instituto politÉcnico nacional maestrÍa en ciencias … · aprecio mucho y que cuentas conmigo...
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATÍA
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
MAESTRÍA EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR
“Análisis funcional de la via CD73 como mecanismo inmunosupresor de células estromales mesenquimales
derivadas de neoplasias cervicales”
T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN
CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR
P R E S E N T A: BIÓL. PÉREZ SALDAÑA KARYNA
DIRECTORES DE TESIS: DRA. PAULA MARÍA DEL CARMEN FIGUEROA ARREDONDO
DR. ALBERTO MONROY GARCÍA
MÉXICO D.F., JULIO 2012.
El presente trabajo se realizó en colaboración entre el Laboratorio de
Microbiología Molecular de la Escuela Nacional de Medicina y Homeopatía del
Instituto Politécnico Nacional; y el Laboratorio de Inmunobiología del Cáncer de la
Unidad de Investigación Médica de Enfermedades Oncológicas del Hospital de
Oncología del Centro Médico Nacional Siglo XXI del Instituto Mexicano del Seguro
Social y el Laboratorio de Inmunobiología de la Unidad Multidisciplinaria de
Investigación Experimental Zaragoza de la Facultad de Estudios Superiores
Zaragoza de la Universidad Nacional Autónoma de México.
El trabajo fue realizado gracias al apoyo financiero proporcionado por el
CONACyT No. 106591; FIS/IMSS/PROT/800 y 1014; DGAPA PAPIIT No.223010.
Durante los estudios de maestría la susténtate recibió los siguientes apoyos: beca
del CONACyT con número de registro 237287 durante el periodo comprendido
entre febrero de 2010 a enero de 2012; Beca Extraordinaria Institucional de
Posgrado febrero-julio 2012; apoyo financiero como Becaria de Investigación con
número de matrícula 99094880 proporcionado por Instituto Mexicano del Seguro
Social en el periodo de marzo 2010 a mayo 2011; beca de Estudios Continuos de
Posgrado con el numero de folio 11BCM204-I por el Consejo Mexiquense de
Ciencia y Tecnología del Estado de México (COMECYT) del periodo comprendido
entre febrero 2011 a Julio 2012.
DEDICATORIA
Primero que nada quiero agradecerle a Dios por todo lo maravilloso que me ha dado, que
es la vida; así como todos los obstáculos que me han fortalecido y que no me han permito
cometer los mismos errores. La vida la tomo con sabiduría para poder disfrutarla en cada
una de sus facetas, has hecho posible realizar cada una de mis aspiraciones personales,
escolares y de ahora en adelante laborales. Gracias por permitirme ser, sentir y vivir; esto
es lo que le ha dado la razón a mi existencia.
A mi mamá: Alejandra Saldaña Terán
Porque nuevamente juntas hemos llegado a la cima de una meta más de nuestras vidas;
a pesar de las adversidades no nos dejamos vencer y eso es gracias a sus enseñanzas;
disciplina y esperanza para aferrarnos a nuestros sueños. Gracias mami por ser mi
ejemplo de mujer y de lucha continua, la amo.
A mi papá Máximo Velasco Beltran
Gracias por ser un amigo incondicional, por el apoyo que me ha brindado siempre en
todos los aspectos de mi vida gracias por haber sido parte de esta y de muchas otras
historias que aun no están escritas.
A mis hermanos: Gris, Luis, Carlos, Sergio
Les agradezco a mis pequeños por siempre estar a mi lado, por no dejarme derrumbar y
ser un apoyo en los momentos más difíciles; comparto con ustedes este logro como
también comparto la felicidad que me da saber que ya cada uno esta emprendiendo su
camino con éxito. Los amo.
A mis abuelitos: Magdalena Terán Aguilar y Pascual Saldaña Hernández
Hace ya 18 años que nos cobijaron en su hogar y en su corazón para que juntos nos
enseñaran a crecer, a fortalecernos, a madurar y sobre todo a sobrevivir, nos llenaron de
amor incondicional que nunca será retribuido con nada; son la parte mas elemental de
mi desarrollo personal siempre los honrare con el ejemplo y su recuerdo (abuelito) que
siempre esta latente en lo mas profundo de mi ser.
A mis tíos: Hortensia, Humberto, Jesús, Alejandro, Efrén y a mi primita Naty
Gracias por sus ánimos, consejos, por sus enseñanzas pero sobre todo por el cariño y el
amor familiar con que siempre nos tratamos.
A mí cuñado Rolando y a mi sobrina Melanie
Rolas te agradezco que me escuches y me apoyes cuando lo he requerido sabes que te
aprecio mucho y que cuentas conmigo eres un hermano mas para mi. Melanie pequeñita
te amo con todo mí ser, eres una gran luz que ilumina mi vida y la de toda la familia
eres una lindura y aunque no me reconozcas como tu “mamá tía Kary” eso soy!!!.
A mi compañero de vida: Dan E. Muñoz Gomez
Nadie creía que esta historia fuera posible pero solo basto que le diéramos tiempo al
tiempo; con dedicación, empeño, devoción y mucho amor estamos construyendo nuestro
camino; a base de confianza y respeto, esta oportunidad me ha hecho ver que eres un
hombre valioso en todos los sentidos siempre estaré para ti como tu lo has estado para mi.
Gracias mi amor por los momentos de felicidad que estamos viviendo y por todos
aquellos que aun nos esperan.
A la familia Muñoz Gomez
Desde el fondo de mi corazón quiero reiterarles lo mucho que los aprecio y que significan
para mi, fueron parte importante para que juntos lográramos tanto en tan poco tiempo;
gracias por creer en mi gracias por el amor de familia que me dan y sobre todo por
abrirnos siempre las puertas de su corazón, de su hogar y de sus vidas. Yo creo que no
hay mayor éxito que el obtenido.
A mi amiga Renata
Amiga!!! Por fin se culmina esta meta; no sabes cuan agradecida estoy de haberte
conocido sabes que te quiero muchísimo; siempre estaré apoyándote. Eres un ejemplo de
inteligencia, valentía y fortaleza.
A mi amiga Susy
Susy gracias por haber compartido muchos momentos gratos durante las clases y fuera
de ellas siempre estuviste escuchándome y ayudándome en lo necesario; eres muy
inteligente y capaz de mucho; te recuerdo que a pesar de la distancia seguiremos siendo
amigas disfrutando cada una ahora sus nuevas prioridades.
A la Dra. Paula María del Carmen Figueroa Arredondo
Doctora, le estaré infinitamente agradecida por el súper apoyo que me dio durante mi
estancia en la ENMyH como en su laboratorio; siempre tan cordial y atenta a mis
necesidades personales como escolares. Le agradezco la confianza que deposito siempre
en mí y que espero nunca haberla defraudado; me disculpo por los inconvenientes pero
al final la unión hace la fuerza y logramos dar lo mejor de si. Es una excelente
profesional, mujer, mamá y amiga. Felicidades por todo el éxito que ha obtenido seguro
la esperan muchos mas triunfos.
Al Dr. Alberto Monroy García y al equipo de trabajo de la UMIEZ FES- Zaragoza
Por su apoyo y dedicación durante estos 5 años de haber tenido el gusto de trabajar con
usted; siempre tan desinteresado y gustoso por transmitir sus conocimientos; por
reconocer y valorar el trabajo hecho por los demás. Nunca olvide que el éxito estará si hay
unión y veracidad.
Al maestro Jorge Hernández Montes
Maestro le agradezco tanto su presencia como sus consejos hechos durante estos 5 años
en que hemos entablado una amistad llena de honestidad y sinceridad; lo admiro por
sus capacidades intelectuales, la visión y la crítica constructiva para discernir entro lo
posible y lo inalcanzable. Siempre fue y seguirá siendo un líder porque con ello se nace.
Al Dr. Héctor Sánchez Peña
Por su valiosa e interesada cooperación para poder permitirme involucrarme en su área de
trabajo para la obtención de las muestras biológicas de las pacientes del Hospital General
2A de Troncoso del IMSS.
A mis profesores de Posgrado de la ENMyH
Gracias por el apoyo académico brindado durante estos últimos dos años, que ayudaron
a mi formación académica; todos son grandes profesionales. Quiero agradecer en especial
a la Dra. Doris Atenea Cerecedo por sus palabras tan alentadoras, por la amistad y
confianza que deposito en mí siempre resaltando mis capacidades y al mismo tiempo
dando ejemplo del esfuerzo con que cada día debemos de hacer nuestras actividades sin
importar nada más.
A los miembros del Jurado:
Dr. Juan Santiago Salas Benito
Por su rápida colaboración para el desarrollo de este trabajo, sus buenos consejos y su
atenta y amable disponibilidad para atender los llamados.
Dr. Cesar Augusto Sandino Reyes López
Por la comprensión, apoyo académico que desinteresadamente nos brindo a los alumnos
y sobre todo su colaboración en la revisión de este trabajo.
Dr. Fernando Enríquez Rincón
Primero que nada le agradezco el haber aceptado ser parte de mi comité evaluador;
considerado sobre todo por su experiencia y buen aporte. Gracias también por sus buenos
consejos; por la confianza y confidencia en relación al trabajo académico. Sinceramente
espero haber cubierto las expectativas esperadas.
INDICE
Descripción
Página
Índice de Figuras I
Índice de Tablas I
Abreviaturas II
Resumen 1
Abstract 3
Introducción 5
Cáncer Cérvico-Uterino y Evasión Inmunológica 5
Vía Adenosinérgica 7
Células Estromales Mesénquimales 9
Características Biológicas de las CEMs 11
Planteamiento del Problema 15
Hipótesis 16
Objetivo General 17
Objetivo Particular 17
Materiales y Métodos 18
Material Biológico 18
Obtención de CEMs de tejidos cervicales normales, NIC y con CaCu.
18
Inmunofenotipo de las CEMs 19
Capacidad de diferenciación osteogénica, condrogénica y adipogénica.
20
Inducción osteogénica
20
Inducción condrogénica 20
Inducción adipogénica 21
Expresión de CD73 y receptor A2a en las CEMs obtenidas de Cérvix Normal, con NIC y CaCu
22
Actividad Enzimática de CD73 para la generación de Adenosina a partir de AMP 23
Cromatografía en capa fina 24
Evaluación del efecto supresor de la adenosina generada por las CEMs de Cérvix Normal y de CaCu sobre la proliferación de LTC.
25
Obtención y cultivo de Linfocitos de Sangre Periférica. 25
Cultivo de LSP con la adenosina producida de la actividad enzimática de CD73 de las CEMs de Cérvix Normal y CaCu.
26
Marcaje y conteo de proliferación de linfocitos T cultivados con la adenosina producida por CD73 de las CEMs de Cérvix Normal y CaCu.
26
Evaluar el efecto supresor de la adenosina generada por las CEMs de Cérvix Normal y CaCu sobre la función efectora de LTC.
27
Obtención de LTC específicos al péptidos E7 YMLDLQPETT (11-20).
27
Detección de linfocitos T específicos para el péptido YMLDLQPETT. 30
Células Blanco 30
Resultados
31
Obtención de CEMs derivadas de tejido cervical normal, NIC y con CaCu.
31
Capacidad de diferenciación osteogénica, condrogénica y adipogénica.
34
Detección de CD73 y receptor A2a en las CEMs derivadas de tejidos cervicales.
35
Análisis de la actividad enzimática de CD73 en las CEMs. 36
Evaluación del efecto supresor de la adenosina generada por las CEMs de Cérvix Normal y CaCu sobre la proliferación de LTC.
37
Evaluación del efecto supresor de la adenosina generada por las CEMs de Cérvix Normal y CaCu sobre la función efectora de LTC.
39
Discusión
42
Conclusión
50
Perspectivas
51
Bibliografía 52
I
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura Descripción Página
1 Vía adenosinérgica llevada a acabo por las Treg. 8
2 Representación de la multipotencialidad de las CEMs. 11
3 Efecto supresor de las CEMs sobre las células del Sistema Inmune. 12
4 Morfología característica de las CEMs. 32
5 Capacidad de diferenciación osteogénica, condrogénica y adipogénica
de las CEMs. 35
6 Expresión de CD73 y Receptor A2a en las CEMs. 36
7 Degradación enzimática de AMP a Adenosina (ADA) de las CEMs de
CaCu y Cérvix Normal. 37
8 La adenosina producida por las CEMs inhibe la proliferación de
Linfocitos T. 38
9 Porcentaje de clonas de LTC CD8+ específicos al péptido E7
(YMLDLQPETT) (11-20) de HPV-16. 39
10 Adenosina generada por las CEMs de CaCu reduce fuertemente la
actividad efectora de linfocitos T citotóxicos. 40
11
Adenosina generada por las CEMs derivadas de tejido cervical normal,
reduce la actividad efectora de linfocitos T citotóxicos.
41
Tabla Descripción Página
1
Caracterización inmunofenotipica de las CEMs 33
II
ABREVIATURAS
ADA Adenosina. AMP Adenosin monofosfato. AMD Adenosina Metileno Difosfato. A2AR Receptor A2a para adenosina. A2BR Receptor A2B para adenosina. ATP Adenosin Trifosfato cAMP Adenosin Monofosfato cíclico. CPA Célula presentadora de antígeno. CaCu Cáncer cérvico-uterino. CDs Células dendríticas. CEMs Células estromales mesénquimales. CMSP Células mononucleares de sangre periférica. CTLA-4 Antígeno-4 asociado al linfocito T citotóxico. CxN Cérvix Nomal. FoxP3 Del ingles forkhead box P3 transcription factor. HLA Antígeno leucocitario humano. HPV Virus de papiloma humano. IDO Indoleamina 2,3-dioxigenasa. IFN-γ Interferón gamma. IL Interleucina. ISCT Sociedad Internacional de Terapia Celular. iTreg Linfocitos T reguladores inducidos. LPS Linfocitos de sangre periférica. LTCs Linfocito T Citotóxicos MHC-I Complejo principal de histocompatibilidad clase I MON Médula ósea normal. NIC Neoplasia intraepitelial cervical. NK Células asesinas naturales. NKT Células T asesinas naturales. nTreg Linfocitos T reguladores naturales. PBS Solución salina amortiguador de fosfatos. PHA Fitohemaglutinina. SFB Suero fetal bovino. siRNA RNA de interferencia. TAPs Moléculas transportadoras de antígenos. TCR Receptor de células T. TGF-β Factor de crecimiento transformante beta. Th Linfocitos T cooperadores.
TNF- Factor de Necrosis Tumoral alfa. Treg Linfocitos T reguladores UTP Urasin trifosfato
1
RESUMEN
En el presente estudio se postula que las células estromales mesénquimales
(CEMs) derivadas CaCu, probablemente tienen hiperactivada la vía
adenosinérgica inmunosupresora, en comparación con las de cérvix normal.
Se procedió a hacer un análisis en las CEMs de cérvix, mismo que permitió
determinar experimentalmente que la molécula CD73 (con actividad enzimática
generadora de Adenosina a partir de AMP) está presente en la membrana de las
CEMs y además se encuentra funcional, por lo que las CEMs podrían estar
ejerciendo un efecto supresor sobre la proliferación y la función efectora de los
LTC.
Para comprobar esta hipótesis se realizaron ensayos funcionales evaluando el
porcentaje de inhibición de la proliferación de los LTC en presencia de adenosina
generada por CEMs de Cérvix Normal, encontrándose un 48% de inhibición,
contra un 51% de inhibición cuando las CEMs proceden de CaCu, lo que implica
que la adenosina tiene el potencial de inhibir proliferación.
El efecto anti-proliferativo inducido por la adenosina tisular con CEMs de cérvix
normal y de CaCu, se ve restablecido hasta en un 13 y 21% respectivamente,
frente al tratamiento con cafeína. La cafeína actúa como un antagonista de la vía
adenosinérgica, substituyendo a la adenosina como ligando del receptor A2a. En
los ensayos de competencia con cafeína, se inhibe la interacción de los receptores
con la adenosina, de manera que la proliferación no se ve afectada.
Por otra parte, el efecto de la adenosina sobre la función efectora de los LTC se
evaluó empleando LTC específicos para el péptido E7 YMLDLQPETT de HPV-16
co-cultivados con células blanco T2 pulsadas con el mismo péptido y adicionando
la adenosina generada por las CEMs procedentes de CaCu.
2
El porcentaje de células CD107 positivas, se determinó por citometría de flujo
como un indicador indirecto de citotoxicidad, ya que éste marcador se expresa
cuando el linfocito se encuentra degranulando o lleva a cabo su función citolítica.
