cualquier otro para

realizar la remediación. Posteriormente el suelo es retornado a su sitio original.

(Granda Laso, 2012)

Como indica la Tabla 4, existen algunas ventajas y desventajas de acuerdo al lugar en el

que se realice la biorremediación.

Tabla 4. Ventajas y desventajas de las tecnologías de remediación in situ y ex situ. Aunque

el lugar de remediación es un factor importante, el tipo de tratamiento es el que define la

estrategia más adecuada para la remediación (Alba-López, 2011).

Tipo de

remediación

Ventajas Desventajas

In situ Tratamiento del suelo sin

necesidad de transporte.

Tiempo mayor de tratamiento.

No muestran un comportamiento

homogéneo, no se puede muestrear

periódicamente

Menor costo de remediación.

Ex situ Menor tiempo de tratamiento. Necesidad de remoción y

tratamiento previo.

Mayores costos de operación.

Es posible homogeneizar y

estandarizar el proceso.

Se debe considerar la

manipulación del material y la

exposición al contaminante.



13

1.1.6.3 Tipo de tratamiento

De acuerdo a los principio de acción, o a la naturaleza de los procesos que tienen lugar en

los suelos, se pueden clasificar las tecnologías de remediación en físicoquímicos, térmicos

y biológicos, y en la Tabla 5 se explican sus ventajas y desventajas.

a) Tratamientos fisicoquímicos. Estos tratamientos basan su principio en el uso de

procesos físicos, químicos o de manera combinada. Utilizan propiedades de los

contaminantes como su densidad y volatilidad, así como procesos químicos como

adición de solventes o transformación de componentes a radicales más libres y más

disponibles, para así ser separados de la matriz del suelo y descontaminarlo

(Coulier-Brasero et al., 2004).

b) Tratamientos biológicos. Los procesos biológicos en la degradación de los

hidrocarburos usan componentes y otros residuos orgánicos como fuente de

carbono. De esta manera, los compuestos muy difíciles de remover o recalcitrantes,

son degradados a estructuras más simples por la acción de estos (Coulier-Brasero et

al., 2004).

c) Tratamientos térmicos. Estos tratamientos permiten la inmovilización, eliminación o

transformación de los contaminantes contenidos en los suelos mediante el aporte de

energía usada como calor. Pueden aumentar la volatilidad de los compuestos e

incluso, si se someten a temperaturas extremas, incinerarlos(Coulier-Brasero et al.,

2004).



14

Tabla 5. Comparación de los tipos de tratamientos de remediación de suelos. En él se

muestran. La comparación se basa en efectos hacia el ambiente y costo (Alba-López, 2011).

Tratamiento Ventajas Desventajas

Fisicoquímico Costo moderado.

Tiempos de operación

relativamente cortos.

Modificación de propiedades

fisicoquímicas del suelo tratado.

Uso de procesos para separar los

componentes.

Biológico Pocos recursos y costo

moderado.

No genera residuos tóxicos o

subproductos.

Precisa mantener condiciones

favorables durante todo el

proceso.

Tiempo prolongado de reacción.

Térmico Tiempos de remoción cortos.

Ideal para emergencias

ambientales.

Elimina contaminantes con alto

peso molecular.

Costos de operación muy altos.

Genera elementos muy tóxicos.

Condiciones de operación muy

controladas.

La figura 7 muestra las principales técnicas de remediación en base a su clasificación, que

son los métodos biológicos, fisicoquímicos y térmicos, mientras que la figura 8 establece

una relación costo-tiempo entre las tecnologías de remediación más utilizadas para suelos

contaminados.



15

Figura 7. Clasificación de las técnicas de remediación para suelos contaminados según su

tipo. La clasificación de la Tabla 6 solo se aprecia en las técnicas biológicas, por ser más

usada en estas (Martınez-Prado et al., 2014).

Excavación

Incineración

Choque térmico

Lavado de suelos

Biosuspensión en reactores Composteo

Bioventeo

Bioestimulación

Parceleo (Landfarming)

Mejoramiento de la rizósfera Hielo-deshielo

Tiempo

Figura 8. Relación costo-tiempo entre algunos de los métodos de remediación de suelos.

Los métodos de bioestimulación y bioventeo se encuentran en el centro de la gráfica

(Reynolds et al., 1997).

Técnicas de remediación

Biológicas

Biorremediación

In situ

Bioventeo Bioestimulación Bioaumentación

Land farming Fitorremediación

Ex situ

Fase sólida Biorremediaci

ón por composteo

Biorreactores

Fisicoquímicas

Electroremediación

Extracción de vapor

Lavado de suelos Extracción con

solventes Inundación de

suelos Solidificación Estabilización Tratamientos

químicos Separación física

Térmicas

Desorción térmica

Incineración Vidrificación

Pirólisis

Cost

o



16

1.1.7 Intemperización y biodisponibilidad

En las áreas edafológicas donde ocurren los derrames de hidrocarburos y que no se tratan

de manera rápida ocurren diferentes procesos; por una parte, los hidrocarburos de fracción

más ligera se eliminan del suelo por procesos naturales como volatilización, mineralización

(transformación a CO2 y agua) y biodegradación de componentes simples. Sin embargo,

aquello hidrocarburos de fracción pesada o con anillos aromáticos abundantes como los

PAH, permanecen y se vuelven recalcitrantes mientras el suelo se «intemperiza» (Teutli-

León et al., 2003).

Para aquellos suelos intemperizados, la remediación se somete a condiciones como el tipo

de hidrocarburos presentes, el grado de impregnación y la concentración de contaminantes

en el suelo. Entre más tiempo de residencia tenga un contaminante en el suelo, se hace

menos disponible a la acción de los microorganismos. De esta manera, se puede definir la

biodisponibilidad como la facilidad relativa con la que un compuesto puede ser usado,

transformado o degradado por los microorganismos nativos presentes en el suelo, y se

entiende como el efecto neto entre la desorción y la biodegradación.(García Rivero, 2003).

En la figura 8 se observa como los fenómenos de transferencia de masa rigen los procesos

de biodisponibilidad de las moléculas en la matriz del suelo.

Figura 9. Representación de los eventos que rigen la biodisponibilidad de las moléculas

contaminantes. El símbolo (●) representa las partículas de hidrocarburo dentro del suelo.



17

1.1.8 Biorremediación

Se entiende como biorremediación el uso de técnicas que utilizan organismos vivos

(plantas, hongos, microorganismos, etc.) para degradar, remover o transformar compuestos

orgánicos muy tóxicos a moléculas y productos metabólicos más simples. Esta alternativa

de remediación de suelos depende del metabolismo de los organismos presentes en él, ya

que estos deben usar todos aquellos contaminantes (hidrocarburos) como fuente de carbono

y energía (Marks et al., 1994).

La meta final de la biodegradación de los hidrocarburos es su mineralización y su

transformación a formas inorgánicas de elementos comunes como N, S y P. Y aunque no

todos los compuestos derivados del petróleo son susceptibles a la biodegradación, se tiene

en la literatura que los procesos de biorremediación se han usado exitosamente para el

tratamiento de suelos y lodos contaminados con HTPs (Hidrocarburos Totales del

Petróleo), solventes, pesticidas, clorofenoles, explosivos y HAP’s (Semple et al., 2001).

1.1.8.1 Bioestimulación y Bioventeo

Como ya se ha mencionado antes, en los suelos contaminados con hidrocarburos

intemperizados, es necesario promover la desorción de estos mediante la aplicación de uno

o más pretratamientos antes de realizar un proceso de biorremediación (Pollard et al.,

1994). Algunas de las tecnologías que se han aplicado para desorber contaminantes

hidrofóbicos de suelos son: el uso de solventes no polares (tolueno), el uso de surfactantes

no iónicos y la aplicación de tratamientos electroquímicos (Ko et al., 2000). El objetivo de

estos procesos es la biodegradación de hidrocarburos persistentes, que consisten en alterar

las propiedades fisicoquímicas del suelo, con la finalidad de aumentar la porosidad y

movilidad de los hidrocarburos para su posterior desplazamiento de los contaminantes. En

general, para utilizar solventes, se requiere un tratamiento previo del suelo con una alta

cantidad de materia orgánica (Volke Sepúlveda et al., 2002).

Sin embargo, estas tecnologías lejos de proveer una solución para la contaminación,

generan un costo elevado y un suelo completamente modificado en propiedades y

estructura. Afortunadamente, existen procesos biológicos que tienen un costo



18

considerablemente bajo, además de no generar alguna modificación en las propiedades del

suelo, ni generación de subproductos tóxicos.

La bioestimulación es el método de biorremediación más empleado para reducir la

concentración de contaminantes en el suelo (Cunningham et al., 2000). En este proceso, la

actividad natural de los microorganismos presentes en el suelo contaminado es estimulada

por la adición de soluciones con nutrientes al suelo, así como oxígeno u otro aceptor de

electrones (Gómez et al., 2009). Este proceso busca incrementar los fenómenos de

transferencia de masa en el suelo, donde los compuestos que se encuentran en la fase sólida

como los hidrocarburos hidrofóbicos y algunas sales puedan incorporarse a la fase líquida y

convertirse en compuestos biodisponibles.

El bioventeo es el tratamiento in situ comúnmente empleado en la remoción de

hidrocarburos de fracción ligera; sin embargo también se ha estudiado su aplicación en

compuestos más complejos. El bioventeo emplea flujos de aire bajos y provee sólo el

oxígeno necesario para la biodegradación de los contaminantes mientras minimiza su

volatilización (Maheshwari et al., 2014). Aunque es un método relativamente simple, de

gran eficiencia, tiene menor costo que otras tecnologías y no altera con significancia el

suelo que trata, su desventaja radica en el tiempo tan prolongado de acción para lograr una

eficiente biodegradación de los hidrocarburos (Magalhães et al., 2009).

1.1.9 Rutas de biodegradación

Los compuestos petroquímicos y sus derivados, como los hidrocarburos, PAHs y BTEX

(Benceno, Tolueno, Etilbenceno y Xileno), regularmente son degradados por los

microorganismos presentes en el suelo, que los utilizan como fuente de energía para sus

compuestos metabólicos (Scragg, 2001). Ya que los hidrocarburos son compuestos

estables, su degradación ocurre regularmente mediante procesos aerobios; los hidrocarburos

alifáticos se convierten en alcoholes para posteriormente ser oxidados a ácidos carboxílicos

que entran en la β-oxidación (Cerniglia, 1993).

En el caso específico del benceno, que es un compuesto aromático monocíclico, es

hidroxilado a cis-1,2-dihidroxi-1,2-dihidrobenceno por una enzima dioxigenasa, para



19

Hidrocarburos

Aromáticos

Policíclicos

(PAHs)

Bacterias

Algas

Hongos

Algas

Citocromo p

450/metano

monooxigenasa

después convertirse a catecol. A su vez, este compuesto puede seguir dos rutas, como se

muestra en la Figura 9: escisión en orto, que da lugar a cis, cis-muconato, y escisión en

meta, transformándolo en semialdehído 2-hidroximucónico. Ambas rutas generan

compuestos que pueden entrar en el ciclo de Krebs, y ser degradados posteriormente

(Scragg, 2001). Se tomó el benceno como ejemplo, ya que los primeros dos pasos de su

degradación son comunes en la degradación de la mayoría de los hidrocarburos aromáticos

mono y policíclicos.

H

H

OH

OH

OH

H

H

OH

OH

OH

OH

COOH

COOH

COOHCHO

OH

H-

H

H

O

Figura 10. Pasos iniciales en la degradación de PAHs por hongos, bacterias y algas. Estas

estructuras degradadas pueden entrar en procesos metabólicos como la β-oxidación

(Cerniglia, 1993).