La proliferación se estima también con el porcentaje de CD107 inducido por la
adenosina de las CEMs. En CEMs de Cérvix Normal el porcentaje de CD107 fue
de 1.14 contra un 1.36 obtenido en el ensayo de competencia con cafeína, lo que
sugiere que el efecto se restablece en presencia de cafeína. Al usar la adenosina
de las CEMs de CaCu, se obtuvo un 2.35% de CD107 contra el 5.43% que se
obtiene en su ensayo correspondiente de competencia con cafeína, lo que sugiere
que la cafeína restablece efectivamente la función efectora en los linfocitos.
Los resultados de éste estudio sugieren un mayor efecto supresor inducido por las
CEMs de CaCu, en comparación con las CEMs procedentes de cérvix normal,
atribuible a que la vía adenosinérgica inmunosupresora iniciada por CD73, se
encuentra activa y no pierde su control en presencia de un aumento de sustrato,
como se observa en un proceso inflamatorio o de hipoxia tisular, por ejemplo el
microambiente hipóxico que sufre el tejido tumoral cervical.
Por lo anterior se concluye que los componentes principales de la vía
adenosinérgica están presentes en poblaciones celulares infiltradas en el
microambiente cervical y que hay una alteración de su función debida al cáncer.
La vía adenosinérgica se ve desequilibrada induciendo a una producción excesiva
de adenosina que causa inmunosupresión de las poblaciones citotóxicas
efectoras, en este caso a los LTC.
Se requieren ensayos adicionales para determinar si la diferencia observada es
significativa, si así fuera ésta tendencia podría indicar que los tratamientos con
cafeína contrarrestan la inhibición de la función efectora de los LTC.
3
ABSTRACT
The present work support that mesenchimal estromal cells (MECs) derived from
cervical cancer, probably have hyperactivated the adenosinergic immunosupresive
pathway, in comparison with those from normal cervix.
Analysis of MECs isolated from cervical cancer and from normal tissues was
performed allowing to experimentally show that CD73 (a molecule with enzymatic
activity that generates Adenosine from AMP) is present in the MECs membrane
and it is functional, thus these cells may be eliciting a suppressive effect altering
proliferation and the effector functions of CTL (cytotoxic T lymphocytes).
To test this hypothesis, functional assays were performed evaluating percentages
of T cells inhibition of proliferation in the presence of the adenosine produced by
MECs from normal cervix, finding 48% inhibition of cell proliferation whereas, 51%
inhibition was found when MECs proceeded from cervical cancer, suggesting that
adenosine has the potential for inhibiting cell proliferation.
Besides, such anti-proliferative effect induced by tissue adenosine on MECs from
normal cervix and cervical cancer, was re-established up to 13% and 21%
respectively, when caffeine treatments were performed. Caffeine performs as an
antagonist of the adenosinergic pathway, in substitution of adenosine (ligand of the
A2a receptor). In competition assays using caffeine, the interaction of adenosine
with the receptors is blocked, the pathway is blocked in such a way that
proliferation is not affected.
In the other hand, the effect of adenosine on the effector function of CTLs was
evaluated on specific CTLs (produced by using a peptide from HPV-16 E7
YMLDLQPETT) co-cultured with their corresponding target cells (T2 pulsed with
the same peptide) and adding adenosine directly generated by the cervical cancer
MECs.
4
Percentages of CD107 positive cells were determined by flow cytometry as an
indirect indicator of cytotoxicity, since expression of this marker is specific for
degranulating or cytotoxic lymphocytes.
Another evidence of proliferation came from determining percentages of CD107,
induced by adenosine from MECs. MECs from normal cervix showed 1.14 % of
CD107, compared with 1.36% from the competition assays using caffeine.
Using the adenosine present in the conditioned medium from cervical cancer
CEMs, the rate of CD107 was 2.35%, in contrast with the 5.43% obtained in the
corresponding competitive assay using caffeine suggesting that in both normal and
cancer cervix, the effect is re-established in the presence of caffeine, which means
that the adenosynergic pathway does work. Although more experiments need to be
performed to reach conclusions, the above results suggest that caffeine helps
recover the effector function of lymphocytes.
This work support that treatments with caffeine neutralize the inhibitory function of
CTLs elicited by the adenosynergic pathway started by CD73. Taken together, the
results from this study suggest a major suppressor effect, induced by MECs from
cervical cancer, in comparison to those coming from normal cervix, and this
difference may be attributed to the immunosuppressive adenosynergic pathway
started by CD73. We demonstrated that the adenosynergic pathway is functional in
normal and cancer cervices, and it does not lose control in augmented substract
conditions, such as those observed on inflammatory or hypoxic processes, like for
example the highly hypoxic microenvironment that the cervical cancer tissue has to
endure. Nevertheless additional assays are required to determine whether
differences observed in this work are significant.
5
INTRODUCCIÓN
CaCu y Evasión Inmunológica
El cáncer cérvico-uterino (CaCu) es un problema importante de salud pública, ya
que constituye una de las principales causas de mortalidad entre las mujeres
Mexicanas con cáncer (INEGI, 2008). Cada año se diagnostican alrededor de
11,000 casos nuevos de cáncer cérvico uterino invasor. La mayoría de las
pacientes ingresan con enfermedad avanzada, con un mal pronóstico y
representan una enorme pérdida de recursos humanos y económicos. Esta
enfermedad se encuentra fuertemente asociada (cercana al 100%) con la
infección por el virus de papiloma humano (HPV) de alto riesgo (Walboomers et al,
1999). La presencia de HPV en este tipo de cáncer genital, también se ha
asociado con la fallas en la respuesta inmune celular mediada por linfocitos T
auxiliares tipo Th1 y por linfocitos T citotóxicos (Visser J et al, 2007 y Molling J.W
et al, 2007; Nakamura T et al, 2007; Piersma S et al, 2007). Dentro de los
principales mecanismos asociados a la deficiente respuesta inmune celular
destacan: defectos en la función inmunoestimuladora mediante citocinas y
moléculas co-estimuladoras de células dendríticas (Gabrilovich DI et al, 2001); la
expresión defectuosa y disminuida de moléculas del complejo principal de
histocompatibilidad (HLA) y de los transportadores asociados al procesamiento de
antígenos TAPs (Brady CS et al, 2000; Evans M et al, 2001); y a la asociación de
ciertos alelos HLA clase I y clase II que conducen a una deficiente presentación de
antígenos a linfocitos T.
En adición se ha demostrado que células T reguladoras inmersas en el
microambiente tumoral participan de manera activa en la desregulación de la
respuesta inmune efectora (Suri-Payer E et al, 1998; Grohmann U et al, 2001;
Dhodapkar M et al, 2001 y Roncarolo M et al, 2001, Cools N et al, 2007).
6
Asimismo, ciertas poblaciones de linfocitos T CD8+, tales como CD8+ CD25+,
CD8+ CD28- y CD8+IL-10+ pueden también tener efectos inhibitorios sobre la
activación y proliferación de linfocitos T citotóxicos (LTCs) (Roncarolo MG et al,
2006; Fontenot JD et al, 2005 y Von Boehmer H et al, 2005). En el caso particular
de neoplasias cervicales intraepiteliales y cáncer cérvico-uterino, se ha observado
que la presencia de linfocitos T reguladores CD4+ CD25+ Foxp3+ y CD4+ CD25+
Foxp3- en sangre periférica de pacientes con NIC y cáncer cérvico uterino, se
correlaciona con el desarrollo de la enfermedad y con la persistencia de infección
por HPV de alto riesgo (Visser J et al, 2007 y Molling J.W et al, 2007; Nakamura T
et al, 2007; Piersma S et al, 2007). Asimismo, la presencia de linfocitos T
reguladores específicos a péptidos antigénicos de proteínas virales, infiltrados en
tumores y nódulos linfáticos de pacientes con CaCu avanzado (Van der Burg SH
et al, 2007; Adurthi S et al, 2008) y en sangre periférica de pacientes vacunadas
con péptidos antigénicos (Welters MJP et al, 2008), sugieren que el avance de la
enfermedad está asociada, entre otros factores, con la inducción de células T
reguladoras específicas a antígenos de HPV.
Con base en resultados obtenidos de modelos in vivo e in vitro, se han propuesto
otros mecanismos de supresión inmune ejercidos por células T reguladoras, estos
incluyen: a) la inducción de la expresión de moléculas co-inhibidoras B7-H4 en
células presentadoras de antígeno (CPAs), las cuales a su vez inducen el arresto
del ciclo celular de LTCs; b) la actividad citolítica sobre CPAs y LTCs mediante la
producción de granzima-B y perforinas por células T reguladoras; c) la expresión
del antígeno 4 asociado al linfocito T citotóxico (CTLA-4) en células T reguladoras,
induce la producción de indoleamina 2,3-dioxygenase (IDO) en CPAs, la cual
suprime la activación de LTCs mediante la reducción de triptófano; d) la liberación
de IL-10 y TGF- que directamente inhibe la activación de linfocitos T y suprime la
función de CPAs al inhibir la expresión de moléculas del Complejo Principal de
Histocompatibilidad, moléculas co-estimuladoras (CD80, CD86) e IL-12 (Zou W
2006; Cools N et al, 2007; Sojka D et al, 2008).
7
Vía Adenosinérgica
Otro mecanismo inmunosupresor, recientemente propuesto para las células T
reguladoras, es la vía adenosinérgica mediante la producción de adenosina
extracelular. Este compuesto es generado a partir de nucleótidos extracelulares
(ATP, ADP) catalizados por ectonucleotidasas como CD39 y CD73 expresados en
linfocitos T reguladores CD4+ CD25+ FoxP3+, células endoteliales, monocitos,
células dendríticas foliculares, células tumorales y células estromales
mesenquimales entre otros (Kobie J et al, 2006 y Deaglio S et al, 2007). CD39
(ENTPD1 (ectonucleotidasa trifosfato difosfohidrolasa-1), EC 3.6.1.5) hidroliza
ATP/UTP y ADP/UDP a sus respectivos nucleósidos (Robson et al, 2005); y la 5´-
ectonucleotidasa ó CD73 (EC 3.1.3.5) degrada al fosfato de adenosina (AMP) a
adenosina (Resta et al, 1998) (Figura 1). De los 4 receptores caracterizados para
adenosina (A1, A2a, A2b y A3) (Fredholm et al, 2001), los receptores A2AR y
A2BR de alta y baja afinidad respectivamente, dispuestos predominantemente en
la membrana de linfocitos T citotóxicos CD8+, son los responsables para ejercer
efectos inhibitorios sobre estas células efectoras (Huang et al, 1997 y Koshiba et
al, 1997). La elevada producción de cAMP a través de la señalización vía los
receptores A2aR y A2bR en las células T resulta en la inhibición de la activación
vía el receptor del linfocito T (Takayama y Sitkovsky 1988; Sugiyama H et al,
1992), y muchas otras funciones efectoras, incluyendo proliferación, expansión y
la secreción de citocinas importantes con función antitumoral como IFN-
(Koshiba et al, 1997) y TNF-(Poehlein CH et al, 2003). Es conocido que el
receptor A2A de alta afinidad a adenosina, tiene un papel crítico en la protección
del tejido normal contra la inflamación (Linden J 2001; Jacobson y Gao 2006). Sin
embargo, se ha propuesto que el receptor A2a dispuesto en la membrana de los
linfocitos T, protege a los tumores de la actividad antitumoral de estas células
efectoras en un microambiente rico en adenosina. Se ha reportado que la
adenosina en el microambiente tumoral puede provenir de varias fuentes tales
como: a) la hipoxia celular en la cual se inhibe la adenosina cinasa, lo que causa
un incremento de AMP extracelular y por tanto un incremento de adenosina,
8
cuando este sustrato interacciona con CD73 (Decking et al, 1997; Synnestvedt et
al, 2002; Kobie et al, 2006; Deaglio et al, 2007 y Resta et al, 1998); b) se ha
descrito que algunas células tumorales derivadas de melanoma también pueden
producir adenosina (Dzhandzhugazyan et al, 1998); c) asimismo, nucleótidos
liberados por células T durante la activación y presentación de antígeno pueden
ser fuentes de la misma (Takayama H et al, 1988). Recientemente se han ideado
algunos sistemas para contrarrestar el efecto inmunosupresor de adenosina en
tumores, por ejemplo, el uso de antagonistas del receptor A2a como la cafeína y el
bloqueo de su expresión mediante siRNA utlizando un sistema de tumor
inmunogénico, ha permitido la reactivación de la actividad funcional de linfocitos T
efectores y la disminución del tamaño tumoral (Ohta et al, 2006), lo cual sugiere
que el uso de antagonistas del receptor A2a y/o el bloqueo de la generación de
adenosina a través del bloqueo de las ectoenzimas CD39/CD73, puede ser de
gran relevancia para revertir el efecto inmunosupresor de células T reguladoras
establecidas en el microambiente tumoral (Sitkovsky M et al, 2008).
Figura 1. Vía adenosinérgica llevada a acabo por las Treg. CD39 capta ATP para generar AMP que es tomado por CD73 hasta defosforilarlo y generar Adenosina que interacciona con los receptores de alta afinidad de adenosina (A2a) para incrementar AMP cíclico e inhibir las vías de activación de linfocitos T. Tomado de Sitkovsky M et al, 2008.
9
Células Estromales Mesénquimales (CEMs)
Por otra parte se ha demostrado que las células neoplásicas se localizan inmersas
en un microambiente celular denominado estroma tumoral, el cual está compuesto
de fibroblastos, vasos sanguíneos y también de células que participan en la
respuesta inmune. Estos elementos estromales responden a factores producidos
por las células tumorales y proveen de componentes necesarios para la
sobrevivencia del tumor, incluyendo soporte estructural, vasculatura y matriz
extracelular (Albini A et al, 2007). A la fecha, no se sabe cual es el origen de los
componentes estromales, sin embargo una posibilidad es que se formen a partir
de las Células Estromales Mesénquimales (CEMs) que se caracterizan
fenotípicamente por tener los marcadores CD73+, CD90+, CD105+ y CD166+ y por
diferenciarse in vitro a células del linaje mesodérmico como condrocitos,
osteocitos y adipocitos, así como en tendón y músculo, (Figura 2) (Pittenger MF et
al, 1999 y Bianco P et al, 2000). Este tipo celular tiene cualidades biológicas como
la de autorenovación, plasticidad y regeneración tisular por lo que se están
empleando en algunos estudios para la terapia regenerativa; ya que la mayoría de
la población celular son células madre adultas que se están regenerando
constantemente para dar origen a células especializadas y formar tejidos
nuevamente (Körbling & Estrov, 2003, Rodríguez, 2005).
La médula ósea (MO) es la principal fuente de aislamiento de las CEM, aunque se
han aislado de tejido adiposo, páncreas, hígado, músculo esquelético, dermis,
membrana sinovial, hueso trabecular (Wexler et al, 2003; Kern et al, 2006), sangre
de cordón umbilical (Bieback et al, 2004), tejido pulmonar (Sabatini et al, 2005),
pulpa dental y ligamento periodontal (Shi et al, 2005). No obstante, los tejidos más
empleados son la medula ósea, la sangre de cordón umbilical y el tejido adiposo
(Kern et al, 2006, Wagner et al, 2005).
10
Las CEMs expresan un gran número de moléculas de adhesión, proteínas de
matriz extracelular y receptores de citocinas, asociadas con su función e
interacciones celulares dentro del estroma de la MO (Devine & Hoffman, 2000). No
hay un marcador antigénico exclusivo para las CEMs y diferentes grupos de
investigación han establecido una variedad de combinaciones de marcadores para
su detección, debido a que se han observado transformaciones espontáneas en
cultivos a largo plazo respecto a su inmunofenotipo (Jackson et al, 2007).
Dado que los investigadores publican estudios de CEM usando diferentes
métodos para su obtención y expansión, recientemente la Sociedad Internacional
de Terapia Celular (ISCT, por sus siglas en inglés), ha propuesto a la comunidad
científica adoptar medidas estándares para la identificación de las CEM.
Así, la ISCT propone tres criterios:
1. Las células deben ser adherentes al plástico cuando son mantenidas en
cultivo;
2. deben ser positivas para los antígeno CD105, CD73 y CD90,
adicionalmente deben ser negativas para la expresión de los antígenos
hematopoyéticos tales como CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79, CD19 y
HLA-DR; y
3. deben ser capaces de diferenciarse hacia adipocitos, osteoblastos y
condroblastos (Dominici et al, 2006).
11
Figura 2. Representación de la multipotencialidad de la CEM. Se muestra el potencial de diferenciación de las CEM hacia tejidos de origen endodérmico: pulmón, hígado, intestino, riñón y bazo; mesodérmico: músculo esquelético, músculo cardíaco, tendón, cartílago, hueso; y ectodérmico: sistema nervioso. (Tomado de Fajardo-Orduña, 2008)
Características Biológicas de las CEMs
Desde el punto de vista funcional, las CEMs se caracterizan por tener actividad
inmunosupresora sobre células de la respuesta inmune, por lo cual son
considerados como supresores universales (Uccelli et al, 2007), debido a ello,
actualmente son utilizadas en el transplante alogénico de médula ósea para evitar
el rechazo de injerto contra huésped (Ringden O et al, 2006; y Le Blanc K et al,
2006). Las CEMs son capaces de inhibir la proliferación de los linfocitos T, aún
bajo condiciones de estímulo ya sea en presencia de mitógenos, aloantígenos o
anticuerpos tales como anti-CD3 y anti-CD28 (Rasmusson et al, 2003; Prevosto C
et al, 2007).
12
El efecto inmunosupresor mediado por las CEM, se ha atribuido a dos factores: la
secreción de factores solubles anti-proliferativos tal como el factor de crecimiento
de hepatocitos, prostaglandina E2, factor de crecimiento transformante beta-1,
indoleamina 2,3-dioxigenasa, óxido nítrico e interleucina-10 (Ucelli et al 2007;
Aggarwal S et al, 2005; Maccario R et al, 2005; Le Blanc K et al, 2006) (Figura 3).
Figura 3. Efecto supresor de las CEMs sobre las células del Sistema Inmune. La célula mesenquimal regula la actividad de los linfocitos B, linfocitos T, las NKs. Por lo tanto su actividad supresora es determinante en el inicio de una respuesta inmune secundaria. Tomado de Ida Rasmusson 2006.Elsevier. 2169-2179 y de Dugast AS and Vanhove B. 2009. Clin Exp Immunol. 1-10.
También se ha postulado que las CEM participan en la generación de linfocitos T
reguladores en los tumores, debido a que éstas se caracterizan por tener actividad
inmunosupresora de la respuesta inmune y por su capacidad de inducir, reclutar y
mantener la función de linfocitos T reguladores (Pittenger MF et al, 1999; Dominici
M et al, 2006; Prevosto C et al, 2007; Lanni MD et al, 2008).
13
Por otro lado, la interacción y el establecimiento de CEMs en tumores malignos ha
sido mostrada inicialmente por Studeny M et al, 2002 en un modelo in vivo de
ratones, al inyectar CEMs humanas marcadas con proteína verde fluorescente y
mostrar su migración hacia tumores de melanoma implantados. Asimismo, Djouad
et al, 2003; mostró en un modelo de ratón alogénico, que el co-transplante de
CEMs con células de melanoma, favorece el implante y crecimiento del tumor.
Otros autores como Karnoub et al, 2007; han mostrado en un modelo de
xenotransplante, que cuando CEMs de médula ósea humana son mezcladas con
células tumorales, se incrementa el potencial metastásico de varias líneas
celulares de cáncer de mama cuando son insertadas subcutáneamente en
ratones. Estos fenómenos se han atribuido a las características inherentes de
estas células estromales: a sus propiedades inmunosupresoras y a su habilidad
para migrar al sitio de la lesión vía secreción de quimiocinas por ejemplo
CCL5/RANTES (Karnoub et al, 2007).
Por otro lado, durante el desarrollo de tumores se llegan a perder los contactos
existentes entre células, lo cual puede contribuir a aumentar las capacidades
migratorias y de metástasis de algunas células. Además de la expresión de
citocinas como TGF-β pueden contribuir a la interacción de células estromales y
células malignas en el microambiente tumoral (Turley et al, 2008). En algunos
estudios se ha demostrado que las CEM provenientes de médula ósea
contribuyen en el microambiente tumoral influenciando el crecimiento y la
progresión del tumor (Hung et al, 2005; Nakamizo et al, 2005; Nakamura et al,
2004). Existe evidencia experimental de que las CEMs migran hacia sitios de
formación del tumor y se incorporan dentro del microambiente tumoral, se ha
propuesto que las propiedades inmunosupresoras de las CEM permiten la
proliferación de las células del tumor y la estimulación de la formación de vasos
sanguíneos (Zhu et al, 2006).
14
Aunque la evidencia de que las CEMs son participantes activas en el cáncer, los
informes de la presencia de CEM en tumores es muy limitada y todavía se
desconoce cómo éstas actúan recíprocamente con las diferentes células
cancerosas, debido a que las interacciones célula-célula son muy específicas para
cada tipo de cáncer (Jodele et al, 2006). En el caso particular de CaCu,
recientemente se reportó un estudio donde aislaron e identificaron CEMs de tejido
de cáncer cérvico-uterino. Los resultados de esta investigación demostraron que
las células aisladas tenían morfología fibroblastoide y crecían en colonias, su
inmunofenotipo reveló que son positivas para CD13, CD29, CD44, CD105 y HLA-I
y que además tienen la capacidad de diferenciarse a osteocitos, adipocitos y a
hepatocitos (Sun et al, 2010).
15
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El cáncer cérvico-uterino (CaCu) es un problema importante de salud pública, ya
que constituye una de las principales causas de mortalidad entre las mujeres
Mexicanas con cáncer (INEGI, 2008). Cada año se diagnostican alrededor de
11,000 casos nuevos de cáncer cérvico uterino invasor. La mayoría de las
pacientes ingresan con enfermedad avanzada, con un mal pronóstico y
representan una enorme pérdida de recursos humanos y económicos. Esta
enfermedad se encuentra fuertemente asociada (cercana al 100%) con la
infección por el virus de papiloma humano (HPV) de alto riesgo (Walboomers et al,
1999). La presencia de HPV en este tipo de cáncer genital, también se ha
asociado con la falla en la respuesta inmune mediada por linfocitos T auxiliares
tipo Th1 y por linfocitos T citotóxicos; debido a que la durante el desarrollo de la
enfermedad se genera tolerancia inmunológica hacia el tumor, con la
concomitante aparición de células inmunosupresoras tales como: linfocitos T
reguladores, macrófagos asociados a tumores, fibroblastos y células estromales
mesenquimales (CEMs) entre otras. Sin embargo, poco se sabe sobre los
mecanismos mediante los cuales éstas regulan e inhiben el reconocimiento
inmune mediado por linfocitos T citotóxicos (Visser J et al, 2000; Molling J.W. et al,
2007; Nakamura T et al, 2007; Piersma S et al, 2007). Recientemente nuestro
grupo de investigación ha logrado obtener y caracterizar CEMs de tejidos
normales (Montesinos JJ et al, 2009) de cuello uterino y de tumores avanzados
de cáncer cérvico-uterino (Montesinos JJ et al, 2012; manuscrito en preparación).
Tomando en consideración que las CEMs poseen varios mecanismos con función
inmunosupresora, dentro de los cuales destaca la presencia de la ectoenzima
CD73, la cual participa en la producción de adenosina, una molécula inhibitoria de
la proliferación y activación de linfocitos T citotóxicos (Decking et al, 1997;
Synnestvedt et al, 2002; Kobie et al, 2000; Deaglio et al, 2007 y Resta et al,1998),
en el presente trabajo se analizó la actividad funcional de CD73 en CEMs
obtenidas de tumores de CaCu y su participación en la función efectora de
linfocitos T citotóxicos (LTC).
16
HIPÓTESIS
Se sabe que durante el desarrollo del cáncer se acentúa la falla de la respuesta
inmune celular hacia células infectadas por virus y células tumorales con la
concomitante aparición de poblaciones celulares inmunosupresoras como los
linfocitos Treg, macrófagos, células dendríticas foliculares y CEMs entre otras.
Uno de los mecanismos de supresión inmunológica ejercido por estos tipos
celulares es a través de la vía adenosinérgica, comprendida por la degradación de
AMP extracelular por medio de la molécula CD73 para generar adenosina cuya
función es inhibir la activación y función efectora de linfocitos T citotóxicos (LTC)
por su interacción sobre los receptores de alta afinidad A2a.
Recientemente nuestro grupo de investigación ha logrado obtener y caracterizar a
las CEMs de tumores de CaCu positivas para el marcador CD73, por lo cual se
espera que CEMs derivadas de tumores de CaCu tengan efecto inmunosupresor
sobre la proliferación y función efectora de LTC a través de la generación de
adenosina.
17
OBJETIVO GENERAL
Analizar la actividad inmunosupresora de las CEMs derivadas de los diferentes
tejidos cervicales (Cérvix Normal, con NIC y CaCu) a través de la vía CD73.
OBJETIVOS PARTICULARES
Obtención y caracterización de CEMs derivadas de los tejidos cervicales
(Cérvix normal, NIC y CaCu).
Analizar la expresión de las moléculas CD73 y A2a en CEMs derivadas de
los tejidos cervicales.
Analizar la actividad enzimática de CD73 de las CEMs para degradar AMP
a Adenosina.
Evaluar el efecto supresor de la adenosina generada por las CEMs sobre
la proliferación de LTC.
Evaluar el efecto supresor de la adenosina generada por las CEMs sobre la
función efectora de LTC.
18
MATERIALES Y MÉTODOS
Material Biológico.
Las muestras biológicas fueron obtenidas a partir de biopsias cervicales de
mujeres con neoplasias intraepiteliales (NIC), con cáncer cérvico-uterino (CaCu) y
con Cérvix normal sin infección por HPV. También se emplearon muestras de
20mL de sangre periférica de donadores normales.
Las biopsias se tomaron mediante colposcopia y fueron trasladadas en
condiciones de esterilidad en tubos conteniendo medio de cultivo RPMI-1640
(Gibco, BRL, New York, USA) suplementado con 10% de suero fetal de bovino
(SFB) y una mezcla de antibióticos (100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de
estreptomicina) para su procesamiento en el laboratorio.
Obtención de las Células Estromales Mesénquimales (CEMs) (Objetivo 1).
Las muestras de tejido cervical, se colocaron en una caja de Petri y se lavaron con
PBS para quitar el exceso de sangre. La muestra lavada se colocó en otra caja
para fragmentarla en pedazos pequeños de aproximadamente 2 mm3, los cuales
se colocaron en un frasco de cultivo de 25 cm2 (Corning, Inc Costar, New Cork,
USA) en presencia de 8 ml de una solución con 0.05% de tripsina y 0.02% de
EDTA (Gibco). El frasco se mantuvo en incubación durante 15 min en agitación
constante para homogeneizar el disgregado. La suspensión celular fue colectada y
vertida a un tubo y fue centrifugada durante 5 min a 1300 rpm. El botón celular fue
resuspendido en medio de cultivo DMEM bajo en glucosa (DMEMbg) (del inglés,
lg-Dulbecco’s Modified Eagle Media) suplementado con 15% de SFB (Gibco) y se
procedió a contar el número de células viables por exclusión del colorante azul de
tripano (Gibco).
19
Las células se sembraron en placas de 6 pozos (Corning), a una densidad de
50,000 a 300,000 células/ml, en un medio comercial específico para células
mesenquimales (MesenCultTM; Stem Cell Technologies [STI], Vancouver, BC,
Canadá), manteniéndose en incubación a 37°C en atmósfera húmeda y con 5% de
CO2. Se realizaron cambios de medio cada tercer día. Una vez que llegaron a la
confluencia del 100%, las células se colectaron utilizando una solución de tripsina
(0.05% EDTA 0.053mM; Gibco) incubando durante 5 minutos a 37°C, se lavaron
con PBS suplementado al 2% con SFB y se centrifugaron durante 5 min a 1200
rpm. El botón celular fue resuspendido en medio DMEM bajo en glucosa
(DMEMbg) y se resembró en botellas Falcon de 75 cm2 (Becton Dickinson) a una
densidad de 103 células/cm2.
La población de células mesenquimales obtenidas de esta última resiembra fue
utilizada en los diferentes ensayos.
Inmunofenotipo de las CEMs
Para conocer el inmunofenotipo de las CEMs, se analizó la expresión de algunos
antígenos de superficie mediante la técnica de citometría de flujo en un equipo de
FACS-Calibur (Becton Dickinson). Se cultivaron 2x105 células, se colocaron en
PBS con 2% de SFB y se incubaron durante 30 min en hielo y en obscuridad con
cada uno de los siguientes anticuerpos monoclonales: anti-CD13-PE, anti-CD14-
PE, anti-CD29-FITC, anti-CD31-FITC, anti-CD34-FITC, anti-CD44-PE, anti-CD54-
PE, anti-CD105-PE, anti-HLA-DR-PE, anti-CD54-PE (Caltag Laboratories,
Burlingame, CA, USA), anti-CD49b-PE, anti-CD73-PE, anti-CD166-PE y anti-HLA-
ABC-FITC (Beckton Dickinson/PharMingen), anti-CD90-FITC (Immunotech,
Marseille, France).
Como controles se incluyeron a las células teñidas con los correspondientes
testigos de isotipo dependiendo de los anticuerpos primarios utilizados: IgG2a-PE,
IgG1-FITC (Caltag Laboratories). Las células teñidas se analizaron contando
10,000 eventos en el citómetro de flujo.
20
Capacidad de diferenciación osteogénica, condrogénica y adipogénica.
Inducción osteogénica:
Se cultivaron 1x104 CEM en cámaras Lab-Tek II (Chamber Slide System, Nunc,
Naperville, IL, USA) con medio DMEMbg suplementado con 15% de SFB o en
presencia de medio de diferenciación osteogénica (Stem Cell KitTM, STI) durante
4 semanas y se realizaron cambios de medio cada 3 días. El medio osteogénico
consistió de medio DMEMbg suplementado con dexametasona 10-8 M, ácido
ascórbico 0.2 mM, β-glicerol fosfato 10 mM y 15% de suplemento osteogénico. La
detección de la diferenciación se realizó mediante la técnica de Von Kossa (Kern
et al, 2006). Al término de las 4 semanas de cultivo con el medio de diferenciación
osteogénica, éste se retiró de la caja y se adicionó PBS durante 10 min.
Se desechó el PBS y se colocó nitrato de plata dejándolo reposar durante 3 horas
expuesto a la luz. La capa celular se lavó con agua destilada y se adicionó
hiposulfito de sodio al 5% durante 2 min. Se lavó con agua destilada y se contrastó
con azul de toluidina al 1% por 2 min. Se deshidrató con diferentes
concentraciones de etanol (al 80%, 90% y absoluto) y xilol grado histológico y se
montaron las laminillas con resina. Los depósitos de calcio se tiñeron de color café
a negro. Se determinó el porcentaje de positividad al analizar la cámara de cultivo
bajo el microscopio.
Inducción condrogénica:
Se obtuvieron 2.5x105 CTM en 500 l de medio de diferenciación condrogénico
(Cambrex Bio Science, Maryland, USA), se colocaron en un tubo de 15 ml de
propileno. Las células se centrifugaron durante 5 min a 1000 rpm para formar una
micromasa al fondo del tubo. Se cultivaron durante 4 semanas y se realizaron
cambios de medio cada 3 días.
21
El medio condrogénico que consiste en medio basal de diferenciación
condrogénica suplementado con dexametasona, piruvato de sodio, prolina,
suplemento ITS+, ascorbato, penicilina/estreptomicina y L-glutamina. Se cultivó
por 4 semanas. Al término de las 4 semanas de cultivo con medio de
diferenciación condrogénica, se desechó el medio, se fijó la micromasa con
formaldehído durante 30 min y se deshidrató en diluciones de etanol (al 80%, 90%
y absoluto) y xilol grado histológico durante 30 min con dos repeticiones cada una.
La micromasa se embebió en parafina y se hicieron cortes histológicos con ayuda
de un micrótomo. La detección de la diferenciación condrogénica se realizó con la
tinción de azul anciano (Sigma-Aldrich) para observar positividad de
mucopolisacaridos.
Inducción adipogénica:
Se cultivaron 1x104 CTM en cámaras Lab-Tek II (Nunc) con medio DMEMbg
suplementado con 10% de SFB o en presencia de medio de diferenciación
adipogénica (AM, STI) durante 4 semanas y se realizaron cambios de medio cada
3 días. El medio adipogénico consiste de DMEMbg al 15% de suplemento
adipogénico. La detección de la diferenciación adipogénica se realizó con la
tinción de rojo oleoso (Sigma–Aldrich) (Kern et al., 2006).
Al término de las 4 semanas de cultivo con el medio de diferenciación
adipogénico, éste se desechó de la caja y se adicionó PBS durante 10 min. Se
desechó el PBS y la capa celular se fijó con formalina al 10% durante 1 hora. Se
adicionó isopropanol al 60% durante 5 min, y posteriormente se adicionó rojo
oleoso durante 20 min. Se lavó con agua destilada y se contrastó con hematoxilina
de Harris por 1 min. Las laminillas se montaron con propilénglicol. Los lípidos se
tiñen de color rojo. Se determinó el porcentaje de positividad después de analizar
la cámara de cultivo bajo el microscopio.