Óxido de areno

Reorganización

no enzimática

Epóxido

hidrolasa

Fenol

trans- Dihidrodiol

Quinona PAH Escisión del anillo

Dioxigenasa

Deshidrogenasa

Escisión en orto

Escisión en meta

Ácido cis, cis-

mucónico

Semialdehído 2-

hidroximucónico



20

Aunque la biorremediación en suelos ocurre regularmente y es recomendada en

condiciones aeróbicas, no siempre se puede mantener el suelo en condiciones óptimas para

este proceso debido a la cantidad de agua presente, el taponamiento de los poros del suelo,

y la estructura de las partículas que conforman el horizonte del suelo. Los hidrocarburos

aromáticos monocíclicos, policíclicos y alifáticos, algunos asfáltenos y otros derivados del

petróleo pueden ser degradados anaeróbicamente, siempre que puedan obtener oxígeno; del

agua mediante metanogénesis, de los nitratos bajo condiciones nitrificantes y de los sulfatos

mediante condiciones reductoras de azufre. Los hidrocarburos se transforman en

intermediarios fácilmente acoplables al ciclo de Krebs. Sin embargo, la gran desventaja de

este proceso es su lentitud, en comparación a la biodegradación bajo condiciones aeróbicas

(Switzenbaum, 1995).

Se han observado características únicas en la degradación de los hidrocarburos de distintos

pesos moleculares, así como de otras moléculas orgánicas. Una de ellas es la capacidad de

algunas enzimas para utilizar diferentes sustratos a los que utilizan regularmente, llamada

metabolismo gratuito, probablemente resultado de la alta especificidad de la enzima.

Contrariamente, aunque algunas enzimas sean altamente específicas, son imprecisas, a tal

punto de metabolizar sustratos que no proporcionan ningún beneficio al compuesto. Esta

condición se denomina co-metabolismo (Semprini, 1997).

1.2 Antecedentes

1.2.1 El sureste mexicano y la contaminación de los suelos

En el sureste mexicano se encuentran un sinnúmero de sitios con diferentes niveles de

impacto ambiental, todos resultado de la actividad petrolera iniciada hace unos 60 años por

parte del gobierno mexicano. A mediados de la década de los 70s, se comenzó a tomar

conciencia que la actividad petrolera en las zonas costeras estaba dañando no solo al suelo,

si no al agua, flora y fauna al ser en estos sitios los principales lugares de extracción,

refinación y transporte del crudo, como consecuencia ha cambiado considerablemente las

características del suelo (R. H. A. Schroeder et al., 1999), hasta el día de hoy los efectos

negativos por la acumulación de hidrocarburos altamente persistentes ha incrementado.



21

Se han realizado estudios en cuanto a la biodisponibilidad y aprovechamiento de los

hidrocarburos intemperizados en los suelos costeros contaminados, así como los efectos de

las altas concentraciones de los mismos para la microbiota y para el ecosistema en general.

Debido a esto se emplearon métodos tradicionales durante muchos años (excavación,

incineración), para alcanzar la efectividad y el mejoramiento de las condiciones del suelo

contaminado; sin embargo, no han funcionado exitosamente en lugares inaccesibles donde

maquinaria pesada no puede emplearse y los métodos químicos ocasionan graves daños al

ecosistema. Ante esta situación las demandas en cuanto al desarrollo de tecnologías de

remediación de suelos por parte de PEMEX y el IMP (Instituto Mexicano del Petróleo) es

la apuesta a tecnologías alternativas y amigables como la biorremediación(Zavala et al.,

2002).

1.2.2 Suelo contaminado en Veracruz

El estado de Veracruz ha sido afectado por derrames petroleros, donde los suelos han

alcanzado concentraciones hasta 450 000 ppm de HTPs (Sepúlveda, 2003). La acumulación

de estos hidrocarburos en el suelo por largos periodos de tiempo, da lugar a hidrocarburos

intemperizados, que son más difíciles de remover por los métodos convencionales debido a

los factores físicos, químicos e hidrogeológicos de los suelos costeros (temperatura,

humedad, pH, mineralización del suelo, etcétera). Existe poca información acerca de los

mecanismos físicos, químicos y biológicos de los hidrocarburos intemperizados, que

conducen a su biodegradación. Estas estructuras tienen una alto contenido de heteroátomos

como azufre, nitrógeno, vanadio, níquel, entre otros siendo la fracción asfalténica la más

persistente en los suelos, así mismo la recalcitrancia de estos inhiben la degradación de

hidrocarburos policílicos aromáticos (HAPs) (García-Bautista et al., 2012).

1.3 Descripción del problema

Agua Dulce, municipio del estado de Veracruz, se encuentra al suroeste del estado con

vertientes principales hacia el Golfo de México, y colinda con el estado de Tabasco. Posee

una actividad urbana tranquila y en sus actividades principales destacan la agricultura y el

pastoreo ((INEGI), 2014).

Si bien Agua Dulce no es un municipio con una intensa actividad petrolera, se encuentra en

el centro de la actividad petrolera más importante del territorio mexicano. Como se aprecia



22

más adelante (Figura 11), el territorio comprendido de Agua Dulce limita con las zonas de

Minatitlán y Coatzacoalcos, donde se concentra el 98 % de la actividad petrolera básica de

todo el país, con una superficie ocupada total de 2,282 hectáreas (Fernández et al., 2013).

Figura 11. Localización geográfica de Agua Dulce, Veracruz. Los municipios aledaños

(Minatitlán y Coatzacoalcos) a la izquierda, son los principales actores en procesos

petroquímicos.

Debido a los procesos relacionados con la actividad petrolera como la extracción,

refinación y transporte del petróleo y sus derivados en esta zona, se han encontrado

recientemente índices graves de contaminación en aguas y suelos, por lo que es necesaria

una estrategia para la remediación de los ecosistemas.



23

2. JUSTIFICACIÓN

El incremento de la biodisponibilidad de los hidrocarburos en suelos mediante procesos

biológicos es una alternativa frente a los tratamientos físicos o mecánicos como la

incineración y excavación que se han implementado durante décadas en nuestro país.

Dichos tratamientos además de ser costosos, generan una contaminación muchas veces

mayor que la que están tratando de remediar, por ejemplo durante la incineración donde se

emplean temperaturas a 1000°C se producen PAHs altamente carcinogénicos los cuales

afectan al ecosistema en general. La región del suroeste del país en donde se concentra la

mayor actividad petrolera de nuestro país y por tanto, es la región con un alto registro de

lugares que no han sido tratados desde hace décadas principalmente en ecosistemas

pantanosos o de difícil acceso. El tipo de ambiente extremo, la complejidad de las

propiedades fisicoquímicas del suelo dificulta la biorremediación de los suelos

contaminados con hidrocarburos intemperizados, los cuales incrementan que son altamente

recalcitrantes.

En este trabajo se propone incrementar la biodisponibilidad de los hidrocarburos

intemperizados, por lo que se estudian dos procesos: bioestimulación que es la adición de

nutrientes y agua más la adición de un consorcio previamente adaptado, y un segundo

proceso que es bioventeo que consiste en la adición de nutrientes, un flujo de aire y un

consorcio previamente adaptado. Mediante un diseño factorial fraccionado (Placket

Burman) se estudiará la búsqueda de los parámetros ideales para favorecer el desarrollo de

microbiota que tenga un sistema enzimático capaz de metabolizar los hidrocarburos

mediante el establecimiento de condiciones adecuadas de aire, nutrientes y humedad.



24

3. HIPÓTESIS

Una combinación adecuada de sales, promueve los procesos metabólicos de los

microorganismos presentes en el suelo costero de Agua Dulce, biotransformando los

hidrocarburos de fracción pesada (HFP) a compuestos más simples; el proceso de

bioestimulación garantiza una remoción de los hidrocarburos de fracción pesada del suelo

tratado, al ser tomados como fuente de carbono por el consorcio nativo de Agua Dulce



25

4. OBJETIVO GENERAL

Mejorar la biodisponibilidad de los hidrocarburos intemperizados presentes en un suelo

costero para eficientizar su potencial de biodegradación mediante el proceso de

bioestimulación.

5. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Establecer concentraciones óptimas de nutrientes para maximizar la biodegradación

de los hidrocarburos intemperizados.

Evaluar la capacidad de degradación de un consorcio microbiano nativo adaptado a

hidrocarburos de fracción pesada.

Determinar la relación de propiedades fisicoquímicas del suelo a los tiempos 0, 7,

14 y 28 días para evaluar el mejoramiento del suelo contaminado con hidrocarburos

intemperizados.

Seleccionar la mejor combinación de nutrientes y condiciones para el mejoramiento

de la biodisponibilidad de los hidrocarburos utilizando bioestimulación.

Realizar estudios preliminares de biodegradación mediante bioventeo para obtener

la biodegradación de los hidrocarburos intemperizados.



26

6. DESARROLLO EXPERIMENTAL

Este trabajo se llevó a cabo en las siguientes etapas: 1) Identificación de las condiciones de

operación de los experimentos a desarrollar a nivel laboratorio, para esto se tomaron

mediciones iniciales de las variables involucradas, se seleccionó el diseño de experimentos

Plackett- Burman, el cual permitirá conocer los efectos principales de 11 factores

(nutrientes esenciales) sobre la variable de respuesta. 2) El monitoreo de las variables de

respuesta se realizarán conforme a la normatividad, con la finalidad de observar si los

valores alcanzados al final de la experimentación se ubican dentro de los estándares

establecidos por la normatividad. 3) La obtención de las concentraciones mínimas

necesarias incrementaran el potencial de biodegradación de los hidrocarburos

intemperizados. 4) Una respuesta del mejor tratamiento se observará en un cambio de las

propiedades fisicoquímicas del suelo, como el pH, la conductividad eléctrica y humedad. 5)

Este trabajo realizó también estudios preliminares de biodegradación de hidrocarburos

adicionando una fuente de nutrientes Bushnell Haas y un flujo de aire implementados en

estudios anteriores, así mismo se aplicó el consorcio microbiano previamente caracterizado

y que contiene las siguientes especies bacterianas: Flavobacterium salisperosum,

Flavobacterium terrae, Flavobacterium saliperosum, Pseudomonas citronellolis,

Pseudomonas delhiensis, Pseudomonas knackmussisi, Ochrobacterium intermedium,

Ochrobactrum cytisi, Ochrobactrum anthrop, y Ochrobactrum tritici todas con un

porcentaje de identidad del 98 % (Jiménez-Hernández, 2014).

6.1 Caracterización fisicoquímica del suelo de Agua Dulce, Veracruz

Se tomaron muestras de suelo en el municipio de Agua Dulce, Veracruz. En las

coordenadas 17° 58’ y 18° 13’ de latitud norte; los meridianos 94° 03’ y 94° 17’ de

longitud oeste; con altitud de entre 10 y 200 m (Planeación, 2014). Este suelo pertenece en

textura al tipo franco-arcilloso. El suelo del que se tomaron las muestras pertenece al tipo

franco-arcilloso, donde al combinar dos propiedades de textura, tiene propiedades

diferentes. Mientras que un suelo arcilloso retiene mucha agua y tiene poca aireación, un

suelo franco facilita la aireación ya que su estructura granular permite interacciones y

fenómenos de transferencia de masa adecuados para el intercambio de nutrientes

(Thompson et al., 1988).



27

Para la caracterización de este suelo se determinaron sus principales características como el

pH, temperatura, conductividad eléctrica, capacidad de retención de agua, producción de

CO2, conteo bacteriano, espectro UV, y cuantificación de hidrocarburos de fracción pesada.

6.2 Uso de dos tecnologías para la biorremediación de suelos

Para el suelo contaminado con hidrocarburos de fracción pesada se utilizaron dos

alternativas de biorremediación. En la primera se utilizó bioestimulación; se agregó una

fuente de nutrientes más un consorcio adaptado y se simuló un ambiente húmedo para

favorecer el crecimiento de microorganismos. En la segunda alternativa, se utilizó un

proceso de bioventeo, con una cantidad de nutrientes y un flujo fijo, de manera que fuera un

ambiente adecuado para el crecimiento bacteriano.