22
Expresión de CD73 y receptor para Adenosina (A2a) en las CEMs obtenidas
de tejido cervical normal, con NIC y CaCu (Objetivo 2).
Se cultivaron 1.6x105 CEMs en cámaras Lab-Tek II (Chamber Slide System, Nunc,
Naperville, IL, USA) con medio DMEMbg suplementado con 15% de SFB
derivadas de cada uno de los tejidos cervicales ya mencionados, se fijaron con
paraformaldehído al 1% y se procedió a realizar las inmunocitoquimicas:
Se colocó el amortiguador de bloqueo y permeado por 30 minutos, se lavó con
solución de lavado (PBS, 0.05M Tris-Base. pH 7.2-7.6). Se eliminó el exceso de
agua, se agregó una gota o dos según fuera necesario para cubrir la muestra con
peróxido de hidrógeno al 3%. Se protegió la placa con parafilm y se incubó por
cinco minutos. Se enjuagó delicadamente con solución de lavado (PBS al 2% de
SFB), y se colocó en un baño con amortiguador fresco.
Anticuerpo Primario
Se eliminó el exceso de amortiguador y se secó cuidadosamente alrededor de la
muestra, se agregó el anticuerpo primario (Anti-Adenosine Receptor A2a clone
monoclonal antibody y Mouse anti CD73 E5NT, NT) y se cubrió la muestra con
parafilm evitando que se secaran, se incubo por 30 minutos, se enjuagó
delicadamente con solución de lavado y se colocó en un baño con amortiguador
fresco.
Unidor
Inmediatamente se eliminó el exceso de amortiguador y se secó alrededor de la
muestra, se agregó una gota de la solución de unión (LINK), se cubrió la muestra
con parafilm, se incubo por 30 minutos y se enjuago delicadamente con solución
de lavado. Se dejó en un baño con amortiguador fresco.
23
Estreptadivina - Peroxidasa
Se eliminó el exceso de amortiguador y se secó cuidadosamente alrededor de la
muestra, se agregó una gota de estreptavidina y se cubrió la muestra con parafilm,
se incubo por 30 minutos, se enjuagó delicadamente con solución de lavado,
dejándolo en baño con amortiguador fresco.
Solución de Sustrato- Cromógeno
Se eliminó el exceso de amortiguador, se secó, se agregó la solución de sustrato-
cromógeno preparado y se cubrió la muestra con parafilm, incubando por 5
minutos, enjuagando delicadamente con agua destilada.
Contratinción
Se cubrió la muestra con hematoxilina, se dejo incubar de 2 a 5 minutos
dependiendo de la hematoxilina usada, se enjuagó delicadamente con agua
destilada, sumergiendo la muestra 10 veces en agua de amonia. Se colocó la
muestra en agua destilada o des-ionizada por dos minutos. Se deshidrató la
muestra, se montaron con resina y se analizó la expresión de A2A en membrana y
de manera intracelular a través de un microscopio óptico tomándose fotografías de
las tinciones que se realizaron.
Actividad Enzimática de CD73 para la generación de Adenosina a partir de
AMP (Objetivo 3).
Con la finalidad de evaluar la capacidad de las moléculas CD73, expresadas en
las CEMs derivadas de los tejidos cervicales, para convertir Adenosina
Monofosfato (AMP) a Adenosina (ADA), 50,000 células viables de cada una de las
CEMs, contadas con ayuda de un hemocitómetro y azul de tripano, se depositaron
por duplicado en placas de 96 pozos de fondo U en medio de cultivo DMEMbg
suplementado con 10% de sustituto de suero (Invitrogen USA). En uno de los
pozos se colocó AMP a una concentración final de 2.5mg/mL y en el segundo
pozo las células se preincubadas durante 15 minutos con 2.5mg/mL del inhibidor
24
de CD73, Adenosina metileno difosfato (AMD), y posteriormente se adicionó el
sustrato AMP a una concentración final de 2.5mg/mL y un volumen final de 200
L. Después de que se adicionó el sustrato, las células se resuspendieron
inmediatamente, se tomó una alícuota de 1L (Tiempo cero) y las células se
incubaron a 37°C, humedad saturante y 5% de CO2. A partir de ese momento y en
cada hora de incubación (1-5 horas aprox.), se tomaron muestras de 1L de la
suspensión celular.
Cromatografía en capa fina
La conversión de AMP a Adenosina efectuada en los cultivos de CEMs, se
visualizó a través de cromatografía en capa fina utilizando laminillas fluorescentes
de poliéster que contienen silica gel (Sigma USA). Como estándares de cada una
de las cromatografías de capa fina se emplearon soluciones de 2.5 mg de
Monofosfato de Adenosina (AMP) (Sigma, Life Science) y de Adenosina 99%
(Sigma, Life Science) y 5 mg de Adenosina Metileno Difosfato (AMD) (Sigma, Life
Science), inhibidor de la enzima CD73, los cuales se resuspendieron en 1 ml de
DMEM con 10% de sustituto de suero y posteriormente se filtraron. Un l de cada
uno de los estándares, así como de las alícuotas tomadas en los diferentes
tiempos (1-5 hrs) se colocaron en las laminillas (3x8cm) de CCF y se dejaron
adsorber durante 30 minutos. Después de este tiempo las laminillas se colocaron
verticalmente en una cámara de elución que contenía 2ml de una mezcla de
solventes orgánicos (Fase móvil) compuesta por: isobutanol: alcohol isoamilico:
etoxietanol: amoniaco: agua (9:6:18:9:15). La fase móvil se dejó correr durante 1
hr y posteriormente las laminillas se retiraron de la cámara de elución para su
secado a temperatura ambiente. Finalmente los compuestos AMP y ADA se
visualizaron y se fotografiaron con un transiluminador con luz UV.
Debido a que las estirpes de CEMs derivadas de tejido con NIC ya no fueron
viables solo se realizaron los ensayos con la adenosina que generaron las CEMs
de Cérvix Normal y de CaCu para evaluar el efecto inhibitorio que ejerce esta
adenosina.
25
Evaluación del efecto supresor de la adenosina generada por las CEMs de
Cérvix Normal y de CaCu sobre la proliferación de LTC (Objetivo 4).
Obtención y cultivo de Linfocitos de Sangre Periférica (LSP)
Con la finalidad de obtener células mononucleares de sangre periférica para
evaluar la capacidad inmunosupresora de adenosina en la proliferación de
linfocitos, se tomaron 10-15 mL de sangre periférica de un donador sano mediante
punción en la vena de un brazo empleando tubos vacutainer con anticoagulante
(ACD) (Becton, Dickinson, USA). En condiciones de esterilidad la muestra de
sangre fue procesada y centrifugada a 2000 rpm durante 10 minutos para separar
el plasma (fase superior) del paquete celular (fase inferior). Con ayuda de una
pipeta serológica se retiró el plasma y se colocó en otro tubo para eliminar las
proteínas de complemento mediante baño maría a temperatura de 56°C durante
30 minutos. La fase inferior que contiene el paquete celular, fue trasvasada a un
tubo Falcon de 50 mL para lavar las células con PBS. Después de dos lavados, el
paquete celular se diluyó con igual volumen de PBS y la mezcla se adicionó a otro
tubo Falcon que contenía 10 mL de Ficoll (Linfograde Microlab, Mex) con una
densidad de 1.077 g/mL. Posteriormente el tubo fue centrifugado durante 30
minutos a 1000 rpm. Por consiguiente, la banda blanca, que contenía a los
linfocitos, situada en la interfase, fue retirada lentamente del gradiente y los
linfocitos finalmente fueron resuspendidos con medio ISCOVES´S modificado con
10% de suero autólogo libre de complemento, 4mM de L-glutamina, 1 mM de
Piruvato de Sodio, 20 M de 2-Mercaptoetano y una mezcla de aminoácidos no
esenciales (Gibco BRL, USA), además de antibióticos (penicilina 100U/mL y
estreptomicina 100g/mL).
26
Cultivo de LSP con la adenosina producida de la actividad enzimática de
CD73 de las CEMs de Cérvix Normal y CaCu.
Los LSP obtenidos por Ficoll fueron sembrados por triplicado a una concentración
de 50,000/100 µl conteniendo diluciones de los sobrenadantes de la degradación
de AMP a Adenosina en las CEMs de Cérvix Normal y CaCu, aproximadamente a
una concentración final de 10 µg/mL tomando como base que la concentración
inicial de AMP fue de 2.5mg/mL. Para inducir la proliferación de los linfocitos T se
adicionaron perlas conteniendo anti-CD3/CD28 (Dynanbeads, Invitrogen USA) en
una proporción 1:10 de perlas: LSP. Por otro lado, con la finalidad de evaluar de
manera simultánea el bloqueo del efecto inmunosupresor de adenosina sobre la
proliferación de LSP, se adicionó cafeína (J.K Baker,USA), un agente bloqueador
de los receptores para adenosina (A2a, A2b, A1, A3) en los linfocitos T, a una
concentración final de 300 µM. LSP sembrados en presencia de perlas co-
estimuladoras (control positivo de proliferación), con medio solo, con AMP , con
Adenosina, con cafeína y con adenosina-cafeína fueron sembrados de manera
independiente para establecer los controles correspondientes.
Marcaje y conteo de proliferación de linfocitos T cultivados con la adenosina
producida por CD73 de las CEMs Cérvix Normal y CaCu.
Después de 72 horas de cultivo, los linfocitos T fueron marcados con 1 µCi de
timidina tritiada [3H] (Dupont, USA) por cada pozo y se dejaron en cultivo por 24
horas más. La placa de 96 pozos fue almacenada a -70°C con la finalidad de
detener la proliferación de linfocitos. Las células fueron cosechadas con ayuda de
una cosechadora de células (marca Brandel modelo MH-12 USA) y la
incorporación de [3H] en los linfocitos T fue determinada con ayuda de un contador
de centelleo automático (Beckman modelo LS 6,500 USA).
27
Finalmente se determinó el porcentaje de inhibición en la proliferación inducido por
cada uno de los sobrenadantes empleando la siguiente fórmula:
%inhibición = 1- ((cpm de los linfocitos cultivados con sobrenadantes/cpm de los
linfocitos cultivados con perlas anti- CD3/CD28)) X 100
Evaluar el efecto supresor de la adenosina generada por las CEMs de Cérvix
Normal y CaCu sobre la función efectora de LTC. (Objetivo 5)
Obtención de LTCs específicos al péptidos E7 YMLDLQPETT (11-20)
Se extrajeron 3 tubos de sangre periférica de donadores normales positivos al
alelo HLA-A2 en su haplotipo HLA clase I del Complejo Principal de
Histocompatibilidad, el cual fue determinado con ayuda del anticuerpo monoclonal
BB7.2 con especificidad para el alelo HLA-A2. Las muestras sanguíneas se
centrifugaron a 2000 rpm para separar el plasma, el cual se colectó en un tubo
falcon de 15 ml para ser desactivado a 56°C por media hora. Al paquete celular se
le adicionó la misma cantidad de PBS, se homogenizó y fue transferido a otro tubo
falcon que contenía 3 ml de Ficoll por cada 10 ml del homogenizado (Histopaque
Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) y se centrifugó por 30 min a 1000rpm, para
obtener tres fases, de las cuales se retiró la parte intermedia conteniendo las
células mononucleares en una capa blanquecina. Las células mononucleares
fueron lavadas con 10 ml PSB aproximadamente, posteriormente se colocaron en
una placa de cultivo de 5 ml con medio IMDM al 10% de suero autólogo humano
por una hora, después se retiró el sobrenandante y a las células adherentes se les
realizó un lavado con PBS, se les agregó 2 ml de medio IMDM al 10% suero
autólogo humano más 30ng/ml de GMC-SF y 20ng/ml de IL-4 con la finalidad de
inducir la diferenciación de células dendríticas (CDs). Al cabo de 5 a 7 días se
retiraron las CDs de la caja de cultivo, se centrifugo y se pulsaron con el péptido
YMLDLQPETT (11-20) de la proteína E7 de HPV-16 específico para el alelo HLA-
A2, a una concentración de 50g/ml, después de 1 hora se le agregó poly I:C a
una concentración de 20mg/ml para inducir la maduración de las CDs.
28
Tres días después, nuevamente se extrajeron células mononucleares del mismo
donador y los linfocitos no adherentes fueron co-cultivados con las CDs
previamente inducidas y maduradas; mientras que la población adherente fue
cultivada par inducir más CDs. Los linfocitos no adherentes fueron re-estimulados
nuevamente con las CDs cargadas con el péptido YMLDLQPETT y posteriormente
fueron utilizados para los ensayos de actividad citotóxica sobre células blanco.
Después de los estímulos se procedió a purificar a la población positiva para
CD8+ mediante un kit (EasySep Human CD8+ T Cell Enrichment Kit).
Brevemente, los linfocitos totales fueron contados y en un tubo de 5 ml se
colocaron 10 millones/ml de PBS y 10l de un coctel de anticuerpos que
reconocen a las subpoblaciones de mononucleares diferentes a CD8+, después
de 10 minutos de incubación se adicionaron 10uL de perlas magnéticas con
afinidad a la porción Fc de los anticuerpos y se incubó el tubo durante 10 minutos.
Posteriormente el tubo fue colocado en un magneto para separar las poblaciones
celulares reconocidas por los anticuerpos. Los linfocitos del sobrenadante (CD8+)
fueron colectados y depositados en otro tubo para su lavado con PBS y se
procedió a contar nuevamente.
La especificidad de los linfocitos estimulados con péptido fue analizada a través
del uso de pentámeros HLA-A2/ péptido YMLDLQPETT (11-20) marcados con
Ficoeritrina (ProImmune Ltd, UK) y con anticuerpos anti CD8+ (BD, USA)
mediante citometría de flujo (ver adelante).
Los linfocitos purificados fueron distribuidos de la siguiente manera para evaluar
su actividad citotóxica sobre células T2 cargadas con el péptido antigénico
YMLDLQPETT (ver adelante).
29
1. LT CD8+ específicos para péptido E7 + T2 pulsada con péptido E7
(Control + de citotoxicidad)
2. LT CD8+ para péptido E7 + Adenosina generada por la CEM-Cérvix
Normal ó de CEM-CaCu + T2 pulsada con péptido E7
3. LT CD8+ para el péptido E7 + Adenosina generada por la CEM-Cérvix Normal
ó de CEM-CaCu + Cafeína + T2 pulsada con el péptido E7
4. LT CD8+ para péptido E7 + Cafeína + T2 pulsada con el péptido E7
5. LT CD8+ para péptido E7 + Adenosina sintética + T2 pulsada con el péptido E7
6. LT CD8+ para péptido E7 + Adenosina sintética + Cafeína + T2 pulsada con el
péptido E7
7- LT CD8+ para el péptido E7 + T2 vacia (sin pulso de péptido)
(Control (–) de citotoxicidad)
Para la función efectora se establecieron co-cultivos de LT con las células blanco
(T2 cargadas con el péptido) en proporción 20:1 en un volumen final de 200uL de
medio IMDM suplementado al 10% con suero autólogo humano conteniendo 10uL
del anticuerpo CD107 (BD, USA), después de 1 hora de incubación se le agregó
50 l de monensina para dar una concentración final de 10mM en cada pozo.
Después de 3 horas de incubación se cosecharon los linfocitos y se centrifugaron,
se les realizó 2 lavados con PBS al 2% SFB. Se procedió a marcar con CD8+ APC
a una dilución de 1:50 de PBS al 2% PBS y se incubó por 20 min a 4°C. Se
realizaron 2 lavados para retirar exceso del anticuerpo y se dejaron fijadas en
100l de PBS al 2%SFB más 100 l de paraformaldheído al 4% para su posterior
lectura al citómetro de flujo.
30
Detección de linfocitos T específicos para el péptido YMLDLQPETT.
Para corroborar la especificidad de la población de linfocitos al péptido
YMLDLQPETT (11-20) de la proteína E7 de HPV-16, se emplearon pentámeros
específicos para este péptido HLA-A2/ YMLDLQPETT (ProImmune Ld, GB). Para
ello, se tomaron 500,000 linfocitos de los que previamente se generaron por
estímulos con las CDs pulsadas con el péptido E7 YMLDLQPETT (11-20), se
agregaron 10 l de la suspensión de pentámero por 20 min a temperatura
ambiente después se lavaron los linfocitos con PBS y se procedió a marcar con
CD8+ APC.