6.2.1 Diseño de Experimentos

Un balance adecuado de nutrientes en el suelo, el contenido de humedad y el nivel de

aireación promueven la biotransformación de los hidrocarburos persistentes, por lo que se

desarrolló un diseño de experimentos para identificar qué factores son los más activos en la

biodegradación de los hidrocarburos intemperizados.

El diseño de Plackett-Burman, es un diseño de barrido que permite establecer relaciones

entre las variables de estudio y la de respuesta. Permite reducir el número de experimentos

considerablemente, al tratarse de un modelo ortogonal. La metodología se reduce a dos

niveles; uno alto y uno bajo, y el número de experimentos siempre es un múltiplo de 4. La

ventaja respecto a otros experimentos radica en la reducción de variables sin importancia

para el desarrollo del experimento, considerando sólo las que tengan significancia para el

mismo (Montgomery Douglas, 1991).

Para cada una de las metodologías propuestas en este trabajo se realizó un diseño de

experimentos factorial. Mediante el uso de las sales mostradas (Tabla 6), se realizó el

diseño obteniendo 12 medios enriquecidos para el proceso de bioestimulación, como

explica la Tabla 7. Para el proceso de bioventeo, se realizó otro diseño de experimentos

factorial en cuatro bloques. De esta manera solo se tuvieron en cuenta tres variables:

humedad, inyección de aire y nutrientes (Tabla 8); durante el proceso de bioventeo ya se

partió de una fuente de nutrientes conocida. El medio Bushnell Haas fue usado para el



28

aislamiento de las bacterias degradadoras de hidrocarburos (Irfan, 2011), el experimento se

realizó por duplicado invirtiendo los valores del diseño, a todas las corridas se les

adicionaron 30 mL de un consorcio adaptado proveniente del suelo contaminado.

Tabla 6. Valores propuestos para el uso de sales durante el proceso de bioestimulación. Las

sales, así como las cantidades, fueron evaluadas por distintos autores.

Compuesto Nivel alto (g/L) Nivel bajo (g/L)

a) NaCl 0.1 0.001

b) MgSO4 • 7H2O 0.5 0.006

c) CaCl2 1 0.002

d) (NH4)2SO4 1 0.2

e) KH2PO4 5 0.0094

f) FeCl3 • 6H2O 1 0.0004

g) (NH4)2PO4 2 0.01

h) NH4Cl 0.25 0.1

i) KH2NO2 1.065 0.0058

j) FeSO4 1 0.1

k) NH4NO3 0.5 0.0122



29

Tabla 7. Diseño de experimentos para el proceso de bioestimulación. Las letras en la tabla 7

se muestran en las columnas de esta tabla, representando las sales, mientras que los valores

1 y 0 mostrados en la tabla representan valores de los niveles altos y bajos,

respectivamente.

Experimento

/Sal

a b c d e f g h i j k

1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1

2 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0

3 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0

4 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1

5 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0

6 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0

7 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 1

8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

9 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1

10 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0

11 0 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1

12 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1



30

Tabla 8. Diseño de experimentos obtenido para el proceso de bioventeo. Los valores 0 y 1

establecidos en la columna de nutrientes corresponden a la adición de la fuente; el 1

representa una adición de 90 mL del medio Bushnell Hass, mientras que el 0 corresponde a

la misma cantidad pero en agua destilada.

Experimento % Humedad Inyección de aire (L/h) Nutrientes (g/L)

1 30 210 1.47

1b 40 80 0

2 30 80 1.47

2b 40 210 0

3 30 210 0

3b 40 80 1.47

4 40 210 1.47

4b 30 80 0

Aunado a los diseños de experimentos, una vez obtenidos los valores resultantes de las

variables medidas para el proceso de bioestimulación, se realizaron diferentes análisis

estadísticos. Pruebas de normalidad y homogeneidad y homoelasticidad de los datos,

posteriormente análisis de varianza (ANOVA) y pruebas de correlación de Pearson, con un

intervalo de confianza de 95 %para determinar interacciones entre los resultados.

6.3 Establecimiento de condiciones para los experimentos

Ambos tratamientos (bioestimulación y bioventeo) se encontraron las mejores condiciones

de operación gracias al diseño de experimentos Plackett-Burman, estos experimentos se

monitorearon y se tomaron muestras a los tiempos 7, 14 y 28 días.



31

6.3.1 Establecimiento de condiciones para bioestimulación

En el caso de la bioestimulación, como anteriormente se mencionó, se simuló un ambiente

húmedo dentro de un recipiente de plástico de 2 L, añadiéndole 50 mL de agua destilada.

Cada uno de los 12 experimentos consistió en un frasco de vidrio con 30 g de suelo

contaminado, adicionando 0.7 mL del consorcio adaptado al suelo. Cada experimento se

realizó por triplicado, por lo que al final se tenían 14 recipientes: 12 recipientes con 3

frascos de vidrio, que correspondían a cada una de los experimentos obtenidos, un control

negativo con suelo contaminado estéril y un blanco con ladrillo incinerado, dando un total

de 42 frascos.

6.3.2 Establecimiento de condiciones para bioventeo

Para la realización de los experimentos usando bioventeo, se utilizó un sistema de

reactores, utilizando frascos de vidrio de 1.8 L pintados de negro, para evitar procesos de

fotooxidación. Estos frascos se diseñaron de tal manera que se permitiera la entrada de un

flujo de aire controlado utilizando un filtro fibra de vidrio Whatman, con un diámetro de

0.45 µm, marca Sigma Aldrich, adaptado en la parte posterior del frasco. Esto con la

finalidad de impedir la entrada de partículas de polvo o microorganismos. Estos frascos

contenían 300 g de suelo contaminado con hidrocarburos, un flujo de aire y una cantidad de

nutrientes determinada por el diseño de experimentos (Tabla 9) y en todos los casos se les

añadieron 30 mL del consorcio nativo del suelo contaminado.

6.4 Cuantificación de CO2

Para la cuantificación del dióxido de carbono producido durante los procesos utilizados en

este trabajo se partió de la dinámica de carbono, que usa el NaOH para el atrapamiento del

dióxido de carbono producido durante la respiración de los microorganismos. Este NaOH

se introdujo en los sistemas de bioestimulación y bioventeo en viales de 30 mL y extraídos

de los sistemas para su cuantificación a tiempos de 7, 14 y 28 días. Se tomaron alícuotas de

5 mL de los viales y fueron titulados con una solución de HCl a concentración 1 N y 0.1 N,

usando como indicadores fenolftaleína y naranja de metilo, respectivamente, este proceso

se realizó por duplicado.



32

Para la determinación de la cantidad de dióxido de carbono producido en mg CO2/Kg suelo

se utilizó la siguiente ecuación:

(Ecuación 2).

6.5 Determinación de pH

El pH se determinó mediante la norma NOM-021-RECANAT-2004, en la que se encuentra

el método utilizado para su determinación. Se utilizó un potenciómetro modelo OAKTON

pH/Conductivity/TDS/°C/°F Meter con una relación suelo-agua de 1:2.

6.6 Determinación de humedad.

Esta característica edafológica se determinó de acuerdo a la NOM-021-SEMARNAT-2000,

el cual establece la metodología en su apartado AS-06. Se utilizó un equipo de secado

marca Sartorius MA 35, tomando una muestra de 0.5 g y registrando la humedad inicial. Se

tomó el tiempo y el porcentaje de humedad de la muestra se determinó mediante la

siguiente fórmula:

(Ecuación 3)

6.7 Determinación de conductividad eléctrica del suelo contaminado

La conductividad eléctrica del suelo contaminado se determinó mediante la NOM-021-

RECANAT-2000, por el método AS-18-2000 que explica la medición de la conductividad

y la determinación de salinidad en el suelo. Se añadió agua desionizada a una muestra de

suelo, se agitó y posteriormente se dejó reposar. Se midió la conductividad eléctrica del

sobrenadante utilizando un conductímetro HACH TDS METER.

6.8 Determinación de materia orgánica

La cantidad de materia orgánica se determinó mediante el método de Walkley y Black,

descrito en el apartado AS-07-2000 de la norma NOM-021-RECANAT-2000, basado en la



33

oxidación del carbono orgánico presente en el suelo usando una disolución de dicromato de

potasio (K2Cr2O7), así mismo se usa ácido sulfúrico concentrado (H2SO4) para la

generación de calor, y después se valora con sulfato ferroso (FeSO4).

6.9 Determinación de hidrocarburos totales a través de espectrofotometría UV-

Visible

Para determinar esta característica se adicionaron 10 mL de cloroformo a 5 g de suelo

contaminado, de manera que la desorción de la fracción pesada de los hidrocarburos se

realizara de una manera más eficiente. Posteriormente se siguieron las especificaciones de

la norma NMX-AA-145-SFCI-2000 y se cuantificó la fracción asfalténica resultante por

UV-visible a una longitud de onda de 408 nm, utilizando un espectrofotómetro modelo

Evolution 300, Marca Thermo Scientific. Para la realización de la curva de calibración para

la posterior medición de la fracción asfalténica se realizó a una λ= 408 nm empleando

cinco concentraciones de crudo Maya (previamente volatilizado a 250°C): 0.4, 0.12, 0.08,

0.072 y 0.04 mg/mL y absorbancia 0.435, 0.135, 0.078, 0.072, 0.037, respectivamente,

para lo cual se empleó hexano como solvente.

6.10 Determinación de hidrocarburos utilizando espectrofotometría infrarrojo

(IR).

La caracterización química del hidrocarburo se llevó a cabo utilizando un FTIR (Fourier

Transform Infrared Spectroscopy), el espectro se tomó en la región media y la técnica para

su obtención fue mediante ATR (Attenuation Total Reflactance), y se puede analizar en

fase sólida o líquida. El procedimiento se siguió de acuerdo al protocolo de Rajasekhar

(Yadav et al., 2005).

6.11 Caracterización de microorganismos presentes en el suelo contaminado.

6.11.1 Aislamiento y cultivo de microorganismos hidrocarbonoclastos en el

suelo contaminado.

El método utilizado para el aislamiento y conteo de bacterias hidrocarbonoclastas fue el

método de dilución en placa. El medio líquido para el crecimiento de las bacterias utilizó



34

petróleo crudo como fuente única de carbono, más las soluciones obtenidas durante el

diseño de experimentos (Tabla 8) y el medio Bushnell Hass, asegurando de esta manera el

crecimiento únicamente de bacterias hidrocarbonoclastas. Estos medios líquidos se

inocularon con un consorcio nativo previamente adaptado al suelo contaminado (Jiménez-

Hernández et al., 2013) y puesto en agitación durante 48 h a 200 rpm. Una vez transcurrido

el tiempo, se realizaron diluciones con 1 mL del hasta llegar a la concentración 10-8.

Posteriormente se inocularon 0.5 mL mediante extensión en placa en cajas Petri con agar

TSA (Soya Triptocaseína) y agar Dextrosa, por ser fuentes protéicas ideales para el rápido

crecimiento y conteo de colonias, así como su caracterización microscópica y bioquímica

(Díaz et al., 2013). Las cajas se incubaron a 38 °C durante 24 h y se procedió a realizar

observación microscópica y conteo transcurrido este tiempo.

Para la caracterización colonial por color, borde y forma se realizó el aislamiento de las

principales colonias observadas en las cajas. Estas se resembraron por duplicado y se

incubaron a 38 °C. Se verificó el crecimiento y la pureza de las cepas a las 24, 28 y 72 h

mediante la morfología de las colonias.



35

7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Para registrar los cambios en los parámetros medidos durante el experimento, se realizó una

caracterización inicial del suelo contaminado de Agua Dulce, como muestra la Tabla 9.

Tabla 9. Caracterización inicial del suelo de Agua Dulce. La mayoría de las variables

fueron determinadas mediantes normas oficiales.

Variable

Valor/Característica Método

Textura Franco arcilloso Bouyoucos G.J.(1962)

% materia orgánica 6.8 Walkley-Black (1934),

UFC/g suelo seco 1.7 x 105 Conteo en placa

pH 5.5 NOM-021-RECANAT-2004

% Humedad 33.97 NOM-021-SEMARNAT-2000

(AS-06) Conductividad eléctrica (µS/cm)

0.18 NOM-021-RECANAT-2000

(AS-18-2000)

Hidrocarburos de fracción pesada (mg/kg

suelo)

80926.4 NMX-AA-134-CFIDS-2006

Fracción media (mg/kg suelo)

400 NMX-AA-145-SCFI-2000

Asfáltenos y resinas

(mg/kg suelo)

0.0237 Britsh Standard BS4696

(1971).

7.1 Cuantificación de parámetros en el proceso de bioestimulación

7.1.1 Cuantificación de CO2.

La respiración del suelo es un proceso que refleja su actividad biológica, y se manifiesta

con el desprendimiento de CO2 resultante de las reacciones metabólicas de los

microorganismos presentes (García Izquierdo et al., 2003).



36

Una vez terminado el lapso de tiempo establecido para cada uno de los tratamientos en

ambos procesos, se extrajo el vial con NaOH contenido y se realizó la técnica de dinámica

de carbono (respirometría) para la cuantificación del CO2 producido.

Figura 12. Gráfico de producción de dióxido de carbono en los experimentos utilizados en

el proceso de bioestimulación. Las líneas representan la desviación estándar; los valores 1 a

12 corresponden a los experimentos, P al testigo (suelo estéril) y N al control negativo

(ladrillo incinerado).

De acuerdo a la figura 12, se aprecia que no hay una producción de CO2 en todos los

tratamientos usados; los que registran un mayor aumento progresivo en la tasa de

respiración son los experimentos 4, 9 y 12 con un valor de 132,180, 94,246 y 92107 mg

CO2/Kg suelo a los 28 días, respectivamente.

En la mayoría los experimentos el valor máximo de producción de dióxido de carbono se

alcanzó al tiempo de 28 días, salvo en el experimento 8 en el que no se agregó ninguna

combinación de nutrientes, y en el experimento 10, donde el valor máximo de este

parámetro se alcanzó al tiempo de 7 días.

Es importante considerar el rol de cada nutriente así como su tipo y concentración en el

suelo contaminado durante el tratamiento (García Araiza, 2012). Normalmente los suelos

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 P N

mg

de

CO

2/k

g su

elo

Experimentos

Cuantificación de CO2

7 días

14 días

28 días



37

costeros contaminados con hidrocarburos intemperizados tienen bajas cantidades de

nutrientes por los efectos de lixiviación, sin embargo, al existir un incremento de la

salinidad afecta la degradación de los nutrientes ya que no sol fácilmente adsorbidos por los

organismos, a nivel del campo (cuando hay inundación), al haber un exceso de estos puede

ocasionar eutrofización, la aparición de algas u otros microorganismos que promoverían los

procesos de anaerobiosis (R. H. A. Schroeder et al., 1999).


proceso de bioestimulación. La línea azul representa el valor mínimo para que alguna de las

sales sea estadísticamente significativa en el resultado.

Como se observa en la figura 12, las sales que conforman los diversos experimentos

utilizados para el tratamiento de bioestimulación no son factores determinantes para la

producción de CO2 en el suelo contaminado. Si bien son fuente de nutrientes, no llegan al

valor mínimo para considerarse estadísticamente significantes en el proceso, aunque de

acuerdo a la observación de la figura 13, son necesarias para las actividades metabólicas del

consorcio microbiano presente en el suelo, ya que tomando como referencia los

experimentos 4, 9 y 12 con cualquier otro utilizado en este tratamiento, se pueden apreciar

grandes diferencias en cuanto a la producción de CO2. Otros factores como el pH, el

porcentaje de humedad, la conductividad eléctrica y el contenido de materia orgánica

pueden ser los responsables de procesos metabólicos relacionados a la microbiota presente

en el suelo contaminado.



38

7.1.2Cuantificación de pH

Para la cuantificación y medición del pH del suelo contaminado sometido a dos

tratamientos, se obtuvieron los siguientes resultados. Para el proceso de bioestimulación los

valores fluctuaron entre 6.5 y 8.25, mientras que en el proceso de bioventeo siempre se

mantuvieron por encima de 7 como mínimo.

Figura 14. Valores registrados de pH para el tratamiento del suelo usando bioestimulación.

Las líneas representan la desviación estándar; los valores 1 a 12 corresponden a los

experimentos, P al control positivo (suelo estéril) y N al control negativo (ladrillo

incinerado).

De acuerdo a la figura 14, en la mayoría d los experimentos se observó un aumento del pH,

especialmente entre los días 14 y 28, a excepción de los experimentos 1, 11 y el control

positivo que entre los días 14 y 28 tendió a acidificar por la lixiviación de nutrientes, sin

embargo esta característica fisicoquímica del suelo tiende a alterarse en función del tipo de

subproductos específicamente de los ácidos carboxílicos provenientes de la hidrólisis

durante la biotransformación de los hidrocarburos. Pero según Leahy (1990), los suelos

contaminados con hidrocarburos son ácidos, y para una óptima biodegradación de los

hidrocarburos persistentes se requiere un pH neutro entre 7.4 y 7.8. Los experimentos que

se encuentran dentro de este rango a los 28 días de iniciado el experimento son: 3, 4, 6, 9 y

10. En función del tipo de nutrientes y su concentración para cada experimento, se estimula

6

6.5

7

7.5

8

8.5

9

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 P N

Val

or

de

pH

Experimentos

pH

7 Días

14 Días

28 Días



39

el crecimiento de los microorganismos, aumentando la biomasa y por efecto los procesos

metabólicos relacionados con la degradación de hidrocarburos (Arrieta Ramírez, 2011).


proceso de bioestimulación. La línea azul representa el valor mínimo para que alguna de las

sales sea estadísticamente significativa en el valor obtenido de pH.

Las sales que tienen cierta significancia en los valores registrados de pH son: KH2PO4,

(NH4)2PO4, FeCl3 ∙ 6H2O y MgSO4 ∙ 7H2O. Como se observa, las principales sales que

tienen significancia en el pH contienen fósforo en forma de fosfato. El pH afecta

directamente en la solubilidad del fósforo y en el transporte de metales pesados en el suelo

(Arroyo et al., 2004), también el pH es altamente dependiente de la forma de nitrógeno

aplicada en las plantas y los suelos, mientras que en forma de NO3- alcaliniza el pH, el ión

amonio (NH4+) lo acidifica (Sas et al., 2003).

7.1.3 Cuantificación de humedad

Se realizaron cuantificaciones del porcentaje de humedad del suelo contaminado a los 7, 14

y 28 días, haciendo réplicas para validar los datos.



40

Figura 16. Valores registrados de porcentaje de humedad para el tratamiento del suelo

usando bioestimulación. Las líneas representan la desviación estándar; los valores 1 a 12

corresponden a los experimentos, P al testigo (suelo estéril) y N al control negativo (ladrillo

incinerado).

En la figura 16 se observa una disminución del porcentaje de humedad por gramo de suelo

en todos los experimentos realizados hacia el día 14. Posteriormente se observa un

incremento del mismo para el día 28. Al principio del experimento el suelo contenía una

humedad aproximada de 77.43 %. Aunque Dibble y Bartha (1976) describieron un rango de

humedad para los procesos de biodegradación de un 30 % hasta un 90 %, Lajoie y Strom

recomendaron un rango óptimo entre el 50 y 70 % de la capacidad de campo del suelo

(Lajoie et al., 1994).

La humedad en un suelo contaminado puede ser un factor limitante en la biodegradación de

los hidrocarburos presentes, principalmente en suelos superficiales que sufran afectaciones

importantes por las oscilaciones importantes en su contenido de agua (Viñas Canals, 2005).

El porcentaje de humedad registrado al inicio del experimento fue de 77.43 %, y el menor

valor se registró en el experimento 8 al día 14, con un valor de 33.36%. El contenido

óptimo de humedad en los suelos depende de la textura del suelo y el contenido de arcilla.

En suelos de granulometría fina con elevados porcentajes de limo y arcilla como los

arcillosos y franco-arcillosos suele haber un rango óptimo de humedad cercano al 40 % de

0

10

20

30

40

50

60

70

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 P N

% d

e H

um

ed

ad

Experimentos

Humedad

7 Días

14 Días

28 Días



41

la capacidad de campo (Menn et al., 2000). Cuando existe un exceso de agua en los suelos,

estos se tornan pantanosos, pues al ser arcillosos y tener un alto contenido de agua se

vuelven plásticos, y esto puede inferir en el transporte de oxígeno al medio y comenzar a

operar bajo condiciones anaeróbicas (Arrieta Ramírez, 2011).

7.1.4 Cuantificación de conductividad eléctrica

Al ser medida esta característica en los experimentos donde la bioestimulación fue el

tratamiento elegido, se observaron resultados variados en los tiempos a los que se tomó

muestra. Mientras que a los 14 días de haber iniciado el experimento el mayor valor

registrado fue en el experimento 6, con 1.43 µS/cm, al día 28 se registró en el experimento

9, con 0.94 µS/cm. Se observó particularmente una disminución de este valor en la mayoría

de los experimentos de los 14 a los 28 días.

Figura 17. Valores registrados de conductividad eléctrica para el tratamiento del suelo

usando bioestimulación. Las líneas representan la desviación estándar; los valores 1 a 12

corresponden a los experimentos, T al testigo (suelo estéril) y N al control negativo (ladrillo

incinerado).

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 T N

Co

nd

uct

ivid

ad e

léct

rica

(µ

S/cm

)

Experimentos

Conductividad eléctrica

7 Días

14 Días

28 Días



42

Si se observa la figura 17, hay un incremento notable de la conductividad eléctrica en la

mayoría de los experimentos al tiempo de 14 días, registrando valores que casi doblan el

anterior, el del día 7. En algunos experimentos con suelos contaminados, la conductividad

del suelo incrementa al paso del tiempo, debido a la penetración de los frentes ácidos y

alcalinos, además que los cambios de pH pueden solubilizar las especies iónicas; aunado a

esto la generación de subproductos puede generar un cambio en los valores de

conductividad (Acar et al., 1996).

7.1.5. Cuantificación de materia orgánica

La materia orgánica es uno de los parámetros más variables en la biorremediación de suelos

contaminados, ya que aumenta de forma proporcional a la concentración de los

hidrocarburos presentes, especialmente gasolina y combustóleo (Martínez, 2001).

Utilizando el método de Walkley-Black, el contenido de materia orgánica es la suma de la

materia biogénica (descomposición de vegetales y animales), y materia petrogénica

(hidrocarburos).

Figura 18. Valores registrados de materia orgánica para el tratamiento del suelo usando

bioestimulación. Las líneas representan la desviación estándar; los valores 1 a 12

corresponden a los experimentos, P al testigo (suelo estéril) y N al control negativo (ladrillo

incinerado).

0

5

10

15

20

25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 T N

% m

ate

ria

org

ánic

a/g

sue

lo

Experimentos

Materia orgánica

7 Días

14 Días

28 Días



43

En la figura 18 se observan los mayores valores de materia orgánica para la mayoría de los

experimentos durante el tiempo de 14 días, disminuyendo notablemente al día 28; los

experimentos 5, 9 y 10 presentaron la mayor disminución de materia orgánica de 3.78%,

2.17% y 2.54% respectivamente, con respecto a los demás tratamientos cual se asocia a la

degradación de la fuente de carbono del suelo y la biotransformación de los compuestos.