Células Blanco.
Como célula blanco, se utilizó la línea linfoblástica denominada T2 (Hosken y
Bevan 1990), la cual expresa moléculas vacías HLA-A*0201 en membrana celular,
las cuales fueron re-establecidas con la adición del péptido antigénico E7
YMLDLQPETT (11-20) de HPV-16 a una concentración de 10ug/mL en incubación
de las células T2 (105) durante toda la noche.
31
RESULTADOS
Obtención de CEMs derivadas de tejido cervical normal, NIC y con CaCu
(Objetivo 1).
Para la realización de este proyecto de investigación se obtuvieron CEMs de tejido
cervical normal (CxN), de cérvix con neoplasia intraepitelial cervical (NIC) y cáncer
cérvico-uterino (CaCu). Cada una de las CEMs generadas fue caracterizada con
base en los criterios establecidos por la Sociedad Internacional de Terapia Celular,
para definir a las CEMs (Dominici et al., 2006), antes ya mencionadas por lo que
se encontró que las CEMs obtenidas tuvieron la capacidad de:
1.-Ser adherentes en condiciones estándar de cultivo.
2.-Expresaron los marcadores CD105, CD73 y CD90 y carecieron de los
marcadores de superficie CD45, CD34, CD14/CD11b, CD79/CD19 y HLA-DR en
la membrana celular.
3.-Tuvieron la capacidad de diferenciarse a osteoblastos, adipocitos y
condroblastos.
Todas las CEMs obtenidas proliferaron de manera adherente a la caja de cultivo y
su morfología fue variada, distinguiéndose esencialmente 8 tipos morfológicos:
grande, romboide, lamelipodia-lamelipodia, lamelipodia-filopodia, filopodiafilopodia,
triangular, neurítica y pequeña, los cuales fueron encontrados en CEMs derivadas
de médula ósea, referidas previamente por Montesinos et al, 2009. Los
porcentajes entre los tipos morfológicos fueron muy heterogéneos entre las
diferentes CEMs obtenidas de los tejidos cervicales. Cabe destacar que la
morfología romboide fue muy frecuente en las CEMs derivadas del tejido cervical
con NIC con un 54.95+16%, la morfología pequeña en las CEM de cérvix normal
con un 33.1+2.3% y la morfología triangular en las CEM de CaCu con 27.14+20.22
(Figura 4).
32
Figura 4. Caracterización morfológica de las células estromales mesenquimales (CEMs). CEMs obtenidas de tejido cervical normal (CxN), neoplasia intraepitelial cervical (NIC), cáncer cérvico-uterino (CaCu) y médula ósea normal (MO), fueron analizadas con base a los tipos morfológicos previamente reportados (Montesinos et al, 2009). Los resultados se presentan en porcentajes de cada tipo morfológico y corresponde a la media de los valores obtenidos a partir de 5 líneas establecidas de CEMs por cada tipo histológico.
Por otro lado, al determinar el inmunofenotipo de las diferentes CEMs, se
detectaron los marcadores típicos (CD105, CD73 y CD90) en un 96 a 100% de las
células. Además los marcadores CD13, CD44, CD166, CD29, CD49b, y HLA-ABC
también se encontraron aumentados en porcentajes similares. Asimismo, como
era de esperarse, las CEMs tuvieron baja expresión de los marcadores típicos de
las células hematopoyéticas, CD34, CD14/CD11b, CD79/CD19 y HLA-DR (Tabla
1).
33
Tabla 1. Caracterización inmunofenotípica de las CEMs. Promedio del porcentaje células que expresan los marcadores de superficie de las CEMs, obtenidas de tejido cervical normal, con NIC y con CaCu mediante citometría de flujo. En azul se denota el porcentaje de CEMs positivas a CD73.
Inmunofenotipo de
las CEMs
CEM
CxN
CEM
NIC
CEM
CaCu
Marcador Promedio %
(intervalo)
Promedio %
(intervalo)
Promedio %
(intervalo)
CD105 99.6625
(99.92-99.41)
71.37
(92.27-50.48)
96.29
(99.5-89.1)
CD73 99.9966667
(100-99.99)
98.80
(99.23-98.38)
99.02
(100-97.8)
CD90 99.694
(99.90-99.00)
96.07
(99.33-92.82)
96.16
(100-86.8)
CD13 99.98
(100-99.97)
99.59
(99.75-99.44)
99.85
(100-99.6)
CD44 99.39
(99.97-98.90)
93.46
(99.56-87.36)
99.60
(99.9-99.3)
CD166 99.9166667
(99.90-99.80)
30.63
(0.95-0.31)
75.69
(100-12.22)
HLA-ABC 99.692
(99.99-99.00)
87.11
(96.07-78.16)
97.81
(100-96)
CD29 99.604
(99.99-99.87)
99.07
(99.12-99.03)
97.61
(99.9-95)
CD49b 99.94
(100-99.80)
93.09
(98.77-87.42)
99.75
(100-99.5)
CD14 1.072
(1.55-0.40)
4.15
(8.28-0.02)
2.45
(4-0.13)
CD31 1.91333333
(1.77-2.59)
0.99
(1.90-0.09)
1.34
(1.9-.028)
CD34 4.0525
(7.68-0.96)
0.94
(1.86-0.03)
1.06
(2-0.25)
HLA-DR 1.686
(3.40-0.45)
0.18
(0.35-0.02)
0.87
(1.2-0.21)
CD54 87.1325
(95.17-77.50)
58.17
(60.01-56.34)
64.61
(71.77-47.72)
34
Capacidad de diferenciación de las CEMs.
Capacidad de diferenciación osteogénica. Después de haber cultivado las
CEMs de cérvix normal y de las biopsias de NIC y CaCu con medio inductor
durante 4 semanas, se observaron depósitos de calcio al realizar la tinción con
Von Kossa, lo que confirma la capacidad de las estirpes de CEM para
diferenciarse a osteocitos (Figura 5).
Capacidad de diferenciación condrogénica. Después de cultivar las CEMs con
medio de diferenciación para condrocitos durante 4 semanas, se obsevó la
formación de micromasas, las cuales al ser incluidas en parafina y cortadas en
laminillas mostraron tinción positiva a azul alciano, la cual es específica para
identificar mucopolisacáridos. Asimismo, las preparaciones celulares también
fueron positivas a la tinción con tricrómico de Masson para determinar la presencia
de colágeno, típica de condrocitos. Comprobándose entonces, que las CEMs
obtenidas de los diferentes tejidos cervicales tienen la capacidad de diferenciarse
hacia condrocitos (figura 5).
Capacidad de diferenciación adipogénica. Después de haber cultivado las
diferentes CEMs con medio de diferenciación específico para adipocitos durante 4
semanas, se observó la formación de células con vacuolas lipídicas, las cuales
fueron detectadas mediante la tinción con rojo oleoso. Todas las estirpes de las
CEMs derivadas de los diferentes tejidos cervicales, mostraron pequeñas
vesículas teñidas con rojo oleoso, asumiéndose entonces la capacidad de
diferenciación de las diferentes CEMs a adipocitos (Figura 5).
35
Figura 5. Capacidad de diferenciación osteogénica, condrogénica y adipogénica de las CEMs. Se muestran las CEMs obtenidas de tejido cervical normal, NIC y de CaCu con las diferentes tinciones para determinar su capacidad de diferenciación: las flechas rosas muestran las vesículas lipídicas teñidas con rojo oleoso y las flechas en naranja señalan depósitos de calcio en color marrón después de la tinción con Von Kossa. Las fotografías de adipogénesis y osteogénesis muestran un aumento de 40X (barra escala=20μm). Las fotografías de condrogénesis, teñidas con azul alciano, muestran la detección de mucopolisacaridos, aumento de 10X, (Barra escala=200μm).
Detección de CD73 y receptor A2a en las CEMs derivadas de tejidos
cervicales (Objetivo 2).
En la Figura 6 se observa la expresión de CD73 en membrana y núcleo de las
CEMs derivadas de los tejidos cervicales con NIC y CaCu. Las CEMs derivadas
de CaCu mostraron una intensa expresión del marcador CD73 en citoplasma y
núcleo en relación a las CEMs obtenidas de médula ósea o de NIC, sugiriendo
una alta actividad de esta enzima CEMs de tejidos tumorales. De manera
interesante también fue posible detectar la expresión del receptor A2a de alta
afinidad para adenosina en las diferentes CEMs, su expresión fue de manera
notable en citoplasma y núcleo.
36
Figura 6. Expresión de CD73 y del receptor A2a en las CEMs. CEMs obtenidas de tejido cervical normal, NIC y de CaCu fueron cultivadas en laminillas y posteriormente teñidas con los anticuerpos anti CD73 y anti receptor A2a. Aumento 20x.
Análisis de la actividad enzimática de CD73 en las CEMs. (Objetivo 3).
Con la finalidad de analizar la actividad funcional de CD73 en las CEMs, se
procedió a analizar su capacidad de convertir AMP a adenosina. Para ello las
CEMs fueron incubadas en presencia de 2.5mg/mL del sustrato AMP o en
presencia de 2.5mg/mL del sustrato AMP y de 2.5mg/ml del inhibidor competitivo
de CD73, Adenosina Metileno Difosfato (AMD). Como puede observarse en la
Figura 7, CEMs obtenidas de tejido cervical normal y de CaCu convirtieron
completamente el sustrato AMP a adenosina durante las primeras 2 horas de
incubación. Mientras que en presencia del inhibidor AMD, aún después de 4 a 5
horas de incubación se encontraba presente una cantidad importante de AMP en
el sobrenadante de los cultivos celulares.
37
Figura 7. Degradación enzimática de AMP a Adenosina (ADA) de CEMs obtenidas de tejido Cervical Normal y de CaCu. Se muestra la cromatografía en capa fina de 1uL de AMP a una concentración de 2.5 mg/ml (+) y Adenosina pura (ADA) (*) a la misma concentración, carril 1 y 2 respectivamente. En los carriles 3 y 4 se colocó una muestra de 1uL de sobrenadante del cultivo de 5x10
4 CEMs en presencia del sustrato AMP 2.5mg/ml (/) ó de AMP 2.5mg/ml más 2.5 mg/ml
del inhibidor de CD73 Adenosina Metileno Difosfato (AMD) (-) respectivamente. Las muestras fueron tomadas al inicio del cultivo (hora 0) y después durante cada hora. La hora 2 resaltada en color rosa nos indica el momento en que el AMP se degrado totalmente en Adenosina.
Evaluación del efecto supresor de la adenosina generada por las CEMs de
Cérvix Normal y CaCu sobre la proliferación de los linfocitos (Objetivo 4).
Con la finalidad de evaluar el efecto supresor de la adenosina producida por las
CEMs de CaCu y Cérvix Normal en los cultivos celulares en presencia de AMP ó
de AMP más el inhibidor AMD, se colectaron los sobrenadantes de dichos cultivos
después de 4 horas y se evaluó su capacidad de inhibir la proliferación de
38
linfocitos T estimulados con perlas conteniendo anticuerpos anti CD3/CD28. Como
puede observarse en la figura 8, los sobrenadantes generados en los cultivos de
las CEMs en presencia de AMP inhibieron en aproximadamente un 50% la
proliferación de los linfocitos T. Este mismo efecto se observó al adicionar
sobrenadantes de las CEMs cultivadas con AMP y el inhibidor AMD, sugiriendo
que en ambos casos la adenosina contenida en los sobrenadantes fue capaz de
generar el efecto inhibitorio. Para corroborar dicho efecto, a los cultivos de
linfocitos T con dichos sobrenadantes se les adicionó cafeína a una concentración
de 300M, concentración requerida para bloquear los 4 diferentes receptores de
adenosina. Bajo estas condiciones, la presencia de cafeína redujo a menos del
20% el efecto inhibitorio de la adenosina contenida en los sobrenadantes de los
cultivos de CEMs en presencia de AMP y casi completamente el efecto de
adenosina contenida en los cultivos de CEMs en presencia de AMP y de AMD
(Figura 8).
Figura 8. La adenosina producida por las CEMs inhibe la proliferación de linfocitos T. 1x105
Células Mononucleares de Sangre Periférica fueron estimuladas con anticuerpos anti-CD3/CD28 (Dynanbeads, Invitrogen USA) en una proporción 1:10, perlas: LSP. Sobrenadantes de cultivos de CEMs de Cérvix Normal y CaCu conteniendo adenosina generada durante los cultivos de 5hrs en presencia de 2.5mg/mL de AMP o de 2.5mg/mL de AMP y de 2.5mg/mL de AMD fueron adicionados a los cultivos de linfocitos T a una dilución 1:250. Después de 4 días de cultivo se determinó la proliferación por incorporación de timidina tritiada durante 18 horas. El ensayo también se evaluó en
presencia de 300M de cafeína, un bloqueador de los receptores A2A de adenosina.
39
Evaluación del efecto supresor de la adenosina generada por las CEMs de
Cérvix Normal y CaCu sobre la función efectora de LTC (Objetivo 5).
Para analizar el efecto inmunosupresor de la adenosina generada por las CEMs
sobre la actividad efectora de Linfocitos T Citotóxicos CD8+, se realizaron ensayos
de citotoxicidad de manera indirecta mediante la detección de CD107; un
marcador de degranulación de linfocitos T. Para ello previamente se obtuvieron
poblaciones de linfocitos T específicos al péptido YMLDLQPETT, secuencia 11-20
de la proteína E7de HPV-16, los cuales fueron detectados por medio de
pentámeros específicos de moléculas HLA-A2/péptido marcados con ficoeritrina,
las poblaciones de linfocitos T CD8+ y positivas a los pentámeros fueron cercanas
al 1% de la población CD8+ (Figura 9).
Figura 9. Porcentaje de clonas de LTC CD8
+ específicos al péptido E7 (YMLDLQPETT) (11-
20) de HPV-16. Mediante el uso de pentámeros construidos específicamente para el sitio de unión correspondiente a la secuencia del péptido YMLDLQPETT asociado a la molécula HLA-A2 se pudieron detectar mediante citometría de flujo las poblaciones CD8+/pentámero positivas.
Los LTC específicos al péptido E7 YMLDLQPETT (11-20) fueron cultivados en
presencia de los sobrenadantes (dilución 1:250) de las CEMs cultivadas con AMP
en presencia y ausencia de AMD. Después de 24 horas de cultivo, los LTC fueron
retados contra células T2 pulsadas con el péptido E7 de HPV-16 en proporción
40
Autoflorescencia
20:1. Después de 4 horas de co-cultivo se determinó el porcentaje de linfocitos T
con marcaje CD8+CD107+. De acuerdo a los resultados obtenidos, el porcentaje
de linfocitos T CD8+CD107+ que reconocieron a las células T2 cargadas con el
péptido fue de 6.25%. Cuando los LTC fueron previamente cultivados en
presencia del sobrenadante de CEMs conteniendo adenosina, el porcentaje de
células efectoras CD8+CD107+ se redujo al 2.35% (Figura 10). De manera
importante, la adición de cafeína al cultivo de LTCs en presencia del sobrenadante
de las CEMs, restableció la función efectora de los LTCs, obteniéndose un 5.43%
de linfocitos CD8+CD107+. Cabe mencionar que la cafeína por sí sola no redujo de
manera significativa el porcentaje de linfocitos T efectores retados contra las
células blanco ya que se obtuvo un 5.68% de LTCs CD8+CD107+ después de
reto. Finalmente, la adición de adenosina sintética (10g/mL) en presencia o
ausencia de cafeína no inhibió de manera significativa la función efectora de los
LTCs (Figura 10).
Figura 10. Adenosina generada por las CEMs de CaCu reduce fuertemente la actividad
efectora de linfocitos T citotóxicos. Se muestran los porcentajes de linfocitos T CD8+CD107
+
obtenidos después de retar LTC (específicos al péptido 11-20 de la proteína E7 de HPV-16)
cultivados previamente con sobrenadantes de CEMs+AMP en presencia o ausencia de 300g/mL de cafeína como se indica.
41
Cuando se utilizó adenosina generada por CEMs de Cérvix Normal se encontró
que los porcentajes de linfocitos T CD8+CD107+ retados contra las células T2
cargadas con el péptido 11-20 de la proteína E7 de HPV-16 fueron bajos, sin
embargo se pudo observar un efecto inhibitorio en la actividad efectora de los LTC
al adicionar adenosina generada por las CEM de Cérvix normal a los cultivos de
LTCs previo al reto con las células blanco T2 cargadas con el péptido
YMLDLQPETT. De 1.83% de linfocitos T CD8+CD107+ detectado inicialmente, la
adición de adenosina contenida en los sobrenadantes de las CEMs de cérvix
normal disminuyó la población efectora a un 1.14 %. De manera interesante, la
adición de cafeína restableció ligeramente la población efectora a un 1.36%.