Se puede suponer que con este método cadenas cortas de hidrocarburos (C5 a C9)

volatilizan por la reacción exotérmica con el ácido sulfúrico, mientras que el resto se oxida.

Cadenas más largas (C10 a C23) tienen menor cantidad de compuestos volátiles, por lo que

generalmente al oxidarse, general valores muy altos de materia orgánica; sin embargo, los

hidrocarburos con cadenas más largas (C25 a C35), son difíciles de tratar por el método de

Walkley-Black ya que solo una pequeña parte de ellos son oxidables (Martínez, 2001). Al

observar los valores considerablemente bajos de materia orgánica, se puede inferir la

presencia de hidrocarburos altamente recalcitrantes en el suelo de Agua Dulce. El aumento

de materia orgánica en estos casos es perjudicial para los suelos, ya que al degradarse la

materia biogénica, se está considerando solo el valor de la materia petrogénica, que en este

caso son los PAHs, asfáltenos y resinas (Fan et al., 1994).

Standardized Pareto Chart for % Humedad

0 5 10 15 20 25 30

Standardized effect

F:Factor_F

A:Factor_A

I:Factor_I

G:Factor_G

K:Factor_K

E:Factor_E

J:Factor_J

H:Factor_H

B:Factor_B+

-



44

Figuras 19 a,b,c. Diagramas de Pareto para la determinación de significancia de las sales

utilizadas para los valores en a) porcentaje de humedad, b) conductividad eléctrica (CE) y

c) materia orgánica. La línea azul representa el valor mínimo para que alguno de los

factores sea estadísticamente significativo en el resultado, cada una de las letras de los

factores representa las sales indicadas en la Tabla 7.

En los diagramas de Pareto para determinar la significancia de las sales en las variables

medidas, se pueden observar ciertas similitudes; por ejemplo, el factor B (MgSO4), incluso

en pequeñas cantidades es estadísticamente significativo para la obtención de los valores

registrados de humedad y conductividad eléctrica. En suelos arcillosos con potenciales altos

de expansión y contracción, la infiltración del agua hacia las grietas puede crear un

fenómeno ascendente de las sales, haciendo significativamente diferentes las condiciones

de los horizontes superiores del suelo (Villafañe et al., 1994).

Standardized Pareto Chart for CE

0 5 10 15 20 25 30

Standardized effect

F:Factor_F

D:Factor_D

E:Factor_E

J:Factor_J

H:Factor_H

A:Factor_A

K:Factor_K

B:Factor_B

I:Factor_I

C:Factor_C+

-

Standardized Pareto Chart for Materia organcia

0 20 40 60 80 100 120

Standardized effect

I:Factor_I

K:Factor_K

H:Factor_H

D:Factor_D

F:Factor_F

A:Factor_A

G:Factor_G

E:Factor_E

J:Factor_J+

-



45

El magnesio (Mg) presente en el suelo está presente regularmente en suelos arcillosos, por

lo que variables como conductividad eléctrica, humedad y pH están directamente

relacionadas con la presencia de este elemento, debido a las características del suelo mismo

(Hernández et al., 2003) En el caso de la materia orgánica, se observa que todas las sales

añadidas son estadísticamente significativas, lo que quiere decir que los microorganismos

aprovechan todos los compuestos añadidos en mayor o menor proporción para la

realización de sus procesos metabólicos, resultando en el aumento de materia orgánica

debido a los mismos.

Los bioelementos presentes en las sales juegan un papel importante en los procesos

metabólicos que desencadenan la degradación de los hidrocarburos de fracción pesada,

elementos como el Ca, Mg, S, Fe, N, y sus formas reducidas, forman parte de importantes

procesos metabólicos celulares como la β-oxidación y la cadena transportadora de

electrones.

La capacidad de biotransformación de los PAHs es un mecanismo muy frecuente en

organismos que recurren a una serie de enzimas que realizan reacciones de conjugación

(sulfo-transferasa, epóxido-hidrolasa, glutatión-S-transferasa y UDP-glicotransferasa). Las

monooxigenasas dependientes del citrocromo P-450 son responsables de la oxidación

enzimática de los PAHs (Li et al., 2001). Al utilizar al hidrocarburo como única fuente de

carbono, dependiendo del microorganismo, del tipo de hidrocarburo y de las condiciones

del medio, el metabolismo se lleva a cabo de diferentes maneras.



46

Figura 20. Ruta metabólica para la degradación del Hexadecano. El producto final es

Palmitoil-CoA (Velasco-Álvarez, 2011).

Las reacciones para la conversión del hidrocarburo en ácido palmítico y palmitoil CoA se

catalizan por un conjunto de proteínas llamado sistema alcano hidroxilasas. Este grupo

contiene una enzima alcano-monooxigenasa, y dos proteínas solubles: la rubredoxina y

rubredoxina reductasa. Se inicia la transferencia de electrones entre la rubredoxina y la

rubredoxina reductasa a través del NADH. Posteriormente esta proteína transfiere

electrones a un alcano oxigenasa, localizada en la membrana citoplasmática. Una vez

terminado esto, se obtiene palmitoil CoA, que debe ser transportado al interior de la matriz

mitocondrial, usando la carnitina (van Beilen et al., 1994). Posteriormente este palmitoil

CoA se incorpora a la β-oxidación, hasta llegar a la tiolasa y Acetil CoA, productos que

entran directamente en el ciclo de Krebs.

Cada enzima necesaria en el proceso de conversión a palmitoil CoA es ayudada por

cofactores, que no son otra cosa que moléculas no proteicas para que una enzima se active.



47

Tabla 10. Cofactores necesarios para el funcionamiento de las enzimas descritas. Las

enzimas son específicas para la degradación de un hidrocarburo, sin embargo los cofactores

indicados son comunes dentro de este proceso.

Enzima Cofactor Referencia

Alcano 1-deshidrogenasa Fe+2, Zn, NADH (Matsuyama et al., 1981)

Alcohol deshidrogenasa Fe +2, Zn+ (Levin et al., 2004)

Aldehído deshidrogenasa Fe+2, Mg+2, K+, NAD (Rojo, 2010)

Acetil Co-A sintetasa Ca+2, Mg+2 (Heinnickel et al., 2010)

En la Tabla 10 se muestran los cofactores relacionados para la activación de las diferentes

enzimas que participan en la conversión del hexadecano. Como se observa, el hierro es uno

de los principales actores en casi todos los procesos, al igual que el magnesio. El hierro

participa como transportador de electrones entre proteínas y hacia complejos multi-

enzimáticos, mientras que el magnesio participa en la activación de ácidos grasos, dando

lugar posteriormente a procesos de β-oxidación.

En los resultados obtenidos de las variables medidas, las sales involucradas en los procesos

son el Fe, Mg y Ca. Los niveles altos o bajos de adición de estos bioelementos al suelo

están determinados por la capacidad de retención de los mismos; mientras que adicionando

un nivel alto se puede saturar al suelo, generando cambios en variables como conductividad

eléctrica y pH, logrando un menor porcentaje de remoción de los hidrocarburos, un nivel

muy bajo puede no generar los nutrientes necesarios para los procesos metabólicos de los

microorganismos presentes, impidiendo que los hidrocarburos de fracción pesada sean

retirados.

7.1.6. Cuantificación de hidrocarburos de fracción pesada (HFP) por

espectrofotometría UV e FTIR.

Para la cuantificación de las fracciones pesada y asfalténica se utilizaron dos métodos

analíticos como lo es la espectrofotometría UV visible y FTIR (Fourier Transform Infrared



48

Spectroscopy). En la espectrofotometría UV visible se utilizó con un barrido en longitud de

onda de los 200 a los 600 nm, utilizando la siguiente curva de calibración (Figura 21).

Figura 21. Curva de calibración de fracción asfalténica. Se realizó previa extracción del

hidrocarburo.

Figura 22. Valores de fracción pesada de hidrocarburos obtenidos durante los tiempos del

experimento utilizando bioestimulación. Las líneas representan la desviación estándar; los

valores 1 a 12 corresponden a los experimentos, P al control positivo (suelo estéril) y N al

control negativo (ladrillo incinerado).

y = 1.1057x - 0.0061 R² = 0.9991

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 Fra

cció

n a

sfal

ten

ica

Absorbancia

Curva de calibración

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 T N

mg

HFP

/g s

ue

lo

Experimentos

Hidrocarburos de Fracción Pesada (HFP)

7 Días

14 Días

28 Días



49

En la figura 22 se observan valores diversos en los diferentes tratamientos de los suelos al

utilizar bioestimulación. Además del suelo testigo, los experimentos 1 y 2 son los que

registran mayor contenido de hidrocarburos de fracción pesada a los 7 días del

experimento. Sin embargo, el análisis de varianza de la fracción pesada con la producción

de CO2 muestra una diferencia significativa, lo que quiere decir que la producción de CO2 y

los procesos metabólicos de los microorganismos del consorcio bacteriano usado influyen

directamente sobre la biodegradación de los hidrocarburos intemperizados. El experimento

1 fue el que registró la menor producción de CO2, y también es el que más contenido de

hidrocarburos registra a los 7 y 14 días; mientras que el experimento 2 al tener un alto

contenido de hidrocarburos de fracción pesada en el día 7, al día 14 registra un decremento

importante de 5470 mg HFP/Kg suelo, que es inversamente proporcional al aumento de

producción de CO2, esto se puede interpretar como procesos metabólicos que degradan los

hidrocarburos de fracción pesada en compuestos más simples.

Para la cuantificación de espectros orgánicos mediante FTIR (Fourier Transform Infrared

Spectroscopy) se realizó previamente la extracción del hidrocarburo del suelo utilizando

hexano como solvente. El análisis cualitativo de los HFPs por espectroscopia de infrarrojo

es un método eficaz para determinar la presencia de un compuesto de interés en suelos y

aguas. La ventaja de esta técnica es su relativa simplicidad y su bajo costo (Arango

Ramírez et al., 2012).

Los diferentes grupos funcionales poseen distintas frecuencias e intensidades de absorción.

Regularmente, los métodos para la medición de HFPs miden la absorción de los enlaces C-

H y la mayoría de los métodos usan una única frecuencia para este grupo funcional (2930

cm-1). Aunque existen otros métodos que realizan la medición de más de una frecuencia, ya

que algunos compuestos más complejos como los enlaces C-H de los compuestos

aromáticos se encuentran en frecuencias de 3100 cm-1 a 3200 cm-1 (Arango Ramírez et al.,

2012).

Se realizó una curva de calibración para FTIR con hexano, y posteriormente se realizó la

corrida de las muestras de hidrocarburos.



50

Figura 23. Curva de calibración para FTIR, usando hexano. La celda utilizada para el

experimento fue de selenuro de zinc.

De acuerdo a la literatura se buscaron frecuencias cercanas a las reportadas donde se

localizan los enlaces C-H, metilo (CH3) y CH2, donde las bandas están sobre los 2920 cm-1

y los 2950 cm-1.



51

Figuras 24 a,b,c. Frecuencias de FTIR a los a) 7, b) 14 y c) 28 días obtenidas en el

experimento 9. Se eligió este por ser el que menor cantidad de hidrocarburos de fracción

pesada registró a los 28 días.

C-H

C-H

C-H

CH3

CH3

C-CH2

CH3

C-CH2

C-CH2



52

Los resultados obtenidos de los espectros mediante el análisis por FTIR, muestran a los

diferentes tiempos vibraciones muy similares comúnmente citadas en la literatura para los

hidrocarburos, sin embargo los valores de transmitancia difieren, y también se observan

apariciones de nuevas bandas dentro de las frecuencias pertenecientes a la huella digital,

esto se asocia a la producción de metabolitos provenientes de la biodegradación de los

hidrocarburos intemperizados.

7.2 Análisis estadísticos

Los valores obtenidos en la medición de las diferentes variables fueron sometidos a pruebas

estadísticas para evaluar si la combinación de sales afecta los valores de las variables a los

tiempos en los que se midieron.

Al realizar pruebas de normalidad, homogeneidad y homoelasticidad de los datos

obtenidos, se observó que no se distribuyen de manera normal, por lo que fue necesario

aplicar métodos de estadística no paramétrica, utilizando el método de Kruskal-Wallis.

En la Tabla se muestran los resultados de la evaluación no paramétrica mediante el método

de Kruskal-Wallis, así como las hipótesis generadas para cada variable en los diferentes

tiempos, con α= 0.05.



53

Tabla 11. Resultados de análisis de estadística no paramétrica para los datos colectados de

las variables medidas a diferentes tiempos. Se utilizó el método de Kruskal-Wallis, con un

α= 0.05.

Experimento Tiempo Hipótesis p valor Conclusión

Medición de

CO2

7 días H0 = La combinación de

sales no afecta el valor del

CO2

H1 = La combinación de

sales afecta el valor de

CO2

0.191 No hay evidencia

estadística para rechazar

H0

14 días 0.036 Se acepta la hipótesis

alternativa H1


alternativa H1

Medición de pH 7 días H0 = La combinación de

sales no afecta el valor del

pH


sales afecta el valor de pH

0.015 Se acepta la hipótesis

alternativa H1


alternativa H1

Medición de

Conductividad

Eléctrica


sales no afecta el valor de

C.E.



C.E.


alternativa H1

28 días 0.091 No hay evidencia


H0

Medición de

Materia

Orgánica



M.O.



M.O.


alternativa H1


alternativa H1

28 días 0.063 No hay evidencia




54

H0

Medición de

Hidrocarburos

de Fracción

Pesada



HFP



HFP


alternativa H1

De acuerdo a los datos arrojados por la Tabla 11, se tienen suficientes pruebas estadísticas

para afirmar que existe una relación entre las combinaciones de sales para los experimentos

y los resultados obtenidos entre las variables, salvo la medición de CO2 a los 7 días, así

como la medición de la materia orgánica y la conductividad eléctrica a los 28 días.

Se realizó también un análisis de correlación de coeficiente de Pearson, en donde se mide el

grado de correlación de distintas variables relacionadas, y su valor se encuentra entre 0 y 1,

alternando de manera positiva o negativa; es decir, puede estar entre 0 y 1 y entre 0 y -1. En

el primer caso, se tendría una correlación perfectamente positiva y en el segundo una

correlación perfectamente negativa (Pedhazur, 1997).



55

Tabla 12. Correlación de coeficientes de Pearson para las variables involucradas en el

proceso de biodegradación de hidrocarburos de fracción pesada utilizando bioestimulación.

Loa valores en negritas son estadísticamente significativos por el p valor.

Medios CO2 pH Humedad M.O. C.E. HTP

Medios 1.0000 -0.06357 0.41539 -0.16604 -0.08987 -0.18303 0.01160

p valor 0.5803 0.0002 0.1463 0.4339 0.1087 0.9197

CO2 -0.06357 1.0000 -0.10467 -0.22224 -0.34027 -0.03435 -0.19677

p valor 0.5803 0.3617 0.0505 0.0023 0.7653 0.0842

pH 0.41539 -0.10467 1.0000 -0.21169 -0.49777 -0.30899 0.27374

p valor 0.0002 0.3617 0.0628 < .0001 0.0059 0.0153

Humedad 0.16604 -0.22224 -0.21169 1.0000 0.57477 -0.08389 0.11205

p valor 0.1463 0.0505 0.0628 < .0001 0.4652 0.3287

M.O. -0.08987 -0.34027 -0.49777 0.57477 1.0000 -0.05901 0.27531

p valor 0.4339 0.0023 < .0001 < .0001 0.6078 0.0147

C.E. -0.18303 -0.03435 -0.30899 -0.08389 -0.05901 1.0000 -0.39061

p valor 0.1087 0.7653 0.0059 0.4652 0.6078 0.0004

HTP 0.01160 -0.19677 0.27374 0.11205 0.27531 -0.39061 1.0000

p valor 0.9197 0.0842 0.0153 0.3287 0.0147 0.0004

La tabla 12 arroja datos que sugieren que no hay una correlación fuertemente positiva o

negativa, ya que el mayor valor de correlación se encuentra entre la materia orgánica y la

humedad, con 0.57477, lo que se podría interpretar como una correlación moderada entre

estas dos variables; sin embargo los datos arrojados en los p valores muestran que más de

una correlación es estadísticamente significativa (p < 0.05), como la materia orgánica con

el CO2 y con los HTPs, o la conductividad con los HTPs, entre otros.



56

El valor en una correlación es muy ambiguo, ya que depende mucho de la naturaleza de los

experimentos que se realizaron, por lo que mientras para unos este valor de 0.57 puede ser

bajo, para otros puede demostrar la validez de los experimentos. Se atribuyen estos valores

a la cantidad de experimentos y a la variabilidad de los datos presentados, ya que los rangos

de los valores en las diferentes variables oscilaban desde decimales hasta miles.

Seguida a esta prueba, se realizó otra entre los factores (medios y tiempo) y las diferentes

variables (CO2, pH, humedad, materia orgánica, conductividad y HTP) para determinar las

interacciones entre las variables y los factores por diferencia mínima significativa.

Estadísticamente se puede inferir una formulación óptima para el mejoramiento de las

condiciones de la biodisponibilidad del suelo de Agua Dulce, en función a los valores de

producción de dióxido de carbono y al porcentaje de remoción de los hidrocarburos totales

del petróleo. La formulación 9 es la que de acuerdo a la bibliografía y el análisis estadístico

el mejor medio que optimiza los variables medidas durante el proceso de bioestimulación,

además de remover la mayor cantidad de hidrocarburos de fracción pesada.

Para los tratamientos del suelo utilizando el proceso de bioventeo no se realizó un análisis

estadístico debido a que no se realizaron réplicas de dichos tratamientos, siendo estos

resultados solo modelos preliminares para el desarrollo de este trabajo. Por esta misma

razón, solo puede haber una comparación cualitativa, cuantitativa pero no estadística de los

resultados obtenidos entre los procesos de bioestimulación y bioventeo.

7.3 Cuantificación de parámetros usando bioventeo.

7.3.1 Cuantificación de CO2

A continuación se presentan resultados experimentales preliminares del estudio de

biodegradación de los hidrocarburos intemperizados mediante la tecnología de bioventeo.

Para el tratamiento del suelo usando bioventeo se realizó el mismo procedimiento para

determinar el CO2 producido durante intervalos de tiempo de 7, 14 y 28 días. Se estableció

una nomenclatura para cada experimento según los datos del diseño de experimentos de la

Tabla 8.



57

Figura 25. Niveles de producción de CO2 en el suelo contaminado tratado con bioventeo.

La nomenclatura utilizada es como ejemplo: C1 (Corrida) B1 (Reactor) T7 (Tiempo de

Experimento.

Como se aprecia en la figura 25 y siguiendo la nomenclatura indicada en el apartado

anterior, solo se graficaron los valores de producción de los experimentos a 7 y 14 días, ya

que ninguno de ellos registró producción de CO2 a un tiempo de 28 días.

El medio mineral Bushnell Hass es utilizado como un medio mínimo de sales para el

crecimiento de microorganismos en suelos contaminados; se infiere que la cantidad de este

medio aunado al flujo de aire y al contenido de humedad en el suelo favorece o inhibe los

procesos metabólicos. En los valores máximos del experimento C1B1T7 y C1B2T7 son

79,250 y 103,250 mg CO2/Kg suelo, respectivamente. Ambos experimentos se realizaron

con un valor bajo de humedad y con el medio Bushnell Hass como fuente de nutrientes, y la

producción de dióxido de carbono en ambos decrece para el día 14. Sin embargo, el

experimento C1B3 registró producción de CO2, solamente con un flujo alto de aire y sin la

adición del medio Bushnell Hass. Esto puede justificarse como interacciones entre los

subproductos de la biodegradación con la fracción mineral del suelo; al estar en contacto la

fracción mineral libera iones, que pueden ser asimilados como nutrientes en el suelo. La

biodegradación de los hidrocarburos requiere que los sustratos sean oxidados mediante

oxigenasas, por eso es necesaria la presencia de un flujo estéril de aire al medio (Castro et

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

mg

CO

2/K

g su

elo

se

co

Experimentos

Producción de CO2 usando bioventeo



58

al., 2004). El flujo de aire es una variable limitante para el control de la tasa de

biodegradación de los hidrocarburos, ya que si el contenido es muy bajo puede que no se

distribuya por toda la matriz del suelo, haciendo anaeróbicas algunas zonas del mismo, y

afectar de manera negativa (Wentz, 1995)

En los suelos costeros y marinos existen relaciones aproximadas de C:N de 30:1, donde el

contenido de N es muy bajo con respecto a otros suelos (Ramón et al., 2013). Cuando los

hidrocarburos poco polares, asfáltenos, resinas u otros elementos de fracción pesada se

encuentran en el suelo, interrumpen las interacciones entre él y los nutrientes, siendo estos

últimos lixiviados. Esto suele ser más común en áreas húmedas, donde las fuertes lluvias y

el alto contenido de humedad aumentan la plasticidad del suelo, influyendo en los

fenómenos de transferencia de masa y la porosidad de las partículas, haciendo más lenta la

biodegradación (Adams et al., 2008).

Los microorganismos requieren un balance de nutrientes para desarrollar sus estructuras y

obtener energía, la mayoría metabolizan materiales inorgánicos para construir sus

componentes orgánicos y obtener energía de estos procesos para sobrevivir, lo cual se

puede obtener adicionando cantidades correctas de sales al suelo.

7.3.2 Cuantificación de pH

Para el tratamiento del suelo usando bioventeo, se registraron valores de todas las corridas,

sin embargo se graficaron aquellos resultados que tienen significancia desde la

cuantificación de dióxido de carbono, por una medida de crecimiento de los

microorganismos, y por tanto de procesos metabólicos que rigen la biodegradación de los

hidrocarburos persistentes.



59

Figura 26. Valores de pH registrados en diferentes experimentos usando bioventeo. Se

realizó únicamente la cuantificación de los experimentos que obtuvieron resultados

favorables en la cuantificación de dióxido de carbono.

La figura 26 arroja el aumento significativo de pH se registró al tiempo de 28 días en todos

los experimentos, lo que puede inferirse como una disminución de la actividad microbiana.

Los procesos de nitrificación son más rápidos en suelos con rangos de pH neutro a alcalino

que en los de pH neutro a ácido (Coyne, 2000).

Estos valores, todos cercanos e incluso superiores a 8, muestran un pH con cierto grado de

alcalinidad, producto de la biomasa generada por el consorcio microbiano, sin embargo esto

no promueve el crecimiento microbiano y aprovechamiento de nutrientes.

6.8

7

7.2

7.4

7.6

7.8

8

8.2

8.4

C1B1 C1B2 C1B3

pH

Tratamiento

Bioventeo

7 Días

14 Días

28 Días



60

7.3.3 Cuantificación de humedad

Para la cuantificación de la humedad en los suelos utilizando bioventeo se obtuvieron los

resultados mostrados a continuación.

Figura 27. Valores de humedad registrados en diferentes experimentos usando bioventeo.

Se realizó únicamente la cuantificación de los experimentos que obtuvieron resultados

favorables en la cuantificación de dióxido de carbono.

Si se observa la figura 27, para los tres tratamientos el valor de humedad disminuye al pasar

del día 7 al día 14, especialmente en el tercer tratamiento (C1B3). También se observa un

descenso crítico en el segundo tratamiento (C1B2) del día 14 al día 28. Al trabajar en un

sistema cerrado, se deben cuidar que las condiciones establecidas permanezcan constantes

durante todo el tiempo de la realización del experimento. Se puede atribuir este valor de

cero a un error instrumental, donde el flujo de aire proporcionado por la bomba hacia el

sistema, se interrumpió debido a los sólidos del suelo.