Asimismo, la adición de cafeína sola, adenosina o adenosina + cafeína tuvieron un
ligero efecto inhibitorio en la población efectora de LTC CD8+CD107+ (Figura 11).
Figura 11. Adenosina generada por las CEMs derivadas de tejido cervical normal, reduce la actividad efectora de linfocitos T citotóxicos. Se muestran los porcentajes de linfocitos T
CD8+CD107
+ obtenidos después de retar LTC (específicos al péptido 11-20 de la proteína E7 de
HPV-16) cultivados previamente con sobrenadantes de CEMs+AMP en presencia o ausencia de
300g/mL de cafeína como se indica.
42
DISCUSIÓN
Aunque se han tratado de esclarecer los mecanismos por los cuales se produce la
inmunidad tumoral, aun existen muchas interrogantes para saber cuales y como
actúan los componentes que favorecen la tolerancia inmunológica. Dentro de los
mecanismos más estudiados en las células tumorales se encuentran: la deficiente
presentación de antígenos, la presencia de moléculas co-inhibidoras de la
respuesta inmune e incluso la síntesis de moléculas inmunosupresoras, que
inactivan a las células efectoras del sistema inmune (Rabinovich et al., 2007). A
partir de que se han podido aislar los componentes que conforman un tejido
tumoral, se han encontrado poblaciones que soportan un microambiente
inmunosupresor y favorecen la evasión de la respuesta inmune, dentro de las
cuales se encuentran: las células T reguladoras, células NK supresoras, células
dendríticas plasmacitoides, macrófagos asociados a tumores (Rabinovich et al,
2007), fibroblastos y células estromales mesenquimales (CEMs) (English et al,
2008). En los ultimos años se ha reportado que la presencia de CEMs en el tejido
tumoral exhibe un efecto inmunosupresor sobre las células T, al inhibir
fuertemente su proliferación y activación, destacando mecanismos
inmunosupresores como la presencia de citocinas supresoras como el factor de
crecimiento transformante β (TGF-β) (Li et al, 2006), interleucina 10 (IL-10), IL-13
(Gerlini et al, 2004), y pequeñas moléculas inhibitorias como la prostaglandina E2
(PGE2) (Akasaki et al, 2004), así como la adenosina extracelular regulada por la
enzima 5´-ectonucleotidasa (CD73). La molécula CD73 es una glicoproteína
anclada en la membrana de las células de varios tejidos y su principal actividad
funcional es catalizar adenosina 5´-monofosfato (AMP) a adenosina (Hoskin et al,
2008). Estudios recientes sugieren que la función de CD73 en tumores está
implicada en la resistencia a las drogas, la promoción, control, crecimiento y
progresión tumoral, metástasis y alteración de la respuesta inmune anti-tumoral
(Airas et al, 1995; Stagg et al, 2010; Jin et al, 2010; Wang L et al, 2011).
43
Por tanto, el análisis de la expresión de CD73 y de la actividad funcional en CEMs
derivadas de tumores resulta relevante para el entendimiento de los mecanismos
inductores de supresión inmunológica y de tolerancia en el crecimiento tumoral.
El presente estudio tuvo como finalidad la de analizar la expresión y la actividad
funcional de CD73 de CEMs aisladas de cáncer cérvico uterino y de tejido cervical
normal, teniendo como hipótesis la vía de inmunosupresión mediante la
generación de adenosina, se encuentra más activa en las CEMs derivadas de
tejidos neoplásicos.
Para contrastar esta hipótesis, se establecieron y caracterizaron Células
Estromales Mesénquimales (CEMs) de tejido cervical normal, sin infección por
HPV; Neoplasia Intraepitelial Cervical (NIC) y de Cáncer cérvico-uterino (CaCu).
Las CEMs establecidas fueron caracterizadas con base a los criterios establecidos
por la Sociedad Internacional de Terapia Celular en relación a su morfología,
fenotipo y capacidad de diferenciaciación. Para analizar su morfología y tamaño,
se utilizó una nomenclatura de formas y tamaños reportados previamente para
CEM de médula ósea (Montesinos et al, 2009). En los diferentes tipos de CEMs se
lograron identificar células grandes, fibroblastoide, neurales y pequeñas; dentro
del tipo morfológico fibroblastoide se encontraron 5 tipos diferentes (romboide,
lamelopodia- lamelopodia, lamelopodia-filopodia, filopodia-filopodia y triangular), lo
que nos indica que hay presencia de diferentes subpoblaciones celulares dentro
de los cultivos de CEMs, este aspecto ha sido previamente reportado por Mets y
Verdonk, 1981, quienes observaron que en CEMs obtenidas de medula ósea, se
identificaron dos diferentes tipos celulares: el tipo I en el que las células eran
pequeñas y fusiformes y el tipo II que corresponde a células más grandes,
aplanadas y con proliferación más lenta. Asimismo, en otro estudio se encontró
que CEMs obtenidas de medula ósea presentaron formas muy delgadas y
alargadas, así como grandes y granulares (Flores-Figueroa et al, 2005).
44
En nuestro estudio encontramos que las formas pedominantes de las CEMs
fueron las de morfología pequeña en tejido cervical normal con un 33%, las de tipo
romboide en NIC con un 55% y las de forma trinagular en CaCu con un 27%.
Cabe mencionar que estos tipos morfológicos en estirpes celulares de CEMs
obtenidas de diversas fuentes han sido descritos como los más proliferativos y con
mayor capacidad de renovación. Esta documentado que las diferencias en el
tamaño celular, están relacionadas con el potencial de autorrenovación y estado
de maduración de las células, ya que las pequeñas y alargadas tienen la
capacidad de proliferación mayor que las células de morfología grande y
extendidas (Colter et al, 2000; Colter et al, 2001; Smith et al, 2004; Lee et al, 2006;
Marcov et al, 2007). Entonces sería importante analizar en estudios posteriores si
también existe relación entre morfología y las características inmunosupresoras de
las CEMs obtenidas de los diferentes tejidos.
Por otro lado, se ha reportado que los marcadores característicos en las CEMs
son CD105, CD73, CD90, CD44, CD166, HLA-ABC, CD29, CD49b, CD14, CD31,
CD34, HLA-DR y CD54, los cuales deben encontrarse en más del 90% de las
CEMs (Dominici et al, 2006). En el caso particular de las CEMs obtenidas en
nuestro estudio, los marcadores predominantes fueron CD73 y CD90 en más de
90% de las células analizadas, lo cual resultó importante para analizar la actividad
funcional de CD73 en las CEMs de CaCu dada su implicación biológica en la
generación de adenosina y su actividad inhibidora de la proliferación de linfocitos T
(Jin et al, 2010; Sitkovsky et al, 2008). La expresión de CD13 y CD44 también fue
encontrada en un alto porcentaje de las CEM obtenidas de los tejidos cervicales;
la expresión de estos marcadores también ha sido reportada para estirpes de
CEMs obtenidas de médula ósea y sangre de cordón umbilical (Fajardo-Orduña
GR 2008) así como en CEMs de diferentes fuentes celulares (Lee et al, 2004;
Marcov et al, 2007); lo que podrían constituir nuevos marcadores para la
caracterización de las CEM.
45
Otro aspecto importante en la caracterización de las CEMs de tejido cervical fue
que todas las CEMs mostraron capacidadades de diferenciación hacia los linajes
adipogénico, osteogénico y condrogénico de manera similar a la mostrada por las
CEMs obtenidas de medula ósea. Las capacidad de diferenciación de las CEMs
ha sido asociada también con la capacidad de renovación y reemplazo de tejido
dañado (Chang et al, 2006; Montesinos et al, 2009; Sun et al, 2010), por lo que en
tejido genital pudiera estar asociado con la renovación de tejido en condiciones
fisiológicas normales después del proceso de menstruación, o con la formación de
estroma de soporte para el desarrollo tumoral en el cáncer cérvico-uterino (Sun et
al, 2010). De hecho, varios autores han reportado que durante el crecimiento
tumoral, existe migración de CEMs hacia el tumor, debido a que las CEMs están
constituidas de diversos receptores para quimiocinas (Stagg et al, 2010). Por otro
lado, considerando que la actividad inmunosupresora de CEMs a través de la vía
CD73, ha sido escasamente estudiada en aquellas derivadas de tejidos tumorales,
en el presente estudio analizamos la expresión y actividad funcional de CD73 de
CEMs obtenidas de CaCu y la comparamos con aquella encontrada en tejido
cervical normal.
En nuestro estudio encontramos que las CEMs de tejido cervical normal y de
CaCu mostraron una fuerte expresión del marcador CD73 y de los receptores de
alta afinidad para adenosina (A2a) tanto en membrana, citoplasma y núcleo
(Figura 6). Sugiriendo entonces una importante actividad de la vía adenosinérgica
en ambos tipos de CEMs. Esta actividad fue comprobada por el hecho de que las
CEMs derivadas de tejido cervical normal y de CaCu mostraron importante
actividad enzimática al convertir AMP a adenosina desde de el inicio de cultivo y
de manera total después de dos horas como mostrado en la cromatografía en
capa fina (Figura 7). Es importante mencionar que dicha actividad puede ser
atribuible a la función de la molécula CD73, puesto que la adición del inhibidor
AMD, específico de CD73, boqueó de manera importante la actividad de esta
enzima aún después de 5 hrs de cultivo celular (Figura 7).
46
La adenosina extracelular es un nucleósido encontrado dentro del líquido
intersticial de tumores sólidos inhibiendo una amplia gama de respuestas de los
linfocitos T sobre las células tumorales, incluyendo su proliferación (Deaglio at al,
2007), la síntesis de IL-2, secreción de citocinas pro inflamatorias como el IFN- y
TNF-α, sobre regulación de CD25 (la cadena del receptor para IL-2 α), la
expresión de moléculas citotóxicas efectoras tales como perforinas, la expresión
del ligando de FAS, el reconocimiento de LTC hacia células blanco y la formación
del gránulos por los LTCs. De hecho, la adenosina inhibe algunos de los primeros
pasos en la activación de la células T que se asocian con la transducción de
señales a través del Receptor de célula T y moléculas co-estimuladoras como
CD28 (MacKenzie et al, 2002; Butler et al, 2003; Raskovalova et al, 2007; Lappas
et al, 2005; Chalmin et al, 2012). En nuestro estudio nos enfocamos a analizar el
efecto de la adenosina generada en los cultivos de CEMs de tejido cervical normal
y de CaCu sobre la proliferación de linfocitos T. En efecto, en los ensayos de
proliferación de linfocitos T usando perlas con anticuerpos anti-CD3/CD28
(Dynanbeads, Invitrogen USA), pudimos observar que los sobrenadantes de
ambos tipos de CEMs mostraron similar efecto inhibitorio (50%) sobre la
proliferación de linfocitos T. Sin embargo, la adición de los sobrenadantes de los
cultivos conteniendo AMD (inhibidor de CD73) en la misma dilución que en los
casos anteriores (1:250) también mostró una inhibición similar, lo cual nos indica
que la cantidad de adenosina producida después de 5 horas de cultivo bajo estas
condiciones, también fue suficiente para producir dicha inhibición (Figura 8). Es
importante resaltar que la adición de cafeína, un antagonista de la adenosina,
mostró un importante efecto, ya que su adición redujo fuertemente la actividad
inhibitoria de adenosina sobre la proliferación de linfocitos T, esto fue observado
empleando los sobrenadantes de CEMs de Cérvix Normal y de CaCu en presencia
y ausencia de AMD (Figura 8).
47
Estos resultados fuertemente nos sugieren que bajo condiciones de estímulo y
co-estímulo de linfocitos T inducido a través de los anticuerpos CD3 y CD28
respectivamente, la adenosina generada por las CEMs de los tejidos cervicales
normales y neoplásicos es capáz de inhibir la proliferación y activación de
linfocitos T (Clayton et al, 2011). En este sentido, es importante considerar que
bajo condiciones de hipoxia, como normalmente ocurre en el desarrollo de
tumores, la activación del factor inductor de hipoxia también está asociada con la
mayor expresión de CD73 y con la de los receptores de alta afinidad de
adenosina, además de promover la síntesis de citocinas anti-inflamatorias como
IL-10, favoreciendo un microambiente inmunosupresor, tal como se ha visto
recientemente en ratones CD73+ comparados con la contraparte CD73-/- (Sotnikov
I y Louis NA, 2012).
Asimismo en ratones deficientes al receptor A2a para adenosina, se ha detectado
una importante mejoría en la respuesta inmune anti-tumor mediada por las células
T CD8+, reduciéndose dramáticamente el crecimiento tumoral. En este caso, la
señalización mediada por el receptor A2a también esta implicado en la inhibición
de la producción de citocinas como son el TGF-ß (Factor de crecimiento
transformante) IL-10 (Interleucina 10), TNF (Factor de necrosis tumoral) Fas-L
(Fas ligando.), moléculas pequeñas inhibitorias como la prostaglandina E2 y la
actividad citotóxica de células asesinas naturales activadas (Células NK), aunque
también se ha visto que el proceso de formación de granulos citolíticos para la
exocitosis de las NK está suprimida a través de un desconocido receptor para
adenosina. En consecuencia, la adenosina constituye un potente inhibidor de la
respuesta inmune celular y por lo tanto, puede ser una barrera importante para la
inmunoterapia contra carcinomas humanos, lo que sugiere que la eficacia de las
terapias inmunológicas para tumores sólidos puede ser mejorada por el
antagonismo selectivo de la adenosina y bloqueo de receptores de adenosina para
mejorar la actividad antitumoral de los linfocitos T y células NK (Mujoomdar et al,
2003; Ohta et al, 2006; Serafini et al, 2006; Fishman et al, 2007; Vieweg et al,
2007; Wang HY y Wang RF, 2007).
48
Por otra parte, durante la activación de los linfocitos T vía su receptor (TCR), se
requiere de señalizaciones para que se lleve acabo la transcripción subsiguiente
de genes implicados en la activación del linfocito, tales como las secuencias que
codifican para el gen c-myc, interferón-γ, IL-2, y CD25. La expansión clonal de
células T y la expresión de moléculas efectoras tales como la perforina implica la
señalización mediada por el receptor de IL-2 (IL-2R) y la subsecuente fosforilación
de tirosina y la activación del factor de transcripción STAT5. La transcripción del
TCR se suprime por la interacción de la adenosina con los receptores de alta
afinidad A2a y A3 dejando inactiva a la célula T (Huang et al, 1997; Mustelin et al,
2003; Zhang et al, 2004). Se ha reportado que la presencia de poblaciones de
linfocitos Treg CD4 + CD25 + Foxp3 + inmersos en el microambiente tumoral
ejercen un mecanismo supresor mediante adenosina a través de la catálisis de
ATP por las moléculas CD39 y CD73 expresadas en su membrana celular. La
adenosina extracelular afecta la producción de citocinas y la función efectora de
linfocitos T citotóxicos a través de su interacción con receptores para adenosina,
excepto A1 (Hoskin et al, 2002; Sotiropoulou et al, 2003; Albers et al, 2005;
Knutson KL y Disis ML, 2005; Koch et al, 2006). Considerando lo antes
mencionado, es posible que las CEMs inmersas en tumores de CaCu también
tengan un papel supresor en la actividad efectora de los linfocitos T citotóxicos.
Para responder a esta pregunta se generaron LTC CD8+ específicos al péptido
antigénico YMLDLQPETT (11-20) de la E7 de HPV-16 y fueron cultivados en
presencia de adenosina generada en los cultivos de CEMs de tejido cervical
normal y de CaCu. Posteriormente fueron retados contra células blanco
consistente de células T2 cargadas con el mismo péptido antigénico. Para medir la
actividad efectora de los linfocitos, se determinó la expresión de la molécula
CD107 en los linfocitos T CD8+ que degranularon al reconocer a la célula blanco.
De manera interesante encontramos que la adenosina contenida en los
sobrenadantes de CEMs de CaCu al interactuar con los receptores para
adenosina inhibieron en más del 70% la degranulación de los LTC, asimismo, la
degranulación fue restablecida de manera importante cuando cafeína, antagonista
de la adenosina, fue adicionada a los cultivos de LTC con el sobrenadante de las
49
CEMs de CaCu, encontrándose en este caso menos del 15% de inhibición de la
degranulación. Por otra parte, al evaluar el efecto de la adenosina contenida en el
sobrenadante de las CEMs obtenidas de tejido cervical normal, el efecto inhibitorio
de la degranulación fue de aproximadamente un 40% y el efecto de la cafeína lo
redujo a un 25% (Figuras 10 y 11).