Un exceso de humedad en el suelo determina una aireación deficiente, que influye tanto en

el desarrollo de su microbiota así como un posible crecimiento de flora en el mismo (Bravo

et al., 2011). En el caso contrario, cuando la humedad del suelo es relativamente baja, estas

0

5

10

15

20

25

C1B1 C1B2 C1B3

% H

um

ed

ad

Tratamiento

Humedad

7días

14días

28días



61

condiciones también rigen en su comportamiento y la alteración de sus condiciones, como

su desecamiento o la dramática variabilidad de sus variables como pH, conductividad

eléctrica y materia orgánica (Esqueda Coronado et al., 2012).

7.3.4 Cuantificación de conductividad eléctrica

En cuanto a la medición de la conductividad eléctrica, se realizó el mismo procedimiento

descrito en el apartado AS-18-2000 de la NOM-021-RECANAT-2000, que también se

utilizó para los tratamientos anteriores en el proceso de bioestimulación.

Figura 28. Valores de conductividad eléctrica registrados en diferentes experimentos

usando bioventeo. Se realizó únicamente la cuantificación de los experimentos que

obtuvieron resultados favorables en la cuantificación de dióxido de carbono.

Los valores de conductividad de la Tabla 28 dentro del proceso de bioventeo no son muy

diferentes al del proceso de bioestimulación, donde también se registran valores muy por

encima del inicial. Cuando la conductividad eléctrica aumenta, puede deberse a diferentes

factores como la presencia importante de sales, que permanecen en el suelo al finalizar el

experimento. Este comportamiento es característico de los lodos estabilizados (Montilla et

al., 2006). El valor de la conductividad eléctrica aumentó en promedio de 3 a 4 veces, en

ambos procesos, esto sucede regularmente en suelos contaminados después de un

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

C1B1 C1B2 C1B3

C.E

. (µ

S/cm

)

Tratamiento

Conductividad Electrica

7 Días

14 Días

28 Días



62

tratamiento, ya que hay adición de sales y transformaciones de los compuestos presentes,

sin afectar de manera negativa las condiciones del suelo (Trujillo-Narcía et al., 2012).

7.4 Relación entre actividad metabólica y degradación de los hidrocarburos

El aprovechamiento de la capacidad de los microorganismos para la degradación de

compuestos es el sostén principal de los procesos de biorremediación de los suelos. El

conocimiento de las características fisiológicas y bioquímicas así como la genética de los

consorcios microbianos es un requisito fundamental para la elección de técnicas adecuadas

que aseguren el correcto saneamiento del suelo tratado, y evaluar la efectividad del método

utilizado (Moreno et al., 2004).

De acuerdo a «The Biodegradative Strain Database», una base de datos virtual publicada

por la Universidad de Virginia, existen diferentes géneros de bacterias y hongos reportados

como degradadores de diferentes tipos de hidrocarburos, desde los más simples hasta

PAHs.

Tabla 13. Especies reportadas como degradadoras de hidrocarburos, según la base de datos

de la Universidad de Virginia (Urbance et al., 2003).

Géneros

Bacterias Achromobacter, Acidovorax, Acinetobacter, Aeromonas, Agrobacterium,

Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Beijerinckia, Burkholderia, Comamonas,

Corynebacterium, Flavobacterium, Microbacterium, Micrococcus, Moraxella, Mycobacterium, Neptunomonas, Nocardia,

Paenibacillus, Porphyrobacter, Pseudomonas,

Ralstonia, Rhodococcus, Sphingomonas,

Streptomyces, Vibrio y Xanthomonas,

Hongos Agrocybe, Aspergillus, Candida, Crinipellis,

Chrysosporium, Cunninghamella, Bjerkandera,

Fusarium, Kuehneromyces, Marasmiellus,

Marasmius, Morteriella, Mucor, Naematoloma,

Laetiporus, Phanerochaete, Pleurotus,

Penicillium, Ramaria, Rhizoctonia,



63

Rhodotorula, Saccharomyces, Syncephalastrum,

Trametes y Trichoderma

Se realizaron cinéticas microbianas con toma de muestra a los 7, 14 y 28 días de iniciado el

experimento, para la cuantificación de los microorganismos mediante la técnica de conteo

en placa. Se tomaron únicamente observaciones del experimento 9 del proceso de

bioestimulación, por cumplir las condiciones óptimas para el mejoramiento de la

biodisponibilidad de los hidrocarburos observando un aumento en órdenes de magnitud,

registrando el valor máximo al día 7, con 3.7 x 107 UFC/g de suelo; justo en este tiempo se

comienza a observar un decremento de la cantidad de hidrocarburos de fracción pesada, con

2030 mg HFP/Kg de suelo al día 28. De esta manera el porcentaje de biodegradación de los

hidrocarburos de fracción pesada es de 97.5 %.


experimento 9. La línea roja indica el hidrocarburo, mientras que la línea azul las UFC.

De acuerdo a los resultados preliminares del proceso de bioventeo, el experimento C1B2

fue el que registró una mayor remoción de HFP durante el tiempo del experimento; sin

embargo, en la en la figura se observa esta remoción mucho antes del aumento exponencial

del consorcio adaptado agregado; esto se interpreta como una degradación de los

compuestos hidrocarbonados mediante atenuación natural. Según los datos de esta corrida,

se inyectó un flujo de aire de 30 %, 0 fuente de nutrientes y 90 mL de agua, por lo que los

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

0 7 14 21 28

mg

HFP

/kg

sue

lo s

eco

días

Experimento 9

107 U

FC/

g d

e su

elo

se

co



64

microorganismos presentes en el suelo solo aprovecharon los nutrientes con los que

contaban para sus procesos metabólicos.


experimento C1B2 de bioventeo. La línea roja representa el hidrocarburo, mientras que la

línea verde el crecimiento del consorcio.

0

20

40

60

80

100

120

140

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

0 5 10 15 20 25

mg

HFP

/kg

de

su

elo

se

co

dias

C1B2



65

8. CONCLUSIONES

Se logró mejorar la biodisponibilidad del suelo costero de Agua Dulce mediante el proceso

de bioestimulación.

El experimento 9 (NaCl 0.001 g/L; MgSO4 • 7H2O 0.006 g/L; CaCl2 0.002 g/L; NH4)2SO4 1

g/L; KH2PO4 5 g/L; FeCl3 • 6H2O 1 g/L; (NH4)2PO4 0.01 g/L; NH4Cl 0.25 g/L; KH2NH3

1.065 g/L; FeSO4 0.1 g/L; NH4NO3 0.5 g/L) de bioestimulación registró un 97.5 % de

remoción de los HFP a los 28 días, convirtiéndose en la combinación óptima de nutrientes

y condiciones fisicoquímicas.

Se encontró que la producción de CO2 y la degradación de los hidrocarburos de fracción

pesada no tienen una relación inversamente proporcional. Estadísticamente también se

comprobó la nulidad de la interacción.

No se comprobó ninguna correlación cercana a 1 o -1 entre los parámetros fisicoquímicos

de bioestimulación evaluados mediante las correlaciones de Pearson, sin embargo el p valor

en todos los casos rechaza la hipótesis H0, en la que no existe correlación entre las

variables.

Los bioelementos que tienen mayor participación en la remoción de los hidrocarburos de

fracción pesada son el hierro, el calcio y el magnesio.

Una de las interacciones importantes en el proceso de bioestimulación se encuentra entre

humedad-materia orgánica y pH-materia orgánica, que aunque el valor de 0.5477 supone

una correlación moderada, el p valor indica una estrecha relación.

El proceso de bioventeo, el experimento C1B2 registró porcentajes de degradación de los

HTP similares a los obtenidos en el proceso de bioestimulación, sin embargo no hay

réplicas que puedan validar el resultado obtenido.



66

9. PERSPECTIVAS

El desarrollo de este trabajo ha generado propuestas para su continuación en la generación

de una nueva tecnología de mejoramiento de la biodisponibilidad de suelos para la que

están contemplados los siguientes puntos:

Utilización de métodos más eficaces para la medición de variables como el CO2.

Reducción de los intervalos de tiempo en las mediciones de las variables de los

experimentos para generar una menor variabilidad de los datos.

Estudiar a detalle los subproductos de la biodegradación, como el tipo de biosurfactante,

ácidos grasos, ácidos carboxílicos que conducen a una mayor precisión de los procesos

metabólicos que se desarrollan durante el experimento de bioestimulación.

Adicionalmente el análisis cromatográfico GS-MS permitirá conocer la disminución de los

compuestos petrolíferos que contienen las muestras del suelo contaminado al inicio y al

final del experimento.

Desarrollo y evaluación de pruebas de toxicidad al suelo remediado, esto con el fin de

corroborar si el nivel de remoción de los hidrocarburos es adecuado para el crecimiento de

plantas y el desarrollo y supervivencia de insectos como gusanos.

Análisis de los resultados obtenidos para la combinación óptima de sales, para su

evaluación financiera y generación de esta combinación a gran escala.

Desarrollo y estandarización de una tecnología alternativa eficaz para lograr la remoción de

los hidrocarburos de fracción pesada en suelos.



67

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between epoxides and homoallylic alcohols: synthesis of 4-chlorotetrahydropyran

derivatives. Tetrahedron letters, 46(13), 2311-2314.

86. Zavala, C., Gavi, R., Adams, S., Ferrera-Cerrato, R., y Palma-López, D. (2002).

Hidrocarburos del petróleo y tecnologías de biorremediación para suelos de

Tabasco. Palma-López DJ, Triano SA (comps) Plan de uso sustentable de los suelos

de Tabasco, 2.



75

ANEXOS

A. Preparación de medios enriquecidos

Tabla 14. Composición del medio Bushnell Haas, utilizado para el proceso de bioventeo.

Sal Cantidad (g/L)

KH2PO4 60

(NH4)2HPO4 60

KNO3 60

FeCl3 3

CaCl2 1.2

MgSO4 * 7H2O 12

B. Análisis estadísticos

1000007500050000250000-25000-50000

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

mg CO2/kg suelo

Po

rce

nta

je

Media 5869

Desv.Est. 17945

N 28

KS 0.372

Valor P <0.010

a) CO2 7 DíasNormal



76

150000100000500000-50000

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

mg CO2/kg suelo

Po

rce

nta

je

Media 27143

Desv.Est. 40209

N 28

KS 0.250

Valor P <0.010

b) CO2 14 DíasNormal

150000100000500000-50000

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

mg CO2/kg suelo

Po

rce

nta

je

Media 44714

Desv.Est. 46721

N 28

KS 0.224

Valor P <0.010

c) CO2 28 DíasNormal

Figura 31 a,b,c. Gráfica de probabilidad normal (línea azul) para los datos de CO2


estadísticos y el valor p de la prueba Kolmogorov-Smirnov.



77

La prueba de bondad de ajuste de Kolmogorov sigue dos hipótesis:

H0 = Los datos analizados siguen una distribución normal.

H1 = Los datos analizados no siguen una distribución normal.

Si el p valor es mayor a α, se acepta la hipótesis H0, de lo contrario se acepta la hipótesis

H1.

9.08.58.07.57.06.56.0

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

pH

Po

rce

nta

je

Media 7.070

Desv.Est. 0.4909

N 28

KS 0.235

Valor P <0.010

pH 7 DíasNormal



78

9.08.58.07.57.06.56.0

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

pH

Po

rce

nta

je

Media 7.260

Desv.Est. 0.5153

N 28

KS 0.234

Valor P <0.010

pH 14 DíasNormal

9.08.58.07.57.06.56.0

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

pH

Po

rce

nta

je

Media 7.573

Desv.Est. 0.5352

N 28

KS 0.131

Valor P >0.150

pH 28 DíasNormal

Figura 32 a,b,c. Gráfica de probabilidad normal (línea azul) para los datos de pH producido

en a) 7 días b) 14 días c) 28 días. A la derecha se encuentran los parámetros estadísticos y

el valor p de la prueba Kolmogorov-Smirnov.



79

7065605550454035

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

% Humedad

Po

rce

nta

je

Media 52.04

Desv.Est. 6.898

N 28

KS 0.136

Valor P >0.150

Humedad 7 díasNormal

5045403530

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

% Humedad

Po

rce

nta

je

Media 39.11

Desv.Est. 4.008

N 28

KS 0.169

Valor P 0.043




80

60555045403530

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

% Humedad

Po

rce

nta

je

Media 44.09

Desv.Est. 6.243

N 28

KS 0.167

Valor P 0.046



Humedad producido en a) 7 días b) 14 días c) 28 días. A la derecha se encuentran los

parámetros estadísticos y el valor p de la prueba Kolmogorov-Smirnov.

35302520151050

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

% M.O./g suelo

Po

rce

nta

je

Media 19.62

Desv.Est. 5.730

N 28

KS 0.367

Valor P <0.010

M.O. 7 DíasNormal



81

2520151050

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

% M.O./g suelo

Po

rce

nta

je

Media 13.86

Desv.Est. 3.983

N 28

KS 0.386

Valor P <0.010

M.O. 14 DíasNormal

20151050

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

% M.O./g suelo

Po

rce

nta

je

Media 12.85

Desv.Est. 3.798

N 28

KS 0.312

Valor P <0.010

M.O. 28 DíasNormal

Figura 34 a,b,c. Gráfica de probabilidad normal (línea azul) para los datos de % de Materia

Orgánica producido en a) 7 días b) 14 días c) 28 días. A la derecha se encuentran los

parámetros estadísticos y el valor p de la prueba Kolmogorov-Smirnov.



82

1.21.00.80.60.40.20.0

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

C.E. (µS/cm)

Po

rce

nta

je

Media 0.7246

Desv.Est. 0.2157

N 28

KS 0.298

Valor P <0.010

C.E. 7 DíasNormal

1.61.41.21.00.80.60.40.2

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

C.E. (µS/cm)

Po

rce

nta

je

Media 0.9093

Desv.Est. 0.2865

N 28

KS 0.136

Valor P >0.150

C.E. 14 DíasNormal



83

1.00.90.80.70.60.50.4

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

C.E. (µS/cm)

Po

rce

nta

je

Media 0.7575

Desv.Est. 0.1057

N 28

KS 0.220

Valor P <0.010

C.E. 28 DíasNormal

Figura 35 a,b,c. Gráfica de probabilidad normal (línea azul) para los datos de

Conductividad Eléctrica producido en a) 7 días b) 14 días c) 28 días. A la derecha se

encuentran los parámetros estadísticos y el valor p de la prueba Kolmogorov-Smirnov.

10005000-500-1000

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

mg HFP/kg suelo

Po

rce

nta

je

Media 2.273737E-13

Desv.Est. 457.9

N 28

KS 0.145

Valor P 0.134

HFP 7 díasNormal



84

2500020000150001000050000-5000-10000

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

HFP

Po

rce

nta

je

Media 7209

Desv.Est. 6289

N 28

KS 0.380

Valor P <0.010

HFP 14 díasNormal

14000120001000080006000400020000

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

mg HFP/kg suelo

Po

rce

nta

je

Media 6404

Desv.Est. 2859

N 28

KS 0.115

Valor P >0.150

HFP 28 díasNormal

Figura 36 a,b,c. Gráfica de probabilidad normal (línea azul) para los datos de HFP

producidos en a) 7 días b) 14 días c) 28 días. A la derecha se encuentran los parámetros

estadísticos y el valor p de la prueba Kolmogorov-Smirnov.



85

Tabla 15. Valores obtenidos mediante el análisis de varianza para los efectos de las sales en

las variables medidas.

Sal p valor

CO2

p valor

pH

p valor

%

Hum

p valor

C.E.

p valor

M.O.

p valor

HFP

NaCl 0.417 0.024 0.049 0.0004 0.032

MgSO4 • 7H2O 0.46 0.049 0.0001 0.033

CaCl2 0.234 0.105 0.023 0.014

(NH4)2SO4 0.223 0.063 0.103 0.0008 0.023

KH2PO4 0.179 0.033 0.006 0.09 0.0001 0.011

FeCl3 • 6H2O 0.2 0.045 0.042 0.0006 0.218

(NH4)2PO4 0.202 0.045 0.013 0.0001 0.001

NH4Cl 0.331 0.12 0.002 0.086 0.001

KH2NH3 0.147 0.015 0.03 0.055 0.004

FeSO4 0.117 0.239 0.005 0.09 0.0001 0.005

NH4NO3 0.308 0.091 0.012 0.046 0.012

R2 98.93 99.89 99.89 99.95 99.99 99.24

R2

(ajustada) 88.30 98.79 99.41 99.48 99.97 97.24



86

Tabla 16. Interacciones de medias estadísticas tiempo-medio entra los medios enriquecidos,

los tiempos y las variables en el proceso de biodegradación de los hidrocarburos de fracción

pesada utilizando bioestimulación. (*DMS Diferencia Mínima Significativa) Valores con la

misma letra son estadísticamente iguales.

Tiempo-

Medio

CO2

(mg

CO2/Kg

suelo)

pH Humedad

(%

humedad/g

suelo)

Materia

orgánica

(% M.O.)

C.E.

(µS/cm)

HTP

(mg

HFP/Kg

suelo)

7 días

M1 0 c 6.97 i 63.40 a 21.27 de 0.845 cde 25455 a

M2 2125 c 6.62 q 41.76 ij 23.00 ab 0.605 ef 18605 bc

M3 4500 c 6.85 lmn 55.37 c 22.28 c 0.6 ef 5645 efgh

M4 12750 bc 6.90 jkl 60.35 b 21.00 ef 0.8 cde 3955 fgh

M5 0 c 7.01 hi 44.43 gh 20.85 f 0.84 cde 2915 fgh

M6 0 c 6.95 ijk 63.09 a 22.64 bc 0.85 cde 9685 def

M7 0 c 7.16 e 53.38 cd 19.97 g 0.87 bcde 4153 fgh

M8 0 c 7.3 d 52.51 d 21.45 d 0.865 bcde 5678 efgh

M9 11375 bc 6.85 lmn 55.55 c 19.80 g 0.41 fg 4110 fgh

M10 46417 abc 6.69 p 49.52 ef 23.23 a 0.805 cde 5435 efgh

M11 0 c 6.95 ijk 44.88 g 19.90 g 0.79 cde 6107 efgh

M12 5000 c 6.82 mno 51.76 de 21.59 d 0.835 cde 0 h

Testigo 0 c 8.68 a 48.23 f 17.71 h 0.135 g 24408 ab

14 días

M1 8625 bc 7.54 c 37.74 klm 14.89 mno 0.965 bc 11031 de

M2 88750 a 6.78 o 42.88 ghi 15.30 jkl 0.715 cdef 4088 fgh

M3 51000 abc 6.89 klm 37.88 klm 15.60 j 0.655 cdef 2650 gh

M4 70250 ab 6.97 ij 42.31 hij 14.88 mno 0.785 cde 1977 gh

M5 0 c 7.13 ef 43.71 ghi 15.08 lmn 0.755 cde 2234 gh

M6 13875 bc 7.09 fg 47.98 f 14.74 nop 1.465 a 1770 gh

M7 0 c 7.04 gh 38.62 kl 14.61 op 1.33 a 3868 fgh



87

M8 0 c 7.26 d 33.50 n 15.17 klm 0.935 bcd 2645 gh

M9 53375 abc 6.96 ij 35.47 mn 13.80 q 0.72 cdef 7169 efg

M10 75875 a 6.79 no 38.80 kl 16.46 i 0.875 bcde 2030 gh

M11 4250 c 7.99 b 36.64 lm 14.45 p 1.19 ab 1297 gh

M12 14000 bc 7.15 ef 40.20 jk 15.50 jk 0.86 cde 846 gh

Testigo 0 c 8.70 a 35.75 mn 13.52 q 0.62 def 16050 cd

28 días

M1 8625 bc 7.54 c 37.74 klm 14.89 mno 0.965 bc 11031 de

M2 88750 a 6.78 o 42.88 ghi 15.30 jkl 0.715 cdef 4088 fgh

M3 51000 abc 6.89 klm 37.88 klm 15.60 j 0.655 cdef 2650 gh

M4 70250 ab 6.97 ij 42.31 hij 14.88 mno 0.785 cde 1977 gh

M5 0 c 7.13 ef 43.71 ghi 15.08 lmn 0.755 cde 2234 gh

M6 13875 bc 7.09 fg 47.98 f 14.74nop 1.465 a 1770 gh

M7 0 c 7.04 gh 38.62 kl 14.61 op 1.33 a 3868 fgh

M8 0 c 7.26 d 33.50 n 15.17 klm 0.935 bcd 2645 gh

M9 53375 abc 6.96 ij 35.47 mn 13.80 q 0.72 cdef 7169 efg

M10 75875 a 6.79 no 38.80 kl 16.46 i 0.875 bcde 2030 gh

M11 4250 c 7.99 b 36.64 lm 14.45 p 1.19 ab 1297 gh

M12 14000 bc 7.15 ef 40.20 jk 15.50 jk 0.86 cde 1846 gh

Testigo 0 c 8.70 a 35.75 mn 13.52 q 0.62 def 16050 cd

DMS 61330 0.06 2.51 0.39 0.32 6780.8

En la tabla 16 se pueden apreciar valores de medias cambiantes en algunas variables,

dependiendo de la formulación del medio y del tiempo. Esto se confirma con la diferencia

mínima significativa, que en el caso del CO2 y de los HTP muestra valores muy altos, por

lo que la mayoría de estos son estadísticamente iguales.



88

Tabla 17. Comparación de medias estadísticas de las formulaciones de los medios las

variables en el proceso de biodegradación de los hidrocarburos de fracción pesada

utilizando bioestimulación. (*DMS Diferencia Mínima Significativa) Valores con la misma

letra son estadísticamente iguales.

Tiempo-

Medio

CO2

(mg

CO2/Kg

suelo)

pH Humedad

(%

humedad/g

suelo)

Materia

orgánica

(% M.O.)

C.E.

(µS/cm)

HTP

(mg

HFP/Kg

suelo)

M1 10375 cde 7.16 f 49.25 ab 16.76 cd 0.85 bc 12162 b

M2 49542 abc 6.76 i 43.05 c 17.54 b 0.65 e 8354 bc

M3 46583 abcd 7.06 g 45.73 bc 16.92 cd 0.65 e 4198 de

M4 47875 abcd 7.20 ef 49.06 ab 16.80 cd 0.77 cde 2654 de

M5 5208 de 7.34 d 43.73 c 16.00 e 0.79 cde 2701 de

M6 12375 cde 7.23 e 53.05 a 17.02 c 1.06 a 4676 cde

M7 9250 cde 7.41 c 46.75 bc 16.13 e 0.97 ab 3861 de

M8 0 e 7.56 b 43.71 c 16.59 d 0.87 bc 2774 de

M9 63000 ab 7.20 ef 45.25 bc 14.95 f 0.69 de 2550 de

M10 70389 a 7.01 gh 44.46 bc 17.94 a 0.69 de 2688 de

M11 15542 cde 7.41 c 41.96 c 16.07 e 0.91 bc 3559 de

M12 26542 bcde 6.98 h 45.95 bc 17.07 c 0.81 cd 3895 de

Testigo 0 e 8.71 a 42.25 c 15.04 f 0.25 f 18681 a

DMS 43478 0.0642 5.216 0.3916 0.1434 4040.4

instituto politÉcnico nacional -...

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