Tomando de manera conjunta los resultados obtenidos en este estudio, podemos
concluir que la adenosina producida mediante la actividad de CD73 en las
diferentes estirpes celulares de CEMs tiene efecto supresor en la proliferación,
activación y función efectora de linfocitos T, y que particularmente las CEMs
derivadas de CaCu parecen mostrar una mayor actividad, lo cual sería
conveniente determinar a través de un análisis cuantitativo de la generación de
adenosina a partir de cantidades equivalentes de CEMs y de concentraciones
conocidas de sustrato AMP.
La ineficacia de vacunas terapéuticas o inmunoterapia contra el cáncer en muchos
modelos de tumor se ha asociado a la supresión inmune tumoral local y sistémica,
así como a un estado de tolerancia, debida en parte a la producción de moléculas
inmunosupresoras generadas por las propias células tumorales y por células
supresoras de la respuesta inmune reclutadas en el microambiente tumoral
(Grünewald y Ridley, 2010; Stagg et al, 2009). De acuerdo a nuestros resultados,
la presencia de CEMs en tumores de CaCu puede contribuir de manera importante
en la supresión de la respuesta inmune mediada por linfocitos T citotóxicos a
través de la vía adenosinérgica, por lo cual sería importante considerar en
estudios posteriores el impacto que tiene esta vía durante la historia natural de la
enfermedad, es decir, en los diferentes estadios de evolución de la enfermedad,
con la finalidad de dirigir estrategias que permitan restablecer la actividad
antitumoral, al interferir ya sea en la generación de adenosina o en la interacción
de adenosina con sus receptores específicos como lo han sugerido.
50
CONCLUSIONES
En el presente estudio, se lograron establecer cultivos primarios de CEMs a partir
de tejidos cervicales (Cérvix normal, con NIC y CaCu).
Las CEMs establecidas fueron caracterizadas con base a los criterios establecidos
por la Sociedad Internacional de Terapia Celular de acuerdo a su morfología
fibroblástica, adherencia a la superficie de cultivo, fenotipo CD73, CD90 y CD105 y
a su capacidad de diferenciación hacia adipocitos, condrocitos y osteocitos.
Las CEMs obtenidas de tejido cervical normal y de CaCu mostraron una alta
expresión de CD73 así como del receptor A2a de alta afinidad para adenosina en
membrana citoplasmática y núcleo.
La actividad funcional de CD73 en las CEMs de tejido cervical normal y de CaCu
fue demostrada a través de la conversión de AMP hacia adenosina en cultivos
celulares a corto plazo (1-5 horas).
La adenosina generada por las CEMs de tejido cervical normal y de CaCu tiene un
importante efecto inhibidor de la proliferación y activación de linfocitos T
estimulados vía su correceptor CD3 o por co-estímulo a través de la molécula
CD28.
La adenosina generada por las CEMs de tejido cervical normal y de CaCu ejerce
un efecto inhibidor en la función efectora de LTC al disminuir su capacidad de
degranulación ante el reconocimiento de células blanco específicas.
La cafeína, antagonista de adenosina, revirtió de manera importante la capacidad
inhibitoria de la proliferación, activación y función efectora de linfocitos T.
51
PERSPECTIVAS El presente trabajo nos permite establecer las siguientes direcciones a seguir en el estudio de las CEMs derivadas de tejidos cervicales normales y tumorales:
Determinar si en las diferentes estirpes celulares de CEMs existen subpoblaciones con diferentes capacidades inmunosupresoras de la respuesta inmune.
Hacer un análisis más amplio sobre las moléculas participantes en la vía adenosinérgica en las CEMs, tales como CD39, CD73, Adenosina desaminasa, y la expresión de los 4 receptores para adenosina.
Evaluar la interferencia de la actividad CD73 mediante el uso de RNAi.
Evaluar la capacidad de inmunosupresión de las CEMs de CaCu y de tejido normal en un modelo in vivo.
Evaluar la producción de citocinas de tipo Th1 y Th2 producidas por ambos tipos de CEMs.
52
BIBLIOGRAFIA
Adurthi S, Krishna S, Mukherjee G, Bafna UD, Devi U, Jayshree RS.
Regulatory T cells in a spectrum of HPV-induced cervical lesions: cervicitis,
cervical intraepithelial neoplasia and squamous cell carcinoma. (2008). Am
J Reprod Immunol. 60:55-65.
Aggarwal S, Pittinger MF. Human mesenchymal stem cells modulate
alloantigen immune cell responses. (2005). Blood 105:1815-22.
Airas L, Hellman J, Salmi M, Bono P, Puurunen T, Smith DJ, Jalkanen S.
CD73 is involved in lymphocyte binding to the endothelium: characterization
of lymphocyte-vascular adhesion protein 2 identifies it as CD73. (1995). J
Exp Med. 1;182(5):1603-8.
Akasaki Y, Liu G, Chung NH, Ehtesham M, Black KL, Yu JS. Induction of a
CD4+ T regulatory type 1 response by cyclooxygenase-2-overexpressing
glioma. (2004). J Immunol. 1;173(7):4352-9.
Albers AE, Ferris RL, Kim GG, Chikamatsu K, DeLeo AB and Whiteside TL:
Immune responses to p53 in patients with cancer: enrichment in tetramer+
p53 peptide-specific T cells and regulatory T cells at tumor sites. (2005).
Cancer Immunol Immunother 54: 1072-1081.
Albini A, Sporn MB.. The tumour microenvironment as a target for
chemoprevention. (2007).Nat Rev Cancer. 7, 139-147.
Bianco P. Gehron RO. Marrow stromal stem cells. (2000). J Clin Invest. 105:
1663-1668.
Bieback K, Kern S, Klüter H, Eichler H. Critical parameters for the isolation
of mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. (2004). Stem Cells.
22: 625-634.
Brady CS, Bartholomew JS, Burt DJ, Duggan-Keen MF, Glenville S, Telford
N, Little AM, Davidson JA, Jimenez P, Ruiz-Cabello F, Garrido F, Stern PL.
Multiple mechanisms underlie HLA dysregulation in cervical cancer. (2000).
Tissue Antigens 55, 401–411.
53
Butler JJ, Mader JS, Watson CL, Zhang H, Blay J and Hoskin DW:
Adenosine inhibits activation-induced T cell expression of CD2 and CD28
co-stimulatory molecules: role of interleukin-2 and cyclic AMP signaling
pathways. (2003). J Cell Biochem 89: 975-991,
Chalmin F, Mignot G, Bruchard M, Chevriaux A, Végran F, Hichami A,
Ladoire S, Derangère V, Vincent J, Masson D, Robson SC, Eberl G,
Pallandre JR, Borg C, Ryffel B, Apetoh L, Rébé C, Ghiringhelli F. Stat3 and
Gfi-1 transcription factors control Th17 cell immunosuppressive activity via
the regulation of ectonucleotidase expression. (2012). Immunity.
23;36(3):362-73.
Chang CJ, Yen ML, Chen YC, Chien CC, Huang HI, Bai CH, Yen BL.
Placentaderived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties that
are enhanced in the presence of interferon gamma. (2006). Stem Cells. 24:
2466-2477.
Clayton A, Al-Taei S, Webber J, Mason MD, Tabi Z. Cancer exosomes
express CD39 and CD73, which suppress T cells through adenosine
production. (2011).J Immunol.15;187(2):676-83.
Colter D, Class R, DiGiralomo C, Prockop D. Rapid expansion of recycling
stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow.
(2000). Proc Natl Acad Sci USA ; 97: 3213-3218.
Colter D, Sekiya I, Prockop D. Identification of a subpopulation of rapidly
self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human
marrow stromal cells. (2001). Proc Natl Acad Sci USA 98: 7841-7845.
Cools N, Ponsaerts P, van Tendeloo VFI and Berneman ZN. Regulatory T
cells and human disease. (2007). Clinical and Developmental Immunology.
2007:1-11.
Deaglio S, Dwyer KM, Gao W, Friedman D, Usheva A, Erat A, Chen JF,
Enjyoji K, Linden J, Oukka M, Kuchroo VK, Strom TB, Robson SC.
Adenosine generation catalyzed by CD39 and CD73 expressed on
regulatory T cells mediates immune suppression. (2007). J Exp Med 204:
1257–1265.
54
Decking UK, Schlieper G, Kroll K, Schrader J Hypoxiainduced inhibition of
adenosine kinase potentiates cardiac adenosine release. (1997). Circ Res
81: 154–164.
Devine S & Hoffman R. Role of mesenchymal stem cell in hematopoietic
stem cell transplantation. (2000). Curr Op Hematol. 7: 358-363.
Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M., Krasovsky, J., Munz, C. & Bhardwaj, N.
Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection
of immature dendritic cells. (2001). J. Exp. Med. 193: 233–238.
Dicker, K. Le Blanc, G. Astrom, V. van Harmelen, C. Gotherstrom, L.
Blomqvist, P. Arner, M. Ryden, Functional studies of mesenchymal stem
cells derived from adult human adipose tissue. (2005). Exp. Cell Res. 308
283–290.
Djouad F, Plence P, Bony C, Tropel P, Apparailly F, Sany J, Noel D,
Jorgensen C. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors
tumor growth in allogeneic animals. (2003). Blood. 102: 3837-3844.
Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for defining
multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for
Cellular Therapy position statement. (2006). Cytotherapy 8:315-317.
Dugast AS, Vanhove B. Immune regulation by non-lymphoid cells in
transplantation. (2009). Clin Exp Immunol. 156(1):25-34.
Dzhandzhugazyan K, Zeuthen J, Hansen MR, Kirkin AF. The immunogenic
properties of human melanomas and melanoma-associated antigens
recognized by cytotoxic T lymphocytes. (1998). Bratisl Lek Listy. 99(8-
9):426-34.
English K, Ryan JM, Tobin L, Murphy MJ, Barry FP, Mahon BP. Cell
contact, prostaglandin E2 and transforming growth factor beta 1 play non-
redundant roles in human mesenchymal stem cell induction of
CD4+CD25High forkhead box P3+ regulatory T cells. (2009). Clin Exp
Immunol. 156: 149-160.
55
Evans M, Borysiewicz LK, Evans AS, Rowe M, Jones M, Gileadi U,
Cerundolo V, Man S. Antigen processing defects in cervical carcinomas limit
the presentation of a CTL epitope from human papillomavirus 16 E6.
(2001).J. Immunol. 167, 5420–5428.
Fajardo-Orduña GR. (2008). Análisis comparativo de la morfología
inmunofenotipo y capacidad de diferenciación de las células troncales
mesénquimales provenientes de medula ósea y de sangre de cordón
umbilical. Tesis de licenciatura. UNAM.
Fishman P, Bar-Yehuda S and Madi L: Adenosine, tumors and immunity. In:
Adenosine Receptors. Therapeutic Aspects for Inflammatory and Immune
Diseases. (2007). Hasko G, Cronstein BN and Szabo C (eds). CRC Press-
Taylor & Francis Group, Boca Raton, pp299-312.
Flores-Figueroa E, Arana-Trejo R, Gutierrez-Espindola G, Pérez-Cabrera A,
Mayani H. Mesenchymal stem cells in myelodysplastic síndromes:
phenotypic and cytogenetic characterization. (2005). Leuk Res 29:215-224.
Fontenot JD, Rasmussen JP, Gavin MA, Rudensky AY. A function for
interleukin 2 in Foxp3-expressing regulatory T cells. (2005). Nat Immunol.
6:1142-51. 215-224.
Fredholm BB, Ijzerman AP, Jacobson KA, Klotz K-N, Linden J. International
Union of Pharmacology. XXV. Nomenclature and Classification of
Adenosine Receptors. (2001). Pharmacol Rev 53: 527–5522.
Gao N, Hu HZ, Liu S, Gao C, Xia Y, Wood JD. Stimulation of adenosine A1
and A2A receptors by AMP in the submucosal plexus of guinea pig small
intestine. (2006). Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292(2):G492-500.
Gabrilovich, D. I., Velders, M. P., Sotomayor, E. M. Kast, W. M. Mechanism
of immune dysfunction in cancer mediated by immature Gr-1+ myeloid cells.
(2001).J Immunol. 166, 5398–5406.
Gerlini G, Tun-Kyi A, Dudli C, Burg G, Pimpinelli N, Nestle FO. Metastatic
melanoma secreted IL-10 down-regulates CD1 molecules on dendritic cells
in metastatic tumor lesions. (2004). Am J Pathol. Dec;165(6):1853-63.
56
Grohmann, U. Fallarino F, Silla S, Bianchi R, Belladonna ML, Vacca C,
Micheletti A, Fioretti MC, Puccetti P. CD40 ligation ablates the tolerogenic
potential of lymphoid dendritic cells. (2001). J. Immunol. 166: 277–283.
Grünewald Jana KG, Anne J Ridley. CD73 represses pro-inflammatory
responses in human endothelial cells. (2010). J.Inflammation. 7:10.
Hoskin DW, Butler JJ, Drapeau D, Haeryfar SM and Blay J. Adenosine acts
through an A3 receptor to prevent the induction of murine anti-CD3-
activated killer T cells. (2002). Int J Cancer 99:386-395.
Hoskin David W, Mader Jamie S, Furlon Suzanne J, Condrad David M.and
Blay Jonathan. Inhibition of T cell and natural killer cell function by
adenosine and its contribution to immune evasion by tumor cells. (2008). J.
Oncology. 32: 527-535.
Huang S, Koshiba M, Apasov S, Sitkovsky M. Role of A2a adenosine
receptor-mediated signaling in inhibition of T cell activation and expansion.
(1997).Blood 90: 1600–1610.
Hung SC, Deng WP, Yang WK, Liu RS, Lee CC, Su TC, Lin RJ, Yang DM,
Chang CW, Chen WH, Wei HJ, Gelovani JG. Mesenchymal stem cell
targeting of microscopic tumors and tumor stroma development monitored
by noninvasive in vivo positron emission tomography imaging. (2005).Clin
Cancer Res. 11: 7749-77560.
INEGI. (2008). Estadísticas vitales, base de datos. Consultado en:
www.inegi.gob.mx
Jackson L, Jones D, Scotting P, Sottile V. Adult mesenchymal stem cells:
Differentiation potential and therapeutic applications. (2007).J Postgrad
Med. 53: 121-126.
Jacobson KA, Gao ZG. Adenosine receptors as therapeutic targets.
(2006).Nat Rev Drug Discov 5: 247–264.
Jin Dachuan, Jie Fan, Long Wang, Linda F. Thompson, Aijie Liu, Benjamin
J. Daniel, Tahiro Shin, Tyler J. Curiel, and Bin Zhang. CD73 on Tumor Cells
Impairs Antitumor T-Cell Responses: A Novel Mechanism of Tumor-Induced
Immune Suppression. (2010).Cancer Res; 70(6); 2245–55.
57
Jodele S, Blavier L, Yoon JM, DeClerck YA. Modifying the soil to affect the
seed: role of stromal-derived matrix metalloproteinases in cancer
progression. (2006).Cancer Metastasis Rev. 25: 35-43.
Karnoub AE, Dash AB, Vo AP, Sullivan A, Brooks MW, Bell GW, Richardson
AL, Polyak K, Tubo R, Weinberg RA. Mesenchymal stem cells within tumour
stroma promote breast cancer metastasis. (2007). Nature 449: 557-563.
Kern S, Eichler H, Stoeve J, Klüter H, Bieback K. Comparative analysis of
mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or
adipose tissue. (2006). Stem Cells. 24: 1294-1301.
Knutson KL and Disis ML. Tumor antigen-specific T helper cells in cancer
immunity and immunotherapy. (2005). Cancer Immunol Immunother 54:
721-728.
Kobie JJ, Shah PR, Yang L, Rebhahn JA, Fowell DJ, Mosmann TR. T
regulatory and primed uncommitted CD4 T cells express CD73, which
suppresses effector CD4 T cells by converting 50-
adenosinemonophosphate to adenosine. (2006).J Immunol 177: 6780–
6786.
Koch M, Beckhove P, Op den Winkel J, Autenrieth D, Wagner P, Nummer
D, Specht S, Antolovic D, Galindo L, Schmitz- Winnenthal FH, Schirrmacher
V, Buchler MW and Weitz J. Tumor infiltrating T lymphocytes in colorectal
cancer: tumorselective activation and cytotoxic activity in situ. (2006).Ann
Surg 244: 986-992.
Körbling M. & Estrov Z. Adult stem cells for tissue repair – a new therapeutic
concept?. (2003). N Engl J Med. 349: 570-582.
Koshiba M, Kojima H, Huang S, Apasov S, Sitkovsky MV. Memory of
extracellular adenosine/A2a purinergic receptormediated signalling in
murine T cells. (1997).J Biol Chem 272:25881–25889.
Lappas CM, Rieger JM and Linden J: A2A adenosine receptor induction
inhibits IFN-γ production in murine CD4+ T cells. (2005).J Immunol 174:
1073-1080.
58
Le Blanc K, Ringden O. Mesenchymal stem cells: properties and role in
clinical bone marrow transplantation. (2006). Curr Opin Immunol 18:586-91.
Le Blanc K, Frassoni F. Ball L, Lanino E, Sundberg B, Lonnies L, et al.
Mesenchymal stem cells for treatment of severe acute graft-versus-host
disease. (2006). Blood 108 Suppl 1:226.
Lee O, Kuo T, Chen W, Lee K, Hsieh S, Chen T. Isolation of multipotent
mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. (2004). Blood. 103:
1669-1675.
Lee R, Hsu Sh, Munoz J, Jung J, Lee R, Pochampally R, Prockop D. A
subset of human rapidly self-renewing marrow stromal cells preferentially
engraft in mice. (2006). Blood; 107: 2153-2161.
Li JC, Ding GF, Xu YF. Study on the correlationship between the expression
of nm23H1mRNA, TGF-beta1mRNA and tumor metastases, survival rate
with prostate cancer. (2006). 39(6):544-52.
Linden J. Molecular approach to adenosine receptors: receptor-mediated
mechanisms of tissue protection. (2001). Annu Rev Pharmacol Toxicol 41:
775–787.
Maccario R, Podestà M, Moretta A, Cometa A, Comoli P, Montagna D, et al.
Interaction of human mesenchymal stem cells with cells involved in
alloantigen-specific immune response favors the differentiation of CD4+ T-
cell subsets expressing a regulatory/suppressive phenotype. (2005).
Haematologica 90:516-25.
Maccario R, Moretta A, Cometa A, Podestà M, Montagna D, Comoli
P, et al. Human mesenchymal stem cells and cyclosporin-A exert a
synergistic suppressive effect on in vitro activation of alloantigen-specific
cytotoxic lymphocytes. (2005). Biol Blood Marrow Transplant 11:1031-2.
MacKenzie WM, Hoskin DW and Blay J: Adenosine suppresses α4ß7
integrin- mediated adhesion of T lymphocytes to colon adenocarcinoma
cells. (2002). Exp Cell Res 276: 90-100.
59
Malmberg KJ. Effective immunotherapy against cancer. A question of
overcoming immune suppression and immune escape?. (2004). Cancer
Immunol Immunother 53: 879-892.
Marcov V, Kusumi K, Tadesse M, William D, Hall D, Lounev V, Carlton A,
Leonard J, Cohen R, Rappaport E, Saitta B. Identification of cord blood-
derived mesenchymal stem/stromal cell populations with distinct growth
kinetics, differentiation potentials and gene expression profiles. (2007).
Stem Cells and Developed; 16: 53-73.
Molling JW, de Gruijl TD, Glim J, Moreno M, Rozendaal L, Meijer CJ, van
den Eertwegh AJ, Scheper RJ, von Blomberg ME, Bontkes HJ.
CD4(+)CD25hi regulatory T-cell frequency correlates with persistence of
human papillomavirus type 16 and T helper cell responses in patients with
cervical intraepithelial neoplasia. (2007). Int J Cancer. 121:1749-1755.
Montesinos JJ, Flores-Figueroa E, Castillo-Medina S, Flores-Guzmán P,
Fajardo-Orduña G, Hernández-Estevez E, Orozco S, Mayani H. Human
mesenchymal stromal cells from adult and neonatal sources: comparative
analysis of their morphology, immunophenotype, differentiation patterns and
neural protein expression. (2009). Cytotherapy 2009; 16:1-14.
Mujoomdar M, Hoskin D and Blay J: Adenosine stimulation of the
proliferation of colorectal carcinoma cell lines. Roles of cell density and
adenosine metabolism. (2003). Biochem Pharmacol 66: 1737-1747.
Mustelin T and Tasken K. Positive and negative regulation of T-cell
activation through kinases and phosphatases. (2003). J Biochem 371:15-27.
Nakamizo A, Marini F, Amano T, Khan A, Studeny M, Gumin J, Chen J,
Hentschel S, Vecil G, Dembinski J, Andreeff M, Lang FF. Human bone
marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of gliomas.
(2005).Cancer Res. 65: 3307-3318.
Nakamura K, Ito Y, Kawano Y, Kurozumi K, Kobune M, Tsuda H, Bizen A,
Honmou O, Niitsu Y, Hamada H. Antitumor effect of genetically engineered
mesenchymal stem cells in a rat glioma model. (2004). Gene Ther. 11:
1155-1164.
60
Nakamura T, Shima T, Saeki A, Hidaka T, Nakashima A, Takikawa O, Saito
S . Expression of indoleamine 2,3-dioxigenase and the recruitment of
Foxp3-expressing regulatory T cells in the development of progression of
uterine cervical cancer. (2007). Cancer Sci. Apr. 13.
Ohta A, Gorelik E, Prasad SJ, Ronchese F, Lukashev D, Wong MK, Huang
X, Caldwell S, Liu K, Smith P, Chen JF, Jackson EK, Apasov S, Abrams S,
Sitkovsky M. A2A adenosine receptor protects tumors from antitumor T
cells. (2006). Proc Natl Acad Sci USA 103: 13132–13137.
Piersma SJ, Jordanova ES, van Poelgeest MI, Kwappenberg KM, van der
Hulst M, Drijfhout JW, Melief CJ, Kenter GG, Fleuren GJ, Offringa R, van
der Burg SH. High number of intraepithelial CD8+ tumor-infiltrating
lymphocytes is associated with the absence of lymph node metastases in
patients with large early cervical cancer. (2007).Cancer Res. 67: 354-61.
Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult
human mesenchymal stem cells. (1999). Science. 284:143-7.
Poehlein CH, Hu HM, Yamada J, Assmann I, Alvord WG, Urba WJ, Fox
BA. TNF plays an essential role in tumor regression after adoptive transfer
of perforin/IFN-gamma double knockout effector T cells. (2003).J Immunol
170: 2004–2013.
Prevosto C, Zancolli M, Canevali P, Zocchi MR, Poggi A. Generation of
CD4+ or CD8+ regulatory cells upon mesenchymal stem cell-lymphocyte
interaction. (2007).Haematologica 92:881-8.
Rabinovich GA, Gabrilovich D, Sotomayor EM. Immunosuppressive
strategies that are mediated by tumor cells. (2007). Annu Rev Immunol. 25:
267-296.
Ramasamy R, Lam EW, Soeiro I et al. Mesenchymal stem cells inhibit
proliferation and apoptosis of tumor cells: Impact on in vivo tumor growth.
(2008). Leukemia. 21:304-310.
61
Raskovalova T, Lokshin A, Huang X, Su Y, Mandic M, Zarour HM, Jackson
EK and Gorelik E: Inhibition of cytokine production and cytotoxic activity of
human antimelanoma specific CD8+ and CD4+ T lymphocytes by
adenosine-protein kinase A type I signalling. (2007). Cancer Res 67: 5949-
5956.
Rasmusson I, Ringden O, Sundberg B, Le Blanc K. Mesenchymal stem cells
inhibit the formation of cytotoxic T lymphocytes, but not activated cytotoxic T
lymphocytes or natural killer cells. (2003).Transplantation 76:1208-13.
Rasmusson I. Immune modulation by mesenchymal stem cells (2006).
Elsevier. 2 2169-2179.
Resta R, Yamashita Y, Thompson LF. Ecto-enzyme and signaling functions
of lymphocyte CD73. (1998). Immunol Rev 161: 95–109.
Ringden O, Uzunel M, Rasmusson I, Remberger M, Sundberg B, Lonnies H,
Mesenchymal stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host
disease. (2006). Transplantation 81:1390-7.
Robson SC, Wu Y, Sun X, Knosalla C, Dwyer K, Enjyoji K.
Ectonucleotidases of CD39 family modulate vascular inflammation and
thrombosis in transplantation. (2005).Semin Thromb Hemost 31: 217–233.
Rodríguez V. (2005). Células madre: Conceptos generales y perspectivas
de investigación. Universitas Scientiarum.10: 5-14.
Roncarolo, M. G., Levings, M. K. & Traversari, C. Differentiation of T
regulatory cells by immature dendritic cells. (2001). J. Exp. Med. 193: F5–
F9.
Roncarolo MG, Gregori S, Battaglia M, Bacchetta R, Fleischhauer K,
Levings MK. Interleukin-10-secreting type 1 regulatory T cells in rodents and
humans.(2006). Immunol Rev. 212: 28-50.
Sabatini F, Petecchia I, Tavian M, Jodon V, Rossi G, Brouty-Boye D. Human
bronchial fibroblast exhibit a mesenchymal stem cell phenotype and
multilineage differentiating potentialities. (2005). Lab Invest. 85: 962-971.
62
Sauer AV, Brigida I, Carriglio N, Hernandez RJ, Scaramuzza S, Clavenna D,
Sanvito F, Poliani PL, Gagliani N, Carlucci F, Tabucchi A, Roncarolo MG,
Traggiai E, Villa A, Aiuti A. Alterations in the adenosine metabolism and
CD39/CD73 adenosinergic machinery cause loss of Treg cell function and
autoimmunity in ADA-deficient SCID. (2012). Blood. 9; 119(6):1428-39.
Serafini P, Borrello I and Bronte V: Myeloid suppressor cells in cancer:
recruitment, phenotype, properties and mechanisms of immune
suppression. (2006). Semin Cancer Biol 16: 53-65.
Shi S, Bartold P, Miura M, Seo B, Robey P, Gronthos S. The efficacy of
mesenchymal stem cells to regenerate and repair dental structures. (2005).
Orthod Craniofac Res. 8:191-199.
Sitkovsky M, Sugiyama H, Chen P, Hunter M, Taffs R. The dual role of the
cAMP-dependent protein kinase C alpha subunit in T-cell receptor-triggered
T-lymphocytes effector functions. (1992). J Biol. Chem. 15; 267(35):25256-
63.
Sitkovsky M, Lukashev D, Deaglio S, Dwyer K, Robson SC, Ohta A.
Adenosine A2A receptor antagonists: blockade of adenosinergic effects and
T regulatory cells. (2008). Br J Pharmacol. 153 :S457-64.
Smith J, Pochampally R Perry A, Hsu Sh, Prockop D. Insolation of a higly
clonogenic and multipotential subfraction of dult stem cells from bone
marrow stroma. (2004). Stem Cells. 22: 823-831.
Sojka DK, Huang YH, Fowell DJ. Mechanisms of regulatory T-cell
suppression a diverse arsenal for a moving target. (2008). Immunology. 124
(1): 13-22.
Sotiropoulou PA, Perez SA, Voelter V, Echner H, Missitzis I, Tsavaris NB,
Papamichail M and Baxevanis CN. Natural CD8+T-cell responses against
MHC class I epitopes of the HER-2/neu oncoprotein in patients with
epithelial tumors. (2003). Cancer Immunol Immunother 52: 771-779.
Sotnikov I, Louis NA. CD73-dependent regulation of interferon αA and
interleukin-10 in the inflamed mucosa. (2010). Scientific World Journal.
4;10:2167-80.
63
Stagga John, Upulie Divisekeraa, Nicole McLaughlina, Janelle Sharkeya,
Sandra Pommeyb,c, Delphine Denoyerd, Karen M. Dwyerb,c, and Mark J.
Anti-CD73 antibody therapy inhibits breast tumor growth and metastasis.
(2009). Proc Natl Acad Sci U S A. 26; 107(4):1547-52.
Studeny M, Marini FC, Champlin RE, Zompetta C, Fidler IJ, Andreeff M.
Bone marrow-derived mesenchymal stem cells as vehicles for interferon-
beta delivery into tumors. (2002).Cancer Res 62:3603-3608.
Sun X, Cai H, Qian H, Zhu W,Yan Y, Xu H, Xu W. Mesenchymal stem cells
isolated from human uterine cervix cancer tissues. (2010). Cell Biol Int.
Short Communication. 35: 1-4.
Suri-Payer, E., Amar, A. Z., Thornton, A. M. & Shevach, E. M. CD4+CD25+
T cells inhibit both the induction and effector function of autoreactive T cells
and represent a unique lineage of immunoregulatory cells. (1998). J.
Immunol. 160, 1212–1218.
Synnestvedt K, Furuta GT, Comerford KM, Louis N, Karhausen J, Eltzschig
HK, Hansen KR, Thompson LF, Colgan SP. Ecto-50-nucleotidase (CD73)
regulation by hypoxia-inducible factor-1 mediates permeability changes in
intestinal epithelial. (2002). J Clin Invest 110: 993–1002.
Takayama H, Trenn G, Sitkovsky MV. Locus of inhibitory action of cAMP-
dependent protein kinase in the antigen-receptor triggered cytotoxic T-
lymphocyte activation pathway. (1988).J Biol Chem 263: 2330–2336.
Turley EA, Veiseh M, Radisky DC, Bissell MJ. Mechanisms of disease:
epithelial-mesenchymal transition--does cellular plasticity fuel neoplastic
progression?. (2008). Nat Clin Pract Oncol. 5: 280-290.
Uccelli A, Pistoia V, Moretta L. Mesenchymal stem cells: a new
strategy for immunosuppression?. (2007). Trends Immunol, 28:219-26.
Van der Burg SH, Piersma SJ, de Jong A, van der Hulst JM, Kwappenberg
KM, van den Hende M, Welters MJ, Van Rood JJ, Fleuren GJ, Melief CJ,
Kenter GG, Offringa R. Association of cervical cancer with the presence of
CD4+ regulatory T cells specific for human papillomavirus antigens.
(2007).Proc Natl Acad Sci U S A. 104:12087-12092.
64
Vieweg J, Su Z, Dahm P and Kusmartsev S. Reversal of tumormediated
immune suppression. (2007). Clin Cancer Res 13 (Suppl 2): S727-S732.
Visser J, Nijman HW, Hoogenboom BN, Jager P, van Baarle D, Schuuring
E, Abdulahad W, Miedema F, van der Zee AG, Daemen T. Frequencies and
role of regulatory T cells in patients with (pre)malignant cervical neoplasia.
(2007). Clin Exp Immunol. 150:199-209.
Von Boehmer H. Mechanisms of suppression by suppressor T cells. (2005).
Nat Immunol. 6:338-43.
Wagner W, Wein F, Seckinger A, Frankhauser M, Wirkner U. Comparative
characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow,
adipose tissue, and umbilical cord blood. (2005). Exp Hematol. 33: 1402-
1416.
Walboomers JM, Jacobs MV, Manos MM, Bosch FX, Kummer JA, Shah KV,
Snijders PJ, Peto J, Meijer CJ, Munoz N. Human papillomavirus is a
necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. (1999). J Pathol
189:12-19.
Wang HY and Wang RF. Regulatory T cells and cancer. (2007). Curr Opin
Immunol 19: 217-223.
Welters MJ, Kenter GG, Piersma SJ, Vloon AP, Löwik MJ, Berends-van der
Meer DM, Drijfhout JW, Valentijn AR, Wafelman AR, Oostendorp J, Fleuren
GJ, Offringa R, Melief CJ, van der Burg SH. Induction of Tumor-Specific
CD4+ and CD8+ T-Cell Immunity in Cervical Cancer Patients by a Human
Papillomavirus Type 16 E6 and E7 Long Peptides Vaccine. (2008). Clin
Cancer Res. 14:178-187.
Wexler S, Donaldson C, Denning-Kendall P, Rice C, Bradley B, Hows JM.
Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal «stem» cells but
umbilical cord and mobilized adult blood are not. (2003). Br J Haematol.
121: 368-374.
65
Zhang H, Conrad DM, Butler JJ, Zhao C, Blay J and Hoskin DW. Adenosine
acts through A2 receptors to inhibit IL-2-induced tyrosine phosphorylation of
STAT5 in T lymphocytes: role of cyclic adenosine 3',5'-monophosphate and
phosphatases. (2004). J. Immunol 173: 932-944.
Zhu W, Xu W, Jiang R, Qian H, Chen M, Hu J, Cao W, Han C, Chen Y.
Mesenchymal stem cells derived from bone marrow favor tumor cell growth
in vivo. (2006). Exp Mol Pathol. 80: 267-274.
Zou W. Immunosuppressive networks in the tumour environment and their
therapeutic relevance. (2006). Nat Rev Cancer. 5: 263-74.